Способы конъюгации агента с тиольным компонентом в белке, который содержит по меньшей мере одну трисульфидную связь - RU2744978C2

Чертежи

Описание

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62/028679, поданной 24 июля 2014 г., которая включена в данный документ посредством ссылки. Все заявки и патенты, процитированные в данном описании, а также все документы или ссылки, процитированные в каждой из заявок или патентов (в том числе во время рассмотрения каждого выданного патента; «цитируемые в заявке документы»), и все заявки или патенты согласно РСТ или зарубежные, соответствующие и/или заявляющие приоритет любых этих заявок и патентов, и все документы, процитированные или ссылаемые в каждом из цитируемых в заявке документов, явным образом включены в данный документ посредством ссылки и могут быть использованы для практической реализации изобретения. В более широком смысле в данном тексте цитируются документы и ссылки, как в ссылочных материалах перед формулой изобретения, так и в самом тексте; и каждый из этих документов или ссылок («цитируемых в данном документе ссылок»), а также каждый документ или ссылка, цитируемые в каждой из цитируемых в данном документе ссылок (включая любые спецификации, инструкции и т.д. производителя), явным образом включены в данный документ посредством ссылки.

Уровень техники

Рекомбинантные белки стали важным классом терапевтических соединений, применяемых для лечения широкого диапазона заболеваний. Недавние успехи в области биотехнологии улучшили способность производить большие количества таких белков. Однако всестороннее изучение характеристик продуктов демонстрирует, что белки подвержены существенной гетерогенности. Например, причиной молекулярной гетерогенности могут быть химически индуцированные модификации, такие как окисление, дезамидирование и гликирование, а также посттрансляционные модификации, такие как протеолитическое созревание, сворачивание белка, гликозилирование, фосфорилирование и образование дисульфидных связей. Молекулярная гетерогенность является нежелательной, так как терапевтические продукты должны быть всестороннее изучены с помощью ряда сложных аналитических методов и соответствовать приемлемым стандартам, которые гарантируют качество и стабильность продукта.

В частности, такой структурной гетерогенности подвержены антитела (или иммуноглобулины) вследствие того, что они являются крупными, многоцепьевыми молекулами. Например, антитела IgG состоят из четырех полипептидных цепей: двух полипептидов легкой цепи (L) и двух полипептидов тяжелой цепи (H). Как правило, четыре цепи соединены дисульфидными связями, которые образуются между остатками цистеина, присутствующими в тяжелых и легких цепях. Эти дисульфидные связи задают общую структуру нативного тетрамера H₂L₂. В общем случае антитела IgG1 содержат четыре межцепьевые дисульфидные связи, включая две дисульфидные связи шарнирной области, которые связывают Н-цепи, и одну дисульфидную связь между каждой H- и L-цепью.

Конъюгаты антитело-лекарственный препарат (ADC, от англ. «antibody-drug conjugate») представляют собой моноклональные антитела (mAb), сопряженные с эффективными лекарственными молекулами, в которых объединены биологическая специфичность антител и высокая эффективность конкретных терапевтических соединений. Лекарственные соединения могут быть сопряжены с антителами с помощью лизин- или цистеин-направленного линкерного химического соединения (Wu, A. M., Nat. Biotechnol. 23:1137-46 (2005)). С помощью цистеин-направленных химических соединений можно связывать лекарственные препараты с нативными цистеинами, получаемыми при восстановлении межцепьевых дисульфидных связей, или со специально сконструированными цистеинами. Стехиометрически, одна восстановленная дисульфидная связь должна открывать два свободных тиола для конъюгации лекарственного препарата. В случае конъюгации с межцепьевыми цистеинами молекул IgG1 получаемые в результате конъюгаты состоят из смеси, содержащей преимущественно молекулы с 0, 2, 4, 6 или 8 лекарственными соединениями на молекулу антитела. Среднее число лекарственных молекул, конъюгированных с антителом (соотношение лекарственного препарата и антитела; «DAR»), является важным атрибутом качества продуктов ADC, так как среднее DAR отображает количество лекарственного препарата, доставляемого в одной дозе, и, следовательно, может влиять как на безопасность, так и на эффективность ADC. Неполное образование дисульфидной связи или разрыв связи вследствие окисления или бета-элиминации с последующей дисульфидной перестановкой являются потенциальными источниками гетерогенности антител. Кроме того, сообщалось об образовании трисульфидной связи в пределах межцепьевых связей шарнирной области человеческого антитела IgG2. (Pristatsky et al, Anal. Chem. 81:6148 (2009); Gu et al, Anal. Biochem. 400:89-98 (2010)). Трисульфидная связь возникает, когда лишний атом серы образует «трисульфидный мостик» (-CH2-S-S-S-CH2-) в молекуле и может приводить к дополнительным проблемам, связанным со стабильностью и загрязнением, во время получения ADC.

Ранее трисульфидные связи были обнаружены в супероксиддисмутазе (Okado-Matsumoto et al., Free Radical Bio. Med. 41:1837 (2006)), усеченной форме интерлейкина-6 (Breton et al., J. Chromatog. 709:135 (1995)) и экспрессируемом бактериями человеческом гормоне госта (hGH) (Canova-Davis et al., Anal. Chem. 68:4044 (1996)). Другие полипептиды, содержащие дисульфидные связи, например, инсулин, интерлейкины и некоторые факторы свертывания крови (такие как фактор VII), потенциально также могут образовывать трисульфидные производные.

В случае hGH предполагали, что образование трисульфида стимулировало высвобождение H₂S во время процесса ферментации (заявка на патент согласно РСТ № WO 96/02570), а содержание трисульфида в hGH возрастало после воздействия H₂S в растворе (патент США № 7232894). Трисульфидные производные hGH также были описаны для рекомбинантного hGH, образуемого во время экспрессии в Escherichia coli (Andersson et al., Int. J. Peptide Protein Res. 47: 311-321 (1996); A. Jesperson et al., Eur. J. Biochem. 219:365-373 (1994)).

В публикации согласно РСТ № WO 96/02570 описан другой способ преобразования трисульфидного производного hGH обратно в нативную форму hGH путем обработки производного сульфитным соединением, таким как сульфит натрия, сульфит калия или сульфит аммония, или сульфит щелочноземельного металла, такой как сульфит магния или сульфит кальция.

В публикации согласно РСТ № WO 00/02900 описаны способы получения рекомбинантных пептидов с низким содержанием трисульфидов, характеризуемые добавлением соли металла (например, соли калия или натрия) во время или после этапа ферментации.

В публикации согласно РСТ № WO 04/31213 раскрыты способы снижения содержания примесей трисульфидной изоформы, вырабатываемой при рекомбинантном получении «антагонистического полипептида гормона роста» в генетически модифицированных клетках-хозяевах, при этом примеси приводят в контакт с «меркапто-соединением» (таким как сульфиты, глутатион, β-меркаптоэтанол, дитиотреитол, цистеин). В заявке также раскрыто применение хелатирующих агентов или солей металлов для достижения снижения содержания образуемого трисульфида.

К сожалению, удаление трисульфидных связей путем обработки цистеином, меркапто-соединениями, сульфитными соединениями, солями металлов и тому подобным в растворе или во время процессов ферментации имеет несколько недостатков, в частности, в случае крупномасштабной обработки. Например, требуются большие количества этих соединений. Кроме того, так как многие из этих химических веществ обладают известной токсичностью, такие способы также требуют дополнительных этапов обработки для удаления химических веществ из белков после удаления трисульфидных связей и представляют еще один источник потенциальных примесей и изменчивости процесса. Кроме того, удаление трисульфидных связей путем обработки такими химическими веществами в растворе может стимулировать агрегацию вследствие образования нежелательных дисульфидных связей.

Следовательно, чтобы разрешить вопросы, связанные с изменчивостью и загрязнением, вызываемыми наличием трисульфидных связей, во время процедур получения и очистки, применяемых в производстве рекомбинантных белков (включая получение антител и ADC), в настоящем документе раскрыты способы, обеспечивающие эффективные и улучшенные средства снижения или устранения такой изменчивости и/или таких примесей.

Сущность изобретения

Конъюгаты антитело-лекарственный препарат (ADC) с межцепьевыми цистеиновыми связями получают путем восстановления части общего числа межцепьевых дисульфидных связей. Затем ставшие доступными свободные тиолы конъюгируют с лекарственной молекулой (которая часто уже является частью более крупного промежуточного продукта линкер-лекарственный препарат). Так как частичное восстановление проводят в неденатурирующих условиях, обычно не наблюдается связывание с цистеинами, участвующими в межцепьевых дисульфидных связях. Линкер-лекарственный препарат, содержащий реагирующий с тиолом компонент (такой как малеимид), добавляют в избытке, чтобы гарантировать конъюгацию всех доступных свободных тиолов. Трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP) является предпочтительным восстановителем в этих процессах благодаря своей благоприятной реакционной кинетике, стабильности раствора до реакции и так как он не может образовывать смешанные дисульфиды с тиолами антитела. Считается, что одна молекула TCEP восстанавливает одну дисульфидную связь, открывая два свободных тиола для конъюгации с лекарственным препаратом. После восстановления молярным эквивалентом TCEP (1,0X TCEP:mAb) ожидаемое среднее значение DAR составляет 2,0. Аналогично, чтобы достичь целевого значения DAR 4,0, требуется прогнозируемое добавление 2 мол. эквивалентов TCEP (2,0X TCEP:mAb). На практике этап восстановления проводят, используя заданное молярное соотношение TCEP:антитело (TCEP:mAb).

Во время разработки нескольких цистеин-направленных продуктов ADC наблюдали отклонения от теоретических прогнозируемых средних значений DAR, о чем сообщалось в (Cumnock, et al. Bioconjugate Chem. 24:1154-60 (2013)). В этих случаях требуемое соотношение восстановителя и антитела, хоть и воспроизводилось для заданной партии антител, различалось для антител, а также для разных партий одного антитела. Хотя для некоторых партий антител требовались количества TCEP, очень близкие к теоретическим прогнозам, для большинства партий требовалось повышенное молярное соотношение TCEP:mAb для достижения целевого среднего значения DAR. Наличие трисульфидных связей было определено как потенциальный источник этой изменчивости, наблюдаемой во время производства ADC. Трисульфиды были определены как потенциальный источник изменчивости соотношения TCEP:mAb, наблюдаемой во время производства этих ADC.

Кроме того, обратно-фазовый анализ ВЭЖХ выявил наличие неожиданных примесей в нескольких композициях, содержащих конъюгированные ADC. Исследование ADC и примесей показало, что реактивные сульфидные компоненты, присутствующие в реакции конъюгации между антителом и лекарственными молекулами в результате восстановления трисульфидных связей, присутствующих в антителах, участвовали в образовании свободных димеров лекарственного препарата, которые и оказались примесями в этих композициях.

Вместо того чтобы модифицировать общепринятые и сертифицированные рекомбинантные технологии, применяемые для получения антител, авторы изобретения разработали способы снижения образования свободных димеров лекарственного препарата (и других примесей), которые возникают при окислении рекомбинантных белков, содержащих трисульфидные связи, путем снижения количества или устранения реактивных сульфидных молекул из этих композиций во время реакций восстановления и/или конъюгации.

Таким образом, в одном аспекте в изобретении предложены способы конъюгации агента к тиольному компоненту в белке, который содержит по меньшей мере одну дисульфидную связь и по меньшей мере одну трисульфидную связь, включающие восстановление по меньшей мере одной сульфидной связи в выделенном белке для получения композиции, содержащей реактивный сульфид и восстановленный белок, содержащий по меньшей мере одну тиольную группу, и снижение содержания реактивного сульфида в получаемой в результате композиции. Затем агент конъюгируют по меньшей мере с одной тиольной группой восстановленного белка для образования конъюгата белок-агент.

Этап восстановления по меньшей мере одной сульфидной связи может включать по меньшей мере частичное восстановление по меньшей мере одной сульфидной связи путем приведения выделенного белка в контакт с восстанавливающим агентом.

Выделенный белок может содержать по меньшей мере четыре дисульфидные связи.

Выделенный белок также может содержать по меньшей мере две трисульфидные связи.

Перед этапом восстановления от около 1% до около 20% сульфидных связей в выделенном белке могут представлять собой трисульфидные связи. Перед этапом восстановления от около 1% до около 20% сульфидных с восстановления от около 5% до около 7% сульфидных связей в выделенном белке могут представлять собой трисульфидные связи.

Этап восстановления можно проводить в неденатурирующих условиях. В этих реакциях восстанавливающим агентом может быть по меньшей мере один из дитиотреитола (DTT), бета-меркаптоэтанола (βME), трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP), цистеина, L-цистеина, восстановленного глутатиона (GSH) и L-GSH. Восстанавливающим агентом может быть TCEP, при этом TCEP может быть смешан с выделенным белком с заданным молярным соотношением между TCEP и выделенным белком. Заданное молярное соотношение между TCEP и выделенным белком может соответствовать молярному избытку TCEP.

Этап восстановления по меньшей мере одной сульфидной связи в белке включает приведение выделенного белка в контакт с химическим восстанавливающим агентом в концентрации от около 0,1 до около 8 мМ; от около 0,1 до около 5 мМ; от около 0,1 до около 3 мМ; от около 0,1 до около 1 мМ; около 8 мМ; около 5 мМ; около 3 мМ; около 1 мМ; и около 0,5 мМ.

Этап восстановления по меньшей мере одной сульфидной связи в белке можно проводить при pH от около 5,0 до около 8,0; от около 5,5 до около 7,5; около 5,5 или около 6,5.

Перед этапом восстановления рН выделенного белка можно доводить до рН от около 5,0 до около 8,0.

Предпочтительно происходит восстановление около 100% трисульфидных связей в белке.

После этапа восстановления от около 4 до около 8 молей тиольных компонентов может быть доступно для конъюгации с агентом на каждый моль восстановленного выделенного белка.

Этап снижения содержания реактивных сульфидов в композиции может включать доведение рН композиции до рН от около 5,0 до около 6,0, что может включать снижение рН композиции до рН около 5,5.

Этап снижения содержания реактивных сульфидов в композиции может включать удаление жидкой среды из композиции и замещение жидкой среды заместительной жидкой средой. Жидкая среда может включать буфер.

Этап снижения содержания реактивных сульфидов в композиции может включать возможность ассоциации восстановленного белка в композиции с твердой подложкой перед замещением по меньшей мере 90% композиции заместительным раствором, в котором отсутствует реактивный сульфид. Твердая подложка может включать по меньшей мере один элемент из фильтрующей мембраны, избирательно проницаемой мембраны и хроматографической смолы.

Этап снижения содержания реактивных сульфидов в композиции может включать смешивание композиции на этапе восстановления со скоростью, достаточной для восстановления содержащихся в композиции реактивных сульфидов. Смешивание может включать перемешивание композиции при повышенной скорости, превышающей оптимальную скорость смешивания для восстановления сульфидных связей в выделенном белке. Смешивание при повышенной скорости может включать повышение скорости смешивания на этапе восстановления в течение времени, меньшего, чем полное время реакции для этапа восстановления.

Этап снижения содержания реактивных сульфидов в композиции может включать приведение раствора в контакт с источником азота. Источник азота может включать газообразный азот, которым можно газировать композицию. Приведение в контакт также может включать барботаж композиции по меньшей мере одним газом из азота, воздуха и аргона. Приведение в контакт можно проводить в течение времени от около 1 минуты до около 240 минут. Приведение в контакт также может включать барботаж композиции газообразным азотом при скорости от около 10 кубических сантиметров в минуту до около 60 кубических сантиметров в минуту. Приведение в контакт также может включать смешивание композиции в присутствии газообразного азота при скорости, которая по меньшей мере на 200% превышает оптимальную скорость смешивания для этапа восстановления.

Этап приведения в контакт можно проводить при рН от около 5,0 до около 8,0. Приведение в контакт можно проводить при температуре от около 4°C до около 40°C. Приведение в контакт также можно проводить при температуре от около 15°C до около 40°C. Приведение в контакт также можно проводить при температуре около 20°C. Приведение в контакт также можно проводить при температуре около 30°C. Соотношение между площадью поверхности и объемом композиции может составлять около 2. Приведение в контакт может включать подачу газообразного азота по трубкам на стенку реакционного сосуда, содержащего композицию. Приведение в контакт может включать погружение в композицию барботажного камня, при этом барботажный камень имеет диаметр от около 1 см до около 1 метра.

Приведение в контакт может включать внесение в композицию газообразного азота во время этапа восстановления в течение времени, которое меньше времени проведения этапа восстановления. Этап приведения в контакт можно проводить в закрытом реакционном сосуде. Приведение в контакт также можно проводить в открытом реакционном сосуде так, чтобы реактивные сульфиды удалялись из композиции.

Приведение в контакт проводят в присутствии по меньшей мере одного из твина и противопенного агента. Твин может представлять собой по меньшей мере один из Твин-20 и Твин-80. Противопенный агент может представлять собой по меньшей мере один из противовспенивателя-A, противовспенивателя-C и полоксамера, такого как полиэтиленоксид.

Выделенный белок может представлять собой антитело или фрагмент антитела. Фрагмент антитела может представлять собой антигенсвязывающий фрагмент, включая, например, Fab, Fab', F(ab)₂, фрагмент Fv, диатело, одноцепочечное антитело, фрагмент scFv или scFv-Fc.

Антитело или фрагмент антитела может представлять собой антитело IgG. Антитело или фрагмент антитела также может представлять собой человеческое моноклональное антитело.

Антитело или фрагмент антитела может содержать константную область человеческого иммуноглобулина. Константная область может представлять собой константную область человеческого IgG. В конкретных вариантах реализации изобретения изотипом константной области IgG является IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

Сульфидные связи в антителе или фрагменте антитела находятся между тяжелыми и легкими цепями антитела или между тяжелыми цепями антитела, или как между тяжелыми и легкими цепями антитела, так и между тяжелыми цепями антитела. Антитело или фрагмент антитела может содержать константный домен легкой цепи. Константный домен легкой цепи может представлять собой константный домен каппа. Антитело также может представлять собой моноклональное антитело IgG1, которое содержит 4 межцепьевые сульфидные связи, включающие две сульфидные связи в шарнирной области, соединяющие тяжелые цепи, и одну сульфидную связь между каждой легкой цепью и тяжелой цепью.

Выделенный белок может представлять собой антитело, а этап восстановления может приводить к восстановлению только межцепьевых дисульфидных связей, но не внутрицепьевых связей.

Агент может представлять собой по меньшей мере один терапевтический агент, выбранный из химиотерапевтического агента, нуклеиновой кислоты, цитокина, иммуносупрессанта, радиоизотопа, антибиотика и терапевтического антитела. Агент также может представлять собой по меньшей мере один антитубулиновый агент, выбранный из ауристатина, алкалоида барвинка, подофиллотоксина, таксана, производного баккатина, криптофизина, майтанзиноида, комбретастатина и доластатина. Доластатин может быть ауристатином. Ауристатин также может быть монометилауристатином E (MMAE) или монометилауристатином F (MMAF).

Агент может представлять собой по меньшей мере один из агента, связывающегося с малой бороздкой ДНК, агента, алкилирующего малую бороздку ДНК, энедиина, лекситропсина, дуокармицина, таксана, пуромицина, доластатина, майтанзиноида и алкалоида барвинка.

Агент может представлять собой линкерный компонент, приспособленный для связывания по меньшей мере одной тиольной группы восстановленного белка с агентом. Линкерный компонент может представлять собой расщепляемый линкер или нерасщепляемый линкер. Линкерный компонент может представлять собой линкер, восприимчивый к расщеплению во внутриклеточных условиях. Линкерный компонент может представлять собой пептидный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой. Линкерный компонент может представлять собой дипептидный линкер. Дипептидный линкер может представлять собой валин-цитруллиновый (val-cit) или фенилаланин-лизиновый (phe-lys) линкер. Дипептидный линкер может представлять собой малеимидную функциональную группу, которая реагирует со свободными тиолами с образованием ковалентной связи.

Конъюгат белок-агент может представлять собой один из аCD22-val-cit-MMAE, аCD22-val-cit-MMAF, аLy6E-val-cit-MMAE, аLy6E-val-cit-MMAF, аCD79b-val-cit-MMAE, аCD79b-val-cit-MMAF, аNaPi2b-val-cit-MMAE, аNaPi2b-val-cit-MMAF, аMUC16-val-cit-MMAE, аMUC16-val-cit-MMAF, aSTEAP1 и аETBR.

В другом аспекте изобретения предложен способ преобразования трисульфидных связей в дисульфидные связи в выделенном антителе, включающий приведение по меньшей мере одного выделенного антитела, содержащего по меньшей мере одну трисульфидную связь, в растворе в контакт с TCEP при рН от около 5,5 до около 7,5 и приведение раствора в контакт с газообразным азотом. Затем выделенное антитело конъюгируют с ауристатином или его производным для образования конъюгата антитело-лекарственный препарат (ADC).

Дополнительные варианты реализации раскрытых способов и композиций приведены, по меньшей мере частично, в нижеследующем описании, могут стать понятными из описания или могут быть изучены путем практической реализации раскрытых способов и композиций. Вышеприведенное краткое описание и нижеследующее подробное описание являются типовыми и пояснительными и не ограничивают заявляемое изобретение.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1 иллюстрирует измерение димеров свободного лекарственного препарата методом ОФ-ВЭЖХ после проведения реакций частичного восстановления и последующих реакций конъюгации с применением промежуточных mAb-продуктов, имеющих разное процентное содержание трисульфидов. Фигура 1А иллюстрирует анализ свободного лекарственного препарата в рабочем конъюгационном пуле для аCD79b-vcMMAE, не содержащего трисульфиды в стартовом промежуточном mAb-продукте (контроль), а фигура 1В иллюстрирует такой же анализ для аCD22-vcMMAE, содержащего около 5-6% определяемых трисульфидов в стартовом промежуточном mAb-продукте.

Фигура 2 иллюстрирует измерение димеров свободного лекарственного препарата методом ОФ-ВЭЖХ после смены буфера частично восстановленных промежуточных mAb-продуктов, имеющих разное процентное содержание трисульфидов, перед конъюгацией с лекарственным препаратом. Фигура 2А иллюстрирует анализ свободного лекарственного препарата в рабочем конъюгационном пуле для аCD79b-vcMMAE, не содержащего трисульфиды в стартовом промежуточном mAb-продукте (контроль), а фигура 1В иллюстрирует такой же анализ для аCD22-vcMMAE, содержащего около 5-6% определяемых трисульфидов в стартовом промежуточном mAb-продукте.

Фигура 3 иллюстрирует влияние ускоренного смешивания во время частичного восстановления промежуточных mAb-продуктов, имеющих разное процентное содержание трисульфидов. Верхняя линия иллюстрирует анализ свободного лекарственного препарата в рабочем конъюгационном пуле для aMUC16-vcMMAE при скорости перемешивания во время восстановления 75 об/мин (контрольное целевое смешивание). Третья линия иллюстрирует такой же анализ димеров свободного лекарственного препарата, когда скорость смешивания во время реакции восстановления составляла 400 об/мин (быстрое смешивание). Средняя линия иллюстрирует анализ свободного лекарственного препарата для протокола скорости смешивания, в котором применяют 75 об/мин в течение 85 минул реакции восстановления и скорость смешивания 400 об/мин в течение последних 5 минут реакции восстановления (5 мин, быстрое смешивание, общее время восстановления: 90 минут). Фоновый контроль показан отдельной нижней линией, которая иллюстрирует анализ свободного лекарственного препарата для пустой буферной смеси.

Фигура 4 иллюстрирует влияние барботажа газом N2 во время частичного восстановления промежуточных mAb-продуктов, имеющих разное процентное содержание трисульфидов. Во время частичной реакции восстановления восстановительный пул газировали газообразным азотом непосредственно перед последующими реакциями конъюгации. Фигура 4А иллюстрирует свободный лекарственный препарат в рабочем конъюгационном пуле для aCD22-vcMMAE с (нижняя линия) и без (верхняя линия) барботажа N2 в течение последних 5 минут реакции частичного восстановления. Фигура 4В иллюстрирует анализ свободного лекарственного препарата в конъюгационном пуле для aLy6E-vcMMAE с (нижняя линия) и без (верхняя линия) барботажа N2 в течение последних 5 минут реакции частичного восстановления TCEP.

Подробное описание изобретения

Далее будут подробно описаны типовые варианты реализации изобретения. Хотя изобретение будет описано в сочетании с пронумерованными вариантами реализации, следует понимать, что изобретение не ограничено этими вариантами реализации. Наоборот, предполагается, что изобретение включает все альтернативные варианты, модификации и эквивалентные варианты, которые могут быть включены в объем настоящего изобретения, определяемый формулой изобретения.

Специалисту в данной области техники известно много способов и материалов, аналогичных или эквивалентных описанным в данном документе, которые можно применять и которые входят в объем практический реализации настоящего изобретения. Настоящее изобретение никаким образом не ограничено описанными способами и материалами.

Определения

Если не указано иное, употребляемые в данном документе технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно подразумевается специалистом в области техники, к которой относится данное изобретение. Хотя для практической реализации или тестирования изобретения можно применять любые способы, устройства и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, далее описаны предпочтительные способы, устройства и материалы.

В контексте данной заявки, включая прилагаемую формулу изобретения, форма единственного числа включает множественное число, если иное четко не следует из контекста, и данные формы употребляются взаимозаменяемо с «по меньшей мере один» или «один или более». Таким образом, выражение «полинуклеотид» включает множество полинуклеотидов или генов и тому подобное.

Употребляемый в данном документе термин «около» представляет несущественную модификацию или вариацию числового значения, такую, что основная функция предмета, к которому относится числовое значение, остается неизменной.

Подразумевается, что употребляемые в данном документе термины «содержит», «содержащий», «включает», «включающий» и любые их вариации включают неисключающее указание так, что процесс, способ, определяемый способом получения продукт или композиция материалов, которые содержат или включают элемент или перечень элементов, включают не только эти элементы, но могут включать другие элементы, явно не приведенные или не присущие такому процессу, способу, определяемому способом получения продукту или композиции материалов.

В данном документе ссылки на любой числовой диапазон (например, диапазон дозировок) явным образом включают каждое числовое значение (включая дробные числа и целые числа), попадающее в этот диапазон. Например, приведенная в данном документе ссылка на диапазон «меньше, чем х» (где х – конкретное число) включает целые числа x-1, x-2, x-3, x-4, x-5, x-6 и т.д. и дробные числа x-0,1, x-0,2, x-0,3, x-0,4, x-0,5, x-0,6 и т.д. В другой иллюстрации приведенная в данном документе ссылка на диапазон от «x до y» (где х – конкретное число, и у – конкретное число) включает каждое целое число от x, x+1, x+2… до y-2, y-1, y, а также каждое дробное число, такое как от x+0,1, x+0,2, x+0,3… до y-0,2, y-0,1. В другом примере термин «по меньшей мере 95%» включает каждое числовое значение (включая дробные числа и целые числа) от 95% до 100%, включая, например, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100%.

Под «терапевтическим» агентом подразумевается соединение или композиция, эффективные для выработки желательного терапевтического ответа у индивида.

Белки, подходящие для применения в способах настоящего изобретения, включают белки естественного или синтетического (т.е. рекомбинантного) происхождения, а способы в соответствии с изобретением можно применять в отношении белков, выделенных из любого источника, например, из растения или животного. Белки могут представлять собой терапевтические белки, определенные выше, и обычно содержат одну или более дисульфидных связей и одну или более трисульфидных связей. Типовые белки включают супероксиддисмутазу, интерлейкин, гормоны роста и антитела или фрагменты антител.

Реактивные сульфиды могут включать сульфид водорода (H₂S) и/или его депротонированные формы (т.е. HS⁻ и/или S₂⁻).

«Трисульфидные связи» образуются путем вставки дополнительного атома серы в дисульфидную связь, тем самым приводя к ковалентному связыванию трех последовательных атомов серы. Трисульфидные связи могут образовываться между остатками цистеина в белках и могут образовываться внутримолекулярно (т.е. между двумя цистеинами одного белка) или межмолекулярно (т.е. между двумя цистеинами разных белков). В случае антител, таких как антитела IgG1, две внутримолекулярные дисульфидные связи соединяют вместе тяжелые цепи, а также внутримолекулярные дисульфидные связи соединяют каждую тяжелую и легкую цепи. Аналогично, молекулы IgG2 содержат три внутримолекулярные дисульфидные связи, которые соединяют тяжелые цепи, а молекулы IgG3 содержат 6-16 внутримолекулярных дисульфидных связей, которые соединяют тяжелые цепи. Трисульфидные модификации могут возникать в любом из этих дисульфидных соединений, но более часто возникают в соединении тяжелая-легкая цепь (HL), чем в соединении тяжелая-тяжелая цепь (HH).

Считается, что химическое восстановление трисульфидных связей в белках высвобождает реактивные сульфидные молекулы, которые могут индуцировать образование димеров лекарственного препарата и белка или других нежелательных и потенциально опасных производных. Хотя не всегда возможно предотвратить образование трисульфидной связи или удалить все существующие трисульфидные связи в белке, авторы настоящего изобретения обнаружили, что возможно снизить или устранить образование примесей в лекарственном препарате и/или белке (т.е. нежелательных продуктов химических реакций) во время восстановления белка в реакциях конъюгации. Способ снижения количества или устранения этих нежелательных продуктов химических реакций включает удаление реактивных сульфидных молекул из жидкой среды химической реакции.

Восстановление выделенных белков

Белки, содержащие дисульфидные и трисульфидные связи, применяемые в способах настоящего изобретения, можно получить различными способами, которые включают, но не ограничиваются этим, выделение из естественного источника (в случае белков природного происхождения), методы получения рекомбинантных белков, которые могут включать сайт-направленный (или олигонуклеотид-опосредованный) мутагенез и кассетный мутагенез ранее приготовленной ДНК, кодирующей полипептид. Протоколы, наборы и реагенты для мутагенеза являются коммерчески доступными, например, как набор для мультисайт-направленного мутагенеза QuikChange™ (Stratagene, La Jolla, Calif.).

Выделенные белки можно химически синтезировать, применяя известный метод олигопептидного синтеза, или можно получать и очищать, применяя рекомбинантную технологию. Соответствующую аминокислотную последовательность или ее части можно получить с помощью прямого пептидного синтеза с применением твердофазного метода (Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, (1969) W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif.; Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154). In vitro синтез белков можно проводить вручную или с помощью автоматизированных методов. Автоматизированный твердофазный синтез можно осуществлять, например, применяя защищенные t-BOC или Fmoc аминокислоты и используя синтезатор пептидов от Applied Biosystems (Foster City, Calif.), следуя инструкциям производителя. Различные части выделенного белка можно отдельно синтезировать химическим путем и комбинировать химическими или ферментативными методами для получения желаемого выделенного белка для применения в способах данного изобретения.

Кроме того, в способах данного изобретения в качестве выделенного белка можно применять фрагменты белков, включая фрагменты антител. Традиционно фрагменты антител получают путем протеолитического расщепления интактных антител (Morimoto et al (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; и Brennan et al (1985) Science, 229:81) или получают непосредственно из рекомбинантных клеток-хозяев. Фрагменты Fab, Fab', F(ab)₂, Fv, диатело, одноцепочечное антитело, фрагменты scFv или фрагменты антитела scFv-Fc можно экспрессировать и секретировать в E. coli, обеспечивая, таким образом, простое получение больших количеств этих фрагментов. Фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител. В альтернативном варианте фрагменты Fab'-SH можно выделять непосредственно из E. coli и проводить химическое сопряжения для образования фрагментов F(ab')₂ (Carter et al (1992) Bio/Technology 10:163-167) или выделять непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Антитело может представлять собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv). Фрагмент антитела также может быть «линейным антителом» (патент США № 5641870). Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими. Антитело или фрагмент антитела может представлять собой антитело IgG. Антитело может быть человеческим моноклональным антителом.

Выделенное антитело также может быть цистеин-сконструированным антителом, которое делает возможным получение конъюгированных соединений антител, таких как конъюгированные соединения антитело-лекарственный препарат (ADC), в которых лекарственные молекулы находятся в определенных, сконструированных, выбранных участках. Реактивные остатки цистеина на поверхности антитела позволяют осуществлять специфическую конъюгацию с лекарственным компонентом посредством реагирующих с тиолом групп, таких как малеимид или галоацетил. Нуклеофильная реактивность функциональной группы тиола с остатком Cys в отношении малеимидной группы в около 1000 раз выше по сравнению с любой другой аминокислотной функциональной группой в белке, такой как аминогруппа остатков лизина или N-концевая аминогруппа. Тиол-специфическая функциональная группа в реагентах йодоацетила и малеимида может реагировать с аминогруппами, но при этом требуется более высокий уровень pH (>9,0) и большее время реакции (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London).

В вариантах реализации изобретения, в которых применяют антитела, содержащие ди- и трисульфидные связи, антитело может содержать только одну или несколько сульфидных связей, которые могут быть восстановлены с образованием достаточно реактивных тиольных групп, посредством которых возможна конъюгация с лекарственным препаратом. Белок может представлять собой моноклональное антитело IgG1, которое содержит всего 4 межцепьевых дисульфида: два в шарнирной области, соединяющие тяжелые цепи, и по одному между каждой тяжелой цепью и легкой цепью вблизи области Fab. Каждая восстановленная дисульфидная связь приводит к образованию двух свободных тиолов, доступных для конъюгации с лекарственным препаратом. Восстановление таких промежуточных продуктов антител в неденатурирующих условиях, как правило, восстанавливает только межцепьевую дисульфидную связь, но не затрагивает внутрицепьевые связи. Таким образом, полное восстановление межцепьевых дисульфидных связей приводит к получению всего 8 молей свободных тиолов на моль промежуточного продукта антитела IgG1.

Антитело может содержать константную область человеческого иммуноглобулина. Антитело или фрагмент антитела может содержать константную область человеческого IgG, а изотипом константной области IgG может быть IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В конкретных вариантах реализации изобретения изотипом константной области IgG является IgG1.

Сульфидные связи, присутствующие в антителе или фрагменте антитела, находятся между тяжелыми и легкими цепями антитела, или между тяжелыми цепями антитела, или как между тяжелыми и легкими цепями антитела, так и между тяжелыми цепями антитела. Антитело или фрагмент антитела может содержать константный домен легкой цепи. Константный домен легкой цепи может представлять собой константный домен каппа. Антитело также может представлять собой моноклональное антитело IgG1, которое содержит 4 межцепьевые сульфидные связи, включающие две сульфидные связи в шарнирной области, соединяющие тяжелые цепи, и одну сульфидную связь между каждой легкой цепью и тяжелой цепью.

Как правило, только подгруппа сульфидных связей в белке находится в виде трисульфидных связей. От около 1% до около 20% сульфидных связей в выделенном белке могут быть трисульфидными связями, в альтернативном варианте от около 1% до около 18%, от около 2% до около 16%, от около 3% до около 12%, от около 4% до около 10% или от около 5% до около 7% сульфидных связей в выделенном белке являются трисульфидными связями. По меньшей мере около 80% трисульфидных связей в выделенном белке могут быть восстановлены на этапе восстановления, в альтернативном варианте по меньшей мере около 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% трисульфидных связей в выделенном белке восстанавливаются на этапе восстановления.

Выделенные белки, включая антитела, восстанавливают в частично или полностью восстановительных условиях, чтобы получить реактивные цистеиновые тиольные группы. Восстанавливающий агент может включать по меньшей мере один из дитиотреитола (DTT), бета-меркаптоэтанола (βME), трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP), цистеина, L-цистеина, восстановленного глутатиона (GSH) и L-GSH. Когда в этих способах применяют антитела, восстанавливающим агентом предпочтительно является один или оба из дитиотреитола (DTT) и трикарбонилэтилфосфина (TCEP), а реакцию восстановления проводят в неденатурирующих условиях. TCEP, как правило, используют в реакции восстановления в заданном молярном соотношении между TCEP и выделенным белком. Как правило, TCEP добавляют в реакцию в молярном избытке по отношению к выделенному белку. TCEP можно добавлять в реакцию восстановления в концентрации от около 0,1 до около 8 мМ; от около 0,1 до около 5 мМ; от около 0,1 до около 3 мМ; от около 0,1 до около 1 мМ; около 8 мМ; около 5 мМ; около 3 мМ; около 1 мМ; или около 0,5 мМ. При применении выделенных антител после этапа восстановления, как правило, от около 4 до около 8 молей тиольных компонентов на каждый моль восстановленного выделенного белка становятся доступными для конъюгации с агентом.

Реакцию восстановления можно проводить при pH ниже pH 7, что может включать pH от около pH 5 до около pH 8, или от около pH 5,5 до около pH 7,5, или от около pH 6 до около pH 7, или при pH около 5,5, или при pH около 6,5.

Реакцию восстановления можно проводить в течение времени, составляющего по меньшей мере около 5 минут, около 10 минут, около 20 минут, около 30 минут, около 40 минут, около 50 минут, около 60 минут, около 90 минут, около 2 часов, около 3 часов, около 4 часов или около 5 часов. Время реакции восстановления может составлять менее чем около 24 часов, менее чем около 20 часов, менее чем около 12 часов или менее чем около 6 часов. Реакцию восстановления также можно проводить в течение около 1 часа.

Реакция восстановления приводит к получению композиции, которая содержит восстановленный белок, содержащий по меньшей мере одну тиольную группу, к которой можно присоединять агент. Кроме того, если перед этапом восстановления в выделенном белке присутствовали трисульфидные связи, полученная в результате композиция также будет содержать реактивный(е) сульфид(ы).

Содержание реактивного сульфида в композиции, получаемой посредством реакции восстановления, может быть снижено путем доведения рН композиции до pH от около 5,0 до около 6,0, или pH от около 5,2 до около 5,8, или путем доведения рН композиции до pH около pH 5,5. Проведение реакции восстановления при слабокислом рН может снижать общую эффективность реакции восстановления, но эти слабокислые условия реакции также снижают содержание реактивного сульфида в композиции. В альтернативном варианте рН композиции можно доводить от нейтрального pH около 7,0 до слабокислого pH от около 5,0 до около 6,0 после завершения реакции восстановления.

На выбор рН в реакции восстановления также влияют другие факторы, такие как стабильность выделенного белка в отношении образования других нежелательных его производных (например, димеров или высших олигомеров, деамидированных форм, сульфоксидированых форм и т.д.), предотвращение осаждения и так далее, и в то же время ищутся пути минимизации содержания реактивного сульфида в композиции.

Содержание реактивного сульфида в композиции, получаемой посредством реакции восстановления, также может быть снижено путем замещения определенной части жидкости в композиции свежей или новой жидкостью, имеющей существенно сниженное или отсутствующее содержание реактивного сульфида, что тем самым снижает содержание реактивного сульфида во всей композиции. Это можно осуществить путем связывания восстановленного белка в композиции с твердой подложкой, а затем промывки восстановленных белков на одном или более этапах промывки. Восстановленные белки в композиции, связанные с твердой подложкой, можно промывать водной средой, которая может включать один или более из буфера, стабилизирующего агента, регулирующего рН агента, денатурирующего белок агента и тому подобного. Например, можно применять промывку ФСБ после связывания восстановленного белка с твердой подложкой, тем самым вымывая некоторые или все молекулы реактивного сульфида, присутствующие в композиции после реакции восстановления. Промывку также можно использовать, например, для очистки от других примесей. Промывку высокосолевым буферным раствором также можно использовать для облегчения очистки от примесей, например, после проведения связывания композиции, содержащей восстановленный белок, с твердой подложкой. Также можно использовать несколько промывок разными жидкостями. Например, промывку высокосолевым раствором можно комбинировать с промывкой, предназначенной для замещения буфера, присутствующего в композиции, или для доведения рН композиции перед этапом конъюгации лекарственного препарата с восстановленным белком. В дополнительном или альтернативном варианте промывку можно применять после связывания восстановленного белка с твердой подложкой, чтобы удалить из белка восстанавливающий агент, когда реакция восстановления считается завершенной. В дополнительном или альтернативном варианте другую промывку, например, промывку низкой концентрацией соли, можно применять для облегчения эффективной диссоциации, например, элюирования, восстановленного белка с твердой подложки. По меньшей мере 90% композиции, содержащей восстановленный белок, можно замещать заместительным раствором, в котором отсутствует реактивный сульфид.

Твердая подложка может включать по меньшей мере один элемент из фильтрующей мембраны, избирательно проницаемой мембраны и хроматографической смолы. Типовые фильтрующие мембраны могут включать мембраны для поперечноточной фильтрации (также известной как тангенциальная фильтрация; TFF) или мембраны для тупиковой фильтрации. Типовые избирательно проницаемые мембраны могут включать мембраны для диализа, обессоливания и замены буфера.

Содержание реактивного сульфида в композиции, получаемой посредством реакции восстановления, снижают путем повышения скорости смешивания компонентов реакции восстановления. Такая повышенная скорость смешивания может позволить молекулам реактивного сульфида избежать реакции, когда газ пропускают через открытое отверстие реактора.

Для этих реакций восстановления, как правило, установлена оптимальная скорость смешивания, при этом происходит полное или частичное экономичное и эффективное восстановление трисульфидных и дисульфидных связей, присутствующих в выделенном белке, до среднего целевого уровня доступных тиольных компонентов для последующей конъюгации с лекарственными молекулами. Скорость смешивания может быть повышена для всего или по меньшей мере части времени реакции восстановления, чтобы повысить удаление реактивных сульфидных молекул из композиции, образуемой во время реакции восстановления. Например, скорость смешивания может быть повышена по меньшей мере на 10%, 20%, 40%, 80%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% или 550% по сравнению с максимальной скоростью смешивания, установленной для реакции восстановления. В другом примере скорость смешивания может быть повышена в 2 раза, три раза, 4 раза или 5 раз по сравнению с максимальной скоростью смешивания, установленной для реакции восстановления. Скорость смешивания также может быть повышена по сравнению с максимальной скоростью смешивания, установленной для реакции восстановления, в течение времени, меньшего, чем время проведения реакции восстановления. Скорость смешивания может быть повышена только во время последней части проведения реакции восстановления. Например, скорость смешивания может быть повышена только во время последней половины проведения реакции восстановления. В альтернативном варианте скорость смешивания может быть повышена только во время последних 40%, 30%, 20%, 10% или 5% времени проведения реакции восстановления. В конкретном примере реакцию восстановления проводят в течение 90 минут, а скорость смешивания повышают на около 200%-500% в течение последних 5 минут реакции восстановления. Скорость смешивания также может быть повышена только во время начала проведения реакции восстановления. Например, скорость смешивания может быть повышена только во время первой половины проведения реакции восстановления. Например, скорость смешивания может быть повышена только во время первых 40%, 30%, 20%, 10% или 5% времени проведения реакции восстановления. В конкретном примере реакцию восстановления проводят в течение 90 минут, а скорость смешивания повышают на около 200%-500% в течение первых 5 минут реакции восстановления.

Содержание реактивного сульфида в композиции, получаемой посредством реакции восстановления, может быть снижено путем приведения композиции, образуемой во время реакции восстановления, в контакт с источником азота.

Источник азота может включать газообразный азот, а также воздух и/или аргон. Источник азота также может включать «благородные газы» (такие как гелий (He), неон (Ne), аргон (Ar), криптон (Kr) и ксенон (Xe)), а именно гелий и аргон.

Способ приведения композиции, образуемой во время реакции восстановления, в контакт с источником азота можно осуществлять, например, пропуская содержащий азот газ через жидкую композицию (например, направляя поток пузырьков газа в среду) с или без перемешивания или смешивания другим образом, или другими способами, создающими большую поверхность раздела жидкая фаза/газовая фаза, при которой может возникать диффузия газа между фазами.

Параметры, которые можно корректировать с целью снижения содержания реактивных сульфидных молекул в композиции, включают длительность контакта между содержащим азот газом и жидкой композицией, скорость внесения/пропускания содержащего азот газа через жидкую композицию, скорость смешивания композиции с содержащим азот газом, рН жидкой среды, температуру жидкой композиции и/или содержащего азот газа, площадь поверхности контакта между газовой фазой и жидкой фазой и объем применяемого содержащего азот газа. Кроме того, содержащий азот газ можно приводить в контакт с жидкой композицией посредством барботажного камня, в случае чего расположение и размер барботажного камня также являются параметрами, которые могут влиять на снижение количества или удаление реактивных сульфидных молекул из композиции.

Длительность контакта между содержащим азот газом и жидкой композицией предпочтительно соответствует времени, достаточному для снижения или устранения наличия реактивных сульфидных молекул в композиции. Оно может составлять, например, от около 1 минуты до около 240 минут. Содержащий азот газ можно приводить в контакт с композицией реакции восстановления в течение всей реакции восстановления. Содержащий азот газ также можно приводить в контакт с композицией реакции восстановления в течение только части времени проведения реакции восстановления. Содержащий азот газ также можно приводить в контакт с композицией реакции восстановления после того, как реакция восстановления считается завершенной или остановленной другими способами, такими как замена буфера для удаления восстановителя из композиции или путем гашения с помощью агента, вносимого в композицию для остановки реакции восстановления. Содержащий азот газ также можно приводить в контакт с композицией реакции восстановления только в течение первой части времени проведения реакции восстановления. Например, содержащий азот газ также можно приводить в контакт с композицией реакции восстановления в течение первых 40%, 30%, 20%, 10% или 5% времени проведения реакции восстановления. Содержащий азот газ можно приводить в контакт с композицией реакции восстановления в течение периода, составляющего около 30 минут, около 60 минут или около 90 минут.

Скорость внесения или пропускания содержащего азот газа через жидкую композицию может включать регулируемую скорость внесения содержащего азот газа в жидкую композицию реакции восстановления, достаточную для того, чтобы существенно снизить или устранить наличие реактивных сульфидных молекул в композиции. Содержащий азот газ можно вносить в композицию при скорости от около 10 кубических сантиметров в минуту до около 60 кубических сантиметров в минуту. Содержащий азот газ можно вносить в композицию при скорости от около 5 литров в час до около 30 литров в час, от около 10 л/ч до около 25 л/ч или от около 15 л/ч до около 20 л/ч. Содержащий азот газ можно вносить в композицию при скорости от около 0,25 до около 1 (объем газа/объем жидкости/минута).

Скорость смешивания композиции с содержащим азот газом может представлять собой скорость смешивания, достаточную для приведения практически всей композиции реакции восстановления в контакт с содержащим азот газом, тем самым обеспечивая существенное снижение числа или удаление реактивных сульфидных молекул, присутствующих в композиции. Скорость смешивания реакции восстановления во время этапа приведения композиции в контакт с содержащим азот газом может быть по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200%, 300% или 400% большей, чем оптимальная скорость смешивания для реакции восстановления. Скорость смешивания реакции восстановления во время этапа приведения композиции в контакт с содержащим азот газом может быть на 200% большей, чем оптимальная скорость смешивания для реакции восстановления.

pH реакции восстановления в течение периода времени, когда содержащий азот газ приводят в контакт с композицией, может соответствовать оптимальному диапазону рН для проведения реакции восстановления до желаемой конечной точки, соответствующей восстановлению некоторой части или всех сульфидных связей, присутствующих в выделенном белке. Этот диапазон pH можно корректировать, чтобы поддерживать хороший выход реакции восстановления и в то же время существенно снижать количество или удалять активные реагирующие между собой молекулы, присутствующие в композиции, в сочетании с приведением композиции в контакт с содержащим азот газом. pH реакции восстановления можно поддерживать в диапазоне pH от около pH 4,0 до около pH 9,0 в то время, когда содержащий азот газ приводят в контакт с композицией реакции восстановления. pH реакции восстановления также можно поддерживать в диапазоне pH от около pH 5,0 до около pH 8,0 в то время, когда содержащий азот газ приводят в контакт с композицией. pH реакции восстановления также можно поддерживать в слабокислом диапазоне pH от около pH 5,0 до около pH 6,0 в то время, когда содержащий азот газ приводят в контакт с композицией.

Температуру жидкой композиции реакции восстановления и содержащего азот газа можно поддерживать в температурном диапазоне, оптимальном для реакции восстановления. Этот температурный диапазон можно модифицировать, чтобы поддерживать хороший выход реакции восстановления и в то же время существенно снижать количество или удалять реактивные сульфидные молекулы в композиции реакции восстановления в сочетании с внесением содержащего азот газа в композицию. Температуру жидкой композиции реакции восстановления можно поддерживать при температуре от около 4°C до около 40°C в то время, когда содержащий азот газ приводят в контакт с композицией. Температуру жидкой композиции реакции восстановления также можно поддерживать при температуре от около 15°C до около 40°C. Температуру жидкой композиции реакции восстановления также можно поддерживать при температуре около 20°C или около 30°C.

Реакционные условия реакции восстановления в то время, когда содержащий азот газ приводят в контакт с реакционной композицией, можно корректировать, чтобы поддерживать площадь поверхности контакта между азотсодержащей газовой фазой и жидкой реакционной фазой в диапазоне, который существенно снижает или устраняет реактивные сульфидные молекулы, присутствующие в реакционной композиции. Соотношение площади поверхности содержащего азот газа к объему композиции составляет от около 0,1 до около 3. Соотношение площади поверхности содержащего азот газа к объему композиции может составлять около 2. Объем содержащего азот газа, вносимого в жидкую композицию реакции восстановления, регулируют, чтобы поддерживать оптимальные скорость и соотношение между площадью поверхности и объемом компонентов жидкой реакции с целью существенного снижения или устранения реактивных сульфидных молекул в композиции реакции восстановления.

Кроме того, содержащий азот газ можно регулируемо приводить в контакт с жидкой композицией реакции восстановления с помощью устройства, генерирующего пузырьки газа определенного размера. Например, содержащий азот газ можно вносить с помощью воздуха или «барботажного» камня или перфорированного фильтровального диска. Барботажные камни из инертных металлов можно использовать повторно и можно очищать путем промывки кислотой/основанием и стерилизовать автоклавированием. Барботажный камень может быть ориентирован в жидкой композиции реакции восстановления вертикально, так, что образуемые пузырьки могут подниматься непосредственно в реакционную жидкость. Барботажный камень может представлять собой барботажный камень из нержавеющей стали, имеющей отверстия размером около 2 микрон. Барботажный камень может иметь поры, которые генерируют пузырьки воздуха диаметром <1 мм при скорости потока до 5 л/мин. Скорость потока можно регулировать с помощью регулятора потока массы, размещенного выше барботажного камня.

Внесение содержащего азот газа при определенных скоростях потока и в определенных условиях смешивания может приводить к образованию пены в композиции реакции восстановления, что может снижать эффективность и/или степень реакции восстановления. Следовательно, когда содержащий азот газ вносят в реакцию восстановления, реакцию можно проводить в присутствии твина и/или противопенного агента. Реакцию восстановления можно проводить в присутствии твина, который представляет собой по меньшей мере один из Твин-20 и Твин-80. Реакцию восстановления также можно проводить в присутствии противопенного агента, который представляет собой по меньшей мере один из противовспенивателя-А, противовспенивателя-С и полоксамеров, таких как полиэтиленоксид.

Конъюгация восстановленных белков

Предназначенный для конъюгации с белком терапевтический агент можно непрямо конъюгировать с аминокислотной боковой цепью восстановленного белка или активированной аминокислотной боковой цепью, или сконструированным в белке цистеином и тому подобным посредством линкера. Например, частично восстановленное антитело можно конъюгировать с биотином, а агент можно конъюгировать с авидином или стрептавидином или наоборот. Биотин избирательно связывается со стрептавидином и, таким образом, агент может быть конъюгирован с антителом таким непрямым образом.

Линкерные компоненты для лекарственных препаратов и способы конъюгации раскрыты в публикации согласно РСТ № WO 2004/010957, патентах США № 7659241, 7829531 и 7851437, которые включены в данный документ посредством ссылки.

Частично восстановленные антитела, полученные способом данного изобретения, также можно химически модифицировать путем ковалентной конъюгации с агентами, которые могут повысить их время полужизни в циркуляции, включая, например, полимеры. Типовые полимеры и способы присоединения их к пептидам проиллюстрированы в патентах США № 4766106, 4179337, 4495285 и 4609546, которые включены в данный документ посредством ссылки. Полимеры могут включать полиоксиэтилированные полиолы и полиэтиленгликоль (ПЭГ) (например, ПЭГ с молекулярной массой от около 1000 до около 40000, например, от около 2000 до около 20000).

Агент может представлять собой терапевтический агент, выбранный из химиотерапевтического агента, нуклеиновой кислоты, цитокина, иммуносупрессанта, радиоизотопа, антибиотика и терапевтического антитела. Терапевтический также может представлять собой химиотерапевтический агент. Химиотерапевтический агент может представлять собой по меньшей мере один антитубулиновый агент, выбранный из ауристатина, алкалоида барвинка, подофиллотоксина, таксана, производного баккатина, криптофизина, майтанзиноида, комбретастатина и доластатина. Химиотерапевтический агент может представлять собой по меньшей мере один из ауристатина, агента, связывающегося с малой бороздкой ДНК, агента, алкилирующего малую бороздку ДНК, энедиина, лекситропсина, дуокармицина, таксана, пуромицина, доластатина, майтанзиноида и алкалоида барвинка. Химиотерапевтический агент может представлять собой доластатин и, в частности, ауристатин, и, в конкретных случаях, – монометилауристатин E (MMAE) или монометилауристатин F (MMAF).

Агент, конъюгированный по меньшей мере с одной тиольной группой восстановленного белка, может образовывать конъюгат антитело-лекарственный препарат (ADC), включая, таким образом, как антитело, так и лекарственный препарат, которые могут быть конъюгированы друг с другом посредством линкера.

Подходящие линкеры для применения в конъюгации лекарственных препаратов с восстановленными антителами при образовании ADC в соответствии со способами данного изобретения включают линкеры, которые расщепляются во внутриклеточных условиях так, что расщепление линкера приводит к высвобождению единицы лекарственного препарата из антитела во внутриклеточную среду. В альтернативном варианте линкер может быть нерасщепляемым, а высвобождение лекарственного препарата происходит, например, посредством разрушения антитела. В альтернативном варианте линкер расщепляется расщепляющим агентом, который присутствует во внутриклеточной среде (например, в лизосоме или эндосоме). Таким образом, линкер может представлять собой пептидильный линкер, который расщепляется внутриклеточным ферментом пептидазой или протеазой, включая, но не ограничиваясь этим, лизосомную или эндосомную протеазу. Длина пептидильного линкера может составлять по меньшей мере две аминокислоты или по меньшей мере три аминокислоты. Расщепляющие агенты могут включать катепсины В и D и плазмин, которые все, как известно, гидролизуют дипептидные производные лекарственного препарата, что приводит к высвобождению активного лекарственного препарата в клетки-мишени (смотрите, например, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Пептидильный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, может представлять собой линкер Val-Cit (валин-цитруллин) или линкер Phe-Lys (фенилаланин-лизин) (смотрите, например, патент США № 6214345, в котором описан синтез доксорубицина с линкером Val-Cit и разные примеры линкеров Phe-Lys). Линкер может представлять собой малеимидную функциональную группу, которая реагирует со свободными тиолами с образованием ковалентной связи.

Этап конъюгации агента по меньшей мере с одной тиольной группой восстановленного белка можно применять для конъюгации противоракового терапевтического агента с антителом с образованием по меньшей мере одного из aCD22-val-cit-MMAE, aCD22-val-cit-MMAF, aLy6E-val-cit-MMAE, aLy6E-val-cit-MMAF, aCD79b-val-cit-MMAE, aCD79b-val-cit-MMAF, aNaPi2b-val-cit-MMAE, aNaPi2b-val-cit-MMAF, aMUC16-val-cit-MMAE, aMUC16-val-cit-MMAF, sSTEAP1 и aETBR.

В одном типовом варианте реализации способов согласно изобретению представлен способ преобразования трисульфидных связей в выделенном антителе посредством приведения в контакт по меньшей мере одного выделенного антитела, содержащего по меньшей мере одну трисульфидную связь и по меньшей мере одну дисульфидную связь, в растворе с TCEP при pH от около pH 5,5 до около pH 7,5 и приведение раствора в контакт с газообразным азотом, и конъюгацию ауристатина или его производного с восстановленным антителом для образования конъюгата антитело-лекарственный препарат (ADC).

Примеры

Следующие примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

В этом примере описано образование димеров лекарственного препарата во время восстановления и конъюгации антитела (анти-CD79b или анти-CD22), имеющего различное содержание трисульфидов, с противораковым доластатином (MMAE) посредством линкера Val-Cit (валин-цитруллин). Эти данные демонстрируют, что в этой модельной системе образование димеров лекарственного препарата связано с содержанием трисульфидов в общем объеме промежуточных mAb-продуктов.

Промежуточные mAb-продукты (анти-CD79b или анти-CD22), имеющие разное процентное содержание трисульфидных связей, были частично восстановлены с помощью TCEP, а последующие реакции конъюгации проводили с соединением линкер-лекарственный препарат vcMMAE.

Неконъюгированные mAb (>5 г/л) доводили до pH в диапазоне pH 5,5 – 7,5. После определения концентрации белка рН-доведенные образцы восстанавливали, используя заданное соотношение TCEP:mAb (из 10 мМ маточного раствора TCEP в воде) для целевого времени восстановления, составляющего 90 минут, при комнатных температурах. Частично восстановленные mAb незамедлительно конъюгировали, используя избыток необходимого малеимид-содержащего соединения линкер-лекарственный препарат. Непрореагировавшее соединение линкер-лекарственный препарат гасили избытком соотношения N-ацетилцистеин (NAC): линкер-лекарственный препарат (из 10 мМ маточного раствора NAC в воде), а pH доводили до соответствия условиям рН лекарственного состава. В случае необходимости проводили замену буфера конъюгированного образца на буфер лекарственного состава, чтобы удалить остатки растворителя и свободные лекарственные молекулы, которые потенциально могут мешать последующему анализу образца. Содержание свободного лекарственного препарата в восстановленной и конъюгированной композиции анализировали с помощью ОФ-ВЭЖХ.

Как показано на фигуре 1A, анализ ОФ-ВЭЖХ не выявил димеров лекарственного препарата в рабочем конъюгационном пуле в случае конъюгата aCD79b-vcMMAE, образуемого из общего объема mAb, не содержащего трисульфидов в исходных mAb. Как показано на фигуре 1B, димеры лекарственного препарата (димеры vcMMAE) выявляются во время анализа рабочего конъюгационного пула в случае aCD22-vcMMAE, содержащего около 5-6% определяемых трисульфидов в исходном промежуточном mAb-продукте.

Пример 2

В этом примере описан анализ замены буфера после восстановления частично восстановленного белка в качестве средства снижения или устранения образования димеров лекарственного препарата в последующей реакции конъюгации. Эти данные демонстрируют, что в этой модельной системе замена буфера частично восстановленных промежуточных mAb-продуктов перед конъюгацией с vcMMAE снижает образование димеров лекарственного препарата.

После частичного восстановления с помощью TCEP, как описано в Примере 1, проводили замену буфера восстановленного белкового пула с помощью центрифужных устройств для замены буфера (CENTIRCON™). Во время замены буфера с помощью Centricon воду (буфер) и низкомолекулярные растворенные вещества пропускают через мембранный фильтр с номинальным отсечением по молекулярной массе и собирают с другой стороны (фильтрат). Восстановленный белок остается на мембране со стороны образца (ретентат), где происходит его концентрирование до меньшего объема, когда воду пропускают через мембрану на противоположную сторону. Центрифужные фильтровальные устройства Centricon с номинальным отсечением по молекулярной массе 10 - 30 кДа применяли в соответствии с инструкциями производителя. Белок, частично восстановленный с помощью TCEP (~1 - 3 мл), как описано в Примере 1, добавляли в одно устройство Centricon и разводили 10 мM Трис, pH 7,5, до конечного объема 10 мл в устройстве. Устройство Centricon центрифугировали при 4500 g в течение 20 минут. Для образца ретентата из устройства Centricon дополнительно проводили обмен буфера 2 дополнительными прогонами по 10 мл 10 мМ Трис, pH 7,5, перед выделением прошедшего замену буфера белка. Прошедший замену буфера частично восстановленный белок выделяли из устройства Centricon и использовали в последующей конъюгации.

После замены буфера частично восстановленный промежуточный mAb-продукт конъюгировали с vcMMAE, а содержание димеров свободного лекарственного препарата определяли с помощью ОФ-ВЭЖХ, как описано в Примере 1. Как показано на фигуре 2A, анализ ОФ-ВЭЖХ рабочего конъюгационного пула для конъюгата антитело-лекарственный препарат (ADC) aCD79b-vcMMAE показал образование димеров свободного лекарственного препарата (димеров vcMMAE). Но, как показано на Фигуре 2B, во время анализа ОФ-ВЭЖХ рабочего конъюгационного пула для того же aCD22-vcMMAE ADC после замены буфера частично восстановленного промежуточного белкового mAb-продукта не было выявлено димеров свободного лекарственного препарата.

Пример 3

В этом примере описан анализ повышения скорости смешивания реакции во время частичного восстановления белка как средства снижения или устранения образования димеров лекарственного препарата в последующей реакции конъюгации. Эти данные демонстрируют, что в этой модельной системе повышение скорости смешивания в течение по меньшей мере части времени реакции восстановления промежуточных mAb-продуктов перед конъюгацией с vcMMAE может снижать образование димеров лекарственного препарата.

Во время частичного восстановления промежуточного mAb-продукта (анти-MUC16) с помощью TCEP, как описано в Примере 1, скорость мешалки с верхним приводом повышали от целевой скорости смешивания, которая ранее была определена как оптимальная для частичного восстановления белка aMUC16. Скорость смешивания регулировали с помощью магнитной мешалки в 100 мл реакторах или с помощью моторной стеклянной мешалки в 100 мл реакторах EASYMAX™. Скорость смешивания магнитных мешалок задавалась настройками на плите магнитной мешалки с ручной корректировкой об/мин для изменения скорости смешивания во время восстановления. Стеклянные мешалки EASYMAX управлялись инструментальным программным обеспечением, а скорость смешивания изменялась вручную на инструментальном сенсорном экране или через заданные установки экспериментальных параметров прилагающегося программного обеспечения.

Реакции конъюгации проводили, как описано в Примере 1, используя целевые параметры смешивания, а анализ ОФ-ВЭЖХ проводили, как описано в Примере 1. Согласно фигуре 3, анализ ОФ-ВЭЖХ проводили с пустым лекарственным буфером в качестве фонового контроля (отдельная нижняя линия).

Для скорости смешивания 75 об/мин в течение 90 мин реакции восстановления TCEP (контрольное целевое смешивание), анализ ОФ-ВЭЖХ рабочего конъюгационного пула для aMUC16-vcMMAE показал образование димеров свободного лекарственного препарата.

Для скорости смешивания 400 об/мин (быстрое смешивание) в течение 90 мин реакции восстановления TCEP анализ ОФ-ВЭЖХ рабочего конъюгационного пула для aMUC16-vcMMAE не выявил димеров свободного лекарственного препарата.

Для комбинированной скорости смешивания, включающей 85 минут смешивания реакции восстановления TCEP при 75 об/мин с последующим повышением скорости смешивания до 400 об/мин в течение последних 5 минут реакции восстановления (5 мин, быстрое смешивание, общее время восстановления: 90 минут) анализ ОФ-ВЭЖХ рабочего конъюгационного пула для aMUC16-vcMMAE показал существенное снижение образования димеров свободного лекарственного препарата.

Пример 4

В этом примере описан анализ барботажа реакции частичного восстановления белка газообразным азотом как средства снижения или устранения образования димеров лекарственного препарата в последующей реакции конъюгации. Эти данные демонстрируют, что в этой модельной системе барботаж реакции в течение по меньшей мере части времени реакции восстановления промежуточных mAb-продуктов перед конъюгацией с vcMMAE может снижать или устранять образование димеров лекарственного препарата.

Частичное восстановление двух модельных антител (анти-CD22 и анти-Ly6E) с помощью TCEP проводили, как описано в Примере 1, и оно дополнительно включало барботаж газообразным азотом восстановительного пула непосредственно перед последующими реакциями конъюгации (с применением лекарственного препарата vcMMAE, как описано в Примере 1). Газообразным азотом барботировали реакционную смесь с помощью полипропиленовой серологической пипетки, присоединенной к закрывающей азот пробке посредством трубки. Перед барботажем реакционной смеси измеряли скорость потока с помощью измерителя потока газа. Газообразный азот подавали в реакцию с известной скоростью потока через трубку для подачи газа, при этом трубки оставались перекрытыми до определенного стартового момента во время восстановления. Реакцию барботируют до определенного конечного времени, трубки снова перекрывают, а пипетки удаляют из реактора. Анализ ОФ-ВЭЖХ полученной в результате композиции ADC проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ, как описано в Примере 1.

Как показано на фигуре 4A, анализ ОФ-ВЭЖХ рабочего конъюгационного пула для aCD22-vcMMAE ADC с (нижняя линия) и без (верхняя линия) барботажа газом N2 в течение последних 5 минут реакции частичного восстановления TCEP (общее время восстановления – 90 минут) продемонстрировал, что барботаж азотом устраняет образование димеров свободного лекарственного препарата vcMMAE. Аналогично, как показано на фигуре 4B, анализ ОФ-ВЭЖХ рабочего конъюгационного пула для aLy6E-vcMMAE ADC с (нижняя линия) и без (верхняя линия) барботажа газом N2 в течение последних 5 минут реакции частичного восстановления TCEP (общее время восстановления – 90 минут) также продемонстрировал, что барботаж азотом устраняет образование димеров свободного лекарственного препарата vcMMAE.

Пример 5

В этом примере описан анализ барботажа реакции частичного восстановления белка воздухом как средства снижения или устранения образования димеров лекарственного препарата в последующей реакции конъюгации.

Две 21 мл реакции восстановления общего объема промежуточного антитела (анти-MUC16), содержащего около 8-12% трисульфидов и конъюгированного с vcMMAE, проводили с помощью восстанавливающих агентов TCEP или DTT. После восстановления каждую реакцию (TCEP и DTT) разделяли на три пула: 1) пул, который 5 мин барботировали газообразным азотом, 2) пул, который 5 мин барботировали воздухом, и 3) контрольную реакцию, которую не барботировали никаким газом. В частности, через 85 мин восстановления антитела TCEP-восстановленные и DTT-восстановленные пулы антител разделяли на два 10 мл образца (образцы 1 – 2) и один 1 мл образец (образец 3). Образец 1 барботировали азотом в течение 5 мин перед добавлением лекарственного препарата для последующей конъюгации. Образец 2 барботировали воздухом в течение 5 мин перед добавлением лекарственного препарата для последующей конъюгации. Образец 3 (контроль) не барботировали и выдерживали в течение 5 мин перед добавлением лекарственного препарата для последующей конъюгации. После этих реакций восстановления восстановленные белки конъюгировали с vcMMAE и анализировали в отношении наличия димеров свободного лекарственного препарата vcMMAE с помощью ОФ-ВЭЖХ.

Каждый конъюгационный пул для образцов 1 - 3 анализировали в отношении наличия, снижения или устранения димеров свободного лекарственного препарата с помощью анализа ОФ-ВЭЖХ. Как показано на фигуре 5A, для реакций, восстанавливаемых TCEP, примесь димеров свободного лекарственного препарата vcMMAE присутствует в контрольной реакции, которую не барботировали никаким газом, и отсутствует как в реакции, которую барботировали газообразным азотом, так и в реакции, которую барботировали воздухом.

Аналогично, для реакций, восстанавливаемых DTT, как показано на Фигуре 5B, примесь димеров свободного лекарственного препарата vcMMAE присутствует в контрольной реакции, которую не барботировали никаким газом, и отсутствует как в реакции, которую барботировали газообразным азотом, так и в реакции, которую барботировали воздухом. Данные по площади под кривой для этих реакций приведены в таблице 1. Барботаж азотом или воздухом в течение 5 мин перед последующей конъюгацией устранял образование димерных молекул свободного лекарственного препарата по сравнению с контрольным небарботированным образцом.

Таблица 1. Образование димеров свободного лекарственного препарата после барботажа газообразным азотом или воздухом.

Эти данные демонстрируют применение восстанавливающих тиол агентов DTT и TCEP для получения димеров свободного лекарственного препарата в трисульфид-содержащих антителах. Кроме того, эти данные демонстрируют, что барботаж реакции восстановления воздухом предотвращает образование димеров свободного лекарственного препарата во время конъюгации, аналогично результату, полученному при применении инертных газов, таких как азот.

Пример 6

В этом примере описан анализ влияния времени барботажа во время реакции восстановления белка на снижение или предотвращение образования димеров лекарственного препарата в последующей реакции конъюгации.

Чтобы исследовать влияние времени барботажа газообразным азотом во время реакции восстановления, варьировали время барботажа, а пиковую площадь для димеров свободного лекарственного препарата определяли с помощью ОФ-ВЭЖХ. Одну 90 мл реакцию восстановления проводили с общим объемом промежуточного антитела (анти-Ly6E антитела). После добавления в стартовую реакцию восстановления TCEP пул барботировали азотом в течение всех 90 мин реакции восстановления. Образцы продуктов реакции восстановления брали перед началом барботажа, а также во время барботажа, а затем каждый образец конъюгировали после барботажа. Каждый конъюгированный образец анализировали с помощью анализа ОФ-ВЭЖХ, чтобы отслеживать количество образуемых димеров свободного лекарственного препарата (vcMMAE). Как показано на фигуре 6 и приведено в таблице 2, пиковая площадь димеров свободного лекарственного препарата уменьшается с увеличением времени барботажа.

Таблица 2. Образование димеров свободного лекарственного препарата после разного времени барботажа.

Эти данные демонстрируют, что димеры свободного лекарственного препарата исчезают после 30 минут барботажа. Также эти данные демонстрируют, что барботаж в начале восстановления эффективно снижает образование димеров свободного лекарственного препарата и, следовательно, барботаж можно проводить в начале или ближе к концу реакции восстановления с аналогичными результатами.

Вышеприведенные примеры настоящего изобретения были представлены в иллюстративных и описательных целях. Кроме того, эти примеры не ограничивают изобретение раскрытой в данном документе формой. Следовательно, вариации и модификации, соответствующие принципам изобретения и компетенции или знаниям соответствующей области техники, входят в объем настоящего изобретения. Описанные в приведенных в данном документе примерах варианты реализации предназначены для того, чтобы дополнительно объяснить наилучший известный способ практической реализации изобретения и сделать возможным применение изобретения другими специалистами в данной области техники посредством таких или других вариантов реализации и с различными модификациями, необходимыми для конкретных применений настоящего изобретения. Подразумевается, что прилагаемая формула изобретения включает альтернативные варианты реализации в той мере, которую позволяет известный уровень техники.

Реферат

Изобретение относится к улучшенным способам конъюгации агента к тиольному компоненту в белке, который содержит по меньшей мере одну дисульфидную связь и по меньшей мере одну трисульфидную связь. Способы позволяют получать конъюгаты антитело-лекарственный препарат, которые практически не содержат примесей, которые образуются в присутствии реактивных сульфидных компонентов в производственных процессах. 2 н. и 111 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 6 пр.

Формула