Композиция для стимулирования роста костей и поддержания здоровья костей - RU2314717C2

Чертежи

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции для поддержания здоровья костей или предупреждения, облегчения и/или лечения заболеваний костей. Оно также относится к применению композиции в производстве питательного продукта, добавки или лекарственного средства и к способу стимулирования роста костей или поддержания здоровья костей, который предусматривает прием внутрь эффективного количества композиции.

Уровень техники

Здоровые кости нуждаются в эффективном перестраивании, включающем равновесие между костеобразованием и резорбцией костей. Причиной большинства заболеваний костей служит повышенная резорбция костей, что делает ее ингибирование основной терапевтической целью, поэтому большинство фармацевтических препаратов, разработанных к настоящему времени, являются противорезорбционными. Например, эстрогены блокируют образование цитокинов, которые способствуют генерации и дифференцировке остеокластов. Разрабатываются SERM (селективные модуляторы реакции эстрогенов), которые оказывают полезное действие на здоровье костей при снижении риска вредных гормональных воздействий на ткани груди или эндометрия. Предполагается, что механизм их действия аналогичен механизму действия эстрогенов в костях. Бисфосфонаты (такие как алендронат, ризедронат и др.) концентрируются в костях и являются на сегодняшний день наиболее эффективными ингибиторами резорбции костей. Они ингибируют критический ферментативный механизм, необходимый для активности и выживания остеокластов. Кальцитонин - это полипептидный гормон, который ингибирует резорбцию костей за счет блокирования активности остеокластов. Новые разработки направлены на блокирование членов семейства рецепторов/лигандов TNF и их сигнальных путей, в частности, RANK/RANKL, на ингибирование костеспецифичных металлопротеаз, таких как катепсин К, или ингибирование специфических киназ.

Создание лечебных средств, стимулирующих костеобразование, несколько отстало от разработки ингибиторов резорбции. Известны некоторые химические или фармацевтические агенты, благоприятствующие росту костей у человека. Например, в WO 9619246 описан способ стимулирования роста костей у больных людей за счет периодического введения им паратиреоидного гормона (РТН), родственного РТН белка или агониста в течение, по меньшей мере, одного месяца. В WO 9619501 фактор, происходящий из поджелудочной железы, ингибирует резорбцию костей и стимулирует пролиферацию костных клеток и увеличивает костеобразование.

Главным открытием последних лет явилась демонстрация роли костного морфогенного белка 2 (BMP-2) как ключевого фактора стимулирования костеобразования, а также того, что статины (эффективные средства для снижения уровня холестерина путем ингибирования синтеза холестерина) улучшают костеобразование, частично опосредованное за счет индукции ВМР-2. Показано, что введение рекомбинантного ВМР-2 индуцирует костеобразование и формирование хрящей. В US 6150328 описывается способ индуцирования костеобразования и формирования хрящей, который предусматривает введение очищенного костного морфогенного белка, полученного культивированием клетки, трансформированной ДНК, кодирующей BMP. WO 9711095 также относится к применению композиций костного морфогенного белка для лечения опухолей нервной системы и болезней роста костей и для заживления ран. В дополнение к BMP, изучаются такие факторы роста (GF), как инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), трансформирующий фактор роста GF-β (TGF-β), факторы роста фибробластов (FGF), которые могут служить в качестве локальной терапии при лечении переломов и дефектов костей. Однако систематическое введение их весьма проблематично из-за метаболизма в кишечнике, а также вследствие возможного влияния на другие ткани. В качестве одного из возможных решений предлагается генотерапия. Альтернативой может служить целенаправленное регулирование образования остеобластов с помощью пищевых или фармацевтических регуляторов экспрессии генов или белка остеобластов.

Хотя указанные химические и фармацевтические соединения подтвердили свою эффективность для лечения заболеваний костей, тем не менее, большой интерес представляет безопасный и эффективный пищевой путь стимуляции роста костей и предупреждения, облегчения или лечения костных/суставных заболеваний у млекопитающих.

Раскрытие изобретения

Согласно первому аспекту, настоящее изобретение относится к композиции, предназначенной для предупреждения, облегчения и/или лечения заболеваний костей или для поддержания здоровья костей у млекопитающих, которая содержит в качестве активного ингредиента эффективное количество, по меньшей мере, одного растения или экстракта из растения, специально подобранного по его способности индуцировать экспрессию костного морфогенного белка.

Примечательным является то, что некоторые растения или экстракты из них, как было установлено, обладают способностью стимулировать рост костей за счет регулирования эндогенных факторов роста в костной или хрящевой тканях. Они обладают способностью индуцировать экспрессию костного морфогенного белка in vivo и в локальном окружении кости, что оказывает положительный эффект на костеобразование и восстановление костей, на поддержание здоровья костей или предупреждение, облегчение и/или лечение заболеваний костей.

Композиция согласно изобретению может использоваться в производстве питательного продукта, добавки, угощения или лекарственного средства, предназначенного для человека или домашних животных.

Введение индивидууму пищевой композиции согласно настоящему изобретению приводит к улучшению регенерации костей при лечении переломов. Настоящая композиция, кроме того, помогает ингибировать резорбцию костей. Она помогает увеличивать костеобразование и минеральную плотность костей в стадии роста и оптимизировать пиковую массу костей. Кроме того, указанная пищевая композиция помогает снизить риск разрежения костей, в частности, разрежения костей, обусловленного возрастом, у млекопитающих. То есть она способствует поддержанию массы костей с возрастом и снижает опасность остеопороза.

Помимо этого, она способствует формированию хрящей у млекопитающих, предупреждению остеоартрита у домашних животных или человека, что обеспечивает повышенную активность или подвижность индивидуума.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к применению растения или экстракта из растения, отобранных по их способности стимулировать костные морфогенные белки и/или ингибировать резорбцию костей, для приготовления композиции, предназначенной для поддержания здоровья костей у млекопитающих и предупреждения, облегчения и/или лечения заболеваний костей.

В дополнение к этому, изобретение обеспечивает способ предупреждения, облегчения и/или лечения заболевания костей или поддержания здоровья костей, который предусматривает введение эффективного количества композиции, описанной выше.

Изобретение также обеспечивает способ увеличения костеобразования, минеральной плотности кости в стадии роста и оптимизации пиковой массы костей, лечения или предупреждения остеопороза, стимулирования регенерации костей при лечении переломов, который предусматривает введение эффективного количества композиции, как описано выше.

Кроме того, оно относится к способу лечения, облегчения и/или профилактики остеоартрита у домашних животных или человека, который включает стадию скармливания индивидууму композиции, как описано выше.

Оно также обеспечивает способ снижения риска разрежения костей, в частности, разрежения костей, обусловленного возрастом, у человека или домашних животных, который включает стадию скармливания индивидууму композиции, как описано выше.

Перечень фигур

Фиг.1. Измерение эндогенной экспрессии мРНК ВМР-2 в hPOB-tert клетках с помощью обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) после обработки экстрактами из Lindera benzoin (P.E. 740, 50 мкг/мл) или Cyperus rotundus (P.E. 205, 10 мкг/мл) в течение 48 ч, показавшее стимуляцию BMP-2 в 3,2 и 2,8 раза, соответственно, по сравнению с контролем. Подтверждение результатов этого эксперимента проводилось с использованием ловастатина (0,5 мкг/мл) в качестве положительного контроля, показавшего индукцию BMP-2 в 2,5 раза.

Фиг.2. Сравнение измеренных показателей ингибирования в тесте на черепном своде (Calvasia Assay) (А) и луночном тесте (Pit Assay) (В) при использовании экстрактов из Ocimum gratissimum (738), Amelanchier alnifolia (734), Glycine max (768), Cyperus rotundus (205), Carthamus tinctorius (746).

Осуществление изобретения

В соответствии с первой целью настоящего изобретения, растение или экстракт из растения согласно изобретению содержит фитохимические соединения, которые обладают анаболическим потенциалом благодаря их способности индуцировать экспрессию костного морфогенного белка и, кроме того, могут служить противорезорбционными агентами.

В предпочтительном воплощении под растением или экстрактом из растения подразумевается любая часть растения, например, листья, клубни, плоды, семена, корни, зерна, зародыши или клеточные культуры. Растение или экстракт из растения может представлять собой высушенный лиофильной сушкой экстракт из листьев, корней и/или плодов в зависимости от вида используемого растения, либо свежесобранное растение, либо обогащенную фракцию, полученную известным в данной области методом экстракции неорганическим или органическим растворителем.

Растение или экстракт из растения отбирают по его способности ингибировать резорбцию костей и/или индуцировать костеобразование, в частности, оно может быть выбрано из группы, включающей Lindera, Artemisia, Acorus, Carthamus, Carum, Cnidium, Amelanchier, Curcuma, Taraxacum, Cyperus, Juniperus, Prunus, Iris, Cichorium, Dodonaea, Epimedium, Eriogonum, Soya, Mentha, Ocimum, Thymus, Tanacetum, Plantago, Spearmint, Bixa, Vitis, Rosmarinus, Rhus и Anethum. Оно может представлять собой также съедобный гриб.

В наиболее предпочтительном варианте это могут быть, например, надземные части Lindera benzoin, надземная часть Artemisia vulgaris, корневище (ризом) Acorus calamus, семена или цветы Carthamus tinctorius, плоды Amelanchier ovalis, плоды Amelanchier alnifolia, корни Cichorium intybus, корневище Curcuma longa, надземная часть Epimedium brevicomum, надземная часть Eriogonum giganteum, листья или корни Taraxacum officinalis, корневище Cyperus rotondus, листья Dodoneae viscosa, клеточные культуры Iris pallida, корневище Iris germanica, pallida или pseudacorus, плоды Juniperus communis, семена Primus persica, клеточные культуры сои, надземные части Mentha spicata, надземные части Ocimum gratissimum, надземные части Thymus sp., надземные части Rhus glabra, aneth, Bixa, ягоды Vitis vinifera, надземные части Rosmarinus officinalis, надземные части Tanacetum vulgare, Carum carvi, Plantago major, надземные части Oxydendron arboreum.

Фитохимические соединения могут представлять собой генистеин, даидзеин, лактуцин, лактукопикрин, 3-дезоксилактуцин, гераниол или карвон.

Растение или экстракт из растения согласно изобретению может использоваться для приготовления пищевой композиции. Указанная композиция может быть в виде сбалансированного по питательным веществам пищевого продукта или корма для домашних животных или питательной добавки, угощения или фармацевтического состава.

Растение или экстракт из растения может использоваться как отдельно, так и в комбинации с другими растениями, такими как, например, цикорий, чай, какао, или с другими биоактивными молекулами, такими как антиоксиданты, жирные кислоты, пребиотические волокна, глюкозамин, хондроитинсульфат.

В одном из воплощений готовится пищевая композиция для потребления человеком. Указанная композиция может представлять собой полностью сбалансированный по питательным веществам состав, молочный продукт, охлажденный или стойкий в хранении напиток, суп, питательную добавку, заменитель пищи в рамках повседневного рациона и питательный батончик или кондитерское изделие.

Помимо экстракта из растения согласно изобретению, питательный состав может содержать источник белка. В качестве источника белка преимущественно используются пищевые белки. Они могут представлять собой любые, пригодные для данной цели, пищевые белки, например, животные белки (такие как белки молока, мясной белок и яичный белок), растительные белки (соевый белок, пшеничный белок, рисовый белок и белок гороха), смеси свободных аминокислот или их комбинации. Особенно предпочтительными видами белков являются, в частности, белки молока (казеин, белки молочной сыворотки) и соевый белок. Композиция может содержать также источник углеводов и источник жира.

Если питательный состав содержит источник жира, то этот источник жира предпочтительно обеспечивает примерно от 5% до 55% энергетической ценности питательного состава, например, от 20% до 50%. Липиды в качестве источника жира могут представлять собой любой, пригодный для данной цели, жир или смеси жиров. Наиболее пригодными являются растительные жиры, например, соевое масло, пальмовое масло, кокосовое масло, сафлоровое масло, подсолнечное масло, кукурузное масло, масло канолы, лецитины и т.п. При необходимости можно добавлять также животные жиры, например, молочный жир.

В питательный состав можно добавить источник углеводов. Он предпочтительно обеспечивает примерно от 40% до 80% энергетической ценности питательного состава. Может использоваться любой, пригодный для данной цели, углевод, например, сахароза, лактоза, глюкоза, фруктоза, сухая кукурузная патока и мальтодекстрины, а также их смеси. При необходимости можно добавить также пищевые волокна. В случае добавления пищевых волокон, они предпочтительно составляют примерно до 5% энергетической ценности питательного состава. Пищевые волокна могут быть любого подходящего происхождения, включая, например, сою, горох, овес, пектин, гуаровую камедь, гуммиарабик и фруктоолигосахариды. В питательный состав могут быть включены соответствующие витамины и минеральные вещества в количестве, соответствующем нормативным показателям.

При необходимости в питательный состав может быть введен один или более эмульгаторов пищевого качества, например, диацетиловые сложные эфиры винной кислоты и моно- и диглицеридов, лецитин и моно- и диглицериды. Равным образом могут быть включены подходящие соли и стабилизаторы. Витамины и минеральные вещества могут комбинироваться также с экстрактом из растения.

Питательный состав предпочтительно предназначен для энтерального введения, например, в виде порошка, таблетки, капсулы, жидкого концентрата, твердого продукта или готового к употреблению напитка. Если требуется приготовить сухой, порошкообразный питательный состав, то гомогенизированную смесь пропускают через соответствующую сушилку, например, распылительную сушилку или сублимационную сушилку, с получением порошка.

В другом воплощении питательная композиция включает молочно-зерновой продукт в смеси с пребиотическим составом. Молочно-зерновой продукт предпочтительно представляет собой продукт детского питания, который служит носителем для пребиотического состава.

Согласно следующему воплощению, обычный пищевой продукт может быть обогащен, по меньшей мере, одним растением или экстрактом из растения, согласно настоящему изобретению, например, кисломолочный продукт, йогурт, свежий сыр, молочный сгусток сычужного свертывания, кондитерское изделие, сладкий или подслащенный напиток, кондитерский батончик, зерновые хлопья или зерновые батончики к завтраку, напитки, сухое молоко, продукты на соевой основе, немолочные ферментированные продукты или питательные добавки для питания в условиях клиник.

Количество растения или экстракта из растения в композиции может варьировать в зависимости от вида растения и используемой части растения. В предпочтительном воплощении эффективная суточная доза равна по меньшей мере примерно 1 мг, в более предпочтительном - от 1 мг до 200 мг активных молекул.

В одном из воплощений может быть приготовлена фармацевтическая композиция, содержащая, по меньшей мере, экстракт или фитохимическое соединение, как указано выше, в количестве, достаточном для достижения требуемого эффекта у индивидуума. Эта композиция может быть в виде таблетки, жидкости, капсул, мягких капсул, пасты или пастилок, гумми либо годных для питья растворов или эмульсий, сухой добавки для орального употребления, влажной добавки для орального употребления. Фармацевтическая композиция будет содержать также носители и наполнители, пригодные для транспортировки соответствующих активных молекул различной природы к ткани-мишени. Вид носителя/наполнителя и его количество будет зависеть от природы вещества и предполагаемого способа доставки и/или введения лекарства. Само собой разумеется, что специалисты в данной области могут выбрать соответствующие компоненты и галеновые формы, опираясь на свой опыт и знания.

Растение или экстракт из растения согласно изобретению может использоваться для приготовления композиции корма для домашних животных. Указанная композиция может скармливаться домашнему животному в качестве добавки к обычному рациону или в качестве компонента сбалансированного по питательным веществам корма для домашних животных или, что более предпочтительно, низкокалорийного корма для домашних животных. Она может представлять собой также фармацевтическую композицию.

Растение или экстракт из растения может использоваться как отдельно, так и в комбинации с другими растениями, такими как, например, цикорий, чай, какао, или с другими биоактивными молекулами, такими как антиоксиданты, жирные кислоты, пребиотические волокна, глюкозамин, хондроитинсульфат.

Предпочтительно композиция корма для домашних животных содержит примерно от 0,01 до 0,5 г высушенных растений на один грамм сухого корма для собак с массой тела 15 кг и от 0,001 до 0,1 г высушенных растений на один грамм влажного корма для собак с массой тела 15 кг.

Сбалансированная по питательным веществам композиция корма для домашних животных согласно изобретению может быть приготовлена в порошкообразном, сухом виде, в виде угощения либо влажного, охлажденного или стойкого в хранении продукта для домашних животных. Она может представлять собой охлажденный продукт или продукт длительного хранения. Указанные продукты для домашних животных можно приготовлять любым известным способом.

Композиция корма для домашних животных может, при необходимости, содержать также пребиотик, пробиотические микроорганизмы или другой активный агент, например, длинноцепочечную жирную кислоту. Количество пребиотика в композиции корма для домашних животных предпочтительно составляет менее 10 мас.%. Например, пребиотик может составлять примерно от 0,1 до 5 мас.% от массы корма. Если корм содержит цикорий в качестве источника пребиотика, то цикорий может добавляться таким образом, чтобы его количество в кормовой смеси составляло примерно от 0,5 до 10 мас.%, более предпочтительно - примерно от 1 до 5 мас.%.

Если используется пробиотический микроорганизм, то в 1 грамме корма для домашних животных в предпочтительном варианте содержится примерно от 10⁴ до 10¹⁰клеток, в более предпочтительном - примерно от 10⁶ до 10⁸ клеток пробиотического микроорганизма. Корм для домашних животных может содержать примерно от 0,5 до 20 мас.% смеси пробиотических микроорганизмов, предпочтительно - примерно от 1 до 6 мас.%, например, примерно от 3 до 6 мас.%.

При необходимости в корм для домашних животных добавляют минеральные вещества и витамины так, чтобы он был полностью сбалансирован по питательным веществам. Кроме того, в корм для домашних животных можно вводить, при необходимости, и другие ингредиенты, например, сахар, соль, специи, пряности, ароматизаторы и т.п.

Согласно другому воплощению можно приготовить питательные добавки, улучшающие качество кормов для домашних животных. Эти питательные добавки могут быть заключены в капсулу или изготовлены в виде порошка и упакованы вместе или отдельно от основного корма, независимо от того, влажный он или сухой. В качестве примера, порошок, содержащий экстракты согласно изобретению, может быть упакован в саше в виде порошка либо в виде геля или липида, либо другого подходящего носителя. Эти отдельно расфасованные добавки можно затем обеспечить вместе с основным кормом или в групповые упаковки для последующего использования вместе с основным кормом или угощением, согласно инструкции для пользователя.

Количество корма, которое должно быть потреблено домашним животным для достижения требуемого эффекта, будет зависеть от размеров, вида и возраста домашнего животного. Однако количество корма для домашних животных, обеспечивающее суточную дозу примерно от 0,5 до 5 г высушенных растений на 1 кг массы тела животного, обычно будет адекватным для собак и кошек.

Введение человеку или домашнему животному пищевой композиции или композиции корма, как описано выше, приводит к улучшению регенерации костей при лечении переломов. Она способна стимулировать костеобразование, повышать минеральную плотность кости в стадии роста и оптимизировать пиковую массу костей. В частности, она может обеспечить оптимальный рост костей в детском возрасте. Указанная пищевая композиция помогает предотвратить разрежение костей, в частности, разрежение костей, обусловленное возрастом, у млекопитающих, или разрежение костей, связанное с длительной госпитализацией. Она снижает опасность остеопороза и улучшает восстановление после перелома. Кроме того, она способствует формированию хрящей у млекопитающих, предупреждает остеоартрит у человека и домашних животных, что приводит к повышению активности или подвижности индивидуума.

Приведенные ниже примеры даются только с целью иллюстрации настоящего изобретения, однако их не следует интерпретировать как ограничивающие объект настоящей заявки. Процентное количество везде указано в мас.%, если нет ссылки на другую размерность. Примерам предшествует краткое описание фигур.

Примеры

Пример 1: Тесты на костеобразование и резорбцию костей

1. Костеобразование

91 экстракт подвергали скринингу на костеобразование путем анализа экспрессии репортерного гена для ВМР-2 (костный морфогенный белок) и на резобцию кости с помощью теста на черепном своде (Calvaria Assay). Указанный 91 экстракт был получен из 30 различных растений.

Материалы и методы

- Приготовление экстрактов для скрининг-анализа:

Измельченное растительное сырье обезжиривали гексаном, затем экстрагировали смесью спирта с водой с различным процентным содержанием воды - от 10 до 90%, предпочтительно 50%. В качестве спирта можно использовать метиловый или этиловый спирты, получая экстракт 1а.

Отбирали аликвотное количество остатка указанного первого экстракта и проводили его ферментативный гидролиз с использованием α- и β-глюкозидаз. Взамен ферментного гидролиза можно проводить кислотный гидролиз. Указанный процесс можно проводить в мягких условиях (при комнатной температуре) или в условиях обратного холодильника при различной концентрации кислоты. Водную гидролизную фазу экстрагировали несмешивающимся растворителем, предпочтительно этилацетатом, с получением экстракта 2а.

Экстракт можно высушить распылением или сублимацией либо получить в жидком виде.

В некоторых случаях возможно удаление полифенолов путем обработки поливинилполипирролидоном (PVVP) во избежание артефакта при скрининг-анализе.

После получения экстрактов каждый экстракт взвешивали, повторно растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до конечной концентрации 20 мг/мл и хранили в виде аликвот при -20°С. Эти растворы использовали в качестве маточных растворов, впоследствии разбавляя их в средах для каждого анализа. В ходе анализов испытывали широкий спектр доз.

- Тест на костеобразование

ВМР-2-люциферазный тест: активность экстрактов определяли с использованием клеток 2Т3, содержащих промотор ВМР-2, функционально связанный с геном люциферазы. Повышение активности люциферазы в клеточных лизатах отражает увеличение активности промотора BMP-2. Экстракты испытывали при начальном разбавлении 100 мкг/мл с последующим разбавлением 1/2 до 0,2 мкг/мл. Активность промотора BMP-2 измеряли путем измерения активности люциферазы в клеточных экстрактах.

13 растений показали высокий положительный результат в стимулировании экспрессии BMP-2 (Таблица 1).

Примерами новых препаратов тех же растений и их субфракций, стимулирующих ВМР-2, являются:

Lindera benzoin, активный экстракт/№ этилацетат/740/2059; активная субфракция/№2060;

Taraxacum officinalis, активный экстракт/№ этилацетат/750/2034; активная субфракция/№2035;

Cyperus rotundus, активный экстракт/№ этилацетат/205/2011; активная субфракция/№2012,2013;

Iris pallida, активный экстракт/№ МеОН/вода/239; активная субфракция/№760/762/2021,2022.

Субфракции получали фракционированием в обращенной фазе на картриджах с силикагелем с последующим элюированием растворителями с различной полярностью. Чистые изофлавоны сои - генистеин и даидзеин (10^-6 М) - стимулировали BMP-2, a эстрадиол - нет.

По-видимому, индукция BMP-2 не ограничивается эстрогеноподобной активностью, поскольку она стимулируется фитоэстрогеном, но не самим эстрогеном. Это означает, что активность фитоэстрогена (такого как генистеин или даидзеин) может опосредоваться через неэстрогенный механизм. Активность промотора ВМР-2 не стимулируется эстрадиолом, поэтому в настоящем эксперименте нет необходимости в эстрогенной активности соединений из растений.

Пример костеобразования в органной культуре черепного свода.

Использованный метод описан в Science 286: 1946-1949 (1999). Экстракты оценивали на 4 день в экспериментах in vitro на черепном своде новорожденных мышей. Кости инкубировали с экстрактами в течение полных 4 дней. Костеобразование оценивали гистологическим методом.

2. Резорбция костей, тест на черепном своде

Способность экстрактов, приготовленных согласно примеру 1, ингибировать стимулируемую IL-1 (10^-10) резорбцию костей оценивали в тесте на резорбцию костей у новорожденных мышей. Каждый экстракт оценивали по его способности ингибировать резорбцию костей в концентрации 10 мкг/мл.

Экстракты из растений, показавшие положительный результат, приведены в таблице 2.

Перечисленные растения проявили активность в тесте на резорбцию костей: Amelanchier ainifolia, Ocimum gratissimum, Carthamus tinctorius и Glycine max. Cyperus rotundus ингибировал резорбцию костей и индуцировал BMP-2.

Пример 2: Влияние экстрактов из растений на эндогенную экспрессию ВМР-2 в остеобластах человека

Растения, показавшие положительные результаты индуцирования BMP-2 в примере 1, испытывались дополнительно на линии клеток периоста/преостеобластов человека (hPOB-tert) на их способность индуцировать эндогенную экспрессию BMP-2. Данный тест на клетках остеобластах подтвердил результаты, полученные в примере 1.

Например, обработка клеток hPOB-tert экстрактами Lindera benzoin (экстракт 740, 50 мкг/мл) и Cyperus rotundus (экстракт 205, 10 мкг/мл) в течение 48 ч стимулировала экспрессию BMP-2 в 3,8 и 2,8 раза, соответственно, по сравнению с контролем (см. фиг.1). Проверку результатов теста проводили с использованием ловастатина (0,5 мкг/мл) в качестве положительного контроля, показавшего индукцию BMP-2 в 2,5 раза.

По достижении конфликтности клетки инкубировали с 0,05 мкг/мл ловастатина или с экстрактами растений. Общую РНК экстрагировали реагентом TRIzol (от фирмы Gibco). 10 мкг РНК обратно транскрибировали, используя набор 1 st Stand cDNA Synthesis Kit (от фирмы Boehringer). Последовательности кДНК BMP-2 амплифицировали в 35 циклах при температуре отжига 55°С с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров (5':TTGCGGCTGCTCAGCATGTT; 3':CATCTTGCATCTGTTCTCGGAA). Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) разделяли методом электрофореза в геле агарозы и обнаруживали путем окрашивания бромистым этидием. Их количественную оценку проводили с помощью программного обеспечения NIH Image, а результаты нормировали с использованием актина в качестве гена "домашнего хозяйства".

Результаты представлены на фиг.1.

Резорбция костей

Экстракты растений, показавшие положительные результаты в тесте на черепном своде, оценивали повторно во втором тесте на резорбцию костей, а именно луночном тесте (pit assay), с использованием смешанных костных клеток кроликов, культивируемых на разломах костей крупного рогатого скота (Tezuka К., et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (2): 911-917 and Lorget F., et al., 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun. 268(3): 899-903). Резорбционные лунки визуализировали путем окрашивания на TRAP (кислая фосфатаза, устойчивая к тартратам). Положительные клетки подсчитывали.

Сравнительная оценка активности экстрактов в концентрации 10 мкг/мл в двух тест-системах представлена на фиг.2.

Пример 3: Сухой корм для домашних животных

Кормовую смесь составляли примерно из 58 мас.% кукурузы, 5,5 мас.% кукурузной клейковины, 22 мас.% кормовой муки из отходов переработки птицы, 2,5% высушенного цикория, 10% экстракта из клубней Cyperus rotondus, остальное - соли, витамины и минеральные вещества.

Кормовую смесь подавали в аппарат для предварительного кондиционирования и увлажняли. Влажный корм подвергали экструзионной варке и желированию. Выходящую из экструдера желированную матрицу продавливали под давлением через головку экструдера и экструдировали. Экструдат нарезали на кусочки удобной для скармливания собакам формы, высушивали примерно при 110°С в течение примерно 20 минут и охлаждали с получением гранул.

Полученный сухой корм для собак оказывал положительное воздействие на здоровье костей и хрящей и увеличивал их подвижность.

Пример 4: Влажный консервированный корм для домашних животных с добавкой

Смесь готовили из 73% тушек птицы, свиных легких и говяжьей печени (в измельченном виде), 16% пшеничной муки, 2% красителя, витаминов и неорганических солей. Полученную смесь эмульгировали при 12°С и экструдировали в виде пудинга, который затем подвергали варке при температуре 90°С. Продукт охлаждали до 30°С и разрезали на куски. 45% полученных кусков смешивали с 55% соуса, приготовленного из 98% воды, 1% красителя и 1% гуаровой камеди. Расфасовывали в жестяные консервные банки и стерилизовали при 125°С в течение 40 мин.

В качестве добавки, предназначенной для смешивания с кормом для домашнего животного перед скармливанием, дополнительная упаковка (например, саше) содержала 25 г порошка из надземной части Cyperus rotundus, предназначенного для добавления в ежедневный рацион. Соответствующее количество ее для домашнего животного составляет, примерно, 25 г/сутки; и оно может поставляться в виде приложения (например, сверху) к консервной банке.

Реферат

Настоящее изобретение относится к композиции для поддержания здоровья костей или предупреждения, облегчения и/или лечения заболеваний костей. Композиция включает в качестве активного ингредиента эффективное количество, по меньшей мере, одного растения или экстракта из растения, содержащего фитохимические соединения, обладающие способностью индуцировать экспрессию костного морфогенного белка. Предложено также применение этой композиции и способ лечения, облегчения или предупреждения заболеваний костей; способ увеличения костеобразования, минеральной плотности кости; способ лечения или предупреждения остеопороза и остеоартрита. Изобретение позволяет обеспечить эффективное стимулирование роста костей или поддержания здоровья костей 8 н. и 10 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.

Формула