Доставка терапевтических полипептидов посредством псевдотипированных онколитических вирусов - RU2758007C2

Чертежи

Показать все 30 чертежа(ей)

Описание

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США № 62/357,195, поданной 30 июня 2016 года, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПОДАННОГО ЭЛЕКТРОННЫМ СПОСОБОМ

[0002] Содержание текстового файла, поданного электронным способом наряду с настоящим документом, полностью включено в настоящий документ посредством ссылки: копия Перечня последовательностей в машиночитаемом формате (название файла: ONCR_004_02WO_ST25.txt; дата записи: 30 июня 2017 года; размер файла: 193 килобайта).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Пациентам, страдающим от определенных гематологических и солидных опухолей, все еще требуются новые варианты терапии. Было продемонстрировано, что применение биспецифичных антител для нацеливания цитотоксических Т–клеток на опухолевые клетки и применение химерных антигенных рецепторов (ХАР) для конструирования антигенной специфичности в отношении клетки–иммунного эффектора обеспечивает терапевтическую пользу. Помимо этого, технологии на основе онколитических вирусов являются подходящим дополнением к применяемому на сегодняшний день стандарту лечения солидных опухолей и характеризуются профилем безопасности и способностью инфицировать, реплицироваться в опухолевых клетках и лизировать их. Однако противоопухолевая эффективность биспецифичных антител, ХАР и онколитического вируса являются недостаточными, что демонстрирует постоянную потребность в дальнейшем прогрессировании онкологии, антител и терапии онколитическими вирусами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен псевдотипированный онколитический вирус, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая содержит (i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую привлекающий полипептид, причем привлекающий полипептид содержит домен активации, специфичный в отношении антигена, экспрессированного на эффекторной клетке, и домен распознавания антигена, специфичный в отношении антигена поверхности клетки, экспрессированного на клетке–мишени. Согласно некоторым вариантам реализации домен распознавания антигена специфично связывается с опухолевым антигеном. Согласно некоторым вариантам реализации опухолевый антиген выбран из таблицы 2.

[0005] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен псевдотипированный онколитический вирус, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая содержит (i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую привлекающий полипептид, причем привлекающий полипептид содержит домен активации, специфичный в отношении антигена, экспрессированного на эффекторной клетке, и домен терапевтической молекулы, который связывается с ингибиторным антигеном, экспрессированным на поверхности клетки. Согласно некоторым вариантам реализации домен терапевтической молекулы специфично связывается с PD1, PDL1 или CD47. Согласно некоторым вариантам реализации рекомбинантная нуклеиновая кислота дополнительно содержит вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтический полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтический полипептид представляет собой полипептид–иммуномодулятор. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид–иммуномодулятор выбран из цитокина, костимулирующей молекулы, полипептида иммунной контрольной точки, антиангиогенного фактора, матриксной металлопротеиназы (matrix metalloprotease, MMP) или нуклеиновой кислоты.

[0006] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид иммунной контрольной точки включает (i) ингибитор PD–1, PDL–1, CTLA–4, LAG3, TIM3, нейропилин или CCR4; (ii) агонист GITR, OX–40 или CD28; или (iii) комбинацию (i) и (ii). Согласно некоторым вариантам реализации полипептид иммунной контрольной точки включает MMP, причем MMP представляет собой MMP9. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид иммунной контрольной точки включает цитокин, причем цитокин выбран из ИЛ–15 (интерлейкина–15, IL–15), ИЛ–12 (IL–12) и CXCL10.

[0007] Согласно некоторым вариантам реализации эффекторная клетка, привлеченная привлекающими молекулами, в настоящем документе представляет собой Т–клетку, NKT–клетку (natural killer T–cell, Т–клетку природного киллера), NK–клетку (natural killer, природного киллера) или макрофаг. Согласно некоторым вариантам реализации домен активации эффекторной молекулы специфично связывается с CD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD28, CD40, CD134, CD137 или NKG2D.

[0008] Согласно некоторым вариантам реализации рекомбинантная нуклеиновая кислота, предложенная в настоящем документе, представляет собой мультицистронные последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации мультицистронная последовательность представляет собой бицистронную последовательность или трицистронную последовательность. Согласно некоторым вариантам реализации мультицистронная последовательность содержит пикорнавирус–2а–подобную последовательность, причем первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты экспрессируются с одной последовательности промотора, присутствующей в рекомбинантной нуклеиновой кислоте.

[0009] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен псевдотипированный онколитический вирус, содержащий последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая содержит (i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую привлекающий полипептид, причем привлекающий полипептид содержит домен активации, специфичный в отношении антигена, экспрессированного на эффекторной клетке, и домен распознавания антигена, специфичный в отношении антигена опухолевой клетки, экспрессированного на клетке–мишени, причем антиген, экспрессированный на эффекторной клетке, представляет собой CD3, и причем антиген опухолевой клетки представляет собой CD19. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 44. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 43. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой ИЛ–12. Согласно таким вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 54. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой ИЛ–15. Согласно таким вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 53. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой CXCL10. Согласно таким вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 55. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой MMP9.

[0010] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен псевдотипированный онколитический вирус, содержащий последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая содержит (i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую привлекающий полипептид, причем привлекающий полипептид содержит домен активации, специфичный в отношении антигена, экспрессированного на эффекторной клетке, и домен терапевтической молекулы, специфичный в отношении ингибиторного антигена, причем антиген, экспрессированный на эффекторной клетке, представляет собой CD3, и причем ингибиторный антиген представляет собой PDL1. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 50. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 49. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой ИЛ–12. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 63. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой ИЛ–15. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 62. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой CXCL10. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 64. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой MMP9. Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула дополнительно содержит третий связывающий домен. Согласно некоторым вариантам реализации третий связывающий домен содержит Fc–домен иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 52. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 51.

[0011] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен псевдотипированный онколитический вирус, содержащий последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая содержит (i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую привлекающий полипептид, причем привлекающий полипептид содержит домен активации, специфичный в отношении антигена, экспрессированного на эффекторной клетке, и домен терапевтической молекулы, специфичный в отношении ингибиторного антигена, причем антиген, экспрессированный на эффекторной клетке, представляет собой CD3, и причем ингибиторный антиген представляет собой SIRP1α. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 46 или 48. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 45 или 47. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой ИЛ–12. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 58 или 59. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой ИЛ–15. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 56 или 57. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой CXCL10. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 60 или 61. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой MMP9. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 65 или 66. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой scFv против PDL1, присоединенный к Fc–домену IgG1. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодирует полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 68 или 70. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 67 или 69.

[0012] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы согласно настоящему изобретению выбраны из аденовируса, вируса простого герпеса 1 (ВПГ1), вируса миксомы, реовируса, полиовируса, вируса везикулярного стоматита (ВВС), вируса кори (ВК), вируса Ласса (ВЛ) или вируса болезни Ньюкасла (ВБН). Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус характеризуется сниженной активностью нейротропизма и/или активностью нейротоксичности в субъекте–человеке по сравнению с эталонным вирусом. Согласно некоторым вариантам реализации эталонный вирус представляет собой i) непсевдотипированный онколитический вирус, или ii) вирус осповакцины. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус представляет собой аттенуированный онколитический вирус. Согласно некоторым вариантам реализации вирус не является вирусом осповакцины.

[0013] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы согласно настоящему изобретению содержат одну рекомбинантную нуклеиновую кислоту. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы содержат множество рекомбинантных нуклеиновых кислот. Согласно некоторым вариантам реализации онколитический вирус избирательно инфицирует клетку–мишень. Согласно некоторым вариантам реализации клетка–мишень представляет собой опухолевую клетку, причем онколитический вирус способен избирательно реплицироваться в опухолевой клетке.

[0014] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающий полипептид представляет собой двойной полипептид и состоит из антитела, домена антитела, вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, антитела с двойным вариабельным доменом (dual–variable–domain antibody, DVD–Ig), тандемного диатела, диатела, антитела flexibody, антитела, полученного методом «замка на причале» («dock and lock»), полипептида Scorpion, одноцепочечного вариабельного фрагмента (single chain variable fragment, scFv), BiTE (bi–specific T–cell engager, привлекающего T–клетки биспецифического активатора), DuoBody, IgG со сконструированным Fc, Fcab, Mab2 или полипептида DART.

[0015] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая любой из псевдотипированных онколитических вирусов, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус индуцирует иммунный ответ. Согласно некоторым вариантам реализации иммунный ответ является избирательно цитотоксическим в отношении клетки–мишени. Согласно некоторым вариантам реализации клетка–мишень представляет собой клетку солидной опухоли или клетку гематологического рака. Согласно некоторым вариантам реализации клетка–мишень экспрессирует один или более опухолевых антигенов. Согласно некоторым вариантам реализации один или более опухолевых антигенов выбраны из таблицы 2.

[0016] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения рака у субъекта, который нуждается в таком лечении, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества онколитического вируса, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации способ дополнительно включает введение субъекту, который нуждается в таком введении, одного или более дополнительных вариантов терапии. Согласно некоторым вариантам реализации один или более дополнительных вариантов терапии включают хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию, иммунотерапию, гормональную терапию или комбинацию указанных вариантов терапии.

[0017] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения одной или более опухолей у субъекта, который нуждается в таком лечении, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества онколитического вируса, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, пациенту, причем одна или более опухолей экспрессируют опухолевый антиген.

[0018] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ выбора пациента для лечения, причем указанный способ включает (a) определение экспрессии опухолевого антигена на одной или более опухолевых клетках, полученных от пациента; и (b) введение онколитического вируса, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, если опухолевые клетки, полученные от пациента, экспрессируют один или более опухолевых антигенов. Согласно некоторым вариантам реализации один или более опухолевых антигенов выбраны из таблицы 2. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ доставки привлекающего полипептида и терапевтического полипептида в участок опухоли, причем указанный способ включает введение пациенту, который нуждается в таком введении, онколитического вируса, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0019] ФИГ. 1 иллюстрирует последовательность аминокислот двойного полипептида CD19–CD3, содержащего первый одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), направленный против CD19, соединенный со вторым scFv, направленным против CD3.

[0020] ФИГ. 2 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции CD19–CD3–IL15, кодируемой бицистронным геном. Первый ген кодирует двойной полипептид, содержащий первый scFv, направленный против CD19, соединенный со вторым scFv, направленным против CD3. Второй ген, кодирующий ИЛ–15, присоединен к последовательности двойного гена посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A.

[0021] ФИГ. 3 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции CD19–CD3–IL12, кодируемой мультицистронным геном. Первый ген кодирует двойной полипептид, содержащий первый scFv, направленный против CD19, соединенный со вторым scFv, направленным против CD3. Второй ген, кодирующий субъединицу p35 ИЛ–12, присоединен к последовательности двойного гена посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A, и третий ген, кодирующий субъединицу p40 ИЛ–12, присоединен посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A.

[0022] ФИГ. 4 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции CD19–CD3–CXCL10, кодируемой бицистронным геном. Первый ген кодирует двойной полипептид, содержащий первый scFv, направленный против CD19, соединенный со вторым scFv, направленным против CD3. Второй ген, кодирующий CXCL10, присоединен к последовательности двойного гена посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A.

[0023] ФИГ. 5 иллюстрирует последовательность аминокислот двойного полипептида SIRP1α–CD3, содержащего первый белок, который содержит первые 120 аминокислот SIRP1α, присоединенный посредством линкера длиной в одну аминокислоту к scFv, направленному против CD3.

[0024] ФИГ. 6 иллюстрирует последовательность аминокислот двойного полипептида SIRP1α–CD3–LL, содержащего первый белок, который содержит первые 120 аминокислот SIRP1α, присоединенный посредством линкера на основе мотива G4S к scFv, направленному против CD3.

[0025] ФИГ. 7 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции SIRP1α–CD3–IL15, кодируемой бицистронным геном. Первый ген кодирует двойной полипептид, который содержит первые 120 аминокислот SIRP1α, присоединенный посредством линкера длиной в одну аминокислоту к scFv, направленному против CD3. Второй ген, кодирующий ИЛ–15, присоединен к последовательности двойного гена посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A.

[0026] ФИГ. 8 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции SIRP1α–CD3–IL15–LL, кодируемой бицистронным геном. Первый ген кодирует двойной полипептид, который содержит первые 120 аминокислот SIRP1α, присоединенный посредством линкера на основе мотива G4S к scFv, направленному против CD3. Второй ген, кодирующий ИЛ–15, присоединен к последовательности двойного гена посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A.

[0027] ФИГ. 9 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции SIRP1α–CD3–IL12, кодируемой мультицистронным геном. Первый ген кодирует двойной полипептид, который содержит первые 120 аминокислот SIRP1α, присоединенный посредством линкера длиной в одну аминокислоту к scFv, направленному против CD3. Второй ген, кодирующий субъединицу p35 ИЛ–12, присоединен к последовательности двойного гена посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A, и третий ген, кодирующий субъединицу p40 ИЛ–12, присоединен посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A.

[0028] ФИГ. 10 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции SIRP1α–CD3–IL12–LL, кодируемой мультицистронным геном. Первый ген кодирует двойной полипептид, который содержит первые 120 аминокислот SIRP1α, присоединенный посредством линкера на основе мотива G4S к scFv, направленному против CD3. Второй ген, кодирующий субъединицу p35 ИЛ–12, присоединен к последовательности двойного гена посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A, и третий ген, кодирующий субъединицу p40 ИЛ–12, присоединен посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A.

[0029] ФИГ. 11 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции SIRP1α–CD3–CXCL10, кодируемой бицистронным геном. Первый ген кодирует двойной полипептид, который содержит первые 120 аминокислот SIRP1α, присоединенный посредством линкера длиной в одну аминокислоту к scFv, направленному против CD3. Второй ген, кодирующий CXCL10, присоединен к последовательности двойного гена посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A.

[0030] ФИГ. 12 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции SIRP1α–CD3–CXCL10–LL, кодируемой бицистронным геном. Первый ген кодирует двойной полипептид, который содержит первые 120 аминокислот SIRP1α, присоединенный посредством линкера на основе мотива G4S к scFv, направленному против CD3. Второй ген, кодирующий CXCL10, присоединен к последовательности двойного гена посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A.

[0031] ФИГ. 13 иллюстрирует последовательность аминокислот двойного полипептида PDL1–CD3, содержащего первый scFv, направленный против PDL1, соединенный со вторым scFv, направленным против CD3.

[0032] ФИГ. 14 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции PDL1–CD3–IL15, кодируемой бицистронным геном. Первый ген кодирует двойной полипептид, содержащий первый scFv, направленный против PDL1, соединенный со вторым scFv, направленным против CD3. Второй ген, кодирующий ИЛ–15, присоединен к последовательности двойного гена посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A.

[0033] ФИГ. 15 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции PDL1–CD3–IL12, кодируемой мультицистронным геном. Первый ген кодирует двойной полипептид, содержащий первый scFv, направленный против PDL1, соединенный со вторым scFv, направленным против CD3. Второй ген, кодирующий субъединицу p35 ИЛ–12, присоединен к последовательности двойного гена посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A, и третий ген, кодирующий субъединицу p40 ИЛ–12, присоединен посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A.

[0034] ФИГ. 16 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции PDL1–CD3–CXCL10, кодируемой бицистронным геном. Первый ген кодирует двойной полипептид, содержащий первый scFv, направленный против PDL1, соединенный со вторым scFv, направленным против CD3. Второй ген, кодирующий CXCL10, присоединен к последовательности двойного гена посредством самоотщепляемого полипептидного линкера T2A.

[0035] ФИГ. 17 иллюстрирует последовательность аминокислот тройного полипептида PDL1–CD3–Fc, содержащего первый scFv, направленный против CD3, соединенный посредством линкера на основе мотива G4S со вторым scFv, направленным против PDL1, который в свою очередь соединен с доменом CH2–CH3 IgG1 человека посредством шарнира IgG1.

[0036] ФИГ. 18 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции SIRP1α–CD3–MMP9–SL, кодируемой бицистронным геном (ФИГ. 18A), и последовательность аминокислот конструкции SIRP1α–CD3–MMP9–LL, кодируемой бицистронным геном (ФИГ. 18B).

[0037] ФИГ. 19A – 19C иллюстрируют связывание конструкций CD19–CD3 BiTE (ФИГ. 19A), конструкций SIRP1α–CD3 BiTE (ФИГ. 19B) и тройных привлекающих T–клетки активаторов PDL1–CD3–Fc (ФИГ. 19C) с CD3⁺ Т–клетками.

[0038] ФИГ. 20 иллюстрирует количественное определение связывания конструкции, привлекающей T–клетки, представленной на ФИГ. 19.

[0039] ФИГ. 21 иллюстрирует CD3–специфичное связывание конструкций CD19–CD3 BiTE (ФИГ. 21A), конструкций SIRP1α–CD3 BiTE (ФИГ. 21B) и тройных привлекающих T–клетки активаторов PDL1–CD3–Fc (ФИГ. 21C) с применением антитела против CD3, OKT3.

[0040] ФИГ. 22 иллюстрирует специфичность плеча SIRP1α, связывающего CD47, конструкции SIRP1α–CD3 BiTE.

[0041] ФИГ. 23A – ФИГ. 23B иллюстрируют связывание конструкций CD19–CD3 и SIRP1α–CD3 BiTE (ФИГ. 23A) с клетками Раджи (CD19⁺CD47⁺). % связывания количественно определен на ФИГ. 23B.

[0042] ФИГ. 24A – ФИГ. 24B иллюстрируют связывание конструкций CD19–CD3 и SIRP1α–CD3 BiTE (ФИГ. 24A) с клетками U2OS (CD19^–CD47⁺). % связывания количественно определен на ФИГ. 24B.

[0043] ФИГ. 25A – ФИГ. 25B иллюстрируют связывание конструкций CD19–CD3 и SIRP1α–CD3 BiTE (ФИГ. 25A) с клетками GBM30–luc (CD19^–CD47⁺). % связывания количественно определен на ФИГ. 25B.

[0044] ФИГ. 26A – ФИГ. 26B иллюстрируют связывание конструкций CD19–CD3 и SIRP1α–CD3 BiTE (ФИГ. 26A) с клетками U251 (CD19^–CD47⁺). % связывания количественно определен на ФИГ. 26B.

[0045] ФИГ. 27A – ФИГ. 27C иллюстрируют связывание тройных привлекающих T–клетки конструкций PDL1–Fc–CD3 с клетками U251. Связывание конструкций PDL1–Fc–CD3 (ФИГ. 27B) сравнивали со связыванием антитела против PDL1 (ФИГ. 27A). Связывание не было опосредовано FcγR, поскольку клетки U251 не экспрессируют FcγRI, FcγRII или FcγRIII (ФИГ. 27C).

[0046] ФИГ. 28 иллюстрирует опосредованную тройными привлекающими T–клетки активаторами CD19–CD3 BiTE, SIRP1α–CD3 BiTE и PDL1–CD3–Fc зависимую от Т–клеток цитотоксичность (Т–КЦ) клеток Раджи.

[0047] ФИГ. 29 иллюстрирует опосредованную тройными привлекающими T– клетки активаторами CD19–CD3 BiTE и PDL1–CD3–Fc Т–КЦ клеток THP1.

[0048] ФИГ. 30 иллюстрирует опосредованную тройными привлекающими T– клетки активаторами CD19–CD3 BiTE и PDL1–CD3–Fc Т–КЦ клеток U251.

[0049] ФИГ. 31 иллюстрирует опосредованную SIRP1α–CD3 BiTE Т–КЦ клеток 293F по сравнению с контрольной конструкцией на основе слияния с остеопонтином.

[0050] ФИГ. 32 иллюстрирует экспрессию конструкций SIRP1α–CD3 BiTE с векторов онколитических ВПГ. Показаны экспрессия конструкций SIRP1α–CD3 BiTE с короткими линкерами (дорожки 1–4 и ONCR085 на дорожках 5–6, представленных на ФИГ. 5) и конструкций SIRP1α–CD3 BiTE с длинными линкерами (ONCR087 на дорожках 7–8, представленных на ФИГ. 6).

[0051] ФИГ. 33 иллюстрирует экспрессию конструкций PDL1–CD3–Fc BiTE с векторов онколитических ВПГ. Очищенный белок PDL1–CD3–Fc BiTE представлен на дорожках 1–4. Концентрированные супернатанты вируса представлены на дорожках 5–6.

[0052] ФИГ. 34A – ФИГ. 34B иллюстрирует Т–КЦ клеток U251 посредством продуцированных вирусом конструкций SIRP1α–CD3, SIRP1α–CD3–LL и PDL1–CD3–Fc BiTE. Фотографии культур клеток U251 после инкубации с указанными конструкциями BiTE и CD8+ Т–клетками представлены на ФИГ. 34A. Активность продуцированных вирусом конструкций BiTE, измеренная в виде % от уничтожения клеток, которую количественно определяли методом проточной цитометрии, представлена на ФИГ. 34B.

[0053] ФИГ. 35 иллюстрирует, что ультрафильтрация на фильтре Amicon эффективно удаляет вирус из образцов, что определяли методом вестернблоттинга с поликлональным антителом против ВПГ, и свидетельствует, что уничтожение посредством BiTE обусловлено BiTE, а не вирусной инфекцией.

[0054] ФИГ. 36 иллюстрирует графическое представление продукции псевдотипированного онколитического вируса и рекомбинантного онколитического вируса, а также инфекции клетки–мишени соответствующим псевдотипированным онколитическим вирусом и рекомбинантным онколитическим вирусом.

[0055] ФИГ. 37 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции SIRP1α–CD3–PDL1–Fc (SL), кодируемой бицистронным геном, причем первый ген кодирует scFv против PDL1, присоединенный к Fc–домену IgG1, и второй ген кодирует двойной полипептид, который содержит первые 120 аминокислот SIRP1α, присоединенные посредством линкера длиной в одну аминокислоту к scFv, направленному против CD3.

[0056] ФИГ. 38 иллюстрирует последовательность аминокислот конструкции SIRP1α–CD3–PDL1–Fc (LL), кодируемой бицистронным геном, причем первый ген кодирует scFv против PDL1, присоединенный к Fc–домену IgG1, и второй ген кодирует двойной полипептид, который содержит первые 120 аминокислот SIRP1α, присоединенные посредством линкера на основе мотива G4S к scFv, направленному против CD3.

[0057] ФИГ. 39 иллюстрирует схему плазмиды экспрессии SIRP1α–CD3–PDL1–Fc. Были получены две конструкции плазмиды: одна для SIRP1α–CD3–PDL1–Fc (SL) и вторая для SIRP1α–CD3–PDL1–Fc (LL).

[0058] ФИГ. 40 иллюстрирует очистку SIRP1α–CD3 BiTE (SL), SIRP1α–CD3 BiTE (LL) и соединений против PDL1–Fc от супернатантов трансфицированных 293 Т–клеток. ФИГ. 40A демонстрирует очистку соединений против PDL1–Fc, которую оценивали с применением красителя Кумасси. ФИГ. 40B иллюстрирует очистку соединений SIRP1α–CD3 BiTE, которую оценивали методом вестернблоттинга с применением идентифицирующего антитела против His.

[0059] ФИГ. 41 демонстрирует результаты анализа блокады PD1/PDL1. Схема анализа представлена на ФИГ. 41A – ФИГ. 41B. Результаты анализа блокады PD1/PDL1 с применением соединения против PDL1–Fc, продуцированного из трансфицированных клеток 293, представлены на ФИГ. 41C

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0060] В настоящем изобретении предложены новые сконструированные онколитические вирусы, в частности, псевдотипированные онколитические вирусы, которые продуцируют полисоставные полипептиды и/или другие терапевтические полипептиды для лечения рака, включая солидные опухоли (например, распространенные солидные опухоли) и гематологические злокачественные образования. Согласно некоторым вариантам реализации онколитический вирус является сконструированным посредством псевдотипирования или другой рекомбинантной технологии с целью модулирования тропизма вируса для получения в результате вирусной инфекции, специфичной в отношении опухолевых клеток и/или окружающей стромы опухоли и/или для других благоприятных целей, как представлено в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации полисоставные и/или терапевтические полипептиды, продуцированные онколитическими вирусами, описанными в настоящем документе, опосредуют или усиливают противоопухолевые эффекты онколитических вирусов, например, посредством опосредованного эффекторными клетками лизиса клеток–мишеней (например, опухолевых клеток). Онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, могут характеризоваться множественными (например, двойными) способами действия, включая опосредованный эффекторными клетками цитолиз клеток–мишеней в результате экспрессии полисоставных полипептидов и опосредованное вирусом разрушение клеток–мишеней. В настоящем изобретении также предложены терапевтические композиции, содержащие сконструированные онколитические вирусы, и способы их применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных образований.

Обзор

[0061] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены псевдотипированные онколитические вирусы, их композиции и способы применения для лечения рака. Псевдотипированные онколитические вирусы, предложенные в настоящем документе, содержат рекомбинантные нуклеиновые кислоты, которые кодируют привлекающие полипептиды и/или другие терапевтические молекулы (например, терапевтические полипептиды). Как правило, привлекающие полипептиды функционируют в качестве привлекающих эффекторную клетку активаторов и обычно содержат первый домен, направленный против молекулы активации, экспрессированной на эффекторной клетке (например, домен активации или привлекающий домен), и второй домен, направленный против антигена клетки–мишени (например, домен распознавания антигена) или другой молекулы поверхности клетки (например, домен терапевтической молекулы). Также предложены двойные, тройные или полисоставные полипептиды (например, содержащие один или более привлекающих доменов, один или более доменов распознавания антигена или один или более доменов терапевтической молекулы и, необязательно, один или более других функциональных доменов).

[0062] Также предложены способы лечения рака, причем указанные способы включают этап доставки субъекту–человеку, который нуждается в таком лечении, терапевтически эффективного количества онколитических вирусов или фармацевтических композиций указанных вирусов, предложенных в настоящем документе. Такие способы необязательно включают этап доставки субъекту–человеку дополнительной противораковой терапии, такой как хирургическое вмешательство, лучевая терапия, химиотерапия, иммунотерапия, гормональная терапия или комбинации указанных вариантов терапии.

Определения

[0063] В настоящем документе формы единственного числа включают упоминания объектов во множественном числе, если контекст однозначно не диктует обратное.

[0064] По всему тексту настоящего описания, если контекст не предписывает иного, слова «включать» либо «содержать» или их варианты, такие как «включает», «содержит» или «включающий», «содержащий» следует понимать как подразумевающие включение указанного элемента или целого числа либо группы элементов или целых чисел, но не исключение любого другого элемента или целого числа либо группы элементов или целых чисел.

[0065] В настоящей заявке термины «приблизительно» и «ориентировочно» используются в качестве эквивалентов. Любые цифры, используемые в настоящей заявке со словами приблизительно/ориентировочно или без данных слов предназначены для включения любых нормальных отклонений, как понимает средний специалист в соответствующей области техники. Согласно определенным вариантам реализации термин «ориентировочно» или «приблизительно» обозначает диапазон значений, которые находятся в пределах 30%, 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее в любом направлении (выше или ниже) от указанного эталонного значения, если не указано обратное или если обратное не является очевидным из контекста (за исключением случаев, когда такое число превысит 100% возможного значения).

[0066] В настоящем описании «субъект» или «субъекты», или «индивидуумы» включают, без ограничения, млекопитающих, таких как люди или млекопитающие, отличные от человека, включая одомашненных, сельскохозяйственных или диких животных, а также птиц и водных животных. Согласно некоторым вариантам реализации субъекты представляют собой домашний скот, такой как крупный рогатый скот, овцы, козы, коровы, свиньи и т.п.; домашнюю птицу, такую как куры, утки, гуси, индюки и т.п.; и одомашненных животных, таких как собаки и кошки. Согласно некоторым вариантам реализации (например, в особенности в контекстах исследования) субъекты представляют собой грызунов (например, мышей, крыс, хомяков), кроликов, приматов или свиней, таких как инбредные свиньи и т.п. Согласно конкретным вариантам реализации субъект представляет собой человека. «Пациенты» представляют собой субъектов, страдающих от или подверженных риску развития заболевания, нарушения или состояния, или которые по другой причине нуждаются в композициях и способах, предложенных в настоящем документе. Ни один из терминов не требует или не ограничен ситуациями, которые характеризуются наблюдением (например, постоянным или периодическим) со стороны работника системы здравоохранения (например, врача, дипломированной медицинской сестры, практикующей медицинской сестры, помощника врача, санитара или работника хосписа).

[0067] В настоящем документе «лечение» обозначает любые показатели успеха в лечении или облегчении заболевания или состояния, в частности, рака. Лечение можно осуществлять in vitro и/или in vivo, и лечение может включать доставку онколитического вируса или композиции на его основе, описанных в настоящем документе, пациенту или субъекту, который нуждается в таком лечении. Согласно некоторым вариантам реализации лечение включает, например, снижение, отсрочивание или облегчение тяжести одного или более симптомов заболевания или состояния, и/или снижение частоты, с которой субъект или пациент испытывает симптомы заболевания, патологии, нарушения или нежелательного состояния. В настоящем документе «лечить или предотвращать» используется для обозначения способа, который приводит к некоторому уровню лечения или облегчения заболевания или состояния и который охватывает диапазон результатов, направленных на достижение данной цели, включая, без ограничения, полное предотвращение состояния.

[0068] В настоящем документе «предотвращение» обозначает предотвращение заболевания или состояния, например, образования опухоли, у пациента или субъекта, и может также обозначаться как «профилактическое лечение». Предотвращение развития заболевания может обозначать полное предотвращение симптомов заболевания, отсрочивание манифестации заболевания или снижение тяжести симптомов развившегося впоследствии заболевания. В качестве неограничивающего иллюстративного примера, если индивидуум, подверженный риску развития опухоли или другой формы рака, получает лечение способами согласно настоящему изобретению, и у него впоследствии не развивается опухоль или другая форма рака, тогда заболевание у данного индивидуума было предотвращено, по меньшей мере в течение некоторого времени.

[0069] Термины «терапевтически эффективное количество» и «терапевтически эффективная доза» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и обозначают количество онколитического вируса или композиции на его основе, которое является достаточным для обеспечения благоприятного эффекта или для снижения вредного неблагоприятного события иным способом (например, количество или доза, достаточные для лечения заболевания). Точное количество или доза онколитического вируса, которая содержится в терапевтически эффективном количестве, или терапевтически эффективная доза зависит от множества факторов, включая: цель лечения; массу тела, пол, возраст и общее состояние здоровья субъекта или пациента; путь введения; сроки введений; и природу заболевания, лечение которого проводят. Терапевтически эффективное количество для данного субъекта или пациента устанавливается специалистом в данной области техники с применением известных методик (см., например, руководства Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1–3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); и Pickar, Dosage Calculations (1999)).

[0070] «Псевдотип» обозначает вирусную частицу, в которой часть вирусной частицы (например, оболочка или капсид) содержит гетерологичные белки, такие как вирусные белки, полученные из гетерологичного вируса, или невирусные белки. Невирусные белки могут включать антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. Предпочтительно, псевдотипированный вирус способен к i) измененному тропизму по сравнению с непсевдотипированным вирусом, и/или ii) снижению или устранению неблагоприятного эффекта. Например, согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный вирус демонстрирует сниженную токсичность или сниженное инфицирование неопухолевых клеток или неопухолевой ткани по сравнению с непсевдотипированным вирусом.

[0071] Термин «нацеливающий фрагмент» обозначает в настоящем документе гетерологичный белок, присоединенный к вирусной частице, который способен к связыванию с белком на поверхности клетки выбранного типа для направления взаимодействия между вирусной частицей и выбранным типом клетки. Нацеливающий фрагмент может быть присоединен ковалентно или нековалентно, и обычно присоединен к белку оболочки, например, E1, E2 или E3. Иллюстративные нацеливающие фрагменты включают антитела, их антигенсвязывающие фрагменты и лиганды рецепторов. Вирусный белок «оболочки» («envelope»), или белок «Env», обозначает любую полипептидную последовательность, которая находится на поверхности липидного бислоя вириона и функция которой заключается в опосредовании поглощения и проникновения в клетки–хозяева, чувствительные к инфекции.

[0072] Термин «вектор» используется в настоящем документе для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной переносить или транспортировать другую молекулу нуклеиновой кислоты. Переносимая нуклеиновая кислота обычно присоединена к молекуле нуклеиновой кислоты вектора, например, встроена в нее. Вектор может содержать последовательности, которые направляют автономную репликацию в клетке, или может содержать последовательности, достаточные для обеспечения интеграции в ДНК клетки–хозяина. Согласно некоторым вариантам реализации вектор представляет собой вирус (т.е. вирусный вектор или онколитический вирусный вектор), и переносимая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующую привлекающую молекулу и/или терапевтическую молекулу. Вирусный вектор может иногда обозначаться как «рекомбинантный вирус» или «вирус». Термины «онколитический вирус» и «онколитический вектор» используются в настоящем документе взаимозаменяемо.

[0073] «Геном нуклеиновой кислоты» или «вирусный геном» обозначает компонент вирусной частицы, представляющий собой нуклеиновую кислоту, который кодирует геном вирусной частицы, включая любые белки, необходимые для репликации и/или интеграции генома. Согласно некоторым вариантам реализации вирусный геном выступает в качестве вирусного вектора и может содержать гетерологичный ген, функционально присоединенный к промотору. Промотор может являться нативным или гетерологичным в отношении гена и может быть вирусным или невирусным по происхождению. Вирусные геномы, описанные в настоящем документе, могут быть основаны на любом вирусе, могут представлять собой геном РНК или ДНК, и могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Предпочтительно, геном нуклеиновой кислоты получен из семейства Rhabdoviridae.

[0074] «Ретровирусные векторы» в настоящем документе обозначают вирусные векторы на основе вирусов семейства Retroviridae. В своей форме дикого типа (ДТ) ретровирусные векторы, как правило, содержат геном нуклеиновой кислоты. В настоящем документе предложены псевдотипированные ретровирусные векторы, которые дополнительно содержат гетерологичный ген, такой как последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты, описанная в настоящем документе.

[0075] Термин «фрагмент антитела или его производное» включает полипептидные последовательности, содержащие по меньшей мере один CDR и способные к специфичному связыванию с антигеном–мишенью. Термин также относится к одноцепочечным антителам или их фрагментам, синтетическим антителам, фрагментам антител, таким как Ig верблюдовых, Ig NAR, Fab–фрагменты, Fab'–фрагменты, F(ab)'2–фрагменты, F(ab)'3–фрагменты, Fv, одноцепочечные Fv–антитела («scFv»), bis–scFv, (scFv)2, миниантителу, диателу, триателу, тетрателу, стабилизированному дисульфидной связью белку Fv («dsFv») и однодоменному антителу (sdAb, наноантителу) и т.д. или к модифицированному химическим способом производному любой из перечисленных молекул. Согласно некоторым вариантам реализации антитела или их соответствующая цепь или цепи иммуноглобулина являются дополнительно модифицированными посредством применения, например, делеции или делеций, вставки или вставок, замены или замен, добавления или добавлений и/или рекомбинации или рекомбинаций аминокислот и/или любой другой модификации или модификаций (например, посттрансляционных и химических модификаций, таких как гликозилирование и фосфорилирование), самой по себе или в комбинации. Способы введения таких модификаций в последовательность ДНК, лежащую в основе последовательности аминокислот цепи иммуноглобулина, хорошо известны специалисту в данной области техники.

[0076] Термин «одноцепочечный», используемый согласно настоящему описанию изобретения, обозначает ковалентную связь двух или более полипептидных последовательностей, предпочтительно, в форме колинейной последовательности аминокислот, кодируемой одной молекулой нуклеиновой кислоты.

[0077] Термины «связывание с» и «взаимодействие с» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и обозначают взаимодействие по меньшей мере двух «антигенвзаимодействующих участков» друг с другом. «Антигенвзаимодействующий участок» обозначает мотив полипептида (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента), способный к специфичному взаимодействию с антигеном или группой антигенов. Связывание/взаимодействие также понимают как определяющие «специфичное взаимодействие» или «специфичное связывание».

[0078] Термины «специфичное связывание» или «специфичное взаимодействие» обозначают антигенвзаимодействующий участок, который способен к специфичному взаимодействию и/или связыванию по меньшей мере с двумя аминокислотами молекулы–мишени, как определено в настоящем документе. Термин относится к способности антигенвзаимодействующего участка проводить различие между конкретными областями (например, эпитопами) молекул–мишеней, определенных в настоящем документе, в результате чего он не реагирует перекрестно или по существу не реагирует перекрестно с полипептидами подобных структур. Согласно некоторым вариантам реализации эпитопы являются линейными. Согласно некоторым вариантам реализации эпитопы являются конформационными эпитопами, структурными эпитопами или прерывистыми эпитопами, состоящими из двух областей молекул–мишеней человека или их частей. В контексте настоящего описания изобретения конформационный эпитоп определен двумя или более отдельными последовательностями аминокислот, разделенными в первичной последовательности, которые соединяются на поверхности свернутого белка. Специфичность и/или перекрестную реактивность панели антигенсвязывающих конструкций, исследование которых проводят, можно изучить, например, посредством оценки связывания панели конструкций с полипептидом, представляющим интерес, а также с некоторым количеством более или менее (структурно и/или функционально) близко родственных полипептидов в обычных условиях (см., например, руководства Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 и Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Только те конструкции, которые связываются с полипептидом/белком, представляющим интерес, и не связываются или по существу не связываются с любым из других полипептидов, считают специфичными в отношении полипептида/белка, представляющего интерес. Примеры специфичных взаимодействий антигенвзаимодействующего участка со специфичным антигеном включают, среди прочего, взаимодействие лигандов, которые индуцируют сигнал после связывания со своим специфичным рецептором, специфичность лиганда в отношении его рецептора, такого как цитокины, которые связываются со специфичными цитокиновыми рецепторами, и связывание антигенсвязывающего сайта антитела с антигенным эпитопом.

[0079] В некоторых случаях специфичное взаимодействие антигенвзаимодействующего участка с конкретным антигеном приводит к запуску сигнала, например, вследствие индукции изменения конформации антигена, олигомеризации антигена и т.д. Согласно некоторым вариантам реализации специфичное связывание включает принцип «ключ–замок». Вследствие этого согласно некоторым вариантам реализации специфичные мотивы в последовательности аминокислот антигенвзаимодействующего участка взаимодействуют со специфичными мотивами в антигене и связываются друг с другом в результате своей первичной, вторичной или третичной структуры, или в результате вторичных модификаций указанной структуры. Согласно некоторым вариантам реализации специфичное взаимодействие антигенвзаимодействующего участка с его специфичным антигеном приводит к простому связыванию сайта с антигеном.

Онколитические вирусы

[0080] Онколитические вирусы способны инфицировать, реплицироваться в опухолевых клетках и лизировать их, а также способны распространяться на другие опухолевые клетки в последовательных раундах репликации. Несмотря на то, что предшествующая терапия онколитическими вирусами на доклинических моделях и в клинических исследованиях представлялась многообещающей, противоопухолевая эффективность данных онколитических вирусов, таких как осповакцина, была неоптимальной. Например, данные вирусы демонстрировали ограниченное распространение вируса в опухоли и/или ограниченную активацию противоопухолевых Т–клеточных ответов в пределах опухоли. Вследствие этого в настоящем изобретении предложен онколитический вирус, который 1) облегчает инфильтрацию опухоли и активацию эффекторных клеток (например, Т–клеток), и 2) эффективно лизирует опухолевые клетки, не инфицированные вирусом (также известно как неспецифический цитолиз).

[0081] Согласно некоторым вариантам реализации предложены вирусные векторы, которые характеризуются преимуществами, включая одно или более из следующих свойств:

(i) векторы являются онколитическими и характеризуются в особенности высокой онколитической активностью по сравнению с другими ранее описанными онколитическими вирусными векторами;

(ii) векторы реплицируются преимущественно в опухолевых клетках и характеризуются в особенности высокой способностью к репликации по сравнению с другими онколитическими вирусными векторами;

(iii) векторы инфицируют активно делящиеся клетки, а также покоящиеся клетки;

(iv) векторы вызывают мощный врожденный, гуморальный и клеточный иммунный ответ;

(v) векторы реплицируются исключительно цитоплазматически, т.е., будучи РНК–вирусами, они не могут встраиваться в геном клетки–хозяина или рекомбинировать в компетентные по репликации вирусы;

(vi) векторы легко упаковываются; и/или

(vii) нативный вирусный гликопротеин является взаимозаменяемым с чужеродным белком оболочки.

[0082] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения относятся к рекомбинантным вирусам везикулярного стоматита (ВВС) и векторам ВВС. Геном ВВС содержит пять генов, l, m, n, p и g, которые кодируют белки L, M, N, P и G и являются важными для размножения вируса. N представляет собой нуклеопротеин, который упаковывает геномную РНК. Геном ВВС реплицируется в виде комплекса РНК – белок, и L и P вместе образуют полимеразный комплекс, который реплицирует геном ВВС и транскрибирует мРНК ВВС. M представляет собой матриксный белок, который обеспечивает структурную поддержку между липидной оболочкой и нуклеокапсидом и является важным для прорастания частицы через мембрану клетки. G представляет собой белок оболочки, который встроен в оболочку вируса и является важным для инфекционности и тропизма вируса.

Псевдотипированные онколитические вирусы

[0083] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены онколитические вирусы, способные быть псевдотипированными или сконструированными иным способом. «Псевдотипированные вирусы» обозначают вирусы, в которых один или более оболочечных белков (например, белки оболочки) были заменены или модифицированы. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный вирус способен к инфицированию типа клетки или ткани, который не способен инфицировать соответствующий непсевдотипированный вирус. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный вирус способен предпочтительно инфицировать тип клетки или ткани по сравнению с непсевдотипированным вирусом.

[0084] Как правило, вирусы характеризуются природными популяциями клеток–хозяев, которые они инфицируют наиболее эффективно. Например, ретровирусы характеризуются ограниченными диапазонами природных клеток–хозяев, тогда как аденовирусы и аденоассоциированные вирусы способны эффективно инфицировать относительно более широкий диапазон клеток–хозяев, несмотря на то, что некоторые типы клеток не поддаются инфекции данными вирусами. Белки на поверхности вируса (например, белки оболочки или белки капсида) опосредуют присоединение к чувствительной клетке–хозяину и поступление в нее и посредством этого определяют тропизм вируса, т.е. способность конкретного вируса инфицировать конкретный тип клетки или ткани. Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, содержат на поверхности вируса один тип белка. Например, ретровирусы и аденоассоциированные вирусы характеризуются одним белком, покрывающим их мембрану. Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, содержат на поверхности вируса более одного типа белка. Например, аденовирусы покрыты белком оболочки и волокнами, которые выходят за пределы поверхности вируса.

[0085] Белки на поверхности вируса могут связываться с молекулами поверхности клетки, такими как гепаринсульфат, посредством этого локализуя вирус на поверхности потенциальной клетки–хозяина. Белки на поверхности вируса могут также опосредовать взаимодействия между вирусом и специфичными белковыми рецепторами, экспрессированными на клетке–хозяине, которые вызывают структурные изменения в вирусном белке с целью опосредовать поступление вируса. В качестве альтернативы, взаимодействия между белками на поверхности вируса и рецепторами клетки могут облегчить интернализацию вируса в эндосомы, причем подкисление просвета эндосомы вызывает рефолдинг вирусной оболочки. В любом случае для поступления вируса в потенциальные клетки–хозяева требуется благоприятное взаимодействие между по меньшей мере одной молекулой на поверхности вируса и по меньшей мере одной молекулой на поверхности клетки.

[0086] Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, содержат вирусную оболочку (например, оболочку вируса или капсид вируса), причем белки, присутствующие на поверхности вирусной оболочки (например, белки оболочки вируса или белки капсида вируса), модулируют распознавание потенциальной клетки–мишени для поступления вируса. В некоторых случаях данный процесс определения вирусом потенциальной клетки–мишени для поступления обозначают как тропизм в отношении хозяина. Согласно некоторым вариантам реализации тропизм в отношении хозяина представляет собой клеточный тропизм, при котором распознавание рецептора вирусом происходит на клеточном уровне, или тканевой тропизм, при котором распознавание клеточных рецепторов вирусом происходит на тканевом уровне. В некоторых случаях вирусная оболочка вируса распознает рецепторы, присутствующие на одном типе клетки. В других случаях вирусная оболочка вируса распознает рецепторы, присутствующие на нескольких типах клеток (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более различных типов клеток). В некоторых случаях вирусная оболочка вируса распознает клеточные рецепторы, присутствующие на одном типе ткани. В других случаях вирусная оболочка вируса распознает клеточные рецепторы, присутствующие на множестве типов ткани (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более различных типов ткани).

[0087] Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, содержат вирусную оболочку, которая была модифицирована для включения белков поверхности из другого вируса с целью облегчения поступления вируса в конкретный тип клетки или ткани. Такие онколитические вирусы обозначают в настоящем документе как псевдотипированные онколитические вирусы. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы содержат вирусную оболочку, причем вирусная оболочка первого вируса заменена вирусной оболочкой второго, причем вирусная оболочка второго вируса позволяет псевдотипированному онколитическому вирусу инфицировать конкретный тип клетки или ткани. Согласно некоторым вариантам реализации вирусная оболочка содержит оболочку вируса. В некоторых случаях оболочка вируса содержит фосфолипидный бислой и белки, такие как белки, полученные из мембраны хозяина. Согласно некоторым вариантам реализации оболочка вируса дополнительно содержит гликопротеины для распознавания и присоединения к рецептору, экспрессируемому клеткой–хозяином. Согласно некоторым вариантам реализации вирусная оболочка содержит капсид. В некоторых случаях капсид собран из олигомерных белковых субъединиц, называемых протомерами. Согласно некоторым вариантам реализации капсид собран из одного типа протомера или белка либо собран из двух, трех, четырех или более типов протомеров или белков.

[0088] Согласно некоторым вариантам реализации характеризуется преимуществом ограничить или расширить диапазон клеток, чувствительных к трансдукции онколитическим вирусом, с целью онколитической терапии. С данной целью было разработано множество вирусов, в которых эндогенные белки вирусной оболочки (например, белки оболочки или капсида вируса) были заменены белками вирусной оболочки от других вирусов или химерными белками. Согласно некоторым вариантам реализации химерные белки состоят из частей вирусного белка, необходимых для встраивания в вирион, а также белков или нуклеиновых кислот, сконструированных для взаимодействия со специфичными белками клетки–хозяина, таких как нацеливающий фрагмент.

[0089] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, являются псевдотипированными с целью ограничения или контроля тропизма вируса (т.е. для уменьшения количества типов клетки или ткани, которые способен инфицировать псевдотипированный онколитический вирус). В большинстве стратегий, применявшихся для ограничения тропизма, использовали химерные белки вирусной оболочки (например, белки оболочки), связанные с фрагментами антитела. Данные вирусы демонстрируют большой потенциал для разработки вариантов онколитической терапии. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, являются псевдотипированными с целью расширения тропизма вируса (т.е. для увеличения количества типов клеток или ткани, которые способен инфицировать псевдотипированный онколитический вирус). Один механизм расширения клеточного тропизма вирусов (например, вирусов в оболочке) заключается в образовании фенотипически смешанных частиц или псевдотипов; данный процесс часто происходит в ходе сборки вируса в клетках, инфицированных двумя или более вирусами. Например, вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ–1). ВИЧ–1 инфицирует клетки, которые экспрессируют CCR4 с соответствующим корецептором. Однако ВИЧ–1 образует псевдотипы посредством встраивания гетерологичных гликопротеинов (glycoproteins, GP) вследствие фенотипического смешивания, в результате чего вирус становится способным инфицировать клетки, которые не экспрессируют рецептор CD4 и/или соответствующий корецептор; посредством этого расширяется тропизм вируса. В нескольких исследованиях было продемонстрировано, что ВИЧ–1 дикого типа, продуцированный в клетках, инфицированных ксенотропным вирусом лейкоза мышей (ВЛМ), амфотропным ВЛМ или вирусом простого герпеса, вызывает образование фенотипически смешанных вирионов с расширенным диапазоном хозяев, что свидетельствует о том, что были продуцированы псевдотипированные вирионы. Как было продемонстрировано, фенотипическое смешивание вирусных GP также возникает между ВИЧ–1 и ВВС в коинфицированных культурах клеток. Данные начальные наблюдения послужили ключом для последующего конструирования лентивирусных векторов на основе ВИЧ–1, несущих гетерологичные GP.

[0090] Существует постоянно растущий перечень альтернативных GP для псевдотипирования лентивирусов, каждый из которых характеризуется конкретными преимуществами и недостатками. Широкое применение G–белков ВВС (ВВС–G) для псевдотипирования лентивирусов сделало данный GP в действительности стандартом, с которым сравнивают применимость других вирусных GP для образования псевдотипов. Дополнительные неограничивающие примеры псевдотипов лентивируса включают псевдотипы, несущие полученные из лиссавируса GP, псевдотипированные лентивирусы, несущие GP вируса лимфатического хориоменингита, псевдотипы лентивируса, несущие GP альфавируса (например, лентивирусные векторы, псевдотипированные GP RRV (Ross River virus, вируса Росс–Ривер) и SFV (Semliki Forest virus, вируса леса Семлики), лентивирусные векторы, псевдотипированные GP вируса синдбис), псевдотипы, несущие GP филовируса, и псевдотипы лентивирусного вектора, содержащие GP64 бакуловируса.

[0091] Согласно некоторым вариантам реализации сконструированные (например, псевдотипированные) вирусы способны к связыванию с опухолью и/или опухолевой клеткой, как правило, посредством связывания с белком, липидом или углеводом, экспрессированным на опухолевой клетке. Согласно таким вариантам реализации сконструированные вирусы, описанные в настоящем документе, могут содержать нацеливающий фрагмент, который направляет вирус на конкретную клетку–хозяина. В некоторых случаях в качестве потенциальной мишени для онколитических вирусов согласно настоящему изобретению можно применять любой биологический материал поверхности клетки, известный в данной области техники или который еще предстоит идентифицировать, который дифференциально экспрессируется или иным способом присутствует на конкретном типе клетки или ткани (например, на опухоли или опухолевой клетке либо опухоль–ассоциированной строме или стромальной клетке). Согласно конкретным вариантам реализации материал поверхности клетки представляет собой белок. Согласно некоторым вариантам реализации нацеливающий фрагмент связывается с антигенами поверхности клетки, свидетельствующими о заболевании, таком как рак (например, молочной железы, легких, яичников, предстательной железы, толстой кишки, лимфома, лейкоз, меланома и другие); аутоиммунное заболевание (например, миастения гравис, множественный склероз, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, сахарный диабет и другие); инфекционное заболевание, включая инфекцию ВИЧ, ВГС (вирус гепатита С), ВГВ (вирус гепатита В), ЦМВ (цитомегаловирус) и ВПЧ (вирус папилломы человека); и генетическое заболевание, включая серповидноклеточную анемию, кистозный фиброз, болезнь Тея–Сакса, J3–талассемию, нейрофиброматоз, поликистозное заболевание почек, гемофилию и т.д. Согласно определенным вариантам реализации нацеливающий фрагмент нацеливается на антиген поверхности клетки, специфичный в отношении конкретного типа клетки или ткани, например, антигены поверхности клетки, присутствующие в нервной ткани, ткани легких, почек, мышечной, сосудистой, тироидной ткани, ткани глаза, молочной железы, яичников, яичек или предстательной железы.

[0092] Иллюстративные антигены и молекулы поверхности клетки для нацеливания включают, например P–гликопротеин, Her2/Neu, эритропоэтин (ЭПО), рецептор эпидермального фактора роста (РЭФР), рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста (Р–СЭФР), кадгерин, карциноэмбриональный антиген (КЭА), CD4, CD8, CD19, CD20, CD33, CD34, CD45, CD117 (c–kit), CD133, HLA–A, HLA–B, HLA–C, хемокиновый рецептор 5 (CCR5), транспортер–маркер стволовых клеток ABCG2, антиген рака яичников CA125, иммуноглобулины, интегрины, простатический специфический антиген (ПСА), антиген стволовых клеток предстательной железы (АСКП), – захватывающий неинтегрин молекулы межклеточной адгезии дендритных клеток (dendritic cell–specific intercellular adhesion molecule 3–grabbing nonintegrin, DC–SIGN), тироглобулин, гранулоцитарно–моноцитарный колониестимулирующий фактор (ГМ–КСФ), миогенный стимулирующий дифференциацию фактор–1 (myogenic differentiation promoting factor–1, MyoD–1), Leu–7 (CD57), LeuM–1, ассоциированный с пролиферацией клеток ядерный антиген человека, определенный моноклональным антителом Ki–67 (Ki–67), вирусные белки оболочки, gp120 ВИЧ, трансферриновый рецептор и т.д. Дополнительные антигены и молекулы поверхности клетки для нацеливания представлены в таблице 2.

[0093] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы, предложенные в настоящем документе, способны к избирательному поступлению, репликации в опухолевых клетках и/или их лизису. Такой вариант реализации проиллюстрирован на ФИГ. 36, где псевдотипированный онколитический вирус получает возможность поступать в клетку–мишень благодаря встраиванию вирусных гликопротеинов, полученных из отличного (т.е. гетерологичного) вируса, которые позволяют псевдотипированному онколитическому вирусу поступать в клетку–мишень. Напротив, непсевдотипированный онколитический вирус не способен получить возможность поступления в клетку–мишень в связи с непермиссивной природой белков оболочки. В некоторых случаях способность псевдотипированного онколитического вируса избирательно проникать, реплицироваться в опухолевых клетках и/или лизировать их обусловлена сниженным или по иной причине неэффективным клеточным ответом интерферона (ИФН). Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы продуцируют привлекающую молекулу и/или терапевтическую молекулу, такую как иммуномодулирующий полипептид, которая препятствует или нарушает клеточный ответ ИФН, тем самым усиливая репликацию псевдотипированного или сконструированного вируса.

[0094] Псевдотипированные онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, могут быть получены из множества вирусов, неограничивающие примеры которых включают вирус осповакцины, аденовирус, вирус простого герпеса 1 (ВПГ1), вирус миксомы, реовирус, полиовирус, вирус везикулярного стоматита (ВВС), вирус кори (ВК), вирус Ласса (ВЛ) и вирус болезни Ньюкасла (ВБН). Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, могут инфицировать по существу любой тип клетки. Иллюстративный лентивирус для применения в онколитической терапии представляет собой вирус иммунодефицита обезьян, покрытый белками оболочки, G–белком (GP), из ВВС. В некоторых случаях данный вирус обозначают как G–псевдотипированный лентивирус ВВС, и, как известно, он инфицирует практически универсальный ряд клеток.

[0095] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы согласно настоящему изобретению представляют собой вирусы ВВС, псевдотипированные против здоровых клеток головного мозга, т.е. нейронов, и демонстрируют в значительной степени сниженную токсичность. Поскольку во всех вариантах применения онколитического ВВС нейротропизм является дозолимитирующим фактором, применение вектора согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заключается в том, что вектор применяют для всех типов солидных опухолей.

[0096] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные векторы ВВС характеризуются одним или более ключевыми признаками, включая: (i) ВВС не является токсичным в отношении клеток; (ii) векторы концентрируют посредством ультрацентрифугирования без потери инфекционности; и (iii) векторы демонстрируют тропизм в отношении опухолевых клеток, тогда как нейроны и другие неопухолевые клетки инфицируются неэффективно. Для повышения безопасности в процессе применения реплицируемых вирусов в вариантах терапевтического применения согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система вектора, которая обеспечивает, что репликация, онколизис и продукция вирусов ВВС происходит исключительно в клетках, которые инфицированы по меньшей мере двумя дефектными по репликации взаимодополняющими векторам.

[0097] Согласно некоторым вариантам реализации генетический материал (например, белок вирусной оболочки или генетический материал кора) для получения псевдотипированного онколитического вируса получен из ДНК–вируса, РНК–вируса или из обоих типов вирусов. Согласно некоторым вариантам реализации ДНК–вирус представляет собой одноцепочечный (оц) ДНК–вирус, двухцепочечный (дц) ДНК–вирус или ДНК–вирус, содержащий области как оц, так и дц ДНК. Согласно некоторым вариантам реализации РНК–вирус представляет собой одноцепочечный (оц) РНК–вирус или двухцепочечный (дц) РНК–вирус. Согласно некоторым вариантам реализации оцРНК вирус дополнительно классифицируют на положительно–полярный РНК–вирус или отрицательно–полярный РНК–вирус.

[0098] В некоторых случаях генетический материал для получения псевдотипированного онколитического вируса получен из дцДНК–вируса любого из следующих семейств: Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, Alloherpesviridae, Herpesviridae, Malacoherpesviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Adenoviridae, Ampullaviridae, Ascoviridae, Asfaviridae, Baculoviridae, Bicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Fuselloviridae, Globuloviridae, Guttaviridae, Hytrosaviridae, Iridoviridae, Marseilleviridae, Mimiviridae, Nimaviridae, Pandoraviridae, Papillomaviridae, Phycodnaviridae, Plasmaviridae, поли–ДНК–вирусы, Polyomaviridae, Poxviridae, Sphaerolipoviridae или Tectiviridae.

[0099] В некоторых случаях генетический материал для получения псевдотипированного онколитического вируса получен из оцДНК–вируса любого из следующих семейств: Anelloviridae, Bacillariodnaviridae, Bidnaviridae, Circoviridae, Geminiviridae, Inoviridae, Microviridae, Nanoviridae, Parvoviridae или Spiraviridae.

[00100] Согласно некоторым вариантам реализации генетический материал для получения псевдотипированного онколитического вируса получен из ДНК–вируса, содержащего области как оцДНК, так и дцДНК. В некоторых случаях ДНК–вирус относится к группе плеолиповирусов. В некоторых случаях плеолиповирусы включают плеоморфный вирус 1 Haloarcula hispanica, плеоморфный вирус 1 Halogeometricum, плеоморфный вирус 1 Halorubrum, плеоморфный вирус 2 Halorubrum, плеоморфный вирус 3 Halorubrum или плеоморфный вирус 6 Halorubrum.

[00101] В некоторых случаях генетический материал для получения псевдотипированного онколитического вируса получен из дцРНК–вируса любого из следующих семейств: Birnaviridae, Chrysoviridae, Cystoviridae, Endornaviridae, Hypoviridae, Megavirnaviridae, Partitiviridae, Picobirnaviridae, Reoviridae, Rotavirus или Totiviridae.

[00102] В некоторых случаях генетический материал для получения псевдотипированного онколитического вируса получен из положительно–полярного оцРНК–вируса любого из следующих семейств: Alphaflexiviridae, Alphatetraviridae, Alvernaviridae, Arteriviridae, Astroviridae, Barnaviridae, Betaflexiviridae, Bromoviridae, Caliciviridae, Carmotetraviridae, Closteroviridae, Coronaviridae, Dicistroviridae, Flaviviridae, Gammaflexiviridae, Iflaviridae, Leviviridae, Luteoviridae, Marnaviridae, Mesoniviridae, Narnaviridae, Nodaviridae, Permutotetraviridae, Picornaviridae, Potyviridae, Roniviridae, Secoviridae, Togaviridae, Tombusviridae, Tymoviridae или Virgaviridae.

[00103] В некоторых случаях генетический материал для получения псевдотипированного онколитического вируса получен из отрицательно–полярного оцРНК–вируса любого из следующих семейств: Bornaviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Nyamiviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, Ophioviridae или Orthomyxoviridae.

[00104] В некоторых случаях генетический материал для получения псевдотипированного онколитического вируса получен из онколитических ДНК–вирусов, симметрия капсида которых является икосаэдрической или сложной. В некоторых случаях икосаэдрические онколитические ДНК–вирусы являются безоболочечными или содержат оболочку. Иллюстративные семейства онколитических ДНК–вирусов включают Adenoviridae (например, аденовирус, размер генома которого составляет 36–38 т.о., тысяч оснований), Herpesviridae (например, ВПГ1, размер генома которого составляет 120–200 т.о.) и Poxviridae (например, вирус осповакцины и вирус миксомы, размер генома которых составляет 130–280 т.о.).

[00105] В некоторых случаях генетический материал для получения псевдотипированного онколитического вируса получен из онколитических РНК–вирусов, которые включают таковые, характеризующиеся икосаэдрической или спиральной симметрией капсида. В некоторых случаях икосаэдрические онколитические вирусы являются безоболочечными (не содержат оболочку) и включают Reoviridae (например, реовирус, геном которого составляет 22–27 т.о.) и Picornaviridae (например, полиовирус, размер генома которого составляет 7,2–8,4 т.о.). В других случаях спиральные онколитические РНК–вирусы являются оболочечеными и включают Rhabdoviridae (например, ВВС, размер генома которого составляет 13–16 т.о.) и Paramyxoviridae (например, ВК и ВБН, размер геномов которых составляет 16–20 т.о.).

[00106] В некоторых случаях генетический материал для получения псевдотипированного онколитического вируса получен из вируса, такого как вирус лейкоза Абельсона, вирус лейкоза мышей Абельсона, вирус Абельсона, вирус острого ларинготрахеобронхита, вирус Аделаид–Ривер, группа аденоассоциированных вирусов, аденовирус, вирус африканской чумы лошадей, вирус африканской лихорадки свиней, вирус СПИДа, парвовирус болезни алеутской норки, альфаретровирус, альфавирус, ВЛС (вирус лейкоза птиц) –связанный вирус, вирус Амапари, афтовирус, аквареовирус, арбовирус, арбовирус C, группа A арбовируса, группа B арбовируса, группа аренавирусов, вирус аргентинской геморрагической лихорадки, вирус аргентинской геморрагической лихорадки, артеривирус, астровирус, группа герпесвируса Ателин, вирус болезни Ауески, вирус Аура, вирус болезни Аусдак, лиссавирус австралийских летучих мышей, авиаденовирус, вирус эритробластоза птиц, вирус инфекционного бронхита птиц, вирус лейкоза птиц, вирус лейкемии птиц, вирус лимфоматоза птиц, вирус миелобластоза птиц, парамиксовирус птиц, вирус псевдочумы птиц, вирус ретикулоэндотелиоза птиц, вирус саркомы птиц, группа ретровируса птиц типа C, авигепаднавирус, авипоксвирус, вирус B, вирус B19, вирус Бабанки, герпесвирус павианов, бакуловирус, вирус Бармах–Форест, вирус Берабу, вирус Берримах, бетаретровирус, бирнавирус, вирус Биттнер, BK–вирус, вирус Блэк–Крик–Канал, вирус блутанг, вирус боливийской геморрагической лихорадки, вирус болезни Бома, вирус пограничной болезни овец, вирус Борна, альфагерпесвирус 1 крупного рогатого скота, альфагерпесвирус 2 крупного рогатого скота, коронавирус крупного рогатого скота, вирус эфемерной лихорадки крупного рогатого скота, вирус иммунодефицита крупного рогатого скота, вирус лейкоза крупного рогатого скота, вирус лейкемии крупного рогатого скота, вирус акромастита крупного рогатого скота, папилломавирус крупного рогатого скота, вирус папулезного стоматита крупного рогатого скота, парвовирус крупного рогатого скота, синцитиальный вирус крупного рогатого скота, онковирус типа C крупного рогатого скота, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, вирус Багги–Крик, группа вируса пулевидной формы, надгруппа вирусов Буньямвера, буньявирус, вирус лимфомы Беркитта, лихорадка Бвамба, CA–вирус, калицивирус, вирус калифорнийского энцефалита, вирус оспы верблюдов, вирус оспы канареек, герпесвирус собак, коронавирус собак, вирус чумки собак, герпесвирус собак, мелкий вирус собак, парвовирус собак, вирус Кано–Дельгадито, вирус артроэнцефалита коз, вирус энцефалита коз, герпесвирус коз, вирус оспы овец, кардиовирус, герпесвирус 1 свинковых, герпесвирус 1 мартышковых, герпесвирус 1 мартышковых, герпесвирус 2 мартышковых, вирус Чандипура, вирус Чангуйнола, вирус американского проточного сома, вирус Чарлевиль, вирус оспы кур, вирус чикунгунья, герпесвирус шимпанзе, реовирус голавля, вирус кеты, вирус Кокал, реовирус горбуши, вирус коитальной сыпи, вирус колорадской клещевой лихорадки, кольтивирус, вирус Колумбия SK, вирус простуды, вирус инфекцинной эктимы, вирус контагиозного пустулезного дерматита, коронавирус, вирус Коррипарта, вирус острого ринита, вирус коровьей оспы, вирус коксаки, ВЦП (вирус цитоплазматического полиэдроза), вирус паралича сверчка, вирус конго–крымской геморрагической лихорадки, вирус псевдокрупа, криптовирус, циповирус, цитомегаловирус, группа цитомегаловирусов, вирус цитоплазматического полиэдроза, папилломавирус оленевых, дельтаретровирус, вирус денге, денсовирус, депендовирус, вирус Дхори, дипломавирус, вирус C Drosophila, вирус гепатита B уток, вирус гепатита 1 уток, вирус гепатита 2 уток, дуовирус, вирус Дювенхейдж, вирус деформации крыла (ВДК), вирус восточного энцефалита лошадей, вирус восточного энцефаломиелита лошадей, вирус ЭБ (Эпштейна–Барр), вирус Эбола, Эбола–подобный вирус, вирус эхо, эховирус, эховирус 10, эховирус 28, эховирус 9, вирус эктромелии, вирус EEE (Eastern equine encephalitis, восточного энцефалита лошадей), вирус EIA (equine infectious anemia, инфекционной анемии лошадей), вирус EIA, вирус энцефалита, группа вируса энцефаломиокардита, вирус энцефаломиокардита, энтеровирус, вирус, повышающий уровень ферментов, вирус, повышающий уровень ферментов (ЛДГ, лактатдегидрогеназы), вирус эпидемической геморрагической лихорадки, вирус эпизоотической геморрагической болезни, вирус Эпштейна–Барр, альфагерпесвирус 1 непарнокопытных, альфагерпесвирус 4 непарнокопытных, герпесвирус 2 непарнокопытных, вирусный аборт кобыл, вирус артериита лошадей, вирус энцефалоза лошадей, вирус инфекционной анемии лошадей, морбилливирус лошадей, вирус ринопневмонии лошадей, риновирус лошадей, вирус Эбенангу, папилломавирус лосей, вирус европейской чумы свиней, вирус Эверглейдс, вирус Айах, герпесвирус 1 кошек, калицивирус кошек, вирус фибросаркомы кошек, герпесвирус кошек, вирус иммунодефицита кошек, вирус инфекционного перитонита кошек, вирус лейкоза/саркомы кошек, вирус лейкоза кошек, вирус панлейкопении кошек, парвовирус кошек, вирус саркомы кошек, синцитиальный вирус кошек, филовирус, вирус Фландерс, флавивирус, вирус ящура, вирус Форт–Морган, хантавирус Фор Корнерс, аденовирус 1 домашней птицы, вирус оспы кур, вирус Фрейнда, гаммаретровирус, вирус гепатита GB, GB–вирус, вирус германскорй кори, вирус Гета, вирус лейкоза гиббонов, вирус железистой лихорадки, вирус оспы коз, вирус золотистого шиммера, вирус Гономета, парвовирус гусей, вирус гранулеза, вирус Гросса, вирус гепатита B бурундука, группа A арбовирусов, вирус Гуанарито, цитомегаловирус морской свинки, вирус морской свинки типа C, вирус Хантаан, Хантавирус, реовирус венерки, вирус фибромы зайцев, ЦМВЧ (цитомегаловирус человека), вирус гемадсорбции 2, гемагглютинирующий вирус Японии, вирус геморрагической лихорадки, вирус Хендра, хенипавирусы, гепаднавирус, вирус гепатита A, группа вируса гепатита B, вирус гепатита C, вирус гепатита D, вирус гепатита дельта, вирус гепатита E, вирус гепатита F, вирус гепатита G, вирус гепатита, отличный от A и B, вирус гепатита, вирус гепатита (не человека), реовирус 3 гепатоэнцефаломиелита, гепатовирус, вирус гепатита B цапли, вирус герпеса B, вирус простого герпеса, вирус простого герпеса 1, вирус простого герпеса 2, герпесвирус, герпесвирус 7, герпесвирус коатов, Herpesvirus hominis, инфекция герпесвируса, герпесвирус саймири, Herpesvirus suis, герпесвирус ветряной оспы, вирус Хайлэнд J, рабдовирус Хайрам, вирус холеры свиней, аденовирус 2 человека, альфагерпесвирус 1 человека, альфагерпесвирус 2 человека, альфагерпесвирус 3 человека, B–лимфотропный вирус человека, бетагерпесвирус 5 человека, коронавирус человека, группа цитомегаловируса человека, пенящий вирус человека, гаммагерпесвирус 4 человека, гаммагерпесвирус 6 человека, вирус гепатита A человека, группа герпесвируса 1 человека, группа герпесвируса 2 человека, группа герпесвируса 3 человека, группа герпесвируса 4 человека, герпесвирус 6 человека, герпесвирус 8 человека, вирус иммунодефицита человека, вирус иммунодефицита человека 1, вирус иммунодефицита человека 2, папилломавирус человека, вирус T–клеточного лейкоза человека, вирус T–клеточного лейкоза I человека, вирус T–клеточного лейкоза II человека, вирус T–клеточного лейкоза III человека, вирус T–клеточной лимфомы I человека, вирус T–клеточной лимфомы II человека, T–клеточный лимфотропный вирус типа 1 человека, T–клеточный лимфотропный вирус типа 2 человека, T–лимфотропный вирус I человека, T–лимфотропный вирус II человека, T–лимфотропный вирус III человека, ихновирус, вирус детского гастроэнтерита, вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, вирус инфекционного гематопоэтического некроза, вирус инфекционного панкреатического некроза, вирус гриппа A, вирус гриппа B, вирус гриппа C, вирус гриппа D, вирус гриппа pr8, иридовирус насекомых, вирус насекомых, иридовирус, японский вирус B, вирус японского энцефалита, JC–вирус, вирус Джунин, герпесвирус, ассоциированный с саркомой Капоши, вирус Кемерово, вирус крыс Килхэма, вирус Кламат, вирус Колонго, вирус корейской геморрагической лихорадки, вирус кумба, вирус болезни кьясанурского леса, вирус Кызылагач, вирус Ла–Кросс, вирус, повышающий уровень лактатдегидрогеназы, вирус лагосских летучих мышей, вирус лангуров, парвовирус кроликов, вирус лихорадки Ласса, вирус Ласса, латентный вирус крыс, LCM–вирус, вирус Лики, лентивирус, лепорипоксвирус, вирус лейкоза, лейковирус, вирус болезни узелкового дерматита, лимфаденопатия–ассоциированный вирус, лимфокриптовирус, вирус лимфатического хориоменингита, группа лимфопролиферативных вирусов, вирус Мачупо, вирус инфекционного бульбарного паралича, группа онковирусов млекопитающих типа B, ретровирусы млекопитающих типа B, группа ретровируса млекопитающих типа C, ретровирусы млекопитающих типа D, вирус опухоли молочной железы, вирус Мапуэра, вирус Марбург, Марбург–подобный вирус, вирус обезьян Мэйзена–Пфейзера, мастаденовирус, вирус Майаро, ME–вирус, вирус кори, вирус Менангле, вирус Менго, менговирус, вирус Миддлбург, вирус ложной коровьей оспы, вирус энтерита норок, мелкий вирус мышей, ВЛМ (вирус лейкоза мышей) –родственный вирус, MM–вирус, вирус Мокола, моллюсципоксвирус, вирус контагиозного моллюска, вирус обезьян B, вирус оспы обезьян, мононегавирусы, морбилливирус, вирус летучих мышей горы Элгон, цитомегаловирус мышей, вирус энцефаломиелита мышей, вирус гепатита мышей, K–вирус мышей, вирус лейкоза мышей, вирус опухоли молочной железы мышей, мелкий вирус мышей, вирус пневмонии мышей, вирус полиомиелита мышей, полиомавирус мышей, вирус саркомы мышей, вирус оспы мышей, вирус Мозамбик, вирус Мукамбо, вирус заболевания слизистой оболочки, вирус эпидемического паротита, бетагерпесвирус 1 мышиных, цитомегаловирус 2 мышиных, группа цитомегаловирусов мышей, вирус энцефаломиелита мышей, вирус гепатита мышей, вирус лейкоза мышей, вирус мышей, вызывающий узелки, полиомавирус мышей, вирус саркомы мышей, муромегаловирус, вирус энцефалита долины Муррея, вирус миксомы, миксовирус, Myxovirus multiforme, Myxovirus parotitidis, вирус болезни найробианских овец, наировирус, нанирнавирус, вирус Нарива, вирус Ндумо, вирус Нитлинг, вирус Нельсон–Бэй, нейротропный вирус, аренавирус Нового Света, вирус пневмонита новорожденных, вирус болезни Ньюкасла, вирус Нипах, нецитопатогенный вирус, вирус Норуолк, вирус ядерного полиэдроза (ВЯП), вирус ниппл–нек, вирус о'Нъонг–нъонг, вирус Окелбо, онкогенный вирус, онкогенная вирусоподобная частица, онкорнавирус, орбивирус, Орф–вирус, вирус Оропуш, ортогепаднавирус, ортомиксовирус, ортопоксвирус, ортореовирус, Орунго, папилломавирус овец, вирус катаральной лихорадки овец, герпесвирус трехполосых дурукули, вирус Палям, папилломавирус, Papillomavirus sylvilagi, паповавирус, вирус парагриппа, вирус парагриппа типа 1, вирус парагриппа типа 2, вирус парагриппа типа 3, вирус парагриппа типа 4, парамиксовирус, парапоксвирус, вирус ложной коровьей оспы, парвовирус, парвовирус B19, группа парвовируса, пестивирус, флебовирус, вирус чумки тюленей, пикоднавирус, пикорнавирус, цитомегаловирус свиней – вирус оспы свиней, вирус Пири, вирус Пиксуна, вирус пневмонии мышей, пневмовирус, вирус полиомиелита, полиовирус, полиднавирус, полиэдрический вирус, вирус полиомы, полиомавирус, Polyomavirus bovis, Polyomavirus cercopitheci, Polyomavirus hominis 2, Polyomavirus maccacae 1, Polyomavirus muris 1, Polyomavirus muris 2, Polyomavirus papionis 1, Polyomavirus papionis 2, Polyomavirus sylvilagi, вирус пузырчатого лишая орангутанов 1, вирус эпизоотической диареи свиней, вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней, парвовирус свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита свиней, вирус свиней типа C, поксвирус, поксвирус, Poxvirus variolae, l вирус Проспект–Хилл, провирус, вирус псевдооспы коров, вирус псевдобешенства, вирус оспы попугаев, вирус оспы перепелок, вирус фибромы кролика, вакуолизирующий вирус почек кролика, папилломавирус кролика, вирус бешенства, парвовирус енотов, вирус оспы енотов, вирус Раникет (псевдочумы птиц), цитомегаловирус крыс, парвовирус крыс, вирус крыс, вирус Раушера, рекомбинантный вирус осповакцины, рекомбинантный вирус, реовирус, реовирус 1, реовирус 2, реовирус 3, вирус типа C рептилий, вирус респираторной инфекции, респираторный синцитиальный вирус, респираторный вирус, вирус ретикулоэндотелиоза, рабдовирус, Rhabdovirus carpia, радиновирус, риновирус, ризидиовирус, вирус лихорадки долины Рифт, вирус Райли, вирус чумы, вирус РНК–опухоли, вирус Росс–Ривер, ротавирус, вирус кори, вирус саркомы Рауша, вирус краснухи, вирус кори, рубивирус, вирус русского осеннего энцефалита, вирус SA 11 обезьян, вирус SA2, вирус Сабия, вирус Сагияма, герпесвирус 1 саймири, вирус слюнных желез, группа вирусов флеботомной лихорадки, вирус Санджимба, вирус SARS (severe acute respiratory syndrome, атипичной пневмонии), SDAV (sialodacryoadenitis virus, вирус сиалодакриоаденита), вирус оспы тюленей, вирус леса Семлики, вирус Сеул, вирус оспы овец, вирус фибромы Шоупа, вирус папилломы Шоупа, пенящий вирус обезьян, вирус гепатита A обезьян, вирус иммунодефицита человека и обезьян, вирус иммунодефицита обезьян, вирус парагриппа обезьян, T–клеточный лимфотропный вирус обезьян, вирус обезьян, вирус 40 обезьян, симплексвирус, вирус Син Номбре, вирус Синдбис, вирус натуральной оспы, вирусы южноамериканской геморрагической лихорадки, вирус оспы воробьев, спумавирус, вирус фибромы белок, ретровирус обезьян, группа вирусов SSV 1, STLV (simian T lymphotropic virus, T–лимфотропный вирус обезьян) типа I, STLV (T–лимфотропный вирус обезьян) типа II, STLV (T–лимфотропный вирус обезьян) типа III, вирус папулезного стоматита, поднижнечелюстной вирус, вирус герпеса свиней 1, вирус герпеса свиней 2, суипоксвирусы, вирус болотной лихорадки, вирус оспы свиней, вирус швейцарского лейкоза мышей, TAC–вирус, вирус комплекса Такарибе, вирус Такарибе, вирус Танапокс, вирус Татерапокс, реовирус линей, вирус энцефаломиелита Тейлера, вирус Тейлера, вирус Тогото, вирус Тхоттапалаям, вирус клещевого энцефалита, вирус Тиоман, тогавирус, торовирус, вирус опухоли, вирус тупайи, вирус ринотрахеита индеек, вирус оспы индеек, ретровирусы типа C, онковирус типа D, группа ретровирусов типа D, рабдовирус язвенной болезни, вирус Уна, группа вирусов Уукуниеми, вирус осповакцины, вакуолизирующий вирус, вирус ветряной оспы, варицелловирус, вирус натуральной оспы (variola), вирус Variola major, вирус variola, вирус болезни Уасингишу, VEE–вирус, вирус венесуэльского энцефалита лошадей, вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей, вирус венесуэльской геморрагической лихорадки, вирус везикулярного стоматита, везикуловирус, вирус Вилюйск, ретровирус гадюки, вирус вирусной геморрагической септицемии, вирус Висна–маеди, вирус Висна, вирус оспы полевок, ВВС (вирус везикулярного стоматита), вирус Валлал, вирус Варрего, вирус папилломы, WEE–вирус, вирус Западного Нила, вирус западного энцефалита лошадей, вирус западного энцефаломиелита лошадей, вирус Ватароа, вирус зимней рвоты, вирус гепатита B лесного сурка, вирус саркомы шерстистой обезьяны, вирус раневых опухолей, вирус WRSV, вирус опухоли обезьян Яба, вирус Яба, ятапоксвирус, вирус желтой лихорадки и вирус Юг Богдановак.

Способы получения псевдотипированных онколитических вирусов

[00107] В некоторых случаях псевдотипированный онколитический вирус, описанный в настоящем документе, получен с применением способов, хорошо известных в данной области техники. В некоторых случаях способы включают один или более этапов трансфекции и один или более этапов инфекции. В некоторых случаях линию клеток, такую как линия клеток млекопитающих, линия клеток насекомых или линия клеток растений, инфицируют псевдотипированным онколитическим вирусом, описанным в настоящем документе, для получения одного или более вирусов. Иллюстративные линии клеток млекопитающих включают: линию клеток 293A, линию клеток 293FT, клетки 293F, клетки 293 H, клетки CHO DG44, клетки CHO–S, клетки CHO–K1, клетки Expi293F™, линию клеток Flp–In™ T–REx™ 293, линию клеток Flp–In™–293, линию клеток Flp–In™–3T3, линию клеток Flp–In™–BHK, линию клеток Flp–In™–CHO, линию клеток Flp–In™–CV–1, линию клеток Flp–In™–Юркат, клетки FreeStyle™ 293–F, клетки FreeStyle™ CHO–S, линию клеток GripTite™ 293 MSR, линию клеток GS–CHO, клетки HepaRG™, линию клеток T–REx™ Юркат, клетки Per.C6, линию клеток T–REx™–293, линию клеток T–REx™–CHO, линию клеток T–REx™–HeLa, 3T6, A549, A9, AtT–20, BALB/3T3, BHK–21, BHL–100, BT, Caco–2, Chang, Клон 9, Клон M–3, COS–1, COS–3, COS–7, CRFK, CV–1, D–17, Дауди, GH1, GH3, H9, HaK, HCT–15, HEp–2, HL–60, HT–1080, HT–29, HUVEC, I–10, IM–9, JEG–2, Jensen, K–562, KB, KG–1, L2, LLC–WRC 256, McCoy, MCF7, VERO, WI–38, WISH, XC или Y–1. Иллюстративные линии клеток насекомых включают клетки S2 Drosophila, клетки Sf9, клетки Sf21, клетки High Five™ или клетки expresSF+®. Иллюстративные линии клеток растений включают клетки водорослей, такие как, например, Phaeocystis pouchetii.

[00108] Любой способ, известный специалисту в данной области техники, используется для крупномасштабной продукции рекомбинантных онколитических векторов и конструкций вектора, таких как псевдотипированные онколитические векторы. Например, главный и рабочий посевной материал могут быть подготовлены в условиях GMP (Good manufacturing practices, надлежащей производственной практики) в компетентных первичных фибробластах эмбриона цыпленка (ФЭЦ) или другими способами. В некоторых случаях клетки высевают на колбы большой площади поверхности, выращивают до состояния, близкого к конфлюентности, и инфицируют с выбранной множественностью заражения. Затем продуцированный вирус можно очистить. В некоторых случаях клетки собирают, и внутриклеточный вирус высвобождается в результате механического разрушения. Согласно некоторым вариантам реализации клеточный дебрис удаляют посредством глубинной фильтрации через поры большого размера, и/или ДНК клетки–хозяина расщепляют эндонуклеазой. В некоторых случаях вирусные частицы затем очищают и концентрируют посредством фильтрации тангенциальным потоком с последующей диафильтрацией. Полученный в результате концентрированный вирус можно приготовить в состав посредством разведения буфером, содержащим один или более стабилизаторов, поместить во флаконы и лиофилизировать. Композиции и составы можно хранить для последующего применения. Согласно некоторым вариантам реализации лиофилизированный вирус восстанавливают посредством добавления одного или более разбавителей.

Привлекающие молекулы

[00109] Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусные векторы, предложенные в настоящем документе, являются псевдотипированными онколитическими вирусами, дополнительно сконструированными для включения полинуклеотидной последовательности, которая кодирует привлекающую молекулу, например, привлекающий полипептид. Привлекающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере два домена, каждый из которых способен к связыванию с отличной молекулой поверхности клетки. Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие полипептиды содержат домен распознавания антигена и домен активации, который распознает конкретные белки поверхности клетки (например, рецепторы или лиганды поверхности клетки), экспрессированные клетками–мишенями и эффекторными клетками, соответственно. В настоящем документе «домен распознавания антигена» представляет собой полипептид, который связывается с одной или более молекулами, присутствующими на поверхности клетки–мишени (например, с опухолевым антигеном), и «домен активации» представляет собой полипептид, который связывается с одной или более молекулами, присутствующими на поверхности эффекторной клетки (например, с молекулой активации). Домен активации может также обозначаться «привлекающий домен».

[00110] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие полипептиды содержат домен терапевтической молекулы и домен активации. Домен терапевтической молекулы представляет собой полипептид, который связывается с конкретным белком поверхности клетки, экспрессированным на эффекторной клетке (например, с рецепторами или лигандами поверхности клетки) и который отличен от белка поверхности клетки, распознаваемого доменом активации. Согласно конкретным вариантам реализации домен терапевтической молекулы связывается с белком поверхности клетки, который представляет собой отрицательный регулятор функции эффекторной клетки (например, молекулу иммунной контрольной точки или другую ингибиторную молекулу). Иллюстративные антигены поверхности клетки для нацеливания посредством терапевтического домена включают CD47, PD1, PDL1, CTLA4, TIM2, LAG3, BTLA, KIR, TIGIT, OX40, FITR, CD27, SLAMF7 и CD200.

[00111] Согласно некоторым вариантам реализации связывание домена активации с молекулой, присутствующей на поверхности эффекторной клетки, приводит к активации эффекторной клетки. Согласно определенным вариантам реализации связывание домена активации с молекулой на эффекторной клетке и связывание домена распознавания антигена с молекулой, присутствующей на клетке–мишени, приводит эффекторную клетку в непосредственную близость с клеткой–мишенью и посредством этого облегчает разрушение клетки–мишени эффекторной клеткой. Согласно определенным вариантам реализации связывание домена активации с молекулой активации на эффекторной клетке и связывание домена терапевтической молекулы с ингибиторной молекулой, присутствующей на эффекторной клетке, усиливает активацию эффекторной клетки и посредством этого облегчает разрушение эффекторной клеткой одной или более находящихся поблизости клеток–мишеней.

[00112] Согласно определенным вариантам реализации привлекающая молекула представляет собой белок, например, сконструированный белок. Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула представляет собой двойной полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула представляет собой тройной или полисоставной полипептид. Согласно таким вариантам реализации привлекающая молекула может содержать один или более доменов активации и/или доменов распознавания антигена либо другие домены, включая один или более костимулирующих доменов, один или более доменов димеризации или тримеризации либо другой домен, способный к связыванию с молекулой, экспрессированной на поверхности клетки. В качестве альтернативы, на отдельном полипептиде необязательно присутствует один или более дополнительных доменов. Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула содержит антитело или фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула представляет собой трифункциональное антитело, Fab₂, биспецифичный scFv, такой как привлекающий T–клетки биспецифический активатор (bi–specific T–cell engager, BiTE), бивалентное миниантитело, биспецифичное диатело, DuoBody или Mab2. Согласно определенным вариантам реализации привлекающая молекула представляет собой двойной привлекающий T–клетки активатор (BiTE) или тройной привлекающий T–клетки активатор (tripartite T cell engager, TiTE).

[00113] Согласно некоторым вариантам реализации домен активации, домен распознавания антигена и/или домен терапевтической молекулы привлекающей молекулы содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), моноклональное антитело, Fv, Fab, миниантитело, диатело. Согласно некоторым вариантам реализации домен активации, домен распознавания антигена и/или домен терапевтической молекулы привлекающей молекулы содержит лиганд, пептид, пептид, который распознает и взаимодействует с растворимым ТКР (Т–клеточным рецептором), или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации данные полученные из антитела фрагменты или производные можно модифицировать химическим, биохимическим или молекулярнобиологическим способами. Соответствующие способы известны в данной области техники и описаны, среди прочего, в лабораторных пособиях (см. руководства Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition 1989 and 3rd edition 2001; Gerhardt et al.; Methods for General and Molecular Bacteriology; ASM Press, 1994; Lefkovits; Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein–Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002). В некоторых случаях полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, применяемые при конструировании привлекающих молекул, описанных в настоящем документе, представляют собой гуманизированные или деиммунизированные конструкции. Способы гуманизации и/или деиммунизации конструкций полипептидов и, в частности, антител, известны специалисту в данной области техники.

[00114] Согласно некоторым вариантам реализации для любой из привлекающих конструкций, описанных в настоящем документе, соответствующие домены находятся в любом порядке от N–конца к C–концу. Например, согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула может содержать N–концевой домен активации и C–концевой домен распознавания антигена. Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула может содержать N–концевой домен распознавания антигена и C–концевой домен активации. Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула может содержать N–концевой домен активации и C–концевой домен терапевтической молекулы. Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула может содержать N–концевой домен терапевтической молекулы и C–концевой домен активации. Согласно определенным вариантам реализации T–клетки являются модифицированными для секреции привлекающих молекул, которые содержат домен распознавания антигена или домен терапевтической молекулы, N–концевой относительно домена активации.

[00115] Согласно конкретным вариантам реализации два или более доменов привлекающей молекулы соединены посредством линкера. В некоторых случаях линкер характеризуется любой подходящей длиной, и такой параметр оптимизируют способами, общепринятыми в данной области техники. Например, линкеры характеризуются длиной и последовательностью, достаточными для обеспечения того, что каждый из первого и второго доменов может, независимо друг от друга, сохранять свои различные специфичности связывания. Термин «пептидный линкер» обозначает последовательность аминокислот, посредством которой соединены последовательности аминокислот первого домена (например, домена активации) и второго домена (например, домена распознавания антигена или домена терапевтической молекулы) определенной конструкции. В некотором случае одним из технических свойств такого пептидного линкера является то, что указанный пептидный линкер не характеризуется какой–либо активностью полимеризации и/или не способствует образованию вторичных структур. Такие пептидные линкеры известны в данной области техники и описаны, например, в публикациях Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266–9273); Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21–30); и Raag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73–80). Согласно некоторым вариантам реализации пептидные линкеры согласно настоящему изобретению содержат менее 5 аминокислот, менее 4 аминокислот, менее 3 аминокислот, менее 2 аминокислот или 1 аминокислоту. Согласно некоторым вариантам реализации пептидный линкер представляет собой линкер длиной в одну аминокислоту. Согласно таким вариантам реализации одна аминокислота представляет собой, как правило, глицин (Gly). Согласно некоторым вариантам реализации пептидные линкеры, которые также не способствуют образованию каких–либо вторичных структур, являются предпочтительными. Способы получения слитых, функционально связанных конструкций и их экспрессии в клетках млекопитающих или бактерий хорошо известны в данной области техники (См., например, международную публикацию PCT № WO 99/54440; руководства Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. 1989 and 1994; и Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).

[00116] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула представляет собой конструкцию одноцепочечного биспецифичного антитела. Термин «конструкция одноцепочечного биспецифичного антитела» обозначает конструкцию, содержащую два связывающих домена, полученных из антитела. Один из связывающих доменов содержит вариабельные области (или их части) тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL) антитела либо антигенсвязывающие фрагменты или их производные, способные к специфичному связыванию/взаимодействию с молекулой активации, экспрессированной на эффекторной клетке (например, CD3). Второй связывающий домен содержит вариабельные области (или их части) тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL) антитела либо антигенсвязывающие фрагменты или их производные, способные к специфичному связыванию/взаимодействию с антигеном–мишенью, экспрессированным на клетке–мишени (например, CD19), или с антигеном, экспрессированным эффекторной клеткой (например, с ингибиторной молекулой). Согласно конкретным вариантам реализации каждое из двух антител либо антигенсвязывающих фрагментов или производных содержит по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность (complementary determining region, CDR), в частности, CDR3. Согласно некоторым вариантам реализации одноцепочечная конструкция одноцепочечного биспецифичного антитела представляет собой биспецифичное scFv или диатело.

[00117] Согласно конкретным вариантам реализации конструкция одноцепочечного биспецифичного антитела представляет собой одноцепочечное биспецифичное scFv. scFv, как правило, содержит домены VH и VL, соединенные посредством линкерного пептида. Согласно некоторым вариантам реализации одноцепочечное биспецифичное scFv содержит сигнальный пептид для обеспечения секреции из клетки, за которым расположены два scFv, соединенные одним или более линкерными пептидами (Lx, Ly, Lz). Биспецифичные одноцепочечные молекулы известны в данной области техники и описаны в международной публикации PCT № WO 99/54440; публикациях Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965–3970; Mack, PNAS, (1995), 92, 7021–7025; Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193– 197; Loftier, Blood, (2000), 95, 6, 2098–2103; и Bruhl, J. Immunol., (2001), 166, 2420–2426.

[00118] Согласно некоторым вариантам реализации молекулярный формат полинуклеотида, кодирующего одноцепочечный биспецифичный полипептид scFv, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид (такую как сигнальные последовательности согласно SEQ ID NO: 2 и 4), за которой расположены две или более полученные из антитела области (например, первый scFv и второй scFv). Каждая полученная из антитела область (например, scFv) содержит одну цепь VH и одну VL. Согласно конкретным вариантам реализации две или более полученные из антитела области представляют собой scFv и соединены пептидным линкером с образованием одноцепочечной биспецифичной конструкции scFv. Согласно некоторым вариантам реализации биспецифичный scFv представляет собой тандемное bi–scFv или диатело. Биспецифичные scFv могут быть организованы в различных форматах, включая следующие: VHO –Lx–V_La–Ly–V_H –Lz–ViJ3, V_La–Lx–V_Ha–Ly–VH –Lz–ViJ3, V_La–Lx–V_H –Ly–VL –Lz–VH, V_H –Lx–V_La–Ly–VL –Lz–VH, V_H –Lx–VL –Ly–VH –Lz–V_La, V_La–Lx–VL –Ly–VH –Lz–V_H, VH –Lx–VH –Ly–VL –Lz–VLa,VLa–Lx–VH –Ly–VL –Lz–V_H, VH –Lx–V_La–Ly–V_H –Lz–VL, VL –Lx–V_La–Ly–V_H –Lz–VH, V_H –Lx–VH –Ly–VLa–Lz–VL,VL –Lx–VH –Ly–VLa–Lz–V_H.

[00119] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула содержит несколько (например, 2, 3, 4, 5 или более) антигенсвязывающих доменов для обеспечения нацеливания на несколько антигенов. Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула содержит несколько (например, 2, 3, 4, 5 или более) доменов активации для активации эффекторных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула содержит несколько (например, 2, 3, 4, 5 или более) доменов терапевтической молекулы для активации эффекторных клеток.

[00120] Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения привлекающая молекула содержит дополнительные домены для выделения и/или получения продуцированных рекомбинантным способом конструкций, такие как «таг» или метка. «Таг» или метка могут представлять собой короткую пептидную последовательность, такую как гистидиновый «таг» (SEQ ID NO: 12), или могут представлять собой «таг» или метку, поддающиеся визуализации, такие как флуоресцентная или радиоактивная метка.

[00121] Согласно конкретным вариантам реализации привлекающие молекулы согласно настоящему изобретению специфично связываются/взаимодействуют с конкретным конформационным/структурным эпитопом или эпитопами антигена–мишени, экспрессированного на клетке–мишени, и молекулой активации, экспрессированной на эффекторной клетке (например, с доменом активации, который специфично связывается с одной из двух областей комплекса CD3 человека, или его частями). Согласно конкретным вариантам реализации привлекающие молекулы согласно настоящему изобретению специфично связываются/взаимодействуют с конкретным конформационным/структурным эпитопом или эпитопами молекулы активации, экспрессированной на эффекторной клетке, и отличным белком поверхности клетки, экспрессированным на эффекторной клетке. Соответственно, специфичность в некоторых случаях определяют экспериментальным путем с применением способов, известных в данной области техники, и способов, раскрытых и описанных в настоящем документе. Такие способы включают, без ограничения, вестернблоттинг, твердофазный иммуноферментный анализ (enzyme–linked immunosorbent assay, ELISA), радиоиммуноанализ (РИА), радиоиммунопреципитацию (РИП), электрохемилюминесценцию (ЭХЛ), иммунорадиометрический анализ (ИРМА), иммуноферментный анализ (ИФА) и сканирование пептидов.

Молекулы активации и антигены клетки–мишени

[00122] Согласно некоторым вариантам реализации связывание домена активации привлекающей молекулы с молекулами активации на поверхности эффекторной клетки приводит к активации эффекторной клетки. В настоящем документе термин «эффекторная клетка» обозначает любой тип клетки млекопитающих, который способен облегчать гибель клетки–мишени. Согласно конкретным вариантам реализации эффекторные клетки согласно настоящему изобретению представляют собой иммунные клетки, такие как T–клетка, В–клетка, врожденный лимфоцит, клетка–природный киллер (NK), T–клетка–природный киллер (NKT), гранулоцит (например, нейтрофил, базофил, тучная клетка или эозинофил), макрофаг, моноцит или дендритная клетка. Иллюстративные типы эффекторных клеток включают Т–клетки, NK–клетки, NKТ–клетки и макрофаги.

[00123] Согласно некоторым вариантам реализации активация эффекторной клетки может привести к одному или более из следующих последствий: (i) увеличенная пролиферация эффекторной клетки; (ii) изменения экспрессии или активности одного или более белков поверхности эффекторной клетки; (iii) изменение экспрессии или активности одного или более внутриклеточных белков, экспрессируемых эффекторной клеткой; (iv) изменения количества или природы факторов, продуцируемых и/или секретируемых эффекторной клеткой, таких как цитокины, хемокины или активные формы кислорода; (v) изменения морфологии эффекторной клетки; (vi) изменения хемотактического потенциала эффекторной клетки, например, в результате увеличения или уменьшения экспрессии одного или более хемокиновых рецепторов; (vii) изменения функциональной активности эффекторной клетки, такие как увеличение цитолитической активности и/или увеличение фагоцитарной активности. Активацию эффекторной клетки или популяции эффекторных клеток можно определить любыми способами, известными в данной области техники. Например, изменения пролиферации, экспрессии, продукции или секреции можно определить методами проточной цитометрии, вестернблоттинга, ELISA, иммуногистохимии, иммунопреципитации или иммунофлуоресценции, и изменения морфологии клеток можно определить посредством множества типов микроскопического анализа, известных в данной области техники.

[00124] Специалист в данной области техники понимает, что природа активирующей молекулы может варьировать в зависимости от природы эффекторной клетки, несмотря на то, что различные группы эффекторных клеток могут характеризоваться общей экспрессией определенных типов молекул активации. Например, Т–клетки экспрессируют отличные рецепторы поверхности, т.е. отличные активирующие рецепторы, чем NK–клетки или макрофаги. В качестве иллюстративного примера, CD3 представляет собой активирующий рецептор, экспрессируемый T–клетками, который не экспрессируется NK–клетками или макрофагами, тогда как CD1, CD16, NKG2D и/или NKp30 представляют собой активирующие рецепторы, экспрессируемые NK–клетками, которые не экспрессируются Т–клетками. Вследствие этого в некоторых случаях привлекающие молекулы, которые активируют T–клетки, содержат отличный домен активации, чем привлекающие молекулы, которые активируют NK–клетки, макрофаги, NKТ–клетки или другие типы эффекторных клеток. Иллюстративные молекулы активации описаны ниже и представлены в таблице 1.

[00125] Согласно некоторым вариантам реализации эффекторная клетка представляет собой Т–клетку, и домен активации привлекающей молекулы связывается с молекулами активации, экспрессированными T–клеткой. Репертуар Т–клеток содержит множество подтипов T–клеток, включая NKТ–клетки, цитотоксические Т–клетки (Tc или ЦТЛ), Т–клетки памяти, Т–клетки хелперы (например, клетки Th1, Th2, Th17, Th9 и/или Th22), супрессорные Т–клетки (например, регуляторные Т–клетки (Treg)), ассоциированные со слизистыми оболочками инвариантные Т–клетки и Т–клетки γδ. В некоторых случаях один или более рецепторов поверхности, экспрессируемых одним подтипом T–клеток, не экспрессируются другим подтипом T–клеток. В некоторых случаях один или более рецепторов поверхности, экспрессируемых одним подтипом T–клеток, экспрессируются по меньшей мере одним другим подтипом T–клеток. В некоторых случаях один или более рецепторов поверхности, экспрессируемых одним подтипом T–клеток, обычно экспрессируются всеми или большинством подтипов T–клеток. Например, CD3 представляет собой сигнальный компонент комплекса T–клеточного рецептора (ТКР) и экспрессируется во многих подтипах T–клеток. Иллюстративные молекулы активации, экспрессируемые Т–клетками (например, NKT, Tc, Т–клетками памяти или T–клетками хелперами), включают, без ограничения, один или более компонентов CD3 (например, CD3γ, CD3δ, CD3ε или CD3ξ), CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD25, CD27, CD28, CD30, CD38, CD40, CD57, CD69, CD70, CD73, CD81, CD82, CD134, CD137, CD152 или CD278. Согласно некоторым вариантам реализации эффекторная клетка представляет собой NKT–клетку. Согласно таким вариантам реализации молекула активации включает, без ограничения, CD3 или инвариантный ТКР.

[00126] Согласно некоторым вариантам реализации эффекторная клетка представляет собой NK–клетку, и домен активации привлекающей молекулы связывается с молекулой активации, экспрессируемой NK–клеткой. Иллюстративные молекулы активации, экспрессируемые NK–клетками, включают, без ограничения, CD16, CD94/NKG2 (например, NKG2D), NKp30, NKp44, NKp46 или рецепторы активации киллера (killer activation receptors, KAR).

Таблица 1: Иллюстративные молекулы активации

[00127] Согласно некоторым вариантам реализации связывание привлекающей молекулы с клеткой–мишенью и эффекторной клеткой (например, связывание домена активации с молекулой на эффекторной клетке и связывание домена распознавания антигена с молекулой, присутствующей на клетке–мишени) приводит эффекторную клетку в непосредственную близость с клеткой–мишенью и посредством этого облегчает разрушение эффекторной клеткой клетки–мишени. В настоящем документе термин «клетка–мишень» обозначает клетку млекопитающих, которую необходимо уничтожить, атаковать, разрушить и/или контролировать. В частности, клетки–мишени представляют собой клетки, которые являются в некоторой степени измененными по сравнению с нормальной клеткой того же типа клеток, такие как раковая клетка, инфицированная бактерией клетка, инфицированная вирусом клетка, инфицированная грибом клетка и/или аутоиммунная клетка. Согласно конкретным вариантам реализации клетки–мишени согласно настоящему изобретению представляют собой раковые клетки (например, опухолевые клетки). Разрушение (т.е. гибель) клетки–мишени можно определить любыми способами, известными в данной области техники, такими как проточная цитометрия (например, с применением AnnexinV, пропидиум иодида или другими способами), подсчет клеток и/или микроскопическое исследование для определения клеточной морфологии клеток–мишеней.

[00128] Согласно некоторым вариантам реализации домен распознавания антигена привлекающей молекулы сближает клетку–мишень (например, опухолевую клетку) с эффекторной клеткой посредством взаимодействия между доменом распознавания антигена и антигенами поверхности, экспрессируемыми клеткой–мишенью (например, антигенами клетки–мишени). Согласно некоторым вариантам реализации антиген клетки–мишени представляет собой опухолевый антиген. Согласно некоторым вариантам реализации опухолевый антиген представляет собой опухоль–специфический антиген (ОСА) и экспрессируется исключительно опухолевыми клетками. Согласно некоторым вариантам реализации антиген клетки–мишени представляет собой опухоль–ассоциированный антиген (ОАА) и экспрессируется опухолевыми клетками и одним или более типами нормальных клеток или неопухолевых клеток. В некоторых случаях ОСА также присутствует на одном или более типах нормальных клеток или неопухолевых клеток, но экспрессируется преимущественно опухолевыми клетками. В некоторых случаях опухолевый антиген (например, ОСА или ОАА) присутствует в одном типе рака. В некоторых случаях опухолевый антиген присутствует в нескольких типах рака. Согласно одному варианту реализации опухолевый антиген экспрессируется на клетке рака крови. Согласно другому варианту реализации опухолевый антиген экспрессируется на клетке солидной опухоли. Согласно некоторым вариантам реализации солидная опухоль представляет собой глиобластому, немелкоклеточный рак легких, рак легких, отличный от немелкоклеточного рака легких, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак печени, рак толстой кишки, рак желудка, рак селезенки, рак кожи, рак головного мозга, отличный от глиобластомы, рак почек, рак щитовидной железы или т.п. Согласно более конкретным вариантам реализации опухолевый антиген экспрессируется опухолевой клеткой у индивидуума.

[00129] Иллюстративные опухолевые антигены (например, ОСА или ОАА) включают, без ограничения, альфафетопротеин (alphafetoprotein, AFP), карциноэмбриональный антиген (КЭА), CA–125, эпителиальный опухолевый антиген (epithelial tumor antigen, ETA), тирозиназу, CD10 (также известный как неприлизин), металлоэндопептидазу мембран (membrane metallo–endopeptidase, MME), нейтральную эндопептидазу (neutral endopeptidase, NEP) или антигенный маркер острого лимфобластного лейкоза (common acute lymphoblastic leukemia antigen, CALLA)), CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, ras, p53, гомолог Bl вирусного онкогена саркомы мышей v–raf (BRAF), кальций–связывающий регулируемый фосфорилированием тирозина (Y) белок (calcium binding tyrosine–(Y)–phosphorylation regulated, CABYR), богатый цистеином секреторный белок 3 (cysteine–rich secretory protein 3, CRISP3), член 2 семейства CSAG (CSAG2), антиген рака/яичек 2 (CTAG2), дигидрофолатредуктазу (DHFR), ферритин, тяжелый полипептид 1; специфичную к яичкам экспрессию (FTHL17), G–антиген 1 (GAGE1), лактатдегидрогеназу C (LDHC), семейство A антигена меланомы (MAGEA) 1, MAGEA3, MAGEA4 (семейство B антигена меланомы, 6) MAGEB6, митоген–активируемую протеинкиназу 1 (mitogen–activated protein kinase 1, MAPK1), последовательность A, связанную с полипептидом MHC класса I (MHC Class I polypeptide–related sequence A, MICA), муцин (MUC) 1, связанный с поверхностью клетки (MUC1), MUC16, семейство NLR, содержащее домен пирина, 4 (NLRP4), плоскоклеточную карциному пищевода Нью–Йорка 1 (New York esophageal squamous cell carcinoma 1, NY–ESO–1), PDZ–связывающуюся киназу (binding kinase, PB), преимущественно экспрессированный антиген в меланоме (preferentially expressed antigen in melanoma, PRAME), определяющий пол участок Y–бокс (SOX)–2, SOX10, SOX11, белок спермы, ассоциированный с ядром, сцепленный с Х–хромосомой, член семейства Al (sperm protein associated with the nucleus, X–linked, family member Al, SPANXA1), синовиальную саркому, X (synovial sarcoma, X, SSX) контрольную точку 2 (SSX2), SSX4, SSX5, белок, специфичный к яичкам, 10 (TSGA10), специфичную к яичкам серинкиназу 6 (testis–specific serine kinase 6, TSSK6), tubby–подобный белок (tubby like protein, TULP2), член 2 семейства X–антигена (X antigen family, member 2, XAGE2), белок цинкового пальца 165 (zinc finger protein 165, ZNF165), отсутствующий в меланоме 2 (absent in melanoma 2, AIM2), онкоген безымянного пальца группы polycomb BMI1 (BMI1), циклооксигеназу–2 (cyclooxygenase–2, COX–2), тирозин–связанный белок (tyrosine related protein, TRP)–1, TRP–2, гликопротеин 100 (GP100), вариант III рецептора эпидермального фактора роста (РЭФР vIII), энхансер гомолога zeste 2 (enhancer of zeste homolog 2, EZH2), молекулу клеточной адгезии LI человека (human LI cell adhesion molecule, LICAM), ливин, белок множественной лекарственной резистентности 3 (multidrug resistance protein 3, MRP–3), нестин, фактор транскрипции 2 олигодендроглиоцитов (oligodendrocyte transcription factor, OLIG2), антиген, распознаваемый Т–клетками (antigen recognized by T cells, ART)–1, ART4, антиген плоскоклеточной карциномы, распознаваемый Т–клетками (squamous cell carcinoma antigen recognized by T cells, SART)–1, SART2, SART3, B–циклин, β–катенин, ассоциированный с глиомой гомолог онкогена 1 (glioma–associated oncogene homlog 1, Glil), кавеолин–1 (Cav–1), катепсин B, кластер дифференциации (cluster of differentiation CD)–74, белок эпителиальной кальций–зависимой адгезии (E–кадгерин), рецептор EPH (эфедрина) A2 (EphA2), EphA2/эпителиальную киназу (EphA2/Eck), fos–родственный антиген 1 (Fra–l/Fosl 1), ганглиозид/GD2, GD3, ацетилглюкозаминилтрансферазу–V (GnT–V, β1,6–Ν), рецептор эпидермального фактора роста 2 человека (Her2/Neu), ядерный ассоциированный с пролиферацией антиген антитела Ki67 (Ki67), гетеродимерные белковые субъединицы Ku человека (u70/80), субъединицу альфа–2 рецептора интерлейкина–13 (ИЛ–13Рα2), антиген меланомы, распознаваемый Т–клетками (melanoma antigen recognized by T cells, MART–1), просперо–гомеобокс белок 1 (prospero homeobox protein 1, PROXl), антиген стволовых клеток предстательной железы (АСКП), сурвивин, рецептор активатора плазминогена урокиназного типа (urokinase–type plasminogen activator receptor, UPAR), белок 1 опухоли Вильмса (Wilms' tumor protein 1, WT–1), рецептор фолиевой кислоты a, глипикан–3, 5T4, 8H9, α_νβ₆ интегрин, B7–H3, B7–H6, CAIX, CA9, CSPG4, EGP2, EGP40, EpCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, эмбриональный AchR, HLA–AI, HLA–A2, ИЛ–1Рα, KDR, Лямбда, Льюис–Y, MCSP, мезотелин, NCAM, лиганды NKG2D, PSC1, ПСМА (простатический специфический мембранный антиген), ROR1, TAG72, TEM1, TEM8, VEGRR2, HMW–MAA, ФРЭС (фактор роста эндотелия сосудов), рецепторы ФРЭС, P–гликопротеин, эритропоэтин (ЭПО), кадгерин, CD4, CD8, CD45, CD117 (c–kit), CD133, HLA–A, HLA–B, HLA–C, хемокиновый рецептор 5 (CCR5), транспортер–маркер стволовых клеток ABCG2, иммуноглобулины, интегрины, простатический специфический антиген (ПСА), антиген стволовых клеток предстательной железы (АСКП), молекулы межклеточной адгезии дендритных клеток 3–захватывающего неинтегрина (DC–SIGN), тироглобулин, гранулоцитарно–моноцитарный колониестимулирующий фактор (ГМ–КСФ), миогенный стимулирующий дифференциацию фактор–1 (MyoD–1), Leu–7 (CD57), LeuM–1, ассоциированный с пролиферацией клеток ядерный антиген человека, определенный моноклональным антителом Ki–67 (Ki–67), вирусные белки оболочки, gp120 ВИЧ и трансферриновый рецептор. Другие иллюстративные опухолевые антигены представляют собой антигены, которые присутствуют во внеклеточном матриксе опухолей, такие как онкофетальные варианты фибронектина, тенасцина или некротические области опухолей.

Таблица 2: Иллюстративные антигены клетки–мишени

[00130] Согласно определенным вариантам реализации домен распознавания антигена привлекающей молекулы специфично связывается с опухоль–ассоциированным антигеном (ОАА) или опухоль–специфическим антигеном (ОСА). Согласно определенным вариантам реализации домен распознавания антигена содержит антитело или фрагмент антитела либо антигенсвязывающий фрагмент или его часть, такое как, например, моноклональное антитело, Fv, scFv, Fab, миниантитело или диатело, которое является специфичным в отношении ОАА или ОСА. Согласно определенным вариантам реализации домен распознавания антигена привлекающей конструкции представляет собой scFv, который является специфичным в отношении ОАА или ОСА. Согласно конкретному варианту реализации ОАА или ОСА экспрессируется на клетке рака. Согласно одному варианту реализации ОАА или ОСА экспрессируется на клетке рака крови. Согласно другому варианту реализации ОАА или ОСА экспрессируется на клетке солидной опухоли. Согласно более конкретным вариантам реализации солидная опухоль представляет собой глиобластому, немелкоклеточный рак легких, рак легких, отличный от немелкоклеточного рака легких, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак печени, рак толстой кишки, рак желудка, рак селезенки, рак кожи, рак головного мозга, отличный от глиобластомы, рак почек, рак щитовидной железы или т.п. Согласно более конкретным вариантам реализации ОАА или ОСА экспрессируется опухолевой клеткой у индивидуума. Согласно некоторым вариантам реализации антигенраспознающий домен привлекающей молекулы является специфичным в отношении одного или более антигенов клетки–мишени, представленных в таблице 2.

EphA2

[00131] Согласно некоторым вариантам реализации EphA2 обозначают как рецептор EPH A2 (рецептор 2 эфрина типа A; EPHA2; ARCC2; CTPA; CTPP1; или ECK), который представляет собой белок, кодируемый у людей геном EPHA2 в подсемействе эфриновых рецепторов семейства протеин–тирозинкиназ. Рецепторы в данном подсемействе обычно содержат один киназный домен и внеклеточную область, содержащую богатый цистеином домен и 2 повтора фибронектина типа III; варианты реализации антител согласно настоящему изобретению нацелены на любой из данных доменов. Иллюстративная последовательность нуклеиновой кислоты EphA2 человека депонирована в GenBank® под учетным № NM_004431, и иллюстративная полипептидная последовательность EphA2 человека депонирована в GenBank® под учетным № NP_004422, обе последовательности полностью включены в настоящий документ. Иллюстративная последовательность нуклеиновой кислоты EphA2 человека депонирована в GenBank® под учетным № NM_004448.2, и иллюстративная полипептидная последовательность EphA2 человека депонирована в GenBank® под учетным № NP_004439, обе последовательности полностью включены в настоящий документ.

[00132] Семейство Eph, наиболее обширная группа среди семейства рецепторных тирозинкиназ, включает подклассы рецепторов EphA (EphA1–10) или EphB (EphB1–6), классифицированных в зависимости от гомологии их последовательности и их аффинности связывания со своими лигандами, эфринами (белками, взаимодействующими с рецепторами Eph). Ген EphA2 человека расположен на хромосоме 1, кодирует рецепторную тирозинкиназу, состоящую из 976 аминокислот, с кажущейся молекулярной массой 130 кДа и характеризуется гомологией последовательности аминокислот 90% с EphA2 мыши. Семейство Eph содержит внеклеточный консервативный N–концевой лиганд–связывающий домен, за которым расположен обогащенный цистеином домен с подобным эпидермальному фактору роста мотивом и двумя повторами фибронектина типа III. За внеклеточным мотивом расположена пронизывающая мембрану область и цитоплазматическая область, которая охватывает околомембранную область, тирозинкиназный домен, стерильный альфа–мотив (sterile alpha motif, SAM), и постсинаптический домен белка (disc large and zona occludens protein (PDZ) домен–связывающий мотив). EphA2 демонстрирует 25–35% гомологии последовательности с другими рецепторами Eph, и остатки тирозина являются консервативными в пределах околомембранного и киназного домена.

[00133] Экспрессия мРНК EphA2 наблюдается в коже, костном мозге, тимусе, матке, яичках, предстательной железе, мочевом пузыре, почках, тонком кишечнике, толстой кишке, селезенке, печени, легких и головном мозге. Экспрессия EphA2 в толстой кишке, коже, почках и легких в десять раз превышала экспрессию в костном мозге. EphA2 также экспрессируется в течение гаструляции в клетках эктодермы и в раннем эмбриогенезе в развивающемся заднем мозге. В коже EphA2 присутствует в кератиноцитах эпидермиса и фолликулах волос, но не в клетках дермы (фибробластах, сосудистых клетках и воспалительных клетках). EphA2 также экспрессируется в пролиферирующих молочных железах самок мышей при половом созревании и дифференциально экспрессируется в течение эстрального цикла. Помимо экспрессии в эмбрионе и в нормальных тканях взрослых EphA2 сверхэкспрессируется при некоторых типах рака, таких как рак молочной железы, рак желудка, меланома, рак яичников, рак легких, глиома, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, пищевода, ренальный рак, рак толстой кишки и рак вульвы. В частности, высокий уровень EphA2 обнаружен в линиях клеток, полученных из злокачественного рака и распространенных форм рака. В свете сверхэкспрессии EphA2 на доклинических моделях и клинических образцах многих различных типов рака увеличенный уровень экспрессии EphA2 является информативным как при предсказании исходов рака, так и для клинического ведения рака. Дифференциальная экспрессия EphA2 в нормальных клетках по сравнению с раковыми клетками также свидетельствует об его важности в качестве терапевтической мишени.

HER2

[00134] Согласно некоторым вариантам реализации HER2 обозначают как рецептор эпидермального фактора роста 2 человека (Neu, ErbB–2, CD340 или pi 85), который представляет собой белок, кодируемый у людей геном ERBB2 в семействе рецептора эпидермального фактора роста (EFR/ErbB). HER2 содержит внеклеточный лиганд–связывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, который взаимодействует с множеством сигнальных молекул. HER2 является членом семейства рецептора эпидермального фактора роста, обладающего тирозинкиназной активностью. Димеризация рецептора приводит к автофосфорилированию остатков тирозина в пределах цитоплазматического домена рецепторов и запускает множество путей передачи сигналов, которые приводят к пролиферации клеток и опухолегенезу. Амплификация или сверхэкспрессия HER2 возникает ориентировочно в 15–30% случаев рака молочной железы и 10–30% случаев желудочных/желудочно–пищеводных типов рака и выступает в качестве прогностического и предиктивного биомаркера. Сверхэкспрессия HER2 также наблюдалась при других типах рака, таких как рак яичников, эндометрия, мочевого пузыря, легких, толстой кишки и головы и шеи. HER2 сверхэкспрессируется в 15–30% инвазивных типах рака молочной железы, что находит прогностическое и предиктивное применение. Сверхэкспрессия белка HER2, определенная методом ИГХ (иммуногистохимии), была обнаружена в 23%, а амплификация гена, определенная методом FISH (fluorescence in situ hybridization, флуоресцентной гибридизации in situ), – в 27% из 200 резецированных опухолей в исследовании рака желудка. Сверхэкспрессия HER2 при раке желудка напрямую коррелирует с более неблагоприятным исходом. В исследовании 260 случаев рака желудка сверхэкспрессия HER2 являлась независимым отрицательным прогностическим фактором, и интенсивность окрашивания HER2 коррелировала с размером опухоли, серозной инвазией и метастазами в лимфатические узлы. В других исследованиях также было подтверждено отрицательное влияние сверхэкспрессии HER2 на рак желудка. О сверхэкспрессии HER2 сообщалось в 0–83% случаев рака пищевода с тенденцией к более высоким степеням положительности при аденокарциноме (10–83%) по сравнению с плоскоклеточными карциномами (0–56%). Сверхэкспрессия HER2 наблюдается у 20–30% пациентов, страдающих от рака яичников. При серозной карциноме эндометрия сообщавшиеся степени сверхэкспрессии HER2 варьировали от 14% до 80%, амплификация HER2 (определенная методом флуоресцентной гибридизации in situ, FISH) варьировала от 21% до 47%. Варианты реализации антител согласно настоящему изобретению нацелены на внеклеточный лиганд–связывающий домен.

Дисиалоганглиозид GD2

[00135] Дисиалоганглиозид GD2 представляет собой содержащий сиаловую кислоту гликосфинголипид, экспрессированный преимущественно на поверхности клетки. Функция данного углеводного антигена до конца не понятна; однако считают, что он играет важную роль в присоединении опухолевых клеток к белкам внеклеточного матрикса. Экспрессия GD2 в нормальных эмбриональных тканях и тканях взрослых преимущественно ограничена центральной нервной системой, периферическими нервами и меланоцитами кожи, несмотря на то, что экспрессия GD2 была описана в стромальном компоненте некоторых нормальных тканей и белой пульпе селезенки. В клетках злокачественных новообразований GD2 однородно экспрессирован в нейробластомах и в большинстве меланом и в различной степени – во множестве других опухолей, включая саркомы кости и мягких тканей, мелкоклеточный рак легких и опухоли головного мозга. GD2 присутствует и концентрируется на поверхностях клетки, причем две углеводородные цепи керамидного фрагмента встроены в плазматическую мембрану, а олигосахариды расположены на внеклеточной поверхности, где они обеспечивают точки распознавания для внеклеточных молекул или поверхностей соседних клеток. Благодаря относительно опухоль–селективной экспрессии в сочетании с присутствием на поверхности клетки GD2 является привлекательной мишенью для опухоль–специфичной антителотерапии. Варианты реализации антител согласно настоящему изобретению нацелены на внеклеточный домен.

Терапевтические молекулы

[00136] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и одну или более дополнительных последовательностей нуклеиновой кислоты, которые кодируют одну или более терапевтических молекул. В настоящем документе «терапевтическая молекула» обозначает молекулу, которая усиливает терапевтическую эффективность онколитического вируса, описанного в настоящем документе. Как правило, терапевтические молекулы, описанные в настоящем документе, представляют собой белки, нуклеиновые кислоты или их комбинации. Иллюстративные терапевтические молекулы включают цитокины, хемокины, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, протеазы, полинуклеотиды РНК и полинуклеотиды ДНК.

[00137] Согласно некоторым вариантам реализации терапевтическая молекула способна к увеличению или усилению терапевтической эффективности онколитического вируса, описанного в настоящем документе, посредством стимуляции или активации клеточного иммунного ответа. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтическая молекула способна к увеличению или усилению терапевтической эффективности онколитического вируса, описанного в настоящем документе, выступая антагонистом супрессивного или регуляторного иммунного ответа. Согласно некоторым вариантам реализации снижение супрессивного иммунного ответа возникает в микроокружении опухоли. В некоторых случаях снижение супрессивного иммунного ответа терапевтической молекулой усиливает онколитические эффекты псевдотипированного онколитического вируса, описанного в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтическая молекула также снижает активность иммунорегуляторных T–клеток у субъекта, получающего лечение псевдотипированным онколитическим вирусом, описанным в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтическая молекула модулирует или нарушает уровень продукции белка на уровне нуклеиновой кислоты или на уровне белка либо нарушает функцию белка.

[00138] Согласно некоторым вариантам реализации последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая привлекающую молекулу, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая одну или более терапевтических молекул, содержатся в одном векторе. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая привлекающую молекулу, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая одну или более терапевтических молекул, содержатся в различных векторах. Согласно некоторым вариантам реализации вектор представляет собой вирусный вектор. В некоторых случаях терапевтическая молекула содержит полипептид или полимер нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации дополнительная последовательность нуклеиновой кислоты встроена в вирусный вектор, который обеспечивает более высокие уровни экспрессии и продукции терапевтической молекулы.

[00139] Согласно некоторым вариантам реализации терапевтическая молекула представляет собой полипептид. В некоторых случаях полипептид представляет собой полипептид–иммуномодулятор. В некоторых случаях полипептид–иммуномодулятор представляет собой цитокин, костимулирующий домен, домен, который ингибирует отрицательные регуляторные молекулы активации T–клеток (например, ингибитор иммунной контрольной точки), или их комбинацию.

[00140] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид–иммуномодулятор модулирует активность одного или более типов клеток, таких как регуляторные Т–клетки (Treg), миелоидные супрессорные клетки (МЛСК), дендритные клетки и/или Т–клетки. Иллюстративные модуляторные полипептиды Treg включают CCR4, Helios, TIGIT, GITR, нейропилин, невритин, CD103, CTLA–4, ICOS и Swap70. Иллюстративные модуляторные полипептиды МЛСК включают ТФР–βР1, ГМ–КСФ, ИФНγ, интерлейкины, такие как ИЛ–β, ИЛ–1F2, ИЛ–6, ИЛ–10, ИЛ–12, ИЛ–13, ИЛ–6, ИЛ–6Рα, комплекс ИЛ–6/ИЛ–6R, ТФР–β1, М–КСФ, простагландин E2/PGE2, простагландин E–синтазу 2, S100A8 и ФРЭС. Иллюстративные модуляторные полипептиды, направленные на дендритные клетки, включают ГМ–КСФ и/или ИЛ–13. Иллюстративные модуляторные полипептиды, направленные на T–клетки, включают ИЛ–12, OX–40, GITR, CD28 или ИЛ–28 либо антитело, выступающее агонистом пути передачи сигнала, включающего ИЛ–12, OX–40, GITR, CD28 или ИЛ–28.

[00141] Согласно другим вариантам реализации терапевтические полипептиды модулируют фиброзную строму. Иллюстративные полипептиды фиброзной стромы включают белок активации фибробластов альфа (БАФ). Согласно некоторым вариантам реализации терапевтический полипептид представляет собой протеазу. Согласно конкретным вариантам реализации протеаза способна к изменению внеклеточного матрикса, в частности, внеклеточного матрикса в пределах микроокружения опухоли. Иллюстративные протеазы включают матриксные металлoпротеазы (MMP), такие как MMP9, коллагеназы и эластазы.

Цитокины в качестве терапевтических молекул

[00142] В некоторых случаях полипептид–иммуномодулятор представляет собой цитокин. Цитокины представляют собой группу небольших белков размером приблизительно 5–20 кДа, которые вовлечены в передачу сигналов между клетками и включают, среди прочих, хемокины, интерфероны (ИФН), интерлейкины (ИЛ) и факторы некроза опухоли (ФНО). Хемокины играют роль в качестве хемоаттрактантов для направления миграции клеток, и их подразделяют на четыре подсемейства: CXC, CC, CX3C и XC. Иллюстративные хемокины включают хемокины из подсемейства CC, такие как CCL1, CCL2 (MCP–1), CCL3, CCL4, CCL5 (RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9 (или CCL10), CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27 и CCL28; подсемейства CXC, такие как CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16 и CXCL17; подсемейства XC, такие как XCL1 и XCL2; и подсемейства CX3C, такие как CX3CL1.

[00143] Интерфероны (ИФН) включают ИФН типа I (например ИФН–α, ИФН–β, ИФН–ε, ИФН–κ и ИФН–ω), ИФН типа II (например ИФН–γ) и ИФН типа III. Согласно некоторым вариантам реализации ИФН–α дополнительно подразделяют на приблизительно 13 подтипов, включая ИФНA1, ИФНA2, ИФНA4, ИФНA5, ИФНA6, ИФНA7, ИФНA8, ИФНA10, ИФНA13, ИФНA14, ИФНA16, ИФНA17 и ИФНA21.

[00144] Интерлейкины представляют собой широкий класс цитокинов, которые способствуют развитию и дифференциации иммунных клеток, включая T– и B–клетки, а также другие гемопоэтические клетки. Иллюстративные интерлейкины включают ИЛ–1, ИЛ–2, ИЛ–3, ИЛ–4, ИЛ–5, ИЛ–6, ИЛ–7, ИЛ–8 (CXCL8), ИЛ–9, ИЛ–10, ИЛ–11, ИЛ–12, ИЛ–13, ИЛ–14, ИЛ–15, ИЛ–16, ИЛ–17, ИЛ–18, ИЛ–19, ИЛ–20, ИЛ–21, ИЛ–22, ИЛ–23, ИЛ–24, ИЛ–25, ИЛ–26, ИЛ–27, ИЛ–28, ИЛ–29, ИЛ–30, ИЛ–31, ИЛ–32, ИЛ–33, ИЛ–35 и ИЛ–36.

[00145] Факторы некроза опухоли (ФНО) представляют собой группу цитокинов, которые модулируют апоптоз. В некоторых случаях в пределах семейства ФНО существует приблизительно 19 членов, включая, без ограничения, ФНОα, лимфотоксин–альфа (LT–α), лимфотоксин–бета (LT–β), T–клеточный антиген gp39 (CD40L), CD27L, CD30L, FASL, 4–1BBL, OX40L и ФНО–связанный индуцируемый апоптозом лиганд (TNF–related apoptosis inducing ligand, TRAIL).

[00146] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует цитокин, который выбран из хемокина, интерферона, интерлейкина или фактора некроза опухоли. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует хемокин, интерферон, интерлейкин и/или фактор некроза опухоли.

Костимулирующие домены в качестве терапевтических молекул

[00147] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид–иммуномодулятор представляет собой костимулирующий домен. В некоторых случаях костимулирующий домен усиливает антиген–специфичную цитотоксичность. В некоторых случаях костимулирующий домен также усиливает продукцию цитокина. Согласно некоторым вариантам реализации костимулирующий домен содержит CD27, CD28, CD70, CD80, CD83, CD86, CD134 (OX–40), CD134L (OK–40L), CD137 (41BB), CD137L (41BBL) или CD224.

[00148] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует костимулирующий домен. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует костимулирующий домен, выбранный из CD27, CD28, CD80, CD83, CD86, CD134, CD134L, CD137, CD137L или CD224.

Ингибиторы иммунной контрольной точки в качестве терапевтических молекул

[00149] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид–иммуномодулятор представляет собой полипептид–ингибитор иммунных контрольных точек, который ингибирует отрицательную регуляторную молекулу активации T–клеток. Ингибитор иммунных контрольных точек связывается с молекулами иммунных контрольных точек, которые представляют собой группу молекул на поверхности CD4 и CD8 Т–клеток. В некоторых случаях данные молекулы эффективно выступают в качестве «тормозов» для понижающей модуляции или ингибирования противоопухолевого иммунного ответа. Ингибитор иммунных контрольных точек обозначает любую молекулу, которая модулирует или ингибирует активность молекулы иммунной контрольной точки. В некоторых случаях ингибиторы иммунной контрольной точки включают антитела, производные антитела (например, Fab–фрагменты, scFv, миниантитела, диатела), антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК, аптамеры или пептиды.

[00150] Иллюстративные молекулы иммунных контрольных точек включают, без ограничения, лиганд запрограммированной смерти 1 (programmed death–ligand 1, PDL1, также известный как B7–H1, CD274), фактор запрограммированной смерти 1 (programmed death 1, PD–1), PD–L2 (B7–DC, CD273), LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD16, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, индуцибельный T–клетками костимулятор (inducible T cell costimulatory, ICOS), KIR, LAIR1, LIGHT, рецептор макрофагов с коллагеновой структурой (macrophage receptor with collageneous structure, MARCO), OX–40, фосфатидилсерин (PS), SLAM, TIGHT, VISTA и VTCN1. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор иммунных контрольных точек ингибирует один или более из PDL1, PD–1, CTLA–4, PD–L2, LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, ICOS, KIR, LAIR1, LIGHT, MARCO, OX–40, PS, SLAM, TIGHT, VISTA и VTCN1.

[00151] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор иммунных контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор иммунных контрольных точек снижает экспрессию или активность одной или более молекул иммунных контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор иммунных контрольных точек снижает взаимодействие между молекулой иммунной контрольной точки и ее лигандом (например, снижает взаимодействие между PD–1 и PDL1). Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор иммунных контрольных точек, ингибирующий один или более из PDL1, PD–1, CTLA–4, PD–L2, LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, ICOS, KIR, LAIR1, LIGHT, MARCO, OX–40, PS, SLAM, TIGHT, VISTA и VTCN1.

[00152] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен терапевтической молекулы, причем домен терапевтической молекулы представляет собой ингибитор иммунных контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен терапевтической молекулы, причем домен терапевтической молекулы представляет собой ингибитор иммунных контрольных точек, который ингибирует один или более из PDL1, PD–1, CTLA–4, PD–L2, LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, ICOS, KIR, LAIR1, LIGHT, MARCO, OX–40, PS, SLAM, TIGHT, VISTA и VTCN1.

Ингибиторы PDL1

[00153] Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор PDL1. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор иммунных контрольных точек представляет собой антитело (например, моноклональное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты либо гуманизированное или химерное антитело или их антигенсвязывающие фрагменты) против PDL1. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор PDL1 снижает экспрессию или активность PDL1. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор PDL1 снижает взаимодействие между PD–1 и PDL1. Иллюстративные ингибиторы PDL1 включают антитела против PDL1, молекулы РНКи (например, РНКи против PDL1), антисмысловые молекулы (например, антисмысловую РНК против PDL1) или доминантно–негативные белки (например, доминантно–негативный белок PDL1). Иллюстративные антитела против PDL1 включают клон EH12; MPDL3280A (Genentech, RG7446); клон 10F.9G2 антитела против PDL1 мыши (BioXcell, кат. № BE0101); моноклональное антитело MDX–1105 против PDL1 (BMS–936559 и BMS–935559 от компании Bristol–Meyers Squibb; MSB0010718C; клон 29E.2A3 мыши против PDL1; и MEDI4736 от компании AstraZeneca.

[00154] Согласно некоторым вариантам реализации антитело против PDL1 представляет собой антитело против PDL1, раскрытое в международной публикации PCT № WO 2013/079174; WO 2010/036959; WO 2013/056716; WO 2007/005874; WO 2010/089411; WO 2010/077634; WO 2004/004771; WO 2006/133396; WO 2013/09906; WO 2012/145493; WO 2013/181634; публикации заявки на патент США № 20140294898; или публикации заявки на патент Китая № CN 101104640.

[00155] Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор PDL1 представляет собой ингибитор экспрессии PDL1 на основе нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор PDL1 представляет собой таковой, раскрытый в международной публикации PCT № WO 2011/127180 или WO 2011/000841. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор PDL1 представляет собой рапамицин.

[00156] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации, который связывается с CD3 (например, scFv против CD3), и домен терапевтической молекулы, который связывается с PDL1 (например, scFv против PDL1). Согласно таким вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус может также содержать дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует дополнительную терапевтическую молекулу.

[00157] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен терапевтической молекулы, который связывается с PDL1. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен распознавания антигена, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор PDL1. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор PDL1, выбранный из EH12, MPDL3280A от компании Genentech (RG7446); клона 10F.9G2 антитела против PDL1 мыши (кат. № BE0101) от компании BioXcell; моноклонального антитела MDX–1105 против PDL1 (BMS–936559) и BMS–935559 от компании Bristol–Meyer's Squibb; MSB0010718C; клона 29E.2A3 мыши против PDL1; и MEDI4736 от компании AstraZeneca.

Ингибиторы PD–L2

[00158] Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор PD–L2. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор PD–L2 представляет собой антитело (например, моноклональное антитело или фрагменты либо гуманизированное или химерное антитело или их фрагменты) против PD–L2. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор PD–L2 снижает экспрессию или активность PD–L2. Согласно другим вариантам реализации ингибитор PD–L2 снижает взаимодействие между PD–1 и PD–L2. Иллюстративные ингибиторы PD–L2 включают антитела (например, антитело против PD–L2), молекулы РНКи (например, РНКи против PD–L2), антисмысловые молекулы (например, антисмысловую РНК против PD–L2) или доминантно–негативные белки (например, доминантно–негативный белок PD–L2).

[00159] Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор PD–L2 представляет собой AMP–224 от компании GlaxoSmithKline (Amplimmune). Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор PD–L2 представляет собой rHIgM12B7.

[00160] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен распознавания антигена, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор PD–L2. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор PD–L2, который выбран из AMP–224 (Amplimmune) или rHIgM12B7.

[00161] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен терапевтической молекулы, который связывается с PDL2. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации, который связывается с CD3 (например, scFv против CD3), и домен терапевтической молекулы, который связывается с PD–L2 (например, scFv против PDL2). Согласно таким вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус может также содержать дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует дополнительную терапевтическую молекулу.

Ингибиторы PD–1

[00162] Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор PD1. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор PDL1 представляет собой антитело (например, моноклональное антитело или фрагменты либо гуманизированное или химерное антитело или их фрагменты) против PD–1. Иллюстративные антитела против PD–1 включают: клон J43 антитела против PD–1 мыши (кат. № BE0033–2) от компании BioXcell; клон RMP1–14 антитела против PD–1 мыши (кат. № BE0146) от компании BioXcell; клон EH12 антитела мыши против PD–1; антитело MK–3475 против PD–1 мыши от компании Merck (Кейтруда, пембролизумаб, ламбролизумаб); и антитело против PD–1 от компании AnaptysBio, известное как ANB011; антитело MDX–1 106 (ONO–4538); моноклональное антитело IgG4 человека ниволумаб от компании Bristol–Myers Squibb (Опдиво®, BMS–936558, MDX1106); AMP–514 и AMP–224 от компании AstraZeneca; и пидилизумаб (CT–011), CureTech Ltd.

[00163] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен распознавания антигена, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор PD1, который выбран из ANB011; антитела MDX–1 106 (ONO–4538); моноклонального антитела IgG4 человека ниволумаба от компании Bristol–Myers Squibb (Опдиво®, BMS–936558, MDX1106); AMP–514 и AMP–224 от компании AstraZeneca; и пидилизумаба (CT–011). Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор PD–1, который выбран из ANB011; антитела MDX–1 106 (ONO–4538); моноклонального антитела IgG4 человека ниволумаба от компании Bristol–Myers Squibb (Опдиво®, BMS–936558, MDX1106); AMP–514 и AMP–224 от компании AstraZeneca; и пидилизумаба (CT–011).

[00164] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен распознавания антигена, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор PD–L2. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор PD–L2, который выбран из AMP–224 (Amplimmune) или rHIgM12B7.

[00165] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен терапевтической молекулы, который связывается с PD1. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации, который связывается с CD3 (например, scFv против CD3), и домен терапевтической молекулы, который связывается с PD1 (например, scFv против PD1). Согласно таким вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус может также содержать дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует дополнительную терапевтическую молекулу.

Ингибиторы CTLA–4

[00166] Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор CTLA–4. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор CTLA–4 представляет собой антитело (например, моноклональное антитело или фрагменты либо гуманизированное или химерное антитело или их фрагменты) против CTLA–4. Согласно одному варианту реализации антитело против CTLA–4 блокирует связывание CTLA–4 с CD80 (B7–1) и/или CD86 (B7–2), экспрессированными на антиген–презентирующих клетках. Иллюстративные антитела против CTLA–4 включают ипилимумаб (также известный как Ервой®, MDX–010, BMS–734016 и MDX–101, Bristol Meyers Squibb); клон 9H10 антитела против CTLA4 от компании Millipore; тремелимумаб (CP–675,206, тицилимумаб, Pfizer); и клон BNI3 антитела против CTLA4 от компании Abcam.

[00167] Согласно некоторым вариантам реализации антитело против CTLA–4 представляет собой таковое, раскрытое в любой из международных публикаций PCT № WO 2001/014424; WO 2004/035607; WO 2003/086459; WO 2012/120125; WO 2000/037504; WO 2009/100140; WO 2006/09649; WO 2005/092380; WO 2007/123737; WO 2006/029219; WO 2010/0979597; WO 2006/12168; WO 1997/020574, в публикации заявки на патент США № 2005/0201994; или публикации заявки на европейский патент № EP 1212422. Дополнительные антитела против CTLA–4 описаны в патентах США №№ 5,811,097; 5,855,887; 5,977,318; 6,051,227; 6,682,736; 6,984,720; 7,109,003; 7,132,281; международной публикации PCT № WO 01/14424 и WO 00/37504; и в публикации заявки на патент США №№ 2002/0039581 и 2002/086014. Согласно некоторым вариантам реализации антитело против CTLA–4 представляет собой таковое, раскрытое в любой из международных публикаций PCT № WO 1998/42752; патентах США №№ 6,682,736 и 6,207, 156; публикациях Hurwitz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17): 10067–10071 (1998); Camacho et al, J. Clin. Oncol., 22(145): Abstract No. 2505 (2004) (антитело CP–675206); Mokyr et al, Cancer Res., 58:5301–5304 (1998).

[00168] Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор CTLA–4 представляет собой лиганд CTLA–4, раскрытый в международной публикации PCT № WO 1996/040915.

[00169] Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор CTLA–4 представляет собой ингибитор экспрессии CTLA–4 на основе нуклеиновой кислоты, такой как молекула РНКи. Согласно некоторым вариантам реализации молекулы РНКи против CTLA4 принимают форму таковых, описанных в любой из международных публикаций PCT № WO 1999/032619 и WO 2001/029058; публикации заявки на патент США №№ 2003/0051263, 2003/0055020, 2003/0056235, 2004/265839, 2005/0100913, 2006/0024798, 2008/0050342, 2008/0081373, 2008/0248576 и 2008/055443; и/или патентах США №№ 6,506,559; 7,282,564; 7,538,095; и 7,560,438. В некоторых случаях молекулы РНКи против CTLA4 представляют собой двухцепочечные молекулы РНКи, такие как таковые, раскрытые в европейском патенте № EP 1309726. В некоторых случаях молекулы РНКи против CTLA4 представляют собой двухцепочечные молекулы РНКи, такие как таковые, описанные в патентах США №№ 7,056,704 и 7,078,196. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор CTLA4 представляет собой аптамер, такой как таковые, описанные в международной публикации PCT № WO 2004/081021, такой как Del 60 или M9–14 del 55. Дополнительно, согласно некоторым вариантам реализации молекулы РНКи против CTLA4 согласно настоящему изобретению представляют собой молекулы РНК, такие как таковые, описанные в патентах США №№ 5,898,031, 6,107,094, 7,432,249 и 7,432,250 и в европейской заявке EP 0928290.

[00170] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен распознавания антигена, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор CTLA–4. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор CTLA–4, который выбран из ипилимумаба (также известен как Ервой®, MDX–010, BMS–734016 и MDX–101); клона 9H10 антитела против CTLA4 от компании Millipore; тремелимумаба от компании Pfizer (CP–675,206, тицилимумаб); и клона BNI3 антитела против CTLA4 от компании Abcam.

[00171] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен терапевтической молекулы, который связывается с CTLA–4. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации, который связывается с CD3 (например, scFv против CD3), и домен терапевтической молекулы, который связывается с CTLA–4 (например, scFv против CTLA–4). Согласно таким вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус может также содержать дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует дополнительную терапевтическую молекулу.

Ингибиторы LAG3

[00172] Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор LAG3 (CD223). Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор LAG3 представляет собой антитело (например, моноклональное антитело или фрагменты либо гуманизированное или химерное антитело или их фрагменты) против LAG3. Согласно дополнительным вариантам реализации антитело против LAG3 блокирует взаимодействие LAG3 с молекулами класса II главного комплекса гистосовместимости (MHC). Иллюстративные антитела против LAG3 включают: клон eBioC9B7W антитела против Lag–3 (C9B7W) от компании eBioscience; антитело LS–B2237 против Lag3 от компании LifeSpan Biosciences; IMP321 (ImmuFact) от компании Immutep; антитело BMS–986016 против Lag3; и химерное антитело A9H12 против LAG–3. Согласно некоторым вариантам реализации антитело против LAG3 представляет собой антитело против LAG3, раскрытое в международной публикации PCT № WO 2010/019570; WO 2008/132601; или WO 2004/078928.

[00173] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен распознавания антигена, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор LAG3. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор LAG3, который выбран из клона eBioC9B7W антитела против Lag–3 (C9B7W) от компании eBioscience; антитела LS–B2237 против Lag3 от компании LifeSpan Biosciences; IMP321 (ImmuFact) от компании Immutep; антитела BMS–986016 против Lag3; и химерного антитела A9H12 против LAG–3.

[00174] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен терапевтической молекулы, который связывается с LAG3. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации, который связывается с CD3 (например, scFv против CD3), и домен терапевтической молекулы, который связывается с LAG3 (например, scFv против LAG3). Согласно таким вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус может также содержать дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует дополнительную терапевтическую молекулу.

Ингибиторы TIM3

[00175] Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор TIM3 представляет собой антитело (например, моноклональное антитело или фрагменты либо гуманизированное или химерное антитело или их фрагменты) против TIM3 (также известен как HAVCR2). Согласно дополнительным вариантам реализации антитело против TIM3 блокирует взаимодействие TIM3 с галектином–9 (Gal9). Согласно некоторым вариантам реализации антитело против TIM3 представляет собой антитело против TIM3, раскрытое в международных публикациях PCT №№ WO 2013/006490; WO 2011/55607; WO 2011/159877; или WO 2001/17057. Согласно другому варианту реализации ингибитор TIM3 представляет собой ингибитор TIM3, раскрытый в международной публикации PCT № WO 2009/052623.

[00176] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен распознавания антигена, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор TIM3, такой как антитело против TIM3, которое блокирует взаимодействие TIM3 с галектином–9 (Gal9).

[00177] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен терапевтической молекулы, который связывается с TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации, который связывается с CD3 (например, scFv против CD3), и домен терапевтической молекулы, который связывается с LAG3 (например, scFv против TIM3). Согласно таким вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус может также содержать дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует дополнительную терапевтическую молекулу.

Ингибиторы B7–H3

[00178] Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор B7–H3. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор B7–H3 представляет собой антитело (например, моноклональное антитело или фрагменты либо гуманизированное или химерное антитело или их фрагменты) против B7–H3. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор B7–H3 представляет собой MGA271 (MacroGenics).

[00179] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен распознавания антигена, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор B7–H3. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ингибитор B7–H3, такой как MGA271.

[00180] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации и домен терапевтической молекулы, который связывается с B7–H3. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует привлекающую молекулу, содержащую домен активации, который связывается с CD3 (например, scFv против CD3), и домен терапевтической молекулы, который связывается с B7–H3 (например, scFv против B7–H3). Согласно таким вариантам реализации псевдотипированный онколитический вирус может также содержать дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует дополнительную терапевтическую молекулу.

[00181] Согласно другим определенным вариантам реализации привлекающая молекула дополнительно содержит один или более других доменов, например, один или более цитокинов, костимулирующих доменов, доменов, которые ингибируют отрицательные регуляторные молекулы активации Т–клеток, или их комбинацию. Согласно альтернативным вариантам реализации привлекающая молекула представляет собой первый полипептид, предложенный в псевдотипированном онколитическом вирусе, со вторым полипептидом, содержащим один или более других доменов, например, один или более цитокинов, костимулирующих доменов, доменов, которые ингибируют отрицательные регуляторные молекулы активации Т–клеток, или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации первый полипептид и второй полипептид кодируются в одном и том же векторе (например, вирусном векторе). Согласно некоторым вариантам реализации первый полипептид и второй полипептид кодируются в различных векторах (например, вирусных векторах). Согласно конкретным вариантам реализации цитокин представляет собой ИЛ–15, ИЛ–2 и/или ИЛ–7. Согласно другим конкретным вариантам реализации костимулирующий домен представляет собой CD27, CD80, CD83, CD86, CD134 или CD137. Согласно другим конкретным вариантам реализации домен, который ингибирует отрицательные регуляторные молекулы активации Т–клеток, представляет собой PD–1, PDL1, CTLA4 или B7–H4.

Антиангиогенные факторы в качестве терапевтических молекул

[00182] Согласно некоторым вариантам реализации терапевтическая молекула представляет собой полипептид, такой как антиангиогенный фактор. Ангиогенез или неоваскуляризация представляет собой образование новых микрососудов из сформированной сосудистой сети. В некоторых случаях ангиогенный процесс включает контакты множества типов клеток, таких как эндотелиальные клетки (ЭК) и циркулирующие эндотелиальные клетки–предшественники, перициты, сосудистые гладкомышечные клетки, стромальные клетки, включая стволовые клетки, и паренхимные клетки. Данные контакты или взаимодействия осуществляются посредством секретируемых факторов, таких как ФРЭС, фактор роста фибробластов (ФРФ), фактор роста тромбоцитов (ФРТ) или ангиопоэтины. В некоторых случаях антиангиогенный фактор представляет собой полипептид, который нарушает одно или более взаимодействий между типами клеток: между эндотелиальными клетками (ЭК) и циркулирующими эндотелиальными клетками–предшественниками, перицитами, сосудистыми гладкомышечными клетками, стромальными клетками, включая стволовые клетки и паренхимные клетки. В некоторых случаях антиангиогенный фактор представляет собой полипептид, который нарушает одно или более взаимодействий секретируемых факторов, таких как ФРЭС, фактор роста фибробластов (ФРФ), фактор роста тромбоцитов (ФРТ) или ангиопоэтины.

[00183] Согласно другим вариантам реализации предложены псевдотипированные онколитические вирусы, содержащие нуклеиновые кислоты, которые кодируют терапевтические полипептиды, модулирующие регуляторные Т–клетки. В некоторых случаях регуляторные Т–клетки поддерживают толерантность к аутоантигенам и в некоторых случаях подавляют аутоиммунитет. В некоторых случаях Treg супрессируют или понижающе регулируют индукцию и пролиферацию эффекторных Т–клеток. Иллюстративные модуляторные полипептиды Treg включают CCR4, Helios, TIGIT, GITR, нейропилин, невритин, CD103, CTLA–4, ICOS и Swap70.

[00184] Согласно другим вариантам реализации предложены псевдотипированные онколитические вирусы, содержащие нуклеиновые кислоты, которые кодируют терапевтические полипептиды, модулирующие миелоидные супрессорные клетки (МЛСК). МЛСК представляют собой гетерогенную популяцию иммунных клеток миелоидной линии (кластер различных типов клеток, которые происходят из стволовых клеток костного мозга), к которой также относятся дендритные клетки, макрофаги и нейтрофилы. В некоторых случаях миелоидные клетки взаимодействуют с Т–клетками для регуляции функции T–клеток. Иллюстративные модуляторные полипептиды МЛСК включают ТФР–βР1, ГМ–КСФ, ИФН–γ, интерлейкины (например, ИЛ–β, ИЛ–1F2, ИЛ–6, ИЛ–10, ИЛ–12, ИЛ–13, ИЛ–6, ИЛ–6Рα, комплекс ИЛ–6/ИЛ–6Р, ТФР–β1, М–КСФ, простагландин E2/PGE2, простагландин E–синтазу 2, S100A8 и ФРЭС.

[00185] Согласно другим вариантам реализации предложены псевдотипированные онколитические вирусы, содержащие нуклеиновые кислоты, которые кодируют терапевтические полипептиды, модулирующие фиброзную строму. Согласно некоторым вариантам реализации фиброз возникает в ответ на воспаление, хроническое или рецидивирующее. Со временем повторяющиеся приступы воспаления вызывают раздражение и рубцевание ткани, что приводит к нарастанию фиброзной ткани. В некоторых случаях, если образуется достаточное количество фиброзного материала, он превращается в стромальный фиброз. Иллюстративные полипептиды фиброзной стромы включают белок активации фибробластов альфа (БАФ).

Полимеры нуклеиновой кислоты в качестве терапевтических молекул

[00186] Согласно некоторым вариантам реализации терапевтическая молекула представляет собой полимер нуклеиновой кислоты. В некоторых случаях полимер нуклеиновой кислоты представляет собой полимер РНК. В некоторых случаях полимер РНК представляет собой антисмысловой полимер, последовательность которого комплементарна последовательности–мишени микроРНК (miRNA или miR). В некоторых случаях полимер РНК представляет собой полимер микроРНК. Согласно некоторым вариантам реализации полимер РНК содержит ДНК–направленную последовательность РНКи (DNA–directed RNAi, ddRNAi), которая делает возможной продукцию короткой шпилечной РНК (кшРНК) in vivo.

[00187] Согласно некоторым вариантам реализации полимер микроРНК представляет собой короткую некодирующую РНК, которая экспрессируется в различных типах ткани и клеток и подавляет экспрессию гена–мишени. Например, микроРНК транскрибируются РНК–полимеразой II как часть кэпированных и полиаденилированных первичных транскриптов (прай–микроРНК). В некоторых случаях первичный транскрипт расщепляется ферментом рибонуклеазой Дроша III с получением предшественника микроРНК длиной ориентировочно 70 нуклеотидов со структурой «петля на стебле» (пре–микроРНК), который затем расщепляется цитоплазматической рибонуклеазой Дайсер с получением в качестве продуктов зрелой микроРНК и антисмысловой микроРНК со звездочкой (микроРНК*). В некоторых случаях зрелая микроРНК встраивается в РНК–индуцированный комплекс сайленсинга (RNA–induced silencing complex, RISC), который распознает мРНК–мишени в результате неидеального спаривания оснований с микроРНК и в некоторых случаях приводит к ингибированию трансляции или к дестабилизации мРНК–мишени.

[00188] В некоторых случаях экспрессия микроРНК с нарушенной регуляцией коррелирует с одним или более типами рака. Согласно некоторым вариантам реализации микроРНК обозначают как онкомиР (oncomiR). В некоторых случаях экспрессия микроРНК с нарушенной регуляцией представляет собой повышенную экспрессию. В некоторых случаях повышенный уровень экспрессии микроРНК коррелирует с одним или более типами рака. Например, сверхэкспрессия микроРНК–155 (miR–155) наблюдалась при типах рака, таких как лимфома Беркитта или плоскоклеточная карцинома гортани (ПККГ), и сверхэкспрессия микроРНК–21 (miR–21) наблюдалась при раке молочной железы.

[00189] Согласно некоторым вариантам реализации иллюстративные микроРНК с повышенным уровнем экспрессии включают, без ограничения, семейство miR–10 (например, miR–10b), miR–17, miR–21, семейство miR–106 (например, miR–106a), семейство miR–125 (например, miR–125b), miR–145, семейство miR–146 (например, miR–146a, miR–146b), miR–155, miR–96, miR–182, miR–183, miR–221, miR–222 и miR–1247–5p.

[00190] В некоторых случаях полимер нуклеиновой кислоты представляет собой антисмысловой полимер, последовательность которого комплементарна онкомиР. В некоторых случаях полимер нуклеиновой кислоты представляет собой антисмысловой полимер, последовательность которого комплементарна онкомиР, которая характеризуется сверхэкспрессией. В некоторых случаях полимер нуклеиновой кислоты представляет собой антисмысловой полимер, последовательность которого комплементарна последовательности–мишени микроРНК. В некоторых случаях полимер нуклеиновой кислоты представляет собой антисмысловой полимер, последовательность которого комплементарна последовательности–мишени микроРНК, которая характеризуется сверхэкспрессией. В некоторых случаях терапевтическая молекула представляет собой антисмысловой полимер, последовательность которого комплементарна последовательности–мишени микроРНК. В некоторых случаях терапевтическая молекула представляет собой антисмысловой полимер, последовательность которого комплементарна последовательности–мишени микроРНК, которая характеризуется сверхэкспрессией. В некоторых случаях уровень сверхэкспрессии сравнивают с эндогенным уровнем экспрессии микроРНК.

[00191] В некоторых случаях экспрессия микроРНК с нарушенной регуляцией представляет собой сниженную экспрессию. В некоторых случаях сниженный уровень экспрессии микроРНК коррелирует с одним или более типами рака. Например, уменьшенный уровень miR–31 наблюдался в линиях клеток метастатического рака молочной железы человека и мыши.

[00192] Согласно некоторым вариантам реализации иллюстративные микроРНК со сниженными уровнями экспрессии включают, без ограничения, miR–31, семейство miR–34 (например, miR34a, miR–34b и miR–34c), miR–101, miR–126, miR–145, miR–196a и семейство miR–200.

[00193] В некоторых случаях полимер нуклеиновой кислоты представляет собой онкомиР. В некоторых случаях онкомиР эквивалентна эндогенной онкомиР, причем эндогенная онкомиР характеризуется сниженным уровнем экспрессии. В некоторых случаях полимер нуклеиновой кислоты представляет собой полимер микроРНК. В некоторых случаях терапевтическая молекула представляет собой полимер микроРНК. В некоторых случаях микроРНК эквивалентна эндогенному полимеру микроРНК, причем эндогенная микроРНК характеризуется сниженным уровнем экспрессии.

[00194] Как описано выше, в некоторых случаях полимер РНК содержит последовательность ДНК–направленной РНКи (ddRNAi). В некоторых случаях конструкция ddRNAi, кодирующая мшРНК, упакована в вирусный вектор, такой как вирусный вектор псевдотипированного онколитического вируса, описанный в настоящем документе. В некоторых случаях после поступления в клетку–мишень (например, опухолевую клетку) вирусный геном процессируется с получением закодированной кшРНК. Затем кшРНК процессируются эндогенными системами хозяина и поступают в путь РНКи для модуляции или сайленсинга желаемого гена–мишени. В некоторых случаях ген–мишень представляет собой ген, который сверхэкспрессируется в типе рака. В некоторых случаях ген–мишень представляет собой ген, который сверхэкспрессируется в солидной опухоли. В некоторых случаях ген–мишень представляет собой ген, который сверхэкспрессируется в гематологическом типе рака. Иллюстративные гены, которые сверхэкспрессируются при раке, включают, без ограничения, TP53, рецептор эпидермального фактора роста 2 человека (HER2), муцин 1, связанный с поверхностью клетки (MUC1), трансформирующий ген опухоли гипофиза 1 человека (human pituitary tumour–transforming gene 1, hPPTG1), белок сверхэкспрессированного гена 1 предстательной железы и рака молочной железы (prostate and breast cancer overexpressed gene 1 protein, PBOV1) и т.п.

[00195] В некоторых случаях полимер нуклеиновой кислоты содержит последовательность ddRNAi. В некоторых случаях полимер нуклеиновой кислоты содержит последовательность ddRNAi, нацеленную на ген, который сверхэкспрессируется при раке. В некоторых случаях терапевтическая молекула содержит последовательность ddRNAi. В некоторых случаях терапевтическая молекула содержит последовательность ddRNAi, нацеленную на ген, который сверхэкспрессируется при раке.

Иллюстративные привлекающие молекулы

[00196] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы, описанные в настоящем документе, содержат конструкцию биспецифичного антитела, содержащую домен активации и домен распознавания антигена, в которой домен активации взаимодействует или связывается с рецептором поверхности эффекторной клетки, представленным в таблице 1; и домен распознавания антигена взаимодействует или связывается с антигеном клетки–мишени, представленным в таблице 2. Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы, описанные в настоящем документе, содержат конструкцию биспецифичного антитела, содержащую домен активации и домен терапевтической молекулы, в которой домен активации взаимодействует или связывается с рецептором поверхности эффекторной клетки, представленным в таблице 1; и домен терапевтической молекулы взаимодействует или связывается с антигеном поверхности клетки, представленным в таблице 2.

[00197] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы, предложенные в настоящем документе, содержат домен активации, причем домен активации содержит scFv против CD3. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD3 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 20, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 22. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD3 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 20, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, который на 100% идентичен последовательности аминокислот SEQ ID NO: 22. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD3 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 20, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 22. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD3 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, состоящий из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 20, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, состоящий из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 22.

[00198] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы, предложенные в настоящем документе, содержат домен активации, причем домен активации содержит scFv против CD3, причем scFv против CD3 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD3 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, которая на 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 21. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD3 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 19, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 21. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD3 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, состоящую из SEQ ID NO: 19, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, состоящую из SEQ ID NO: 21.

[00199] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы, предложенные в настоящем документе, содержат домен распознавания антигена, причем домен распознавания антигена содержит scFv против CD19. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD19 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 16, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 18. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD19 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 16, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, который на 100% идентичен последовательности аминокислот SEQ ID NO: 18. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD19 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 16, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 18. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD19 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, состоящий из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 16, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, состоящий из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 18.

[00200] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы, предложенные в настоящем документе, содержат домен распознавания антигена, причем домен распознавания антигена содержит scFv против CD19, причем scFv против CD19 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD19 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, которая на 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD19 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 15, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD19 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, состоящую из SEQ ID NO: 15, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, состоящую из SEQ ID NO: 17.

[00201] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы, предложенные в настоящем документе, содержат домен терапевтической молекулы, причем домен терапевтической молекулы содержит scFv против PDL1. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против PDL1 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 36, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 38. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против PDL1 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 36, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, который на 100% идентичен последовательности аминокислот SEQ ID NO: 38. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против PDL1 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 36, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 38. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против PDL1 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, состоящий из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 36, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, состоящий из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 38.

[00202] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы, предложенные в настоящем документе, содержат домен терапевтической молекулы, причем домен терапевтической молекулы содержит scFv против PDL1, причем scFv против PDL1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 35, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 37. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против PDL1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, которая на 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 35, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 37. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против PDL1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 35, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 37. Согласно некоторым вариантам реализации scFv против PDL1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, состоящую из SEQ ID NO: 35, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, состоящую из SEQ ID NO: 37.

[00203] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы, предложенные в настоящем документе, содержат домен терапевтической молекулы, причем домен терапевтической молекулы содержит фрагмент полипептида SIRP1α. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент полипептида SIRP1α содержит последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 32. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент полипептида SIRP1α содержит последовательность аминокислот, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 32. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент полипептида SIRP1α содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 32. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент полипептида SIRP1α состоит из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 32.

[00204] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы, предложенные в настоящем документе, содержат домен терапевтической молекулы, причем домен терапевтической молекулы содержит фрагмент полипептида SIRP1α, причем фрагмент полипептида SIRP1α содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 31. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент полипептида SIRP1α содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 31. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент полипептида SIRP1α содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 31. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент полипептида SIRP1α состоит из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 31.

[00205] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы содержат домен активации, содержащий scFv, который связывается с CD3, и домен распознавания антигена, содержащий scFv, который связывается с CD19, обозначаемые в настоящем документе как CD19–CD3 BiTE или CD19 BiTE. Схема иллюстративного CD19–CD3 BiTE представлена на ФИГ. 1 (SEQ ID NO: 44). Согласно таким вариантам реализации scFv против CD3 и scFv против CD19 соединены посредством линкера G4S (SEQ ID NO: 6). Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, содержат бицистронную или мультицистронную последовательность нуклеиновой кислоты, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует CD19–CD3 BiTE, и вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует терапевтическую молекулу, такую как ИЛ–15 (ФИГ. 2, SEQ ID NO: 53), ИЛ–12 (ФИГ. 3, SEQ ID NO: 54) или CXCL10 (ФИГ. 4, SEQ ID NO: 55). Согласно таким вариантам реализации CD19–CD3 BiTE (например, SEQ ID NO: 44) присоединен к терапевтической молекуле, например, ИЛ–15 (SEQ ID NO: 24), p35 ИЛ–12 (SEQ ID NO: 28), p40 ИЛ–12 (SEQ ID NO: 26) и/или CXCL10 (SEQ ID NO: 30), посредством самоотщепляемого пептидного линкера T2A (SEQ ID NO: 14).

[00206] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы содержат домен активации, содержащий scFv, который связывается с CD3, и домен терапевтической молекулы, содержащий фрагмент полипептида SIRP1α, который связывается с CD47 (SEQ ID NO: 32), обозначаемые в настоящем документе как SIRP1α–CD3 BiTE или SIRP1α BiTE. Схема иллюстративного SIRP1α–CD3 BiTE представлена на ФИГ. 5 (SIRP1α–CD3 (SL), SEQ ID NO: 46) и ФИГ. 6 (SIRP1α–CD3 (LL), SEQ ID NO: 48). Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD3 и фрагмент пептида SIRP1α соединены посредством линкера длиной в одну аминокислоту, или «короткого линкера» (short linker, SL) (например, SIRP1α–CD3 (SL), как представлено на ФИГ. 5). Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD3 и фрагмент пептида SIRP1α соединены посредством линкера G4S или «длинного линкера» (long linker, LL) (например, SIRP1α–CD3 (LL), как представлено на ФИГ. 6). Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, содержат бицистронную или мультицистронную последовательность нуклеиновой кислоты, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует SIRP1α–CD3 BiTE, и вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует терапевтическую молекулу, такую как ИЛ–15 (ФИГ. 7, SEQ ID NO: 56 и ФИГ. 8, SEQ ID NO: 57), ИЛ–12 (ФИГ. 9, SEQ ID NO: 58 и ФИГ. 10, SEQ ID NO: 59) или CXCL10 (ФИГ. 11, SEQ ID NO: 60 и ФИГ. 12, SEQ ID NO: 61). Согласно таким вариантам реализации SIRP1α–CD3 BiTE (например, SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 48) присоединен к терапевтической молекуле, например, ИЛ–15 (SEQ ID NO: 24), p35 ИЛ–12 (SEQ ID NO: 28), p40 ИЛ–12 (SEQ ID NO: 26) и/или CXCL10 (SEQ ID NO: 30), посредством самоотщепляемого пептидного линкера T2A (SEQ ID NO: 14).

[00207] Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, содержат бицистронную или мультицистронную последовательность нуклеиновой кислоты, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует SIRP1α–CD3 BiTE, и вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует терапевтическую молекулу, такую как MMP9 (ФИГ. 18A, SEQ ID NO: 65 и ФИГ. 18B, SEQ ID NO: 66). Согласно таким вариантам реализации SIRP1α–CD3 BiTE (например, SEQ ID NO: 65 или 66) присоединен к полипептиду MMP9 (SEQ ID NO: 34) посредством самоотщепляемого пептидного линкера T2A (SEQ ID NO: 14).

[00208] Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, содержат бицистронную или мультицистронную последовательность нуклеиновой кислоты, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует SIRP1α–CD3 BiTE, и вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1, присоединенный к Fc–домену IgG1 (например, содержит CH2–CH3–шарнир IgG1, SEQ ID NO: 40), такие как конструкция SIRP1α–CD3–PDL1–Fc (SL), представленная на ФИГ. 37 (SEQ ID NO: 68), или конструкция SIRP1α–CD3–PDL1–Fc (LL), представленная на ФИГ. 38 (SEQ ID NO: 70).

[00209] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающие молекулы содержат домен активации, содержащий scFv, который связывается с CD3, и домен терапевтической молекулы, содержащий scFv, который связывается с PDL1, обозначаемые в настоящем документе как PDL1–CD3 BiTE или PDL1 BiTE. Иллюстративные PDL1–CD3 BiTE представлены на ФИГ. 13 (SEQ ID NO: 50). Согласно некоторым вариантам реализации scFv против CD3 и scFv против PDL1 соединены посредством линкера G4S (SEQ ID NO: 6). Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, содержат бицистронную или мультицистронную последовательность нуклеиновой кислоты, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует PDL1–CD3 BiTE, и вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует терапевтическую молекулу, такую как ИЛ–15 (ФИГ. 14, SEQ ID NO: 62), ИЛ–12 (ФИГ. 15, SEQ ID NO: 63) или CXCL10 (ФИГ. 16, SEQ ID NO: 64). Согласно таким вариантам реализации SIRP1α–CD3 BiTE (например, SEQ ID NO: 50) присоединен к терапевтической молекуле, например, ИЛ–15 (SEQ ID NO: 24), p35 ИЛ–12 (SEQ ID NO: 28), p40 ИЛ–12 (SEQ ID NO: 26) и/или CXCL10 (SEQ ID NO: 30), посредством самоотщепляемого пептидного линкера T2A (SEQ ID NO: 14).

[00210] Согласно некоторым вариантам реализации привлекающая молекула представляет собой тройную привлекающую молекулу и содержит домен активации, содержащий scFv, который связывается с CD3, домен терапевтической молекулы, содержащий scFv, который связывается с PDL1, и третий домен, содержащий Fc–домен IgG1 (например, содержит CH2–CH3–шарнир IgG1, SEQ ID NO: 40) и способный к связыванию с одним или более FcγR, обозначенный в настоящем документе как тройной привлекающий T–клетки активатор PDL1–CD3–Fc, или TiTE, или PDL1 TiTE. Схема иллюстративных PDL1–CD3–Fc TiTE представлена на ФИГ. 17 (SEQ ID NO: 52).

[00211] Последовательности аминокислот иллюстративных привлекающих молекул и терапевтических молекул представлены в таблице 3.

Таблица 3: Последовательности аминокислот иллюстративных привлекающих молекул и терапевтических молекул

[00212] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующие привлекающую молекулу и/или терапевтическую молекулу. Иллюстративные последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты представлены в таблице 4.

[00213] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой ИЛ–15. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–15, содержащую последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 24. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–15, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 24. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–15, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 24. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–15, состоящую из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 24. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–15 и содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–15 и содержат последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–15 и состоят из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23.

[00214] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой ИЛ–12 (т.е. p35 ИЛ–12 и/или p40 ИЛ–12). Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12, содержащую последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 26. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 26. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 26. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12, состоящую из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 26. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12 и содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12 и содержат последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12 и состоят из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25.

[00215] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12, содержащую последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 28. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 28. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12, состоящую из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 28. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12 и содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12 и содержат последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12 и состоят из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27.

[00216] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 26 и 28. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу ИЛ–12 и содержат последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25 и 27.

[00217] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой CXCL10. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу CXCL10, содержащую последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 30. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу CXCL10, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 30. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу CXCL10, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 30. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу CXCL10, состоящую из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 30. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу CXCL10 и содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 29. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу CXCL10 и содержат последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 29. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу CXCL10 и состоят из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 29.

[00218] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула представляет собой MMP9. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу MMP9, содержащую последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 34. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу MMP9, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 34. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу MMP9, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 34. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу MMP9, состоящую из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 34. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу MMP9 и содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 33. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу MMP9 и содержат последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 33. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу MMP9 и состоят из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 33.

[00219] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, причем терапевтическая молекула содержит scFv против PDL1. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1, причем scFv против PDL1 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 36, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 38. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1, причем scFv против PDL1 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 36, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, который на 100% идентичен последовательности аминокислот SEQ ID NO: 38. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1, причем scFv против PDL1 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 36, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 38. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1, причем scFv против PDL1 содержит вариабельный фрагмент легкой цепи, состоящий из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 36, и вариабельный фрагмент тяжелой цепи, состоящий из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 38.

[00220] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1, причем scFv против PDL1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 35, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 37. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1, причем scFv против PDL1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, которая на 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 35, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, которая на 100% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 37. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1, причем scFv против PDL1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 35, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 37. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1, причем scFv против PDL1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента легкой цепи, состоящую из SEQ ID NO: 35, и последовательность нуклеиновой кислоты вариабельного фрагмента тяжелой цепи, состоящую из SEQ ID NO: 37.

[00221] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1 и Fc–домен IgG1. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1 и Fc–домен IgG1, причем Fc–домен IgG1 содержит последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1 и Fc–домен IgG1, причем Fc–домен IgG1 на 100% идентичен последовательности аминокислот SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1 и Fc–домен IgG1, причем Fc–домен IgG1 содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1 и Fc–домен IgG1, причем Fc–домен IgG1 состоит из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1 и Fc–домен IgG1, причем последовательность нуклеиновой кислоты Fc–домена IgG1 по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 39. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1 и Fc–домен IgG1, причем последовательность нуклеиновой кислоты Fc–домена IgG1 содержит SEQ ID NO: 39. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют терапевтическую молекулу, содержащую scFv против PDL1 и Fc–домен IgG1, причем последовательность нуклеиновой кислоты Fc–домена IgG1 содержит SEQ ID NO: 39.

[00222] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая выбрана из SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51, 67 и 69. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны последовательности нуклеиновой кислоты, которая выбрана из SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51, 67 и 69. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, на 100% идентичны последовательности нуклеиновой кислоты, которая выбрана из SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51, 67 и 69. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, состоят из последовательности нуклеиновой кислоты, которая выбрана из SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51, 67 и 69.

[00223] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют привлекающую молекулу и/или терапевтическую молекулу, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот, которая выбрана из SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50 и 52. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют белок привлекающей молекулы, который на 100% идентичен последовательности аминокислот, которая выбрана из SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50 и 52. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют белок привлекающей молекулы, содержащий последовательность аминокислот, которая выбрана из SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50 и 52. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют белок привлекающей молекулы, состоящий из последовательности аминокислот, которая выбрана из SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50 и 52.

[00224] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе, кодируют привлекающую молекулу и терапевтическую молекулу. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты кодируют последовательность аминокислот, содержащую привлекающую молекулу и терапевтическую молекулу, причем последовательность аминокислот по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот, которая выбрана из SEQ ID NO: 53–66, 68 и 70. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты кодируют последовательность аминокислот, содержащую привлекающую молекулу и терапевтическую молекулу, причем последовательность аминокислот на 100% идентична последовательностям аминокислот, которые выбраны из SEQ ID NO: 53–66, 68 и 70. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности нуклеиновой кислоты кодируют последовательность аминокислот, содержащую привлекающую молекулу и терапевтическую молекулу, причем последовательность аминокислот состоит из последовательности аминокислот, которая выбрана из SEQ ID NO: 53–66, 68 и 70.

Таблица 4: Нуклеиновые последовательности иллюстративных привлекающих молекул

[00225] Дополнительные иллюстративные варианты реализации привлекающих молекул включают привлекающие молекулы, содержащие домен активации, который содержит scFv против CD3 (например, состоящий из SEQ ID NO: 20 и 22), и терапевтический домен, содержащий scFv, который связывается с белком поверхности клетки, таким как CTLA4, TIM3, LAG3, BTLA, KIR, TIGIT, OX40 или GITR. Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, содержат бицистронную или мультицистронную последовательность нуклеиновой кислоты, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует привлекающие молекулы, содержащие домен активации, который содержит scFv против CD3 (например, состоящий из SEQ ID NO: 20 и 22), и терапевтический домен, содержащий scFv, который связывается с белком поверхности клетки, таким как CTLA4, TIM3, LAG3, BTLA, KIR, TIGIT, OX40, CD47 или GITR, и вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует терапевтическую молекулу, такую как ИЛ–15 (SEQ ID NO: 24), ИЛ–12 (SEQ ID NO: 26 и 28), CXCL10 (SEQ ID NO: 30) или MMP9 (SEQ ID NO: 34). Согласно таким вариантам реализации привлекающая молекула присоединена к полипептиду терапевтической молекулы посредством самоотщепляемого пептидного линкера T2A (SEQ ID NO: 14).

[00226] Дополнительные иллюстративные варианты реализации привлекающих молекул включают привлекающие молекулы, содержащие домен активации, который содержит scFv против CD3 (например, состоящий из SEQ ID NO: 20 и 22), и домен распознавания антигена, содержащий scFv, который связывается с SLAMF7 (также известный как CD319) или CD27 (с мембраносвязанной формой CD27 или растворимой формой CD27). Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, содержат бицистронную или мультицистронную последовательность нуклеиновой кислоты, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует привлекающие молекулы, содержащие домен активации, который содержит scFv против CD3 (например, состоящий из SEQ ID NO: 20 и 22), и антигенраспознающий домен, содержащий scFv, который связывается с антигеном клетки–мишени, таким как SLAMF7 или CD27, и вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует терапевтическую молекулу, такую как ИЛ–15 (SEQ ID NO: 24), ИЛ–12 (SEQ ID NO: 26 и 28), CXCL10 (SEQ ID NO: 30) или MMP9 (SEQ ID NO: 34). Согласно таким вариантам реализации привлекающая молекула присоединена к полипептиду терапевтической молекулы посредством самоотщепляемого пептидного линкера T2A (SEQ ID NO: 14).

[00227] Дополнительные белки поверхности клетки, которые являются подходящими для нацеливания посредством привлекающих молекул, описанных в настоящем документе, представлены ниже в таблице 5. Дополнительные белки, которые являются подходящими для применения в качестве терапевтических молекул, представлены ниже в таблице 6.

Таблица 5: Белки поверхности клетки, подходящие для нацеливания посредством привлекающих молекул

Таблица 6: Белки, подходящие для применения в качестве терапевтических молекул

Варианты терапевтического применения онколитических вирусов

[00228] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены композиции и способы применения для предотвращения, лечения и/или облегчения ракового заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации способы, описанные в настоящем документе, включают введение субъекту, который нуждается в таком введении, эффективного количества (например, терапевтически эффективного количества) онколитического вируса, описанного в настоящем документе, причем вирус экспрессирует привлекающую молекулу или привлекающую молекулу и терапевтическую молекулу.

[00229] Согласно некоторым вариантам реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению являются подходящими для всех стадий и типов рака, включая минимальную остаточную болезнь, раннюю солидную опухоль, распространенную солидную опухоль и/или метастатическую солидную опухоль. Согласно некоторым вариантам реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению применяют для лечения множества солидных опухолей, связанных с множеством различных типов рака. Термин «солидные опухоли» обозначает рецидивирующие или трудно поддающиеся лечению опухоли, а также метастазы (расположенные где–либо), отличные от метастазов, наблюдаемых при лимфатическом раке.

[00230] Иллюстративные солидные опухоли включают, без ограничения, опухоли головного мозга и других отделов центральной нервной системы (например, опухоли оболочек головного мозга, головного мозга, спинного мозга, черепных нервов и других частей центральной нервной системы, например, глиобластомы или медуллобластомы); рак головы и/или шеи; опухоли молочной железы; опухоли кровеносной системы (например, сердца, средостения и плевры и других органов грудной полости, опухоли сосудов и опухоль–ассоциированную сосудистую ткань); опухоли выделительной системы (например, почек, почечной лоханки, мочеточника, мочевого пузыря, других и неуказанных органов мочевыведения); опухоли желудочно–кишечного тракта (например, пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстой кишки, толстой и прямой кишок, ректосигмоидного соединения, прямой кишки, заднепроходного отверстия и заднепроходного канала), опухоли, затрагивающие печень и внутрипеченочные желчные протоки, желчный пузырь, другие и неуказанные части желчевыводящих путей, поджелудочную железу, другие органы пищеварения); опухоли головы и шеи; ротовой полости (губ, языка, десен, диафрагмы полости рта, неба и других частей рта, околоушных слюнных желез и других частей слюнных желез, миндалины, ротоглотки, носоглотки, грушевидного синуса, гортаноглотки и других участков губ, ротовой полости и глотки); опухоли репродуктивной системы (например, наружных половых органов, влагалища, шейки матки, тела матки, матки, яичников и других участков, связанных с женскими половыми органами, плаценты, полового члена, предстательной железы, яичек и других участков, связанных с мужскими половыми органами); опухоли дыхательных путей (например, носовой полости и среднего уха, околоносовых пазух, гортани, трахей, бронхов и легких, например, мелкоклеточный рак легких или немелкоклеточный рак легких); опухоли скелетной системы (например, кости и суставного хряща конечностей, суставного хряща костей и других участков); опухоли кожи (например, злокачественную меланому кожи, немеланомный рак кожи, базальноклеточную карциному кожи, плоскоклеточную карциному кожи, мезотелиому, саркому Капоши); и опухоли, затрагивающие другие ткани, включая периферические нервы и автономную нервную систему, соединительные и мягкие ткани, забрюшинное пространство и брюшину, глаза и придатки, щитовидную железу, надпочечники и другие эндокринные железы и родственные структуры, вторичные и неуточненные злокачественные новообразования лимфатических узлов, вторичные злокачественные новообразования дыхательной и пищеварительной систем и вторичные злокачественные новообразования других участков, олигодендроглиому, олигоастроцитому, астроцитому, глиобластому или медуллобластому либо другие солидные опухоли.

[00231] Согласно конкретным вариантам реализации солидная опухоль представляет собой опухоль головного мозга. В некоторых случаях опухоль головного мозга включает, без ограничения, глиому, в частности, эпендимому, олигодендроглиому, олигоастроцитому, астроцитому, глиобластому или медуллобластому.

[00232] Согласно некоторым вариантам реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению применяют для лечения гематологического типа рака. Термин «гематологический тип рака» обозначает в настоящем документе рак кровеносной системы и включает рецидивирующие или трудно поддающиеся лечению гематологические типы рака, а также метастазировавшие гематологические типы рака (расположенные где–либо). В некоторых случаях гематологический тип рака представляет собой злокачественное T–клеточное новообразование или злокачественное B–клеточное новообразование. Иллюстративные злокачественные T–клеточные новообразования включают, без ограничения, периферическую T–клеточную лимфому без дополнительных уточнений (peripheral T–cell lymphoma not otherwise specified, PTCL–NOS), анапластическую крупноклеточную лимфому, ангиоиммунобластную лимфому, T–клеточную лимфому кожи, T–клеточный лейкоз/лимфому взрослых (adult T–cell leukemia/lymphoma, ATLL), бластную NK–клеточную лимфому, T–клеточную лимфому энтеропатического типа, T–клеточную лимфому печени и селезенки гамма–дельта, лимфобластную лимфому, назальные NK/T–клеточные лимфомы или связанные с проводимым лечением T–клеточные лимфомы.

[00233] Иллюстративные злокачественные B–клеточные новообразования включают, без ограничения, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (МКЛЛ), ХЛЛ высокого риска, лимфому, отличную от ХЛЛ/МКЛЛ, пролимфоцитарный лейкоз (ПЛЛ), фолликулярную лимфому (ФЛ), диффузную В–крупноклеточную лимфому (ДБКЛ), мантийноклеточную лимфому (МКЛ), макроглобулинемию Вальденстрема, множественную миелому, экстранодальную В–клеточную лимфому из клеток краевой зоны, узловую B–клеточную лимфому из клеток краевой зоны, лимфому Беркитта, B–клеточную лимфому высокой степени злокачественности, отличную от лимфомы Беркитта, первичную медиастинальную В–клеточную лимфому (ПМБКЛ), иммунобластную крупноклеточную лимфому, лимфобластную лимфому В–клеток–предшественников, В–клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому краевой зоны селезенки, плазмоклеточную миелому, плазмоцитому, медиастинальную (тимическую) B–крупноклеточную лимфому, внутрисосудистую B–крупноклеточную лимфому, первичную эффузионную лимфому или лимфогранулематоз. В некоторых случаях гематологический тип рака представляет собой рецидивирующий или трудно поддающийся лечению гематологический тип рака. В некоторых случаях гематологический тип рака представляет собой метастазировавший гематологический тип рака.

[00234] Согласно некоторым вариантам реализации онколитический вирус является сконструированным для обеспечения высокого уровня экспрессии привлекающей молекулы и/или терапевтического полипептида до гибели инфицированной вирусом клетки, например, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часов после инфекции или в течение 2, 3, 4, 5 или 6 дней после инфекции. Экспрессию привлекающей молекулы и/или терапевтического полипептида можно определить посредством способов, известных в данной области техники, включая, среди прочих, вестернблоттинг, ELISA, иммунопреципитацию или электрофорез. Как правило, «высокий уровень экспрессии» применительно к терапевтической молекуле обозначает уровень экспрессии, который превышает базальный уровень экспрессии соответствующего полипептида в клетке, не инфицированной онколитическим вирусом.

Композиции и способы введения

[00235] Согласно некоторым вариантам реализации субъекту вводят терапевтически эффективное количество онколитического вируса или его композиций. Согласно настоящему описанию изобретения термин «фармацевтическая композиция» относится к композиции для введения индивидууму. Введение композиций, описанных в настоящем документе, может являться местным или системным и может осуществляться любыми путями, например, посредством внутривенного, подкожного, интраперитонеального, внутримышечного, наружного или внутрикожного введения. Согласно некоторым вариантам реализации композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят любыми способами, известными в данной области техники. Например, композиции, описанные в настоящем документе, можно вводить субъекту внутривенным, внутриопухолевым, внутрикожным, внутриартериальным, интраперитонеальным, внутриочаговым, внутричерепным, внутрисуставным способом, вводить в предстательную железу, внутриплевральным, внутритрахеальным, интраназальным, интравитреальным, интравагинальным, ректальным, наружным, внутриопухолевым, внутримышечным, интратекальным, подкожным, субконъюнктивальным, внутрипузырным, мукозальным, интраперикардиальным, внутрипуповинным, внутриглазным, пероральным, местным способом, посредством ингаляции, посредством инъекции, посредством инфузии, посредством непрерывной инфузии, посредством локализированной перфузии, через катетер, посредством проведения лаважа, в креме или в композиции липидов. Согласно конкретным вариантам реализации композицию вводят индивидууму посредством инфузии или инъекции. Согласно некоторым вариантам реализации введение является парентеральным, например, внутривенным. Согласно некоторым вариантам реализации онколитический вирус или композиции на его основе вводят в участок–мишень напрямую, например, посредством биолистической доставки во внутренний или внешний участок–мишень или через катетер в участок в артерии. Согласно конкретным вариантам реализации композиции, описанные в настоящем документе, вводят подкожным или внутривенным способом. Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы или их композиции, описанные в настоящем документе, вводят внутривенным или внутриартериальным способом.

[00236] Согласно предпочтительному варианту реализации композиции, описанные в настоящем документе, приготовлены в состав для конкретного способа введения, для парентерального, чрескожного, внутрипросветного, внутриартериального, интратекального, внутривенного введения или для прямой инъекции в раковую опухоль. Согласно некоторым вариантам реализации композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. «Фармацевтически или фармакологически приемлемый» обозначает в настоящем документе молекулярные соединения и композиции, которые не вызывают нежелательной, аллергической или другой неблагоприятной реакции при введении животному или человеку, в соответствующих случаях. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. «Фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, буферы, стабилизирующие составы, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие всасывание, и т.п. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны в данной области техники и включают фосфатно–буферные солевые растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы увлажняющих средств, стерильные растворы и т.д. Композиции, содержащие такие носители, приготовлены в состав хорошо известными общепринятыми способами. Согласно некоторым вариантам реализации в композиции дополнительно включены вспомогательные активные компоненты. Для введения человеку композиции, описанные в настоящем документе, соответствуют стандартам стерильности, пирогенности и общей безопасности и чистоты согласно требованиям Офиса биологических стандартов Управления по контролю над качеством продуктов питания и лекарственных средств США (Food and Drug Administration, FDA).

[00237] Согласно некоторым вариантам реализации композиции, описанные в настоящем документе, содержат носитель, такой как растворитель или дисперсионная среда, содержащий, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерол, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и растительные масла. Надлежащую текучесть поддерживают, например, посредством применения покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и посредством применения поверхностно–активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечить с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, известных в данной области техники. Во многих случаях предпочтительно добавлять изотонические средства, например, сахара или хлорид натрия. Согласно некоторым вариантам реализации пролонгированное всасывание инъецируемых композиций можно обеспечить посредством применения в композиции средств, которые замедляют всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.

[00238] Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, приготовлены в состав в композиции в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислоты (образованные со свободными аминогруппами белка), которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, хлористоводородная или фосфорная кислоты, либо с такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные свободными карбоксильными группами, также могут быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и из таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п.

[00239] Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии; составы, включая кунжутное масло, арахисовое масло или водный пропиленгликоль; и стерильные порошки для получения стерильных инъекционных растворов или дисперсий непосредственно перед введением. В некоторых случаях форма является стерильной и представляет собой жидкость. В некоторых случаях форма является стабильной в условиях изготовления и при определенных параметрах хранения (например, при хранении в холодильнике или замораживании) и защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Водные композиции согласно некоторым вариантам реализации в настоящем документе включают эффективное количество вируса, нуклеиновой кислоты, терапевтического белка, пептида, конструкции, стимулятора, ингибитора и т.п., растворенное или диспергированное в фармацевтически приемлемом носителе или водной среде. Также предусмотрены водные композиции векторов, экспрессирующих любое из вышеуказанных соединений.

[00240] Согласно определенным вариантам реализации биологический материал интенсивно диализуют для удаления нежелательных низкомолекулярных веществ и/или в соответствующих случаях лиофилизируют в желаемый сосуд для получения более готового состава. Согласно некоторым вариантам реализации активные соединения или конструкции приготовлены в состав для парентерального введения, например, приготовлены в состав для инъекций посредством внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутриочагового, интраназального или интраперитонеального способов. Используют любой способ, применяемый для вакцинации или бустер–иммунизации субъекта. Препарат водной композиции, который содержит активный компонент или ингредиент, известен специалисту в данной области техники в свете настоящего изобретения. Как правило, такие композиции приготовлены в качестве инъецируемых композиций, жидких растворов или суспензий; также готовят твердые формы, подходящие для применения при приготовлении растворов или суспензий при добавлении жидкости перед инъекцией; и препараты также являются эмульгированными.

[00241] В некоторых случаях онколитический вирус диспергирован в фармацевтически приемлемом составе для инъекций. Согласно некоторым вариантам реализации стерильные инъекционные растворы приготовлены посредством введения активных соединений или конструкций в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним из компонентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием.

[00242] После приготовления в состав композиции, описанные в настоящем документе, вводят способом, совместимым с заболеванием, лечение которого проводят, и в дозированной лекарственной форме и в таким количестве, которое является терапевтически эффективным. Составы с легкостью вводят во множестве лекарственных форм, таких как тип инъекционных растворов, описанный выше, но также в виде капсул с замедленным высвобождением или микрочастиц и микросфер и т.п.

[00243] Для парентерального введения в водном растворе, например, раствор при необходимости подходящим способом забуферивают, и жидкий разбавитель сначала делают изотоническим с помощью достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Данные конкретные водные растворы являются в особенности подходящими для внутривенного, внутриопухолевого, внутримышечного, подкожного и интраперитонеального введения. В этой связи применяемая стерильная водная среда известна специалисту в данной области техники в свете настоящего изобретения. Например, одну дозу растворяют в 1 мл изотонического раствора NaCl и добавляют к 1000 мл гиподермолизисной жидкости или инъецируют в предложенный участок инфузии.

[00244] Помимо соединений, приготовленных в состав для парентерального введения, такого как внутривенная, внутриопухолевая, внутрикожная или внутримышечная инъекция, другие фармацевтически приемлемые формы включают, например, таблетки или другие твердые формы для перорального введения; составы на основе липосом; капсулы с пролонгированным высвобождением; разлагаемые биологическим способом, и любые другие из применяемых на сегодняшний день.

[00245] Согласно некоторым вариантам реализации вирусы инкапсулируют, чтобы ингибировать иммунное распознавание, и помещают в участок опухоли.

[00246] В некоторых случаях препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевой раствор и забуференные среды. Парентеральные наполнители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Рингера или нелетучие масла. Внутривенные наполнители включают жидкие и питательные наполнители, электролитные наполнители (такие как таковые на основе декстрозы Рингера) и т.п. Также присутствуют консерванты и другие добавки, такие как, например, антимикробные вещества, антиоксиданты, хелатирующие средства, инертные газы и т.п. Кроме того, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать белковые носители, такие как, например, сывороточный альбумин или иммуноглобулин, предпочтительно, полученные от человека. Предполагается, что фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать, помимо белковых конструкций биспецифичного одноцепочечного антитела или молекул нуклеиновой кислоты либо векторов, кодирующих данные конструкции (описанных в настоящем изобретении), дополнительные биологически активные средства в зависимости от предполагаемого применения фармацевтической композиции.

[00247] Согласно некоторым вариантам реализации инфильтрующие опухоль вирус–продуцирующие клетки, которые непрерывно высвобождают векторы, приготовлены в состав для непосредственной имплантации в опухоль с целью повышения онколизиса вирусом и эффективности переноса терапевтических генов.

[00248] Составы для интраназального применения известны в данной области техники и описаны, например, в патентах США №№ 4,476,116; 5,116,817; и 6,391,452. Составы, которые приготовлены согласно данным и другим методикам, хорошо известным в данной области техники, приготовлены в виде растворов в солевом растворе, с применением бензилового спирта или других подходящих консервантов, фторуглеродов и/или других солюбилизирующих или диспергирующих средств, известных в данной области техники. См., например, руководство Ansel, H. C. et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Sixth Ed. (1995). Предпочтительно, данные композиции и составы приготовлены с подходящими нетоксичными фармацевтически приемлемыми компонентами. Данные компоненты известны специалистам по приготовлению лекарственных форм для назального применения, и некоторые из них можно найти в руководстве Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, 2005, стандартном источнике в данной области техники. Выбор подходящих носителей во многом зависит от точной природы желаемой лекарственной формы для назального применения, например, растворы, суспензии, мази или гели. Лекарственные формы для назального применения обычно содержат большие количества воды, помимо активного компонента. Также присутствуют незначительные количества других компонентов, таких как регуляторы pH, эмульгаторы или диспергирующие средства, консерванты, поверхностно–активные вещества, желатинирующие средства или забуферивающие и другие стабилизирующие и солюбилизирующие средства. Лекарственная форма для назального применения является изотонической с секретом носа.

[00249] Для введения посредством ингаляции, описанного в настоящем документе, находится в форме аэрозоля, водяной пыли или порошка. Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, удобно доставляют из находящихся под давлением упаковок или распылителя с применением подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае находящегося под давлением аэрозоля единица дозы может быть определена посредством обеспечения клапана для доставки отмеренного количества. Для применения в ингаляторе или инсуффляторе могут быть приготовлены в состав капсулы и картриджи, такие как, исключительно в качестве примера, из желатина, содержащие порошкообразную смесь соединения, описанного в настоящем документе, и подходящей порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.

Терапевтически эффективные количества и терапевтические режимы

[00250] Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы и их композиции, описанные в настоящем документе, вводят субъекту в терапевтически эффективном количестве. Терапевтически эффективное количество зависит от субъекта, лечение которого проводят, состояния (например, общего состояния здоровья) субъекта, желаемой защиты, заболевания, лечение которого проводят, пути введения и/или природы вируса. Согласно некоторым вариантам реализации лицо, ответственное за введение (например, лечащий врач), определит соответствующую дозу для индивидуума. Как хорошо известно в области медицины, дозы для любого пациента зависят от множества факторов, включая размер пациента, массу тела, площадь поверхности тела, возраст, пол и общее состояние здоровья, конкретное соединение, введение которого проводят, конкретное заболевание, лечение которого проводят, сроки и способ введения и другие лекарственные препараты, которые вводят одновременно. Вследствие этого ожидают, что в случае каждого индивидуального пациента, даже если вирусы вводят популяции в целом, проводят наблюдение над каждым пациентом в отношении надлежащей дозы для индивидуума, и такая практика наблюдения над пациентом является общепринятой в данной области техники.

[00251] Согласно некоторым вариантам реализации терапевтически эффективное количество онколитического вируса, описанного в настоящем документе, вводят в одной дозе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения псевдотипированные онколитические вирусы или их композиции вводят субъекту в дозе, которая варьирует от приблизительно 1×10⁺⁵ БОЕ (бляшкообразующих единиц) до приблизительно 1×10⁺¹⁵ БОЕ, от приблизительно 1×10⁺⁸ БОЕ до приблизительно 1×10⁺¹⁵ БОЕ, от приблизительно 1×10⁺¹⁰ БОЕ до приблизительно 1×10⁺¹⁵ БОЕ или от приблизительно 1×10⁺⁸ БОЕ до приблизительно 1×10⁺¹² БОЕ. Например, согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы или их композиции вводят субъекту в дозе приблизительно 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴ или 10¹⁵ БОЕ вируса. Согласно некоторым вариантам реализации доза зависит от возраста субъекта, которому вводят композицию. Например, может требоваться более низкая доза, если субъект является подростком, и может требоваться более высокая доза, если субъект представляет собой взрослого человека. Согласно определенным вариантам реализации, например, субъект–подросток получает приблизительно 1×10⁺⁸ БОЕ и приблизительно 1×10⁺¹⁰ БОЕ, тогда как субъект–взрослый человек получает дозу от приблизительно 1×10⁺¹⁰ БОЕ до приблизительно 1×10⁺¹² БОЕ. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтически эффективное количество онколитического вируса, описанного в настоящем документе, вводят в течение курса двух или более доз. Согласно некоторым вариантам реализации две или более дозы вводят одновременно (например, в один и тот же день или в течение короткого периода времени) или через соответствующие промежутки времени, например, в виде двух, трех, четырех или более суб–доз в день.

[00252] Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы или их композиции, описанные в настоящем документе, вводят субъекту один раз. Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы или их композиции, описанные в настоящем документе, вводят субъекту более одного раза. Например, композицию, раскрытую в настоящем документе, можно вводить несколько раз, включая 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более раз. Согласно некоторым вариантам реализации композицию, раскрытую в настоящем документе, можно вводить субъекту ежедневно или еженедельно в течение периода времени либо ежемесячно, дважды в год или ежегодно в зависимости от потребности или подверженности воздействию патогенного организма или состояния у субъекта (например, рака). Согласно конкретным вариантам реализации онколитические вирусы и их композиции приготовлены в состав таким способом, и их вводят в таком количестве и/или с такой частотой, что они сохраняются субъектом в течение продолжительных периодов времени.

[00253] Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы или их композиции вводят для терапевтических вариантов применения или вводят в качестве поддерживающей терапии, такой как, например, для пациента в состоянии ремиссии. Согласно некоторым вариантам реализации псевдотипированные онколитические вирусы или их композиции вводят один раз в месяц, один раз в 2 месяца, один раз в 6 месяцев, один раз в год, два раза в год, три раза в год, один раз в два года, один раз в три года или один раз в пять лет.

[00254] Согласно некоторым вариантам реализации, в которых состояние пациента улучшается, псевдотипированные онколитические вирусы или их композиции можно вводить постоянно по усмотрению врача. Согласно некоторым вариантам реализации дозу композиции временно снижают и/или введение композиции временно приостанавливают в течение определенного периода времени (т.е. «лекарственных каникул»). Согласно некоторым вариантам реализации продолжительность лекарственных каникул варьирует от 2 дней до 1 года, включая исключительно в качестве примера 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 15 дней, 20 дней, 28 дней, 35 дней, 50 дней, 70 дней, 100 дней, 120 дней, 150 дней, 180 дней, 200 дней, 250 дней, 280 дней, 300 дней, 320 дней, 350 дней или 365 дней. Снижение дозы в течение лекарственных каникул составляет от 10% до 100%, включая исключительно в качестве примера 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.

[00255] Согласно некоторым вариантам реализации после того, как произошло улучшение состояния пациента, при необходимости можно вводить поддерживающую дозу. Согласно некоторым вариантам реализации доза и/или частота введения композиции является сниженной в зависимости от симптомов до уровня, на котором поддерживается улучшенное заболевание, нарушение или состояние. Согласно некоторым вариантам реализации при любом повторном появлении симптомов пациентам может потребоваться интермиттирующая терапия на долгосрочной основе.

[00256] Согласно некоторым вариантам реализации токсичность и терапевтическую эффективность таких терапевтических режимов определяют посредством стандартных фармацевтических процедур на культурах клеток или экспериментальных животных, включая, без ограничения, определение LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной у 50% популяции). Соотношение дозы между токсичными и терапевтическими эффектами представляет собой терапевтический индекс и выражается в виде соотношения между LD₅₀ и ED₅₀. Соединения, демонстрирующие высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. Данные, полученные в анализах на культуре клеток и исследованиях на животных, применяют при разработке диапазона доз для применения у человека. Доза таких соединений, предпочтительно, лежит в пределах диапазона циркулирующих концентраций, которые включают ED₅₀ с минимальной токсичностью. Доза варьирует в пределах данного диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы и применяемого пути введения.

[00257] В некоторых случаях уровни экспрессии опухолевого антигена определяют для оценки прогресса лечения пациента, для распределения пациента в группу и/или для модулирования терапевтического режима. В некоторых случаях оценка уровней экспрессии антигена включает применение иммуногистохимии (ИГХ) (включая полуколичественную или количественную ИГХ) или других анализов на основе антител (вестернблоттинга, флуоресцентного иммуноанализа (ФИА), флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), радиоиммуноанализа (РИА), радиоиммунопреципитации (РИП), твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), иммуноанализа, иммунорадиометрического анализа, иммунофлуоресцентного анализа, хемилюминесцентного анализа, биолюминесцентного анализа, гель–электрофореза), или опосредованную оценку посредством количественного определения транскриптов данных генов (например, методом гибридизации in situ, методом с защитой от действия нуклеаз, нозернблоттинга, полимеразой цепной реакции (ПЦР), включая ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ–ПЦР)). В некоторых случаях клетки, например, лимфоциты, анализируют с применением технологии FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, сортировки флуоресцентно активированных клеток), или залитые парафином срезы опухоли анализируют с применением антител.

[00258] В некоторых случаях применяют антитела, чтобы охарактеризовать содержание белка клеток–мишеней посредством методик, таких как иммуногистохимическое исследование, ELISA и вестернблоттинг. В некоторых случаях данный подход позволяет проводить скрининг, например, в отношении наличия или отсутствия субъекта, который, вероятно, будет благоприятно отвечать на терапию онколитическим вирусом и/или для которого требуется совместное введение иммуностимулирующего средства с онколитическим вирусом.

[00259] Согласно некоторым вариантам реализации иммуногистохимическое исследование проводят на образце ткани из биопсии. В некоторых случаях образец исследуют в свежем или замороженном виде. В некоторых случаях антитела против антигенов, присутствующих в клетках, добавляют к образцу на стекле, и антитела связываются там, где присутствуют антигены. Согласно некоторым вариантам реализации избыток антитела затем смывают. В некоторых случаях антитела, которые остаются связанными с клеткой, дополнительно метят вторичным антителом для визуализации под микроскопом.

[00260] Согласно некоторым вариантам реализации исследуемые образцы получены от субъекта, такие как, например, из ткани (например, биопсии опухоли), спинномозговой жидкости (СМЖ), лимфы, крови, плазмы, сыворотки, мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), лимфатической жидкости, лимфоцитов, синовиальной жидкости и мочи. Согласно конкретным вариантам реализации исследуемый образец получен из СМЖ или ткани опухоли. Согласно другим конкретным вариантам реализации исследуемый образец получен из ткани опухоли, и, например, в образце определяют относительное количество CD4⁺ и/или CD8⁺ клеток и/или в образце измеряют уровень одного или более цитокинов Th1 и/или Th2, например, посредством иммунофлуоресцентного окрашивания фиксированных и пермеабилизированных клеток из образца антителами против цитокинов Thl и/или Th2. Согласно другим конкретным вариантам реализации исследуемый образец получен из крови и, например, уровень одного или более цитокинов Thl и/или Th2 в образце измеряют методом ELISA.

Комбинированная терапия

[00261] Согласно некоторым вариантам реализации вирусы, конструкции экспрессии, молекулы нуклеиновой кислоты и/или векторы, описанные в настоящем документе, вводят в комбинации с другим терапевтическим средством. Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы и дополнительное терапевтическое средство приготовлены в состав в одной и той же композиции. Согласно таким вариантам реализации композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. Согласно некоторым вариантам реализации онколитические вирусы и дополнительное терапевтическое средство приготовлены в состав в отдельных композициях (например, в двух или более композициях, подходящих для введения пациенту или субъекту). Настоящее изобретение также охватывает протоколы совместного введения с другими вариантами противораковой терапии, например, с конструкциями биспецифичных антител, нацеленными токсинами или другими соединениями, включая таковые, которые действуют посредством иммунных клеток, включая T–клеточную терапию. Клинический режим для совместного введения композиции или композиций согласно настоящему изобретению включает совместное введение одновременно, перед и/или после введения другого компонента. Конкретные варианты комбинированной терапии включают химиотерапию, лучевую терапию, хирургическое вмешательство, гормональную терапию и/или другие типы иммунотерапии. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтически эффективное количество псевдотипированного онколитического вируса вводят субъекту, который нуждается в таком введении, в комбинации с дополнительным терапевтическим средством. В некоторых случаях дополнительное терапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство, стероид, иммунотерапевтическое средство, таргетную терапию или комбинацию указанных средств.

[00262] Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтические композиции вводят в сочетании с адъювантной терапией. Например, активирующую адъювантную терапию вводят перед, одновременно с или после одного или более введений (например, внутриопухолевой инъекции псевдотипированного вируса). Например, адъювантная терапия включает модулирование лигандов Toll–подобного рецептора (Toll–like receptor, TLR), такое как активацию TLR9 молекулами ДНК, содержащими последовательности CpG, или активацию TLR9 (например, РНК–лигандами). Другие варианты адъювантной терапии включают антитела–агонисты или другие полипептиды–агонисты (например, активацию CD40 или GITR под действием лиганда CD40 (CD40L) или лиганда GITR (GITRL), соответственно). Также предложены циклические динуклеотиды (например, ц–ди–ГМФ), которые модулируют STING. Другие активирующие адъюванты включают интерлейкины, такие как ИЛ–33.

[00263] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство включает средство, которое выбрано из: бендамустина, бортезомиба, леналидомида, иделалисиба (GS–1101), вориностата, эверолимуса, панобиностата, темсиролимуса, ромидепсина, вориностата, флударабина, циклофосфамида, митоксантрона, пентостатина, преднизона, этопзида, прокарбазина и талидомида.

[00264] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство представляет собой многокомпонентный терапевтический режим. Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство включает режим HyperCVAD (циклофосфамид, винкристин, доксорубицин, дексаметазон, чередующиеся с метотрексатом и цитарабином). Согласно некоторым вариантам реализации режим HyperCVAD вводят в комбинации с ритуксимабом.

[00265] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство включает режим R–CHOP (ритуксимаб, циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон).

[00266] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство включает режим FCR (FCR (флударабин, циклофосфамид, ритуксимаб).

[00267] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство включает режим FCMR (флударабин, циклофосфамид, митоксантрон, ритуксимаб).

[00268] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство включает режим FMR (флударабин, митоксантрон, ритуксимаб).

[00269] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство включает режим PCR (пентостатин, циклофосфамид, ритуксимаб).

[00270] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство включает режим PEPC (преднизон, этопозид, прокарбазин, циклофосфамид).

[00271] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство включает радиоиммунотерапию⁹⁰Y–ибритумомабом тиуксетаном или¹³¹I–тозитумомабом.

[00272] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство представляет собой трансплантат аутологичной стволовой клетки.

[00273] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство выбрано из группы, включающей: азотистые иприты, такие как, например, бендамустин, хлорамбуцил, хлорметин, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан, преднимустин, трофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, манносульфан, треосульфан; этиленимины, такие как карбоквон, тиотепа, триазиквон; производные нитрозомочевины, такие как кармустин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, семустин, стрептозоцин; эпоксиды, такие как, например, этоглуцид; другие алкилирующие средства, такие как, например, дакарбазин, митобронитол, пипоброман, темозоломид; аналоги фолиевой кислоты, такие как, например, метотрексат, перметрексед, пралатрексат, ралтитрексид; аналоги пурина, такие как, например, кладрибин, клофарабин, флударабин, меркаптопурин, неларабин, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как, например, азацитидин, капецитабин, кармофур, цитарабин, децитабин, фторурацил, гемцитабин, тегафур; алкалоиды барвинка, такие как, например, винбластин, винкристин, виндезин, винфлунин, винорелбин; производные подофиллотоксина, такие как, например, этопозид, тенипозид; производные колхицина, такие как, например, демеколцин; таксаны, такие как, например, доцетаксел, паклитаксел, паклитаксел полиглумекс; другие растительные алкалоиды и природные продукты, такие как, например, трабектедин; актиномицины, такие как, например, дактиномицин; антрациклины, такие как, например, акларубицин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон, пирарубицин, валрубицин, зорубицин; другие цитотоксические антибиотики, такие как, например, блеомицин, иксабепилон, митомицин, пликамицин; соединения платины, такие как, например, карбоплатин, цисплатин, оксалиплатин, сатраплатин; метилгидразины, такие как, например, прокарбазин; сенсибилизирующие средства, такие как, например, аминолевулиновая кислота, эфапроксирал, метиламинолевулинат, порфимер натрия, темопорфин; ингибиторы протеинкиназ, такие как, например, дазатиниб, эрлотиниб, эверолимус, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, нилотиниб, пазонаниб, сорафениб, сунитиниб, темсиролимус; другие противоопухолевые средства, такие как, например, алитретиноин, альтретамин, амзарцин, анагрелид, триоксид мышьяка, аспарагиназа, бексаротен, бортезомиб, целекоксиб, денилейкин дифтитокс, эстрамустин, гидроксикарбамид, иринотекан, лонидамин, мазопрокол, милтефозин, митогуазон, митотан, облимерзен, пэгаспаргаза, пентостатин, ромидепсин, ситимаген цераденовек, тиазофурин, топотекан, третиноин, вориностат; эстрогены, такие как, например, диэтилстилбестрол, этинилэстрадиол, фосфэстрол, полиэстрадиол фосфат; прогестагены, такие как, например, гестонорон, медроксипрогестерон, мегестрол; аналоги гонадотропин–высвобождающего гормона, такие как, например, бусерелин, гозерелин, лейпрорелин, трипторелин; антиэстрогены, такие как, например, фулвестрант, тамоксифен, торемифен; антиандрогены, такие как, например, бикалутамид, флутамид, нилутамид, ингибиторы ферментов, аминоглутетимид, анастрозол, эксеместан, форместан, летрозол, ворозол; другие антагонисты гормонов, такие как, например, абареликс, дегареликс; иммуностимулирующие средства, такие как, например гистамина дигидрохлорид, мифамуртид, пидотимод, плериксафор, роквинимекс, тимопентин; иммуносупрессирующие средства, такие как, например, эверолимус, гусперимус, лефлуномид, микофеноловая кислота, сиролимус; ингибиторы кальциневрина, такие как, например, циклоспорин, такролимус; другие иммуносупрессирующие средства, такие как, например, азатиоприн, леналидомид, метотрексат, талидомид; и радиофармацевтические средства, такие как, например, иобенгуан.

[00274] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство выбрано из: интерферонов, интерлейкинов, факторов некроза опухоли, факторов роста или т.п.

[00275] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство выбрано из: анцестима, филграстима, ленограстима, молграмостима, пэгфилграстима, сарграмостима; интерферонов, таких как, например, природный ИФНα, ИФН α–2a, ИФН α–2b, ИФН альфакон–1, ИФН α–n1, природный ИФН β, ИФН β–1a, ИФН β–1b, ИФН γ, пэгинтерферон α–2a, пэгинтерферон α–2b; интерлейкинов, таких как, например, альдеслейкин, опрелвекин; других иммуностимулирующих средств, таких как, например, вакцина БЦЖ, глатирамера ацетат, гистамина дигидрохлорид, иммуноцианин, лентинан, вакцина против меланомы, мифамуртид, пэгадемаза, пидотимод, плериксафор, поли–I:C, поли–ICLC, роквинимекс, тазонермин, тимопентин; иммуносупрессирующих средств, таких как, например, абатацепт, абетимус, алефацепт, антилимфоцитарный иммуноглобулин (лошадей), антитимоцитарный иммуноглобулин (кролика), экулизумаб, эфализумаб, эверолимус, гусперимус, лефлуномид, муромаб–CD3, микофеноловая кислота, натализумаб, сиролимус; ингибиторов ФНОα, таких как, например, адалимумаб, афелимомаб, цертолизумаба пегол, этанерцепт, голимумаб, инфликсимаб; ингибиторов интерлейкинов, таких как, например, анакинра, базиликсимаб, канакинумаб, даклизумаб, меполизумаб, рилонацепт, тоцилизумаб, устекинумаб; ингибиторов кальциневрина, таких как, например, циклоспорин, такролимус; других иммуносупрессирующих средств, таких как, например, азатиоприн, леналидомид, метотрексат, талидомид.

[00276] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство выбрано из: адалимумаба, алемтузумаба, базиликсимаба, бевацизумаба, цетуксимаба, цертолизумаба пегола, даклизумаба, экулизумаба, эфализумаба, гемтузумаба, ибритумомаба тиуксетана, инфликсимаба, муромонаба–CD3, натализумаба, панитумомаба, ранибизумаба, ритуксимаба, тозитумомаба, трастузумаба или т.п. или комбинации указанных средств.

[00277] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство выбрано из: моноклональных антител, таких как, например, алемтузумаб, бевацизумаб, катумаксомаб, цетуксимаб, эдреколомаб, гемтузумаб, панитумомаб, ритуксимаб, трастузумаб; иммуносупрессирующих средств, экулизумаба, эфализумаба, муромаба–CD3, натализумаба; ингибиторов ФНО альфа, таких как, например, адалимумаб, афелимомаб, цертолизумаба пегол, голимумаб, инфликсимаб; ингибиторов интерлейкинов, базиликсимаба, канакинумаба, даклизумаба, меполизумаба, тоцилизумаба, устекинумаба; радиофармацевтических средств, ибритумомаба тиуксетана, тозитумомаба; дополнительных моноклональных антител, таких как, например, абаговомаб, адекатумумаб, алемтузумаб, моноклональное антитело Xmab2513 против CD30, моноклональное антитело MetMab против MET, аполизумаб, апомаб, аркитумомаб, базиликсимаб, биспецифичное антитело 2B1, блинатумомаб, брентуксимаб ведотин, капромаб пендитид, циксутумумаб, клаудиксимаб, конатумумаб, дацетузумаб, деносумаб, экулизумаб, эпратузумаб, эпратузумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, фигитумумаб, фрезолимумаб, галиксимаб, ганитумаб, гемтузумаб озогамицин, глембатумумаб, ибритумомаб, инотузумаб озогамицин, ипилимумаб, лексатумумаб, линтузумаб, линтузумаб, лукатумумаб, мапатумумаб, матузумаб, милатузумаб, моноклональное антитело CC49, нецитумумаб, нимотузумаб, ореговомаб, пертузумаб, рамакуримаб, ранибизумаб, сиплизумаб, сонепцизумаб, танезумаб, тозитумомаб, трастузумаб, тремелимумаб, тукотузумаб целмолейкин, велтузумаб, визилизумаб, волоциксимаб, залутумумаб.

[00278] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство выбрано из: средств, влияющих на микроокружение опухоли, таких как клеточная сеть передачи сигналов пути передачи сигналов (например, фосфатидилинозитол 3–киназы (PI3K)), передающая сигнал от B–клеточного рецептора и рецептора IgE). Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство представляет собой ингибитор передачи сигналов PI3K или ингибитор syc–киназы. Согласно одному варианту реализации ингибитор syk представляет собой R788. Согласно другому варианту реализации представляет собой ингибитор PKCγ, такой как, исключительно в качестве примера, энзастаурин.

[00279] Примеры средств, влияющих на микроокружение опухоли, включают ингибитор передачи сигналов PI3K, ингибитор syc–киназы, ингибиторы протеинкиназы, такие как, например, дазатиниб, эрлотиниб, эверолимус, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, нилотиниб, пазонаниб, сорафениб, сунитиниб, темсиролимус; другие ингибиторы ангиогенеза, такие как, например, GT–111, JI–101, R1530; другие ингибиторы киназ, такие как, например, AC220, AC480, ACE–041, AMG 900, AP24534, Arry–614, AT7519, AT9283, AV–951, акситиниб, AZD1152, AZD7762, AZD8055, AZD8931, бафетиниб, BAY 73–4506, BGJ398, BGT226, BI 811283, BI6727, BIBF 1120, BIBW 2992, BMS–690154, BMS–777607, BMS–863233, BSK–461364, CAL–101, CEP–11981, CYC116, DCC–2036, динациклиб, довитиниб лактат, E7050, EMD 1214063, ENMD–2076, фостаматиниб двухнатриевый, GSK2256098, GSK690693, INCB18424, INNO–406, JNJ–26483327, JX–594, KX2–391, линифаниб, LY2603618, MGCD265, MK–0457, MK1496, MLN8054, MLN8237, MP470, NMS–1116354, NMS–1286937, ON 01919.Na, OSI–027, OSI–930, ингибитор Btk, PF–00562271, PF–02341066, PF–03814735, PF–04217903, PF–04554878, PF–04691502, PF–3758309, PHA–739358, PLC3397, прогенипоэтин, R547, R763, рамуцирумаб, регорафениб, RO5185426, SAR103168, SCH 727965, SGI–1176, SGX523, SNS–314, TAK–593, TAK–901, TKI258, TLN–232, TTP607, XL147, XL228, XL281RO5126766, XL418, XL765.

[00280] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство выбрано из: ингибиторов передачи сигналов митоген–активируемой протеинкиназы, например, U0126, PD98059, PD184352, PD0325901, ARRY–142886, SB239063, SP600125, BAY 43–9006, вортманнина или LY294002; ингибиторов Syk; ингибиторов mTOR; и антител (например, ритуксана).

[00281] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство выбрано из группы, включающей: 20–epi–1, 25 дигидроксивитамин D3; 5–этинилурацил; абиратерон; акларубицин; ацилфулвен; адеципенол; адозелезин; альдеслейкин; антагонисты ALL–TK; алтретамин; амбамустин; амидокс; амифостин; аминолевулиновую кислоту; амрубицин; амсакрин; анагрелид; анастрозол; андрографолид; ингибиторы ангиогенеза; антагонист D; антагонист G; антареликс; антидорсализирующий морфогенетический белок–1; антиандроген, средство против карциномы предстательной железы; антиэстроген; антинеопластон; антисмысловые олигонуклеотиды; афидиколина глицинат; модуляторы генов апоптоза; регуляторы апоптоза; апуриновую кислоту; ara–CDP–DL–PTBA; аргининдезаминазу; асулакрин; атаместан; атримустин; аксинастатин 1; аксинастатин 2; аксинастатин 3; азастерон; азатоксин; азатирозин; производные баккатина III; баланол; батимастат; антагонисты BCR/ABL; бензохлорины; бензоилстауроспорин; бета–лактамные производные; бета–алетин; бетакламицин B; бетулиновую кислоту; ингибитор bФРФ; бикалутамид; бисантрен; бисазиридинилспермин; биснафид; бистратен A; бизелезин; брефлат; бропиримин; будотитан; бутионин сульфоксимин; кальципотриол; кальфостин C; производные камптотецина; ИЛ–2 канарипокс, капецитабин; карбоксамид–амино–триазол; карбоксиамидотриазол; CaRest M3; CARN 700; полученный из хряща ингибитор; карзелезин; ингибиторы казеинкиназы (ICOS); кастаноспермин; цекропин B; цетрореликс; хлорины; хлорхиноксалина сульфонамид; цикапрост; цис–порфирин; кладрибин; аналоги кломифена; клотримазол; коллисмицин A; коллисмицин B; комбретастатин A4; аналог комбретастатина; конагенин; крамбесцидин 816; криснатол; криптофицин 8; производные криптофицина A; курацин A; циклопентантрахиноны; циклоплатам; ципемицин; цитарабина оксфосфат; цитолитический фактор; цитостатин; дакликсимаб; децитабин; дегидродидемнин B; деслорелин; дексаметазон; дексифосфамид; дексразоксан; дексверапамил; диазиквон; дидемнин B; дидокс; диэтилнормспермин; дигидро–5–азацитидин; 9–диоксамицин; дифенилспиромустин; доказанол; долазетрон; доксифлуридин; дролоксифен; дронабинол; дуокармицин SA; эбселен; эномустин; эдельфозин; эдреколомаб; эфлорнитин; элемен; эмитефур; эпирубицин; эпристерид; аналог эстрамустина; агонисты эстрогена; антагонисты эстрогена; этанидозол; этопозида фосфат; эксеместан; фадрозол; фазарабин; фенретинид; филграстим; финастерид; флавопиридол; флезеластин; флуастерон; флударабин; флуородаунорубицина гидрохлорид; форфенимекс; форместан; фостриецин; фотемустин; гадолиний тексафирин; нитрат галлия; галоцитабин; ганиреликс; ингибиторы желатиназы; гемцитабин; ингибиторы глутатиона; гепсульфам; херегулин; гексаметилен бисацетамид; гиперицин; ибандроновую кислоту; идарубицин; идоксифен; идрамантон; илмофозин; иломастат; имидазоакридоны; имиквимод; иммуностимулирующие пептиды; ингибитор рецептора инсулиноподобного фактора роста–1; агонисты интерферона; интерфероны; интерлейкины; иобенгуан; иододоксорубицин; ипомеанол, 4–; ироплакт; ирсогладин; изобенгазол; изогомохаликондрин B; итасетрон; ясплакинолид; кагалалид F; ламелларин–N триацетат; ланреотид, леинамицин; ленограстим; лентинана сульфат; лептолстатин; лектрозол; ингибирующий лейкоз фактор; лейкоцитарный альфа–интерферон; леупролид+эстроген+прогестерон; леупрорелин; левамизол; лиарозол; линейный аналог полиамина; липофильный пептид с дисахаридом; липофильные соединения платины; лиссоклинамид 7; лобаплатин; ломбрицин; лометрексол; лонидамин; лозоксантрон; ловастатин, локсорибин; луртотекан; тексафирин лютеция; лизофиллин; литические пептиды; майтанзин; манностатин A; маримастат; мазопрокол; маспин; ингибиторы матрилизина; ингибиторы матриксной металлопротеиназы; меногарил; мербарон; метерелин; метиониназу; метоклопрамид; ингибитор MIF; мифепристон; милтефозин; миримостим; двухцепочечные РНК с неправильным спариванием; митогуазон; митолактол; аналоги митомицина; митонафид; фактор роста фибробластов митотоксин – сапорин; митоксантрон; мофаротен; молграмостим; моноклональное антитело, хорионический гонадотропин человека; монофосфориллипид A+sk клеточной стенки микобактерий; мопидамол; ингибитор гена множественной лекарственной устойчивости; терапию на основе множественного опухолевого супрессора 1; средство против злокачественной опухоли на основе иприта; микапероксид B; экстракт клеточной стенки микобактерий; мириапорон; N–ацетилдиналин; N–замещенные бензамиды; нафарелин; нагрестип; налоксон+пентазоцин; напавин; нафтерпин; нартограстим; недаплатин; неморубицин; неридроновую кислоту; нейтральную эндопептидазу; нилутамид; низамицин; модуляторы оксида азота; нитроксидный антиоксидант; нитруллин; O6–бензилгуанин; октреотид; окиценон; олигонуклеотиды; онапристон; ондансетрон; ондансетрон; орацин; пероральный индуктор цитокинов; ормаплатин; осатерон; оксалиплатин; оксауномицин; палауамин; пальмитоилризоксин; памидроновую кислоту; панакситриол; паномифен; парабактин; пазеллиптин; пэгаспаргазу; пелдезин; пентосан полисульфат натрия; пентостатин; пентрозол; перфлуброн; перфосфамид; периллиловый спирт; феназиномицин; фенилацетат; ингибиторы фосфатазы; пицибанил; пилокарпина гидрохлорид; пирарубицин; пиритрексим; плацетин A; плацетин B; ингибитор активатора плазминоген; комплекс платины; соединения платины; комплекс платина–триамин; порфимер натрия; порфиромицин; преднизон; пропил бис–акридон; простагландин J2; ингибиторы протеасом; иммуномодулятор на основе белка A; ингибитор протеинкиназы C; ингибиторы протеинкиназы C, микроалгал; ингибиторы протеинтирозинфосфатазы; ингибиторы пуриннуклеозидфосфорилазы; пурпурины; пиразолоакридин; конъюгат пиридоксилированного гемоглобина и полиоксиэтилена; антагонисты raf; ралтитрексед; рамосетрон; ингибиторы фарнезилпротеинтрансферазы ras; ингибиторы ras; ингибитор ras–GAP; демителированный ретеллиптин; рений Re 186 этидронат; ризоксин; рибозимы; RII ретинамид; роглетимид; рохитукин; ромуртид; роквинимекс; рубигинон B1; рубоксил; сафингол; саинтопин; SarCNU; саркофитол A; сарграмостим; миметики Sdi 1; семустин; образующийся при старении ингибитор 1; смысловые олигонуклеотиды; ингибиторы передачи сигнала; модуляторы передачи сигнала; одноцепочечный антигенсвязывающий белок; сизофиран; собузоксан; борокаптат натрия; фенилацетат натрия; солверол; соматомедин–связывающий белок; сонермин; спарфозовую кислоту; спирамицин D; спиромустин; спленопентин; спонгистатин 1; скваламин; ингибитор стволовых клеток; ингибиторы деления стволовых клеток; стрипиамид; ингибиторы стромелизина; сульфинозин; антагонист суперактивного вазоактивного интестинального пептида; сурадисту; сурамин; сваинсонин; синтетические гликозаминогликаны; таллимустин; тамоксифена метиодид; тауромустин; тазаротен; текогалан натрия; тегафур; теллурапирилий; ингибиторы телогеразы; темопорфин; темозоломид; тенипозид; тетрахлордекаоксид; тетразомин; талибластин; тиокоралин; тромбопоэтин; миметик тромбопоэтина; тималфазин; агонист рецептора тимопоэтина; тимотринан; тиреостимулирующий гормон; этилэтиопурпурин олова; тирапазамин; титаноцена бихлорид; топсентин; торемифен; фактор тотипотентных стволовых клеток; ингибиторы трансляции; третиноин; триацетилуридин; трицирибин; триметрексат; трипторелин; трописетрон; туростерид; ингибиторы тирозинкиназы; тирфостины; ингибиторы UBC; убенимекс; происходящий из урогенитального синуса ингибиторный фактор; антагонисты рецептора урокиназы; вапреотид; вариолин B; систему вектора, терапию геном эритроцитов; веларесол; верамин; вердины; вертепорфин; винорелбин; винксалтин; витаксин; ворозол; занотерон; зениплатин; зиласкорб и зиностатина стималамер.

[00282] Согласно некоторым вариантам реализации дополнительное терапевтическое средство выбрано из: алкилирующих средств, антиметаболитов, природных продуктов или гормонов, например, азотистых ипритов (например, мехлоретамина, циклофосфамида, хлорамбуцила и т.д.), алкилсульфонатов (например, бусульфана), нитрозомочевины (например, кармустина, ломустина и т.д.) или триазенов (декарбазина и т.д.). Примеры антиметаболитов включают, без ограничения, аналог фолиевой кислоты (например, метотрексат) или аналоги пиримидина (например, цитарабин), аналоги пурина (например, меркаптопурин, тиогуанин, пентостатин).

[00283] Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтические композиции вводят в сочетании с адъювантной терапией. Например, активирующую адъювантную терапию вводят перед, одновременно с или после одного или более введений (например, внутриопухолевой инъекции псевдотипированного вируса). Например, адъювантная терапия включает модулирование лигандов Toll–подобного рецептора (TLR), такое как активацию TLR9 молекулами ДНК, содержащими последовательности CpG, или активацию TLR9 (например, РНК–лигандами). Другие варианты адъювантной терапии включают антитела–агонисты или другие полипептиды–агонисты (например, активацию CD40 или GITR под действием лиганда CD40 (CD40L) или лиганда GITR (GITRL), соответственно). Также предложены циклические динуклеотиды (например, ц–ди–ГМФ), которые модулируют STING. Другие активирующие адъюванты включают интерлейкины, такие как ИЛ–33. В некоторых случаях фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, вводят в сочетании с адъювантной терапией.

Наборы

[00284] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены наборы, содержащие один или более онколитических вирусов, описанных в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем документе, вектор, описанный в настоящем документе, и/или клетку–хозяин, описанную в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации наборы содержат фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе выше, саму по себе или в комбинации с дополнительными терапевтическими средствами, которые вводят индивидууму, нуждающемуся в таком введении.

[00285] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены наборы для применения векторов и вирус–продуцирующих клеток согласно настоящему изобретению в качестве лекарственных препаратов в терапевтических способах. В частности, векторы и вирус–продуцирующие клетки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применяют для терапии или лечения солидных опухолей у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтический эффект вызван онколитическими свойствами рекомбинантных векторов и вирусов, а также применением терапевтических генов.

[00286] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены наборы для применения со способами и композициями. Некоторые варианты реализации относятся к наборам, содержащим композиции вакцины для применения с целью снижения вероятности возникновения одной или более солидных опухолей или с целью лечения субъектов, страдающих от одной или более солидных опухолей. Другие варианты реализации относятся к наборам для получения и применения молекулярных конструкций, описанных в настоящем документе. В некоторых случаях наборы также содержат подходящий контейнер, например, пузырьки, пробирки, пробирки для мини– или микроцентрифугирования, пробирки для исследований, флаконы, бутыли, шприцы или другие емкости. Если предложен дополнительный компонент или средство, набор содержит один или более дополнительных контейнеров, в которые помещены данное средство или компонент. Наборы в настоящем документе также включают средства для содержания контейнера с конструкциями, композициями вакцины и любым другим реактивом плотно укупоренным для коммерческой продажи. Такие контейнеры включают пластиковые контейнеры для инъекций или изготовленные литьем с раздувом пластиковые контейнеры, в которых находятся желаемые флаконы. Для описанных композиций необязательно необходимы одно или более дополнительных средств, таких как другие противовирусные средства, противогрибковые или противобактериальные средства, например, для применения композиций в качестве вакцины.

[00287] Все публикации, патенты и заявки на патент, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент и заявка на патент была конкретно и индивидуальна указана как включенная посредством ссылки.

ПРИМЕРЫ

[00288] Примеры ниже дополнительно иллюстрируют описанные варианты реализации без ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1: Получение псевдотипированных ВВС–G

[00289] Следующий протокол был выбран для получения иллюстративных псевдотипированных ВВС–G посредством сочетания ВВС–гликопротеина (ВВС–GP) с белками gag и rev ВИЧ1.

[00290] Культура клеток и трансфекция: для трансфекции клеток 293Т смешивали и готовили ДНК следующих упаковывающих плазмид: pMDLg/pRRE, экспрессирующей GAG/POL ВИЧ–1; pRSV/REV, экспрессирующей REV ВИЧ–1; и pMD2.G 5 60 5,8 гликопротеин ВВС. К 500 мкл предварительно нагретой среды Optimem II добавляли смесь ДНК. Рабочий исходный раствор реактива для трансфекции полиэтиленимина (PEI) готовили в концентрации 1 мкг/мкл в 1–кратном ФБР (фосфатном буферном растворе), pH 4,5, и к смеси добавляли 88 мкл рабочего исходного раствора, поддерживая соотношение PEI:ДНК 4:1 об./масса. Смесь недолго встряхивали на вортексе и оставляли в течение 5–10 мин. при комнатной температуре для образования комплекса трансфекции PEI:ДНК. На чашку диметром 15 см суммарно высевали 2,5×106 клеток 293Т кратковременного пассивирования (менее P20) в 15 мл DMEM с добавлением 10% сыворотки и 1% Pen/Strep. За 2 часа до трансфекции среду для культивирования клеток отсасывали и заменяли на 15 мл свежей предварительно нагретой среды для роста (GM). Затем на каждую чашку диметром 15 см по каплям добавляли комплекс трансфекции, недолго вращали чашки для перемешивания и инкубировали в течение 8 часов при 10% CO₂, 35° C. Через 8 часов среду заменяли на 10 мл свежей среды для роста, содержащей 25 мМ HEPES и 10% сыворотки. Затем смесь инкубировали в течение 48 часов после трансфекции.

[00291] Сбор вируса: Среду из каждой чашки отбирали, объединяли и фильтровали через фильтр быстрого потока с низким связыванием с белком с диметром пор 0,22 мкм и хранили при температуре 4°C. В каждую чашку добавляли свежую среду для роста объемом 5 мл и инкубировали в течение ночи при температуре 4°C (60–72 часа после трансфекции). Вторую часть среды из каждой чашки собирали, как на предыдущем этапе, и объединяли с ранее собранной средой. Перенос плазмид удаляли посредством расщепления ДНКазой–I (исходный раствор 1 мг/мл). Раствор супернатанта вируса 1 мкг/мл с добавлением 1 мкл 1 M MgCl₂ инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. с последующей инкубацией в течение 2–4 часов при температуре 4°C. Отфильтрованные супернатанты можно использовать непосредственно с культивируемыми клетками или разделить на аликвоты и хранить при температуре –80°C. Супернатант вируса псевдотипированного ВВС–G можно необязательно концентрировать и очистить.

Пример 2: Конструкция псевдотипированного ВВС–G, экспрессирующего биспецифичное антитело – привлекающую молекулу CD28–CA125

[00292] Псевдотипированные ВВС–G получали, как описано в примере 1, и дополнительно обрабатывали для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей привлекающий полипептид, который содержал домен активации, содержащий молекулу против CD28, и домен распознавания антигена, содержащий молекулу против CA125, а также нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуномодуляторный пептид против PD1. Полученный в результате онколитический вирус представляет собой псевдотипированный онколитический вирус ВВС–G, кодирующий привлекающую молекулу CD28–CA125 и терапевтическую молекулу против PD1 (CD28–CA125–PD1 ВВС–G).

Пример 3: CD28–CA125–PD1 ВВС–G активирует Т–клетки человека и демонстрирует противоопухолевую активность

[00293] Т–клетки человека инфицировали псевдотипированным вирусом CD28–CA125–PD1 ВВС–G. Через 24–48 часов после вирусной инфекции среду для культивирования T–клеток собирали и анализировали в отношении присутствия провоспалительных цитокинов. Полученные результаты показали, что Т–клетки активируются CD28–CA125–PD1 ВВС–G, что подтверждается присутствием провоспалительных цитокинов, таких как ИФН–β и ИЛ–2, в супернатанте культуры Т–клеток человека, инфицированных CD28–CA125–PD1 ВВС–G.

[00294] Сверхэкспрессирующие EphA2 клетки рака желудка из линии клеток KATO3 инфицировали псевдотипированным вирусом CD28–CA125–PD1 ВВС–G или непсевдотипированным вирусом CD28–CA125–PD1 ВВС и оценивали пролиферацию клеток. Полученные результаты показали, что пролиферация клеток значительно снижена в клетках KATO3, инфицированных псевдотипированным CD28–CA125–PD1 ВВС–G, по сравнению с клетками KATO3, инфицированными непсевдотипированным вирусом CD28–CA125–PD1 ВВС.

Пример 4: Привлекающие молекулы CD19–CD3, SIRP1α–CD3 и PDL1–CD3–Fc специфично связываются с T–клетками посредством CD3

[00295] Изучали связывание двойных (CD19–CD3 и SIRP1α–CD3) и тройных (PDL1–CD3–Fc) привлекающих молекул с Т–клетками. Вкратце, 25000 Т–клеток стимулировали 200 Ед./мл ИЛ–2 в течение 12 дней. Через 12 дней T–клетки инкубировали с варьирующими концентрациями привлекающих молекул (500, 1000 или 2000 нг/мл для CD19–CD3 и SIRP1α–CD3; неразбавленный супернатант для PDL1–CD3–Fc) в течение 20 минут при комнатной температуре в трех повторах. Затем клетки промывали дважды с последующим окрашиванием антителом против 6XHis APC в концентрации 500 нг/мл в течение дополнительных 20 минут. Клетки промывали снова и обрабатывали пропидиум иодидом (PI), чтобы исключить из последующего анализа мертвые клетки. Окрашенные клетки анализировали методом проточной цитометрии на цитометре BD LSR Fortesa, и процент популяции клеток, положительной в отношении окрашивания, задавали как 2% от исключительно вторичного контроля.

[00296] Результаты для CD19–CD3 (ФИГ. 19A), SIRP1α–CD3 (ФИГ. 19B) и PDL1–CD3–Fc (ФИГ. 19C) демонстрируют, что CD3–связывающий фрагмент каждой из данных молекул функционально связывается с CD3–экспрессирующими Т–клетками 293F, о чем свидетельствует увеличение процента клеток, которые являются положительными в отношении привлекающих молекул, по сравнению с вторичным антителом самим по себе. В частности, дозозависимое увеличение % положительных клеток наблюдается для CD19–CD3 (ФИГ. 19A), тогда как конструкция SIRP1α–CD3 демонстрировала максимальное связывание во всех концентрациях. Использованное количество неразбавленного супернатанта PDL1–CD3–Fc приводило к связыванию конструкции с большинством Т–клеток (ФИГ. 19C).

[00297] Результаты данного эксперимента количественно представлены на ФИГ. 20. В частности, все из конструкций демонстрировали значительное увеличение % положительных Т–клеток по сравнению с образцами, в которые не была добавлена привлекающая молекула.

[00298] Дополнительные эксперименты продемонстрировали, что связывание CD19–CD3, SIRP1α–CD3 и PDL1–CD3–Fc было опосредовано взаимодействиями домена привлекающей молекулы, направленного против CD3, с CD3, экспрессированным Т–клетками. До воздействия на Т–клетки привлекающих молекул Т–клетки инкубировали с моноклональным антителом против CD3 (OKT3). Предварительная инкубация с OKT3 ингибировала связывание привлекающей молекулы CD19–CD3 и по существу снижала связывание привлекающей молекулы PDL1–CD3–Fc. Отсутствие ингибирования связывания привлекающей молекулы SIRP1α–CD3 в результате предварительной инкубации с OKT3 (ФИГ. 21C), вероятно, обусловлено неполным ингибированием CD3 под действием OKT3 в данных образцах.

Пример 5: Конструкции SIRP1α–CD3 специфично связываются с CD47

[00299] Проводили эксперименты для определения специфичности связывания конструкций привлекающей молекулы SIRP1α–CD3. Клетки Раджи предварительно инкубировали с привлекающими молекулами SIRP1α–CD3 в течение 20 мин. при к.т. Затем клетки промывали и инкубировали с флуоресцентно меченным моноклональным антителом против CD47 в течение 20 мин. при к.т., после чего клетки промывали и анализировали методом проточной цитометрии. Клетки Раджи, которые предварительно не инкубировали с привлекающей молекулой SIRP1α–CD3, продемонстрировали значительное связывание с моноклональным антителом против CD47 (ФИГ. 22, гистограмма контрольного IgG по сравнению с гистограммой против CD47). Предварительная инкубация клеток Раджи с привлекающей молекулой SIRP1α–CD3 блокировала связывание моноклонального антитела против CD47 (ФИГ. 22, гистограмма против CD47 по сравнению с гистограммой против CD47 +SIRP1α–CD3).

Пример 6: Связывание привлекающих молекул SIRP1α–CD3 и CD19–CD3 с клетками–мишенями

[00300] Проводили эксперименты для определения способности SIRP1α–CD3 и CD19–CD3 BiTE к связыванию с типами клеток–мишеней Раджи (CD19⁺CD47⁺, ФИГ. 23), U2OS (CD19^–CD47⁺, ФИГ. 24), GBM30–luc (CD19^–CD47⁺, ФИГ. 25) и U251 (CD19^–CD47⁺, ФИГ. 26). В случае каждого типа клетки–мишени клетки обрабатывали 500 или 1000 нг/мл (i) меченного His растворимого SIRP1α; (ii) SIRP1α–CD3 BiTE; или (iii) или CD19–CD3 BiTE. Затем клетки окрашивали флуоресцентно меченным антителом против His и анализировали методом проточной цитометрии.

[00301] Результаты связывания SIRP1α–CD3 и CD19–CD3 с CD19⁺CD47⁺ клетками Раджи представлены на ФИГ. 23. По сравнению с Ig отрицательного контроля (исключительно 2º) растворимый SIRP1α, SIRP1α–CD3 BiTE и CD19–CD3 BiTE были способны к связыванию с клетками Раджи, о чем свидетельствует сдвиг гистограмм привлекающих молекул вправо по сравнению с гистограммой контрольного IgG (ФИГ. 23A). Количественное определение данных связывания, демонстрирующее процент BiTE–положительных клеток, представлено на ФИГ. 23B.

[00302] Результаты связывания SIRP1α–CD3 и CD19–CD3 с клетками CD19^–CD47⁺ U2OS представлены на ФИГ. 24. По сравнению с Ig отрицательного контроля (исключительно 2º) растворимый SIRP1α, SIRP1α–CD3 BiTE были способны к связыванию с клетками U2OS во всех применявшихся концентрациях, о чем свидетельствует сдвиг гистограмм привлекающих молекул вправо по сравнению с гистограммой контрольного IgG (ФИГ. 24A). CD19–CD3 BiTE не был способен к связыванию с клетками U2OS, что и ожидали на основании отсутствия экспрессии CD19 клетками U2OS. Количественное определение полученных данных связывания, демонстрирующее процент BiTE–положительных клеток, представлено на ФИГ. 24B.

[00303] Результаты связывания SIRP1α–CD3 и CD19–CD3 с клетками CD19^–CD47⁺ GBM30–luc представлены на ФИГ. 25. По сравнению с Ig отрицательного контроля (исключительно 2º) SIRP1α–CD3 BiTE был способен к связыванию с клетками GBM30–luc во всех применявшихся концентрациях, о чем свидетельствует сдвиг гистограмм привлекающих молекул вправо по сравнению с гистограммой контрольного IgG (ФИГ. 25A). Напротив, CD19–CD3 BiTE не был способен к связыванию с клетками GBM30–luc, что и ожидали на основании отсутствия экспрессии CD19 клетками GBM30–luc. Количественное определение полученных данных связывания, демонстрирующее процент BiTE–положительных клеток, представлено на ФИГ. 25B.

[00304] Результаты связывания SIRP1α–CD3 и CD19–CD3 с клетками CD19^–CD47⁺ U251 представлены на ФИГ. 26. По сравнению с Ig отрицательного контроля (исключительно 2º) SIRP1α–CD3 BiTE был способен к связыванию с клетками U251 во всех применявшихся концентрациях, о чем свидетельствует сдвиг гистограмм привлекающих молекул вправо по сравнению с гистограммой контрольного IgG (ФИГ. 26A). Напротив, CD19–CD3 BiTE не был способен к связыванию с клетками U251, что и ожидали на основании отсутствия экспрессии CD19 клетками U251. Количественное определение полученных данных связывания, демонстрирующее процент BiTE–положительных клеток, представлено на ФИГ. 26B.

Пример 7: Связывание PDL1–CD3–Fc TiTE с клетками U251 опосредовано CD47, а не FcγR

[00305] Поскольку конструкция PDL1–CD3–Fc TiTE содержит 2 домена, способные к связыванию с клетками–мишенями (домен против PDL1 и Fc–домен), проводили эксперименты для оценки специфичности связывания данных конструкций. Клетки CD19^–CD47⁺ U251 обрабатывали 2 мкг/мл флуоресцентно меченного антитела против PDL1, изотипического контроля или супернатанта трансфекции PDL1–CD3–Fc. По сравнению с Ig отрицательного контроля PDL1–CD3–Fc TiTE связывался с клетками U251 (ФИГ. 27B). Для оценки того, было данное наблюдаемое связывание обусловлено взаимодействиями с CD47 или с FcγR, экспрессируемыми клетками U251, определяли экспрессию FcγR на клетках U251. Клетки инкубировали с 2 мкг/мл конъюгированного с флуорофором МАТ (моноклонального антитела) против CD16/32 (распознающего FcγRIII/FcγRII) или МАТ против CD64 (распознающего FcγRI) в течение 20 мин. при к.т. Затем клетки промывали и анализировали методом проточной цитометрии с применением цитометра BD LSR Fortessa. Как представлено на ФИГ. 27C, клетки U251 не экспрессируют FcγRI, FcγRII или FcγRIII; это свидетельствует, что связывание конструкции PDL1–CD3–Fc было опосредовано взаимодействиями с CD47, а не FcγR.

Пример 8: Конструкции CD19–CD3, SIRP1α–CD3 и PDL1–CD3–Fc стимулируют опосредованное CD8⁺ T–клетками уничтожение клеток–мишеней

[00306] Проводили эксперименты для определения способности конструкций CD19–CD3, SIRP1α–CD3 и PDL1–CD3–Fc опосредовать уничтожение клеток–мишеней. Вкратце, CD8⁺ Т–клетки стимулировали в течение 8–12 дней в присутствии 200 Ед./мл ИЛ–2 и бусин Dynabeads. Перед совместным культивированием с клетками–мишенями все Dynabeads удаляли с помощью магнита, а клетки промывали для удаления ИЛ–2. Клетки–мишени Раджи (ФИГ. 28), THP1 (ФИГ. 29), U251 (ФИГ. 30) и 293F (ФИГ. 31) перед высеванием метили флуоресцентным мембранным красителем PKH67 зеленым. Затем CD8⁺ эффекторные Т–клетки совместно культивировали с клетками–мишенями при соотношении эффектора к мишени 1:1 вместе с 1000 нг/мл CD19–CD3 BiTE, SIRP1α–CD3 BiTE или разведением супернатанта трансфекции PDL1–CD3–Fc в соотношении 1:3. Совместные культуры клеток–мишеней и эффекторных клеток инкубировали в течение 18 часов, после чего окрашивали 7–AAD и проводили анализ живых/мертвых клеток методом проточной цитометрии на цитометре BD LSR Fortesa.

[00307] Результаты данных экспериментов свидетельствуют, что все привлекающие конструкции CD19–CD3, SIRP1α–CD3 и PDL1–CD3–Fc были способны к индукции опосредованной эффекторными клетками гибели клеток–мишеней Раджи (ФИГ. 28), EC₅₀ каждой из привлекающих молекул CD19–CD3, SIRP1α–CD3 и PDL1–CD3–Fc на клетках Раджи представлены ниже в таблице 7.

Таблица 7: EC₅₀привлекающих молекул на клетках Раджи

[00308] Результаты данных экспериментов также свидетельствуют, что привлекающие конструкции PDL1–CD3–Fc, но не конструкции CD19–CD3, были способны к индукции опосредованной эффекторными клетками гибели клеток–мишеней THP1 (ФИГ. 29). Это, вероятно, обусловлено отсутствием экспрессии/относительно низкой экспрессией CD19 клетками THP1.

[00309] Также привлекающие конструкции PDL1–CD3–Fc были способны к индукции опосредованной эффекторными клетками гибели клеток–мишеней U251 (ФИГ. 30), тогда как конструкции CD19–CD3 не индуцировали опосредованную эффекторными клетками гибель клеток U251 в связи с отсутствием экспрессии CD19 клетками U251. EC₅₀ для каждой из конструкций CD19–CD3 и PDL1–CD3–Fc на клетках U251 представлены ниже в таблице 8.

Таблица 8: EC₅₀привлекающих молекул на клетках U251

[00310] Также привлекающие конструкции SIRP1α–CD3 были способны к индукции опосредованной эффекторными клетками гибели клеток–мишеней 293F (ФИГ. 31), о чем свидетельствует увеличение гибели клеток в культурах, содержащих SIRP1α–CD3, по сравнению с контрольным остеопонтин–слитым белком (OPN 1). EC₅₀ привлекающих молекул SIRP1α–CD3 на клетках 293F представлена ниже в таблице 9.

Таблица 9: EC₅₀SIRP1α–CD3 на клетках 293F

Пример 9: PDL1–CD3–Fc BiTE усиливает уничтожение клеток U251 первичными NK–клетками

[00311] Проводили эксперименты для оценки способности конструкций PDL1–CD3–Fc индуцировать опосредованное NK–клетками уничтожение клеток–мишеней. Вкратце, клетки U251 метили красителем клеточных мембран PKH67 зеленым, а затем высевали и позволяли прикрепиться к лункам в течение ночи (ФИГ. 32). Затем в каждую лунку добавляли первичные NK–клетки (StemCell Technologies, Inc.) при соотношении эффектора к мишени 1:1 вместе с варьирующими количествами продуцированного вирусом белка PDL1–CD3–Fc. Совместную культуру эффекторной клетки/клетки–мишени инкубировали при температуре 37°C в течение 6 часов перед проведением анализа для определения живых/мертвых клеток посредством окрашивания 7–AAD. Окрашенные клетки анализировали методом проточной цитометрии на цитометре BD LSR Fortesa.

[00312] Данные результаты продемонстрировали, что продуцированные вирусом соединения PDL1–CD3–Fc способны стимулировать опосредованную NK–клетками гибель клеток–мишеней, таких как U251.

Пример 10: Инфицированные оВПГ клетки Vero экспрессируют SIRP–1α–CD3 BiTE

[00313] Для демонстрации того, что онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, способны продуцировать привлекающие молекулы, клетки Vero инфицировали оВПГ (онколитическим вирусом простого герпеса), экспрессирующим SIRP1α–CD3 BiTE (ФИГ. 32) с коротким линкером (SL) (ONCR–085; 2A5B SIRP1α–CD3 (SL) BiTE) или с длинным линкером (LL) (ONCR–087; 2A5B SIRP1α–CD3 (LL) BiTE), или оВПГ, экспрессирующим PDL1–CD3–Fc TiTE (ONCR–089, ФИГ. 33). Клетки инфицировали в течение 3 дней, после чего супернатанты от инфицированных клеток пропускали через мембрану MWCO 100K для ультрафильтрации с целью удаления каких–либо вирусных частиц. Пропускаемую жидкость концентрировали с применением мембраны для ультрафильтрации 10K MWCO. Затем концентрированные супернатанты вируса и 100 нг, 50 нг, 25 нг или 12,5 нг очищенного белка SIRP1α–CD3 или PDL1–CD3–Fc анализировали методом ПААГ с последующим вестернблоттингом с применением идентифицирующего антитела против 6xHis с целью определения количества привлекающего белка, присутствующего в супернатантах вируса.

[00314] Результаты демонстрируют, что клетки, инфицированные ONCR–085 или ONCR–087, продуцировали белок SIRP1α–CD3 (SL) и SIRP1α–CD3 (LL), соответственно (ФИГ. 32). Также клетки, инфицированные ONCR–089, продуцировали белок PDL1–CD3–Fc (ФИГ. 33). Способность фильтрации на фильтре Amicon 100K и 10K и этапов концентрирования удалять оставшийся вирус оценивали методом вестернблоттинга. Рабочий процесс для очистки супернатантов вируса включает низкоскоростное центрифугирование супернатантов с последующей фильтрацией через мембрану для фильтрации с размером пор 0,8 мкм. Затем фильтраты супернатанта пропускали через фильтр Amicon 100 кДа, чтобы уловить вирус, с последующим пропусканием фильтрата через фильтр Amicon 10 кДа, чтобы уловить оставшийся белок. Аликвоты супернатантов из инфицированных вирусом клеток отбирали до и после очистки с применением фильтров Amicon, и присутствие ВПГ определяли посредством блоттинга с поликлональным антителом против ВПГ. Данные результаты демонстрируют, что этапы ультрафильтрации, применявшиеся для очистки привлекающих конструкций, эффективно удаляли вирус (ФИГ. 35). Вследствие этого любое уничтожение клетки–мишени, наблюдаемое в присутствии данных привлекающих конструкций, обусловлено привлекающей конструкцией самой по себе, а не вирусной инфекцией клеток–мишеней.

Пример 11: Продуцированные вирусом привлекающие конструкции SIRP1α–CD3 и PDL1–CD3–Fc индуцировали опосредованное эффекторными клетками уничтожение клеток–мишеней

[00315] Проводили эксперименты для оценки способности продуцированных вирусом привлекающих молекул (конструкций SIRP1α–CD3 и PDL1–CD3–Fc) опосредовать уничтожение клетки–мишени. Вкратце, белки SIRP1α–CD3 (SL), SIRP1α–CD3 (LL) и PDL1–CD3–Fc получали из клеток Vero, описанных в примере 10. 50 мкл полученных в результате образцов белка привлекающих белков SIRP1α–CD3 (SL), SIRP1α–CD3 (LL) и PDL1–CD3–Fc разводили в соотношении 1:1 в среде для культивирования тканей, содержащей 20% ЭТС (эмбриональную телячью сыворотку). Затем разведенные привлекающие белки инкубировали с активированными CD8⁺ эффекторными Т–клетками, которые совместно культивировали с флуоресцентно меченными клетками–мишенями U251 при соотношении мишени к эффектору 1:1 в течение 18 часов. Гибель клеток U251 изучали методом проточной цитометрии на цитометре BD LSR Fortesa.

[00316] Результаты данного эксперимента демонстрируют, что продуцированные вирусом привлекающие конструкции направляют опосредованное T–клетками уничтожение клеток–мишеней U251 (ФИГ. 34A). Данные результаты количественно представлены на ФИГ. 34B.

Пример 12: Экспрессия соединений SIRP1α–CD3/PDL1–Fc в Т–клетках 293

[00317] Получали две плазмиды экспрессии, кодирующие привлекающую молекулу SIRP1α–CD3 и терапевтическую молекулу PDL1–Fc. Одна конструкция содержала первый ген, кодирующий меченный HA PDL1–Fc, соединенный со вторым геном, кодирующим меченный His SIRP1α–CD3 BiTE. Последовательность аминокислот SIRP1α присоединяли к scFv против CD3 посредством линкера длиной в одну аминокислоту (т.е. короткого линкера) (SIRP1α–CD3/PDL1–Fc (SL), ФИГ. 37). Другая конструкция содержала первый ген, кодирующий PDL1–Fc, соединенный со вторым геном, кодирующим SIRP1α–CD3 BiTE. Последовательность аминокислот SIRP1α присоединяли к scFv против CD3 посредством линкера G4S (т.е. длинного линкера) (SIRP1α–CD3/PDL1–Fc (LL), ФИГ. 38). Конструкции встраивали в плазмиду (ФИГ. 39), и полученными плазмидами экспрессии SIRP1α–CD3/PDL1–Fc трансфицировали Т–клетки 293 Free Style. Через четыре дня после трансфекции плазмидами собирали супернатанты культуры.

[00318] Соединения против PDL1–Fc очищали из супернатантов культуры с применением колонки HiTrap MabSelect SuRe с белком А (GE Healthcare). Вкратце, супернатанты от 293 Т–клеток, трансфицированных плазмидами экспрессии SIRP1α–CD3/PDL1–Fc (LL) или SIRP1α–CD3/PDL1–Fc (LL), наносили на колонку для очистки соединений против PDL1–Fc посредством связывания метки HA с колонкой. Проточную фракцию собирали для обнаружения SIRP1α–CD3 BiTE методом вестернблоттинга с применением антитела против His (ФИГ. 40B). Колонки промывали буфером для промывки (20 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,4). Связанный белок против PDL1–Fc элюировали буфером для элюирования IgG (pH 2,8, Pierce) и немедленно нейтрализовали 1 M буфером Tris–HCl, pH 8.

[00319] Затем содержание белка против PDL1–Fc в различных элюированных фракциях визуализировали посредством окрашивания Кумасси. Вкратце, элюированные фракции анализировали на 4% – 12% геле Bis–Tris NuPAGE в буфере MOPS при напряжении 180 вольт в течение 1 часа. Гели окрашивали в течение 1 часа красителем Simply Blue SafeStain с последующим обесцвечиванием водой. Содержание белка против PDL1–Fc для каждой элюированной фракции представлено на ФИГ. 40A. После анализа с окрашиванием Кумасси элюированные фракции объединяли и диализовали против ФБР при температуре 4°C. Затем суммарную концентрацию белка против PDL1–Fc определяли посредством метода с бицинхониновой кислотой.

Пример 13: Выделенные белки PDL1–Fc стимулируют опосредованную T–клетками гибель клеток–мишеней

[00320] Способность белков против PDL1–Fc индуцировать опосредованную эффекторными клетками гибель клеток–мишеней оценивали посредством анализа блокады PD1/PDL1. Общая схема анализа представлена на ФИГ. 41A – 41B. Вкратце, CD8⁺ Т–клетки совместно культивировали с экспрессирующими PDL1 клетками–мишенями (клетки CHO–K1). Затем к культуре добавляли варьирующие концентрации белка против PDL1–Fc, выделенные, как описано в примере 12. Наивысшая использованная концентрация против PDL1–Fc составила 50 мкг/мл. Затем проводили 8 2,5–кратных серийных разведений для получения оставшихся концентраций против PDL1–Fc. Гибель клеток анализировали посредством анализа цитотоксичности CytoTox–Glo^TM в присутствии (ФИГ. 41B) и при отсутствии (ФИГ. 41A) против PDL1–Fc. Результаты количественно представлены на ФИГ. 41C. EC₅₀против PDL1–Fc представлена в таблице 10. Данные результаты демонстрируют, что терапевтические молекулы против PDL1–Fc, продуцированные в результате экспрессии конструкций, описанных в настоящем документе, способны к опосредованию опосредованной эффекторными клетками гибели клеток–мишеней.

Таблица 10. EC₅₀ соединений против PDL1–Fc

Пример 13: Инфицированные оВПГ клетки Vero экспрессируют терапевтические молекулы MMP9 и против PDL1–Fc

[00321] Помимо продукции привлекающих молекул, как описано в примере 10, проводили эксперименты для демонстрации того, что онколитические вирусы, описанные в настоящем документе, способны к продукции терапевтических молекул MMP9 и против PDL1–Fc. Клетки Vero инфицировали оВПГ, экспрессирующим конструкции SIRP1α–CD3/PDL1–Fc BiTE (ФИГ. 37 и ФИГ. 38), или оВПГ, экспрессирующим конструкции SIRP1α–CD3/MMP9 (ФИГ. 18A и ФИГ. 18B). Клетки инфицировали в течение 3 дней, после чего супернатанты от инфицированных клеток пропускали через мембрану 100K MWCO для ультрафильтрации с целью удаления каких–либо вирусных частиц. Проточную фракцию концентрировали с помощью мембраны для ультрафильтрации 10K MWCO. MMP9 и против PDL1–Fc очищали из отфильтрованных концентрированных супернатантов согласно протоколу, изложенному в примере 11. Выделенные на белке A фракции MMP9 и против PDL1 анализировали методом ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси. SIRP1α–CD3 BiTE, присутствующие в проточной фракции с белка A, анализировали методом вестернблоттинга с применением идентифицирующего антитела против 6x His.

[00322] Результаты продемонстрировали, что клетки, инфицированные векторами оВПГ, которые кодируют конструкции SIRP1α–CD3/PDL1–Fc или конструкции SIRP1α–CD3/MMP9, продуцировали белок SIRP1α–CD3 (SL) и SIRP1α–CD3 (LL) BiTE, MMP9 и против PDL1–Fc.

Пример 14: Продуцированные вирусом привлекающие конструкции SIRP1α–CD3/MMP9 и SIRP1α–CD3/PDL1–Fc индуцируют опосредованное эффекторными клетками уничтожение клеток–мишеней

[00323] Проводили эксперименты для оценки способности продуцированных вирусом привлекающих молекул (SIRP1α–CD3) и терапевтических молекул (MMP9 и против PDL1–Fc) опосредовать уничтожение клетки–мишени. Вкратце, белки SIRP1α–CD3 (SL), SIRP1α–CD3 (LL), MMP9 и против PDL1–Fc были получены из клеток Vero, как описано в примере 13. 50 мкл полученных в результате образцов белка разводили в среде для культивирования ткани, содержащей 20% ЭТС. Затем разведенные белки инкубировали с активированными CD8⁺ эффекторными Т–клетками или эффекторными NK–клетками и совместно культивировали с флуоресцентно меченным клетками–мишенями при соотношении мишени к эффектору 1:1 в течение 18 часов. Гибель клеток–мишеней оценивали методом проточной цитометрии на цитометре BD LSR Fortesa.

[00324] Результаты данного эксперимента продемонстрировали, что продуцированные вирусом привлекающие конструкции SIRP1α–CD3 и терапевтические молекулы MMP9 и против PDL1–Fc способны направлять опосредованное T–клетками и/или NK–клетками уничтожение клеток–мишеней.

[00325] Несмотря на то, что в настоящем документе были продемонстрированы и описаны предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, специалистам в данной области техники очевидно, что такие варианты реализации предложены исключительно в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены могут быть внесены специалистами в данной области техники в пределах настоящего изобретения. Следует понимать, что при реализации настоящего изобретения на практике можно применять различные альтернативы вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в настоящем документе. Предполагается, что следующая формула изобретения определяет объем настоящего изобретения, и что ею охватываются способы и структуры в пределах объема данной формулы изобретения и их эквиваленты.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Oncorus, Inc.

Evnin, Luke

<120> ДОСТАВКА ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПОЛИПЕПТИДОВ ПОСРЕДСТВОМ ПСЕВДОТИПИРОВАННЫХ ОНКОЛИТИЧЕСКИХ ВИРУСОВ

<130> ONCR-004/02WO 324865-2063

<150> US 62/357,195

<151> 2016-06-30

<160> 70

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид

<400> 1

atggagttcg gcctgagctg ggtgttcctg gtggccctgt tcaggggcgt gcagtgc 57

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезированного сигнального пептида

<400> 2

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp

20

<210> 3

<400> 3

000

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезированного сигнального пептида

<400> 4

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp

20

<210> 5

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий линкерный полипептид GlySer

<400> 5

ggcggcggcg gcagc 15

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезированного линкерного полипептида GlySer

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 7

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий линкерный полипептид GlySer

<400> 7

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagc 45

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезированного линкерного полипептида GlySer

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 9

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий линкерный полипептид GlySer

<400> 9

gtggagggcg gcagcggcgg cagcggcggc agcggcggca gcggcggcgt ggac 54

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезированного линкерного полипептида GlySer

<400> 10

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий 6-His-«таг»

<400> 11

caccaccacc accaccac 18

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезированного 6-His-«тага»

<400> 12

His His His His His His

1 5

<210> 13

<211> 66

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий линкер T2A

<400> 13

cgaagaaaac gcgaggggag gggctccctg ctcacctgtg gtgatgtcga agagaaccct 60

gggccg 66

<210> 14

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезированного линкера T2A

<400> 14

Arg Arg Lys Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 15

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий последовательность легкой цепи против CD19

<400> 15

gacatccagc tgacccagag ccccgccagc ctggccgtga gcctgggcca gagggccacc 60

atcagctgca aggccagcca gagcgtggac tacgacggcg acagctacct gaactggtac 120

cagcagatcc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg acgccagcaa cctggtgagc 180

ggcatccccc ccaggttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaacatccac 240

cccgtggaga aggtggacgc cgccacctac cactgccagc agagcaccga ggacccctgg 300

accttcggcg gcggcaccaa gctggagatc aag 333

<210> 16

<211> 111

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезированной легкой цепи против CD19

<400> 16

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 372

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий последовательность тяжелой цепи против CD19

<400> 17

caggtgcagc tgcagcagag cggcgccgag ctggtgaggc ccggcagcag cgtgaagatc 60

agctgcaagg ccagcggcta cgccttcagc agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cccggccagg gcctggagtg gatcggccag atctggcccg gcgacggcga caccaactac 180

aacggcaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgacg agagcagcag caccgcctac 240

atgcagctga gcagcctggc cagcgaggac agcgccgtgt acttctgcgc caggagggag 300

accaccaccg tgggcaggta ctactacgcc atggactact ggggccaggg caccaccgtg 360

accgtgagca gc 372

<210> 18

<211> 124

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезированной тяжелой цепи против CD19

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 318

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий последовательность легкой цепи против CD3

<400> 19

gacatccagc tgacccagag ccccgccatc atgagcgcca gccccggcga gaaggtgacc 60

atgacctgca gggccagcag cagcgtgagc tacatgaact ggtaccagca gaagagcggc 120

accagcccca agaggtggat ctacgacacc agcaaggtgg ccagcggcgt gccctacagg 180

ttcagcggca gcggcagcgg caccagctac agcctgacca tcagcagcat ggaggccgag 240

gacgccgcca cctactactg ccagcagtgg agcagcaacc ccctgacctt cggcgccggc 300

accaagctgg agctgaag 318

<210> 20

<211> 106

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синетзированной легкой цепи против CD3

<400> 20

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 21

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий последовательность тяжелой цепи против CD3

<400> 21

gacatcaagc tgcagcagag cggcgccgag ctggccaggc ccggcgccag cgtgaagatg 60

agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc aggtacacca tgcactgggt gaagcagagg 120

cccggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gcaggggcta caccaactac 180

aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accaccgaca agagcagcag caccgcctac 240

atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc caggtactac 300

gacgaccact actgcctgga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gagcagc 357

<210> 22

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезированной тяжелой цепи против CD3

<400> 22

Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 489

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 23

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120

gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180

gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240

cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300

gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360

agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420

gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480

acttcttag 489

<210> 24

<211> 162

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

50 55 60

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Thr Ser

<210> 25

<211> 987

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 25

atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60

gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120

gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180

accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240

gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300

ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360

aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420

acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480

ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540

agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600

gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660

gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720

ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780

acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840

agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900

cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960

gaatgggcat ctgtgccctg cagttag 987

<210> 26

<211> 329

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Pro Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe

1 5 10 15

Leu Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr

20 25 30

Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val

35 40 45

Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp

50 55 60

Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu

85 90 95

Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile

100 105 110

Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr

115 120 125

Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp

130 135 140

Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser

145 150 155 160

Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu

165 170 175

Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val

180 185 190

Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro

195 200 205

Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr

210 215 220

Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys

225 230 235 240

Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser

245 250 255

Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu

260 265 270

Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp

275 280 285

Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn

290 295 300

Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp

305 310 315 320

Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser

325

<210> 27

<211> 762

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 27

atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60

catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120

ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180

gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240

gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300

gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360

ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420

aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480

atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540

atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600

atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660

gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720

gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct ag 762

<210> 28

<211> 253

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala

1 5 10 15

Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg

20 25 30

Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val

35 40 45

Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro

50 55 60

Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg

65 70 75 80

Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr

85 90 95

Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys

100 105 110

Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu

115 120 125

Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys

130 135 140

Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser

145 150 155 160

Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn

165 170 175

Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn

180 185 190

Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser

195 200 205

Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys

210 215 220

Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala

225 230 235 240

Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser

245 250

<210> 29

<211> 297

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 29

atgaatcaaa ctgccattct gatttgctgc cttatctttc tgactctaag tggcattcaa 60

ggagtacctc tctctagaac tgtacgctgt acctgcatca gcattagtaa tcaacctgtt 120

aatccaaggt ctttagaaaa acttgaaatt attcctgcaa gccaattttg tccacgtgtt 180

gagatcattg ctacaatgaa aaagaagggt gagaagagat gtctgaatcc agaatcgaag 240

gccatcaaga atttactgaa agcagttagc aaggaaaggt ctaaaagatc tccttag 297

<210> 30

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

Met Asn Gln Thr Ala Ile Leu Ile Cys Cys Leu Ile Phe Leu Thr Leu

1 5 10 15

Ser Gly Ile Gln Gly Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys

20 25 30

Ile Ser Ile Ser Asn Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu

35 40 45

Glu Ile Ile Pro Ala Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala

50 55 60

Thr Met Lys Lys Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys

65 70 75 80

Ala Ile Lys Asn Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Lys Arg

85 90 95

Ser Pro

<210> 31

<211> 426

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 31

atggagaccg ataccctgct cttgtgggtt ttgcttcttt gggtgccagg atctacaggt 60

gatgaagaag aattgcagat catccaacca gacaaatccg tactcgtggc cgcaggagag 120

accgctaccc tcagatgtac catcacttct ctcttccccg ttggccccat ccagtggttt 180

cgaggcgcag gaccaggacg agtgcttatt tacaatcaac gacagggccc attcccaaga 240

gtgacaacag tatccgatac caccaagcgc aataatatgg actttagcat tagaatcggc 300

aacataacac ccgctgacgc cggtacatac tattgtatta aatttcgaaa gggctcacca 360

gacgacgtgg aatttaagtc aggggccgga accgaactct cagttagagc aaaaccttct 420

gctagc 426

<210> 32

<211> 142

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys

20 25 30

Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile

35 40 45

Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly

50 55 60

Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg

65 70 75 80

Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser

85 90 95

Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser

130 135 140

<210> 33

<211> 2124

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 33

atgagcctct ggcagcccct ggtcctggtg ctcctggtgc tgggctgctg ctttgctgcc 60

cccagacagc gccagtccac ccttgtgctc ttccctggag acctgagaac caatctcacc 120

gacaggcagc tggcagagga atacctgtac cgctatggtt acactcgggt ggcagagatg 180

cgtggagagt cgaaatctct ggggcctgcg ctgctgcttc tccagaagca actgtccctg 240

cccgagaccg gtgagctgga tagcgccacg ctgaaggcca tgcgaacccc acggtgcggg 300

gtcccagacc tgggcagatt ccaaaccttt gagggcgacc tcaagtggca ccaccacaac 360

atcacctatt ggatccaaaa ctactcggaa gacttgccgc gggcggtgat tgacgacgcc 420

tttgcccgcg ccttcgcact gtggagcgcg gtgacgccgc tcaccttcac tcgcgtgtac 480

agccgggacg cagacatcgt catccagttt ggtgtcgcgg agcacggaga cgggtatccc 540

ttcgacggga aggacgggct cctggcacac gcctttcctc ctggccccgg cattcaggga 600

gacgcccatt tcgacgatga cgagttgtgg tccctgggca agggcgtcgt ggttccaact 660

cggtttggaa acgcagatgg cgcggcctgc cacttcccct tcatcttcga gggccgctcc 720

tactctgcct gcaccaccga cggtcgctcc gacggcttgc cctggtgcag taccacggcc 780

aactacgaca ccgacgaccg gtttggcttc tgccccagcg agagactcta cacccgggac 840

ggcaatgctg atgggaaacc ctgccagttt ccattcatct tccaaggcca atcctactcc 900

gcctgcacca cggacggtcg ctccgacggc taccgctggt gcgccaccac cgccaactac 960

gaccgggaca agctcttcgg cttctgcccg acccgagctg actcgacggt gatggggggc 1020

aactcggcgg gggagctgtg cgtcttcccc ttcactttcc tgggtaagga gtactcgacc 1080

tgtaccagcg agggccgcgg agatgggcgc ctctggtgcg ctaccacctc gaactttgac 1140

agcgacaaga agtggggctt ctgcccggac caaggataca gtttgttcct cgtggcggcg 1200

catgagttcg gccacgcgct gggcttagat cattcctcag tgccggaggc gctcatgtac 1260

cctatgtacc gcttcactga ggggcccccc ttgcataagg acgacgtgaa tggcatccgg 1320

cacctctatg gtcctcgccc tgaacctgag ccacggcctc caaccaccac cacaccgcag 1380

cccacggctc ccccgacggt ctgccccacc ggacccccca ctgtccaccc ctcagagcgc 1440

cccacagctg gccccacagg tcccccctca gctggcccca caggtccccc cactgctggc 1500

ccttctacgg ccactactgt gcctttgagt ccggtggacg atgcctgcaa cgtgaacatc 1560

ttcgacgcca tcgcggagat tgggaaccag ctgtatttgt tcaaggatgg gaagtactgg 1620

cgattctctg agggcagggg gagccggccg cagggcccct tccttatcgc cgacaagtgg 1680

cccgcgctgc cccgcaagct ggactcggtc tttgaggagc cgctctccaa gaagcttttc 1740

ttcttctctg ggcgccaggt gtgggtgtac acaggcgcgt cggtgctggg cccgaggcgt 1800

ctggacaagc tgggcctggg agccgacgtg gcccaggtga ccggggccct ccggagtggc 1860

agggggaaga tgctgctgtt cagcgggcgg cgcctctgga ggttcgacgt gaaggcgcag 1920

atggtggatc cccggagcgc cagcgaggtg gaccggatgt tccccggggt gcctttggac 1980

acgcacgacg tcttccagta ccgagagaaa gcctatttct gccaggaccg cttctactgg 2040

cgcgtgagtt cccggagtga gttgaaccag gtggaccaag tgggctacgt gacctatgac 2100

atcctgcagt gccctgagga ctag 2124

<210> 34

<211> 707

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Met Ser Leu Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Cys

1 5 10 15

Cys Phe Ala Ala Pro Arg Gln Arg Gln Ser Thr Leu Val Leu Phe Pro

20 25 30

Gly Asp Leu Arg Thr Asn Leu Thr Asp Arg Gln Leu Ala Glu Glu Tyr

35 40 45

Leu Tyr Arg Tyr Gly Tyr Thr Arg Val Ala Glu Met Arg Gly Glu Ser

50 55 60

Lys Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Leu Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu

65 70 75 80

Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr

85 90 95

Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly

100 105 110

Asp Leu Lys Trp His His His Asn Ile Thr Tyr Trp Ile Gln Asn Tyr

115 120 125

Ser Glu Asp Leu Pro Arg Ala Val Ile Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala

130 135 140

Phe Ala Leu Trp Ser Ala Val Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Arg Asp Ala Asp Ile Val Ile Gln Phe Gly Val Ala Glu His Gly

165 170 175

Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe

180 185 190

Pro Pro Gly Pro Gly Ile Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu

195 200 205

Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly Val Val Val Pro Thr Arg Phe Gly Asn

210 215 220

Ala Asp Gly Ala Ala Cys His Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser

225 230 235 240

Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Leu Pro Trp Cys

245 250 255

Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly Phe Cys Pro

260 265 270

Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Arg Asp Gly Asn Ala Asp Gly Lys Pro Cys

275 280 285

Gln Phe Pro Phe Ile Phe Gln Gly Gln Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr

290 295 300

Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr

305 310 315 320

Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly Phe Cys Pro Thr Arg Ala Asp Ser Thr

325 330 335

Val Met Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val Phe Pro Phe Thr

340 345 350

Phe Leu Gly Lys Glu Tyr Ser Thr Cys Thr Ser Glu Gly Arg Gly Asp

355 360 365

Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Asn Phe Asp Ser Asp Lys Lys

370 375 380

Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala

385 390 395 400

His Glu Phe Gly His Ala Leu Gly Leu Asp His Ser Ser Val Pro Glu

405 410 415

Ala Leu Met Tyr Pro Met Tyr Arg Phe Thr Glu Gly Pro Pro Leu His

420 425 430

Lys Asp Asp Val Asn Gly Ile Arg His Leu Tyr Gly Pro Arg Pro Glu

435 440 445

Pro Glu Pro Arg Pro Pro Thr Thr Thr Thr Pro Gln Pro Thr Ala Pro

450 455 460

Pro Thr Val Cys Pro Thr Gly Pro Pro Thr Val His Pro Ser Glu Arg

465 470 475 480

Pro Thr Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro

485 490 495

Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr Ala Thr Thr Val Pro Leu Ser Pro Val

500 505 510

Asp Asp Ala Cys Asn Val Asn Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly

515 520 525

Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu

530 535 540

Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp

545 550 555 560

Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Val Phe Glu Glu Pro Leu Ser

565 570 575

Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly

580 585 590

Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala

595 600 605

Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met

610 615 620

Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln

625 630 635 640

Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly

645 650 655

Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val Phe Gln Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr

660 665 670

Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu

675 680 685

Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys

690 695 700

Pro Glu Asp

705

<210> 35

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий Fv легкой цепи PD-L1

<400> 35

gatatccaga tgacacagag cccatcatct ctgtctgcaa gcgtaggaga ccgagtcacc 60

attacatgca gagcctccca agacgtttcc acagcagtgg cctggtatca gcaaaaacct 120

ggtaaggcgc ccaagcttct catctattca gccagttttc tgtatagcgg cgttcccagc 180

cgattctctg gctctggatc cggcacggac tttactttga caatttcctc tcttcagccc 240

gaagattttg caacctacta ctgtcagcaa tatctctacc atccagccac attcggacag 300

ggcaccaaag tcgaaatcaa aaga 324

<210> 36

<211> 108

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезированного Fv легкой цепи PD-L1

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 37

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий Fv тяжелой цепи PD-L1

<400> 37

gaagtgcaac tcgttgaaag cggaggaggg cttgtccaac ctggcgggtc actgcggttg 60

agctgcgccg caagcggatt caccttctca gactcttgga tccattgggt gcgccaggct 120

cccggaaaag gcttggaatg ggttgcttgg atttcaccgt atggcggttc cacatactac 180

gctgacagcg ttaagggtcg attcaccatc tctgcagata cttcaaaaaa cacagcctac 240

cttcagatga atagtttgcg cgccgaggac acagcggttt attattgtgc ccgaagacat 300

tggcccggcg gtttcgacta ctgggggcaa ggtacgttgg tgactgtgag cgcc 354

<210> 38

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезированного Fv тяжелой цепи PD-L1

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 39

<211> 699

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 39

gtagatgaag caaaatcttg tgacaaaacc catacctgcc caccatgccc agccccagaa 60

cttcttggcg gaccctctgt cttccttttc cctccgaagc ccaaggatac cctgatgatc 120

agccgaaccc cggaggtaac atgtgtggtg gtcgatgtta gccatgagga tcctgaagtc 180

aaatttaact ggtatgtaga cggtgttgag gtgcacaacg ctaaaactaa gcccagggag 240

gagcagtaca actcaaccta tcgcgtcgta tctgtgctta ccgtcctgca tcaagactgg 300

ctcaatggta aggaatataa atgtaaagtg agtaacaagg cactgccagc acctatcgaa 360

aaaaccatct caaaggcgaa gggacagccc agggaacccc aggtctatac tctgccacct 420

tctcgggatg aattgaccaa gaaccaagtt agcctgacat gtctggtgaa aggtttctat 480

ccaagcgata tagctgtcga gtgggagtcc aatggccaac ctgagaacaa ttataagacc 540

accccacccg ttctggacag cgacggatcc tttttcctgt actcaaaact cactgtcgat 600

aaatcaagat ggcaacaagg caacgttttt agctgtagcg tgatgcacga agcacttcat 660

aatcactata cacagaagtc actctctctt tctccagga 699

<210> 40

<211> 233

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

Val Asp Glu Ala Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

35 40 45

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

50 55 60

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

65 70 75 80

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

85 90 95

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

100 105 110

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

115 120 125

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

130 135 140

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

165 170 175

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

180 185 190

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

195 200 205

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

210 215 220

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

225 230

<210> 41

<211> 69

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 41

gtagatgaag caaaatcttg tgacaaaacc catacctgcc caccatgccc agccccagaa 60

cttcttggc 69

<210> 42

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

Val Asp Glu Ala Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

20

<210> 43

<211> 1572

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий конструкцию биспецифического привлекающего Т-клетки активатора CD19-CD3

<400> 43

atggagttcg gcctgagctg ggtgttcctg gtggccctgt tcaggggcgt gcagtgcgac 60

atccagctga cccagagccc cgccagcctg gccgtgagcc tgggccagag ggccaccatc 120

agctgcaagg ccagccagag cgtggactac gacggcgaca gctacctgaa ctggtaccag 180

cagatccccg gccagccccc caagctgctg atctacgacg ccagcaacct ggtgagcggc 240

atccccccca ggttcagcgg cagcggcagc ggcaccgact tcaccctgaa catccacccc 300

gtggagaagg tggacgccgc cacctaccac tgccagcaga gcaccgagga cccctggacc 360

ttcggcggcg gcaccaagct ggagatcaag ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 420

ggcggcggcg gcagccaggt gcagctgcag cagagcggcg ccgagctggt gaggcccggc 480

agcagcgtga agatcagctg caaggccagc ggctacgcct tcagcagcta ctggatgaac 540

tgggtgaagc agaggcccgg ccagggcctg gagtggatcg gccagatctg gcccggcgac 600

ggcgacacca actacaacgg caagttcaag ggcaaggcca ccctgaccgc cgacgagagc 660

agcagcaccg cctacatgca gctgagcagc ctggccagcg aggacagcgc cgtgtacttc 720

tgcgccagga gggagaccac caccgtgggc aggtactact acgccatgga ctactggggc 780

cagggcacca ccgtgaccgt gagcagcggc ggcggcggca gcgacatcaa gctgcagcag 840

agcggcgccg agctggccag gcccggcgcc agcgtgaaga tgagctgcaa gaccagcggc 900

tacaccttca ccaggtacac catgcactgg gtgaagcaga ggcccggcca gggcctggag 960

tggatcggct acatcaaccc cagcaggggc tacaccaact acaaccagaa gttcaaggac 1020

aaggccaccc tgaccaccga caagagcagc agcaccgcct acatgcagct gagcagcctg 1080

accagcgagg acagcgccgt gtactactgc gccaggtact acgacgacca ctactgcctg 1140

gactactggg gccagggcac caccctgacc gtgagcagcg tggagggcgg cagcggcggc 1200

agcggcggca gcggcggcag cggcggcgtg gacgacatcc agctgaccca gagccccgcc 1260

atcatgagcg ccagccccgg cgagaaggtg accatgacct gcagggccag cagcagcgtg 1320

agctacatga actggtacca gcagaagagc ggcaccagcc ccaagaggtg gatctacgac 1380

accagcaagg tggccagcgg cgtgccctac aggttcagcg gcagcggcag cggcaccagc 1440

tacagcctga ccatcagcag catggaggcc gaggacgccg ccacctacta ctgccagcag 1500

tggagcagca accccctgac cttcggcgcc ggcaccaagc tggagctgaa gcaccaccac 1560

caccaccact ag 1572

<210> 44

<211> 523

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора CD19-CD3

<400> 44

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val

20 25 30

Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val

35 40 45

Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly

50 55 60

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly

65 70 75 80

Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln

100 105 110

Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly

145 150 155 160

Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser

165 170 175

Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys

195 200 205

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala

210 215 220

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe

225 230 235 240

Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met

245 250 255

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro

275 280 285

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

290 295 300

Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu

305 310 315 320

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln

325 330 335

Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr

340 345 350

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

355 360 365

Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly

370 375 380

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly

385 390 395 400

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr

405 410 415

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

420 425 430

Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln

435 440 445

Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val

450 455 460

Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

465 470 475 480

Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

485 490 495

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

500 505 510

Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His

515 520

<210> 45

<211> 1177

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий конструкцию биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-CD3-SL

<400> 45

atggagaccg ataccctgct cttgtgggtt ttgcttcttt gggtgccagg atctacaggt 60

gatgaagaag aattgcagat catccaacca gacaaatccg tactcgtggc cgcaggagag 120

accgctaccc tcagatgtac catcacttct ctcttccccg ttggccccat ccagtggttt 180

cgaggcgcag gaccaggacg agtgcttatt tacaatcaac gacagggccc attcccaaga 240

gtgacaacag tatccgatac caccaagcgc aataatatgg actttagcat tagaatcggc 300

aacataacac ccgctgacgc cggtacatac tattgtatta aatttcgaaa gggctcacca 360

gacgacgtgg aatttaagtc aggggccgga accgaactct cagttagagc aaaaccttct 420

gctagcgaca tcaagctgca gcagagcggc gccgagctgg ccaggcccgg cgccagcgtg 480

aagatgagct gcaagaccag cggctacacc ttcaccaggt acaccatgca ctgggtgaag 540

cagaggcccg gccagggcct ggagtggatc ggctacatca accccagcag gggctacacc 600

aactacaacc agaagttcaa ggacaaggcc accctgacca ccgacaagag cagcagcacc 660

gcctacatgc agctgagcag cctgaccagc gaggacagcg ccgtgtacta ctgcgccagg 720

tactacgacg accactactg cctggactac tggggccagg gcaccaccct gaccgtgagc 780

agcgtggagg gcggcagcgg cggcagcggc ggcagcggcg gcagcggcgg cgtggacgac 840

atccagctga cccagagccc cgccatcatg agcgccagcc ccggcgagaa ggtgaccatg 900

acctgcaggg ccagcagcag cgtgagctac atgaactggt accagcagaa gagcggcacc 960

agccccaaga ggtggatcta cgacaccagc aaggtggcca gcggcgtgcc ctacaggttc 1020

agcggcagcg gcagcggcac cagctacagc ctgaccatca gcagcatgga ggccgaggac 1080

gccgccacct actactgcca gcagtggagc agcaaccccc tgaccttcgg cgccggcacc 1140

aagctggagc tgaagcacca ccatcatcac cactgag 1177

<210> 46

<211> 391

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-CD3-SL

<400> 46

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys

20 25 30

Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile

35 40 45

Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly

50 55 60

Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg

65 70 75 80

Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser

85 90 95

Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser Asp Ile

130 135 140

Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val

145 150 155 160

Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met

165 170 175

His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

180 185 190

Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp

195 200 205

Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

210 215 220

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

225 230 235 240

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

245 250 255

Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala

275 280 285

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala

290 295 300

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr

305 310 315 320

Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val

325 330 335

Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

370 375 380

Lys His His His His His His

385 390

<210> 47

<211> 1191

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий конструкцию биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-CD3-LL

<400> 47

atggagaccg ataccctgct cttgtgggtt ttgcttcttt gggtgccagg atctacaggt 60

gatgaagaag aattgcagat catccaacca gacaaatccg tactcgtggc cgcaggagag 120

accgctaccc tcagatgtac catcacttct ctcttccccg ttggccccat ccagtggttt 180

cgaggcgcag gaccaggacg agtgcttatt tacaatcaac gacagggccc attcccaaga 240

gtgacaacag tatccgatac caccaagcgc aataatatgg actttagcat tagaatcggc 300

aacataacac ccgctgacgc cggtacatac tattgtatta aatttcgaaa gggctcacca 360

gacgacgtgg aatttaagtc aggggccgga accgaactct cagttagagc aaaaccttct 420

gctagcggcg gcggcggcag cgacatcaag ctgcagcaga gcggcgccga gctggccagg 480

cccggcgcca gcgtgaagat gagctgcaag accagcggct acaccttcac caggtacacc 540

atgcactggg tgaagcagag gcccggccag ggcctggagt ggatcggcta catcaacccc 600

agcaggggct acaccaacta caaccagaag ttcaaggaca aggccaccct gaccaccgac 660

aagagcagca gcaccgccta catgcagctg agcagcctga ccagcgagga cagcgccgtg 720

tactactgcg ccaggtacta cgacgaccac tactgcctgg actactgggg ccagggcacc 780

accctgaccg tgagcagcgt ggagggcggc agcggcggca gcggcggcag cggcggcagc 840

ggcggcgtgg acgacatcca gctgacccag agccccgcca tcatgagcgc cagccccggc 900

gagaaggtga ccatgacctg cagggccagc agcagcgtga gctacatgaa ctggtaccag 960

cagaagagcg gcaccagccc caagaggtgg atctacgaca ccagcaaggt ggccagcggc 1020

gtgccctaca ggttcagcgg cagcggcagc ggcaccagct acagcctgac catcagcagc 1080

atggaggccg aggacgccgc cacctactac tgccagcagt ggagcagcaa ccccctgacc 1140

ttcggcgccg gcaccaagct ggagctgaag caccaccacc accaccacta g 1191

<210> 48

<211> 396

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-CD3-LL

<400> 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys

20 25 30

Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile

35 40 45

Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly

50 55 60

Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg

65 70 75 80

Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser

85 90 95

Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

145 150 155 160

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

165 170 175

Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn

195 200 205

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser

210 215 220

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu

275 280 285

Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

290 295 300

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln

305 310 315 320

Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys

325 330 335

Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

340 345 350

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

355 360 365

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly

370 375 380

Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His

385 390 395

<210> 49

<211> 1545

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий конструкцию биспецифического привлекающего Т-клетки активатора PDL1-CD3

<400> 49

atggagttcg gcctgagctg ggtgttcctg gtggccctgt tcaggggcgt gcagtgcgac 60

atcaagctgc agcagagcgg cgccgagctg gccaggcccg gcgccagcgt gaagatgagc 120

tgcaagacca gcggctacac cttcaccagg tacaccatgc actgggtgaa gcagaggccc 180

ggccagggcc tggagtggat cggctacatc aaccccagca ggggctacac caactacaac 240

cagaagttca aggacaaggc caccctgacc accgacaaga gcagcagcac cgcctacatg 300

cagctgagca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgcgccag gtactacgac 360

gaccactact gcctggacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgag cagcgtggag 420

ggcggcagcg gcggcagcgg cggcagcggc ggcagcggcg gcgtggacga catccagctg 480

acccagagcc ccgccatcat gagcgccagc cccggcgaga aggtgaccat gacctgcagg 540

gccagcagca gcgtgagcta catgaactgg taccagcaga agagcggcac cagccccaag 600

aggtggatct acgacaccag caaggtggcc agcggcgtgc cctacaggtt cagcggcagc 660

ggcagcggca ccagctacag cctgaccatc agcagcatgg aggccgagga cgccgccacc 720

tactactgcc agcagtggag cagcaacccc ctgaccttcg gcgccggcac caagctggag 780

ctgaagggcg gcggcggcag cgatatccag atgacacaga gcccatcatc tctgtctgca 840

agcgtaggag accgagtcac cattacatgc agagcctccc aagacgtttc cacagcagtg 900

gcctggtatc agcaaaaacc tggtaaggcg cccaagcttc tcatctattc agccagtttt 960

ctgtatagcg gcgttcccag ccgattctct ggctctggat ccggcacgga ctttactttg 1020

acaatttcct ctcttcagcc cgaagatttt gcaacctact actgtcagca atatctctac 1080

catccagcca cattcggaca gggcaccaaa gtcgaaatca aaagaggcgg cggcggcagt 1140

ggcggcgggg gttcaggagg cgggggttct gaagtgcaac tcgttgaaag cggaggaggg 1200

cttgtccaac ctggcgggtc actgcggttg agctgcgccg caagcggatt caccttctca 1260

gactcttgga tccattgggt gcgccaggct cccggaaaag gcttggaatg ggttgcttgg 1320

atttcaccgt atggcggttc cacatactac gctgacagcg ttaagggtcg attcaccatc 1380

tctgcagata cttcaaaaaa cacagcctac cttcagatga atagtttgcg cgccgaggac 1440

acagcggttt attattgtgc ccgaagacat tggcccggcg gtttcgacta ctgggggcaa 1500

ggtacgttgg tgactgtgag cgcccaccac catcatcacc actga 1545

<210> 50

<211> 514

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора PDL1-CD3

<400> 50

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

165 170 175

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys

195 200 205

Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly

245 250 255

Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

260 265 270

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

275 280 285

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln

290 295 300

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe

305 310 315 320

Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

325 330 335

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

340 345 350

Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly

355 360 365

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

370 375 380

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

405 410 415

Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

420 425 430

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr

435 440 445

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr

450 455 460

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

465 470 475 480

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp

485 490 495

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala His His His His

500 505 510

His His

<210> 51

<211> 2244

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий конструкцию биспецифического привлекающего Т-клетки активатора PDL1-CD3-Fc

<400> 51

atggagttcg gcctgagctg ggtgttcctg gtggccctgt tcaggggcgt gcagtgcgac 60

atcaagctgc agcagagcgg cgccgagctg gccaggcccg gcgccagcgt gaagatgagc 120

tgcaagacca gcggctacac cttcaccagg tacaccatgc actgggtgaa gcagaggccc 180

ggccagggcc tggagtggat cggctacatc aaccccagca ggggctacac caactacaac 240

cagaagttca aggacaaggc caccctgacc accgacaaga gcagcagcac cgcctacatg 300

cagctgagca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgcgccag gtactacgac 360

gaccactact gcctggacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgag cagcgtggag 420

ggcggcagcg gcggcagcgg cggcagcggc ggcagcggcg gcgtggacga catccagctg 480

acccagagcc ccgccatcat gagcgccagc cccggcgaga aggtgaccat gacctgcagg 540

gccagcagca gcgtgagcta catgaactgg taccagcaga agagcggcac cagccccaag 600

aggtggatct acgacaccag caaggtggcc agcggcgtgc cctacaggtt cagcggcagc 660

ggcagcggca ccagctacag cctgaccatc agcagcatgg aggccgagga cgccgccacc 720

tactactgcc agcagtggag cagcaacccc ctgaccttcg gcgccggcac caagctggag 780

ctgaagggcg gcggcggcag cgatatccag atgacacaga gcccatcatc tctgtctgca 840

agcgtaggag accgagtcac cattacatgc agagcctccc aagacgtttc cacagcagtg 900

gcctggtatc agcaaaaacc tggtaaggcg cccaagcttc tcatctattc agccagtttt 960

ctgtatagcg gcgttcccag ccgattctct ggctctggat ccggcacgga ctttactttg 1020

acaatttcct ctcttcagcc cgaagatttt gcaacctact actgtcagca atatctctac 1080

catccagcca cattcggaca gggcaccaaa gtcgaaatca aaagaggcgg cggcggcagt 1140

ggcggcgggg gttcaggagg cgggggttct gaagtgcaac tcgttgaaag cggaggaggg 1200

cttgtccaac ctggcgggtc actgcggttg agctgcgccg caagcggatt caccttctca 1260

gactcttgga tccattgggt gcgccaggct cccggaaaag gcttggaatg ggttgcttgg 1320

atttcaccgt atggcggttc cacatactac gctgacagcg ttaagggtcg attcaccatc 1380

tctgcagata cttcaaaaaa cacagcctac cttcagatga atagtttgcg cgccgaggac 1440

acagcggttt attattgtgc ccgaagacat tggcccggcg gtttcgacta ctgggggcaa 1500

ggtacgttgg tgactgtgag cgccgtagat gaagcaaaat cttgtgacaa aacccatacc 1560

tgcccaccat gcccagcccc agaacttctt ggcggaccct ctgtcttcct tttccctccg 1620

aagcccaagg ataccctgat gatcagccga accccggagg taacatgtgt ggtggtcgat 1680

gttagccatg aggatcctga agtcaaattt aactggtatg tagacggtgt tgaggtgcac 1740

aacgctaaaa ctaagcccag ggaggagcag tacaactcaa cctatcgcgt cgtatctgtg 1800

cttaccgtcc tgcatcaaga ctggctcaat ggtaaggaat ataaatgtaa agtgagtaac 1860

aaggcactgc cagcacctat cgaaaaaacc atctcaaagg cgaagggaca gcccagggaa 1920

ccccaggtct atactctgcc accttctcgg gatgaattga ccaagaacca agttagcctg 1980

acatgtctgg tgaaaggttt ctatccaagc gatatagctg tcgagtggga gtccaatggc 2040

caacctgaga acaattataa gaccacccca cccgttctgg acagcgacgg atcctttttc 2100

ctgtactcaa aactcactgt cgataaatca agatggcaac aaggcaacgt ttttagctgt 2160

agcgtgatgc acgaagcact tcataatcac tatacacaga agtcactctc tctttctcca 2220

ggacaccacc atcatcacca ctga 2244

<210> 52

<211> 747

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора PDL1-CD3-Fc

<400> 52

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

165 170 175

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys

195 200 205

Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly

245 250 255

Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

260 265 270

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

275 280 285

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln

290 295 300

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe

305 310 315 320

Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

325 330 335

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

340 345 350

Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly

355 360 365

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

370 375 380

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

405 410 415

Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

420 425 430

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr

435 440 445

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr

450 455 460

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

465 470 475 480

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp

485 490 495

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Val Asp Glu Ala

500 505 510

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

515 520 525

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

530 535 540

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

545 550 555 560

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

565 570 575

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

580 585 590

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

595 600 605

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

610 615 620

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

625 630 635 640

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

645 650 655

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

660 665 670

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

675 680 685

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

690 695 700

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

705 710 715 720

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

725 730 735

Ser Leu Ser Pro Gly His His His His His His

740 745

<210> 53

<211> 707

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора CD19-IL15

<400> 53

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val

20 25 30

Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val

35 40 45

Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly

50 55 60

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly

65 70 75 80

Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln

100 105 110

Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly

145 150 155 160

Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser

165 170 175

Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys

195 200 205

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala

210 215 220

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe

225 230 235 240

Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met

245 250 255

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro

275 280 285

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

290 295 300

Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu

305 310 315 320

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln

325 330 335

Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr

340 345 350

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

355 360 365

Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly

370 375 380

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly

385 390 395 400

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr

405 410 415

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

420 425 430

Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln

435 440 445

Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val

450 455 460

Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

465 470 475 480

Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

485 490 495

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

500 505 510

Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His Arg Arg Lys Arg Glu

515 520 525

Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

530 535 540

Pro Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys

545 550 555 560

Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile

565 570 575

His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu

580 585 590

Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu

595 600 605

Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val

610 615 620

His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu

625 630 635 640

Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val

645 650 655

Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn

660 665 670

Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn

675 680 685

Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile

690 695 700

Asn Thr Ser

705

<210> 54

<211> 1149

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора CD19-IL12

<400> 54

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val

20 25 30

Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val

35 40 45

Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly

50 55 60

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly

65 70 75 80

Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln

100 105 110

Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly

145 150 155 160

Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser

165 170 175

Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys

195 200 205

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala

210 215 220

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe

225 230 235 240

Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met

245 250 255

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro

275 280 285

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

290 295 300

Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu

305 310 315 320

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln

325 330 335

Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr

340 345 350

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

355 360 365

Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly

370 375 380

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly

385 390 395 400

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr

405 410 415

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

420 425 430

Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln

435 440 445

Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val

450 455 460

Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

465 470 475 480

Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

485 490 495

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

500 505 510

Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His Arg Arg Lys Arg Glu

515 520 525

Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

530 535 540

Pro Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala

545 550 555 560

Ala Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys

565 570 575

Arg Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu

580 585 590

Val Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr

595 600 605

Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu

610 615 620

Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe

625 630 635 640

Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp

645 650 655

Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn

660 665 670

Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser

675 680 685

Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser

690 695 700

Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met

705 710 715 720

Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln

725 730 735

Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn

740 745 750

Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr

755 760 765

Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg

770 775 780

Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Arg Arg

785 790 795 800

Lys Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu

805 810 815

Asn Pro Gly Pro Pro Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe

820 825 830

Ser Leu Val Phe Leu Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys

835 840 845

Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly

850 855 860

Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr

865 870 875 880

Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu

885 890 895

Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His

900 905 910

Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys

915 920 925

Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro

930 935 940

Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg

945 950 955 960

Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser

965 970 975

Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly

980 985 990

Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr

995 1000 1005

Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala

1010 1015 1020

Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys

1025 1030 1035

Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile

1040 1045 1050

Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys

1055 1060 1065

Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp

1070 1075 1080

Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val

1085 1090 1095

Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp

1100 1105 1110

Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser

1115 1120 1125

Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp

1130 1135 1140

Ala Ser Val Pro Cys Ser

1145

<210> 55

<211> 643

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора CD19-CXCL10

<400> 55

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val

20 25 30

Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val

35 40 45

Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly

50 55 60

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly

65 70 75 80

Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln

100 105 110

Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly

145 150 155 160

Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser

165 170 175

Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys

195 200 205

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala

210 215 220

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe

225 230 235 240

Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met

245 250 255

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro

275 280 285

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

290 295 300

Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu

305 310 315 320

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln

325 330 335

Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr

340 345 350

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

355 360 365

Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly

370 375 380

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly

385 390 395 400

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr

405 410 415

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

420 425 430

Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln

435 440 445

Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val

450 455 460

Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

465 470 475 480

Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

485 490 495

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

500 505 510

Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His Arg Arg Lys Arg Glu

515 520 525

Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

530 535 540

Pro Met Asn Gln Thr Ala Ile Leu Ile Cys Cys Leu Ile Phe Leu Thr

545 550 555 560

Leu Ser Gly Ile Gln Gly Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr

565 570 575

Cys Ile Ser Ile Ser Asn Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys

580 585 590

Leu Glu Ile Ile Pro Ala Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile

595 600 605

Ala Thr Met Lys Lys Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser

610 615 620

Lys Ala Ile Lys Asn Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Lys

625 630 635 640

Arg Ser Pro

<210> 56

<211> 575

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-IL15-SL

<400> 56

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys

20 25 30

Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile

35 40 45

Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly

50 55 60

Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg

65 70 75 80

Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser

85 90 95

Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser Asp Ile

130 135 140

Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val

145 150 155 160

Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met

165 170 175

His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

180 185 190

Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp

195 200 205

Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

210 215 220

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

225 230 235 240

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

245 250 255

Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala

275 280 285

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala

290 295 300

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr

305 310 315 320

Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val

325 330 335

Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

370 375 380

Lys His His His His His His Arg Arg Lys Arg Glu Gly Arg Gly Ser

385 390 395 400

Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Arg Ile

405 410 415

Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu

420 425 430

Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His Val Phe Ile

435 440 445

Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val

450 455 460

Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met

465 470 475 480

His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys

485 490 495

Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser

500 505 510

Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile

515 520 525

Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser

530 535 540

Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe

545 550 555 560

Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser

565 570 575

<210> 57

<211> 580

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-IL15-LL

<400> 57

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys

20 25 30

Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile

35 40 45

Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly

50 55 60

Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg

65 70 75 80

Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser

85 90 95

Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

145 150 155 160

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

165 170 175

Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn

195 200 205

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser

210 215 220

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu

275 280 285

Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

290 295 300

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln

305 310 315 320

Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys

325 330 335

Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

340 345 350

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

355 360 365

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly

370 375 380

Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His Arg Arg Lys Arg

385 390 395 400

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

405 410 415

Gly Pro Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln

420 425 430

Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly

435 440 445

Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr

450 455 460

Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp

465 470 475 480

Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp

485 490 495

Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu

500 505 510

Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr

515 520 525

Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly

530 535 540

Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys

545 550 555 560

Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe

565 570 575

Ile Asn Thr Ser

580

<210> 58

<211> 1017

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-IL12-SL

<400> 58

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys

20 25 30

Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile

35 40 45

Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly

50 55 60

Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg

65 70 75 80

Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser

85 90 95

Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser Asp Ile

130 135 140

Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val

145 150 155 160

Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met

165 170 175

His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

180 185 190

Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp

195 200 205

Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

210 215 220

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

225 230 235 240

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

245 250 255

Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala

275 280 285

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala

290 295 300

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr

305 310 315 320

Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val

325 330 335

Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

370 375 380

Lys His His His His His His Arg Arg Lys Arg Glu Gly Arg Gly Ser

385 390 395 400

Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Trp Pro

405 410 415

Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala Ala Thr Gly

420 425 430

Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg Leu Ser Met

435 440 445

Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu Asp

450 455 460

His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly

465 470 475 480

Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser

485 490 495

Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr

500 505 510

Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr

515 520 525

Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu

530 535 540

Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser

545 550 555 560

Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu

565 570 575

Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu

580 585 590

Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala

595 600 605

Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val

610 615 620

Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile

625 630 635 640

Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile

645 650 655

Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Arg Arg Lys Arg Glu Gly

660 665 670

Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

675 680 685

Pro Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe

690 695 700

Leu Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr

705 710 715 720

Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val

725 730 735

Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp

740 745 750

Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val

755 760 765

Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu

770 775 780

Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile

785 790 795 800

Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr

805 810 815

Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp

820 825 830

Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser

835 840 845

Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu

850 855 860

Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val

865 870 875 880

Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro

885 890 895

Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr

900 905 910

Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys

915 920 925

Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser

930 935 940

Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu

945 950 955 960

Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp

965 970 975

Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn

980 985 990

Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp

995 1000 1005

Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser

1010 1015

<210> 59

<211> 1022

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-IL12-LL

<400> 59

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys

20 25 30

Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile

35 40 45

Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly

50 55 60

Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg

65 70 75 80

Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser

85 90 95

Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

145 150 155 160

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

165 170 175

Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn

195 200 205

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser

210 215 220

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu

275 280 285

Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

290 295 300

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln

305 310 315 320

Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys

325 330 335

Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

340 345 350

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

355 360 365

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly

370 375 380

Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His Arg Arg Lys Arg

385 390 395 400

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

405 410 415

Gly Pro Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro

420 425 430

Ala Ala Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln

435 440 445

Cys Arg Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr

450 455 460

Leu Val Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala

465 470 475 480

Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu

485 490 495

Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu

500 505 510

Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys

515 520 525

Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys

530 535 540

Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly

545 550 555 560

Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu

565 570 575

Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr

580 585 590

Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp

595 600 605

Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe

610 615 620

Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe

625 630 635 640

Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile

645 650 655

Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Arg

660 665 670

Arg Lys Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

675 680 685

Glu Asn Pro Gly Pro Pro Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp

690 695 700

Phe Ser Leu Val Phe Leu Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu

705 710 715 720

Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro

725 730 735

Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile

740 745 750

Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr

755 760 765

Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys

770 775 780

His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys

785 790 795 800

Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu

805 810 815

Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly

820 825 830

Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe

835 840 845

Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys

850 855 860

Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu

865 870 875 880

Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala

885 890 895

Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu

900 905 910

Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys

915 920 925

Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg

930 935 940

Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His

945 950 955 960

Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys

965 970 975

Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val

980 985 990

Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr

995 1000 1005

Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser

1010 1015 1020

<210> 60

<211> 511

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-CXCL10-SL

<400> 60

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys

20 25 30

Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile

35 40 45

Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly

50 55 60

Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg

65 70 75 80

Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser

85 90 95

Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser Asp Ile

130 135 140

Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val

145 150 155 160

Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met

165 170 175

His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

180 185 190

Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp

195 200 205

Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

210 215 220

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

225 230 235 240

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

245 250 255

Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala

275 280 285

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala

290 295 300

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr

305 310 315 320

Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val

325 330 335

Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

370 375 380

Lys His His His His His His Arg Arg Lys Arg Glu Gly Arg Gly Ser

385 390 395 400

Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asn Gln

405 410 415

Thr Ala Ile Leu Ile Cys Cys Leu Ile Phe Leu Thr Leu Ser Gly Ile

420 425 430

Gln Gly Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys Ile Ser Ile

435 440 445

Ser Asn Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Glu Ile Ile

450 455 460

Pro Ala Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala Thr Met Lys

465 470 475 480

Lys Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala Ile Lys

485 490 495

Asn Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Lys Arg Ser Pro

500 505 510

<210> 61

<211> 516

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-CXCL10-LL

<400> 61

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys

20 25 30

Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile

35 40 45

Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly

50 55 60

Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg

65 70 75 80

Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser

85 90 95

Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

145 150 155 160

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

165 170 175

Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn

195 200 205

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser

210 215 220

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu

275 280 285

Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

290 295 300

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln

305 310 315 320

Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys

325 330 335

Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

340 345 350

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

355 360 365

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly

370 375 380

Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His Arg Arg Lys Arg

385 390 395 400

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

405 410 415

Gly Pro Met Asn Gln Thr Ala Ile Leu Ile Cys Cys Leu Ile Phe Leu

420 425 430

Thr Leu Ser Gly Ile Gln Gly Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys

435 440 445

Thr Cys Ile Ser Ile Ser Asn Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu

450 455 460

Lys Leu Glu Ile Ile Pro Ala Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile

465 470 475 480

Ile Ala Thr Met Lys Lys Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu

485 490 495

Ser Lys Ala Ile Lys Asn Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser

500 505 510

Lys Arg Ser Pro

515

<210> 62

<211> 698

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора PDL1-CD3-IL15

<400> 62

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

165 170 175

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys

195 200 205

Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly

245 250 255

Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

260 265 270

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

275 280 285

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln

290 295 300

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe

305 310 315 320

Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

325 330 335

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

340 345 350

Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly

355 360 365

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

370 375 380

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

405 410 415

Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

420 425 430

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr

435 440 445

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr

450 455 460

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

465 470 475 480

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp

485 490 495

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala His His His His

500 505 510

His His Arg Arg Lys Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly

515 520 525

Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu

530 535 540

Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His

545 550 555 560

Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser

565 570 575

Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp

580 585 590

Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr

595 600 605

Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met

610 615 620

Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp

625 630 635 640

Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn

645 650 655

Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys

660 665 670

Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val

675 680 685

His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser

690 695

<210> 63

<211> 1140

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора PDL1-CD3-IL12

<400> 63

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

165 170 175

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys

195 200 205

Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly

245 250 255

Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

260 265 270

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

275 280 285

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln

290 295 300

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe

305 310 315 320

Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

325 330 335

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

340 345 350

Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly

355 360 365

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

370 375 380

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

405 410 415

Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

420 425 430

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr

435 440 445

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr

450 455 460

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

465 470 475 480

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp

485 490 495

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala His His His His

500 505 510

His His Arg Arg Lys Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly

515 520 525

Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser

530 535 540

Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala

545 550 555 560

Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser

565 570 575

Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala

580 585 590

Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu

595 600 605

His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys

610 615 620

Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp

625 630 635 640

His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu

645 650 655

Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr

660 665 670

Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe

675 680 685

Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr

690 695 700

Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys

705 710 715 720

Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu

725 730 735

Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser

740 745 750

Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu

755 760 765

Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser

770 775 780

Tyr Leu Asn Ala Ser Arg Arg Lys Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu

785 790 795 800

Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Pro Met Cys His Gln

805 810 815

Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu Ala Ser Pro Leu

820 825 830

Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp

835 840 845

Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr

850 855 860

Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val

865 870 875 880

Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp

885 890 895

Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser

900 905 910

Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile

915 920 925

Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu

930 935 940

Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile

945 950 955 960

Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp

965 970 975

Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val

980 985 990

Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp

995 1000 1005

Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met

1010 1015 1020

Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser

1025 1030 1035

Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu

1040 1045 1050

Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp

1055 1060 1065

Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu

1070 1075 1080

Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys

1085 1090 1095

Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg

1100 1105 1110

Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser

1115 1120 1125

Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser

1130 1135 1140

<210> 64

<211> 634

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора PDL1-CD3-CXCL10

<400> 64

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

165 170 175

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys

195 200 205

Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly

245 250 255

Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

260 265 270

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

275 280 285

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln

290 295 300

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe

305 310 315 320

Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

325 330 335

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

340 345 350

Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly

355 360 365

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

370 375 380

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

405 410 415

Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

420 425 430

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr

435 440 445

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr

450 455 460

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

465 470 475 480

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp

485 490 495

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala His His His His

500 505 510

His His Arg Arg Lys Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly

515 520 525

Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asn Gln Thr Ala Ile Leu Ile

530 535 540

Cys Cys Leu Ile Phe Leu Thr Leu Ser Gly Ile Gln Gly Val Pro Leu

545 550 555 560

Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys Ile Ser Ile Ser Asn Gln Pro Val

565 570 575

Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Glu Ile Ile Pro Ala Ser Gln Phe

580 585 590

Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala Thr Met Lys Lys Lys Gly Glu Lys

595 600 605

Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala Ile Lys Asn Leu Leu Lys Ala

610 615 620

Val Ser Lys Glu Arg Ser Lys Arg Ser Pro

625 630

<210> 65

<211> 1120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-MMP9-SL

<400> 65

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys

20 25 30

Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile

35 40 45

Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly

50 55 60

Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg

65 70 75 80

Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser

85 90 95

Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser Asp Ile

130 135 140

Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val

145 150 155 160

Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met

165 170 175

His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

180 185 190

Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp

195 200 205

Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

210 215 220

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

225 230 235 240

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

245 250 255

Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala

275 280 285

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala

290 295 300

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr

305 310 315 320

Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val

325 330 335

Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

370 375 380

Lys His His His His His His Arg Arg Lys Arg Glu Gly Arg Gly Ser

385 390 395 400

Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Leu

405 410 415

Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Cys Cys Phe Ala

420 425 430

Ala Pro Arg Gln Arg Gln Ser Thr Leu Val Leu Phe Pro Gly Asp Leu

435 440 445

Arg Thr Asn Leu Thr Asp Arg Gln Leu Ala Glu Glu Tyr Leu Tyr Arg

450 455 460

Tyr Gly Tyr Thr Arg Val Ala Glu Met Arg Gly Glu Ser Lys Ser Leu

465 470 475 480

Gly Pro Ala Leu Leu Leu Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu Pro Glu Thr

485 490 495

Gly Glu Leu Asp Ser Ala Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr Pro Arg Cys

500 505 510

Gly Val Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Leu Lys

515 520 525

Trp His His His Asn Ile Thr Tyr Trp Ile Gln Asn Tyr Ser Glu Asp

530 535 540

Leu Pro Arg Ala Val Ile Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala Phe Ala Leu

545 550 555 560

Trp Ser Ala Val Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr Ser Arg Asp

565 570 575

Ala Asp Ile Val Ile Gln Phe Gly Val Ala Glu His Gly Asp Gly Tyr

580 585 590

Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly

595 600 605

Pro Gly Ile Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Leu Trp Ser

610 615 620

Leu Gly Lys Gly Val Val Val Pro Thr Arg Phe Gly Asn Ala Asp Gly

625 630 635 640

Ala Ala Cys His Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Ala

645 650 655

Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Leu Pro Trp Cys Ser Thr Thr

660 665 670

Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly Phe Cys Pro Ser Glu Arg

675 680 685

Leu Tyr Thr Arg Asp Gly Asn Ala Asp Gly Lys Pro Cys Gln Phe Pro

690 695 700

Phe Ile Phe Gln Gly Gln Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg

705 710 715 720

Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Arg Asp

725 730 735

Lys Leu Phe Gly Phe Cys Pro Thr Arg Ala Asp Ser Thr Val Met Gly

740 745 750

Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val Phe Pro Phe Thr Phe Leu Gly

755 760 765

Lys Glu Tyr Ser Thr Cys Thr Ser Glu Gly Arg Gly Asp Gly Arg Leu

770 775 780

Trp Cys Ala Thr Thr Ser Asn Phe Asp Ser Asp Lys Lys Trp Gly Phe

785 790 795 800

Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe

805 810 815

Gly His Ala Leu Gly Leu Asp His Ser Ser Val Pro Glu Ala Leu Met

820 825 830

Tyr Pro Met Tyr Arg Phe Thr Glu Gly Pro Pro Leu His Lys Asp Asp

835 840 845

Val Asn Gly Ile Arg His Leu Tyr Gly Pro Arg Pro Glu Pro Glu Pro

850 855 860

Arg Pro Pro Thr Thr Thr Thr Pro Gln Pro Thr Ala Pro Pro Thr Val

865 870 875 880

Cys Pro Thr Gly Pro Pro Thr Val His Pro Ser Glu Arg Pro Thr Ala

885 890 895

Gly Pro Thr Gly Pro Pro Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Thr Ala

900 905 910

Gly Pro Ser Thr Ala Thr Thr Val Pro Leu Ser Pro Val Asp Asp Ala

915 920 925

Cys Asn Val Asn Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly Asn Gln Leu

930 935 940

Tyr Leu Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu Gly Arg Gly

945 950 955 960

Ser Arg Pro Gln Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp Pro Ala Leu

965 970 975

Pro Arg Lys Leu Asp Ser Val Phe Glu Glu Pro Leu Ser Lys Lys Leu

980 985 990

Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly Ala Ser Val

995 1000 1005

Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala Asp Val

1010 1015 1020

Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met Leu

1025 1030 1035

Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln

1040 1045 1050

Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser Glu Val Asp Arg Met Phe Pro

1055 1060 1065

Gly Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val Phe Gln Tyr Arg Glu Lys

1070 1075 1080

Ala Tyr Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp Arg Val Ser Ser Arg

1085 1090 1095

Ser Glu Leu Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr Val Thr Tyr Asp

1100 1105 1110

Ile Leu Gln Cys Pro Glu Asp

1115 1120

<210> 66

<211> 1125

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-MMP9-LL

<400> 66

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys

20 25 30

Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile

35 40 45

Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly

50 55 60

Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg

65 70 75 80

Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser

85 90 95

Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

145 150 155 160

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

165 170 175

Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn

195 200 205

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser

210 215 220

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu

275 280 285

Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

290 295 300

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln

305 310 315 320

Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys

325 330 335

Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

340 345 350

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

355 360 365

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly

370 375 380

Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His Arg Arg Lys Arg

385 390 395 400

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

405 410 415

Gly Pro Met Ser Leu Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu

420 425 430

Gly Cys Cys Phe Ala Ala Pro Arg Gln Arg Gln Ser Thr Leu Val Leu

435 440 445

Phe Pro Gly Asp Leu Arg Thr Asn Leu Thr Asp Arg Gln Leu Ala Glu

450 455 460

Glu Tyr Leu Tyr Arg Tyr Gly Tyr Thr Arg Val Ala Glu Met Arg Gly

465 470 475 480

Glu Ser Lys Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Leu Leu Gln Lys Gln Leu

485 490 495

Ser Leu Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala Thr Leu Lys Ala Met

500 505 510

Arg Thr Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe

515 520 525

Glu Gly Asp Leu Lys Trp His His His Asn Ile Thr Tyr Trp Ile Gln

530 535 540

Asn Tyr Ser Glu Asp Leu Pro Arg Ala Val Ile Asp Asp Ala Phe Ala

545 550 555 560

Arg Ala Phe Ala Leu Trp Ser Ala Val Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg

565 570 575

Val Tyr Ser Arg Asp Ala Asp Ile Val Ile Gln Phe Gly Val Ala Glu

580 585 590

His Gly Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His

595 600 605

Ala Phe Pro Pro Gly Pro Gly Ile Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp

610 615 620

Asp Glu Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly Val Val Val Pro Thr Arg Phe

625 630 635 640

Gly Asn Ala Asp Gly Ala Ala Cys His Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly

645 650 655

Arg Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Leu Pro

660 665 670

Trp Cys Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly Phe

675 680 685

Cys Pro Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Arg Asp Gly Asn Ala Asp Gly Lys

690 695 700

Pro Cys Gln Phe Pro Phe Ile Phe Gln Gly Gln Ser Tyr Ser Ala Cys

705 710 715 720

Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala

725 730 735

Asn Tyr Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly Phe Cys Pro Thr Arg Ala Asp

740 745 750

Ser Thr Val Met Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val Phe Pro

755 760 765

Phe Thr Phe Leu Gly Lys Glu Tyr Ser Thr Cys Thr Ser Glu Gly Arg

770 775 780

Gly Asp Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Asn Phe Asp Ser Asp

785 790 795 800

Lys Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val

805 810 815

Ala Ala His Glu Phe Gly His Ala Leu Gly Leu Asp His Ser Ser Val

820 825 830

Pro Glu Ala Leu Met Tyr Pro Met Tyr Arg Phe Thr Glu Gly Pro Pro

835 840 845

Leu His Lys Asp Asp Val Asn Gly Ile Arg His Leu Tyr Gly Pro Arg

850 855 860

Pro Glu Pro Glu Pro Arg Pro Pro Thr Thr Thr Thr Pro Gln Pro Thr

865 870 875 880

Ala Pro Pro Thr Val Cys Pro Thr Gly Pro Pro Thr Val His Pro Ser

885 890 895

Glu Arg Pro Thr Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Ser Ala Gly Pro Thr

900 905 910

Gly Pro Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr Ala Thr Thr Val Pro Leu Ser

915 920 925

Pro Val Asp Asp Ala Cys Asn Val Asn Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu

930 935 940

Ile Gly Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Trp Arg Phe

945 950 955 960

Ser Glu Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp

965 970 975

Lys Trp Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Val Phe Glu Glu Pro

980 985 990

Leu Ser Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr

995 1000 1005

Thr Gly Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly

1010 1015 1020

Leu Gly Ala Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Arg Ser Gly

1025 1030 1035

Arg Gly Lys Met Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu Trp Arg Phe

1040 1045 1050

Asp Val Lys Ala Gln Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser Glu Val

1055 1060 1065

Asp Arg Met Phe Pro Gly Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val Phe

1070 1075 1080

Gln Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp

1085 1090 1095

Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu Asn Gln Val Asp Gln Val Gly

1100 1105 1110

Tyr Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys Pro Glu Asp

1115 1120 1125

<210> 67

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий конструкцию биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-PDL1-CD3-Fc-SL

<400> 67

atggaaaccg atacacttct gttgtgggtg ctgctgctgt gggtccctgg ttcaacaggc 60

gattatccct acgatgtgcc cgactacgca ggcgctcagc cagctgatga tatccagatg 120

acacagagcc catcatctct gtctgcaagc gtaggagacc gagtcaccat tacatgcaga 180

gcctcccaag acgtttccac agcagtggcc tggtatcagc aaaaacctgg taaggcgccc 240

aagcttctca tctattcagc cagttttctg tatagcggcg ttcccagccg attctctggc 300

tctggatccg gcacggactt tactttgaca atttcctctc ttcagcccga agattttgca 360

acctactact gtcagcaata tctctaccat ccagccacat tcggacaggg caccaaagtc 420

gaaatcaaaa gaggcggcgg cggcagtggc ggcgggggtt caggaggcgg gggttctgaa 480

gtgcaactcg ttgaaagcgt aggagggctt gtccaacctg gcgggtcact gcggttgagc 540

tgcgccgcaa gcggattcac cttctcagac tcttggatcc attgggtgcg ccaggctccc 600

ggaaaaggct tggaatgggt tgcttggatt tcaccgtatg gcggttccac atactacgct 660

gacagcgtta agggtcgatt caccatctct gcagatactt caaaaaacac agcctacctt 720

cagatgaata gtttgcgcgc cgaggacaca gcggtttatt attgtgccct aagacattgg 780

cccggcggtt tcgactactg ggggcaaggt acgttggtga ctgtgagcgc cgtagatgaa 840

gcaaaatctt gtgacaaaac ccatacctgc ccaccatgcc cagccccaga acttcttggc 900

gtaccctctg tcttcctttt ccctccgaag cccaaggata ccctgatgat cagccgaacc 960

ccggaggtaa catgtgtggt ggtcgatgtt agccatgagg atcctgaagt caaatttaac 1020

tggtatgtag acggtgttga ggtgcacaac gctaaaacta agcccaggga ggagcagtac 1080

aactcaacct atcgcgtcgt atctgtgctt accgtcctgc atcaagactg gctcaatggt 1140

aaggaatata aatgtaaagt gagtaacaag gcactgccag cacctatcga aaaaaccatc 1200

tcaaaggcga agggacagcc cagggaaccc caggtctata ctctgcaacc ttctcgggat 1260

gaattgacca agaaccaagt tagcctgaca tgtctggtga aaggtttcta tccaagcgat 1320

atagctgtcg agtgggagtc caatggccaa cctgagaaca attataagac caccccaccc 1380

gttctggaca gcgacggatc ctttttcctg tactcaaaac tcactgtcga taaatcaaga 1440

tggcaacaag gcaacgtttt tagctgtagc gtgatgcacg aagcacttca taatcactat 1500

acacagaagt cactctctct ttctccagga aaggttgacg aacagaaatt gatatccgag 1560

gaagatctca ataggaggaa gagagaaggc agggggagcc ttctcacttg cggcgatgtc 1620

gaggaaaatc cggggcctat ggagaccgat accctgctct tgtgggtttt gcttctttgg 1680

gtgccaggat ctacaggtga tgaagaagaa ttgcagatca tccaaccaga caaatccgta 1740

ctcgtggccg caggagagac cgctaccctc agatgtacca tcacttctct cttccccgtt 1800

ggccccatcc agtggtttcg aggcgcagga ccaggacgag tgcttattta caatcaacga 1860

cagggcccat tcccaagagt gacaacagta tccgatacca ccaagcgcaa taatatggac 1920

tttagcatta gaatcggcaa cataacaccc gctgacgccg gtacatacta ttgtattaaa 1980

tttcgaaagg gctcaccaga cgacgtggaa tttaagtcag gggccggaac cgaactctca 2040

gttagagcaa aaccttctgc tagcgacatc aagctgcagc agagcggcgc cgagctggcc 2100

aggcccggcg ccagcgtgaa gatgagctgc aagaccagcg gctacacctt caccaggtac 2160

accatgcact gggtgaagca gaggcccggc cagggcctgg agtggatcgg ctacatcaac 2220

cccagcaggg gctacaccaa ctacaaccag aagttcaagg acaaggccac cctgaccacc 2280

gacaagagca gcagcaccgc ctacatgcag ctgagcagcc tgaccagcga ggacagcgcc 2340

gtgtactact gcgccaggta ctacgacgac cactactgcc tggactactg gggccagggc 2400

accaccctga ccgtgagcag cgtggagggc ggcagcggcg gcagcggcgg cagcggcggc 2460

agcggcggcg tggacgacat ccagctgacc cagagccccg ccatcatgag cgccagcccc 2520

ggcgagaagg tgaccatgac ctgcagggcc agcagcagcg tgagctacat gaactggtac 2580

cagcagaaga gcggcaccag ccccaagagg tggatctacg acaccagcaa ggtggccagc 2640

ggcgtgccct acaggttcag cggcagcggc agcggcacca gctacagcct gaccatcagc 2700

agcatggagg ccgaggacgc cgccacctac tactgccagc agtggagcag caaccccctg 2760

acctccggcg ccggcaccaa gctggagctg aagcaccacc atcatcacca ctga 2814

<210> 68

<211> 937

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-PDL1-CD3-Fc-SL

<400> 68

Met Glu Thr Asp Arg Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala

20 25 30

Gln Pro Ala Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

35 40 45

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp

50 55 60

Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

65 70 75 80

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

85 90 95

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

100 105 110

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu

115 120 125

Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

165 170 175

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp

180 185 190

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

195 200 205

Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

210 215 220

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

225 230 235 240

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

245 250 255

Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

260 265 270

Val Thr Val Ser Ala Val Asp Glu Ala Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

275 280 285

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

290 295 300

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

305 310 315 320

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

325 330 335

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

340 345 350

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

355 360 365

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

370 375 380

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

385 390 395 400

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

405 410 415

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

420 425 430

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

435 440 445

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

450 455 460

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

465 470 475 480

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

485 490 495

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val

500 505 510

Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Arg Lys Arg

515 520 525

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

530 535 540

Gly Pro Met Glu Thr Asp Arg Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp

545 550 555 560

Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro

565 570 575

Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys

580 585 590

Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly

595 600 605

Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe

610 615 620

Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp

625 630 635 640

Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr

645 650 655

Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys

660 665 670

Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser

675 680 685

Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

690 695 700

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

705 710 715 720

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

725 730 735

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

740 745 750

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

755 760 765

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

770 775 780

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

785 790 795 800

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

805 810 815

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser

820 825 830

Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys

835 840 845

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser

850 855 860

Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser

865 870 875 880

Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

885 890 895

Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

900 905 910

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

915 920 925

Glu Leu Lys His His His His His His

930 935

<210> 69

<211> 2829

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный полинуклеотид, кодирующий конструкцию биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-PDL1-CD3-Fc-LL

<400> 69

atggaaaccg atacacttct gttgtgggtg ctgctgctgt gggtccctgg ttcaacaggc 60

gattatccct acgatgtgcc cgactacgca ggcgctcagc cagctgatga tatccagatg 120

acacagagcc catcatctct gtctgcaagc gtaggagacc gagtcaccat tacatgcaga 180

gcctcccaag acgtttccac agcagtggcc tggtatcagc aaaaacctgg taaggcgccc 240

aagcttctca tctattcagc cagttttctg tatagcggcg ttcccagccg attctctggc 300

tctggatccg gcacggactt tactttgaca atttcctctc ttcagcccga agattttgca 360

acctactact gtcagcaata tctctaccat ccagccacat tcggacaggg caccaaagtc 420

gaaatcaaaa gaggcggcgg cggcagtggc ggcgggggtt caggaggcgg gggttctgaa 480

gtgcaactcg ttgaaagcgt aggagggctt gtccaacctg gcgggtcact gcggttgagc 540

tgcgccgcaa gcggattcac cttctcagac tcttggatcc attgggtgcg ccaggctccc 600

ggaaaaggct tggaatgggt tgcttggatt tcaccgtatg gcggttccac atactacgct 660

gacagcgtta agggtcgatt caccatctct gcagatactt caaaaaacac agcctacctt 720

cagatgaata gtttgcgcgc cgaggacaca gcggtttatt attgtgccct aagacattgg 780

cccggcggtt tcgactactg ggggcaaggt acgttggtga ctgtgagcgc cgtagatgaa 840

gcaaaatctt gtgacaaaac ccatacctgc ccaccatgcc cagccccaga acttcttggc 900

gtaccctctg tcttcctttt ccctccgaag cccaaggata ccctgatgat cagccgaacc 960

ccggaggtaa catgtgtggt ggtcgatgtt agccatgagg atcctgaagt caaatttaac 1020

tggtatgtag acggtgttga ggtgcacaac gctaaaacta agcccaggga ggagcagtac 1080

aactcaacct atcgcgtcgt atctgtgctt accgtcctgc atcaagactg gctcaatggt 1140

aaggaatata aatgtaaagt gagtaacaag gcactgccag cacctatcga aaaaaccatc 1200

tcaaaggcga agggacagcc cagggaaccc caggtctata ctctgcaacc ttctcgggat 1260

gaattgacca agaaccaagt tagcctgaca tgtctggtga aaggtttcta tccaagcgat 1320

atagctgtcg agtgggagtc caatggccaa cctgagaaca attataagac caccccaccc 1380

gttctggaca gcgacggatc ctttttcctg tactcaaaac tcactgtcga taaatcaaga 1440

tggcaacaag gcaacgtttt tagctgtagc gtgatgcacg aagcacttca taatcactat 1500

acacagaagt cactctctct ttctccagga aaggttgacg aacagaaatt gatatccgag 1560

gaagatctca ataggaggaa gagagaaggc agggggagcc ttctcacttg cggcgatgtc 1620

gaggaaaatc cggggcctat ggagaccgat accctgctct tgtgggtttt gcttctttgg 1680

gtgccaggat ctacaggtga tgaagaagaa ttgcagatca tccaaccaga caaatccgta 1740

ctcgtggccg caggagagac cgctaccctc agatgtacca tcacttctct cttccccgtt 1800

ggccccatcc agtggtttcg aggcgcagga ccaggacgag tgcttattta caatcaacga 1860

cagggcccat tcccaagagt gacaacagta tccgatacca ccaagcgcaa taatatggac 1920

tttagcatta gaatcggcaa cataacaccc gctgacgccg gtacatacta ttgtattaaa 1980

tttcgaaagg gctcaccaga cgacgtggaa tttaagtcag gggccggaac cgaactctca 2040

gttagagcaa aaccttctgc tagcggcggc ggcggcagcg acatcaagct gcagcagagc 2100

ggcgccgagc tggccaggcc cggcgccagc gtgaagatga gctgcaagac cagcggctac 2160

accttcacca ggtacaccat gcactgggtg aagcagaggc ccggccaggg cctggagtgg 2220

atcggctaca tcaaccccag caggggctac accaactaca accagaagtt caaggacaag 2280

gccaccctga ccaccgacaa gagcagcagc accgcctaca tgcagctgag cagcctgacc 2340

agcgaggaca gcgccgtgta ctactgcgcc aggtactacg acgaccacta ctgcctggac 2400

tactggggcc agggcaccac cctgaccgtg agcagcgtgg agggcggcag cggcggcagc 2460

ggcggcagcg gcggcagcgg cggcgtggac gacatccagc tgacccagag ccccgccatc 2520

atgagcgcca gccccggcga gaaggtgacc atgacctgca gggccagcag cagcgtgagc 2580

tacatgaact ggtaccagca gaagagcggc accagcccca agaggtggat ctacgacacc 2640

agcaaggtgg ccagcggcgt gccctacagg ttcagcggca gcggcagcgg caccagctac 2700

agcctgacca tcagcagcat ggaggccgag gacgccgcca cctactactg ccagcagtgg 2760

agcagcaacc ccctgacctt cggcgccggc accaagctgg agctgaagca ccaccaccac 2820

caccactag 2829

<210> 70

<211> 942

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная конструкция биспецифического привлекающего Т-клетки активатора SIRP1альфа-PDL1-CD3-Fc-LL

<400> 70

Met Glu Thr Asp Arg Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala

20 25 30

Gln Pro Ala Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

35 40 45

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp

50 55 60

Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

65 70 75 80

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

85 90 95

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

100 105 110

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu

115 120 125

Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

165 170 175

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp

180 185 190

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

195 200 205

Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

210 215 220

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

225 230 235 240

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

245 250 255

Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

260 265 270

Val Thr Val Ser Ala Val Asp Glu Ala Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

275 280 285

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

290 295 300

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

305 310 315 320

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

325 330 335

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

340 345 350

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

355 360 365

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

370 375 380

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

385 390 395 400

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

405 410 415

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

420 425 430

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

435 440 445

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

450 455 460

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

465 470 475 480

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

485 490 495

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val

500 505 510

Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Arg Lys Arg

515 520 525

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

530 535 540

Gly Pro Met Glu Thr Asp Arg Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp

545 550 555 560

Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro

565 570 575

Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys

580 585 590

Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly

595 600 605

Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe

610 615 620

Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp

625 630 635 640

Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr

645 650 655

Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys

660 665 670

Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Ser

675 680 685

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

690 695 700

Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr

705 710 715 720

Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

725 730 735

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn

740 745 750

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser

755 760 765

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

770 775 780

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp

785 790 795 800

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly

805 810 815

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile

820 825 830

Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys

835 840 845

Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp

850 855 860

Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr

865 870 875 880

Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

885 890 895

Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala

900 905 910

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly

915 920 925

Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His

930 935 940

<---

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен онколитический вирус простого герпеса (ВПГ), содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую привлекающий полипептид, причем указанный привлекающий полипептид содержит первый домен, специфичный в отношении антигена, экспрессированного на эффекторной клетке, и второй домен, специфичный в отношении антигена, экспрессированного на клетке-мишени, причем указанный антиген, экспрессированный на эффекторной клетке, представляет собой CD3, и причем указанный антиген, экспрессированный на клетке-мишени, представляет собой PDL1. Также представлена фармацевтическая композиция, содержащая указанный онколитический вирус. Кроме того, представлен способ лечения рака. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения рака. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 10 табл., 14 пр., 41 ил.

Формула