Композиция вакцины - RU2684211C2

Чертежи

Показать все 48 чертежа(ей)

Описание

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/767776, поданной 21 февраля 2013 года, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Настоящее изобретение относится к онколитическим вирусам для индукции иммунного ответа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Онколитические вирусы (ОВ) особым образом инфицируют, реплицируются в злокачественных клетках и уничтожают их, не поражая при этом здоровые ткани. Некоторые ОВ достигли поздних стадий клинической оценки лечения различных новообразований (Russell SJ. et al., (2012) Nat Biotechnol 30:658-670). После разрешения для применения такие вирусные агенты могли бы заменить или комбинироваться со стандартными видами терапии рака, и позволили бы снизить токсичность и повысить терапевтическую эффективность.

[0004] В дополнение к вирусу везикулярного стоматита (VSV) (Stojdl DF. et al., (2000) Nat Med 6:821-825; Stojdl DF. et al., (2003) Cancer Cell 4:263-275) недавно были описаны другие рабдовирусы, демонстрирующие онколитическую активность (Brun J. et al., (2010) Mol Ther 18:1440-1449; Mahoney DJ. et al., (2011) Cancer Cell 20:443-456). Среди них вирус Maraba, не представляющий собой VSV, демонстрировал широчайший онкотропизм in vitro (WO 2009/016433). Был сконструирован мутантный вирус Maraba с повышенной селективностью в отношении опухоли и сниженной вирулентностью в здоровых клетках. Указанный ослабленный штамм представляет собой двойной мутантный штамм, содержащий мутации как G-белка (Q242R), так и М-белка (L123W). In vivo данный ослабленный штамм, называемый MG1 или Maraba MG1, демонстрировал сильную противоопухолевую активность в ксенотрансплантатных и сингенных моделях опухолей у мышей с большей терапевтической эффективностью, чем ослабленный VSV, VSVΔM51 (WO 2011/070440).

[0005] Данные, накопленные за последние несколько лет, показали, что противоопухолевая эффективность онколитических вирусов зависит не только от их прямого онколизиса, но может также зависеть от их способности стимулировать противоопухолевый иммунитет (Bridle BW. et al., (2010) Mol Ther 184:4269-4275). Данный иммуноопосредуемый контроль опухоли, по-видимому, играет критическую роль в общей эффективности терапии ОВ. Действительно, клетки опухолеспецифического адаптивного иммунного ответа могут «патрулировать» ткани и разрушать клетки опухоли, которые были пропущены ОВ. Более того, их компартмент иммунологической памяти может предотвращать рецидив опухоли.

[0006] Были разработаны различные стратегии для повышения ОВ-индуцируемого противоопухолевого иммунитета (Pol J. et al., (2012) Virus Adaptation and Treatment 4:1-21). Несколькими группами исследователей методами генной инженерии был получен ОВ, экспрессирующий иммуностимулирующие цитокины. Вирус простого герпеса и вирус коровьей оспы, экспрессирующие гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), достигли соответственно III и IIB фазы клинической оценки терапии рака, тогда как VSV, экспрессирующий IFN-β, только вступил в I фазу.

[0007] Другая стратегия, определяемая как онколитическая вакцина, состоит из экспрессии опухолевого антигена из ОВ (Russell SJ. et al., (2012) Nat Biotechnol 30:658-670). Ранее было показано, что VSV можно также применять в качестве противоракового вакцинного вектора (Bridle BW. et al., (2010) Mol Ther 184:4269-4275). При применении в условиях гетерологичной вакцинации прайм-буст (prime-boost) для лечения модели меланомы у мышей, онколитическая вакцина на основе допахромтаутомеразы VSV человека (hDCT) индуцировала не только повышенный опухолеспецифический иммунитет к DCT, но также сопутствующее снижение противовирусного адаптивного иммунитета. В результате терапевтическая эффективность значительно повышалась с увеличением как средней, так и длительной выживаемости (WO 2010/105347). Хотя было показано, что VSV является эффективным при использовании hDCT в качестве опухолеассоциированного антигена, нет способа предсказать, какие опухолеассоциированные антигены будут эффективными в условиях гетерологичной вакцинации прайм-буст.

[0008] Желательным является получение вакцинного вектора, который можно применять для активации иммунной системы пациента для уничтожения клеток опухоли с пониженной токсичностью для здоровых тканей, например, путем активации антител и/или лимфоцитов против опухолеассоциированного антигена на опухоли. Желательно, чтобы такой вакцинный вектор демонстрировал как онколитическую активность, так и способность повышать адаптивный клеточный иммунитет.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Следующее краткое описание предназначено для ознакомления читателя с одним или более изобретениями, описанными в настоящем документе, но не для определения какого-либо из них.

[0010] Задачей настоящего изобретения является устранение или ограничение по меньшей мере одного из недостатков предыдущих противораковых вакцин.

[0011] Авторы настоящего изобретения неожиданно установили, что MAGEA3, гибридный белок Е6/Е7 вируса папилломы человека, белок, представляющий собой шести-трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы человека, и раково-тестикулярныйантиген 1 можно применять в условиях гетерологичной вакцинации прайм-буст для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Данные результаты являются неожиданными и непрогнозируемыми, поскольку не все опухолеассоциированные антигены способны индуцировать иммунный ответ посредством гетерологичной вакцинации прайм-буст. Например, авторы настоящего изобретения также установили, что плацентарный белок 1 (PLAC-1) и ядерный антиген 1 вируса Эпштейна-Барр неспособны стимулировать иммунный ответ посредством гетерологичной вакцинации прайм-буст.

[0012] В соответствии с первым аспектом предложен набор для применения для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Указанный набор содержит: первый вирус, который экспрессирует белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или его вариант в качестве антигенного белка, и который включен в состав для выработки иммунитета к указанному белку или его варианту у млекопитающего. Набор также содержит вирус Maraba MG1, кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или его вариант в качестве антигенного белка, при этом указанный вирус Maraba MG1 включен в состав для индукции иммунного ответа у млекопитающего; при этом первый вирус иммунологически отличается от вируса Maraba MG1. Антигенный белок, экспрессируемый первым вирусом, и антигенный белок, экспрессируемый вирусом Maraba MG1, могут быть идентичными.

[0013] Первый вирус, вирус Maraba MG1 или оба вируса могут быть представлены в форме для введения в виде выделенных вирусов.

[0014] Вирус Maraba MG1 может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию трансгена, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. Вирус Maraba MG1 может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию кодон-оптимизированного трансгена, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3.

[0015] Первый вирус может содержать трансген, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или 3, или может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию трансгена, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или 3, в зависимости от того, является первый вирус вирусом, содержащим плюс-смысловую РНК, ДНК-вирусом или вирусом, содержащим минус-смысловую РНК.

[0016] Указанные два вируса могут быть способны экспрессировать разные варианты белка, содержащего последовательность SEQ ID NO: 1. Вариант белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, который экспрессируется первым вирусом, вирусом Maraba MG1 или обоими вирусами, может содержать по меньшей мере один опухолеассоциированный эпитоп, выбранный из группы, состоящей из: FLWGPRALV, KVAELVHFL, EGDCAPEEK, KKLLTQHFVQENYLEY, RKVAELVHFLLLKYR и KKLLTQHFVQENYLEY, и быть по меньшей мере на 70% идентичным последовательности SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 80% идентичен последовательности SEQ ID NO: 1. Более предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO: 1. Еще более предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 95% идентичен последовательности SEQ ID NO: 1.

[0017] Вариант белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, который экспрессируется первым вирусом, вирусом Maraba MG1 или обоими вирусами, может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Нуклеотидная последовательность, которая кодирует указанный вариант, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5.

[0018] Вирус Maraba MG1 может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5. Первый вирус может содержать трансген, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, или может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию трансгена, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, в зависимости от того, является первый вирус вирусом, содержащим плюс-смысловую РНК, ДНК-вирусом или вирусом, содержащим минус-смысловую РНК.

[0019] Если первый вирус представляет собой вирус, содержащий минус-смысловую РНК, один из: либо вирус Maraba MG1, либо первый вирус может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2 или 3, а другой из вируса Maraba MG1 и первого вируса может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию последовательности SEQ ID NO: 5.

[0020] Если первый вирус представляет собой вирус, содержащий плюс-смысловую РНК, или ДНК-вирус, вирус Maraba MG1 может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2 или 3, а первый вирус может содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5. В качестве альтернативы, вирус Maraba MG1 может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, а первый вирус может содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или 3.

[0021] Один из: либо вирус Maraba MG1, либо первый вирус может быть способен экспрессировать белок, который содержит последовательность SEQ ID NO: 1 или 4, а другой из вируса Maraba MG1 и первого вируса может быть способен экспрессировать белок, который содержит другую последовательность.

[0022] Первый вирус может представлять собой аденовирус.

[0023] В соответствии с другим аспектом предложена выделенная вирусная частица Maraba MG1, содержащая геном, который кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или его вариант.

[0024] Вариант белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

[0025] Геном может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2 или 3.

[0026] Геном может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5.

[0027] Геном может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6.

[0028] В соответствии с другим аспектом предложен набор для применения для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Указанный набор содержит: первый вирус, который экспрессирует белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или его вариант в качестве антигенного белка, и который включен в состав для выработки иммунитета к указанному белку или его варианту у млекопитающего. Набор также содержит вирус Maraba MG1, кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или его вариант в качестве антигенного белка, при этом указанный вирус Maraba MG1 включен в состав для индукции иммунного ответа у млекопитающего; при этом первый вирус иммунологически отличается от вируса Maraba MG1. Антигенный белок, экспрессируемый первым вирусом, и антигенный белок, экспрессируемый вирусом Maraba MG1, могут быть идентичными.

[0029] Первый вирус, вирус Maraba MG1 или оба вируса могут быть представлены в форме для введения в виде выделенных вирусов.

[0030] Если первый вирус представляет собой вирус, содержащий минус-смысловую РНК, вирус Maraba MG1, первый вирус или оба вируса могут содержать обратно-комплементарную и РНК-версию кодон-оптимизированного трансгена, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8. Если первый вирус представляет собой ДНК-вирус или вирус, содержащий плюс-смысловую РНК, первый вирус может содержать кодон-оптимизированный трансген, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8.

[0031] Вариант белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, который экспрессируется первым вирусом, вирусом Maraba MG1 или обоими вирусами, может содержать по меньшей мере один опухолеассоциированный эпитоп и быть по меньшей мере на 70% идентичным последовательности SEQ ID NO: 7. Предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 80% идентичен последовательности SEQ ID NO: 7. Более предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO: 7. Еще более предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 95% идентичен последовательности SEQ ID NO: 7.

[0032] Один из: либо вирус Maraba MG1, либо первый вирус может быть способен экспрессировать белок, который содержит последовательность SEQ ID NO: 7, а другой из вируса Maraba MG1 и первого вируса может быть способен экспрессировать вариант белка, который содержит последовательность SEQ ID NO: 7. Указанные два вируса могут быть способны экспрессировать разные варианты белка, который содержит последовательность SEQ ID NO: 7.

[0033] Первый вирус может представлять собой лентивирус.

[0034] В соответствии с другим аспектом предложена выделенная вирусная частица Maraba MG1, содержащая геном, который кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или его вариант.

[0035] Геном может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 8.

[0036] Геном может содержать нуклеотидную последовательность, которая представляет собой обратно-комплементарную и РНК-версию SEQ ID NO: 9.

[0037] В соответствии с другим аспектом предложен набор для применения для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Указанный набор содержит: первый вирус, который экспрессирует белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или его вариант в качестве антигенного белка, и который включен в состав для выработки иммунитета к указанному белку или его варианту у млекопитающего. Набор также содержит вирус Maraba MG1, кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или его вариант в качестве антигенного белка, при этом указанный вирус Maraba MG1 включен в состав для индукции иммунного ответа у млекопитающего; при этом первый вирус иммунологически отличается от вируса Maraba MG1. Антигенный белок, экспрессируемый первым вирусом, и антигенный белок, экспрессируемый вирусом Maraba MG1, могут быть идентичными.

[0038] Первый вирус, вирус Maraba MG1 или оба вируса могут быть представлены в форме для введения в виде выделенных вирусов.

[0039] Если первый вирус представляет собой вирус, содержащий минус-смысловую РНК, вирус Maraba MG1, первый вирус или оба вируса могут содержать обратно-комплементарную и РНК-версию кодон-оптимизированного трансгена, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11. Если первый вирус представляет собой ДНК-вирус или вирус, содержащий плюс-смысловую РНК, первый вирус может содержать кодон-оптимизированный трансген, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11.

[0040] Вариант белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, который экспрессируется первым вирусом, вирусом Maraba MG1 или обоими вирусами, может содержать по меньшей мере один опухолеассоциированный эпитоп и быть по меньшей мере на 70% идентичным последовательности SEQ ID NO: 10. Предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 80% идентичен последовательности SEQ ID NO: 10. Более предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO: 10. Еще более предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 95% идентичен последовательности SEQ ID NO: 10.

[0041] Один из: либо вирус Maraba MG1, либо первый вирус может быть способен экспрессировать белок, который содержит последовательность SEQ ID NO: 10, а другой из вируса Maraba MG1 и первого вируса может быть способен экспрессировать вариант белка, который содержит последовательность SEQ ID NO: 10. Указанные два вируса могут быть способны экспрессировать разные варианты белка, который содержит последовательность SEQ ID NO: 10.

[0042] Первый вирус может представлять собой лентивирус.

[0043] В соответствии с другим аспектом предложена выделенная вирусная частица Maraba MG1, содержащая геном, который кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или его вариант.

[0044] Геном может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 11.

[0045] Геном может содержать нуклеотидную последовательность, которая представляет собой обратно-комплементарную и РНК-версию SEQ ID NO: 12.

[0046] В соответствии с другим аспектом предложен набор для применения для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Указанный набор содержит: первый вирус, который экспрессирует белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, или его вариант в качестве антигенного белка, и который включен в состав для выработки иммунитета к указанному белку или его варианту у млекопитающего. Набор также содержит вирус Maraba MG1, кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, или его вариант в качестве антигенного белка, при этом указанный вирус Maraba MG1 включен в состав для индукции иммунного ответа у млекопитающего; при этом первый вирус иммунологически отличается от вируса Maraba MG1. Антигенный белок, экспрессируемый первым вирусом, и антигенный белок, экспрессируемый вирусом Maraba MG1, могут быть идентичными.

[0047] Первый вирус, вирус Maraba MG1 или оба вируса могут быть представлены в форме для введения в виде выделенных вирусов.

[0048] Если первый вирус представляет собой вирус, содержащий минус-смысловую РНК, вирус Maraba MG1, первый вирус или оба вируса могут содержать обратно-комплементарную и РНК-версию кодон-оптимизированного трансгена, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14. Если первый вирус представляет собой ДНК-вирус или вирус, содержащий плюс-смысловую РНК, первый вирус может содержать кодон-оптимизированный трансген, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14.

[0049] Вариант белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, который экспрессируется первым вирусом, вирусом Maraba MG1 или обоими вирусами, может содержать по меньшей мере один опухолеассоциированный эпитоп и быть по меньшей мере на 70% идентичным последовательности SEQ ID NO: 13. Предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 80% идентичен последовательности SEQ ID NO: 13. Более предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO: 13. Еще более предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 95% идентичен последовательности SEQ ID NO: 13.

[0050] Один из: либо вирус Maraba MG1, либо первый вирус может быть способен экспрессировать белок, который содержит последовательность SEQ ID NO: 13, а другой из вируса Maraba MG1 и первого вируса может быть способен экспрессировать вариант белка, который содержит последовательность SEQ ID NO: 13. Указанные два вируса могут быть способны экспрессировать разные варианты белка, который содержит последовательность SEQ ID NO: 13.

[0051] Первый вирус может представлять собой лентивирус.

[0052] В соответствии с другим аспектом предложена выделенная вирусная частица Maraba MG1, содержащая геном, который кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, или его вариант.

[0053] Геном может включать обратно-комплементарную и РНК-версию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 14.

[0054] Геном может включать нуклеотидную последовательность, которая представляет собой обратно-комплементарную и РНК-версию SEQ ID NO: 15.

[0055] Другие аспекты и признаки настоящего изобретения станут очевидными для специалиста в данной области техники после рассмотрения следующего описания конкретных вариантов реализации в сочетании с прилагаемыми фигурами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0056] Варианты реализации настоящего изобретения далее будут описаны со ссылкой на прилагаемые фигуры и только в качестве примера.

[0057] На фиг. 1А показаны ответы CD8⁺ или CD4⁺ Т-клеток у мышей, являющихся носителями опухолей, которым вводили MG1-hDCT.

[0058] На фиг. 1B показана терапевтическая эффективность MG1-hDCT, вводимого в качестве только примирующего вектора в модели метастатического рака легкого у мышей.

[0059] На фиг. 2 показано сравнение иммунного ответа в результате вакцинации прайм-буст у мышей С57/В16 с использованием Ad-hDCT в качестве примирующего вектора и либо Maraba MG1-hDCT, либо VSV-hDCT в качестве бустер-вектора.

[0060] На фиг. 3 показан ответ Т-клеток в модели метастатического рака легкого у мышей после введения только Ad-empty или Ad-hDCT в качестве примирующего вектора или после вакцинации прайм-буст с использованием Ad-hDCT в качестве примирующего вектора и либо Maraba MG1 GFP, либо Maraba MG1-hDCT в качестве бустер-вектора.

[0061] На фиг. 4 показан график выживаемости в модели метастатического рака легкого у мышей после введения только Ad-empty или Ad-hDCT в качестве примирующего вектора или после вакцинации прайм-буст с использованием Ad-hDCT в качестве примирующего вектора и либо Maraba MG1 GFP, либо Maraba MG1-hDCT в качестве бустер-вектора.

[0062] На фиг. 5 показан график выживаемости в модели метастатического рака головного мозга у мышей после введения только Ad-empty или Ad-hDCT в качестве примирующего вектора или после вакцинации прайм-буст с использованием Ad-hDCT в качестве примирующего вектора и Maraba MG1-hDCT в качестве бустер-вектора.

[0063] Фиг. 6 представляет собой схему стратегии с примирующим вектором Ad-MAGEA3, бустер-вектором Maraba MG1-MAGEA3 и стратегии прайм-буст, используемой в исследовании токсичности/иммуногенности у приматов.

[0064] На фиг. 7 показан усредненный ответ Т-клеток у приматов, которым вводили Ad-MAGEA3 в качестве примирующего вектора и высокую или низкую дозу MG1-MAGEA3 в качестве бустер-вектора. Ответы Т-клеток определяли через 5, 13 и 84 дня после введения бустер-вектора.

[0065] На фиг. 8 показаны ответы Т-клеток у отдельных приматов, которым вводили Ad-MAGEA3 в качестве примирующего вектора и MG1-MAGEA3 в качестве бустер-вектора, через 5 дней после введения бустер-вектора. Ответы Т-клеток стратифицировали относительно пептидного пула MAGEA3, используемого для стимуляции ответа.

[0066] На фиг. 9 показан график выживаемости в модели метастатического рака легкого у мышей после введения Ad-hDCT относительно Ad-hDCT плюс циклофосфамид в качестве только примирующего вектора или после вакцинации прайм-буст с использованием Ad-hDCT относительно Ad-hDCT плюс циклофосфамид в качестве примирующего вектора и VSV-hDCT в качестве бустер-вектора.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0067] Согласно настоящему изобретению предложен набор для применения для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Указанный набор содержит первый вирус, который экспрессирует MAGEA3, гибридный белок Е6/Е7 вируса папилломы человека, белок, представляющий собой шести-трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы человека, или раково-тестикулярныйантиген 1, или его вариант в качестве антигена и который включен в состав для выработки иммунитета к указанному антигену у млекопитающего. Набор также содержит вирус Maraba MG1, кодирующий такой же антиген или вариант такого же антигена, при этом указанный вирус Maraba MG1 включен в состав для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Первый вирус иммунологически отличается от вируса Maraba MG1, так что он может выступать в качестве «примирующего вируса» при гетерологичной вакцинации прайм-буст.

[0068] Иммунизацию прайм:буст можно осуществлять с помощью несовпадающих способов доставки вакцины при использовании одного и того же антигена, в «гетерологичном» формате прайм-буст; или с помощью совпадающих способов доставки вакцины, в «гомологичном» формате прайм-буст. Гетерологичные способы прайм-буст являются предпочтительными при использовании платформ на основе векторных вакцин, поскольку гомологичная вакцинация приведет к бустированию ответов как на вектор, так и на трансген во вторичном ответе. Гетерологичная система, напротив, фокусирует вторичный ответ (т.е. бустированный ответ) на антигене, поскольку ответы на первый и второй вектор являются первичными ответами и, следовательно, гораздо менее устойчивыми.

[0069] В настоящем изобретении первый вирус и вирус Maraba MG1 применяют в гетерологичном формате прайм-буст.

[0070] Антигенные белки, перечисленные выше, представляют собой аутоантигены, уже толеризованные иммунной системой в результате жестко контролируемого процесса негативной селекции в тимусе (Kruisbeek AM and Amsen D, (1996) Curr Opin Immunol 8:233-244; Stockinger В (1999) Adv Immunol 71:229-265) или периферической толеризации. Главной задачей в случае разработки вакцин для данных антигенных белков и любых других аутоантигенов является индукция сильного иммунного ответа, направленного селективно на раковые клетки. Хотя был обнаружен ряд опухолеассоциированных антигенных пептидов, авторы настоящего изобретения установили, что невозможно предсказать какие опухолеассоциированные антигенные пептиды можно успешно применять для разработки вакцин.

[0071] Антиген меланомы, семейство А,3 (MAGEA3) представляет собой «раково-тестикулярный антиген». MAGE-семейство генов, кодирующих опухолеспецифические антигены, рассмотрено в De Plaen et al., Immunogenetics 40:360-369 (1994), MAGEA3 экспрессируется в широком спектре опухолей, включая меланому, опухоль толстой и прямой кишки, и легкого. Авторы настоящего изобретения использовали данный белок в качестве антигенного белка как в первом вирусе, так и в вирусе Maraba MG1. Авторы настоящего изобретения также использовали вариант белка MAGEA3 в качестве антигенного белка как в первом вирусе, так и в вирусе Maraba MG1.

[0072] Онкобелки Е6/Е7 вируса папилломы человека (HPV) конструктивно экспрессируются при раке шейки матки (Zur Hausen, H (1996) Biochem Biophys Acta 1288:F55-F78). Кроме того, 16 и 18 типы HPV являются причиной 75% случаев рака шейки матки (Walboomers JM (1999) J Pathol 189:12-19). Авторы настоящего изобретения использовали гибридный белок онкобелков Е6/Е7 HPV 16 и 18 типов в качестве антигенного белка. Указанный гибридный белок экспрессировали с использованием нуклеотидной последовательности, коэкспрессирующей Е6/Е7 HPV 16/18 типа в виде гибридного белка, который подвергали мутациям с устранением онкогенного потенциала. Авторы настоящего изобретения использовали указанный гибридный белок в качестве антигенного белка как в первом вирусе, так и в вирусе Maraba MG1.

[0073] Шести-трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы (huSTEAP) представляет собой недавно идентифицированный белок, который, как было показано, сверхэкспрессируется при раке предстательной железы и подвергается повышающей регуляции в нескольких линиях раковых клеток, включая рак поджелудочной железы, толстой кишки, молочной железы, яичка, шейки матки, мочевого пузыря, яичников, острый лимфоцитарный лейкоз и саркому Юинга (Hubert RS et al., (1999) Proc Natl Acad Sci 96:14523-14528). Ген STEAP кодирует белок с шестью потенциальными трансмембранными областями, фланкированными гидрофильными амино- и карбоксиконцевыми доменами. Авторы настоящего изобретения использовали данный белок в качестве антигенного белка как в первом вирусе, так и в вирусе Maraba MG1.

[0074] Раково-тестикулярный антиген 1 (NYESO1) представляет собой раково-тестикулярный антиген, экспрессируемый в здоровых тканях взрослого, таких как яичко и яичник, и при различных видах рака (Nicholaou Τ et al., (2006) Immunol Cell Biol 84:303-317). Раково-тестикулярные антигены представляют собой уникальное семейство антигенов, которые демонстрируют экспрессию, ограниченную половыми клетками яичка у здорового взрослого, но аномально экспрессируются в различных солидных опухолях, включая саркомы мягких тканей, меланому и эпителиальные раковые опухоли. Авторы настоящего изобретения использовали данный белок в качестве антигенного белка как в первом вирусе, так и в вирусе Maraba MG1.

[0075] В отличие от успешного применения MAGEA3, гибрида Е6/Е7 HPV, белков huSTEAP и NYESO1 в качестве антигенных белков в гетерологичной вакцине прайм-буст, авторы настоящего изобретения установили, что ядерный антиген 1 вируса Эпштейна-Барр (EBDNA1, SEQ ID NO: 16, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 17) не мог вызывать подобный иммунный ответ. EBDNA1 представляет собой многофункциональный вирусный белок, ассоциированный с вирусом Эпштейна-Барр (EBV) (Sibille H et al., (2003) Proc Natl Acad Sci 100:10989-10994), и согласованно экспрессируется в EBV-ассоциированных опухолях (Young LS et al., (2004) Nature Reviews - Cancer 4:757-768). EBNA1 содержит последовательность повторов глицин-аланин, которая разделяет белок на амино- и карбоксиконцевые домены (Young LS (2004) Nature Reviews - Cancer 4:757-768). Данная последовательность также, по-видимому, стабилизирует белок, предотвращая протеасомный распад, а также нарушая процессирование антигена и рестриктированное главным комплексом гистосовместимости (МНС) I класса представление антигена. Это, таким образом, ингибирует CD8-рестриктированный ответ цитотоксических Т-клеток, направленный против клеток, инфицированных вирусом (Levitskaya J et al., (1995) Nature 375:685-688).

[0076] Плацентарный белок 1 (PLAC-1) является другим примером опухолеассоциированного антигенного белка, который не мог вызывать иммунный ответ в гетерологичной вакцине прайм-буст.

[0077] В контексте настоящего изобретения термин «вариант» опухолеассоциированного антигенного белка относится к белку, который (а) содержит по меньшей мере один опухолеассоциированный антигенный эпитоп указанного опухолеассоциированного антигенного белка и (b) по меньшей мере на 70% идентичен указанному опухолеассоциированному антигенному белку. Предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 80% идентичен опухолеассоциированному антигенному белку. Более предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 90% идентичен опухолеассоциированному антигенному белку. Еще более предпочтительно, указанный вариант будет по меньшей мере на 95% идентичен опухолеассоциированному антигенному белку. Варианты с более высокой идентичностью последовательностей демонстрируют увеличенную вероятность того, что эпитопы представлены в 3-мерном виде, схожем с антигенными белками дикого типа.

[0078] Как правило, опухолеассоциированный антигенный эпитоп может быть идентифицирован путем расщепления всего антигенного белка на перекрывающиеся серии пептидов, или путем генерирования библиотек случайных пептидов и определения ответов Т-клеток путем стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) или спленоцитов животных, вакцинированных целевым белком, с использованием пептидных пулов. Пулы, получающие ответ, позволяют идентифицировать данный пептид как потенциальный антигенный эпитоп. Данный подход рассмотрен Morris, GE в Encyclopedia of Life Sciences, 2007, page 1-3 (doi: 10.1002/9780470015902.a0002624.pub2).

[0079] База данных, суммирующая общепринятые антигенные эпитопы, предложена Van der Bruggen Ρ, Stroobant V, Vigneron Ν, Van den Eynde В в "Database of Τ cell-defined human tumor antigens: the 2013 update." Cancer Immun 2013 13:15 и на сайте .

[0080] Опухолеассоциированные антигенные эпитопы уже идентифицированы для MAGEA3. Соответственно, вариант белка MAGEA3 может представлять собой, например, антигенный белок, который содержит по меньшей мере один опухолеассоциированный антигенный эпитоп, выбранный из группы, состоящей из: EVDPIGHLY, FLWGPRALV, KVAELVHFL, TFPDLESEF, VAELVHFLL, MEVDPIGHLY, EVDPIGHLY, REPVTKAEML, AELVHFLLL, MEVDPIGHLY, WQYFFPVIF, EGDCAPEEK, KKLLTQHFVQENYLEY, RKVAELVHFLLLKYR, KKLLTQHFVQENYLEY, ACYEFLWGPRALVETS, RKVAELVHFLLLKYR, VIFSKASSSLQL, VIFSKASSSLQL, VFGIELMEVDPIGHL, GDNQIMPKAGLLIIV, TSYVKVLHHMVKISG, RKVAELVHFLLLKYRA и FLLLKYRAREPVTKAE; и который по меньшей мере на 70% идентичен белку MAGEA3.

[0081] Может быть желательным, чтобы варианты опухолеассоциированного антигенного белка содержали только антигенные эпитопы, которые имеют высокую частоту аллелей, такую как частота, составляющая более 40% популяции. Соответственно, предпочтительные примеры вариантов MAGEA3 могут включать белки, которые содержат по меньшей мере один антигенный эпитоп, выбранный из группы, состоящей из: FLWGPRALV, KVAELVHFL, EGDCAPEEK, KKLLTQHFVQENYLEY, RKVAELVHFLLLKYR и KKLLTQHFVQENYLEY; и которые по меньшей мере на 70% идентичны белку MAGEA3.

[0082] Антиген, экспрессируемый первым вирусом, не обязательно должен иметь точно такую же последовательность, что и антиген, экспрессируемый вирусом Maraba MG1. Антиген, экспрессируемый Maraba MG1, должен только индуцировать перекрывающийся иммунный ответ на антиген, экспрессируемый первым вирусом. Например, первый вирус может экспрессировать MAGEA3, а вирус Maraba MG может экспрессировать вариант MAGEA3 или наоборот. Поскольку как MAGEA3, так и вариант MAGEA3 индуцируют перекрывающиеся иммунные ответы (так как они оба содержат по меньшей мере одну идентичную опухолеассоциированную антигенную последовательность), первый вирус выступает в качестве примирующего вектора, а вирус Maraba MG1 выступает в качестве бустер-вируса. Достаточно того, что иммунный ответ, вызываемый у млекопитающего на первый антиген, обуславливает иммунный ответ главным образом на MAGEA3 или вариант MAGEA3, когда вводят вирус Maraba MG1.

[0083] В контексте настоящего изобретения следует понимать, что все обсуждения и ссылки на «белок, экспрессируемый вирусом» точнее относятся к белку, экспрессируемому клеткой, инфицированной указанным вирусом, поскольку сами вирусы не обладают способностью экспрессировать белки. Подобным образом, все обсуждения и ссылки на «вирус, который экспрессирует белок» или вирус, способный экспрессировать белок» точнее относятся к вирусу, который содержит генетическую информацию, необходимую для экспрессии указанного белка клеткой, инфицированной данным вирусом.

[0084] Набор может дополнительно содержать иммунопотенцирующее соединение, такое как циклофосфамид (CPA), которое повышает первичный иммунный ответ на опухолеассоциированный антигенный белок, вызываемый у млекопитающего путем введения первого вируса. Циклофосфамид представляет собой химиотерапевтический агент, который может приводить к усилению иммунных ответов на опухолеассоциированный антигенный белок. В синергетической модели опухоли-меланомы у мышей CPA, вводимый до примирующего вектора, значительно увеличивал выживаемость, в то время как в случае CPA, вводимого до бустер-вектора, этого не наблюдали.

[0085] Терапевтический подход, описанный в настоящем документе, сочетает: (1) вирусную вакцину и (2) вирус Maraba MG1 в качестве онколитической вирусной вакцины, оба из которых экспрессируют MAGEA3, гибридный белок Е6/Е7 вируса папилломы человека, белок, представляющий собой шести-трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы человека, или раково-тестикулярный антиген 1, или его вариант. Бустирование онколитической вакциной может привести как к уменьшению массы опухоли онколитическим вирусом, так и к значительному увеличению количества опухолеспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) у животных, примированных вирусной вакциной. В действительности данная методика парадоксальным образом вызывает большие противоопухолевые ответы у животных, являющихся носителями опухолей, по сравнению с животными без опухолей, поскольку репликация онколитического вируса усиливается у животных, являющихся носителями опухолей, что приводит к увеличению количества антигенспецифических проникающих в опухоль лимфоцитов (TIL), по сравнению с репликацией онколитического вируса у животных без опухолей и связанным количеством антигенспецифических проникающих в опухоль лимфоцитов (TIL).

[0086] Продукты экспрессии данных генов процессируются в пептиды, которые, в свою очередь, экспрессируются на клеточных поверхностях. Это может привести к лизису клеток опухоли специфическими CTL. Ответ Т-клеток на чужеродные антигены включает как цитолитические Т-лимфоциты, так и хелперные Т-лимфоциты. CD8⁺ цитотоксические или цитолитические Т-клетки (CTL) представляют собой Т-клетки, которые в активированном состоянии лизируют клетки, которые представляют соответствующий антиген, представленный молекулами I класса HLA. CD4⁺ Т-хелперы представляют собой Т-клетки, которые секретируют цитокины для стимуляции макрофагов и антигенпродуцирующих В-клеток, которые представляют соответствующий антиген с помощью молекул II класса HLA на своей поверхности.

[0087] Белок «MAGEA3» может также называться «MAGE-A3» и обозначает ассоциированный с меланомой антиген 3. Антигенный белок MAGEA3 согласно настоящему изобретению представляет собой белок, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Данная аминокислотная последовательность может кодироваться нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2. В качестве альтернативы, указанная аминокислотная последовательность может кодироваться кодон-оптимизированным трансгеном, который содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3. Вирус, содержащий минус-смысловую РНК, экспрессирующий белок SEQ ID NO: 1, может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию полинуклеотида SEQ ID NO: 2 или 3. Вирус, содержащий плюс-смысловую РНК, или ДНК-вирус, экспрессирующий белок SEQ ID NO: 1, может содержать последовательность, которая представляет собой SEQ ID NO: 2 или 3.

[0088] Примером варианта антигенного белка MAGEA3 согласно настоящему изобретению является белок, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Данная аминокислотная последовательность может кодироваться нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5. Вирус, содержащий минус-смысловую РНК, экспрессирующий белок SEQ ID NO: 4, может содержать РНК-полинуклеотид, который содержит последовательность, которая представляет собой обратно-комплементарную и РНК-версию SEQ ID NO: 5. ДНК-вирус или РНК-вирус, который экспрессирует белок SEQ ID NO: 4, может содержать последовательность, которая представляет собой SEQ ID NO: 5.

[0089] Одним из примеров такого вируса, содержащего минус-смысловую РНК, является вирус Maraba, который содержит обратно-комплементарную и РНК-версию SEQ ID NO: 6.

[0090] Антигенный белок «гибридный белок Е6/Е7» или «гибридный белок Е6/Е7 вируса папилломы человека» согласно настоящему изобретению представляет собой белок, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. Данная аминокислотная последовательность может кодироваться нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8. Вирус, содержащий минус-смысловую РНК, экспрессирующий белок SEQ ID NO: 7, может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию полинуклеотида SEQ ID NO: 8. ДНК-вирус или вирус, содержащий плюс смысловую РНК, экспрессирующий белок SEQ ID NO: 7, может содержать полинуклеотид SEQ ID NO: 8. Одним из примеров такого вируса, содержащего минус-смысловую РНК, является вирус Maraba, который содержит обратно-комплементарную и РНК-версию SEQ ID NO: 9.

[0091] Белок «huSTEAP» или «белок, представляющий собой шести-трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы человека» согласно настоящему изобретению представляет собой белок, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Данная аминокислотная последовательность может кодироваться нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 11. Вирус, содержащий минус-смысловую РНК, экспрессирующий белок SEQ ID NO: 10, может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию полинуклеотида SEQ ID NO: 11. ДНК-вирус или РНК-вирус, экспрессирующий белок SEQ ID NO: 10, может содержать последовательность, которая представляет собой SEQ ID NO: 11. Одним из примеров такого вируса, содержащего минус-смысловую РНК, является вирус Maraba, который содержит обратно-комплементарную и РНК-версию SEQ ID NO: 12.

[0092] Белок «NYESO1» или «раково-тестикулярный антиген 1 человека» согласно настоящему изобретению представляет собой белок, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. Данная аминокислотная последовательность может кодироваться нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 14. Вирус, содержащий минус-смысловую РНК, экспрессирующий белок SEQ ID NO: 13, может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию полинуклеотида SEQ ID NO: 14. ДНК-вирус или РНК-вирус, экспрессирующий белок SEQ ID NO: 13, может содержать последовательность, которая представляет собой SEQ ID NO: 14. Одним из примеров такого вируса, содержащего минус-смысловую РНК, является вирус Maraba, который содержит обратно-комплементарную и РНК-версию SEQ ID NO: 15.

[0093] Вышеуказанные последовательности представлены в Приложении А.

[0094] Термин «млекопитающее» относится к людям, а также к млекопитающим, не относящимся к человеку. В настоящем описании термин «рак» включает любой рак, экспрессирующий опухолеассоциированный антигенный белок (т.е.: MAGEA3, гибридный белок Е6/Е7 вируса папилломы человека, белок, представляющий собой шести-трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы человека, или раково-тестикулярный антиген 1), используемый в представляющих интерес вирусах.

[0095] Например, при рассмотрении MAGEA3 в качестве антигенного белка термин «рак» включает любой рак, экспрессирующий MAGEA3 в качестве антигена. Примеры такого рака включают, но не ограничиваются ими, меланому, немелкоклеточный рак легкого, рак головы и шеи, рак толстой и прямой кишки, и рак мочевого пузыря.

[0096] При рассмотрении гибридного белка Е6/Е7 в качестве антигенного белка термин «рак» включает любой рак, экспрессирующий белки Е6 и Е7 в качестве антигенных белков. Примеры такого рака включают, но не ограничиваются ими, рак шейки матки.

[0097] Первый вирус, вирус Maraba MG1 или оба вируса можно независимо вводить млекопитающему внутривенно, внутримышечно, интраперитонеально или интраназально. После введения указанных вирусов иммунный ответ формируется у млекопитающего в интервале иммунного ответа, например, в течение примерно 4 дней, и действует в течение месяцев, лет или возможно всей жизни.

[0098] Первый вирус может представлять собой любой вирус, который индуцирует иммунный ответ на опухолеассоциированный антигенный белок или его вариант после введения указанного первого вируса пациенту. Вирусы, которые можно применять согласно настоящему изобретению, включают, например: аденовирус (Ad), поксвирус, ретровирус и альфа-вирус. Примером поксвируса является вирус коровьей оспы. Примером ретровируса является лентивирус. Примером альфа-вируса является вирус леса Семлики.

[0099] Для формирования иммунного ответа на опухолеассоциированный антигенный белок или его вариант вакцинацию с применением первого вируса и вируса Maraba MG1 можно осуществлять с использованием общепринятых методик. Как очевидно специалисту в данной области техники, количество вируса, которое требуется для того, чтобы вызвать иммунный ответ, будет варьироваться в зависимости от ряда факторов, включая, например, выбранный антиген, вирусный вектор, применяемый для доставки антигена, и млекопитающее, которое лечат, например, вид, возраст, объем и т.д. В этом отношении, например, внутримышечного введения по меньшей мере примерно 10⁷ БОЕ аденовирусного вектора мыши достаточно для того, чтобы вызвать иммунный ответ. Соответствующее количество будет достаточным для введения человеку для того, чтобы вызвать иммунный ответ.

[00100] После выработки иммунного ответа у млекопитающего путем введения первого вируса, вирус Maraba MG1, кодирующий опухолеассоциированный антигенный белок или его вариант, вводят в количестве, подходящем для онколитической вирусной терапии, в подходящем интервале иммунного ответа. Подходящий интервал иммунного ответа может составлять, например, по меньшей мере примерно 24 часа, предпочтительно по меньшей мере примерно 2-4 дня или больше, например, по меньшей мере примерно 1 неделю или по меньшей мере примерно 2 недели. Количество вируса Maraba MG1, подходящее для онколитической вирусной терапии, будет варьироваться в зависимости от млекопитающего, которого лечат, как очевидно специалисту в данной области техники. Например, 10⁸ БОЕ вируса Maraba MG1, кодирующего MAGEA3, вводимых внутривенно мыши, достаточно для онколитической терапии. Соответствующее количество будет достаточным для применения у человека.

[00101] Вирус Maraba MG1, кодирующий опухолеассоциированный антигенный белок или его вариант, может быть получен путем включения обратно-комплементарной последовательности трансгена, кодирующего опухолеассоциированный антигенный белок или его вариант, в вирус Maraba MG1 с использованием стандартной рекомбинантной технологии. Например, обратно-комплементарная последовательность трансгена может быть включена в геном вируса Maraba MG1 или, в качестве альтернативы, может быть включена в указанный вирус с использованием плазмиды, содержащей трансген. Трансген, кодирующий опухоль, может представлять собой кодон-оптимизированный трансген.

ПРИМЕРЫ

[00102] Онколитический Maraba MG1 представляет собой эффективную платформу на основе онколитической вакцины. Несмотря на неспособность примировать с вызовом детектируемых ответов на ассоциированный с меланомой антиген, Maraba MG1-вакцина демонстрировала способность бустировать предсуществующий опухолеспецифический иммунитет, опосредуемый CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетками. При применении для лечения сингенных моделей опухоли-меланомы у мышей Maraba MG1-опосредуемая вторичная иммунизация приводила к увеличению средней выживаемости с полной ремиссией у более 20% животных, получавших лечение.

[00103] В исследовании токсичности у приматов гетерологичная вакцинация прайм-буст с применением примирующего вектора Ad-MAGEA3 с последующим бустер-вектором Maraba-MG1-MAGEA3 вызывала ответы Т-клеток, сопоставимые с ответами, полученными в сингенных моделях опухолей у мышей, что показывает, что в аутбредной популяции приматов стратегия онколитической вакцины прайм-буст позволяет получить иммунные ответы, сопоставимые с моделями у животных, в которых опухоли могут быть привиты, и достигается значительное увеличение выживаемости.

[00104] Авторы настоящего изобретения также установили, что белки, имеющие последовательности SEQ ID NO: 7, 10 или 13, можно применять для стимуляции иммунного ответа у пациента с применением гетерологичной вакцинации прайм-буст вирусом Maraba MG1. В противоположность этому, авторы настоящего изобретения установили, что введение первого вируса, экспрессирующего белок EBDNA-1 или плацентарный белок 1 (PLAC-1), с последующим введением Maraba-MG1, экспрессирующего белок EBDNA-1 или PLAC-1 соответственно, не могло стимулировать иммунный ответ.

[00105] Пример 1: MG1-hDCT представляет собой слабый примирующий вектор, но сильный бустер-вектор:

[00106] Ad-empty и Ad-hDCT представляют собой дефектные по репликации аденовирусы (Е1/Е3-деления) на основе 5 серотипа человека (Lane С.et al., (2004) Cancer Research 64:1509-1514; Ng P. et al., (2001) Mol Ther 3:809-815). Вектор на основе дефектного по репликации аденовируса создавали для экспрессии трансгена hDCT, который кодирует полноразмерный ассоциированный с меланомой антиген человека DCT (допахромтаутомераза), тогда как Ad-empty не содержит трансген. Полученный аденовирусный вектор называется «Ad-hDCT».

[00107] MG1-вариант вируса Maraba создавали для экспрессии человеческой формы трансгена hDCT ассоциированного с меланомой антигена. Полученный MG1-вирусный вектор называется «MG1-hDCT» или «Maraba MG1-hDCT». Другие вирусные векторы названы с использованием подобного обозначения.

[00108] Рекомбинантные Maraba и VSV получали путем встраивания трансгена между вирусными генами G и L. VSV-hDCT происходит из штамма Indiana дикого типа вируса VSV (Bridle BW. et al. (2009) 17:1814-1821; Lawson ND. et al., (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:4477-4481). MG1-GFP (зеленый флуоресцентный белок, используемый для встраивания в качестве контрольного неиммуногенного трансгена) и MG1-hDCT происходят из ослабленного штамма MG1 вируса Maraba. Перед исследованиями in vivo экспрессию DCT (и GFP) из указанного вируса подтверждали путем вестерн-блоттинга лизатов инфицированных клеток Vero, культивированных в альфа-MEM, содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (все от Invitrogen, Гранд-Айленд, Нью-Йорк).

[00109] Вначале оценивали терапевтическую эффективность MG1-hDCT, вводимого в виде монотерапии. Для получения метастазов в легких мышам С57 В1/6 (в возрасте 8-10 недель в начале исследования) внутривенно вводили путем инъекции 2,5×10⁵ клеток В16-F10 (клетки меланомы мыши, экспрессирующие антиген DCT мыши) в 200 мкл соленой воды. Онколитическую вакцину вводили системно путем инъекции спустя 5 или 14 дней, и ответы Т-клеток на антиген меланомы DCT измеряли в крови в 19 день. Вирус вводили системно в высокой дозе (10⁹ БОЕ внутривенно в 200 мкл ФБР). Ответы Т-клеток измеряли путем выделения МКПК или спленоцитов и их стимуляции пептидами SVYDFFVWL (SVY) или KFFHRTCKCTGNFA (KFF), соответствующими MHC-I- или МНС-II-рестриктированным иммунодоминантным эпитопам DCT соответственно. Отвечающие Т-клетки детектировали после внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) на предмет IFN-γ путем проточной цитометрии.

[00110] Как показано на фиг. 1А и 1В, MG1-hDCt не мог примировать с вызовом DCT-специфических ответов CD8⁺ или CD4⁺ Т-клеток у мышей, являющихся носителями опухолей (фиг. 1А). Одна только вводимая вакцина MG1-hDCT не улучшала исход опухоли. Действительно, мыши, которых лечили через 14 дней после заражения опухолью, достигали конечной точки в подобные сроки, что и мыши, не получавшие лечения: через 20 дней для контрольной группы с Ad-empty относительно 21 дня для группы с Ad-empty + MG1-hDCT (фиг. 1В). Кроме того, выживаемость не увеличивалась, даже когда мышей лечили MG1-hDCT уже через 5 дней после прививания опухолью (группа MG1-hDCT, фиг. 1В). В заключение, MG1-hDCT не только не индуцировал иммунитет анти-DCT, но его онколитическая активность не обеспечивала полезный терапевтический эффект. Данные результаты показывают, что MG1-hDCT не может примировать с вызовом значительных ответов Т-клеток на опухолевый антиген DCT и, таким образом, является слабым примирующим вектором.

[00111] Ранее сообщали, что онколитический VSV-вектор служит сильным бустером предсуществующего иммунитета (Bridle BW. et al., (2010) Mol Ther 184:4269-4275; WO 2010/105347). В настоящем изобретении исследовали способность вируса Maraba MG1 выступать в качестве бустер-вакцины. Аденовирусные векторы использовали в качестве примирующих векторов и вводили внутримышечно (в/м) в общей дозе, составляющей 2×10⁸ БОЕ (1×10⁸ БОЕ в 50 мкл ФБР в бедро). Для инъекции аденовируса мышей анестезировали в герметичной камере, содержащей 5% ингаляционный изофлуран. С использованием Ad-hDCT в качестве примирующего вектора MG1-hDCT оценивали в качестве бустера предсуществующих DCT-специфических ответов. Для оценки вируса Maraba в качестве бустер-вектора оценивали различные пути введения. Вводили онколитическую дозу, составляющую 1×10⁹ БОЕ вируса, которая хорошо переносилась у мышей данной линии, и выбирали интервал, составляющий 12 дней после Ad-примирования, поскольку он являлся самым длинным интервалом, который практически возможен в указанной модели опухоли. Когда данную дозу MG1-Maraba-hDCT вводили внутривенным (в/в), интраназальным (и/н) и внутримышечным (в/м) путями, внутривенный путь оказался гораздо более эффективным по данным измерения путем ICS на предмет IFN-γ в периферических CD8⁺ Т-клетках: 28,33%±3,82 внутривенно по сравнению с 4,73%±1,52 интраназально по сравнению с 13,84%±1,88 внутримышечно. Ответы измеряли в 5 день после введения Maraba, что совпадало с пиком MG1-hDCT-опосредуемого буст-ответа. У животных, которых бустировали внутривенно, значительную часть DCT-специфических CD8⁺ Т-клеток также измеряли в селезенке, при этом 3-кратное увеличение наблюдали у мышей, которым вводили оба вакцинных вектора, по сравнению с животными, которых только примировали: 3,45%±0,45 в группе Ad-hDCT по сравнению с 11,02%±2,14 у животных, иммунизированных Ad-hDCT + MG1-hDCT (р=0,0085**). В то время как Ad-hDCT не мог индуцировать детектируемую DCT-специфическую популяцию CD4⁺ Т-клеток в крови и едва детектируемую популяцию в селезенке, бустер-вектор MG1 Maraba-hDCT мог вызывать отчетливый системный ответ CD4⁺ Т-клеток, но только при внутривенном введении (0,30%±0,11). Ответ можно было также детектировать в селезенке, при этом 0,14%±0,03 CD4⁺ Т-клеток селезенки реагировали на воздействие пептида DCT KFF. Подобно VSV, максимального бустирования иммунного ответа вирусом MG1 Maraba достигали путем внутривенного введения. В заключение, оказалось, что системная доставка Maraba-векторной вакцины в дозе, составляющей 10⁹ БОЕ, обеспечивала эффективное бустирование антигенспецифических популяций как CD8⁺, так и CD4⁺ Т-клеток. По этой причине данный путь и дозу использовали для введения Maraba MG1 в последующих экспериментах in vivo.

[00112] Для демонстрации того, что Maraba MG1-hDCT является более мощным бустер-вектором, чем VSV-hDCT, мышей С57/В16 примировали Ad-hDCT (Ad-BHG включали в качестве контрольного вектора, не содержащего трансген), а затем бустировали с использованием внутривенной дозы либо VSV-hDCT, либо Maraba-hDCT спустя 14 дней. Анализ иммунных ответов CD8⁺ Т-клеток проводили в периферической крови в 5 день после введения бустер-вектора. В эквивалентной дозе ответ, индуцируемый путем вакцинации Maraba, был в 3-8 раз больше VSV-индуцируемых ответов (фиг. 2).

[00113] Пример 2: стратегия с применением вакцины MG1-hDCT в моделях рака у мышей

[00114] Затем исследовали терапевтическую эффективность MG1-hDCT, вводимого в качестве бустер-вектора. Через пять дней после прививания B16-F10 для образования метастазов в легких у животных, животные получали примирующую вакцину Ad-hDCT с последующей, спустя 9 дней, однократной внутривенной дозой MG1 Maraba-hDCT в качестве онколитической бустер-вакцины. Ad-hDCT-прайм-MG1-hDCT-буст-вакцинация вызывала очень сильный DCT-специфический ответ CD8⁺ Т-клеток (средний % IFN-γ⁺ CD8⁺ Т-клеток = 27,54±2,17, фиг. 3), который был в 14 раз выше, чем у мышей, которым не вводили бустер-вакцину (1,95%±0,29 в группе Ad-hDCT и 1,91%±0,59 в группе Ad-hDCT + MG1-GFP, фиг. 3). Подобным образом, DCT-специфические ответы CD4⁺ Т-клеток измеряли у животных, которым вводили бустер-вакцину MG1-hDCT, тогда как их редко детектировали у мышей, которым вводили только примирующую вакцину (средний % IFN-γ⁺ CD4⁺ Т-клеток = 0,25%±0,06 в группе Ad-hDCT + MG1-hDCT по сравнению с<0,05% в группах Ad-hDCT и Ad-hDCT + MG1-GFP, фиг. 3).

[00115] Если рассматривать результат лечения, иммунизация Ad-hDCT обеспечивала 10-дневное увеличение средней выживаемости по сравнению с мышами, не получавшими лечение: 31 день для лечения Ad-hDCT по сравнению с 20,5 днями для группы Ad-empty (фиг. 4). Лечение Ad-hDCT с последующим онколитическим лечением MG1 Maraba-GFP не увеличивало выживаемость (средняя выживаемость для группы Ad-hDCT + MG1-GFP составляла 27,5 дней, фиг. 4). Однако бустирование противоопухолевого иммунитета вакциной Maraba MG1-DCT значительно улучшало исход опухоли с 20-дневным увеличением средней выживаемости по сравнению с животными, которым вводили только примирующую вакцину Ad-hDCT (51 день для группы Ad-hDCT + MG1-hDCT, фиг. 4). Что еще более важно, лечение онколитической бустер-вакциной MG1-hDCT приводило к 23,3% длительной выживаемости (фиг. 4).

[00116] Для того чтобы охарактеризовать соответствующий вклад опухолеспецифических ответов CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток в терапевтическую эффективность, каждую категорию Т-клеток селективно истощали (данные не представлены). Истощение популяции CD8⁺ Т-клеток в момент бустирования «отменяло» полезный терапевтический эффект введения MG1-hDCT. Оказалось, что истощение CD4⁺ Т-клеток, напротив, не оказывало значительного влияния на терапевтическую эффективность, что указывает на то, что Maraba-иммунобустирование CD8⁺ Т-клеток является CD4⁺-независимым. В то время как критическая роль CD8⁺ Т-клеток в контроле роста опухоли является признанной, данные результаты показывают, что бустирование опухолеспецифических CD8⁺ Т-клеток вакциной Maraba является эффективным способом улучшения терапии рака.

[00117] Наконец, эффективность стратегии прайм-буст, в которую вовлечена вакцина Maraba, также оценивали в очень сложной интракраниальной модели рака головного мозга, вызванного метастатической меланомой B16-F10. Ad-hDCT-опосредуемая иммунотерапия значительно увеличивала выживаемость мышей с метастазами в головном мозге, вызванными меланомой, со средним значением, увеличенным с 15 дней для контролей Ad-empty до 25,5 дней для группы Ad-hDCT (фиг. 5). Как сообщалось ранее, такая терапевтическая эффективность демонстрирует способность индуцированных опухолеспецифических эффекторных Т-клеток преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в ложе опухоли (Bridle BW. et al., (2010) Mol Ther 184:4269-4275). Дополнительное введение онколитической бустер-вакцины Maraba MG1-hDCT дополнительно улучшало исход опухоли со средней выживаемостью, достигающей 42 дней, наряду с излечением, наблюдаемым у 21,4% животных, получавших лечение (группа Ad-hDCT + MG1-hDCT, фиг. 5).

[00118] Пример 3: неспособность стратегии с вакциной индуцировать ответ Т-клеток анти-mPLAC1:

[00119] Хотя Maraba MG1 и VSV могли выступать в качестве бустер-векторов с использованием hDCT в качестве опухолеассоциированного антигена, не все опухолеассоциированные антигены могут быть использованы в стратегии с гетерологичной вакциной прайм-буст. Авторы настоящего изобретения тестировали стратегию прайм-буст с гетерологичной вакциной с использованием huAd5-mPLAC1 в качестве примирующего вектора и VSV-mPLAC1 в качестве бустер-вектора.

[00120] PLAC1 представляет собой недавно описанный опухолеассоциированный антиген, экспрессируемый в плаценте, а также был описан в нескольких линиях клеток опухоли и в опухолях пациентов с раком молочной железы, легкого, печени, желудка и толстой и прямой кишки (Silva, WA et al, (2007) Cancer Immun 7:18).

[00121] Ad-mPLAC1 представляет собой дефектный по репликации аденовирус (Е1/Е3-делеция) на основе 5 серотипа человека (Lane С.et al., (2004) Cancer Research 64:1509-1514; Ng P. et al., (2001) Mol Ther 3:809-815). Вектор на основе дефектного по репликации аденовируса создавали для экспрессии трансгена mPLAC1, который кодирует полноразмерный антиген PLAC1 мыши (плацентарный белок 1), и полученный аденовирусный вектор называется «Ad-mPLAC1» или «huAd5-mPLAC1».

[00122] Вирус VSV создавали для экспрессии человеческой формы трансгена mPLAC1 ассоциированного с меланомой антигена. Полученный VSV-вирусный вектор называется «VSV-mPLAC1». Рекомбинантный VSV получали путем встраивания трансгена между вирусными генами G и L. VSV-mPLAC1 происходит из штамма Indiana дикого типа вируса VSV (Bridle BW. et al. (2009) 17:1814-1821; Lawson ND. et al., (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:4477-4481).

[00123] Мышей С57 В1/6 примировали Ad-mPLAC1 (2×10⁹ БОЕ, внутримышечная инъекция), а затем бустировали однократной внутривенной дозой VSV-mPLAC1 (2×10⁹ БОЕ) спустя 14 дней. Ответы Т-клеток измеряли путем выделения спленоцитов и их стимуляции индивидуальными 15-мерными пептидами из библиотеки перекрывающихся пептидов PLAC1 всего в течение 6 часов с добавлением golgi plug через 1 час после начала стимуляции. После стимуляции спленоциты окрашивали на предмет CD4, CD8 и IFNγ; и анализировали на FACSCanto и FlowJo. Отвечающие Т-клетки детектировали после внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) на предмет IFN-γ путем проточной цитометрии. Ни один из пептидов mPLAC1 не мог стимулировать выработку IFN-γ ни в CD8, ни в CD4 Т-клетках.

[00124] Пример 4: создание онколитических вакцинных векторов с MAGEA3 или его вариантом:

[00125] Ad-MAGEA3 представляет собой дефектный по репликации аденовирус (Е1/Е3-делеция) на основе 5 серотипа человека (Lane С.et al., (2004) Cancer Research 64:1509-1514; Ng P. et al., (2001) Mol Ther 3:809-815), содержащий полноразмерный ген MAGEA3 человека. Maraba MG1-hMAGEA3 был разработан и содержит кодон-оптимизированный полноразмерный ген MAGEA3 человека, встроенный между вирусными генами G и L двойного мутанта MG1 вируса Maraba (Brun J. et al., (2010) Mol Ther 18:1440-1449). Последовательность MAGEA3 (ID гена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI): 4102 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4102) кодон-оптимизировали для экспрессии в клетках млекопитающих, а затем синтезировали с FLAG-меткой на 3'-конце и с сайтами рестрикции MluI как на 3'-, так и на 5'-конце. Данную последовательность лигировали в шаттл-вектор pMRB-MG1/pNF в сайте MluI (между генами G и L), содержащий часть генома Maraba-MG1 от начала гена G до конца гена L, фланкированную сайтами ΚpnΙ и NheI соответственно. Затем всю область от ΚpnΙ до NheI, ныне содержащую MAGEA3 Flag между G и L, удаляли из pMRB-MG1/pNF и снова лигировали в геномную плазмиду pMRB-MG1 с использованием сайтов ΚpnΙ и NheI. Затем Maraba-MG1-MAGEA3 Flag восстанавливали и очищали методом бляшек. Это проиллюстрировано на фиг. 6.

[00126] Полноразмерный белок MAGEA3 человека, экспрессируемый аденовирусом, может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Аденовирус может содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. В качестве альтернативы, аминокислотная последовательность может кодироваться кодон-оптимизированным трансгеном, который содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3. Соответственно, аденовирус может содержать кодон-оптимизированную нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.

[00127] Вирус Maraba MG1 может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2. В качестве альтернативы, аминокислотная последовательность может кодироваться кодон-оптимизированным трансгеном, который содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3. Соответственно, вирус Maraba MG1 может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3.

[00128] Один из вариантов MAGEA3 представляет собой белок, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Данная аминокислотная последовательность может кодироваться нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5. Аденовирус может содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5. Вирус Maraba MG1 может содержать обратно-комплементарную и РНК-версию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5.

[00129] Вирус, содержащий минус-смысловую РНК, такой как вирус Maraba, который экспрессирует белок SEQ ID NO: 4, может содержать РНК-полинуклеотид, который содержит последовательность, которая представляет собой обратно-комплементарную и РНК-версию SEQ ID NO: 6.

[00130] Пример 5: иммунный ответ на вакцину MG1-MAGEA3 у здоровых приматов:

[00131] Здоровых яванских макак использовали в исследовании, предназначенном для сбора данных токсичности и иммуногенности для разработки потенциальной онколитической вакцины MG1-MAGEA3 для применения у человека. Использование яванских макак максимально увеличивает вероятность идентификации ответов, которые количественно и качественно схожи с ответами, ожидаемыми у людей. Перед началом исследования приматам давали 4-6 недель для адаптации с момента поступления животного до момента оперативного вмешательства по имплантации порт-системы сосудистого доступа. Через минимум 2-3 недели после оперативного вмешательства животных вакцинировали примирующим вектором Ad-MAGEA3 на основе нереплицирующегося аденовируса, вводимым путем инъекции в каждую ногу, 0,5 мл на дозу, что в общем составляло 1×10¹⁰ БОЕ, путем медленной внутримышечной инъекции. Для исследования прайм-буст с использованием Ad-MAGEA3/MG1-MAGEA3 примирование Ad-MAGEA3 осуществляли либо за 2 недели (-14 дней), либо за 4 недели (-28 дней) до бустирования MG1-MAGEA3. Следовательно, введение Ad-MAGEA3 осуществляли в -14 день или -28 день, а бустирование MG1-MAGEA3 осуществляли в 0 и 3 день. Основание для уровня доз Ad-MAGEA3 следует из литературы и из предшествующих экспериментов, демонстрирующих, что доза, составляющая 1×10¹⁰ БОЕ у макак (и людей), является безопасной дозой без наблюдаемой токсичности (Bett et al. Vaccine, 2010). Для животных в группе бустирования через 2 недели вирус MG1-MAGEA3 вводили внутривенно путем инъекции любо в низкой дозе 1×10¹⁰, либо в высокой дозе 1×10¹¹ в 0 и 3 дни эксперимента (14 и 17 дни после введения Ad-MAGEA3). Для животных в группе бустирования через 4 недели вирус MG1-MAGEA3 вводили внутривенно путем инъекции любо в низкой дозе 1×10¹⁰, либо в высокой дозе 1×10¹¹ в 0 и 3 дни эксперимента (28 и 31 дни после введения Ad-MAGEA3). Бустер-вирус вводили путем инфузии в 30 мл стерильного буферного раствора (рН 7,5) в течение 30 минут через порт-систему сосудистого доступа. Основание для низкого уровня доз MG1-MAGEA3 следует из доклинических исследований, демонстрирующих, что максимальная переносимая доза у мышей составляет 1×10⁹. Увеличение относительной площади поверхности тела для макак приравнивает данную дозу к общему значению 3,5×10¹⁰ БОЕ. Основание для высокого уровня доз MG1-MAGEA3 следует из пилотного токсикологического исследования у нечеловекообразных приматов (NHP), в котором не наблюдали токсичность на уровне доз, составляющем 2×10¹¹ БОЕ. Животных в исследовании прайм-буст умерщвляли либо рано (14 день), либо поздно (84 день). Для исследования прайм-буст с использованием Ad-MAGEA3/MG1-MAGEA3 у всех животных брали образцы крови в 5 различных моментов времени. Для животных в 2-недельной когорте гетерологичной вакцинации прайм-буст образцы крови забирали перед любой вакцинацией и в день перед -14 днем (начало исследования) и в 5, 13 и 84 день эксперимента. Для животных в 4-недельной когорте гетерологичной вакцинации прайм-буст образцы крови забирали перед любой вакцинацией и в день перед -28 днем (начало исследования) и в 5, 13 и 84 день эксперимента.

[00132] Для оценки иммунных ответов у приматов на гетерологичную вакцинацию прайм-буст с использованием Ad-MAGEA3/MG1-MAGEA3, мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) инкубировали в течение 4 часов (последние 3 часа в присутствии Брефелдина А) совместно с пулом 10 пептидов hMAGE-А3 для (повторной) стимуляции Т-клеток (или оставляли без стимуляции для оценки фонового значения). Пептиды были из библиотеки перекрывающихся пептидов, включающей весь антиген hMAGE-А3 от N- до С-конца в 87 пептидах (каждый 15-мерный). После стимуляции Т-клетки окрашивали флуоресцентными антителами анти-CD8 и анти-CD4 в течение 25 минут. После данного окрашивания поверхности клетки пермеабилизировали и фиксировали BD Cytofix/Cytoperm в течение 20 минут. Затем детектировали hMAGE-А3-специфические Т-клетки путем наблюдения за экспрессией цитокинов путем внутриклеточного окрашивания флуоресцентными антителами анти-IFNγ и анти-TNFα в течение 25 минут. Анализ клеток проводили на проточном цитометре BD Canto.

[00133] На фиг. 7 показаны средние иммунные ответы CD8⁺ Т-клеток у обезьян, которым вводили высокую и низкую дозу MG1-MAGEA3 в качестве бустер-вектора после примирования Ad-MAGEA3. У животных, которым вводили низкую дозу MG1-MAGEA3, происходило значительное увеличение ответа CD8⁺ Т-клеток через 5 дней после бустирования, которое спадало со временем, тогда как у животных, которым вводили высокую дозу MG1-MAGEA3, происходило схожее значительное увеличение ответа CD8⁺ Т-клеток через 5 дней после бустирования, которое поддерживалось на более высоком уровне в течение времени. На фиг. 8 показано, что все животные в исследовании демонстрировали значительное увеличение ответа CD8⁺ Т-клеток через 5 дней после бустирования MG1-MAGEA3, независимо от того, была доза высокой или низкой. Данные пиковые ответы Т-клеток у приматов показывают, что в аутбредной популяции стратегия онколитической вакцины прайм-буст позволяет получить иммунные ответы, сопоставимые с моделями у животных, в которых опухоли могут быть привиты, и достигается значительное увеличение выживаемости.

[00134] Пример 6: конструирование и иммунотестирование лентивирусных примирующих векторов и онколитических вакцинных векторов, экспрессирующих гибридный белок Е6/Е7 вируса папилломы человека:

[00135] Трансген HPV представляет собой гибрид полноразмерных последовательностей Е6 (gi/4927720/gb/AAD33252.1/AF125673_1 Е6 вирус папилломы человека 16 типа) и Е7 (gi/4927721/gb/AAD33253.1/AF125673_2 Е7 вирус папилломы человека 16 типа) дикого типа 16 серотипа HPV и полноразмерных последовательностей Е6 (gi/137758/sp/P06463.1/VE6_HPV18 RecName: Full = Protein Е6) и Е7 (gi/137792/sp/P06788.2/VE7_HPV18 RecName: Full = Protein E7) дикого типа 18 серотипа HPV с делениями во всех 4 нуклеотидных последовательностях для удаления цинковых пальцев, необходимых для связывания Rb или р53 (устранение онкогенного потенциала указанных белков). Полученный гибридный белок имеет гибкий глициновый линкер плюс последовательность AAY (который служит в качестве сайта протеасомного расщепления с тем, чтобы каждый антиген протеолитически распадался на пептиды, обычно образующиеся для представления антигена). Данная кодон-оптимизированная гибридная нуклеотидная последовательность позволяет получить 527-аминокислотный гибридный белок Е6/Е7 HPV16/18 (SEQ ID NO: 7).

[00136] Лентивирусы, экспрессирующие гибридный трансген Е6/Е7 вируса папилломы человека, получали с использованием лентивирусного вектора pDY.EG.WS. Модифицированный трансген HPV амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров, содержащих сайт рестрикции EcoRI (прямой праймер

[00137] Maraba MG1 создавали таким образом, чтобы он содержал гибридный трансген Е6/Е7 вируса папилломы, встроенный между вирусными генами G и L двойного мутанта MG1 вируса Maraba (Brun J. et al., (2010) Mol Ther 18:1440-1449). Последовательность трансгена (SEQ ID NO: 8) кодон-оптимизировали для экспрессии в клетках млекопитающих. Полученный Maraba MG1, содержащий Е6/Е7 HPV, обозначается, как правило, «Maraba-MG1-HPV Е6/Е7». Модифицированный остов Maraba MG1 использовали для облегчения клонирования. Молчащую мутацию вводили в ген L остова генома Maraba MG1 для удаления одного из сайтов Mlul. Второй сайт Mlul заменяли сайтом BsiWI в области клонирования между G и L. Данные модификации остова генома Maraba MG1 позволяли получить систему более направленного клонирования, чем система, описанная в документе Brun et al., поскольку она позволяет избежать использования шаттл-плазмиды pMRB-MG1/pNF. Последовательность гибридного трансгена Е6/Е7 HPV лигировали в модифицированный остов генома Maraba MG1 в сайте Mlul и сайте BsiWI (в области клонирования между G и L). Затем Maraba-MG1-HPV Е6/Е7 восстанавливали (как описано ранее в Brun et al., (2010) Mol Ther 18:1440-1449), один раз очищали методом бляшек и подвергали очистке с использованием Opti-Prep. Maraba-MG1-HPV Е6/Е7 содержит геномную последовательность, которая является обратно-комплементарной и РНК-версией SEQ ID NO: 9.

[00138] Как правило, животных иммунизировали путем введения примирующего вектора (лентивирус-Е6/Е7 HPV + poly I:С качестве адъюванта) в 0 день и путем введения 1е9 БОЕ бустер-вектора (Maraba-MG1-E6/E7 HPV) в 14 день. Контрольных мышей вакцинировали по типу прайм-буст вирусными векторами, кодирующими GFP вместо трансгена Е6/Е7 HPV в качестве встраивания контрольного неиммуногенного трансгена. Анализ ответа на примирующий вектор проводили в 14 день, а ответа на бустер-вектор - в 19 день. Каждый препарат лентивирус-HPVE6/Е7 получали с использованием 250 мкг poly I:С, добавляемого в качестве адъюванта к примирующему вирусу, а затем делили между 5 животными для каждого вируса. Мышей анестезировали изофлураном и 30 мкл лентивирус-HPV Е6/Е7/poly I:С вводили путем инъекции в каждую подушечку задних лап. Оставшийся вирус вводили путем инъекции подкожно рядом с левым паховым лимфатическим узлом. Через 14 дней после примирования кровь забирали и анализировали путем проточной цитометрии. Затем мышей бустировали 1×10⁹ БОЕ MG1-HPV Е6/Е7 внутривенно. Через 5 дней после бустирования брали кровь и оценивали иммунные ответы путем проточной цитометрии.

[00139] Анализ иммунных ответов проводили следующим образом: кровь забирали путем ретроорбитального кровопускания с использованием гепаринизированного капилляра и кровь собирали в гепарин. Затем эритроциты лизировали с использованием лизирующего буфера АСК и полученные МКПК анализировали на предмет иммунных ответов на опухолевые антигены. МКПК либо инкубировали в отсутствии пептида, либо стимулировали 2 мкг/мл пептидов (RAHYNIVTF) всего в течение 5 часов с добавлением golgi plug через 1 час после начала стимуляции. После стимуляции МКПК окрашивали на предмет CD4, CD8 и IFNγ, и анализировали на FACSCanto и FlowJo. Отвечающие Т-клетки детектировали после внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) на предмет IFN-γ путем проточной цитометрии. Значения, полученные от нестимулированных МКПК, рассматривали в качестве фоновых и вычитали из значений, полученных от стимулированных МКПК. Данные представляют собой среднее значение +/- SEM. В таблице 1 показано, что пептиды Е6/Е7 HPV могли стимулировать выработку IFN-γ в клетках CD8, что указывает на наличие иммунного ответа.

[00140] Пример 7: конструирование и иммунотестирование лентивирусных примирующих векторов и онколитических вакцинных векторов, экспрессирующих раково-тестикулярный антиген 1:

[00141] Трансген NYESO1 представляет собой полноразмерную последовательность дикого типа (SEQ ID NO: 14), кодон-оптимизированную для экспрессии у человека и мыши с образованием 180-аминокислотного белка (SEQ ID NO: 13).

[00142] Лентивирусы, экспрессирующие трансген раково-тестикулярного антигена 1, получали с использованием лентивирусного вектора pDY.EG.WS. Трансген NYESO1 амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров, содержащих сайт рестрикции BamHI (прямой праймер

[00143] Maraba MG1 создавали таким образом, чтобы он содержал трансген раково-тестикулярного антигена 1, встроенный между вирусными генами G и L двойного мутанта MG1 вируса Maraba (Brun J. et al., (2010) Mol Ther 18:1440-1449). Последовательность трансгена кодон-оптимизировали для экспрессии в клетках млекопитающих. Полученный Maraba MG1, содержащий белок NYESO1, обозначается «Maraba-MG1-NYESO1» или «MG1-NYESO1».

[00144] Трансген NYESO1 лигировали в шаттл-вектор pMRB-MG1/pNF в сайте Mlul (между генами G и L), содержащий часть генома Maraba-MG1 от начала гена G до конца гена L, фланкированную сайтами ΚpnΙ и NheI соответственно. Затем всю область от ΚpnΙ до NheI, ныне содержащую трансген NYESO1, встроенный между G и L, удаляли из pMRB-MG1/pNF и снова лигировали в геномную плазмиду pMRB-MG1 с использованием сайтов ΚpnΙ и NheI. Затем Maraba-MG1-NYESO1 восстанавливали (как ранее описано в Brun J. et al, (2010) Mol Ther 18:1440-1449). Maraba-MG1-NYESO1 три раза очищали методом бляшек и очищали путем очистки на сахарозной подушке. Вирус Maraba-MG1-NYESO1 содержит геномную последовательность, которая является обратно-комплементарной и РНК-версией SEQ ID NO: 15.

[00145] Как правило, животных иммунизировали путем введения примирующего вектора (лентивирус-NYESO1 + poly I:С качестве адъюванта) в 0 день и путем введения 1е9 БОЕ бустер-вектора (Maraba-MG1-NYESO1) в 14 день. Контрольных мышей вакцинировали по типу прайм-буст вирусными векторами, кодирующими GFP вместо трансгена NYESO1 в качестве встраивания контрольного неиммуногенного трансгена. Анализ ответа на примирующий вектор проводили в 14 день и 19 день. Каждый препарат лентивирус-NYESO1 получали с использованием 250 мкг poly I:С, добавляемого в качестве адъюванта к примирующему вирусу, а затем делили между 5 животными для каждого вируса. Мышей анестезировали изофлураном и 30 мкл лентивирус-NYESO1/poly I:С вводили путем инъекции в каждую подушечку задних лап. Оставшийся вирус вводили путем инъекции подкожно рядом с левым паховым лимфатическим узлом. Через 14 дней после примирования кровь забирали и анализировали путем проточной цитометрии. Затем мышей бустировали 1×10⁹ БОЕ MG1-NYESO1 внутривенно. Через пять дней после бустирования брали кровь и оценивали иммунные ответы путем проточной цитометрии.

[00146] Анализ иммунных ответов проводили следующим образом: кровь забирали путем ретроорбитального кровопускания с использованием гепаринизированного капилляра и кровь собирали в гепарин. Затем эритроциты лизировали с использованием лизирующего буфера АСК и полученные МКПК анализировали на предмет иммунных ответов на опухолевые антигены. МКПК либо инкубировали в отсутствии пептида, либо стимулировали 2 мкг/мл пептидов (RGPESRLL) всего в течение 5 часов с добавлением golgi plug через 1 час после начала стимуляции. После стимуляции МКПК окрашивали на предмет CD4, CD8 и IFNγ, и анализировали на FACSCanto и FlowJo. Отвечающие Т-клетки детектировали после внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) на предмет IFN-γ путем проточной цитометрии. Значения, полученные от нестимулированных МКПК, рассматривали в качестве фоновых и вычитали из значений, полученных от стимулированных МКПК. Данные представляют собой среднее значение +/- SEM. В таблице 2 показано, что пептиды NYESO1 могли стимулировать выработку IFN-γ в клетках CD8, что указывает на наличие иммунного ответа.

[00147] Пример 8: конструирование и иммунотестирование лентивирусных примирующих векторов и онколитических вакцинных векторов, экспрессирующих белок, представляющий собой шести-трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы человека:

[00148] Трансген huSTEAP представляет собой полноразмерную последовательность дикого типа (SEQ ID NO: 11), кодон-оптимизированную для экспрессии у человека и мыши с образованием 341-аминокислотного белка (SEQ ID NO: 10).

[00149] Лентивирусы, экспрессирующие белок, представляющий собой шести-трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы человека, получали с использованием лентивирусного вектора pDY.EG.WS. Трансген huSTEAP амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров, содержащих сайт рестрикции EcoRI (прямой праймер

[00150] Maraba MG1 создавали таким образом, чтобы он содержал трансген шести-трансмембранного эпителиального антигена предстательной железы человека, встроенный между вирусными генами G и L двойного мутанта MG1 вируса Maraba (Bran J. et al., (2010) Mol Ther 18:1440-1449). Последовательность трансгена кодон-оптимизировали для экспрессии в клетках млекопитающих. Полученный Maraba MG1, содержащий белок huSTEAP, обозначается «Maraba-MG1-huSTEAP» или «MG1-huSTEAP». Модифицированный остов Maraba MG1 использовали для облегчения клонирования. Молчащую мутацию вводили в ген L остова генома Maraba MG1 для удаления одного из сайтов Mlul. Второй сайт Mlul заменяли сайтом BsiWI в области клонирования между G и L. Данные модификации остова генома Maraba MG1 позволяли получить систему более направленного клонирования, чем система, описанная в документе Brun et al., поскольку она позволяет избежать использования шаттл-плазмиды pMRB-MG1/pNF. Последовательность трансгена huSTEAP лигировали в модифицированный остов генома Maraba MG1 в сайте MluI и сайте BsiWI (в области клонирования между G и L). Затем Maraba-MG1-huSTEAP восстанавливали (как описано ранее в Brun J. et al., (2010) Mol Ther 18:1440-1449), один раз очищали методом бляшек и подвергали очистке с использованием Opti-Prep. Maraba-MG1-huSTEAP содержит геномную последовательность, которая является обратно-комплементарной и РНК-версией SEQ IDNO: 12.

[00151] Как правило, животных иммунизировали путем введения примирующего вектора (лентивирус-huSTEAP + poly I:С качестве адъюванта) в 0 день и путем введения 1е9 БОЕ бустер-вектора (Maraba-MG1-huSTEAP) в 14 день. Контрольных мышей вакцинировали по типу прайм-буст вирусными векторами, кодирующими GFP вместо трансгена huSTEAP в качестве встраивания контрольного неиммуногенного трансгена. Анализ ответа на примирующий вектор проводили в 14 день и 19 день. Каждый препарат лентивирус-huSTEAP получали с использованием 250 мкг poly I:С, добавляемого в качестве адъюванта к примирующему вирусу, а затем делили между 5 животными для каждого вируса. Мышей анестезировали изофлураном и 30 мкл лентивирус-huSTEAP/poly I:С вводили путем инъекции в каждую подушечку задних лап. Оставшийся вирус вводили путем инъекции подкожно рядом с левым паховым лимфатическим узлом. Через 14 дней после примирования кровь забирали и анализировали путем проточной цитометрии. Затем мышей бустировали 1×10⁹ БОЕ MG1-huSTEAP внутривенно. Через пять дней после бустирования брали кровь и оценивали иммунные ответы путем проточной цитометрии.

[00152] Анализ иммунных ответов проводили следующим образом: кровь забирали путем ретроорбитального кровопускания с использованием гепаринизированного капилляра и кровь собирали в гепарин. Затем эритроциты лизировали с использованием лизирующего буфера ACK и полученные МКПК анализировали на предмет иммунных ответов на антигены опухоли. МКПК либо инкубировали в отсутствии пептида, либо стимулировали пептидами всего в течение 5 часов с добавлением golgi plug через 1 час после начала стимуляции. МКПК либо инкубировали в отсутствии пептида, либо стимулировали 2 мкг/мл пептидов (RSRYKLL) всего в течение 5 часов с добавлением golgi plug через 1 час после начала стимуляции. После стимуляции МКПК окрашивали на предмет CD4, CD8 и IFNγ, и анализировали на FACSCanto и FlowJo. Отвечающие Т-клетки детектировали после внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) на предмет IFN-γ путем проточной цитометрии. Значения, полученные от нестимулированных МКПК, рассматривали в качестве фоновых и вычитали из значений, полученных от стимулированных МКПК. Данные представляют собой среднее значение +/- SEM. В таблице 3 показано, что пептиды huSTEAP могли стимулировать выработку IFN-γ в клетках CD8, что указывает на наличие иммунного ответа.

[00153] Пример 9: конструирование и иммунотестирование лентивирусных примирующих векторов и онколитических вакцинных векторов, экспрессирующих ядерный антиген 1 вируса Эпштейна-Барр:

[00154] Трансген EBDNA1 представляет собой частичную нуклеотидную последовательность полноразмерного EBDNA1 дикого типа (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/Q1HVF7.1) с делецией последовательности, кодирующей повторы глицин-аланин (которая делит белок на амино- и карбоксиконцевые домены). Данная последовательность, по-видимому, стабилизирует белок, предотвращая протеасомный распад, а также нарушая процессирование антигена и МНС I-рестриктированную презентацию антигена (Levitskaya J et al., (1995) Nature 375:685-688). Укороченную нуклеотидную последовательность EBDNA1 (SEQ ID NO: 17) кодон-оптимизировали для экспрессии у человека и мыши с образованием 238-аминокислотного белка (SEQ IDNO: 16).

[00155] Лентивирусы, экспрессирующие белок, представляющий собой ядерный антиген 1 вируса Эпштейна-Барр, получали с использованием лентивирусного вектора pDY.EG.WS. Модифицированный трансген EBDNA1 амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров, содержащих сайт рестрикции EcoRI (прямой праймер

[00156] Maraba MG1 создавали таким образом, чтобы он содержал трансген ядерного антигена 1 вируса Эпштейна-Барр, встроенный между вирусными генами G и L двойного мутанта MG1 вируса Maraba (Brun J. et al., (2010) Mol Ther 18:1440-1449). Последовательность трансгена кодон-оптимизировали для экспрессии в клетках млекопитающих. Полученный Maraba MG1, содержащий белок EBVDNA1, обозначается «Maraba-MG1-EBVDNA1» или «MG1-EDVDNA1». Модифицированный остов Maraba MG1 использовали для облегчения клонирования. Молчащую мутацию вводили в ген L остова генома Maraba MG1 для удаления одного из сайтов Mlul. Второй сайт Mlul заменяли сайтом BsiWI в области клонирования между G и L. Данные модификации остова генома Maraba MG1 позволяли получить систему более направленного клонирования, чем система, описанная в документе Brun et al., поскольку она позволяет избежать использования шаттл-плазмиды pMRB-MG1/pNF. Последовательность трансгена EBDNA1 лигировали в модифицированный остов генома Maraba MG1 в сайте Mlul и сайте BsiWI (в области клонирования между G и L). Затем трансген Maraba-MG1-EBDNA1 восстанавливали (как описано ранее в Brun J. et al., (2010) Mol Ther 18:1440-1449), один раз очищали методом бляшек и подвергали очистке с использованием Opti-Prep.

[00157] Как правило, животных иммунизировали путем введения примирующего вектора (лентивирус-EBDNA1 + poly I:С качестве адъюванта) в 0 день и путем введения 1е9 БОЕ бустер-вектора (Maraba-MG1-EBDNA1) в 14 день. Контрольных мышей вакцинировали по типу прайм-буст вирусными векторами, кодирующими GFP вместо трансгена ТАА в качестве встраивания контрольного неиммуногенного трансгена. Анализ ответа на примирующий вектор проводили в 14 день и 19 день. Каждый препарат лентивирус-EBDNA1 получали с использованием 250 мкг poly I:С, добавляемого в качестве адъюванта к примирующему вирусу, а затем делили между 5 животными для каждого вируса. Мышей анестезировали изофлураном и 30 мкл лентивирус-EBDNA1/poly I:С вводили путем инъекции в каждую подушечку задних лап. Оставшийся вирус вводили путем инъекции подкожно рядом с левым паховым лимфатическим узлом. Через 14 дней после примирования кровь забирали и анализировали путем проточной цитометрии. Затем мышей бустировали 1×10⁹ БОЕ MG1-EBVDNA1 внутривенно. Через пять дней после бустирования брали кровь и оценивали иммунные ответы путем проточной цитометрии.

[00158] Анализ иммунных ответов проводили следующим образом: кровь забирали путем ретроорбитального кровопускания с использованием гепаринизированного капилляра и кровь собирали в гепарин. Затем эритроциты лизировали с использованием лизирующего буфера АСК и полученные МКПК анализировали на предмет иммунных ответов на опухолевые антигены. МКПК либо инкубировали в отсутствии пептида, либо стимулировали 2 мкг/мл пептидов (VYGGSKTSL) всего в течение 5 часов с добавлением golgi plug через 1 час после начала стимуляции. После стимуляции МКПК окрашивали на предмет CD4, CD8 и IFNγ, и анализировали на FACSCanto и FlowJo. Отвечающие Т-клетки детектировали после внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) на предмет IFN-γ путем проточной цитометрии. Значения, полученные от нестимулированных МКПК, рассматривали в качестве фоновых и вычитали из значений, полученных от стимулированных МКПК. Данные представляют собой среднее значение +/- SEM. Пептиды EBVDNA1 не могли стимулировать выработку IFN-γ в CD8 Т-клетках, что указывает на отсутствие иммунного ответа, как показано в таблице 4.

[00159] Пример 10: влияние циклофосфамида на стратегию с применением вакцины на основе аденовируса-ОВ по типу прайм-буст:

[00160] Циклофосфамид (CPA) представляет собой химиотерапевтический агент, применяемый для лечения различных видов рака. Для эффективной химиотерапии требуются высокие дозы данного лекарственного средства. Считается, что высокие дозы CPA приводят к иммуносупрессии, тогда как низкие дозы указанного лекарственного средства могут приводить к усилению иммунных ответов на различные антигены. Удивительным образом, в стратегии гетерологичной вакцинации прайм-буст согласно настоящему изобретению CPA приводит к повышению иммунного ответа при введении только до примирования иммунной системы первым вирусом.

[00161] Для получения метастазов в легких мышам С57 В1/6 (в возрасте 8-10 недель в начале исследования) внутривенно вводили путем инъекции 2,5×10⁵ клеток B16-F10 (клетки меланомы мыши, экспрессирующие антиген DCT мыши) в 200 мкл соленой воды в 0 день. Через пять дней после прививания B16-F10 мыши получали примирующую вакцину Ad-hDCT (2×10⁸ БОЕ в 200 мкл ФБР внутримышечно) с последующей, спустя 14 дней, однократной внутривенной дозой VSV-hDCT (2×10⁹ БОЕ в 200 мкл ФБР внутривенно) в качестве онколитической бустер-вакцины. Кроме того, мыши получали либо носитель, либо CPA (1 мг/20 г мыши, интраперитонеально) в день (-1) перед примированием и/или в 13 день перед бустированием. На фиг. 9 можно видеть, что CPA, вводимый перед примирующим вектором, значительно увеличивал выживаемость, тогда как CPA, вводимый перед бустер-вектором, не увеличивал выживаемость (данные не представлены).

[00162] В предшествующем описании в целях пояснения приведено множество подробностей для обеспечения полного понимания примеров. Вышеописанные примеры приведены только в качестве примера. Специалистом в данной области техники могут быть произведены изменения, модификации и вариации конкретных примеров в пределах объема, определяемого исключительно прилагаемой формулой изобретения.

Приложение А - белковые и нуклеотидные последовательности

Белковая последовательность полноразмерного MAGEA3 человека дикого типа (SEQ ID NO: 1):

Последовательность ДНК, кодирующая полноразмерный MAGEA3 человека дикого типа (SEQ ID NO: 2):

Кодон-оптимизированная последовательность ДНК, кодирующая полноразмерный белок MAGEA3 человека дикого типа (SEQ ID NO: 3):

Белковая последовательность варианта полноразмерного MAGEA3 человека дикого типа (SEQ ID NO: 4):

Последовательность ДНК, кодирующая вариант полноразмерного MAGEA3 человека дикого типа (SEQ ID NO: 5):

Белковая последовательность гибридного белка Е6/Е7 HPV (SEQ ID NO: 7):

Последовательность ДНК для гибридного белка Е6/Е7 HPV (SEQ ID NO: 8):

Белковая последовательность белка huSTEAP (SEQ ID NO: 10):

Последовательность ДНК для белка huSTEAP (SEQ ID NO: 11):

Белковая последовательность белка NYESO1 MAR (SEQ ID NO: 13):

Последовательность ДНК для NYESO1 MAR (SEQ ID NO: 14):

Белковая последовательность EBDNA1 (SEQ ID NO: 16):

Последовательность ДНК для EBDNA1 (SEQ ID NO: 17):

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Описано применение для лечения пациента с раком, экспрессирующим опухолеассоциированный антигенный белок MAGEA3, выделенной вирусной частицы Maraba MG1 и первого вируса. Частица содержит нуклеиновую кислоту, которая способна экспрессировать опухолеассоциированный антигенный белок MAGEA3. Указанный антигенный белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 1, и включает по меньшей мере один опухолеассоциированный эпитоп MAGEA3, выбранный из группы, состоящей из: FLWGPRALV (SEQ ID NO: 27), KVAELVHFL (SEQ ID NO: 28), EGDCAPEEK (SEQ ID NO: 35), KKLLTQHFVQENYLEY (SEQ ID NO: 36) и RKVAELVHFLLLKYR (SEQ ID NO: 37). Антигенный белок способен индуцировать иммунный ответ у указанного пациента в гетерологичном прайм-буст формате. Указанный первый вирус представляет собой аденовирус, содержащий нуклеиновую кислоту, способную экспрессировать опухолеассоциированный антигенный белок MAGEA3. Указанный антигенный белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 1, и включает по меньшей мере один опухолеассоциированный эпитоп MAGE A3, выбранный из группы, состоящей из: FLWGPRALV (SEQ ID NO: 27), KVAELVHFL (SEQ ID NO: 28), EGDCAPEEK (SEQ ID NO: 35), KKLLTQHFVQENYLEY (SEQ ID NO: 36) и RKVAELVHFLLLKYR (SEQ ID NO: 37). Описана онколитическая гетерологичная вирусная прайм-буст вакцина для лечения пациента с раком и применение выделенной вирусной частицы Maraba MG1 для индукции иммунного ответа у пациента в гетерологичном прайм-буст формате для онколитической вирусной терапии. Изобретение позволяет расширить арсенал средств, используемых для онколитической вирусной терапии. 3 н. и 30 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 10 пр.

Формула