Вакцины против малярии - RU2702163C2

Чертежи

Показать все 181 чертежа(ей)

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к частице, содержащей полипептид и по меньшей мере один антиген малярии, а также содержащей ее композиции или вакцине, ее применению в медицине, в частности, для предупреждения или лечения малярии.

Предшествующий уровень техники

Малярия является одним из наиболее распространенных в мире серьезных инфекционных заболеваний, при этом каждый год заражаются примерно 250 миллионов людей и 1 миллион умирают от малярии (WHO, 2009). Смертность преимущественно наблюдается среди детей в возрасте пяти лет и беременных женщин. В Африке каждые 45 секунд от малярии умирает ребенок. Заболевание передается от человека к человеку инфицированными москитами, поэтому ранее ликвидации очагов инфекции сводились к массовым компаниям по уничтожению насекомых. Это оказалось успешным, например, в юго-западной части США, в отличие от большинства слаборазвитых тропических стран. В настоящее время попытки включают распространение кроватей с сетками, в частности, кроватей, пропитанных инсектицидами, для предотвращения укусов москитов по ночам. Однако быстро возникает резистентность к инсектицидным веществам и противомалярийным лекарственным средствам, предназначенным для предупреждения и для лечения малярии. Таким образом, существует острая потребность в вакцине против малярии для защиты миллионов людей от заболевания (http://www.globalvaccines.org/content/malaria+vaccine+program/19614).

Малярия, вызываемая Plasmodium falciparum, остается главной угрозой общественному здоровью, особенно среди детей и беременных женщин в Африке. Эффективная вакцина против малярии будет являться ценным инструментом для снижения уровня заболеваемости и сможет содействовать устранению малярии в некоторых регионах мира. Существующие в настоящее время вакцины-кандидаты против малярии нацелены против стадий жизненного цикла паразитов у человека и москитов, но на сегодняшний день сравнительно небольшое число белков исследовано в отношении разработки потенциальной вакцины.

Наиболее перспективная из вакцин-кандидатов, RTS,S, обеспечивала частичную защиту от малярии на фазе II клинических исследований, и в настоящее время проходит оценку на стадии III клинических испытаний в Африке. (The Journal of Clinical Investigation 120(12) 4168-4178, 2010).

CSP является главным поверхностным антигеном на поверхности спорозоитов. CSP состоит из N-концевой области, которая связывается с протеогликанами, содержащими гепарин-сульфат (RI), центральной области, содержащей четыре аминокислотных повтора (NPNA), и GPI-заякоренной С-концевой области, содержащей тромбоспондин-подобный домен (RII). Область CSP, включенная в вакцину RTS,S, включает последние 16 повторов NPNA и весь фланкирующий С-конец. Частицы HBsAg служат в качестве матрицы-носителя для RTS,S, 25% которых слиты с сегментом CSP (The Journal of Clinical Investigation 120(12) 4168-4178, 2010).

В сериях фазы II клинических испытаний RTS,S 30-50% незараженных малярией взрослых, иммунизированных RTS,S, были защищены от заражения москитами, инфицированными гомологичным клоном P. Falciparum. На фазе II полевых испытаний в Гамбии и Кении вакцина RTS,S обеспечивала кратковременную защиту от малярийной инфекции у приблизительно 35% взрослых, хотя результаты испытаний в Кении не достигли статистической значимости. Приблизительно 30-50% детей и новорожденных, иммунизированных RTS,S на фазе II испытаний, проводимых в Мозамбике, Танзании и Кении, были защищены от клинической малярии, однако защита была, как правило, кратковременной (The Journal of Clinical Investigation 120(12) 4168-4178, 2010). Результаты опорного крупномасштабного испытания фазы III, опубликованные 9 ноября 2012 года, онлайн в New England Journal of Medicine (NEJM), показали, что противомалярийная вакцина-кандидат RTS,S может помочь защитить африканских новорожденных от малярии. При сравнении с иммунизацией контрольной вакциной, новорожденные (в возрасте 6-12 недель на момент первой вакцинации), вакцинированные RTS,S, имели на треть меньше эпизодов как клинической, так и тяжелой малярии, и показали сходные реакции на инъекцию.

В настоящее время не существует лицензированных вакцин против малярии. Имеется острая потребность в высокоэффективной вакцине против малярии.

Вирусоподобные частицы (VLP) представляют собой мультибелковые структуры, которые имитируют организацию и конформацию аутентичных нативных вирусов, но лишены вирусного генома, что позволяет получить более безопасные и более дешевые вакцины-кандидаты. Небольшое количество профилактических вакцин на основе VLP в настоящее время производится по всему миру: Engerix® фирмы GlaxoSmithKline (вирус гепатита B) и Cervarix® (папилломавирус человека), и Recombivax HB® фирмы Merck and Co., Inc. (вирус гепатита B) и Gardasile® (папилломавирус человека) являются некоторыми примерами. Другие вакцины-кандидаты на основе VLP проходят клинические испытания или подвергаются предклинической оценке, такие как вирус гриппа, парвовирус, вирус Норуолк и различные химерные VLP. Многие другие все еще ограничиваются фундаментальным исследованием в лабораторном масштабе, несмотря на их успешность в предклинических испытаниях. Сложности крупномасштабного производства VLP обсуждаются с точки зрения контроля процесса, мониторинга и оптимизации. Основные указанные выше и ниже технические проблемы выявлены и описаны соответствующим образом. Успешные вакцины-лидеры на основе VLP кратко описаны вместе с последними результатами клинических испытаний и последними разработками в области технологии на основе химерных VLP для терапевтической или профилактической вакцинации (Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010).

Вирус Чикунгунья (CHIKV) инфицировал миллионы людей в Африке, Европе и Азии после того, как этот альфавирус повторно появился из Кении в 2004 году. Тяжесть заболевания и распространенность этого эпидемического вируса представляет серьезную угрозу для здоровья людей в отсутствие вакцин или противовирусных терапий. Сообщается, что вакцина на основе VLP против эпидемического вируса Чикунгунья защищает приматов, не относящихся к человеку, от инфекции (Nat Med. 2010 March; 16(3): 334-338). В публикации патента США No. 2012/0003266 описана вирусоподобная частица (VLP), содержащая один или несколько структурных полипептидов вируса Чикунгунья, которую применяют для изготовления вакцины или антигенной композиции против вируса Чикунгунья, которая индуцирует иммунитет на инфекцию или, по меньшей мере, один его симптом. В WO2012/106356 описаны модифицированные вирусоподобные частицы (VLP) альфавируса или флавивируса и способы усиления выработки модифицированных VLP для применения в предупреждении или лечении заболеваний, опосредованных альфавирусом и флавивирусом. (эти цитированные ссылки включены здесь путем отсылки).

Сущность изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает частицу, способную к самосборке, которая содержит полипептид и по меньшей мере один антиген малярии, при этом указанный полипептид содержит по меньшей мере один участок присоединения, и указанный по меньшей мере один антиген малярии содержит по меньшей мере один второй участок присоединения, и при этом указанный полипептид и указанный антиген малярии связаны посредством указанного по меньшей мере одного первого и указанного по меньшей мере одного второго участка присоединения.

Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты, которая разработана для экспрессии частицы, обеспеченной в первом аспекте настоящего изобретения.

В третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию или вакцину, содержащую частицу, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, обеспеченную во втором аспекте настоящего изобретения.

В четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения антитела, включающий приведение в контакт частицы, обеспеченной в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, обеспеченной во втором аспекте настоящего изобретения, с млекопитающим.

В пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ иммуномодулирования, способ лечения малярии, способ индукции и/или усиления иммунного ответа против антигена малярии у млекопитающего, включающий введение млекопитающему композиции, обеспеченной в третьем аспекте настоящего изобретения.

В шестом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ пассивной иммунизации против патогена, вызывающего малярию, включающий введение млекопитающему антитела, обеспеченного в четвертом аспекте настоящего изобретения.

В седьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ презентации антигена на макрофаге, включающий приведение в контакт частицы, обеспеченной в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, обеспеченной во втором аспекте настоящего изобретения, с млекопитающим.

В восьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения частицы, обеспеченной в первом аспекте настоящего изобретения, включающий конструирование вектора для экспрессии указанной частицы; культивирование клетки, которая трансфицирована указанным вектором для экспрессии указанной частицы; и извлечение указанной частицы.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показан вектор pVLP74_—15 (VLP_CHI 532 NPNAx6).

На фигуре 2 показан вектор pVLP78_—15 (VLP_CHI 532 NPNAx25).

На фигуре 3 показан вектор pVLP74_—25 (VLP_VEEV 519 NPNAx6).

На фигуре 4 показано, что сыворотка, полученная от отдельных обезьян, иммунизированных VLP малярии, через 2 недели показала высокий титр антител против CSP.

На фигуре 5 показаны средние значения и стандартные отклонения (SD) данных, представленных на фигуре 4.

На фигуре 6 показаны эффекты комбинированной иммунизации VLP CHIKV и VLP VEEV на индукцию антител против CSP. На фигуре Adj обозначает адъювант.

На фигуре 7 показаны эффекты введенной VLP, слитой с антигеном без малярии, на индукцию антител против CSP. На фигуре 4 w, 6 w, 10 w и 14 w обозначают 4 недели после иммунизации, 6 недель после иммунизации. 10 недель после иммунизации и 14 недель после иммунизации, соответственно.

На фигуре 8 показаны эффекты введенной VLP, слитой с антигеном малярии, на индукцию антител против CSP. На фигуре 4 w, 6 w, 10 w и 14 w обозначают 4 недели после иммунизации, 6 недель после иммунизации. 10 недель после иммунизации и 14 недель после иммунизации, соответственно.

На фигуре 9 показаны эффекты введенной VLP, слитой с антигеном малярии, вместе с адъювантом на индукцию антител против CSP. На фигуре 4 w, 6 w, 10 w и 14 w обозначают 4 недели после иммунизации, 6 недель после иммунизации. 10 недель после иммунизации и 14 недель после иммунизации, соответственно.

На фигуре 10 показана схема эксперимента.

На фигуре 11 показана детекция 18S ДНК малярии посредством PCR.

Подробное описание изобретения

(1) Частица, содержащая полипептид и по меньшей мере один антиген малярии

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает частицу, способную к самосборке, которая содержит полипептид и по меньшей мере один антиген малярии, при этом указанный полипептид содержит по меньшей мере один первый участок присоединения, и указанный по меньшей мере один антиген содержит по меньшей мере один второй участок присоединения, и при этом указанный полипептид и указанный антиген малярии связаны посредством указанного по меньшей мере одного первого и указанного по меньшей мере одного второго участка присоединения.

Используемая здесь «частица, которая способна к самосборке», относится к частице, образованной по меньшей мере одним компонентом, который собирается спонтанно. Компонент может представлять собой полипептид или непептидное химическое соединение. В одном варианте осуществления «частица, которая способна к самосборке» может представлять собой частицу, содержащую или состоящую по меньшей мере из одного полипептида. По меньшей мере один полипептид состоит из одного или нескольких видов пептидов. В одном варианте осуществления указанная частица имеет диаметр по меньшей мере 10 нм, например, по меньшей мере 20 нм, предпочтительно, по меньшей мере 50 нм. В одном варианте осуществления молекулярная масса указанной частицы составляет от 100 кДа до 100000 кДа, предпочтительно, от 400 кДа до 30000 кДа.

Полипептид, используемый для настоящего изобретения, может быть спонтанно собирающимся. Полипептид может представлять собой структурный полипептид вируса. Таким образом, частица, обеспеченная настоящим изобретением, может представлять собой вирусоподобную частицу.

Структурный полипептид вируса может представлять собой природный полипептид вируса или его модифицированный полипептид. В одном варианте осуществления модифицированный полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична аминокислотной последовательности природного структурного полипептида вируса, включая капсид и оболочечный белок. В одном варианте осуществления модифицированный полипептид представляет собой мутант, в котором не более 10% аминокислот удалены, замещены и/или добавлены к природному структурному полипептиду вируса, включая капсид и оболочечный белок.

В одном варианте осуществления структурный полипептид вируса, используемый для настоящего изобретения, состоит или содержит капсид и/или оболочечный белок или его фрагмент. Например, структурный полипептид вируса, используемый для настоящего изобретения, состоит или содержит капсид и Е2 и Е1. Антиген может быть вставлен в Е2. В одном варианте осуществления частица, обеспеченная первым аспектом настоящего изобретения, может быть образована путем сборки 240 капсидов, 240 белков Е1 и 240 белков Е2, при этом антиген малярии вставлен в каждый из белков Е2.

Структурный полипептид вируса, используемый для настоящего изобретения, может быть получен из альфавируса или флавивируса. Таким образом, частица, обеспеченная настоящим изобретением, может представлять собой вирусоподобную частицу, полученную из альфавируса или флавивируса. Примеры альфавируса и флавивируса включают, но без ограничения, аура-вирус, вирус Babanki, пенящий вирус коров (Barmah Forest virus, BFV), вирус Bebaru, вирус Cabassou, вирус чикунгунья (Chikungunya virus, CHIKV), вирус восточного лошадиного энцефалита (Eastern equine encephalitis virus, EEEV), Эйлатский вирус, вирус Эверглейдса, вирус Fort Morgan, вирус Getah, вирус Highlands J, вирус Kyzylagach, вирус Mayaro, вирус Me Tri, вирус Middelburg, вирус Mosso das Pedras, вирус Mucambo, вирус Ndumu, вирус O′nyong-nyong, вирус Pixuna, вирус Rio Negro, вирус Ross River virus (RRV), вирус Salmon pancreas disease, вирус Semliki Forest, вирус Sindbis, вирус Southern elephant seal, вирус Tonate, вирус Trocara, вирус Una, вирус Venezuelan equine encephalitis (VEEV), вирус Western equine encephalitis (WEEV), вирус Whataroa, вирус West Nile, вирус денге, вирус клещевого энцефалита и вирус желтой лихорадки.

Малярия представляет собой заболевание, которым страдает человек или другое животное (например, мышь). Примеры малярии включают, но без ограничения, заболевание, вызванное разновидностями Plasmodium (P.), включая P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, P. knowlesi, P. berghei, P. chabaudi и P. Yoelii.

Используемый здесь термин «антиген малярии» относится к любому антигену или его фрагменту. Термин антиген или его фрагмент означает любую последовательность на основе пептида, которая может распознаваться иммунной системой и/или которая стимулирует опосредованный клетками иммунный ответ, и/или стимулирует образование антител.

Согласно Scand. J. Immunol. 56, 327-343, 2002, рассматривая весь жизненный цикл паразитов, существует в основном шесть мишеней для вакцины против малярии: (1) спорозоиты; (2) печеночная стадия; (3) мерозоиты; (4) инфицированные RBC; (5) токсины паразитов; (6) половые стадии.

В таблице приводятся основные антигены-кандидаты каждой идентифицированной стадии.

Таблица 1. Основные вакцинны-кандидаты из различных фаз жизненного цикла Plasmodium

(Scand. J. Immunol. 56, 327-343, 2002)

В соответствии с настоящим изобретением можно использовать один или несколько антигенов, указанных выше, при условии, что они формируются в частицу. Например, белок циркумспорозоита и его фрагмент можно использовать в качестве антигена. Примеры белка циркумспорозоита включают, но без ограничения, белок циркуспорозоита Plasmodium falciparum, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной ниже (SEQ ID No.: 56):

В одном варианте осуществления антиген малярии представляет собой В-клеточный эпитоп белка циркумспорозоита Plasmodium falciparum. Примером В-клеточного эпитопа белка циркумспорозоита Plasmodium falciparum может служить последовательность повтора NPNA, включая (NPNA)_4-30(то есть 4xNPNA, 5xNPNA, 6xNPNA, 7xNPNA, 8xNPNA, 9xNPNA, 10xNPNA, 11xNPNA, 12xNPNA, 13xNPNA 14xNPNA, 15xNPNA, 16xNPNA, 17xNPNA, 18xNPNA, 19xNPNA, 20xNPNA, 21xNPNA, 22xNPNA, 23xNPNA, 24xNPNA, 25xNPNA, 26xNPNA, 27xNPNA, 28xNPNA, 29xNPNA или 30xNPNA).

В одном варианте осуществления антиген малярии представляет собой В-клеточный эпитоп белка циркумспорозоита Plasmodium yoelii, включая (QGPGAP)_3-12.

В одном варианте осуществления антиген малярии представляет собой В-клеточный эпитоп белка циркумспорозоита Plasmodium vivax, включая (ANGAGNQPG)_1-12.

В одном варианте осуществления антиген малярии представляет собой В-клеточный эпитоп белка циркумспорозоита Plasmodium malariae, включая (NAAG)_4-30.

В одном варианте осуществления антиген малярии представляет собой Т-клеточный эпитоп белка циркумспорозоита Plasmodium falciparum. Примером Т-клеточного эпитопа белка циркумспорозоита Plasmodium falciparum может служить EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT (SEQ ID No.:44). Также, (EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT)_1-6можно использовать в качестве антигена малярии.

В одном варианте осуществления антиген малярии представляет собой Т-клеточный эпитоп белка циркумспорозоита Plasmodium yoelii, который представляет собой YNRNIVNRLLGDALNGPEEK (SEQ ID No.45). Также, (YNRNIVNRLLGDALNGPEEK)_1-6можно использовать в качестве антигена малярии.

Настоящее изобретение удовлетворяет одной или нескольким из указанных выше потребностей путем обеспечения антигенов, векторов, кодирующих антигены, и антител (и подобных антителам молекул, включая аптамеры и пептиды), которые специфически связываются с антигеном, в сочетании с их применением (отдельно или в комбинации) для предупреждения или лечения малярийных инфекций. Используемый здесь термин «антитело» относится к молекулам, которые способны связываться с эпитопом или антигенной детерминантой. Подразумевается, что данный термин охватывает целые антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, включая одноцепочечные антитела. Такие антитела включают антигенсвязывающие фрагменты антител человека и охватывают, но без ограничения, Fab, Fab′ и F(ab′)2, Fd, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидной связью Fv (sdFv) и фрагменты, содержащие VL- или VH-домен. Антитела могут происходить из любого животного, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно, антитела происходят от млекопитающих, например, человека, мыши, кролика, козы, морской свинки, верблюда, лошади и тому подобного, или других подходящих животных, таких как куры. Используемый здесь термин «человеческие» антитела охватывает антитела, характеризующиеся аминокислотной последовательностью человеческого иммуноглобулина, и охватывают антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных по одному или нескольким человеческим иммуноглобулинам и не экспрессирующих эндогенные иммуноглобулины, как описано, например, в патенте США № 5939598, раскрытие которого включено здесь полностью путем отсылки.

Антиген, используемый для настоящего изобретения, может представлять собой модифицированный полипептид, полученный из природного белка. Модифицированный полипептид может представлять собой фрагмент природного белка. В одном варианте осуществления модифицированный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична последовательности полипептида, полученного из природного белка. В одном варианте осуществления модифицированный полипептид представляет собой мутант, в котором не более 10% аминокислот удалены, замещены и/или добавлены по сравнению с полипептидом, полученным из природного белка.

В частице, обеспеченной настоящим изобретением, полипептид и антиген могут быть связаны посредством по меньшей мере одного участка присоединения, который присутствует в полипептиде, и по меньшей мере одного второго участка присоединения, который присутствует в антигене.

Как используется здесь, каждый из «первого участка присоединения» и «второго участка присоединения» относится к участку, в котором более чем одно вещество связано друг с другом.

В одном варианте осуществления полипептид и антиген слиты напрямую. Альтернативно, один или два линкера могут быть вставлены между N-концевым остатком антигена и полипептидом, и/или между С-концевым остатком антигена и полипептидом.

Антиген или полипептид может быть укорочен и заменен на короткие линкеры. В некоторых вариантах осуществления антиген или полипептид включают один или несколько пептидных линкеров. Обычно линкер состоит из 2-25 аминокислот. Как правило, он содержит от 2 до 15 аминокислот в длину, хотя в определенных случаях он может содержать только один остаток, такой как остаток глицина.

В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, в которой полинуклеотид, кодирующий полипептид, генетически слит с полинуклеотидом, кодирующим антиген, экспрессируется в клетке-хозяине таким образом, что первый участок присоединения и второй участок присоединения связаны посредством пептидной связи. В этом случае полипептид и антиген связаны посредством пептидной связи. Что касается этого варианта осуществления, первый участок присоединения и/или второй участок присоединения могут быть генетически модифицированы из исходного полипептида или антигена. Например, первый участок присоединения модифицирован из полипептида таким образом, что посредством линкерного пептида, включая SG, GS, SGG, GGS и SGSG, полипептид является конъюгированным с антигеном.

Когда полипептид химически конъюгирован с антигеном, первый участок присоединения и второй участок присоединения могут быть связаны посредством химического кросс-линкера, который представляет собой химическое соединение.

Примеры кросс-линкера включают, но без ограничения, SMPH, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA и другие кросс-линкеры, доступные от фирмы Pierce Chemical Company.

В одном варианте осуществления частица, обеспеченная в настоящем изобретении, содержит полипептид, связанный с антигеном, при этом пространственное расстояние между N-концевым остатком и С-концевым остатком антигена составляет 30 Å или менее, когда расстояние определено в кристалле антигена или природном белке, содержащем антиген, или модифицированном из него белке.

Антиген, используемый для настоящего изобретения, может быть разработан специалистом в данной области. Например, антиген, используемый для настоящего изобретения, может представлять собой природный белок или его фрагмент. Альтернативно, антиген, используемый для настоящего изобретения, может представлять собой белок, модифицированный из природного белка или его фрагмента. Специалист в данной области сможет разработать антиген таким образом, что пространственное расстояние между N-концевым остатком и С-концевым остатком антигена будет составлять 30 Å или менее, когда расстояние определено в кристалле антигена или природном белке, содержащем антиген, или модифицированном из него белке. Например, антиген, используемый для частицы, обеспеченной настоящим изобретением, может быть разработан с использованием бесплатного программного обеспечения, в том числе PyMOL (например, PyMOL версия 0.99: http:/www.pymol.org). В одном варианте осуществления пространственное расстояние между N-концевым остатком и С-концевым остатком антигена составляет 30 Å (ангстрем) или менее, 20 Å или менее, или 10 Å или менее (например, от 5 Å до 15 Å, от 5 Å до 12 Å, от 5 Å до 11 Å, от 5 Å до 10 Å, от 5 Å до 8 Å, от 8 Å до 15 Å, от 8 Å до 13 Å, от 8 Å до 12 Å, от 8 Å до 11 Å, от 9 Å до 12 Å, от 9 Å до 11 Å, от 9 Å до 10 Å или от 19 Å до 11 Å).

Вирусоподобная частица вируса Чикунгунья или вирусоподобная частица вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает вирусоподобную частицу вируса Чикунгунья или вирусоподобную частицу вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, содержащую структурный полипептид вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей и по меньшей мере один антиген малярии, при этом указанный структурный полипептид вируса Чикунгунья или указанный структурный полипептид вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей содержит по меньшей мере один первый участок присоединения, и указанный по меньшей мере один антиген малярии содержит по меньшей мере один второй участок присоединения, и при этом указанный структурный полипептид вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей и указанный по меньшей мере один антиген связаны посредством указанного по меньшей мере одного первого и указанного по меньшей мере одного второго участка присоединения.

В одном варианте осуществления пространственное расстояние между N-концевым остатком и С-концевым остатком антигена малярии может составлять 30 Å или менее; 25 Å или менее; 20 Å или менее; 15 Å или менее; 14 Å или менее; 13 Å или менее; 12 Å или менее; 11 Å или менее; 10 Å или менее; 9 Å или менее; или 8 Å или менее (например, от 5 Å до 15 Å, от 5 Å до 12 Å, от 5 Å до 11 Å, от 5 Å до 10 Å, от 5 Å до 8 Å, от 8 Å до 15 Å, от 8 Å до 13 Å, от 8 Å до 12 Å, от 8 Å до 11 Å, от 9 Å до 12 Å, от 9 Å до 11 Å, от 9 Å до 11 Å или от 10 Å до 11 Å), когда расстояние определено в кристалле антигена малярии или природном белке, содержащем антиген малярии, или модифицированном из него белке.

В одном варианте осуществления антиген малярии связан со структурным полипептидом вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей посредством химического перекрестного сшивания или находится в форме гибридного белка, полученного методом генной инженерии.

Структурный полипептид вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, используемый в настоящем изобретении, может содержать оболочечный белок и/или капсид вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей.

Примеры вируса Чикунгунья включают, но без ограничения, штаммы 37997 и LR2006 OPY-1.

Примеры вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей включают, но без ограничения, TC-83.

Структурный полипептид вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой природный структурный полипептид вируса или его модифицированный полипептид. Модифицированный полипептид может представлять собой фрагмент структурного полипептида природного вируса. В одном варианте осуществления модифицированный полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичную аминокислотной последовательности природного вирусного капсида и/или оболочечного белка. В одном варианте осуществления модифицированный полипептид представляет собой мутант, в котором не более 10% аминокислот удалены, замещены и/или добавлены по сравнению с природным вирусным капсидом и/или оболочечным белком. Например, мутация K64A или K64N может быть введена в капсид структурного полипептида вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, используемого в настоящем изобретении.

Структурный полипептид вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей может состоять или содержать капсид, Е2 и Е1.

Примеры структурного полипептида вируса Чикунгунья включают, но без ограничения, Капсид-Е2-Е1 вируса Чикунгунья штамма 37997 и Капсид-Е2-Е1 вируса Чикунгунья LR2006 OPY-1.

Примеры структурного полипептида вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей включают, но без ограничения, Капсид-Е2-Е1 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей штамма ТС-83.

Иллюстративная последовательность структурного полипептида вируса Чикунгунья представлена в Genbank под номером доступа No. ABX40006.1, и описана ниже (SEQ ID No.:1):

Другая иллюстративная последовательность структурного полипептида вируса

Чикунгунья представлена в Genbank под номером доступа No. ABX40011.1, и описана

ниже (SEQ ID No.:2):

Иллюстративная последовательность структурного полипептида вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей представлена ниже (SEQ ID No.:3):

В одном варианте осуществления первый участок присоединения содержит аминогруппу, предпочтительно аминогруппу остатка лизина. В одном варианте осуществления второй участок присоединения содержит сульфгидрильную группу, предпочтительно сульфгидрильную группу цистеина.

В одном варианте осуществления конъюгирование более чем двух веществ (например, антигена и структурного полипептида вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей) посредством первого участка присоединения или второго участка присоединения достигается с использованием химического кросс-линкера. Примеры кросс-линкера включают, но без ограничения, SMPH, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA и другие кросс-линкеры, доступные от фирмы Pierce Chemical Company.

В соответствии с настоящим изобретением может быть обеспечена вирусоподобная частица вируса Чикунгунья или венесуэльского энцефаломиелита лошадей, содержащая структурный полипептид вируса Чикунгунья или венесуэльского энцефаломиелита лошадей и антиген, при этом указанный структурный полипептид вируса Чикунгунья или венесуэльского энцефаломиелита лошадей и указанный антиген экспрессируются в виде гибридного белка.

В одном варианте осуществления антиген может быть слит с любым участком структурного полипептида вируса Чикунгунья или венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Например, антиген может быть напрямую или опосредованно связан с N- или С-концом структурного полипептида вируса Чикунгунья или венесуэльского энцефаломиелита лошадей, или антиген может быть вставлен в структурный белок вируса Чикунгунья или венесуэльского энцефаломиелита лошадей.

В одном варианте осуществления по меньшей мере один антиген вставлен в Е2 структурного белка вируса Чикунгунья или венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Например, в отношении структурного белка вируса Чикунгунья, по меньшей мере один антиген вставлен между остатками 519 и 520 SEQ ID No.1 или 2 (то есть между G в 519-положении и Q в 520-положении SEQ ID No.1 или 2); между остатками 530 и 531 SEQ ID No.1 или 2 (то есть между G в 530-положении и S в 531-положении SEQ ID No.1 или 2); между остатками 531 и 532 SEQ ID No.1 или 2 (то есть между S в 531-положении и N в 532-положении SEQ ID No.1 или 2); между остатками 529 и 530 SEQ ID No.1 или 2 (то есть между G в 529-положении и G в 530-положении SEQ ID No.1 или 2); или между остатками 510 и 511 SEQ ID No.1 или 2 (то есть между S в 510-положении и G в 511-положении SEQ ID No.1 или 2); или между остатками 511 и 512 SEQ ID No.1 или 2 (то есть между G в 511-положении и N в 512-положении SEQ ID No.1 или 2); или между остатками 509 и 510 SEQ ID No.1 или 2 (то есть между Q в 509-положении и S в 510-положении SEQ ID No.1 или 2).

Например, в отношении структурного белка вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, по меньшей мере один антиген вставлен между остатками 517 и 518 SEQ ID No.3 (то есть между G в 517-положении и S в 518-положении SEQ ID No.3); между остатками 518 и 519 SEQ ID No.3 (то есть между S в 518-положении и S в 519-положении SEQ ID No.3); между остатками 519 и 520 SEQ ID No.3 (то есть между S в 519-положении и V в 520-положении SEQ ID No.3); между остатками 515 и 516 SEQ ID No.3 (то есть между L в 515-положении и S в 516-положении SEQ ID No.3); между остатками 516 и 517 SEQ ID No.3 (то есть между S в 516-положении и G в 517-положении SEQ ID No.3); между остатками 536 и 537 SEQ ID No.3 (то есть между C в 536-положении и G в 537-положении SEQ ID No.3); между остатками 537 и 538 SEQ ID No.3 (то есть между G в 537-положении и G в 538-положении SEQ ID No.3); между остатками 538 и 539 SEQ ID No.3 (то есть между G в 538-положении и T в 539-положении SEQ ID No.3).

Гибридный белок можно экспрессировать с применением общепринятых в данной области методов. Для экспрессии гибридного белка можно использовать различные системы экспрессии. Например, гибридный белок можно экспрессировать в клетках 293, клетках Sf9 или E. coli.

Полипептид, полученный из вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV), может представлять собой природный вирусный полипептид или его модифицированный полипептид. Кроме того, полипептид, полученный из антигена малярии, может представлять собой природный полипептид или модифицированный полипептид природного полипептида, или фрагмент природного полипептида или модифицированного пептида. Модифицированный полипептид может представлять собой фрагмент природного структурного полипептида вируса.

В одном варианте осуществления модифицированный полипептид, полученный из антигена малярии, содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична аминокислотной последовательности природного полипептида. В одном варианте осуществления модифицированный пептид, полученный из антигена малярии, представляет собой мутант, в котором не более 10% аминокислот удалены, замещены и/или добавлены, по сравнению с природным полипептидом, полученным из антигена малярии.

В случае, когда полипептид, полученный из вируса, конъюгирован с полипептидом, полученным из антигена, можно использовать линкерный пептид, включая SG, GS, SGG, GGS SGSG и TRGGS. Примеры конъюгирования полипептида, полученного из вируса (называемого ниже как «PFV»), с полипептидом, полученным из антигена (называемым ниже как «PFA»), включают, но без ограничения: PFV-SG-PFA-GS-PFV; PFV-SG-PFA-GGS-PFV; PFV-SSG-PFA-GS-PFV; PFV-SGG-PFA-GGS-PFV; PFV-SGSG-PFA-GS-PFV; и PFA-SGG-PFA-TRGGS-PFV.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает вирусоподобную частицу, содержащую гибридный белок полипептида, полученного из вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV), и полипептида, полученного из антигена малярии, при этом вирусоподобная частица получена путем трансфекции экспрессирующего вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 28, 31, 34, 37, 39, 41 или 43, в клетку млекопитающего (например, клетку 293F). Что касается этого варианта осуществления, модифицированный гибридный белок может быть также использован для вирусоподобной частицы, обеспеченной настоящим изобретением, которая может быть получена путем трансфекции клетки млекопитающего (например, клетки 293F) экспрессирующим вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, соответствующую аминокислотной последовательности, которая, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична SEQ ID NO. 28, 31, 34, 37, 39, 41 или 43.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает вирусоподобную частицу, содержащую или состоящую из:

одного или нескольких капсидов вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV);

одного или нескольких Е1 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV); и

одного или нескольких Е2 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV), при этом антиген малярии вставлен в Е2 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV). Например, настоящее изобретение обеспечивает вирусоподобную частицу, содержащую или состоящую из:

240 капсидов вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV);

240 Е1 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV); и

240 Е2 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV), при этом антиген малярии вставлен в каждый из Е2 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV).

В этом варианте осуществления Е2, в который вставлен антиген, может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID No.50; E1 может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID No.51; и капсид может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO.: 52; или

Е2, в который вставлен антиген, может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO.53; Е1 может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO.54; и капсид может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO.55.

Кроме того, что касается этого варианта осуществления, модифицированный капсид вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV), модифицированный Е1 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV), и модифицированный Е2 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV) можно использовать для вирусоподобной частицы. Например, модифицированный капсид вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV) может содержать аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO.: 52 или SEQ ID No.:55; модифицированный Е1 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV) может содержать аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO.: 51 или SEQ ID No.:54; и/или модифицированный Е2 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV) может содержать аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO.: 50 или SEQ ID No.:53.

Также, модифицированный капсид, Е1 или Е2 могут представлять собой мутант, в котором не более 10% аминокислот удалены, замещены и/или добавлены по сравнению с капсидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO.: 52 или SEQ ID No.:55; E1, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO.: 51 или SEQ ID No.:54; и/или E2, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO.: 50 или SEQ ID No.:53.

(2) Нуклеотид, вектор, клетка-хозяин

Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты, которая разработана для экспрессии частицы, обеспеченной в первом аспекте настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует вирусоподобную частицу вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV), как описано выше.

Примеры нуклеотидной последовательности, которая кодирует вирусоподобную частицу вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, включают, но без ограничения, нуклеотидную последовательность, кодирующую оболочку вируса Чикунгунья штамма 37997; нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид-оболочку вируса Чикунгунья штамма 37997; нуклеотидную последовательность, кодирующую оболочку вируса Чикунгунья штамма LR2006 OPY-1; нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид-оболочку вируса Чикунгунья штамма LR2006 OPY-1; нуклеотидную последовательность, кодирующую оболочку вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей штамма ТС-83; и нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид-оболочку вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей штамма ТС-83.

Что касается вируса Чикунгунья, иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует оболочку, описана ниже (SEQ ID No.:4):

Что касается вируса Чикунгунья, еще одна иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует оболочку, описана ниже (SEQ ID No.:5):

Что касается вируса Чикунгунья, иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует капсид-оболочку, описана ниже (SEQ ID No.:6):

Что касается вируса Чикунгунья, еще одна иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует капсид-оболочку, описана ниже (SEQ ID No.:7):

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, как описано выше, при этом вектор необязательно содержит последовательность, контролирующую экспрессию, оперативно связанную с молекулой нуклеиновой кислоты.

Примеры последовательности, контролирующей экспрессию, включают, но без ограничения, промотор, такой как промотор CMV, PL промотор фага лямбда, промоторы lac, phoA и tac E. coli, ранние и поздние промоторы SV40, и промоторы ретровирусных LTR.

В этом варианте осуществления вектор, содержащий последовательность, контролирующую экспрессию, оперативно связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, как описано выше, может быть использован в качестве экспрессирующего вектора для получения частицы, обеспеченной первым аспектом настоящего изобретения.

Вектора экспрессии могут быть получены специалистом в данной области на основе WO/2012/006180, полное содержание которого включено здесь путем отсылки.

Примеры векторов, которые могут быть использованы для экспрессии вирусоподобной частицы, содержащей гибридный белок полипептида, полученного из вируса Чикунгунья (CHIKV), и полипептида антигена, включают вектор, показанный в векторе VLP_CHI 512 (SEQ ID No.:8), содержащем полинуклеотид VLP CHIKV (SEQ ID No. 13; соответствующая аминокислотная последовательность представлена SEQ ID No.:14); и векторе VLP_CHI 532 (SEQ ID No.: 9), содержащем полинуклеотид VLP CHIKV (SEQ ID No. 15; соответствующая аминокислотная последовательность представлена SEQ ID No.:16).

Экспрессирующие вектора могут быть получены специалистом в данной области на основе US2012/0003266, полное содержание которого включено здесь путем отсылки.

Примеры векторов, которые могут быть использованы для экспрессии вирусоподобной частицы, содержащей гибридный белок полипептида, полученного из вируса венесуэльского энцефомиелита лошади (VEEV), и полипептида антигена, включают вектор, показанный в векторе VLP_VEEV VLP 518 (SEQ ID No.:10), содержащем полинуклеотид VLP VEEV (SEQ ID No. 17; соответствующая аминокислотная последовательность представлена SEQ ID No.:18); векторе VLP_VEEV VLP 519 (SEQ ID No.11), содержащем полинуклеотид VLP VEEV (SEQ ID No. 19; соответствующая аминокислотная последовательность представлена SEQ ID No.:20); и векторе VLP_VEEV VLP 538 (SEQ ID No.: 12), содержащем полинуклеотид VLP VEEV (SEQ ID No. 21; соответствующая аминокислотная последовательность представлена SEQ ID No.:22).

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предлагается молекула нуклеиновой кислоты, которая разработана для экспрессии вирусоподобной частицы, содержащей гибридный белок полипептида, полученного из вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита (VEEV), и полипептида, полученного из антигена малярии, которая состоит из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID No.26-27, 29-30, 32-33, 35-36, 38, 40 или 42.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предлагается молекула нуклеиновой кислоты, которая модифицирована из молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную любой из SEQ ID No.26-27, 29-30, 32-33 или 35-36, 38, 40, или 42. Модифицированная молекула нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичную нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, представленной любой из SEQ ID No.26-27, 29-30, 32-33, 35-36, 38, 40 или 42. Также, модифицированная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой мутант, в котором не более 10% аминокислот удалены, замещены и/или добавлены по сравнению с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную любой из SEQ ID No.26-27, 29-30, 32-33, 35-36, 38, 40 или 42.

(3) Композиция или вакцина

В третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию или вакцину, содержащую частицу, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, обеспеченную во втором аспекте настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предлагается композиция или вакцина, содержащая вирусоподобную частицу альфавируса или флавивируса (например, вирусоподобную частицу вируса Чикунгунья или вирусоподобную частицу вируса венесуэльского энцефаломиелита лошади), как описано выше, или молекулу нуклеиновой кислоты, как описано выше. Содержание вирусоподобной частицы альфавируса или флавивируса и содержание молекулы нуклеиновой кислоты может составлять 0,00001-1 масс.%.

Величина дозы частицы, обеспеченной в первом аспекте настоящего изобретения (например, VLP CHIKV или VLP VEEV), может составлять 1-500 мкг/день.

Один или несколько антигенов малярии могут быть использованы для одной композиции или одной вакцины, обеспеченной третьим аспектом настоящего изобретения.

Композиция или вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель и/или адъювант. Примеры адъюванта включают, но без ограничения, соли алюминия, гидроксид натрия, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда и раствор Риби (Sigma Adjuvant system, Sigma-Aldrich). Композиция или вакцина, обеспеченная в третьем аспекте настоящего изобретения, может содержать буферный агент, такой как двухосновный натрия фосфат, дигидрофосфат натрия и хлорид натрия; и консервант, такой как тимеросал. В одном варианте осуществления композиция или вакцина представляет собой водный раствор, содержащий 0,001-1 масс.% частицы, обеспеченной в первом аспекте настоящего изобретения (например, VLP CHIKV или VLP VEEV), 1-10 масс.% буферного агента, 0,01-1 масс.% адъюванта и 0,00001-0,001 масс.% консерванта.

Специалист в данной области сможет приготовить фармацевтическую композицию и вакцину с использованием общепринятых методов. Например, частицу, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения, смешивают с буферным раствором, имеющим физиологическое значение рН (например, рН 5-9, рН 7), для приготовления фармацевтической композиции и вакцины, обеспеченной в третьем аспекте настоящего изобретения.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать один активный ингредиент или комбинацию из двух или более активных ингредиентов, при условии, что они не противоречат объектам настоящего изобретения. Например, для комбинированной терапии можно использовать цитокины, включая хемокины; антитело к цитокинам, такое как антитело против фактора некроза опухоли (TNF) (например, инфликсимаб, адалимумаб); антитело против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (например, бевацизумаб и ранибизумаб); антагонист рецепторов цитокинов, такой как антитело против рецептора эпидермального фактора роста человека (HER2) (например, трастузумаб), антитело против рецептора эпидермального фактора роста (EGF) (например, цетуксимаб), аптамер против VEGF (например, пегаптаниб); и иммуномодуляторы, такие как циклоспорин, такролимус, убенимекс.

В комбинации, содержащей множество активных ингредиентов, их соответствующее содержание может быть подходящим образом увеличено или уменьшено с учетом их терапевтических эффектов и безопасности.

Используемый здесь термин «комбинация» означает, что два или более активных ингредиентов вводят пациенту одновременно в форме единого объекта или дозы, или оба активных ингредиента вводят пациенту в виде раздельных объектов либо одновременно, либо последовательно, но без специальных временных ограничений, причем такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух компонентов в организме, предпочтительно в одно и то же время.

В одном варианте осуществления композиция представляет собой композицию вакцины, включая ДНК-вакцину. В одном варианте осуществления ДНК-вакцина, обеспеченная настоящим изобретением, включает олигонуклеотид, содержащий CpG.

Композицию или вакцину, обеспеченную в третьем аспекте настоящего изобретения, можно вводить один или несколько раз. В случае, когда композицию или вакцину, обеспеченную в третьем аспекте настоящего изобретения, вводят более чем один раз, различные частицы, обеспеченные в первом аспекте настоящего изобретения (например, VLP CHIKV или VLP VEEV), можно использовать для каждого введения. В одном варианте осуществления используют комбинацию иммунизации с использованием VLP CHIKV, обеспеченной в первом аспекте изобретения, и иммунизацию с использованием VLP VEEV, обеспеченной в первом аспекте изобретения. Например, VLP CHIKV, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения, можно использовать для 1-ой иммунизации, и VLP VEEV, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения, можно использовать для 2-ой иммунизации, или VLP VEEV, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения, можно использовать для 1-ой иммунизации, и VLP CHIKV, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения, можно использовать для 2-ой иммунизации.

Специалист в данной области может определить время проведения иммунизации с использованием композиции или вакцины, обеспеченной в третьем аспекте настоящего изобретения. Например, 2-ю иммунизацию выполняют через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель после 1-й иммунизации.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает набор, включающий:

(а) композицию вакцины, содержащую частицу, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения; и

(b) еще одну композицию вакцины, содержащую частицу, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения,

при этом частица, содержащаяся в (а), представляет собой вирусоподобную частицу, которая отличается от частицы, содержащейся в (b). В этом варианте осуществления частица, содержащаяся в (а), может представлять собой вирусоподобную частицу вируса Чикунгунья, и частица, содержащаяся в (b), может представлять собой вирусоподобную частицу вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает набор, включающий:

(а) композицию вакцины, содержащую частицу, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения; и

(b) еще одну композицию вакцины, содержащую частицу, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения;

(с) одну или несколько композиций вакцин, каждая из которых содержит частицу, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения,

при этом (а) использовали для первичной иммунизации, и (b) и (с) использовали для бустерной иммунизации; и частица, содержащаяся в (а), представляет собой вирусоподобную частицу, которая отличается от частицы, содержащейся в (b); и частица, содержащаяся в (с), отличается от частицы, содержащейся в (а) и (b), или является такой же, как частица, содержащаяся в (а) или (b).

Соответствующие композиции вакцин, содержащиеся в описанном выше наборе, можно вводить одновременно, раздельно или последовательно.

Вирусоподобную частицу альфавируса или флавивируса (например, вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей), обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения, или молекулу нуклеиновой кислоты, обеспеченную во втором аспекте изобретения, можно использовать для композиции и вакцины, обеспеченной в третьем аспекте настоящего изобретения.

Например, вирусоподобную частицу вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, содержащую или состоящую из:

одного или нескольких (например, 240) капсидов вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV);

одного или нескольких (например, 240) Е1 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV); и

одного или нескольких (например, 240) Е2 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV);

при этом антиген малярии вставлен в Е2 вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV), можно использовать для приготовления композиции или вакцины, обеспеченной в третьем аспекте настоящего изобретения. Е2, в который вставлен антиген, может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID No.50; Е1 может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID No.51; и капсид может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID No.52; или

Е2, в который вставлен антиген, может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID No.53; Е1 может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID No.54; и капсид может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID No.55.

Композицию или вакцину, обеспеченную в третьем аспекте настоящего изобретения, можно вводить млекопитающему (например, человеку) внутримышечно (i.m.), внутрикожно (i.c.), подкожно (s.c.), индрадермально (i.d.) или интраперитонеально (i.p.).

Композицию или вакцину, обеспеченную в третьем аспекте настоящего изобретения, можно применять для лечения или предупреждения малярии.

Таким образом, в настоящем изобретении предлагается также применение вирусоподобной частицы альфавируса или флавивируса (например, вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей), обеспеченной в первом аспекте настоящего изобретения, или молекулы нуклеиновой кислоты, обеспеченной во втором аспекте изобретения, для изготовления фармацевтической композиции или вакцины для лечения или предупреждения малярии.

(4) Способ получения антитела, способ иммуномодулирования, способ лечения малярии, способ индукции и/или усиления иммунного ответа против антигена малярии у млекопитающего, способ пассивной иммунизации, способ презентации антигена на макрофаге и способ получения частицы

В четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения антитела, включающий приведение в контакт частицы, обеспеченной в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, обеспеченной во втором аспекте настоящего изобретения, с млекопитающим.

Антитело, полученное в четвертом аспекте настоящего изобретения, может быть гуманизировано с применением общепринятых способов. Таким образом, в одном варианте осуществления способ, обеспеченный в четвертом аспекте изобретения, дополнительно включает стадию гуманизации антитела, вырабатываемого не относящимся к человеку млекопитающим.

Частицу, обеспеченную в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, обеспеченную во втором аспекте настоящего изобретения, можно вводить непосредственно в организм пациента, в пораженный орган или системно; или применять ex vivo к клеткам, полученным от пациента, или линии клеток человека, которые затем вводят пациенту, или использовать in vitro для отбора субпопуляции из иммунных клеток, таких как В-клетки или Т-клетки, полученные от пациента, которые затем повторно вводят пациенту.

В соответствии с настоящим изобретением вирусоподобную частицу можно применять для иммунной терапии.

В пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ иммуномодулирования, способ лечения малярии, способ индукции и/или усиления иммунного ответа против антигена малярии у млекопитающего, включающий введение млекопитающему композиции, обеспеченной в третьем аспекте настоящего изобретения.

В шестом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ пассивной иммунизации против вызывающего малярию патогена, включающий введение млекопитающему антитела, обеспеченного в четвертом аспекте настоящего изобретения.

В седьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ презентации антигена малярии на макрофаге, включающий приведение в контакт частицы, обеспеченной в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, обеспеченной во втором аспекте настоящего изобретения, с млекопитающим.

В восьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения частицы, обеспеченной в первом аспекте настоящего изобретения, включающий конструирование вектора для экспрессии указанной частицы; культивирование клетки, которая трансфицирована указанным вектором для экспрессии указанной частицы; и извлечение указанной частицы.

Примеры млекопитающего включают, но без ограничения, человека.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ получения антитела против антигена малярии, включающий приведение в контакт вирусоподобной частицы вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, как описано выше, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, как описано выше, с млекопитающим. Полученное антитело может представлять собой антитело, которое может специфически связываться с антигеном малярии, содержащимся в вирусоподобной частице вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, или антигеном малярии, кодируемым молекулой нуклеиновой кислоты. Способ получения антитела, обеспеченный настоящим изобретением, можно применять для получения моноклонального или поликлонального антитела против антигена малярии.

В одном варианте осуществления антитело против антигена малярии, полученное с помощью способа получения антитела в соответствии с настоящим изобретением, применяется для пассивной иммунизации. Способ пассивной иммунизации может включать введение полученного антитела млекопитающему.

В одном предпочтительном варианте осуществления иммуномодулирование, обеспеченное настоящим изобретением, представляет собой индукцию и/или усиление иммунного ответа против антигена малярии у млекопитающего. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ индукции и/или усиления иммунного ответа против антигена малярии у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества композиции, как описано выше.

Учитывая симптомы пациентов, инфицированных вирусом Чикунгунья или вирусом венесуэльского энцефаломиелита лошадей, а также необычно крупную молекулу вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, эта VLP может действовать эффективно и достаточно для направленного воздействия на макрофаг, и ее композиция, такая как цитокины и иммуномодулирующие соединения.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ презентации антигена на макрофаге, включающий введение млекопитающему вирусоподобной частицы вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, как описано выше, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, как описано выше. Вирусоподобная частица вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, обеспеченная настоящим изобретением, является подходящей для направленного воздействия на макрофаг. В одном варианте осуществления вирусоподобная частица вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, обеспеченная настоящим изобретением, представлена в виде системы доставки в макрофаг, по меньшей мере, одного антигена, который содержится в вирусоподобной частице вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ получения вирусоподобной частицы вируса Чикунгунья или вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, обеспеченной в первом аспекте настоящего изобретения, включающий конструирование вектора для экспрессии указанной частицы; культивирование клетки, которая трансфицирована указанным вектором для экспрессии указанной частицы; и извлечение указанной частицы. В этом варианте осуществления трансфекцию можно осуществить общепринятым способом. Клетки, используемые для трансфекции, могут представлять собой клетки 293. Извлечение VLP может включать сбор кондиционированной среды после трансфекции клеток вектором, и может дополнительно включать выделение VLP из кондиционированной среды с помощью ультрацентрифугирования.

Настоящее изобретение будет описано подробно с помощью следующих примеров, которые, однако, не предполагают ограничения объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Приготовление вирусоподобной частицы вируса Чикунгунья (CHIKV), содержащей структурный полипептид вируса и фрагмент антигена малярии

Использовали следующие полинуклеотиды белков CSP1 малярии. N-концевой линкер представляет собой SGG, и С-концевой линкер представляет собой GGS.

VLP74 (6 повторов NPNA аминокислотной последовательности)

Соответствующие полинуклеотиды вставляли между кодонами, кодирующими Ser в 531-положении и Asn в 532-положении SEQ ID No.15 или 16 (SEQ ID No.1 или 2) для конструирования плазмиды (называемой здесь как CHIKV-VLP74 или 78) для экспрессии вирусоподобной частицы вируса Чикунгунья, при этом модифицированный пептид, полученный из VLP74 или 78, вставлен в Е2 структурного полипептида вируса Чикунгунья.

Клетки 293F (Lifetechnology) трансфицировали плазмидой с использованием PEI (GE Healthcare) или GeneX (ATCC). Через 4 дня после трансфекции кондиционированную среду собирали и центрифугировали при 300 об/мин в течение 15 минут для отделения ее от клеток. Супернатант фильтровали с использованием фильтра 0,45 мкм с получением вирусоподобных частиц. Вирусоподобные частицы концентрировали с использованием колонки TFF и очищали с использованием колонки QXL (GE Healthcare) с получением очищенных вирусоподобных частиц. При иммунизации животных вирусоподобными частицами очищенные вирусоподобные частицы дополнительно концентрировали с использованием спин-колонки (отсечение по молекулярной массе: 100 кДа) с получением вирусоподобных частиц для иммунизации.

Экспрессию VLP, содержащей VLP74 или 78, конъюгированной со структурным полипептидом вируса Чикунгунья, подтверждали Вестерн-блоттингом с использованием антитела, специфического в отношении CHIVK (ATCC: VR-1241AF), и антитела, специфического в отношении VLP74 или 78.

Пример 2: Приготовление вирусоподобной частицы вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV), содержащей структурный полипептид вируса и фрагмента антигена малярии

Использовали те же самые полинуклеотиды белков CSP1 малярии (VLP74 и VLP78), которые использовали в примере 1. N-концевой линкер представляет собой SGG, и C-концевой линкер представляет собой GGS.

Соответствующие полинуклеотиды вставляли между кодонами, кодирующими Ser в 518-положении и Ser в 519-положении SEQ ID No.19 или 20 (SEQ ID No.3) для конструирования плазмиды (называемой здесь как VEEV-VLP74 или 78) для экспрессии вирусоподобной частицы вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, при этом модифицированный пептид, полученный из VLP74 или 78, вставляли в Е2 структурного полипептида вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей.

Клетки 293F (Lifetechnology) трансфицировали плазмидой с использованием PEI (GE Healthcare) или GeneX (ATCC). Через 4 дня после трансфекции кондиционированную среду собирали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут для отделения ее от клеток. Супернатант фильтровали с использованием фильтра 0,45 мкм с получением вирусоподобных частиц. Вирусоподобные частицы концентрировали с использованием колонки TFF и очищали с использованием колонки QXL (GE Healthcare) с получением очищенных вирусоподобных частиц. При иммунизации животных вирусоподобными частицами очищенные вирусоподобные частицы дополнительно концентрировали с использованием спин-колонки (отсечение по молекулярной массе: 100 кДа) с получением вирусоподобных частиц для иммунизации.

Экспрессию VLP, содержащей VLP74 или 78, конъюгированной со структурным полипептидом вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, подтверждали Вестерн-блоттингом с использованием антитела, специфического в отношении VEEV, и антитела, специфического в отношении VLP74 или 78.

Пример 3: Иммуногенность у приматов, не относящихся к человеку (обезьян)

Обезьян иммунизировали ×25-CHI (80 мкг) на 0 неделе и ×6-VEE (80 мкг) на 3 неделе путем внутримышечной инъекции с адъювантом и без адъюванта (Sigma Adjuvant System, Sigma, S6322). ×25-CHI означает 25 раз повторяющийся аминокислотный мотив NPNA белка CSP малярии на VLP-частице CHIKV (VLP78_—15). ×6-VEE означает 6 раз повторяющийся аминокислотный мотив NPNA белка CSP малярии на VLP-частице VEEV (VLP74_—25). Кровь собирали на 2 и 5 неделе после первой иммунизации.

96-луночный ELISA-планшет покрывали рекомбинантным белком циркумспорозоита (rCSP) (Reagent Proteins, ATG-422) при концентрации 50 нг в 100 мкл PBS буфера на лунку. После 2 часов инкубации планшеты промывали три раза буфером TBS, содержащим 0,05% Tween-20, и блокировали буфером TBS, содержащим 0.05% Tween-20 и 5% сухого молока. Активированную путем нагревания разбавленную сыворотку обезьян добавляли в блокирующий буфер и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания три раза добавляли меченный пероксидазой козий античеловеческий IgG или антимышиный IgG в разведении 1:4000, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания три раза субстрат пероксидазы добавляли для развития реакции и инкубировали в течение 10 мин, после чего реакцию останавливали путем добавления 2N H₂SO₄. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Gen5 (BioTek) и GraphPad Prism6 (GraphPad software Inc).

Результаты иммуногенности показаны на фигурах с 4 по 6.

Индукция антител против CSP была обнаружена в сыворотке всех обезьян, иммунизированных VLP малярии (смотри фигуру 4). Средние значения OD, указывающие на титр антител против CSP, показаны на фигуре 5. На фигуре 5 показано, что сыворотка от иммунизированных обезьян индуцировала высокий титр антител против CSP.

Как видно на фигуре 6, более высокий титр антител против CSP бы достигнут, когда VLP-частицу CHIKV, содержащую NPNA, и VLP-частицу VEEV, содержащую NPNA, использовали для первичной иммунизации и бустерной иммунизации, соответственно, по сравнению с тем, когда для первичной иммунизации и бустерной иммунизации использовали только VLP-частицу CHIKV, содержащую NPNA. Кроме того, на фигуре 6 показано, что при использовании адъюванта дополнительно повышается титр антител против CSP. Кроме того, на фигуре 6 показано, что введение 25 повторов NPNA вызывает более высокий титр антител против CSP по сравнению с введением 6 повторов CSP.

Титр антитела против Pf CSP в сыворотке, полученной от обезьян, иммунизированных ×25-CHI (80 мкг) на 0 неделе и ×6-VEE (80 мкг) на 3 неделе без использования адъюванта, измеряли с помощью ELISA в Malaria Serology Lab Malaria Vaccine Branch, WRAIR. В анализе ELISA, выполненном в Malaria Serology Lab Malaria Vaccine Branch, WRAIR, планшеты покрывали CSPrp ((NPNA)6 пептид) [0,2 мкг/мкл] (Поставщик: Eurogentec EP070034), и в качестве второго антитела использовали козий античеловеческий IgG (KPL/074-1002 LOT#120714). Конечный титр определяли по фактору разведения со значением OD 1,0 (414 нм).

В результате, титр антитела против Pf CSP в сыворотке от обезьян был повышенным после 2-й иммунизации по сравнению с 1-й иммунизацией (смотри таблицу 2). По сравнению с титром антитела против Pf CSP в сыворотке от обезьян, иммунизированных RTS,S (GlaxoSmithKline), титр антитела против Pf CSP в сыворотке от обезьян, иммунизированных ×25-CHI (80 мкг) и ×6-VEE (80 мкг) в отсутствие адъюванта, считался более высоким, даже несмотря на то, что RTS,S (GlaxoSmithKline) содержит адъювант.

Таблица 2

Пример 4: Иммуногенность у мышей

Мышей иммунизировали 10 мкг VLP78_—15 на неделе 0, 10 мкг VLP74_—25 на неделе 3 и 10 мкг VLP78_—15 на неделе 6 с адъювантом или без адъюванта (Sigma Adjuvant System, Sigma, S6322) путем внутримышечной инъекции.

Титр антитела против Pf CSP в сыворотке от иммунизированных мышей измеряли с помощью ELISA в Malaria Serology Lab Malaria Vaccine Branch, WRAIR, при этом планшеты были покрыты CSPrp ((NPNA) 6 пептид) [0,2 мкг/мкл] (Supplier: Eurogentec EP070034), и в качестве второго антитела использовали козий антимышиный IgG (KPL/074-1806 LOT#100737) для детекции антител в сыворотке.

Конечный титр определяли по фактору разведения, который достиг значения OD, равного 1,0 (414 нм).

Результаты иммуногенности показаны в таблицах 3 и 4.

В таблицах 3 и 4 показано, что более высокий титр антител против CSP был достигнут после трехкратной иммунизации вирусоподобной частицей. Кроме того, в таблицах 3 и 4 показано, что использование адъюванта повысило титр антител против CSP.

Таблица 3

Мыши на 3 неделе (после 1-й иммунизации)

QNS = количество, недостаточное для тестирования

Таблица 4

Пример 5: Иммуногенность VLP со вставкой P. yoelii CSP у мышей

QGPGAP, наблюдаемый в CSP малярии грызунов (P. yoelii CSP), использовали в качестве антигена. 6×QGPGAP вставляли в VLP CHIKV. Мышей иммунизировали 2 раза VLP CHIKV на 0 и 8 неделе (20 мкг VLP на мышь) путем внутримышечной инъекции с адъювантом или без адъюванта Ribi.

Иммуногенность подтверждали на 4, 6, 10 и 14 неделях после первой иммунизации. Антитела против P. yoelii CSP измеряли с помощью ELISA. Анализ ELISA выполняли таким же способом, как анализ ELISA, описанный в примере 3, за исключением того, что планшеты были покрыты повторяющейся пептидной последовательностью P. Yoelii CSP при 0,1 нг/мкл. Вторичное антитело представляло собой антимышиный IgG-HRP (Cell signal, #7076S). Результаты показаны на фигурах 7-9.

На фигурах 7-9 показано, что более высокий титр антител против CSP был достигнут путем внутримышечного введения VLP CHIKV, содержащей 6×QGPGAP. Кроме того, на фигурах 7-9 показано, что использование адъюванта повысило титр антител против CSP.

Пример 6: Защита мышей от малярии путем внутримышечной инъекции VLP CHIKV, содержащей эпитоп P. yoelii CSP: 6×QGPGAP

6×QGPGAP вставляли в VLP CHIKV. Мышей (n=5) иммунизировали 2 раза VLP CHIKV на 0 и 8 неделе (20 мкг VLP на мышь) путем внутримышечной инъекции с адъювантом или без адъюванта Ribi (смотри фигуру 10). Малярия грызунов: заражение P. yoelii (внутривенно (i.v.)) выполняли на 17 неделе (смотри фигуру 10).

Малярийную инфекцию подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции (PCR). Геномную ДНК выделяли из крови мышей через 6 дней после заражения. 18S ДНК малярии амплифицировали с помощью PCR. На фигуре 11 представлены результаты PCR, которые показывают, что все 5 контрольных мышей (инъекция PBS) были инфицированы малярией; все 5 мышей, иммунизированных контрольной VLP, были инфицированы малярией; из 5 мышей, иммунизированных VLP CHIKV, содержащей 6×QGPGAP, 2 мыши были инфицированы малярией и 3 мыши не были инфицированы малярией; и из 5 мышей, иммунизированных VLP CHIKV, содержащей 6×QGPGAP с адъювантом Ribi, 1 мышь была инфицирована малярией и 4 мыши не были инфицированы малярией.

Пример 7: Приготовление композиции вакцины, содержащей вирусоподобную частицу вируса Чикунгунья (CHIKV), содержащую повтор NPNA, или вирусоподобную частицу вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV), содержащую повтор NPNA

Вирусоподобную частицу вируса Чикунгунья (CHIKV), содержащую 6х или 25х NPNA, получали в соответствии с примером 1, и вирусоподобную частицу вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEEV), содержащую 6×NPNA, получали в соответствии с примером 2. Для приготовления композиции вакцины 80 мкг каждой из полученных частиц смешивали с 1 мл сахарозно-фосфатного раствора, рН 7,2, не содержащего эндотоксин (Teknova, SP-буфер).

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложена вирусоподобная частица для вакцинации против малярии, которая содержит структурный полипептид вируса, полученный из вируса Чикунгунья (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и по меньшей мере один антиген малярии, где указанный структурный полипептид вируса содержит по меньшей мере один первый участок присоединения в белке оболочки и указанный по меньшей мере один антиген малярии содержит по меньшей мере один второй участок присоединения, указанный антиген малярии является антигеном, содержащим (NPNA), где n составляет от 4 до 30, и/или антиген содержит (EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT), где y составляет от 1 до 6, и указанный структурный полипептид вируса и указанный антиген малярии связаны посредством указанного по меньшей мере одного первого и указанного по меньшей мере одного второго участков присоединения. Изобретение может быть использовано в медицине для борьбы с малярией. 6 н. и 6 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 табл., 7 пр.

Формула