Композиции, повышающие число копий вектора (чкв), и способы их применения - RU2744603C2

Код документа: RU2744603C2

Чертежи

Показать все 27 чертежа(ей)

Описание

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии со статьей 35 §119(e) Свода законов США на основании предварительной заявки на патент США №62/429,514, поданной 2 декабря 2016 г., 62/417,085, поданной 3 ноября 2016 г., предварительной заявки на патент США №62/313,571, поданной 25 марта 2016 г., и предварительной заявки на патент США №62/294,615, поданной 12 февраля 2016 г., описание каждой из которых полностью включено в данную заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники

Настоящее изобретение в общем смысле относится, в том числе, к улучшенным композициям для генной терапии и способам их получения.

Описание предшествующего уровня техники

Генотерапия имеет огромный потенциал в новой эре медицины человека. Методики генотерапии позволят лечить состояния, лечение которых было недоступно в рамках стандартной медицинской практики. Тем не менее, Управление по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) еще не одобрило продажу ни одного продукта для генотерапии человека. Современная генотерапия экспериментальна и приводит к неоднозначным результатам в клинических испытаниях. Ginn и др., J Gene Med 2013 и Naldini и др., Nature Review 2015.

В 1999 г. генотерапия потерпела главную неудачу со смертью 18-летнего Jesse Gelsinger. Jesse участвовал в генотерапевтическом испытании для лечения недостаточности орнитинтранскарбоксилазы (OTCD). Он умер от полиорганной недостаточности через 4 дня после начала лечения. Считают, что к его смерти привел сильный иммунный ответ на аденовирусный носитель. Sibbald и др., СМА J 2001.

Другой крупный провал произошел в январе 2003 г., когда FDA временно приостановили все генотерапевтические испытания с применением ретровирусных векторов в стволовых клетках крови. FDA предприняло такое действие после того, как стало известно о том, что у второго ребенка, которого лечили во французском генотерапевтическом испытании, развилось подобное лейкозу состояние. Hacein-Bey-Abina и др., Science 2003. Как этого ребенка, так и другого, у которого развилось аналогичное состояние в августе 2002, успешно лечили путем генотерапии Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита (X-SCID), также известного как "синдром мальчика в пузыре". Консультативный комитет FDA по проблемам модификаторов биологического ответа (BRMAC) встретился в конце февраля 2003 г., чтобы обсудить возможные меры, которые могли бы позволить проводить множество генотерапевтических испытаний с использованием ретровирусов для лечения опасных для жизни заболеваний с подходящими мерами обеспечения безопасности. В апреле 2003 г. FDA сняло запрет на генотерапевтические испытания с применением ретровирусных векторов в стволовых клетках крови.

Тем не менее, недавно несколько групп исследователей провели умеренно успешные генотерапевтические испытания для борьбы с несколькими заболеваниями. В 2008 г. исследователи из Великобритании из Института офтальмологии UCL и Центра биомедицинских исследований NIHR Больницы глаз Moorfields доложили об успешном генотерапевтическом клиническом испытании для лечения врожденного амавроза Лебера - одного из типов наследственной слепоты. Полученные результаты показали, что экспериментальное лечение безопасно и способно улучшить зрение (Maguire и др., N Engl J Med. 358(21):2240 (2008)).

В 2009 г. группа французских ученых доложила о применении генотерапии, опосредованной гематопоэтическими стволовыми клетками, для успешного лечения Х-сцепленной адренолейкодистрофии (ALD). Carrier и др., Science 2009. Аутологические стволовые клетки удаляли из пациентов, вносили в них генетические изменения ex vivo, а затем вводили их обратно пациенту путем инфузии после того, как пациент получал миелоаблативную терапию. На протяжении 24-30 месяцев последующего наблюдения обнаружили поликлональное восстановление с 9-14% гранулоцитов, моноцитов и Т- и В-лимфоцитов, экспрессирующих белок ALD. Данные результаты убедительно указывают на то, что гематопоэтические стволовые клетки были трансдуцированы у данных пациентов. Начиная с 14-16 месяца после инфузии генетически скорректированных клеток, прогрессирующая церебральная демиелинизация у двух пациентов остановилась.

В 2011 г. Neurologix, Inc. объявила о положительных результатах фазы 2 испытаний экспериментальной генотерапии поздней стадии болезни Паркинсона (БП) - NLX-P101. У участников исследования, которые получали NLX-P101, выявили статистически значимые и клинически значимые улучшения показателей двигательной активности при воздержании от приема лекарств по сравнению с контрольными субъектами, которым провели фиктивное хирургическое вмешательство. В данном исследовании такое благоприятное действие наблюдали через один месяц и продолжали наблюдать практически неизменно на протяжении периода слепого исследования, составляющего шесть месяцев. Полученные результаты также продемонстрировали положительный профиль безопасности NLX-P101, при этом не сообщалось о серьезных нежелательных явлениях, связанных с генотерапией или хирургической процедурой. У пациентов, включенных в данное исследование, была БП средней - поздней стадии, и они не были в достаточной мере восприимчивы к современным методам лечения.

Недавний прогресс в области генотерапии дал надежду на то, что для пациентов, страдающих от гемоглобинопатии, таких как β-талассемия и серповидноклеточная анемия, будут полезны новые терапевтические подходы. Cavazzana-Calvo и др., Nature 2010. Трансплантация гематопоэтических клеток (ГСК), модифицированных лентивирусными векторами, несущими ген β-глобина, привела к длительной коррекции гемоглобиновых расстройств в нескольких моделях на мышах, например, Imren и др., Proc Natl Acad Set USA. 2002; 99(22):14380-14385; Malik и др., Ann NY Acad Sci. 2005; 1054:238-249; May и др., Nature. 2000; 406(6791):82-86; Pawliuk и др., Science. 2001; 294(5550): 2368-2371).

Хотя основные преимущества введения путем инфузии генетически модифицированных аутологических клеток состоят в том, что удается избежать риска реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) и дотрансплантационной иммунодепрессивной подготовки, а также проблемы отсутствия совместимых доноров, для современной терапии существует по меньшей мере три важных предостережения: необходимость токсичной миелоабляции (Dunbar и др.,. Hum Gene Ther. 1998; 9(17):2629-2640); современные способы переноса генов не позволяют транедуцировать более некоторой фракции гематопоэтических стволовых клеток (ГСК) (Santoni de Sio и Naldini, Methods Mol Biol. 2009; 506:59-70); число копий вектора в транедуцированных ГСК часто находится на нижнем пределе для терапевтической эффективности; и эффективность и безопасность различных доступных стратегий селекции in vivo субоптимальны (Beard и др., J Clin Invest. 2010; 120(7):2345-2354; Cornetta и др., Cancer Gene Ther. 2006; 13(9):886-895; Milsom и др., Cancer Res. 2008; 68(15): 6171-6180).

На сегодняшний день существует огромное количество протоколов, которые используют исследовательские и клинические группы для введения лентивирусных генотерапевтических векторов в целевые клетки. В прошлом добивались высокой эффективности переноса генов в различные типы клеток, применяя различные стратегии. Тем не менее, большинство из данных стратегий, например, поликатионы, катионные липосомы, полибрен, включают применение адъювантной терапии, которая токсична для клеток, что ограничивает их применение с чувствительными целевыми клетками первичного происхождения, такими как гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники.

Известно, что гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники очень трудно эффективно трансдуцировать, и, следовательно, неэффективная трансдукция является одним из первичных ограничивающих факторов, предотвращающих внедрение генотерапии на основе ГСК в клиническую практику. Неэффективная трансдукция также повышает расходы на разработку генотерапевтических методов лечения, так как необходимы большие количества вектора для получения необходимого количества трансдуцированных клеток. Таким образом, повышение эффективности трансдукции гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников не только приведет к значительному клиническому результату, но и уменьшит количество вируса, необходимого для получения лекарственных продуктов и, таким образом, уменьшит стоимость клинических испытаний.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данной заявке предложены улучшенные способы генотерапии. В конкретных вариантах реализации генотерапия включает композиции гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников с повышенной терапевтической эффективностью и способы их получения и применения. В других конкретных вариантах реализации настоящего изобретения предложены композиции и способы повышения эффективности трансдукции и числа копий вектора (ЧКВ) в гематопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках человека (ГСПК) с получением улучшенных генотерапевтических композиций.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, популяция гематопоэтических клеток, содержащая гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (ГСПК), трансдуцированные ретровирусным вектором, при этом по меньшей мере 50% ГСПК трансдуцированы, и при этом среднее число копий вектора (ЧКВ) ГСПК составляет приблизительно от 0,5 до 5.

В конкретных вариантах реализации ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор трансдуцирует ГСПК при множественности инфекции (МИ), составляющей от приблизительно 10 до приблизительно 30.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор трансдуцирует ГСПК при множественности инфекции (МИ), составляющей от приблизительно 10 до приблизительно 25.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор трансдуцирует ГСПК при множественности инфекции (МИ), составляющей от приблизительно 10 до приблизительно 20.

В конкретных вариантах реализации ГСПК включают CD34⁺ клетки или CD133⁺ клетки.

В некоторых вариантах реализации ГСПК включают CD34⁺CD38^LoCD90⁺CD45RA^- клетки.

В дополнительных вариантах реализации по меньшей мере 75% клеток были трансдуцированы.

В дополнительных вариантах реализации по меньшей мере 90% клеток были трансдуцированы.

В конкретных вариантах реализации среднее ЧКВ составляет по меньшей мере 1,0.

В конкретных вариантах реализации среднее ЧКВ составляет по меньшей мере 1,5.

В конкретных вариантах реализации среднее ЧКВ составляет по меньшей мере 2,0.

В конкретных вариантах реализации среднее ЧКВ составляет по меньшей мере 2,5.

В некоторых вариантах реализации жизнеспособность популяции клеток составляет по меньшей мере 75%.

В дополнительных вариантах реализации жизнеспособность популяции клеток составляет по меньшей мере 85%.

В дополнительных вариантах реализации жизнеспособность популяции клеток составляет по меньшей мере 95%.

В дополнительных вариантах реализации уровень эндотоксина в популяции гематопоэтических клеток составляет не более 5,0 единиц эндотоксина (ЕЭ)/мл.

В некоторых вариантах реализации уровень эндотоксина в популяции гематопоэтических клеток составляет не более, чем 0,5 ЕЭ/мл.

В дополнительных вариантах реализации популяция клеток содержит по меньшей мере 1×10⁶ клеток ГСПК.

В конкретных вариантах реализации популяция клеток содержит по меньшей мере 1×10⁷ клеток ГСПК.

В конкретных вариантах реализации популяция клеток содержит по меньшей мере 1×10⁸ клеток ГСПК.

В некоторых вариантах реализации популяция клеток содержит по меньшей мере 1×10⁹ клеток ГСПК.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует полипептид представителя 1 подсемейства D белков с АТФ-связывающей кассетой (ABCD1).

В дополнительных вариантах реализации лентивирусный вектор содержит энхансер миелопролиферативного вируса саркомы, промотор (MND) с удаленной областью отрицательного контроля и с заменой участка связывания праймера на d1587rev или его транскрипционно активный фрагмент, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим полипептид представителя 1 подсемейства D белков с АТФ-связывающей кассетой (ABCD1).

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует аденозиндезаминазу.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор содержит промотор фактора элонгации 1 альфа, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим аденозиндезаминазу.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует рецептор интерлейкина-2 гамма.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор содержит промотор фактора элонгации 1 альфа, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим рецептор интерлейкина-2 гамма.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует трипептидилпептидазу 1.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор содержит промотор фактора элонгации 1 альфа или содержит энхансер миелопролиферативного вируса саркомы, промотор (MND) с удаленной областью отрицательного контроля и с заменой участка связывания праймера на d1587rev, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим трипептидилпептидазу 1.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует альфа-L-идуронидазу.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует идуронат-2-сульфатазу.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор содержит промотор, содержащий один или более элементов из области контроля локуса (LCR) β-глобина человека.

В некоторых вариантах реализации указанная LCR β-глобина человека содержит гиперчувствительные к ДНКазе I участки 2, 3 и 4 из LCR β-глобина человека.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор дополнительно содержит 3'-энхансерный элемент β-глобина человека.

В дополнительных вариантах реализации представляющий интерес ген кодирует белок, предотвращающий образование серповидноклеточных эритроцитов, или ген глобина.

В конкретных вариантах реализации представляющий интерес ген кодирует белок β-глобина человека, белок δ-глобина человека, белок γ-глобина человека, белок β^А-T87Q-глобина человека, белок β^{А-G16D/Е22А/T87Q}-глобина человека или белок β^{А-T87Q/K95E/K120E}-глобина человека.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, популяция гематопоэтических клеток, содержащая гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (ГСПК), трансдуцированные ретровирусом, при этом указанная популяция гематопоэтических клеток содержит по меньшей мере 85% ГСПК, при этом по меньшей мере 50% ГСПК трансдуцированы, при этом среднее число копий вектора (ЧКВ) в ГСПК составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 5,0, при этом жизнеспособность популяции клеток составляет по меньшей мере 75%, при этом уровень эндотоксина в популяции гематопоэтических клеток составляет от приблизительно 0,5 ЕЭ/мл до приблизительно 5,0 ЕЭ/мл, и при этом указанная популяция гематопоэтических клеток содержит по меньшей мере 1×10⁶ ГСПК.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, популяция гематопоэтических клеток, содержащая CD34⁺CD38^LoCD90⁺CD45RA^- клетки, трансдуцированные ретровирусом, при этом по меньшей мере 50% CD34⁺CD38^LoCD90⁺CD45RA^- клеток трансдуцированы, при этом CD34⁺CD38^LoCD90⁺CD45RA^- клетки содержат среднее ЧКВ от приблизительно 0,5 до приблизительно 5,0, при этом жизнеспособность популяции гематопоэтических клеток составляет по меньшей мере 75%, при этом уровень эндотоксина в популяции гематопоэтических клеток составляет от приблизительно 0,5 ЕЭ/мл до приблизительно 5,0 ЕЭ/мл, и при этом указанная популяция гематопоэтических клеток содержит по меньшей мере 1×10⁶ CD34⁺ клеток.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, популяция гематопоэтических клеток, содержащая CD34⁺ клетки, трансдуцированные ретровирусом, при этом по меньшей мере 50% CD34⁺ трансдуцированы, при этом CD34⁺ клетки содержат среднее число копий вектора (ЧКВ) от приблизительно 0,5 до приблизительно 5,0, при этом жизнеспособность популяции гематопоэтических клеток составляет по меньшей мере 75%, при этом уровень эндотоксина в популяции гематопоэтических клеток составляет от приблизительно 0,5 ЕЭ/мл до приблизительно 5,0 ЕЭ/мл и при этом популяция содержит по меньшей мере 2×10⁶ CD34⁺ клеток.

В конкретных вариантах реализации ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор трансдуцирует ГСПК или CD34⁺ клетки при множественности инфекции (МИ) от приблизительно 10 до приблизительно 30.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор трансдуцирует ГСПК или CD34⁺ при множественности инфекции (МИ) от приблизительно 10 до приблизительно 25.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор трансдуцирует ГСПК или CD34⁺ при множественности инфекции (МИ) от приблизительно 10 до приблизительно 20.

В некоторых вариантах реализации МИ составляет приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29 или приблизительно 30.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 75% клеток были трансдуцированы.

В дополнительных вариантах реализации по меньшей мере 90% клеток были трансдуцированы.

В конкретных вариантах реализации среднее ЧКВ составляет по меньшей мере 1,0.

В конкретных вариантах реализации среднее ЧКВ составляет по меньшей мере 1,5.

В конкретных вариантах реализации среднее ЧКВ составляет по меньшей мере 2,0.

В конкретных вариантах реализации среднее ЧКВ составляет по меньшей мере 2,5.

В некоторых вариантах реализации жизнеспособность популяции клеток составляет по меньшей мере 85%.

В некоторых вариантах реализации жизнеспособность популяции клеток составляет по меньшей мере 95%.

В дополнительных вариантах реализации уровень эндотоксина в популяции гематопоэтических клеток составляет не более 5,0 ЕЭ/мл.

В дополнительных вариантах реализации популяция клеток содержит по меньшей мере 1×10⁷ клеток ГСПК.

В дополнительных вариантах реализации популяция клеток содержит по меньшей мере 1×10⁸ клеток ГСПК.

В некоторых вариантах реализации популяция клеток содержит по меньшей мере 1×10⁹ клеток ГСПК.

В некоторых вариантах реализации источником клеток является пуповинная кровь, костный мозг или мобилизованная периферическая кровь.

В некоторых вариантах реализации источником клеток является мобилизованная периферическая кровь.

В дополнительных вариантах реализации ретровирусный вектор получен из лентивируса, выбранного из группы, состоящей из: ВИЧ (вируса иммунодефицита человека; включая ВИЧ типа 1 и ВИЧ типа 2); вируса висна-маеди (VMV); вируса козьего артрита-энцефалита (CAEV); вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV); вируса иммунодефицита кошек (FIV); вируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV) и вируса иммунодефицита обезьян (SIV).

В некоторых вариантах реализации ретровирусный вектор получен из лентивируса ВИЧ.

В дополнительных вариантах реализации ретровирусный вектор получен из лентивируса ВИЧ-1.

В некоторых вариантах реализации ретровирусный вектор содержит: а) 5' длинный концевой повтор (LTR); b) элемент экспорта РНК; с) центральный полипуриновый тракт (сРРТ) лентивируса; d) промотор, функционально связанный с представляющим интерес геном; и е) 3'-LTR самоинактивирующейся конструкции (SIN).

В некоторых вариантах реализации модифицированный 5'-LTR дополнительно содержит делецию относительно 5'-LTR дикого типа.

В конкретных вариантах реализации промотор 5'-LTR заменяют на гетерологичный промотор, выбранный из группы, состоящей из: промотора цитомегаловируса (CMV), промотора вируса саркомы Рауса (RSV) или промотора вируса обезьян 40 (SV40).

В дополнительных вариантах реализации элемент экспорта РНК включает посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита В (PRE) или Rev- чувствительный регуляторный элемент вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

В некоторых вариантах реализации 3'-LTR содержит последовательность полиаденилирования.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует аденозиндезаминазу.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует рецептор интерлейкина-2 гамма.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует трипептидилпептидазу 1.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует альфа-L-идуронидазу.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует идуронат-2-сульфатазу.

В некоторых вариантах реализации промотор содержит один или более элементов LCR β-глобина человека.

В некоторых вариантах реализации LCR β-глобина человека содержит гиперчувствительные к ДНКазе I участки 2, 3 и 4 из LCR β-глобина человека.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор дополнительно содержит З'-энхансерный элемент β-глобина человека.

В конкретных вариантах реализации клетки, трансдуцированные векторами и композициями, предложенными в данной заявке, содержат аллели β-глобина: β^Е/β⁰, β^C/β⁰, β⁰/β⁰, β^Е/β^Е, β^C/β⁺, β^Е/β⁺, β⁰/β⁺, β⁺/β⁺, β^C/β^C, β^E/β^S, β⁰/β^S, β^C/β^S, β⁺/β^D или β^S/β^S.

В конкретных вариантах реализации клетки, трансдуцированные векторами и композициями, предложенными в данной заявке, содержат аллели β-глобина: β^Е/β⁰, β^C/β⁰, β⁰/β⁰, β^C/β^C, β^Е/β^Е, β^Е/β⁺, β^C/β^Е, β^C/β⁺, β⁰/β⁺ или β⁺/β⁺.

В конкретных вариантах реализации клетки, трансдуцированные векторами и композициями, предложенными в данной заявке, содержат аллели β-глобина: β^E/β^S, β⁰/β^S, β^C/β^S, β⁺/β^S или β^S/β^S.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, композиция, содержащая популяцию гематопоэтических клеток, предложенных в данной заявке.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, фармацевтическая композиция, содержащая популяцию гематопоэтических клеток, предложенных в данной заявке, и фармацевтически приемлемый носитель.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, композиция, содержащая: гематопоэтическую стволовую клетку или клетку-предшественника; ретровирусный вектор или лентивирусный вектор и полоксамер со средней молекулярной массой субъединиц полипропилена более чем приблизительно 2250 дальтон, содержащий более чем приблизительно 40% оксида полиэтилена, при этом необязательно полоксамер выбран из группы, состоящей из: полоксамера 288, полоксамера 335, полоксамера 338 и полоксамера 407.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, культура, содержащая: гематопоэтическую стволовую клетку или клетку-предшественника; культуральную среду; ретровирусный вектор и полоксамер со средней молекулярной массой субъединиц полипропилена более чем приблизительно 2250 дальтон, содержащий более чем приблизительно 40% оксида полиэтилена.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, культура, содержащая: гематопоэтическую стволовую клетку или клетку-предшественника; культуральную среду; ретровирусный вектор; агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР; и полоксамер со средней молекулярной массой субъединиц полипропилена более чем приблизительно 2250 дальтон, содержащий более чем приблизительно 40% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации средняя молекулярная масса субъединиц полипропилена в полоксамере составляет по меньшей мере приблизительно 2750 дальтон.

В конкретных вариантах реализации средняя молекулярная масса субъединиц полипропилена в полоксамере составляет по меньшей мере приблизительно 3250 дальтон.

В конкретных вариантах реализации средняя молекулярная масса субъединиц полипропилена в полоксамере составляет по меньшей мере приблизительно 4000 дальтон.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 50% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 60% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 70% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 80% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации средняя молекулярная масса субъединиц полипропилена в полоксамере составляет по меньшей мере приблизительно 2750 дальтон, и указанный полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 40% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации средняя молекулярная масса субъединиц полипропилена в полоксамере составляет по меньшей мере приблизительно 3250 дальтон, и указанный полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 50% оксида полиэтилена.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, культура, содержащая: гематопоэтическую стволовую клетку или клетку-предшественника; культуральную среду; ретровирусный вектор; агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР; и полоксамер, молекулярная масса которого составляет по меньшей мере 10000 дальтон.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, культура, содержащая: CD34+ гематопоэтическую стволовую клетку или клетку-предшественника; культуральную среду; лентивирусный вектор и полоксамер 338.

В некоторых вариантах реализации агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, выбран из группы, состоящей из: PGA₂; PGB₂; PGD₂; PGE₁; PGE₂; PGF₂; PGI₂; PGH₂; PGJ₂; и его производных и аналогов.

В конкретных вариантах реализации агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, выбран из группы, состоящей из: 15d-PGJ₂; дельта-12-PGJ₂; 2-гидроксигептадекатриеновой кислоты (ННТ); тромбоксана А2; тромбоксана В2; илопроста; трепростинила; травопроста; карбопроста трометамина; талфупроста; латанопроста; биматопроста; унопростона изопропила; клопростенола; эстрофана; суперфана; мизопростола; бутапроста; линолевой кислоты; 13(s)-гидроксиоктадекадиеновой (13(s)-HODE) кислоты; LY171883; мидовой кислоты; эйкозатриеновой кислоты; эпоксиэйкозатриеновой кислоты; ONO-259; Сау1039; агониста рецептора PGE₂; 16,16-диметил-PGE₂; 19(R)-гидрокси-PGE₂; п-(п-ацетамидобензамидо)фенилового эфира 16,16-диметил-PGE₂; 11-дезокси-16,16-диметил-PGE₂; 9-дезокси-9-метилен-16,16-диметил-PGE₂; 9-дезокси-9-метилен-PGE2; сульпростона; сериноламида PGE2; метилового эфира PGE2; 16-фенилтетранора PGE2; 15(S)-15-метил-PGE2 и 15(R)-15-метил-PGE2.

В дополнительных вариантах реализации агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, выбран из группы, состоящей из: простагландина Е₂ (PGE₂) или 16,16-диметил-PGE₂.

В конкретных вариантах реализации агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, представляет собой PGE2.

В конкретных вариантах реализации гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники представляют собой CD34⁺ или CD 133⁺ клетки.

В некоторых вариантах реализации гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники трансдуцировали в присутствии полоксамера, выбранного из группы, состоящей из: полоксамера 288, полоксамера 335, полоксамера 338 и полоксамера 407.

В конкретных вариантах реализации гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники трансдуцировали в присутствии полоксамера 288.

В некоторых вариантах реализации гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники трансдуцировали в присутствии полоксамера 335.

В дополнительных вариантах реализации гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники трансдуцировали в присутствии полоксамера 338.

В дополнительных вариантах реализации указанные гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники трансдуцировали в присутствии полоксамера 407.

В некоторых вариантах реализации гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники трансдуцированы в присутствии поликатионного полимера.

В дополнительных вариантах реализации поликатионный полимер представляет собой полибрен, сульфат протамина, полиэтиленимин или блок-сополимер полиэтиленгликоля/поли-L-лизина.

В некоторых вариантах реализации ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор.

В некоторых вариантах реализации ретровирусный вектор получен из лентивируса, выбранного из группы, состоящей из: ВИЧ (вируса иммунодефицита человека; включая ВИЧ типа 1 и ВИЧ типа 2); вируса висна-маеди (VMV); вируса козьего артрита-энцефалита (CAEV); вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV); вируса иммунодефицита кошек (FIV); вируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV) и вируса иммунодефицита обезьян (SIV).

В некоторых вариантах реализации ретровирусный вектор получен из лентивируса ВИЧ.

В конкретных вариантах реализации ретровирусный вектор получен из лентивируса ВИЧ-1.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор присутствует при МИ от приблизительно 10 до приблизительно 30.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор присутствует при МИ от приблизительно 10 до приблизительно 25.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор присутствует при МИ от приблизительно 10 до приблизительно 20.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор присутствует при МИ, составляющей приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29 или приблизительно 30.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует аденозин дезаминазу.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует рецептор интерлейкина-2 гамма.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует трипептидилпептидазу 1.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует альфа-L-идуронидазу.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует идуронат-2-сульфатазу.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор содержит промотор, содержащий один или более элементов LCR β-глобина человека.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, культура, содержащая: гематопоэтическую стволовую клетку или клетку-предшественника; культуральную среду; стауроспорин; ретровирусный вектор и полоксамер, молекулярная масса которого составляет по меньшей мере 10000 дальтон, при этом необязательно клетки приводят в контакт со стауроспорином перед приведением в контакт с ретровирусным вектором и полоксамером.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложена, в том числе, культура, содержащая: гематопоэтическую стволовую клетку или клетку-предшественника; культуральную среду; стауроспорин; ретровирусный вектор и полоксамер со средней молекулярной массой субъединиц полипропилена более чем приблизительно 2250 дальтон, содержащий более чем приблизительно 40% оксида полиэтилена.

В некоторых вариантах реализации гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники представляют собой CD34⁺ или CD 133⁺ клетки.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 50% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 60% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 70% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 80% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники трансдуцировали в присутствии полоксамера, выбранного из группы, состоящей из: полоксамера 288, полоксамера 335, полоксамера 338 и полоксамера 407.

В конкретных вариантах реализации полоксамер представляет собой полоксамер 288.

В конкретных вариантах реализации полоксамер представляет собой полоксамер 335.

В конкретных вариантах реализации полоксамер представляет собой полоксамер 338.

В конкретных вариантах реализации полоксамер представляет собой полоксамер 407.

В дополнительных вариантах реализации ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор.

В некоторых вариантах реализации ретровирусный вектор получен из лентивируса ВИЧ.

В конкретных вариантах реализации ретровирусный вектор получен из лентивируса ВИЧ-1.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует аденозиндезаминазу.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует рецептор интерлейкина-2 гамма.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует трипептидилпептидазу 1.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует альфа-L-идуронидазу.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует идуронат-2-сульфатазу.

В конкретных вариантах реализации представляющий интерес ген кодирует белок β-глобина человека, белок δ-глобина человека, белок γ-глобина человека, белок β^А-'T87Q-глобина человека, белок β^{А-G16D/Е22А/T87Q}-глобина человека или белок β^{А-T87Q/K95E/K120E}-глобина человека.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ трансдукции популяции гематопоэтических клеток, включающий культивирование указанных клеток в культуральной среде в присутствии лентивируса и полоксамера 338, при этом необязательно клетки приводят в контакт со стауроспорином, если он присутствует, перед приведением в контакт с ретровирусным вектором и полоксамером.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ трансдукции популяции гематопоэтических клеток, включающий культивирование указанных клеток в культуральной среде в присутствии лентивируса, агента, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, или стауроспорина и полоксамера, молекулярная масса которого составляет по меньшей мере 10000 дальтон, при этом необязательно клетки приводят в контакт со стауроспорином, если он присутствует, перед приведением в контакт с ретровирусным вектором и полоксамером.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ трансдукции популяции гематопоэтических клеток, включающий культивирование указанных клеток в культуральной среде в присутствии лентивируса и полоксамера 407, при этом необязательно клетки приводят в контакт со стауроспорином, если он присутствует, перед приведением в контакт с ретровирусным вектором и полоксамером.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ трансдукции популяции гематопоэтических клеток, включающий культивирование указанных клеток в культуральной среде в присутствии лентивируса, агента, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, или стауроспорина и полоксамера со средней молекулярной массой субъединиц полипропилена более чем приблизительно 2250 дальтон и содержащего более чем приблизительно 40% оксида полиэтилена, при этом необязательно клетки приводят в контакт со стауроспорином, если он присутствует, перед приведением в контакт с ретровирусным вектором и полоксамером.

В дополнительных вариантах реализации агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, выбран из группы, состоящей из: 15d-PGJ₂; дельта-12-PGJ₂; 2-гидроксигептадекатриеновой кислоты (ННТ); тромбоксана А2; тромбоксана В2; илопроста; трепростинила; травопроста; карбопроста трометамина; талфупроста; латанопроста; биматопроста; унопростона изопропила; клопростенола; эстрофана; суперфана; мизопростола; бутапроста; линолевой кислоты; 13(s)-HODE; LY171883; мидовой кислоты; эйкозатриеновой кислоты; эпоксиэйкозатриеновой кислоты; ONO-259; Сау1039; агониста рецептора PGE₂; 16,16-диметил-PGE₂; 19(R)-гидрокси-PGE₂; п-(п-ацетамидобензамидо)фенилового эфира 16,16-диметил-PGE₂; 11-дезокси-16,16-диметил-PGE₂; 9-дезокси-9-метилен-16,16-диметил-PGE₂; 9-дезокси-9-метилен-PGE₂; сульпростона; сериноламида PGE₂; метилового эфира PGE₂; 16-фенилтетранора PGE₂; 15(S)-15метил-PGE2 и 15(R)-15-метил-PGE₂.

В конкретных вариантах реализации агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, выбран из группы, состоящей из: простагландина Е₂ (PGE₂) или 16,16-диметил-PGE₂.

В конкретных вариантах реализации агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, представляет собой PGE₂.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 50% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 60% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 70% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 80% оксида полиэтилена.

В некоторых вариантах реализации популяцию гематопоэтических клеток трансдуцируют в присутствии полоксамера, выбранного из группы, состоящей из: полоксамера 288, полоксамера 335, полоксамера 338 и полоксамера 407.

В конкретных вариантах реализации полоксамер представляет собой полоксамер 288.

В конкретных вариантах реализации полоксамер представляет собой полоксамер 335.

В конкретных вариантах реализации полоксамер представляет собой полоксамер 338.

В конкретных вариантах реализации полоксамер представляет собой полоксамер 407.

В некоторых вариантах реализации популяцию гематопоэтических клеток трансдуцируют в присутствии поликатионного полимера.

В конкретных вариантах реализации поликатионный полимер представляет собой полибрен, сульфат протамина, полиэтиленимин или блок-сополимер полиэтиленгликоля/поли-L-лизина.

В дополнительных вариантах реализации лентивирусный вектор получен из лентивируса, выбранного из группы, состоящей из: ВИЧ (вируса иммунодефицита человека; включая ВИЧ типа 1 и ВИЧ типа 2); вируса висна-маеди (VMV); вируса козьего артрита-энцефалита (CAEV); вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV); вируса иммунодефицита кошек (FIV); вируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV) и вируса иммунодефицита обезьян (SIV).

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор получен из лентивируса ВИЧ.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор получен из лентивируса ВИЧ-1.

В дополнительных вариантах реализации ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор, который содержит: а) 5' длинный концевой повтор (LTR); b) сигнал упаковки Psi Ψ); с) элемент экспорта РНК; d) центральный полипуриновый тракт (сРРТ) лентивируса; е) промотор, функционально связанный с представляющим интерес полинуклеотидом; и f) 3'-LTR SIN.

В некоторых вариантах реализации промотор 5'-LTR заменяют на гетерологичный промотор, выбранный из группы, состоящей из: промотора цитомегаловируса (CMV), промотора вируса саркомы Рауса (RSV) или промотора вируса обезьян 40 (SV40)

В некоторых вариантах реализации элемент экспорта РНК включает посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита В (PRE) или Rev-чувствительный регуляторный элемент вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

В некоторых вариантах реализации 3'-LTR содержит последовательность полиаденилирования.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует аденозиндезаминазу.

В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует рецептор интерлейкина-2 гамма.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует трипептидилпептидазу 1.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует альфа-L-идуронидазу.

В конкретных вариантах реализации лентивирусный вектор кодирует идуронат-2-сульфатазу.

В некоторых вариантах реализации популяцию гематопоэтических клеток трансдуцируют в течение по меньшей мере приблизительно 2 часов.

В некоторых вариантах реализации популяцию гематопоэтических клеток трансдуцируют в течение по меньшей мере приблизительно 24 часов.

В некоторых вариантах реализации популяцию гематопоэтических клеток трансдуцируют в течение от приблизительно 2 часов до приблизительно 24 часов.

В дополнительных вариантах реализации гематопоэтические клетки включают гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники.

В конкретных вариантах реализации гематопоэтические клетки включают CD34⁺ или CD133⁺ клетки.

В некоторых вариантах реализации проводят селекцию популяции гематопоэтических клеток по экспрессии CD34⁺ или CD133⁺ перед трансдукцией.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ лечения гемоглобинопатии у субъекта, включающий введение указанному субъекту популяции клеток, предложенных в данной заявке.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ облегчения по меньшей мере одного симптома гемоглобинопатии у субъекта, включающий введение указанному субъекту популяции клеток, предложенных в данной заявке, или композиции, предложенной в данной заявке.

В конкретных вариантах реализации аллели β-глобина у субъекта следующие: β^Е/β⁰, β^C/β⁰, β⁰/β⁰, β^Е/β^Е, β^C/β⁺, β^Е/β⁺, β⁰/β⁺, β⁺/β⁺, β^C/β^C, β^E/β^S, β⁰/β^S, β^C/β^S, β⁺/β^S или β^S/β^S.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ лечения талассемии у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества популяции гематопоэтических клеток, предположенных в данной заявке, или композиции, предложенной в данной заявке.

В некоторых вариантах реализации талассемия представляет собой α-талассемию.

В дополнительных вариантах реализации талассемия представляет собой β-талассемию.

В конкретных вариантах реализации аллели β-глобина у субъекта следующие: β^Е/β⁰, β^C/β⁰, β⁰/β⁰, β^C/β^C, β^Е/β^Е, β^Е/β⁺, β^C/β^Е, β^C/β⁺, β⁰/β⁺или β⁺/β⁺.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ лечения серповидноклеточной болезни у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества популяции гематопоэтических клеток, предположенных в данной заявке, или композиции, предложенной в данной заявке.

В дополнительных вариантах реализации аллели β-глобина у субъекта следующие: β^E/β^S, β⁰/β^S, β^C/β^S, β⁺/β^S или β^S/β^S.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ лечения Р-талассемии у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества популяции гематопоэтических клеток, предположенных в данной заявке, или композиции, предложенной в данной заявке.

В дополнительных вариантах реализации аллели β-глобина у субъекта следующие: β^Е/β⁰, β^C/β⁰, β⁰/β⁰, β^C/β^C, β^Е/β^Е, β^Е/β⁺, β^C/β^Е, β^C/β⁺, β⁰/β⁺или β⁺/β⁺.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ лечения адренолейкодистрофии или адреномиелонефропатии у субъекта, включающий введение указанному субъекту некоторого количества популяции гематопоэтических клеток, предположенных в данной заявке, или композиции, предложенной в данной заявке.

В конкретных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита, вызванного дефицитом аденозиндезаминазы (ADA-SCID), у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества популяции гематопоэтических клеток, предположенных в данной заявке, или композиции, предложенной в данной заявке.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ лечения Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита (X-SCID) у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества популяции гематопоэтических клеток, предположенных в данной заявке, или композиции, предложенной в данной заявке.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ лечения болезни Баттена у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества популяции гематопоэтических клеток, предположенных в данной заявке, или композиции, предложенной в данной заявке.

В дополнительных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ лечения мукополисахаридоза I типа (MPS I) у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества популяции гематопоэтических клеток, предположенных в данной заявке, или композиции, предложенной в данной заявке.

В дополнительных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, способ лечения мукополисахаридоза II типа (MPS II) у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества популяции гематопоэтических клеток, предположенных в данной заявке, или композиции, предложенной в данной заявке.

В некоторых вариантах реализации популяцию гематопоэтических стволовых клеток вводят внутривенным путем, интрамедуллярным путем или внутрикостным путем.

В конкретных вариантах реализации популяцию гематопоэтических стволовых клеток вводят внутривенно.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, набор, содержащий агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, или стауроспорин и полоксамер, молекулярная масса которого составляет по меньшей мере 10000 дальтон.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен, в том числе, набор, содержащий агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, или стауроспорин и полоксамер со средней молекулярной массой субъединиц полипропилена более чем приблизительно 2250 дальтон, содержащий более чем приблизительно 40% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации средняя молекулярная масса субъединиц полипропилена в полоксамере составляет по меньшей мере приблизительно 2250 дальтон.

В некоторых вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 40% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 50% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 60% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 70% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 80% оксида полиэтилена.

В некоторых вариантах реализации полоксамер выбран из группы, состоящей из: полоксамера 288, полоксамера 335, полоксамера 338 и полоксамера 407.

В конкретных вариантах реализации полоксамер представляет собой полоксамер 288.

В некоторых вариантах реализации полоксамер представляет собой полоксамер 335.

В дополнительных вариантах реализации полоксамер представляет собой полоксамер 338.

В дополнительных вариантах реализации полоксамер представляет собой полоксамер 407.

В дополнительных вариантах реализации агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, выбран из группы, состоящей из: PGA₂; PGB₂; PGD₂; PGE₁; PGE₂; PGF₂; PGI₂; PGH₂; PGJ₂; и его производных и аналогов.

В некоторых вариантах реализации агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, представляет собой PGE₂.

В некоторых вариантах реализации набор дополнительно содержит поликатионный полимер.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фигуре 1 показан анализ in vivo обработанных PGE₂ hCD34⁺ клеток. (А) Приживление hCD34⁺ клеток измеряли по положительному окрашиванию антителом к hCD45. (В) Анализ ЧКВ в клетках человека, приживленных в костный мозг (КМ) мыши.

На фигуре 2 показано, что для hCD34⁺ клеток, трансдуцированных в присутствии возрастающих концентраций F108, выявили зависимое от дозы повышение (А) проникновения вируса и (В) ЧКВ.

На фигуре 3 показано, что для hCD34⁺ клеток, трансдуцированных в присутствии F108, PGE₂ или F108 и PGE₂ не выявили пониженную жизнеспособность клеток по сравнению с контрольной обработкой клеток.

На фигуре 4 показано, что для hCD34⁺ клеток, трансдуцированных в присутствии возрастающих концентраций F68, не выявили зависимое от дозы повышение (А) проникновения вируса и (В) ЧКВ.

На фигуре 5 показано повышение ЧКВ и эффективности трансдукции для hCD34⁺ клеток, трансдуцированных в присутствии F108 и PGE₂, по сравнению с клетками, трансдуцированными в присутствии F108 отдельно, или контролями.

На фигуре 6 показан анализ отдельных колоний в двух независимых экспериментах, который демонстрирует повышение среднего ЧКВ при комбинированной обработке F108 и PGE₂, а также существенное уменьшение количества предшественников, которые не трансдуцированы.

На фигуре 7 показано, что в hCD3⁴⁺ клетках, трансдуцированных в присутствии возрастающих концентраций PGE₂ и фиксированной концентрации F108, не выявили зависимое от дозы повышение ЧКВ.

На фигуре 8 показано, что как для общей популяции гематопоэтических клеток, так и для фенотипа стволовых клеток (CD34⁺CD38^LoCD90⁺CD45RA^-), трансдуцированных в присутствии обработки PGE₂ и F108, выявили повышенную эффективность трансдукции по сравнению со стандартными условиями трансдукции с применением сульфата протамина.

На фигуре 9 показано, что в hCD34⁺ клетках, трансдуцированных в присутствии F108 или F108 и PGE₂; выявили повышенное ЧКВ по сравнению с контролями.

На фигуре 10 показан анализ ЧКВ и эффективности трансдукции hCD34⁺ клеток, обработанных PGE₂, F108 или их комбинацией. (A) F108, отдельно или в комбинации с PGE₂, повышает ЧКВ в партии клеток с низким уровнем трансдукции. (В) F108, отдельно или в комбинации с PGE₂, повышает эффективность трансдукции в партии клеток с низким уровнем трансдукции. (С) Анализ ЧКВ через 2 месяца после трансплантации выявил, что F108, отдельно или в комбинации с PGE₂, повышает ЧКВ in vivo в приживленных hCD34⁺ клетках. (D) Анализ ЧКВ через 4 месяца после трансплантации выявил, что F108, отдельно или в комбинации с PGE₂, повышает ЧКВ in vivo в приживленных hCD34⁺ клетках.

На фигуре 11 показан уровень приживления и способности к дифференцировке hCD34+ клеток, обработанных PGE₂, F108 или их комбинацией, через 2 и 4 месяца после трансплантации. (А) Ни F108, ни PGE₂, ни комбинация не влияли на уровни приживления трансдуцированных hCD34+ клеток в условиях ксенотрансплантации. (В) Способность к миелоидной дифференцировке приживленных клеток сохранялась. (С и D) Способность к лимфоидной дифференцировке приживленных клеток сохранялась.

На фигуре 12 показано, что в hCD34⁺ клетках, трансдуцированных в присутствии стауроспорина, F108, или F108 и стауроспорина, выявили повышенное ЧКВ по сравнению с контролями.

На фигуре 13 показано, что как F108, так и F127 повышают ЧКВ в hCD34⁺ клетках относительно стандартной трансдукции сульфатом протамина. ЧКВ дополнительно повышается при добавлении PGE₂ к обоим вариантам трансдукции F108 и F127.

На фигуре 14 показано, что как F108, так и Р105 повышают ЧКВ в hCD34⁺ клетках относительно стандартной трансдукции сульфатом протамина. ЧКВ дополнительно повышается при добавлении PGE₂ к обоим вариантам трансдукции Р105 и F108.

На фигуре 15 показано, что Р105 (данные с фигуры 14), F127 (данные с фигуры 13), F108 и F98 повышают ЧКВ в hCD34⁺ клетках относительно стандартной трансдукции сульфатом протамина. ЧКВ дополнительно повышается при добавлении PGE₂. На фигуре 15 также показано, что трансдукция hCD34+ клеток в присутствии Р105, F127, F108 или F98 и необязательно PGE₂ не влияла на рост клеток.

На фигуре 16 показано, что Р123, Р104, L101, и F108 повышают ЧКВ в hCD34⁺ клетках относительно стандартной трансдукции сульфатом протамина, но также что Р123, Р104 и L101 уменьшают рост клеток. ЧКВ повышается при добавлении P123 и PGE₂.

На фигуре 17 показано, что F87, F88 и F68 не повышают ЧКВ в hCD34⁺ клетках относительно стандартной трансдукции сульфатом протамина и не влияют на рост клеток.

На фигуре 18 показано, что в β⁰/β⁰ hCD34⁺ клетках, трансдуцированных в присутствии PGE2 и F108, приблизительно в три раза повышено ЧКВ и процент трансдуцированных клеток (% LVV+) по сравнению с контрольными трансдуцированными клетками.

На фигуре 19 показано, что количество безъядерных эритроидных клеток, дифференцированных из β⁰/β⁰ hCD34⁺ клеток, трансдуцированных в присутствии PGE₂ и F108, было сопоставимо с количеством безъядерных эритроидных клеток, дифференцированных из hCD34⁺ клеток, полученных из здоровых доноров.

На фигуре 20 показано, что количество HbA, продуцированного безъядерными эритроидными клетками, дифференцированными из β⁰/β⁰ hCD34⁺ клеток, трансдуцированных в присутствии PGE₂ и F108, было сопоставимо с количеством HbA, продуцированного безъядерными эритроидными клетками, дифференцированными из hCD34⁺ клеток, полученных из здоровых доноров.

На фигуре 21 показаны анализы образования колоний гематопоэтическими клетками-предшественниками, трансдуцированными 8 мкг/мл сульфата протамина (СП), 10 мкг/мл F108 (F108Lo), 1000 мкг/мл F108 (F108Hi) или 1000 мкг/мл F108 в комбинации с 8 мкг/мл сульфата протамина (F108Hi/СП). Обработки значительно не влияли на образование колоний.

На фигуре 22 показано, что F108 повышает эффективность трансдукции фенотипически долговременных ГСК (CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺CD49f⁺) лентивирусным вектором с GFP.

На фигуре 23 показаны три различные партии клеток (629, 703, 010), являющиеся примерами клеток с низкой, средней и высокой способностью к трансдукции, трансдуцированных LentiGlobin ВВ305 при двух МИ.

Трансдуцированные колонии объединяли и анализировали в них ЧКВ (СП=8 мкг/мл сульфата протамина, F108Hi/PGE₂=1000 мкг/мл F108 и 10 мкМ PGE₂). F108 и PGE₂ повышали ЧКВ во всех партиях клеток.

На фигуре 24 показаны клетки CD34⁺ человека, трансдуцированные лентивирусным вектором, кодирующим IL2Rγ, в присутствии либо сульфата протамина (верхний ряд), либо F108 и PGE₂ (нижний ряд), при этом лентивирусный вектор получали путем временной трансфекции или из клонов клеток-продуцентов (PrCL1, PrCL2). ЧКВ из объединенных колоний в метилцеллюлозе в день 14 (Д14) показаны на крайних левых панелях; ЧКВ в отдельных колониях из собранных колоний и %LVV+ колонии в Д14 показаны на центральных панелях; и подсчет колоний показан на крайних правых панелях.

На фигуре 25 показано, что F108 и PGE₂ повышают трансдукцию лентивирусными векторами, кодирующими трипептидилпептидазу 1 (ТРР1).

CD34⁺ человека трансдуцировали LVV, кодирующими либо EF1α-TPP1, либо MND-TPP1 при МИ 5 или 15 с добавлением и без F108 и PGE₂. ЧКВ в объединенных колониях в метилцеллюлозе в день 14 показаны на верхней левой панели. Активность фермента ТРР-1 из культур с цитокинами в день 7 показана на верхней средней панели (осадок клеток) и на верхней правой панели (кондиционированный клетками супернатант). Клетки костного мозга мыши без маркеров линейной принадлежности (Lin-) трансдуцировали MND-TPP1 LVV при МИ, составляющей 5, 15 или 30, с добавлением и без F108 и PGE₂. ЧКВ в жидких культурах в Д7 показаны на нижней левой панели; ЧКВ в отдельных колониях, определенные с помощью количественной ПЦР, показаны на нижней средней панели; и %LVV+ колоний показан на нижней правой панели.

На фигуре 26 CD34⁺ человека из пациентов с AMN (фигура 26, панели А-D), пациентов с ALD (фигура 26, панели Е-Н) и здоровых доноров (ЗД; фигура 26, панели I-L) трансдуцировали MND-ABCD1 LVV в присутствии либо сульфата протамина, либо F108, либо PGE₂, либо F108 и PGE₂. Экспрессия белка ALDP показана на панелях А, Е и I; ЧКВ в объединенных колониях показано на панелях В, F и J; ЧКВ в отдельных колониях показано на панелях С, G и K; и анализ образования колоний показан на панелях D, Н и L.

На фигуре 27 показано ЧКВ в объединенных колониях (левая панель), анализ образования колоний (средняя панель) и ЧКВ в отдельных колониях и %LVV+ клетки (правая панель) из hCD34⁺ клеток, трансдуцированных при МИ, равных 10 или 25, с добавлением и без F108 и PGE₂.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

А. Обзор

В различных типичных вариантах реализации настоящего изобретения представлены генотерапевтические средства, содержащие композиции гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников с повышенной терапевтической эффективностью, и способы их получения и применения.

Генотерапия, в том числе, основывается на достаточной экспрессии терапевтического гена и соответствующего белка. Одним из факторов, которые влияют на экспрессию генов, является число копий, или как много копий терапевтического гена присутствует в клетке. Вирусы, такие как ретровирус, например, лентивирус, аденовирус и аденоассоциированный вирус, представляют собой часто используемые генотерапевтические векторы для внедрения терапевтического гена в клетку - процесса, известного как трансдукция. Неэффективная вирусная трансдукция гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников является одним из наиболее важных факторов, которые ограничивают сферу и применимость генотерапии при многих заболеваниях и расстройствах, для лечения которых были бы полезны генетически модифицированные клетки, полученные из гематопоэтической системы. Недостаточная трансдукция вируса проявляется низким числом копий вектора (ЧКВ) и/или низким процентом трансдуцированных клеток. Таким образом, существенной проблемой, связанной с генотерапией, в которой используют вирусные векторы для доставки терапевтических трансгенов в гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, является неэффективная трансдукция вируса, которая может привести к субтерапевтическому уровню лекарственного продукта. Неэффективная трансдукция также приводит к более высокой стоимости товаров, например, она повышает стоимость получения лентивируса, так как чем более неэффективна трансдукция, тем больше лентивируса потребуется.

Генотерапевтические средства на основе гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников, предложенные в данной заявке, и способы их получения и применения решают данные и другие проблемы, существующие в данной области.

В конкретных типичных вариантах реализации предложена популяция гематопоэтических клеток, трансдуцированных ретровирусным вектором, при этом указанная популяция клеток содержит повышенное количество или процент трансдуцированных гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников по сравнению с популяциями клеток, трансдуцированных с помощью способов и композиций, существующих в данной области. В другом варианте реализации популяция гематопоэтических клеток, трансдуцированных ретровирусным вектором, содержит повышенное ЧКВ по сравнению с ЧКВ в популяциях клеток, трансдуцированных с помощью способов и композиций, существующих в данной области.

В других типичных вариантах реализации предложены композиции, фармацевтические композиции и культуры клеток, содержащие трансдуцированные гематопоэтические клетки.

В некоторых вариантах реализации предложены культуры клеток, содержащие популяцию гематопоэтических клеток, ретровирус и полоксамер.

В некоторых вариантах реализации предложены культуры клеток, содержащие популяцию гематопоэтических клеток, ретровирус, агент, который увеличивает передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, и полоксамер.

В конкретных вариантах реализации предложены способы трансдукции гематопоэтических клеток, включающие приведение в контакт гематопоэтической клетки с ретровирусом и культивирование указанной гематопоэтической клетки и ретровируса в присутствии полоксамера.

В конкретных вариантах реализации предложены способы лечения субъекта, страдающего моногенным заболеванием, включающие введение указанному субъекту любого из генотерапевтических средств на основе гематопоэтических клеток, предложенных в данной заявке.

В различных вариантах реализации, предложенных в данной заявке, будут использовать, если конкретно не указано противоположное, обычные способы химии, биохимии, органической химии, молекулярной биологии, микробиологии, технологии рекомбинантной ДНК, генетики, иммунологии и клеточной биологии, которые находятся в рамках компетенции в данной области, многие из которых описаны ниже с целью пояснения. Такие методики в полном объеме объяснены в литературе. См., например, Sambrook, и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3е издание, 2001); Sambrook, и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ое издание, 1989); Maniatis и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, доработанное в июле 2008 г. ); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates и Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, тома I и II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes (Academic Press, Нью-Йорк, 1992); Transcription and Translation (B. Hames и S. Higgins, ред., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow и Lane, Antibodies (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринт Харбор, Нью-Йорк, 1998) Current Protocols in Immunology, Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach и W. Strober, ред., 1991); Annual Review of Immunology; а также монографии в таких журналах как Advances in Immunology.

В. Определения

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют те же значения, которые обычно понимают средние специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при осуществлении или проверке настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данной заявке, предпочтительные варианты реализации композиций, способов и материалов описаны в данной заявке. Для целей настоящего изобретения следующие термины определены ниже.

Термины, описанные в данной заявке в единственном числе, используют в данной заявке для описания одного или более чем одного (т.е., по меньшей мере одного, или одного или более) грамматического объекта данной статьи. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или один или более элементов.

Использование альтернативы (например, "или") следует понимать как означающее одну, обе или любую комбинацию перечисленных альтернатив.

Термин "и/или" следует понимать как означающий либо одну, либо обе из альтернатив.

В данной заявке термин "около" или "приблизительно" относится к количеству, уровню, значению, числу, частоте, проценту, величине, размеру, объему, массе или длине, которое изменяется в пределах до 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% от указанного количества, уровня, значения, числа, частоты, процента, величины, размера, объема, массы или длины. В конкретных вариантах реализации термины "около" или "приблизительно", когда они стоят перед числовым значением, указывают на значение плюс или минус диапазон 15%, 10%, 5% или 1%.

В данной заявке термин "по существу" относится к количеству, уровню, значению, числу, частоте, проценту, величине, размеру, объему, массе или длине, составляющим 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более от указанного количества, уровня, значения, числа, частоты, процента, величины, размера, объема, массы или длины. В одном варианте реализации "по существу такой же" относится к количеству, уровню, значению, числу, частоте, проценту, величине, размеру, объему, массе или длине, которые оказывают эффект, например, физиологический эффект, приблизительно такой же, как и эффект, оказываемый указанным количеством, уровнем, значением, числом, частотой, процентом, величиной, размером, объемом, массой или длиной.

По всему тексту настоящего описания, если в контексте не требуется иное, термины "включать", "включает" и "включающий" следует понимать как подразумевающие включение указанного этапа или элемента или группы этапов или элементов, но не исключение какого-либо другого этапа или элемента или группы этапов или элементов. В данной заявке термины "содержат" и "включают" используют как синонимы. Под термином "состоящий из" подразумевают содержащий, и он ограничен любыми терминами, которые следуют после формулировки "состоящий из". Таким образом, формулировка "состоящий из" указывает на то, что перечисленные элементы необходимы или обязательны и что не могут присутствовать другие элементы. Под термином "состоящий по существу из" подразумевают включающий любые элементы, перечисленные после указанной формулировки, и он ограничен другими элементами, которые не препятствуют или не способствуют активности или действию, установленным в указанном описании для перечисленных элементов. Таким образом, формулировка "состоящий по существу из" указывает на то, что перечисленные элементы необходимы или обязательны, но что не присутствуют другие элементы, которые материально влияют на активность или действие перечисленных элементов.

По всему тексту настоящего описания ссылка на "один вариант реализации," "вариант реализации", "конкретный вариант реализации", "связанный вариант реализации", "некоторый вариант реализации", "дополнительный вариант реализации" или "добавочный вариант реализации" или комбинации перечисленных формулировок означает, что конкретная особенность, структура или свойство, описанные в связи с указанным вариантом реализации, включены в по меньшей мере один вариант реализации настоящего изобретения. Таким образом, появления указанных выше формулировок в различных местах по всему тексту настоящего описания не обязательно все относятся к одному и тому же варианту реализации. Более того, конкретные особенности, структуры или свойства можно объединить любым подходящим способом в один или более вариантов реализации. Также следует понимать, что позитивное перечисление некоторой особенности в одном варианте реализации служит основой для исключения указанной особенности из некоторого варианта реализации.

"Трансфекция" относится к процессу внедрения "голой" ДНК в клетки с помощью невирусных способов.

"Инфекция" относится к процессу внедрения чужеродной ДНК в клетки с применением вирусного вектора.

"Трансдукция" относится к внедрению чужеродной ДНК в геном клетки с применением вирусного вектора.

"Число копий вектора" или "ЧКВ" относится к количеству копий вектора или его части в геноме клетки. Среднее ЧКВ можно определить для популяции клеток или для отдельных колоний клеток. Примеры способов определения ЧКВ включают полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и проточную цитометрию.

"Эффективность трансдукции" относится к проценту клеток, трансдуцированных по меньшей мере одной копией вектора. Например, если 1×10⁶клеток подвергли воздействию вируса и у 0,5×10⁶ клеток выявили по меньшей мере одну копию вируса в их геноме, то эффективность трансдукции составляет 50%. Примеры способов определения эффективности трансдукции включают ПЦР и проточную цитометрию. В различных вариантах реализации формулировки "количество положительных по лентивирусному вектору клеток" или "процент положительных по лентивирусному вектору клеток" используют для указания эффективности трансдукции.

В данной заявке термин "ретровирус" относится к РНК-содержащему вирусу, который путем обратной транскрипции своей геномной РНК образует копию линейной двухцепочечной ДНК, а затем ковалентно встраивает свою геномную ДНК в геном хозяина. Ретровирусы представляют собой общепринятое средство доставки генов (Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). После того, как вирус встроился в геном хозяина, его называют "провирусом". Провирус служит в качестве матрицы для РНК-полимеразы II и направляет экспрессию молекул РНК, кодируемых указанным вирусом.

Типичные ретровирусы включают, но не ограничены перечисленными: вирус лейкоза мыши Молони (M-MuLV), вирус саркомы мыши Молони (MoMSV), вирус саркомы мыши Харви (HaMuSV), вирус опухоли молочной железы мыши (MuMTV), вирус лейкоза гиббонов (GaLV), вирус лейкоза кошек (FLV), спумавирус, вирус лейкоза мыши Фрейнда, вирус стволовых клеток мыши (MSCV), вирус саркомы Рауса (RSV) и лентивирус.

В данной заявке термин "лентивирус" относится к группе (или роду) сложных ретровирусов. Типичные лентивирусы включают, но не ограничены перечисленными: ВИЧ (вирус иммунодефицита человека; включая ВИЧ типа 1 и ВИЧ типа 2); вирус висна-маеди (VMV); вирус артрита-энцефалита коз (CAEV); вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV); вирус иммунодефицита кошек (FIV); вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV) и вирус иммунодефицита обезьян (SIV). В одном варианте реализации остовы вектора на основе ВИЧ (т.е., элементы цис-действующей последовательности ВИЧ) предпочтительны.

Ретровирусные векторы и, в частности, лентивирусные векторы, можно применять для осуществления настоящего изобретения. Соответственно, в данной заявке подразумевают, что термин "ретровирус" или "ретровирусный вектор" включает "лентивирус" и "лентивирусные векторы", соответственно.

Термин "вектор", используемый в данной заявке, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить или транспортировать другую молекулу нуклеиновой кислоты. Переносимая нуклеиновая кислота, как правило, связана, например, встроена в молекулу нуклеиновой кислоты вектора. Вектор может включать последовательности, которые направляют автономную репликацию в клетке, или может включать последовательности, достаточные для того, чтобы позволить встраивание в ДНК клетки-хозяина. Полезные векторы включают, например, плазмиды (например, ДНК-плазмиды или РНК-плазмиды), транспозоны, космиды, бактериальные искусственные хромосомы и вирусные векторы. Полезные вирусные векторы включают, например, неспособные реплицироваться ретровирусы и лентивирусы.

Для специалиста в данной области будет очевидно, что термин "вирусный вектор" широко используют для обозначения либо молекулы нуклеиновой кислоты (например, переносящей плазмиды), которая содержит элементы нуклеиновых кислот из вируса, которые, как правило, способствуют переносу молекулы нуклеиновой кислоты или встраиванию в геном клетки, либо вирусной частицы, которая опосредует перенос нуклеиновой кислоты. Вирусные частицы, как правило, будут содержать различные вирусные компоненты и иногда также компоненты клетки-хозяина дополнительно к нуклеиновой(-ым) кислоте(-ам).

Термин вирусный вектор может относиться либо к вирусу или к вирусной частице, способной переносить нуклеиновую кислоту в клетку, либо к самой переносимой нуклеиновой кислоте. Вирусные векторы и переносящие плазмиды содержат структурные и/или функциональные генетические элементы, которые, главным образом, получены из вируса. Термин "ретровирусный вектор" относится к вирусному вектору или плазмиде, содержащей структурные и функциональные генетические элементы, или их части, которые, главным образом, получены из ретровируса. Термин "лентивирусный вектор" относится к ретровирусному вектору или плазмиде, содержащей структурные и функциональные генетические элементы, или их части, включая LTR, которые, главным образом, получены из лентивируса. Термин "гибридный" относится к вектору, LTR или другой нуклеиновой кислоте, содержащей как ретровирусные, например, лентивирусные, последовательности, так и нелентивирусные вирусные последовательности. В одном варианте реализации гибридный вектор относится к вектору или переносящей плазмиде, содержащей ретровирусные, например, лентивирусные, последовательности для обратной транскрипции, репликации, встраивания и/или упаковки.

В конкретных вариантах реализации термины "лентивирусный вектор" и "лентивирусный вектор экспрессии" можно применять для обозначения лентивирусных переносящих плазмид и/или инфекционных лентивирусных частиц. Когда в данной заявке упоминаются такие элементы, как сайты клонирования, промоторы, регуляторные элементы, гетерологичные нуклеиновые кислоты и т.д., должно быть очевидно, что последовательности данных элементов присутствуют в виде РНК в лентивирусных частицах согласно настоящему изобретению и присутствуют в виде ДНК в ДНК-плазмидах согласно настоящему изобретению.

На каждом конце провируса находятся структуры, называемые "длинными концевыми повторами" или "LTR". Термин "длинный концевой повтор (LTR)" относится к доменам из пар оснований, расположенных на концах ретровирусных ДНК, которые, в контексте их природных последовательностей, представляют собой прямые повторы и содержат области U3, R и U5. LTR, как правило, осуществляют функции, необходимые для экспрессии ретровирусных генов (например, индукцию, инициацию и полиаденилирование транскриптов генов) и для репликации вируса. LTR содержит множество регуляторных сигналов, включая регулирующие транскрипцию элементы, сигналы полиаденилирования и последовательности, необходимые для репликации и встраивания вирусного генома. LTR вирусов подразделяют на три области, называемые U3, R и U5. Область U3 содержит элементы энхансера и промотора. Область U5 представляет собой последовательность между сайтом связывания праймера и областью R и содержит последовательность полиаденилирования. Область R (повтор) фланкирована областями U3 и U5. LTR состоит из областей U3, R и U5 и находится на обоих 5'- и 3'-концах генома вируса. Рядом с 5'-LTR расположены последовательности, необходимые для обратной транскрипции генома (сайт связывания праймера тРНК) и для эффективной упаковки вирусной РНК в частицы (сайт пси).

В данной заявке термин "сигнал упаковки" или "последовательность упаковки" относится к последовательностям, расположенным внутри ретровирусного генома, которые необходимы для встраивания вирусной РНК в капсид или частицу вируса, см., например, Clever и др., 1995. J. of Virology, том 69, №4; стр. 2101-2109. В нескольких ретровирусных векторах используются минимальные сигналы упаковки (также называемые последовательностью пси [Ψ] или [Ψ+]), необходимые для заключения в капсид генома вируса. Таким образом, в данной заявке термины "последовательность упаковки", "сигнал упаковки", "пси" и символ "Ψ" используют для обозначения некодирующей последовательности, необходимой для заключения в капсид цепей ретровирусной РНК в процессе образования вирусной частицы.

В различных вариантах реализации векторы содержат модифицированные 5'-LTR и/или 3'-LTR. Модификации 3'-LTR часто осуществляют, чтобы улучшить безопасность лентивирусных или ретровирусных систем, делая вирусы неспособными реплицироваться. Квалифицированный специалист сможет определить, был ли модифицирован LTR, путем сравнения с исходным LTR. В данной заявке термин "неспособный реплицироваться" относится к вирусу, который не способен осуществить полную эффективную репликацию, так что инфекционные вирионы не образуются (например, неспособное реплицироваться потомство лентивируса). Термин "способный реплицироваться" относится к вирусу дикого типа или мутантному вирусу, который способен реплицироваться, так что репликация указанного вируса способна приводить к продукции инфекционных вирионов (например, способного реплицироваться лентивирусного потомства).

"Самоинактивирующиеся" (SIN) векторы относятся к неспособным реплицироваться векторам, например, ретровирусным или лентивирусным векторам, в которых область энхансера-промотора правого (3') LTR, известная как область U3, была модифицирована (например, путем делеции и/или замены) для предотвращения транскрипции вируса после первого раунда репликации вируса. Это происходит, так как область U3 правого (3') LTR используется в качестве матрицы для области U3 левого (5') LTR в процессе репликации вируса, и, таким образом, транскрипт вируса не может образоваться без энхансера-промотора U3. В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения 3'-LTR модифицирован таким образом, что область U5 заменена, например, на гетерологичную или синтетическую последовательность поли(А), один или более инсуляторных элементов и/или индуцируемый промотор. Следует отметить, что модификации LTR, такие как модификации 3'-LTR, 5'-LTR или обоих 3' и 5'-LTR, также входят в объем настоящего изобретения.

Дополнительное улучшение безопасности обеспечивается заменой области U3 5'-LTR на гетерологичный промотор, чтобы запускать транскрипцию генома вируса во время образования вирусных частиц. Примеры гетерологичных промоторов, которые можно применять, включают, например, промоторы вируса обезьян 40 (SV40) (например, ранний или поздний), цитомегаловируса (CMV) (например, немедленно-ранний), вируса лейкоза мыши Молони (MoMLV), вируса саркомы Рауса (RSV) и вируса простого герпеса (HSV) (тимидинкиназы). Типичные промоторы способны запускать высокие уровни транскрипции Tat-независимым образом. Такая замена уменьшает вероятность рекомбинации с образованием способного реплицироваться вируса, так как в системе продукции вируса отсутствует полноразмерная последовательность U3. В некоторых вариантах реализации гетерологичный промотор может быть индуцируемым, так что транскрипция полноразмерного или части генома вируса будет происходить, только когда присутствует один или более факторов индукции. Факторы индукции включают, но не ограничены одним или более химическими соединениями или физиологическими условиями, например, температурой или рН, в которых культивируют клетки-хозяева.

В некоторых вариантах реализации вирусные векторы содержат элемент TAR. Термин "TAR" относится к генетическому элементу "ответа на трансактивацию", расположенному в области R лентивирусного (например, ВИЧ) LTR. Данный элемент взаимодействует с лентивирусным генетическим трансактивирующим элементом (tat) с повышением репликации вируса. Тем не менее, данный элемент не требуется в вариантах реализации, в которых область U3 5'-LTR заменена на гетерологичный промотор.

"Область R" относится к области внутри ретровирусных LTR, которая начинается в начале кэп-группы (т.е., в начале транскрипции) и заканчивается сразу перед началом поли(А)-тракта. Область R также определяют как фланкированную областями U3 и U5. Область R играет роль в процессе обратной транскрипции, позволяя перенос образующейся ДНК с одного конца генома к другому.

В данной заявке термин "элемент FLAP" относится к нуклеиновой кислоте, последовательность которой содержит центральный полипуриновый тракт и центральные последовательности терминации (сРРТ и CTS) ретровируса, например, ВИЧ-1 или ВИЧ-2. В некоторых вариантах реализации термины "элемент FLAP" и "cPPT/FLAP" используют взаимозаменяемо для обозначения упомянутого выше элемента FLAP. Подходящие элементы FLAP описаны в патенте США номер 6682907 и в Zennou, и др., 2000, Cell, 101:173. В процессе обратной транскрипции ВИЧ-1 центральное инициирование плюс-цепи ДНК в центральном полипуриновом тракте (сРРТ) и центральная терминация в центральной терминирующей последовательности (CTS) приводят к образованию трехцепочечной структуры ДНК с центральным вытесненным участком ДНК (flap) ВИЧ-1. Без привязки к какой-либо конкретной теории, указанный вытесненный участок ДНК может действовать как цис-активная детерминанта импорта в ядро генома лентивируса и/или может повышать титр вируса. В конкретных вариантах реализации остовы ретровирусного или лентивирусного вектора содержат один или более элементов FLAP против хода транскрипции или по ходу транскрипции от представляющих интерес гетерологичных генов в указанных векторах. Например, в конкретных вариантах реализации вектор содержит элемент FLAP. В одном варианте реализации вектор согласно настоящему изобретению содержит элемент FLAP, выделенный из ВИЧ-1.

В одном варианте реализации ретровирусные или лентивирусные переносящие векторы содержат один или более элементов экспорта. Термин "элемент экспорта" относится к цис-действующему посттранскрипционному регуляторному элементу, который регулирует транспорт РНК-транскрипта из ядра в цитоплазму клетки. Примеры элементов экспорта РНК включают, но не ограничены перечисленными: Rev-чувствительный регуляторный элемент вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (см., например, Cullen и др., 1991. J. Virol. 65: 1053; и Cullen и др., 1991. Cell 58: 423) и посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита В (HPRE). Как правило, элемент экспорта РНК размещают внутри 3'-НТО гена, и его можно встроить в виде одной или множества копий.

В конкретных вариантах реализации экспрессию гетерологичных последовательностей в вирусных векторах повышают путем внедрения в векторы посттранскрипционных регуляторных элементов, эффективных сайтов полиаденилирования и необязательно сигналов терминации транскрипции. Различные посттранскрипционные регуляторные элементы могут повышать уровень экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты на уровне белка, например, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE; Zufferey и др., 1999, J. Virol., 73:2886); посттранскрипционный регуляторный элемент, присутствующий в вирусе гепатита В (HPRE) (Huang и Yen, 1995, Mol. Cell. Biol., 5:3864); и тому подобные посттранскрипционные регуляторные элементы (Liu и др., 1995, Genes Dev., 9:1766). В конкретных вариантах реализации векторы согласно настоящему изобретению лишены или не содержат посттранскрипционный регуляторный элемент, такой как WPRE или HPRE, так как в некоторых случаях данные элементы увеличивают риск трансформации клеток и/или по существу или значительно не повышают количество мРНК-транскрипта или не повышают стабильность мРНК. Следовательно, в некоторых вариантах реализации векторы согласно настоящему изобретению лишены или не содержат WPRE или HPRE в качестве дополнительной меры безопасности.

В конкретных вариантах реализации векторы содержат последовательность полиаденилирования с 3'-стороны от полинуклеотида, кодирующего полипептид, который нужно экспрессировать. Термин "сайт поли(А)" или "последовательность поли(А)" в данной заявке обозначает последовательность ДНК, которая направляет как терминацию, так и полиаденилирование образующегося РНК-транскрипта РНК-полимеразой II. Последовательности полиаденилирования могут способствовать стабильности мРНК путем добавления поли(А)-хвоста к 3'-концу кодирующей последовательности и, таким образом, вносят вклад в повышенную эффективность трансляции. Отщепление и полиаденилирование направляет последовательность поли(А) в РНК. Коровая последовательность поли(А) для пре-мРНК млекопитающих содержит два элемента узнавания, фланкирующих сайт отщепления-полиаденилирования. Обычно, почти неизменный гексамер AAUAAA находится в 20-50 нуклеотидах против хода транскрипции от более вариабельного элемента, богатого остатками U или GU. Отщепление образующегося транскрипта происходит между данными двумя элементами и сопровождается добавлением до 250 аденозинов к 5'-отщепленному продукту. В конкретных вариантах реализации коровая последовательность поли(А) представляет собой идеальную последовательность поли(А) (например, ААТААА, АТТААА, AGTAAA). В конкретных вариантах реализации последовательность поли(А) представляет собой последовательность поли(А) SV40, последовательность поли(А) бычьего гормона роста (BGHpA), последовательность поли(А) β-глобина кролика (rβgpA) или другую подходящую гетерологичную или эндогенную последовательность поли(А), известную в данной области.

В некоторых вариантах реализации ретровирусный или лентивирусный вектор дополнительно содержит один или более инсуляторных элементов. Инсуляторные элементы могут способствовать защите экспрессируемых с лентивируса последовательностей, например, терапевтических полипептидов, от влияния сайта встраивания, которое может быть опосредовано цис-действующими элементами, присутствующими в геномной ДНК, и приводить к нарушению регуляции экспрессии перенесенных последовательностей (т.е., эффект положения; см., например, Burgess-Beusse и др., 2002, Proc. Natl. Acad. Set, USA, 99:16433; и Zhan и др., 2001, Hum. Genet., 109:471). В некоторых вариантах реализации переносящие векторы содержат один или более инсуляторных элементов в 3'-LTR, и после встраивания провируса в геном хозяина указанный провирус содержит один или более инсуляторов на 5'-LTR и/или 3'-LTR благодаря дупликации 3'-LTR. Подходящие инсуляторы для применения в настоящем изобретении включают, но не ограничены инсулятором β-глобина цыпленка (см. Chung и др., 1993. Cell 74:505; Chung и др., 1997. PNAS 94:575; и Bell и др., 1999. Cell 98:387, включены в данную заявку посредством ссылки). Примеры инсуляторных элементов включают, но не ограничены инсулятором из локуса β-глобина человека, таким как HS4 цыпленка.

Согласно некоторым конкретным вариантам реализации, большая часть или все последовательности остова вирусного вектора получены из лентивируса, например, ВИЧ-1. Тем не менее, должно быть очевидно, что можно использовать множество различных источников лентивирусных последовательностей, и можно ввести множество замен и изменений в некоторых из лентивирусных последовательностей, не нарушая способность переносящего вектора осуществлять функции, описанные в данной заявке. Более того, в данной области известны различные лентивирусные векторы, см. Naldini и др., (1996а, 1996b, и 1998); Zufferey и др., (1997); Dull и др., 1998, патенты США №6013516; и 5994136, многие из которых можно приспособить для продукции вирусного вектора или переносящей плазмиды согласно настоящему изобретению.

В данной заявке в объем термина "агент" входят полоксамеры, поликатионные полимеры, стауроспорин, малые органические молекулы, простагландины, энхансеры цАМФ, агонисты сигнального пути Wnt, агонисты сигнального пути цАМФ/PI3K/AKT, агонисты сигнального пути вторичного мессенджера Са2+, агонисты сигнального пути оксида азота (NO)/ангиотензина и неорганические химические вещества, включая, без ограничения, все их аналоги и производные.

"Малая молекула", "малая органическая молекула" или "низкомолекулярное соединение" относится к соединению с низкой молекулярной массой, молекулярная масса которого меньше чем приблизительно 5 кДа, меньше чем приблизительно 4 кДа, меньше чем приблизительно 3 кДа, меньше чем приблизительно 2 кДа, меньше чем приблизительно 1 кДа или меньше чем приблизительно 5 кДа. В конкретных вариантах реализации малые молекулы могут включать нуклеиновые кислоты, пептиды, пептидомиметики, пептоиды, другие малые органические соединения или лекарственные средства и тому подобные молекулы. Библиотеки химических и/или биологических смесей, таких как экстракты грибов, бактерий или водорослей, известны в данной области, и их можно подвергнуть скринингу с помощью любого из анализов согласно настоящему изобретению. Примеры способов синтеза молекулярных библиотек можно найти в Carell и др., 1994а; Carell и др., 1994b; Cho и др., 1993; DeWitt и др., 1993; Gallop и др., 1994; Zuckermann и др., 1994.

По отношению к агентам, таким как органические молекулы, термин "аналог" или "производное" относится к молекуле, которая аналогична другому химическому веществу по структуре и функции и часто отличается структурно одним элементом или группой, но может отличаться модификацией более чем одной группы (например, 2, 3 или 4 групп), если она сохраняет ту же функцию, что и исходное химическое вещество. Такие модификации стандартно используют специалисты в данной области, и они включают, например, дополнительные или замещающие химические молекулы, такие как сложные эфиры или амиды кислоты, защитные группы, такие как бензильная группа для спирта или тиола и трет-бутоксилкарбонильные группы для амина. Также в объем данного термина входят модификации алкильных боковых цепей, таких как алкильные замены (например, метил, диметил, этил и т.д.), изменения уровня насыщенности или ненасыщенности боковых цепей и добавление модифицированных групп, таких как содержащий заместители фенил и феноксил. Производные также могут включать конъюгаты, такие как молекулы биотина или авидина, ферменты, такие как пероксидаза хрена и тому подобные, и содержать радиоактивно меченые, биолюминесцентные, хемилюминесцентные или флуоресцентные молекулы. Также к агентам, описанным в данной заявке, можно добавить молекулы для изменения их фармакокинетических свойств, например, для увеличения времени их полужизни in vivo или ex vivo, или для повышения их способности проникать в клетку, среди прочих желательных свойств. Также включены пролекарства, которые, как известно, улучшают многочисленные желательные свойства фармацевтических средств (например, растворимость, биодоступность, производство и т.д.) (примеры агонистических пролекарств ЕР см., например, в WO/2006/047476, который включен посредством ссылки в отношении описания таких агонистов).

В данной заявке термины "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота" относятся к геномной ДНК (гДНК), комплементарной ДНК (кДНК) или ДНК. Полинуклеотиды включают одно- и двухцепочечные полинуклеотиды, либо рекомбинантные, либо синтетические, либо изолированные. В некоторых вариантах реализации полинуклеотид относится к информационной РНК (мРНК), РНК, геномной РНК (гРНК), плюс-цепи РНК (РНК(+)), минус-цепи РНК (РНК(-)). В данной заявке термины "полирибонуклеотид" или "рибонуклеиновая кислота" также относятся к информационной РНК (мРНК), РНК, геномной РНК (гРНК), плюс-цепи РНК (РНК(+)), минус-цепи РНК (РНК(-)) и ингибиторным РНК, включая, но не ограничиваясь перечисленными: миРНК, короткую шпилечную РНК (кшРНК), взаимодействующую с piwi РНК (пиРНК), миРНК или микроРНК, и кшРНК, заключенные в остов микроРНК (shmir). Предпочтительно полинуклеотиды согласно настоящему изобретению включают полинуклеотиды или варианты, последовательность которых по меньшей мере приблизительно на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична любой из эталонных последовательностей, описанных в данной заявке (см., например, перечень последовательностей), обычно при этом вариант сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность эталонной последовательности. В различных типичных вариантах реализации предложены полинуклеотидные последовательности вирусного вектора и переносящей плазмиды и содержащие их композиции. В конкретных вариантах реализации предложены полинуклеотиды, кодирующие терапевтический полипептид, включая, но не ограничиваясь перечисленными: полипептид глобина, полипептид глобина, предотвращающего образование серповидноклеточных эритроцитов, полипептид аденозиндезаминазы, полипептид рецептора интерлейкина-2 гамма, полипептид трипептидилпептидазы 1, полипептид альфа-L-идуронидазы, полипептид идуронат-2-сульфатазы или полипептид представителя 1 подсемейства D (ALD) белков с АТФ-связывающей кассетой (ABCD1), которые обсуждались в других местах в данной заявке.

В данной заявке термины "вариант полинуклеотида", "вариант" и тому подобные термины относятся к полинуклеотидам, проявляющим существенную идентичность последовательности с эталонной полинуклеотидной последовательностью, или к полинуклеотидам, которые гибридизуются с эталонной последовательностью при строгих условиях, которые описаны далее в данной заявке. В объем данных терминов входят полинуклеотиды, в которых один или более нуклеотидов были вставлены, или удалены, или заменены на отличные нуклеотиды по сравнению с эталонным полинуклеотидом. В этом отношении, в данной области известно, что в эталонный полинуклеотид можно внести некоторые изменения, включая мутации, вставки, делеции и замены, при условии, что измененный полинуклеотид сохраняет биологическую функцию или активность эталонного полинуклеотида.

В данной заявке термин "изолированный" означает материал, например, полинуклеотид, полипептид, клетку, который по существу или главным образом свободен от компонентов, которые обычно сопровождают его в нативном состоянии. В конкретных вариантах реализации термин "полученный" или "происходящий" используют синонимично с термином "изолированный". Например, "изолированный полинуклеотид" в данной заявке относится к полинуклеотиду, который был очищен от последовательностей, которые фланкируют его во встречающемся в природе состоянии, например, к фрагменту ДНК, который был удален из последовательностей, которые обычно расположены рядом с указанным фрагментом.

Термины, которые описывают ориентацию полинуклеотидов, включают: 5' (обычно конец полинуклеотида, содержащий свободную фосфатную группу) и 3' (обычно конец полинуклеотида, содержащий свободную гидроксильную (ОН) группу). Полинуклеотидные последовательности можно обозначить как находящиеся в ориентации от 5' к 3' или в ориентации от 3' к 5'.

Термины "комплементарный" и "комплементарность" относятся к полинуклеотидам (т.е., к последовательностям нуклеотидов), связанным по правилам спаривания оснований. Например, комплементарная цепь для последовательности ДНК 5'-AGTCATG-3' представляет собой 3'-TCAGTAC-5'. Последнюю из упомянутых последовательностей часто записывают как обратный комплемент с 5'-концом слева и 3'-концом справа: 5'-CATGACT-3'. Последовательность, которая одинакова со своим обратным комплементом, называют палиндромной последовательностью. Комплементарность может быть "частичной", при которой лишь некоторые из оснований нуклеиновых кислот соответствуют друг другу согласно правилам спаривания оснований. Или может быть "полная" или "абсолютная" комплементарность между нуклеиновыми кислотами.

Термин "кассета нуклеиновых кислот" или "кассета экспрессии" в данной заявке относится к генетическим последовательностям внутри вектора, которые могут экспрессировать РНК и, впоследствии, полипептид. В одном варианте реализации кассета нуклеиновых кислот содержит представляющий(-е) интерес ген(ы), например, представляющий(-е) интерес полинуклеотид(ы). В другом варианте реализации кассета нуклеиновых кислот содержит одну или более контролирующих экспрессию последовательностей, например, промотор, энхансер, последовательность поли(А), и представляющий(-е) интерес ген(ы), например, представляющий(-е) интерес полинуклеотид(ы). Векторы могут содержать одну, две, три, четыре, пять или более кассет нуклеиновых кислот. Указанная кассета нуклеиновых кислот позиционно и последовательно ориентирована внутри вектора таким образом, что нуклеиновая кислота в кассете может транскрибироваться в РНК и, при необходимости, транслироваться в белок или полипептид, подвергнуться подходящим посттрансляционным модификациям, необходимым для активности в трансформированной клетке, и переместиться в подходящий компартмент для проявления биологической активности путем нацеливания на подходящие внутриклеточные компартменты или секреции во внеклеточные компартменты. Предпочтительно кассета содержит 3'- и 5'-концы, приспособленные для быстрой вставки в вектор, например, содержит на каждом конце сайты рестрикции эндонуклеазами. В предпочтительном варианте реализации кассета нуклеиновых кислот содержит последовательность терапевтического гена, используемую для лечения, предотвращения или снижения выраженности генетического расстройства. Указанную кассету можно удалить и встроить в плазмиду или вирусный вектор в виде единого элемента.

В данной заявке термин "представляющий(-е) интерес полинуклеотид(ы)" относится к одному или более полинуклеотидам, например, полинуклеотиду, кодирующему полипептид (т.е., представляющий интерес полипептид), встроенный в вектор экспрессии, который необходимо экспрессировать. В предпочтительных вариантах реализации векторы и/или плазмиды содержат один или более представляющих интерес полинуклеотидов, например, полинуклеотид, кодирующий полипептид глобина, полипептид глобина, предотвращающего образование серповидноклеточных эритроцитов, полипептид аденозиндезаминазы, полипептид рецептора интерлейкина-2 гамма, полипептид трипептидилпептидазы 1, полипептид альфа-L-идуронидазы, полипептид идуронат-2-сульфатазы или полипептид представителя 1 подсемейства D (ALD) белков с АТФ-связывающей кассетой (ABCD1). В некоторых вариантах реализации представляющий интерес полинуклеотид кодирует полипептид, который оказывает терапевтическое действие для лечения, предотвращения или снижения выраженности гематопоэтического заболевания или расстройства, который можно назвать "терапевтическим полипептидом", например, ген глобина. См., например, патенты США 6051402 и 7901671, полные описания и формулы изобретения которых особо включены в данную заявку посредством ссылки.

В некоторых других вариантах реализации представляющий интерес полинуклеотид кодирует полипептид, который оказывает терапевтическое действие, приводящее к лечению, предотвращению или снижению выраженности адренолейкодистрофии или адреномиелонейропатии, который можно назвать "терапевтическим полипептидом", например, ген ABCD1. См., например, патенты США 5869039 и 6013769, полные описания и формулы изобретения которых явно включены в данную заявку посредством ссылки.

Термин "глобин" в данной заявке относится к белкам или субъединицам белков, которые способны ковалентно или нековалентно связывать молекулу гема и, следовательно, могут транспортировать или запасать кислород. Субъединицы гемоглобинов позвоночных и беспозвоночных, миоглобинов позвоночных и беспозвоночных или их мутантов входят в объем термина глобин. В объем данного термина не входят гемоцианины. Примеры глобинов включают α-глобин или его вариант, β-глобин или его вариант, γ-глобин или его вариант и δ-глобин или его вариант.

В одном варианте реализации представляющий интерес полинуклеотид представляет собой трансген, который кодирует полипептид, который предоставляет терапевтическую функцию для лечения гемоглобинопатии, например, α-глобин, γ-глобин, β-глобин или предотвращающий образование серповидноклеточных эритроцитов β-глобин, например, β-глобин^А-T87Q. Представляющие интерес полинуклеотиды и кодируемые с них полипептиды включают как полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды дикого типа, так и их функциональные варианты и фрагменты. В конкретных вариантах реализации последовательность функционального варианта по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична соответствующей последовательность эталонного полинуклеотида или полипептида дикого типа. В некоторых вариантах реализации функциональный вариант или фрагмент обладает по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 100% или по меньшей мере 110% или более биологической активности соответствующего полипептида дикого типа. Примеры полинуклеотидных последовательностей, подходящих для применения в типичных вариантах реализации, включают, но не ограничены перечисленными: полинуклеотиды, кодирующие α-глобин, β-глобин, β-глобин^А-T87Q, предотвращающие образование серповидноклеточных эритроцитов глобины, γ-глобин и δ глобин.

Полинуклеотиды, независимо от длины кодирующей последовательности самой по себе, можно комбинировать с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы и/или энхансеры, нетранслируемые области (НТО), последовательности Козак, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты для ферментов рестрикции, сайты множественного клонирования, внутренние участки посадки рибосомы (IRES), участки распознавания рекомбиназой (например, сайты LoxP, FRT и Att), терминирующие кодоны, сигналы терминации транскрипции, полинуклеотиды, кодирующие самоотщепляющиеся полипептиды, эпитопные метки, описанные в других местах в данной заявке или известные в данной области, так что их суммарная длина может значительно изменяться. Следовательно, предполагается, что можно использовать фрагмент полинуклеотида практически любой длины, при этом общая длина предпочтительно ограничивается простотой получения и применения в предполагаемом протоколе для рекомбинантной ДНК.

Термин "контролирующая экспрессию последовательность" относится к полинуклеотидной последовательности, которая содержит один или более промоторов, энхансеров или других регулирующих транскрипцию элементов или комбинации перечисленных элементов, которые способны направлять, повышать, регулировать или контролировать транскрипцию или экспрессию функционально связанного с ними полинуклеотида. В конкретных вариантах реализации векторы согласно настоящему изобретению содержат одну или более контролирующих экспрессию последовательностей, которые специфичны для конкретных клеток, типов клеток или линий дифференцировки клеток, например, для целевых клеток; то есть, полинуклеотиды, функционально связанные с контролирующей экспрессию последовательностью, специфичной для конкретных клеток, типов клеток или линий дифференцировки клеток, экспрессируются в целевых клетках, но не в других нецелевых клетках. Каждая из одной или более контролирующих экспрессию последовательностей в векторе, которая специфична для конкретных клеток, может экспрессироваться в одной и той же или в различных типах клеток в зависимости от желательной терапии. В предпочтительных вариантах реализации векторы содержат одну или более контролирующих экспрессию последовательностей, специфичных для гематопоэтических клеток, например, гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников. В других предпочтительных вариантах реализации векторы содержат одну или более контролирующих экспрессию последовательностей, специфичных для гематопоэтических и/или эритроидных клеток.

Термин "промотор" в данной заявке относится к участку распознавания в полинуклеотиде (ДНК или РНК), с которым связывается РНК-полимераза.

Термин "энхансер" относится к фрагменту ДНК, который содержит последовательности, способные обеспечивать повышенную транскрипцию и, в некоторых случаях, может функционировать независимо от его ориентации по отношению к другой контролирующей последовательности. Энхансер может функционировать совместно или дополнительно к промоторам и/или другим энхансерным элементам. Термин "промотор/энхансер" относится к фрагменту ДНК, который содержит последовательности, способные осуществлять функции как промотора, так и энхансера.

В конкретных вариантах реализации вектор содержит экзогенные, эндогенные или гетерологичные контролирующие последовательности, такие как промоторы и/или энхансеры. "Эндогенная" контролирующая последовательность представляет собой такую последовательность, которая в природе связана с данным геном в геноме. "Экзогенная" контролирующая последовательность представляет собой такую последовательность, которую поместили рядом с геном с помощью генетических манипуляций (т.е., методик молекулярной биологии), так что транскрипция данного гена направляется связанным с ним энхансером/промотором. "Гетерологичная" контролирующая последовательность представляет собой экзогенную последовательность, которая получена из вида, отличного от вида, к которому принадлежит подвергнутая генетической манипуляции клетка. "Синтетическая" контролирующая последовательность может содержать элементы из одной или более эндогенных и/или экзогенных последовательностей и/или последовательностей, определенных in vitro или in silico, которые обеспечивают оптимальную активность промотора и/или энхансера для конкретной генотерапии.

Термин "функционально связанный" относится к расположению рядом, при котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать предполагаемым образом. В одном варианте реализации данный термин относится к функциональной связи между контролирующей экспрессию нуклеиновой кислоты последовательностью (такой как промотор, и/или энхансер, или другая контролирующая экспрессию последовательность) и второй полинуклеотидной последовательностью, например, представляющим интерес полинуклеотидом, при этом контролирующая экспрессию последовательность направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности.

В данной заявке термин "конститутивная контролирующая экспрессию последовательность" относится к промотору, энхансеру или промотору/энхансеру, который позволяет непрерывную или постоянную транскрипцию функционально связанной с ним последовательности. Конститутивная контролирующая экспрессию последовательность может представлять собой "общераспространенный" промотор, энхансер или промотор/энхансер, который позволяет экспрессию в большом разнообразии типов клеток и тканей, или "специфичный для клетки", "специфичный для типа клеток", "специфичный для линии дифференцировки клеток" или "тканеспецифический" промотор, энхансер, или промотор/энхансер, который позволяет экспрессию в ограниченных разновидностях типов клеток и тканей, соответственно. Типичные общераспространенные контролирующие экспрессию последовательности включают, но не ограничены перечисленными: немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV), промотор вируса обезьян 40 (SV40) (например, ранний или поздний), промотор LTR вируса лейкоза мыши Молони (MoMLV), контролирующую экспрессию последовательность LTR вируса саркомы Рауса (RSV), промотор вируса простого герпеса (HSV) (тимидинкиназы), промоторы Н5, Р7.5 и Р11 из вируса коровьей оспы, промотор фактора элонгации 1-альфа (EF1a), контролирующую экспрессию последовательность белка раннего ростового ответа 1 (EGR1), ферритина Н (FerH), ферритина L (FerL), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), эукариотического фактора инициации трансляции 4А1 (EIF4A1), белка теплового шока 5 массой 70 кДа (HSPA5), представителя 1 белков теплового шока бета массой 90 кДа (HSP90B1), белка теплового шока массой 70 кДа (HSP70), β-кинезина (β-KIN), локуса ROSA 26 человека (Irions и др., (2007) Nature Biotechnology 25, 1477-1482), промотор убиквитина С (UBC), промотор фосфоглицераткиназы-1 (PGK), энхансер цитомегаловируса/промотор β-актина цыпленка (CAG) и промотор β-актина.

В некотором варианте реализации может быть желательно применение специфичной для клетки, типа клеток, линии дифференцировки клеток или ткани контролирующей экспрессию последовательности для достижения специфичной для типа клеток, специфичной для линии дифференцировки или тканеспецифической экспрессии желательной полинуклеотидной последовательности (например, для экспрессии конкретной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид только в подгруппе типов клеток, линий дифференцировки клеток или тканей или во время конкретной стадии развития).

Наглядные примеры тканеспецифических промоторов включают, но не ограничены перечисленными: промотор В29 (экспрессия в В-клетках), промотор родственного runt фактора транскрипции (CBFa2) (специфическая экспрессия в стволовых клетках), промотор CD14 (экспрессия в моноцитарных клетках), промотор CD43 (экспрессия в лейкоцитах и тромбоцитах), промотор CD45 (экспрессия в гематопоэтических клетках), промотор CD68 (экспрессия в макрофагах), промотор CYP450 3А4 (экспрессия в гепатоцитах), промотор десмина (экспрессия в мышцах), промотор эластазы 1 (экспрессия в ацинарных клетках поджелудочной железы), промотор эндоглина (экспрессия в эндотелиальных клетках), промотор фибробласт-специфичного белка 1 (FSP1) (экспрессия в фибробластах), промотор фибронектина (экспрессия в фибробластах), промотор fms-родственной тирозинкиназы 1 (FLT1) (экспрессия в эндотелиальных клетках), промотор глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) (экспрессия в астроцитах), промотор инсулина (экспрессия в бета-клетках поджелудочной железы), промотор интегрина альфа 2b (ITGA2B) (мегакариоциты), промотор молекулы межклеточной адгезии 2 (ICAM-2) (эндотелиальные клетки), промотор интерферона бета (IFN-β) (гематопоэтические клетки), промотор кератина 5 (экспрессия в кератиноцитах), промотор миоглобина (MB) (экспрессия в мышцах), промотор гена миогенной дифференцировки 1 (MYOD1) (экспрессия в мышцах), промотор нефрина (экспрессия в подоцитах), промотор белка гамма-карбоксиглутамата 2 кости (OG-2) (экспрессия в остеобластах), промотор трансферазы 2В 3-оксокислотной СоА (Oxct2B) (экспрессия в гаплоидной сперматиде), промотор поверхностно-активного белка В (SP-B) (экспрессия в легком), промотор синапсина (экспрессия в нейронах), промотор белка синдрома Вискотта-Олдрича (WASP) (экспрессия в гематопоэтических клетках).

В одном варианте реализации вектор содержит один или более специфичных для гематопоэтических клеток или тканеспецифических промоторов и/или энхансеров, выбранных из группы, состоящей из: промотора β-глобина человека; LCR β-глобина человека; и энхансера HS40 α-глобина человека и промотора анкирина-1, функционально связанных с полинуклеотидом, кодирующим полипептид глобина.

В другом варианте реализации вектор согласно настоящему изобретению содержит промотор, активный в микроглиальной клетке, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим полипептид представителя 1 подсемейства D белков с АТФ-связывающей кассетой (ABCD1). В некоторых вариантах реализации промотор содержит энхансер миелопролиферативного вируса саркомы, промотор MND с удаленной областью отрицательного контроля и с заменой участка связывания праймера на d1587rev или его транскрипционно активный фрагмент.

В данной заявке "условная экспрессия" может относиться к любому типу условной экспрессии, включая, но не ограничиваясь перечисленными: индуцируемую экспрессию; репрессируемую экспрессию; экспрессию в клетках или тканях, находящихся в определенном физиологическом, биологическом или болезненном состоянии и т.д. Не предполагается, что данное определение исключает специфическую для типа клеток или тканеспецифическую экспрессию. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложена условная экспрессия представляющего интерес полинуклеотида, например, экспрессию контролируют, подвергая клетку, ткань, организм и т.д. обработке или помещая в условия, которые вызывают экспрессию полинуклеотида или которые вызывают повышение или снижение экспрессии полинуклеотида, кодируемого представляющим интерес полинуклеотидом.

Наглядные примеры индуцируемых промоторов/систем включают, но не ограничены перечисленными: индуцируемые стероидами промоторы, такие как промоторы для генов, кодирующих рецепторы глюкокортикоидов или эстрогенов (индуцируемые обработкой соответствующим гормоном), промотор металлотионеина (индуцируемый обработкой различными тяжелыми металлами), промотор МХ-1 (индуцируемый интерфероном), регулируемую мифепристоном систему "GeneSwitch" (Sirin и др., (2003), Gene, 323:67), индуцируемый куматом переключатель генов (WO 2002/088346), тетрациклин-зависимые регуляторные системы и т.д.

Условной экспрессии также можно добиться, применяя сайт-специфическую ДНК-рекомбиназу. Согласно некоторым вариантам реализации вектор может содержать по меньшей мере один (обычно два) сайт для рекомбинации, опосредованной сайт-специфической рекомбиназой. В данной заявке термины "рекомбиназа" или "сайт-специфическая рекомбиназа" включают вырезающие или объединяющие белки, ферменты, кофакторы или ассоциированные с ними белки, которые участвуют в реакциях рекомбинации с вовлечением одного или более сайтов рекомбинации (например, двух, трех, четырех, пяти, семи, десяти, двенадцати, пятнадцати, двадцати, тридцати, пятидесяти и т.д.), которые могут представлять собой белки дикого типа (см. Landy, (1993) Current Opinion in Biotechnology 3:699-707) или их мутанты, производные (например, слитые белки, содержащие рекомбинационные белковые последовательности или их фрагменты), фрагменты и варианты. Наглядные примеры рекомбиназ, подходящих для применения в конкретных вариантах реализации настоящего изобретения, включают, но не ограничены перечисленными: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ФС31, Cin, резольвазу Tn3, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 и ParA.

Указанные векторы могут содержать один или более сайтов рекомбинации для любой из большого разнообразия сайт-специфических рекомбиназ. Должно быть очевидно, что целевой сайт для сайт-специфической рекомбиназы встраивают дополнительно к какому-либо сайту(-ам), необходимому(-ым) для встраивания вектора, например, ретровирусного вектора или лентивирусного вектора. В данной заявке термины "последовательность рекомбинации", "сайт рекомбинации" или "участок сайт-специфической рекомбинации" относятся к конкретной последовательности нуклеиновой кислоты, которую распознает и связывает рекомбиназа.

Например, один сайт рекомбинации для рекомбиназы Cre представляет собой 1охР, который представляет собой последовательность из 34 пар оснований, содержащую два инвертированных повтора по 13 пар оснований (которые служат в качестве сайтов связывания рекомбиназы), фланкирующих коровую последовательность из 8 пар оснований (см. фиг. 1 в Sauer, В., (1994) Current Opinion in Biotechnology 5:521-527). Другие примеры сайтов loxP включают, но не ограничены перечисленными: 1ох511 (Hoess и др., 1996; Bethke и Sauer, 1997), lox5171 (Lee и Saito, 1998), lox2272 (Lee и Saito, 1998), m2 (Langer и др., 2002), lox71 (Albert и др., 1995) и lox66 (Albert и др., 1995).

Подходящие сайты распознавания для рекомбиназы FLP включают, но не ограничены перечисленными: FRT (McLeod, и др., 1996), F1, F2, F3 (Schlake и Bode, 1994), F4, F5 (Schlake и Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff и др., 1988), FRT(RE) (Senecoff и др., 1988).

Другими примерами последовательностей узнавания являются последовательности attB, attP, attL и attR, которые узнаются рекомбиназным ферментом λ интегразой, например, phi-c31. ϕС31 SSR опосредует рекомбинацию только между гетеротипическими сайтами attB (длиной 34 п. о.) и attP (длиной 39 п. о.) (Groth и др., 2000). Оба сайта attB и attP (сайты присоединения (от attachment) интегразы фага в геномах бактерии (В) и фага (Р), соответственно) содержат неидеальные инвертированные повторы, которые вероятно связаны гомодимерами ϕС31 (Groth и др., 2000). Полученные сайты attL и attR активно инертны к дальнейшей опосредованной ϕС31 рекомбинации (Belteki и др., 2003), что делает данную реакцию необратимой. В отношении катализа вставок было обнаружено, что несущая attB ДНК встраивается в геномный сайт attP легче, чем сайт attP в геномный сайт attB (Thyagarajan и др., 2001; Belteki и др., 2003). Таким образом, в обычных стратегиях несущий attP "сайт присоединения" располагают путем гомологичной рекомбинации в определенном локусе, который затем образует пару с несущей attB образующейся последовательностью для вставки.

В данной заявке "внутренний участок посадки рибосомы" или "IRES" относится к элементу, который вызывает непосредственную внутреннюю посадку рибосомы на инициирующий кодон, такой как ATG, цистрона (кодирующей белок области), тем самым приводя к кэп-независимой трансляции гена. См., например, Jackson и др., (1990) Trends Biochem Sci 15(12):477-83) и Jackson и Kaminski. (1995) RNA 1(10):985-1000. В конкретных вариантах реализации вектор содержит один или более представляющих интерес полинуклеотидов, которые кодируют один или более полипептидов. В конкретных вариантах реализации для достижения эффективной трансляции каждого из множества полипептидов, указанные полинуклеотидные последовательности можно разделить одной или более последовательностями IRES или полинуклеотидными последовательностями, кодирующими самоотщепляющиеся полипептиды.

В данной заявке термин "последовательность козак" относится к короткой последовательности нуклеотидов, которая значительно способствует первоначальному связыванию мРНК с малой субъединицей рибосомы и повышает уровень трансляции. Консенсусная последовательность козак представлена далее: (GCC)RCCATGG, где R представляет собой пурин (А или G) (Kozak, (1986) Cell. 44(2):283-92, и Kozak, (1987) Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48). В конкретных вариантах реализации векторы, предложенные в настоящем изобретении, содержат полинуклеотиды, которые содержат консенсусную последовательность козак и которые кодируют желательный полипептид.

В некоторых вариантах реализации векторы содержат ген селекции, также называемый селектируемым маркером. Обычные гены селекции кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, гигромицину, метотрексату, зеоцину, бластицидину или тетрациклину, (b) восполняют ауксотрофный дефицит или (с) предоставляют необходимые питательные вещества, которые не доступны в комплексной среде, например, ген, кодирующий D-аланинрацемазу для бацилл. Можно применять любое количество систем селекции для получения линий трансформированных клеток. Они включают, но не ограничены перечисленными: гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler и др., (1977) Cell 11:223-232) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy и др., (1990) Cell 22:817-823), которые можно использовать в клетках tk- или aprt-, соответственно.

В различных вариантах реализации векторы применяют для повышения, установления и/или поддержания экспрессии одного или более полипептидов. Термины "полипептид" и "белок" используют взаимозаменяемо в данной заявке по отношению к полимеру из аминокислотных остатков и к его вариантам и синтетическим аналогам. Таким образом, данные термины используют по отношению как к полимерам аминокислот, в которых один или более аминокислотных остатков являются синтетическими не встречающимися в природе аминокислотами, такими как химический аналог соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, так и к полимерам встречающихся в природе аминокислот. Наглядные примеры полипептидов включают, но не ограничены полипептидами глобинов, подходящими для применения в композициях и способах конкретных вариантов реализации. Также см., например, патенты США 6051402; 7901671 и 9068199, полные описания и формулы изобретения которых явно включены в данную заявку посредством ссылки.

Наглядные примеры полипептидов также включают полипептиды ABCD1. Также см., например, патенты США 5869039; 6013769; 8858928 и 9061031, полные описания и формулы изобретения которых явно включены в данную заявку посредством ссылки.

Дополнительно наглядные примеры полипептидов включают, но не ограничены перечисленными: полипептид глобина, полипептид глобина, предотвращающего образование серповидноклеточных эритроцитов, полипептид аденозиндезаминазы, полипептид рецептора интерлейкина-2 гамма, полипептид трипептидилпептидазы 1, полипептид альфа-L-идуронидазы, полипептид идуронат-2-сульфатазы или полипептид представителя 1 подсемейства D (ALD) белков с АТФ-связывающей кассетой (ABCD1).

Конкретные варианты реализации, предложенные в данной заявке, также включают "варианты" полипептидов. Термин "вариант" полипептида относится к полипептидам, которые отличаются от исходного полипептида вставкой, делецией, укорачиванием, модификациями и/или заменой по меньшей мере одного аминокислотного остатка, и которые сохраняют биологическую активность. В некоторых вариантах реализации вариант полипептида отличается от исходного полипептида одной или более заменами, которые могут быть консервативными или неконсервативными, как известно в данной области.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот варианта полипептида по меньшей мере приблизительно на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более процентов идентична или подобна соответствующей последовательности исходного полипептида. В некоторых вариантах реализации вставки или делеции аминокислот встречаются на С-конце и/или N-конце исходного полипептида.

Выше отмечено, что полипептиды согласно настоящему изобретению можно изменить различными способами, включая замены аминокислот, делеции, укорачивания и вставки. Способы таких манипуляций, как правило, известны в данной области. Например, варианты последовательности аминокислот исходного полипептида можно получить, внося мутации в ДНК. Способы мутагенеза и изменений последовательности нуклеотидов хорошо известны в данной области. См., например, Kunkel (1985) Proc. Natl Acad. Sci. USA. 82: 488-492, Kunkel и др., (1987) Methods in Enzymol, 154: 367-382, патент США номер 4873192, Watson, J.D. и др., (1987) Molecular Biology of the Gene, четвертое издание, Benjamin/Cummings, Менло Парк, Калифорния, и ссылки, цитированные в указанных источниках. Руководство по подходящим заменам аминокислот, которые не влияют на биологическую активность представляющего интерес белка, можно найти в модели Dayhoff и др., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Вашингтон, округ Колумбия).

"Клетка-хозяин" включает клетки, трансфицированные, инфицированные или трансдуцированные in vivo, ex vivo или in vitro рекомбинантным вектором или полинуклеотидом, предложенным в данной заявке. Клетки-хозяева могут включать пакующие клетки, клетки-продуценты и клетки, инфицированные вирусными векторами. В конкретных вариантах реализации клетки-хозяева, инфицированные вирусным вектором согласно настоящему изобретению, вводят нуждающемуся в терапии субъекту. В некоторых вариантах реализации термин "целевая клетка" используют взаимозаменяемо с термином клетка-хозяин, и он относится к трансфицированным, инфицированным или трансдуцированным клеткам желательного типа. В предпочтительных вариантах реализации целевая клетка представляет собой стволовую клетку или клетку-предшественника. В некоторых предпочтительных вариантах реализации целевая клетка представляет собой соматическую клетку, например, стволовую клетку взрослого, клетку-предшественника или дифференцированную клетку. В особо предпочтительных вариантах реализации целевая клетка представляет собой гематопоэтическую клетку, например, гематопоэтическую стволовую клетку или клетку-предшественника. Дополнительные терапевтические целевые клетки обсуждаются ниже.

В конкретных вариантах реализации целевые клетки представляют собой первичную клетку. Термин "первичная клетка", используемый в данной заявке, известен в данной области как относящийся к клетке, которую выделили из ткани и приспособили для роста in vitro или ex vivo. Соответствующие клетки претерпевают очень малое число удвоений популяции, если вообще претерпевают, и, следовательно, лучше представляют основной функциональный компонент ткани, из которой они получены, по сравнению с непрерывными линиями клеток, следовательно, являются более репрезентативной моделью состояния in vivo. Способы получения образцов из различных тканей и способы получения линий первичных клеток хорошо известны в данной области (см., например, Jones и Wise, Methods Mol Biol. 1997). Первичные клетки для применения в способе согласно настоящему изобретению получены, например, из крови, лимфомы и эпителиальных опухолей. В одном варианте реализации первичная клетка представляет собой гематопоэтическиую стволовую клетку или клетку-предшественника.

Термин "стволовая клетка" относится к клетке, которая представляет собой недифференцированную клетку, способную к (1) длительному самообновлению или способную образовывать по меньшей мере одну идентичную копию исходной клетки, (2) дифференцировке на уровне одной клетки во множество, а в некоторых случаях только в один специализированный тип клеток, и (3) функциональной регенерации тканей in vivo. Стволовые клетки разделяют на следующие подклассы в соответствии с их способностью к дифференцировке: тотипотентные, плюрипотентные, мультипотентные и олиго/унипотентные. "Самообновление" относится к клетке с уникальной способностью производить неизмененные дочерние клетки и образовывать специализированные типы клеток (потентность). Самообновления можно добиться двумя путями. В результате асимметричного деления клетки образуется одна дочерняя клетка, которая идентична исходной клетке, и одна дочерняя клетка, которая отличается от исходной клетки и представляет собой клетку-предшественника или дифференцированную клетку. В результате симметричного деления клетки образуется две идентичные дочерние клетки. "Пролиферация" или "размножение" клеток относится к симметрично делящимся клеткам.

В данной заявке термин "предшественник" или "клетки-предшественники" относится к клеткам, обладающим способностью к самообновлению и дифференцировке в более зрелые клетки. Многие клетки-предшественники дифференцируются по одной линии дифференцировки, но могут обладать достаточно обширной способностью к пролиферации.

Гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) порождают коммитированные гематопоэтические клетки-предшественники (ГКП), которые способны образовывать весь репертуар зрелых клеток крови на всем протяжении жизни организма. Термин "гематопоэтическая стволовая клетка" или "ГСК" относится к мультипотентным стволовым клеткам, которые порождают все типы клеток крови организма, включая миелоидные (например, моноциты и макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты/тромбоциты, дендритные клетки) и лимфоидные линии дифференцировки (например, Т-клетки, В-клетки, NK-клетки), а также другие типы клеток, известные в данной области (см. Fei, R., и др., патент США №5635387; McGlave, и др., патент США №5460964; Simmons, Р., и др., патент США №5677136; Tsukamoto, и др., патент США №5750397; Schwartz, и др., патент США №5759793; DiGuisto, и др., патент США №5681599; Tsukamoto, и др., патент США №5716827). После трансплантации облученным летальной дозой животным или людям гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники могут восстановить популяцию эритроидных клеток, нейтрофилов-макрофагов, мегакариоцитов и лимфоидных гематопоэтических клеток.

Крупномасштабное получение вирусных частиц часто необходимо для достижения приемлемого титра вируса. Вирусные частицы получают путем трансфекции переносящим вектором пакующей линии клеток, которая содержит структурные и/или вспомогательные гены вируса, например, гены gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx, или nef, или другие гены ретровирусов.

В данной заявке термин "пакующий вектор" относится к вектору экспрессии или вирусному вектору, в котором отсутствует сигнал упаковки, и включает полинуклеотид, кодирующий один, два, три, четыре или более структурных и/или вспомогательных генов вируса. Обычно пакующие векторы содержатся в пакующей клетке, и их внедряют в указанную клетку путем трансфекции, трансдукции или инфекции. Способы трансфекции, трансдукции или инфекции хорошо известны специалистам в данной области. Ретровирусный/лентивирусный переносящий вектор, предложенный в конкретных вариантах реализации, можно внедрить в пакующую линию клеток путем трансфекции, трансдукции или инфекции с получением клетки-продуцента или линии клеток-продуцентов. Пакующие векторы можно внедрить в клетки или линии клеток человека с помощью стандартных способов, включая, например, кальций-фосфатную трансфекцию, липофекцию или электропорацию. В некоторых вариантах реализации пакующие векторы внедряют в клетки вместе с доминантным селектируемым маркером, таким как неомицин, гигромицин, пуромицин, бластицидин, зеоцин, тимидинкиназа, DHFR, синтетаза Gin или ADA, а затем подвергают селекции в присутствии подходящего препарата и выделяют клонов. Ген селектируемого маркера может быть физически связан с генами, кодирующими пакующий вектор, например, посредством IRES или самоотщепляющихся пептидов вируса.

Белки оболочки вируса (env) определяют диапазон клеток-хозяев, которые в конечном итоге могут быть инфицированы и трансформированы рекомбинантными ретровирусами, полученными из линий клеток. В случае лентивирусов, таких как ВИЧ-1, ВИЧ-2, SIV, FIV и EIV, белки env включают gp41 и gpl20. Предпочтительно, белки env вируса, которые экспрессируются пакующими клетками согласно настоящему изобретению, кодируются отдельным вектором от кодирующего гены gag и pol вируса, что было описано ранее.

Наглядные примеры полученных из ретровируса генов env, которые можно применять в настоящем изобретении, включают, но не ограничены перечисленными: гены оболочек MLV, оболочки 10А1, оболочек эндогенного вируса бабуинов (BAEV), вируса лейкоза кошачьих типа В (FeLV-B), эндогенного вируса кошачьих RD114, ассоциированного с саркомой вируса обезьян (SSAV), вируса эбола, вируса сендай, вируса чумы домашней птицы (FPV) и вируса гриппа. Аналогично, можно применять гены, кодирующие оболочки из РНК-содержащих вирусов (например, РНК-содержащего вируса из семейства Picornaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Bimaviridae, Retroviridae), а также из ДНК-вирусов (семейства Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxyiridae и Iridoviridae). Типичные примеры включают: FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, вирус бешенства, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 и EIAV.

В других вариантах реализации белки оболочки для псевдотипирования вируса согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены белками оболочки из любого из следующих вирусов: вируса гриппа А, такого как H1N1, H1N2, H3N2 и H5N1 (птичий грипп), вируса гриппа В, вируса гриппа С, вируса гепатита А, вируса гепатита В, вируса гепатита С, вируса гепатита D, вируса гепатита Е, ротавируса, любого вируса из группы вирусов норфолк, кишечных аденовирусов, парвовируса, вируса лихорадки денге, вируса оспы обезьян, Mononegavirales, лиссавируса, такого как вирус бешенства, вируса лагосских летучих мышей, вируса мокола, вируса Duvenhage, вируса европейский летучих мышей 1 и 2 и вируса австралийских летучих мышей, эфемеровируса, везикуловируса, вируса везикулярного стоматита (VSV), герпесвирусов, таких как вирус простого герпеса типа 1 и 2, ветряная оспа, опоясывающий лишай, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр (EBV), герпесвирусов человека (HHV), герпесвируса типа 6 и 8 человека, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса папилломы, гаммагерпесвируса мыши, аренавирусов, таких как вирус аргентинской геморрагической лихорадки, вирус боливийской геморрагической лихорадки, сэбия-ассоциированный вирус геморрагической лихорадки, вирус венесуэльской геморрагической лихорадки, вирус лихорадки ласса, вирус мачупо, вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), Bunyaviridiae, таких как вирус конго-крымской геморрагической лихорадки, хантавирус, вирус, вызывающий геморрагическую лихорадку с почечным синдромом, вирус лихорадки долины Рифт, Filoviridae (филовирусы), включая вирус геморрагической лихорадки эбола и вирус марбургской геморрагической лихорадки, Flaviviridae, включая вирус болезни Кьясанурского леса, вирус омской геморрагической лихорадки, вирус, вызывающий переносимый клещами энцефалит, и Paramyxoviridae, такие как вирус Хендра и вирус Нипах, Variola major и Variola minor (малая оспа), альфавирусы, такие как вирус венесуэльского лошадиного энцефалита, вирус восточного лошадиного энцефалита, вирус западного лошадиного энцефалита, SARS-ассоциированный коронавирус (SARS-CoV), вирус лихорадки Западного Нила, любой вызывающий энцефалит вирус.

В одном варианте реализации предложены пакующие клетки, которые продуцируют рекомбинантный ретровирус, например, лентивирус, псевдотипированные гликопротеином VSV-G.

Термины "псевдотип" или "псевдотипирование" в данной заявке относятся к вирусу, белки оболочки которого были заменены на таковые из другого вируса, обладающего предпочтительными свойствами. Например, ВИЧ можно псевдотипировать G-белками оболочки вируса везикулярного стоматита (VSV-G), что позволяет ВИЧ инфицировать более широкий диапазон клеток, так как белки оболочки ВИЧ (кодируемые геном env) обычно нацеливают вирус на CD4⁺-представляющие клетки. В предпочтительном варианте реализации белки оболочки лентивируса псевдотипируют VSV-G. В одном варианте реализации пакующие клетки продуцируют рекомбинантный ретровирус, например, лентивирус, псевдотипированный гликопротеином оболочки VSV-G.

В данной заявке термин "линии пакующих клеток" используют для обозначения линий клеток, которые не содержат сигнал упаковки, но стабильно или временно экспрессируют структурные белки и ферменты репликации вируса (например, gag, pol и env), которые необходимы для правильной упаковки вирусных частиц. В конкретных вариантах реализации для получения пакующих клеток согласно настоящему изобретению можно применять подходящую линию клеток. Как правило, указанные клетки представляют собой клетки млекопитающих. В некотором варианте реализации клетки, используемые для получения линии пакующих клеток, представляют собой клетки человека. Подходящие линии клеток, которые можно применять, включают, например, клетки СНО, клетки BHK, клетки MDCK, клетки С3Н 10Т1/2, клетки FLY, клетки Psi-2, клетки BOSC 23, клетки РА317, клетки WEHI, клетки COS, клетки BSC 1, клетки BSC 40, клетки ВМТ 10, клетки VERO, клетки W138, клетки MRC5, клетки А549, клетки НТ1080, клетки 293, клетки 293Т, клетки В-50, клетки 3Т3, клетки NIH3T3, клетки HepG2, клетки Saos-2, клетки Huh7, клетки HeLa, клетки W163, клетки 211 и клетки 211А. В предпочтительных вариантах реализации пакующие клетки представляют собой клетки 293, клетки 293Т, клетки 293F или клетки А549.

В данной заявке термин "линия клеток-продуцентов" относится к линии клеток, которые способны продуцировать рекомбинантные ретровирусные частицы, включающей линию пакующих клеток и конструкцию переносящего вектора, содержащую сигнал упаковки. Получение инфекционных вирусных частиц и исходных растворов вируса можно осуществить, применяя обычные методики. Способы получения исходных растворов вируса известны в данной области и проиллюстрированы, например, в Y. Soneoka и др. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, и N. R. Landau и др. (1992) J. Virol. 66:5110-5113. Инфекционные вирусные частицы можно собрать из пакующих клеток, применяя обычные методики. Например, инфекционные частицы можно собрать путем лизиса клеток или сбора супернатанта из культуры клеток, как известно в данной области. Необязательно собранные вирусные частицы можно очистить, если требуется. Подходящие методики очистки хорошо известны специалистам в данной области, например, Kutner и др., ВМС Biotechnol. 2009; 9:10. doi: 10.1186/1472-6750-9-10; Kutner и др. Nat. Protoc. 2009; 4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22.

Термины "улучшать", или "стимулировать", или "увеличивать", или "расширять", как правило, относятся к способности указанных композиций и/или способов, предложенных в данной заявке, вызывать, обусловливать или создавать более высокие количества трансдуцированных клеток по сравнению с количеством клеток, трансдуцированных либо средой, либо контрольной молекулой/композицией. В одном варианте реализации трансдукция гематопоэтической стволовой клетки или клетки-предшественника с помощью композиций и способов, предложенных в данной заявке, позволяет получить повышенное количество трансдуцированных клеток по сравнению с существующими композициями и способами трансдукции. Повышение уровня трансдукции клеток можно установить, применяя способы, известные в данной области, такие как анализы по гену-репортеру, ОТ-ПЦР и экспрессия белка на поверхности клетки, среди прочих. "Повышенный" или "увеличенный" уровень трансдукции обычно представляет собой "статистически значимый" уровень и может включать увеличение в 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 или более раз (например, в 500, 1000 раз) (включая все целые числа и десятичные знаки между и выше 1, например, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, и т.д.) относительно количества клеток, трансдуцированных средой, контрольной композицией или другим способом трансдукции.

Термины "уменьшать", или "снижать", или "убавлять", или "сокращать", или "ослаблять", как правило, относятся к композициям или способам, которые приводят к сравнительно меньшему количеству трансдуцированных клеток по сравнению с клетками, трансдуцированными с помощью композиций и/или способов согласно настоящему изобретению. "Уменьшенное" или "сокращенное" количество трансдуцированных клеток обычно представляет собой "статистически значимое" количество и может включать уменьшение в 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 или более раз (например, 500, 1000 раз) (включая все целые числа и десятичные знаки между и выше 1, например, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, и т.д.) относительно количества трансдуцированных клеток (эталонного ответа), полученных с помощью композиций и/или способов согласно настоящему изобретению.

Термины "сохранять", или "предохранять", или "поддержание", или "нет изменений", или "нет существенных изменений", или "нет существенного снижения", как правило, относятся к физиологическому ответу, который сопоставим с ответом, вызванным либо средой, либо контрольной молекулой/композицией, или к ответу в конкретной клетке. Сопоставимый ответ представляет собой такой ответ, который значительно не отличается или измеримо не отличается от эталонного ответа.

В следующем далее описании приведены некоторые конкретные подробности, чтобы дать полное понимание различных пояснительных вариантов реализации настоящего изобретения, предложенных в данной заявке. Тем не менее, для специалиста в данной области должно быть очевидно, что конкретные пояснительные варианты реализации можно осуществить без данных подробностей. Кроме того, должно быть очевидно, что отдельные векторы или группы векторов, полученных из различных комбинаций структур и замещающих групп, описанных в данной заявке, раскрыты в настоящей заявке в той же степени, как если бы каждый вектор или группа векторов был описан отдельно. Таким образом, выбор конкретных структур вектора или конкретных замещающих групп входит в объем настоящего описания.

С. Агенты

Различные варианты реализации, предложенные в данной заявке, обусловлены неожиданным открытием, что эффективность трансдукции и/или ЧКВ значительно повышается при приведении в контакт клеток in vitro, ex vivo или in vivo с ретровирусом и одним или более агентами, которые повышают эффективность трансдукции или ЧКВ, предложенными в данной заявке. В различных вариантах реализации эффективность трансдукции значительно повышается при приведении в контакт клеток in vitro, ex vivo или in vivo с ретровирусом и полоксамером. В различных вариантах реализации эффективность трансдукции значительно повышается при приведении в контакт клеток in vitro, ex vivo или in vivo с ретровирусом и полоксамером, возможно в комбинации с одним или более поликатионными полимерами или пептидами. В различных вариантах реализации эффективность трансдукции значительно повышается при приведении в контакт клеток in vitro, ex vivo или in vivo с ретровирусом, полоксамером и одним или более агентами, которые стимулируют путь передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, и/или стауроспорином, необязательно в комбинации с одним или более поликатионными полимерами или пептидами.

1. АГОНИСТЫ ПУТИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛОВ РЕЦЕПТОРА ПРОСТАГЛАНДИНА ЕР.

Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что эффективность трансдукции и/или ЧКВ в популяциях клеток, содержащих гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, можно повысить путем культивирования указанных клеток в присутствии ретровируса, полоксамера и одного или более агентов, которые стимулируют путь передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, и их аналогов и производных.

В конкретных вариантах реализации популяцию клеток, содержащую гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, трансдуцируют путем культивирования клеток в присутствии ретровируса в присутствии одного или более агентов, которые стимулируют путь передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, т.е. агониста пути передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, и полоксамера.

Агенты, которые стимулируют передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, включают, но не ограничены малыми молекулами или соединениями, описанными в WO 2007/112084 и WO 2010/108028, каждый из которых полностью включен в данную заявку посредством ссылки. В данной заявке формулировки "стимулируют передачу сигналов рецептора простагландина ЕР", "активируют передачу сигналов рецептора простагландина ЕР" или "повышают передачу сигналов рецептора простагландина ЕР" в общем смысле относятся к способности агента повышать активность передачи сигнала от рецептора простагландина ЕР в клетке, которую приводят в контакт с одним или более агентами, по сравнению с активностью передачи сигнала в клетке от рецептора простагландина ЕР в отсутствие одного или более указанных агентов. Анализы, которые можно применять для измерения активации или стимуляции пути передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, известны в данной области и описаны, например, в WO 20107108028, который полностью включен в данную заявку посредством ссылки.

Наглядные примеры агентов, которые стимулируют путь передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, включают, но не ограничены перечисленными: малые молекулы, например, малые органические молекулы, простагландины, агонисты сигнального пути Wnt, агонисты сигнального пути сАМР/PI3K/AKT, агонисты сигнального пути вторичного мессенджера Са²⁺, агонисты сигнального пути оксида азота (NO)/ангиотензина и другие соединения, которые, как известно, стимулируют сигнальный путь простагландина, выбранные из группы, состоящей из: мебеверина, флурандренолида, атенолола, пиндолола, габоксадола, кинуреновой кислоты, гидралазина, тиабендазола, бикукуллина, везамикола, перувозида, имипрамина, хлорпропамида, 1,5-пентаметилентетразола, 4-аминопиридина, диазоксида, бенфотиамина, 12-метоксидодеценовой кислоты, N-формил-Met-Leu-Phe, галламина, IAA 94, хлортрианизена и производных данных соединений.

В конкретных вариантах реализации агент, который стимулирует сигнальный путь простагландина, представляет собой встречающуюся в природе или синтетическую химическую молекулу или полипептид, который связывается и/или взаимодействует с рецептором ЕР, обычно чтобы активировать или усилить один или более нисходящих сигнальных путей, связанных с рецептором простагландина ЕР.

В одном варианте реализации агент, который стимулирует сигнальный путь простагландина, выбран из группы, состоящей из: PGA₂; PGB₂; PGD₂; PGE₁ (алпростадила); PGE₂; PGF₂; PGI₂ (эпопростенола); PGH₂; PGJ₂; и их производных и аналогов.

Дополнительные типичные агенты, которые стимулируют сигнальный путь простагландина, включают, но не ограничены перечисленными: 15d-PGJ₂; дельта-12-PGJ₂; 2-гидроксигептадекатриеновую кислоту (ННТ); тромбоксан (ТХА₂ и ТХВ₂); аналоги PGI₂, например, илопрост и трепростинил; аналоги PGF₂, например, травопрост, трометамин карбопроста, талфупрост, латанопрост, биматопрост, изопропил унопростона, клопростенол, эстрофан и суперфан; аналоги PGE₁, например, 11-дезокси-PGE₁, мизопростол и бутапрост; и спирт кори-А [[3аα,4а,5β,6аα]-(-)-[гексагидро-4-(гидроксиметил)-2-оксо-2Н-циклопента[b]фуран-5-ил][1,1'-бифенил]-4-карбоксилат]; спирт кори-В [2Н-циклопента[b]фуран-2-он,5-(бензоилокси)гексагидро-4-(гидроксиметил)[3aR-(3аα,4α,5β,6аα)]]; и диол кори ((3aR,4S,5R,6aS)-гексагидро-5-гидрокси-4-(гидроксиметил)-2Н-циклопента[b]фуран-2-он).

В одном варианте реализации агент представляет собой лиганд рецептора простагландина ЕР, включая, но не ограничиваясь простагландином Е₂ (PGE₂), а также его "аналогами" или "производными". Простагландины в целом относятся к подобным гормонам молекулам, которые получают из жирных кислот, содержащих 20 атомов углерода, включая 5-углеродное кольцо, описанное в данной заявке и известное в данной области.

Наглядные примеры "аналогов" или "производных" PGE₂ включают, но не ограничены перечисленными: 16,16-диметил-PGE₂, 16-16 диметил-PGE₂ п-(п-ацетамидобензамидо)фениловый эфир, 11-дезокси-16,16-диметил-PGE₂, 9-дезокси-9-метилен-16, 16-диметил-PGE₂, 9-дезокси-9-метилен-PGE₂, 9-кетофлупростенол, 5-транс-PGE₂, 17-фенил-омега-тринор-PGE₂, сериноламид PGE₂, метиловый эфир PGE₂, 16-фенилтетранор PGE₂, 15(S)-15-метил-PGE₂, 15(R)-15-метил-PGE₂, 8-изо-15-кето-PGE₂, изопропиловый сложный эфир 8-изо-PGE₂, 20-гидрокси-PGE₂, ноклопрост, сульпростон, бутапрост, 15-кето-PGE₂ и 19(R)-гидрокси-PGE₂.

Также в данной заявке предложены аналоги или производные простагландина со сходной с PGE₂ структурой, которые содержат в качестве заместителя галоген в 9 положении (см., например, WO 2001/12596, который полностью включен в данную заявку посредством ссылки), а также производные 2-декарбокси-2-фосфиникопростагландина, такие как описанные в публикации патента США №2006/0247214, который полностью включен в данную заявку посредством ссылки).

В некоторых вариантах реализации соединение представляет собой лиганд не на основе PGE₂. В некоторых вариантах реализации лиганд не на основе PGE₂ выбран из группы, состоящей из агониста EP₁, агониста ЕР₂, агониста ЕР₃ и агониста ЕР₄.

В конкретных вариантах реализации рецептор простагландина ЕР выбран из ЕР₁, ЕР₂, ЕР₃ и ЕР₄.

Наглядные примеры агонистов EP₁ не на основе PGE₂ включают, но не ограничены перечисленными: ONO-DI-004 и ONO-8713. Наглядные примеры агонистов ЕР₂ не на основе PGE₂ включают, но не ограничены перечисленными: CAY10399, ONO_8815Ly, ONO-AE1-259 и СР-533,536. Дополнительные примеры агонистов ЕР₂ не на основе PGE₂ включают карбазолы и флуорены, описанные в WO 2007/071456, включенном в данную заявку посредством ссылки в отношении описания таких агентов. Наглядные примеры агонистов ЕР₃ не на основе PGE₂ включают, но не ограничены перечисленными: АЕ5-599, МВ28767, GR 63799Х, ONO-NT012 и ONO-AE-248. Наглядные примеры агонистов ЕР₄ не на основе PGE₂ включают, но не ограничены перечисленными: ONO-4819, APS-999 Na, АН23848 и ONO-AE 1-329. Дополнительные примеры агонистов ЕР₄ не на основе PGE₂ можно найти в WO 2000/038663; патенте США №6747037 и патенте США №6610719, каждый из которых включен посредством ссылки в отношении описания таких агонистов.

В одном варианте реализации агент, который стимулирует путь передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, представляет собой агонист Wnt. Наглядные примеры агонистов Wnt включают, но не ограничены полипептидами Wnt и ингибиторами киназы 3 гликогенсинтазы (GSK3). Наглядные примеры полипептидов wnt, подходящих для применения в качестве соединений, которые стимулируют путь передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, включают, но не ограничены перечисленными: Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt14, Wnt15 или Wnt15 и их биологически активные фрагменты.

Ингибиторы GSK3, подходящие для применения в качестве агентов, которые стимулируют путь передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, связывают и снижают активность GSK3α или GSK3β. Наглядные примеры ингибиторов GSK3 включают, но не ограничены перечисленными: BIO (6-бромоиндирубин-3'-оксим), LiCl или другие ингибиторы GSK-3, приведенные в качестве примера в патентах США 6057117 и 6608063 и заявках на патенты США 2004/0092535 и 2004/0209878; АТР-конкурентные селективные ингибиторы GSK-3-CHIR-911 и CH1R-837 (также называемые СТ-99021 и СТ-98023, соответственно). Chiron Corporation (Эмеривилл, Калифорния).

В другом варианте реализации агент, который стимулирует путь передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, повышает передачу сигналов через сигнальный путь вторичного мессенджера сАМР/PI3K/AKT и выбран из группы, состоящей из дибутирил-сАМР (DBcAMP), форболового эфира, форсколина, скларелина, 8-бром-сАМР, токсина холеры (СТх), аминофиллина, 2,4-динитрофенола (DNP), норэпинефрина, эпинефрина, изопротеренола, изобутилметилксантина (IBMX), кофеина, теофиллина (диметилксантина), дофамина, ролипрама, илопроста, полипептида, активирующего аденилатциклазу гипофиза (РАСАР), вазоактивного полипептида кишечника (VIP) и производных данных агентов.

В еще одном варианте реализации агент, который стимулирует путь передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, повышает передачу сигналов через сигнальный путь вторичного мессенджера Са2+ и выбран из группы, состоящей из Bapta-AM, фендилина, никардипина и производных данных агентов.

В другом варианте реализации агент, который стимулирует путь передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, повышает передачу сигналов через сигнальный путь NO/ангиотензина и выбран из группы, состоящей из L-Arg, нитропруссида натрия, ванадата натрия, брадикинина и производных перечисленных агентов.

В одном варианте реализации предложен способ улучшения эффективности трансдукции, включающий культивирование популяции клеток с ретровирусом и полоксамером и одним или более агентами, которые повышают передачу сигналов рецептора простагландина ЕР, выбранными из группы, состоящей из: простагландина, PGE₂; PGD₂; PGI₂; линолевой кислоты; 13(s)-HODE; LY171883; мидовой кислоты; эйкозатриеновой кислоты; эпоксиэйкозатриеновой кислоты; ONO-259; Сау1039; PGE₂; 16,16-диметил-PGE₂; 19(R)-гидрокси-PGE₂; п-(п-ацетамидобензамидо)фенилового эфира 16,16-диметил-PGE₂; 11-дезокси-16,16-диметил-PGE₂; 9-дезокси-9-метилен-16,16-диметил-PGE₂; 9-дезокси-9-метилен-PGE2; бутапроста; сульпростона; сериноламида PGE₂; метилового эфира PGE₂; 16-фенилтетранора PGE₂; 15(S)-15-метил-PGE2; 15(R)-15-метил-PGE₂; BIO; 8-бром-сАМР; форсколина; Bapta-AM; фендилина; никардипина; нифедипина; пимозида; строфантидина; ланатозида; L-Arg; нитропруссида натрия; ванадата натрия; брадикинина; мебеверина; флурандренолида; атенолола; пиндолола; габоксадола; кинуреновой кислоты; гидралазина; тиабендазола; бикукуллина; везамикола; перувозида; имипрамина; хлорпропамида; 1,5-пентаметилентетразола; 4-аминопиридина; диазоксида; бенфотиамина; 12-метоксидодеценовой кислоты; N-формил-Met-Leu-Phe; галламина; IAA 94 и хлортрианизена.

В некотором варианте реализации способ улучшения эффективности трансдукции включает культивирование популяции клеток с ретровирусом и полоксамером и одним или более агентами, которые представляют собой лиганды рецептора простагландина ЕР, выбранными из группы, состоящей из: PGE₂, 16,16-диметил-PGE₂, п-(п-ацетамидобензамидо)фенилового эфира 16,16-диметил-PGE₂, 11-дезокси-16,16-диметил-PGE₂, 9-дезокси-9-метилен-16, 16-диметил-PGE₂, 9-дезокси-9-метилен-PGE₂, 9-кетофлупростенола, 5-транс-PGE₂, 17-фенил-омега-тринор-PGE₂, сериноламида PGE₂, метилового эфира PGE₂, 16-фенилтетранора PGE₂, 15(S)-15-метил-PGE₂, 15(R)-15-метил-PGE₂, 8-изо-15-кето-PGE₂, изопропилового сложного эфира 8-изо-PGE₂, 20-гидрокси-PGE₂, ноклопроста, сульпростона, бутапроста, 15-кето-PGE₂ и 19(R)-гидрокси-PGE₂.

В конкретных вариантах реализации агент, который стимулирует рецептор пути передачи сигналов простагландина ЕР, представляет собой PGE₂ или 16,16-диметил-PGE₂.

В одном варианте реализации агент, который стимулирует рецептор пути передачи сигналов простагландина ЕР, представляет собой PGE₂.

В различных вариантах реализации популяцию клеток культивируют в присутствии ретровируса, одного или более агентов, которые стимулируют путь передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, и полоксамера со средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 10000 дальтон.

В различных вариантах реализации популяцию клеток культивируют в присутствии ретровируса, одного или более агентов, которые стимулируют путь передачи сигналов рецептора простагландина ЕР, и полоксамера, средняя молекулярная масса субъединиц полипропилена в котором составляет более чем приблизительно 2250 дальтон и который содержит более чем приблизительно 40% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 50% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 60% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 70% оксида полиэтилена.

В конкретных вариантах реализации полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 80% оксида полиэтилена.

В одном варианте реализации полоксамер представляет собой полоксамер 288.

В одном варианте реализации полоксамер представляет собой полоксамер 335.

В одном варианте реализации полоксамер представляет собой полоксамер 338.

В одном варианте реализации полоксамер представляет собой полоксамер 407.

2. СТАУРОСПОРИН

Стауроспорин - алкалоид, исходно полученный в Streptomyces staurospores в 1977 г. как противогрибковый агент. Стауроспорин представляет собой ингибитор протеинкиназ широкого спектра, ингибирующий такие киназы как, например, протеинкиназа С (PKC), сАМР-зависимая протеинкиназа (PKA), киназа фосфорилазы, киназа рибосомного белка S6, киназа рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R) и Са²⁺/кальмодулин-зависимая протеинкиназа II (Са/СаМ PKII). Наибольшая эффективность ингибирования наблюдается в отношении PKC (IC₅₀=2,7 нМ), и в несколько раз более низкая в отношении других протеинкиназ. Стауроспорин проявляет сильную цитотоксичность в отношении линий опухолевых клеток млекопитающих, индуцирует апоптоз клеток и останавливает рост поделившихся дрожжевых клеток, в частности, на стадии сразу после деления клетки.

Неожиданно авторы настоящего изобретения также обнаружили, что эффективность трансдукции и/или ЧКВ в популяциях клеток, содержащих гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, можно повысить путем культивирования указанных клеток в присутствии ретровируса, полоксамера и стауроспорина, и их аналогов и производных.

В различных вариантах реализации популяцию клеток культивируют в присутствии ретровируса, стауроспорина и полоксамера, средняя молекулярная масса которого составляет приблизительно 10000 дальтон.

В различных вариантах реализации популяцию клеток культивируют в присутствии ретровируса, стауроспорина и полоксамера, средняя молекулярная масса субъединиц полипропилена в котором составляет более чем приблизительно 2250 дальтон, и который содержит более чем приблизительно 40% оксида полиэтилена.