Метод индукции иммунного ответа организма млекопитающих-2 - RU2278704C2

Описание

Изобретение относится к области иммунологии, а именно к способам воздействия на иммунную систему, и может быть использовано при терапии заболеваний млекопитающих (как людей, так и животных), в том числе при терапии онкологических, аутоиммунных и вирусных заболеваний.

Известен метод индукции иммунного ответа на образование опухолевых клеток в организме млекопитающих (заявка на изобретение US №20030219420, А 61 К 045/00, С 12 N 005/08), состоящий:

1) в обработке опухоли тем или иным традиционным образом (чтобы уничтожить основную массу опухолевых клеток in vivo (абзац 0082 заявки));

2) в обработке лейкоцитарного концентрата (полученного в экстракорпоральном цикле из крови того же организма) таким образом, чтобы уменьшить количество плазмы и белков сыворотки в концентрате, а также, чтобы инициировать дифференциацию моноцитов, содержащихся наряду с другими клетками в концентрате, в функциональные дендритные антигенпрезентирующие клетки (далее АПК) путем прокачки лейкоцитарной массы через систему пластиковых каналов и фильтров;

3) и введении обработанного лейкоцитарного концентрата в организм.

Предполагается, что антигенные структуры клеток опухоли при взаимодействии с дендритными клетками будут последними предоставляться после введения в организм Т-клеткам с индукцией иммунного отклика со стороны организма.

Принципиальным недостатком метода является высокий риск распространения опухолевого процесса при недостаточно радикальном воздействии на опухоль при ее разрушении in vivo, например методами фотодинамической терапии. При традиционном же лечении - методами химиотерапии или облучением опухоли ионизирующей радиацией, а также при использовании сочетанных методов, - как известно, неизбежно страдает иммунная система организма в целом. Период иммуносупрессии длится достаточно долго и рассчитывать на значительную стимуляцию иммунной системы с формированием ответа организма, направленного против опухолевых клеток, путем введения в организм дифференцированных моноцитов не приходится, даже если предположить, что дифференцированные таким образом моноциты будут действительно достаточно функционально активны in vivo, что требует веских экспериментальных доказательств, полученных в условиях in vivo.

Кроме того, сам автор отдает себе отчет в том, что количество антигенных структур клеток солидных опухолей, которые могут попасть в систему кровообращения после разрушения опухоли и свободно циркулировать в крови крайне незначительно (см. абзац 0053) и, следовательно, вероятность контакта с дифференцированными моноцитами, введенными в организм, непосредственно в кровеносном русле также мала. Повысить константу связывания свободно циркулирующих антигенных структур и вводимых в организм обработанных моноцитов предлагается путем введения дополнительно в организм некоторого количества антител, специфичных к раковым клеткам того или иного типа и легко связывающихся с дифференцированными моноцитами. Помимо очевидного усложнения технологии в этом случае следует отметить, что спектр антител, связывающихся с опухолевыми клетками конкретного вида, весьма ограничен и далеко не исчерпывает собой все возможные в клинической практике варианты.

Известен еще один способ воздействия на иммунную систему млекопитающих путем

1) индукции in vitro дифференцирования в АПК моноцитов, содержащихся в некотором объеме крови, забранной из организма, путем обработки указанных моноцитов физическими воздействиями или химическими средствами;

2) последующей инкубацией дифференцированных моноцитов совместно с забранными из того же организма (или экзогенными) патологическими биологически активными элементами (предварительно инактивированными физическими воздействиями или химическими средствами);

3) и введением полученной смеси в указанный организм (патент US 6607722, A 01 N 063/00, A 01 N 065/00, A 01 N 001/02, С 12 N 005/00, см. также заявки на изобретения: US №20010053355, А 61 К 048/00, А 61 К 039/00; US №20020098469, А 01 N 001/02, А 01 N 063/00, А 01 N 065/00; US №20020114793, A 61 К 048/00, А 61 К 031/555, А 61 К 031/37, А 61 К 031/409, С 12 N 015/01; US №20020004044, A 61 К 048/00, С 12 N 005/08).

Под патологическими биологически активными элементами (далее ПБЭ) понимаются любые биологические структуры, способные вызывать ту или иную патологию и имеющие хотя бы один ассоциированный с ними антиген, являющийся их индивидуальным иммунологическим маркером: эти патологические клетки, способные вызывать ряд заболеваний (те или иные клоны иммунокомпетентных клеток (например, при аутоиммунных заболеваниях), клетки зараженные вирусом или пораженные бактериями, опухолевые клетки, различные микробы, вирусы, бактерии, циркулирующие в организме и т.д.

Применение указанного метода позволяет по данным авторов достичь более значительного терапевтического эффекта по сравнению с методом-предшественником (патент US 4613322, А 61 М 1/03), который был назван фото-ферезом.

Вместе с тем метод является трудоемким (см. раздел "примеры" патента US 6607722) и потенциально менее эффективен, чем возможные альтернативные варианты. Искусственная дифференцировка моноцитов in vitro в АПК после длительного физико-химического воздействия не позволяет считать, что при введении в организм таким образом полученных АПК их функциональная активность в условиях in vivo будет сопоставима с функциональной активностью АПК, образованных в ходе естественной дифференцировки в организме в процессе формирования иммунного отклика на антигенный стимул. Необходимый уровень иммунореактивности вводимых дифференцированных клеток обеспечивается их значительным количеством и;

следовательно, существенным объемом обработанной крови, что достаточно травматично для пациента.

Способ введения инкубированной смеси (внутривенно, подкожно, внутридермально или внутримышечно - см. текст описания патента US 6607722) также не позволяет достичь оптимального эффекта. Известно (см., например, А.Ройт, Дж.Бростофф, Д.Мейл. "Иммунология", М., изд-во "Мир", 2000 г.), что наиболее важными для предоставления "чужеродных" антигенов покоящимся Т-клеткам являются не тканевые макрофаги (в том числе и моноциты крови), способные презентировать антигены Т-лимфоцитам, а так называемые интердигитатные клетки (далее ИДК) регионарных лимфоузлов, АПК; локализованные в коже и в других плоскоэпителиальных покровах тела, а также моноциты крови при контакте с антигенами лишь после миграции по афферентным лимфатическим сосудам в паракортикальные области регионарных лимфоузлов и после взаимодействия там с рядом Т-клеток переходят в ИДК и способны эффективно представлять антигены Т-хелперам для формирования системного иммунологического отклика. Введенные же в организм в общей массе принудительно дифференцированные моноциты крови смогут вызвать генерализованный иммунный ответ также только после транспортировки связанных ими специфических маркеров ПБЭ в регионарные органы периферической иммунной системы.

Поэтому, исходя из вышеизложенного, наиболее близким по сущности и механизму действия на организм к заявляемому способу является метод, описанный в патенте US 5571082, A 61 M 37/00, который обеспечивает прямой контакт обработанных антигенов с ИДК, согласно которому обогащенную лейкоцитами суспензию, приготовленную из жидких тканей организма, подвергают облучению светом оптического диапазона (ультрафиолетовое излучение или излучение в видимой области спектра) в присутствии фотохимического агента, после чего возвращают эту фракцию непосредственно в лимфатическую систему пациента. Появление в организме фотоаддуктов, образовавшихся в результате ковалентного связывания молекул фотохимического агента с компонентами патологических антигенных структур (например, клоны патологических иммунокомпетентных клеток при злокачественных лимфопрофилеративных или аутоиммунных заболеваниях, пораженные вирусом или бактериями клетки, циркулирующие в организме собственно вирусы или бактерии и т.д.), присутствующих во введенной в лимфатическую систему фракции, их непосредственный контакт с ИДК обеспечивает генерализованный иммунный ответ, инициированный in vivo и протекающий без травмирования ИДК и других клеток периферической иммунной системы. При этом нет необходимости в специальной инкубации моноцитов крови с антигенными структурами патологических клеток, вирусов или бактерий.

Основным недостатком данного способа является то, что область его применения в клинической практике ограничивается перечнем только тех патологий, при которых специфические антигенные структуры, против которых и формируется иммунный ответ организма, присутствуют непосредственно в биологических жидкостях пациента (вирусные и бактериальные инфекции, аутоиммунные заболевания, заболевания системы крови или лимфы, включая злокачественные опухоли системы крови и костного мозга).

Предлагаемый способ решает задачу расширения области применения метода лимфофотофереза (патент US 5571082).

Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого способа, заключается в:

1) индукции иммунного ответа организма, направленного против любых опухолевых клеток, в том числе и клеток солидных опухолей, а также в

2) превентивной иммунизации организма против вирусов и бактерий.

По первому варианту заявленного изобретения указанный технический результат достигается тем, что способ индукции иммунного ответа организма млекопитающих включает получение из указанного организма или экзогенного источника патологических биологически активных элементов (ПБА-элементов), представляющих собой клетки опухолей любой локализации, за исключением клеток крови, или патологические клетки не опухолевой природы, за исключением клеток крови, или вирусы, или бактерии, преобразование ПБА-элементов в жидкую суспензию, обработку полученной жидкой суспензии ПБА-элементов светом оптического диапазона, или светом оптического диапазона в присутствии одного или нескольких фотохимических агентов, введение обработанной жидкой суспензии ПБА-элементов в лимфатическую систему.

Предпочтительно, чтобы подачу излучения оптического диапазона осуществляли в импульсной форме или в виде постоянного потока излучения.

Предпочтительно, чтобы облучение жидкой суспензии ПБА-элементов осуществлялось в присутствии кислорода.

Предпочтительно также, чтобы введение обработанной жидкой суспензии ПБА-элементов осуществлялось путем катетеризации или пункции лимфатической системы в области нижних конечностей.

Предпочтительно также, чтобы введение облученных фракций в лимфатическую систему осуществлялось постепенно в течение интервала времени от 0,5 до 24 часов.

По второму варианту заявленного изобретения указанный технический результат достигается тем, что способ индукции иммунного ответа организма млекопитающих включает получение из указанного организма биологической жидкости, получение из указанного организма или из экзогенного источника патологических биологических элементов (ПБА-элементов), представляющих собой клетки опухолей любой локализации, или патологические клетки неопухолевой природы, или вирусы, или бактерии, обогащение биологической жидкости ПБА-элементами, обработку биологической жидкости, обогащенной ПБА-элементами, светом оптического диапазона, или светом оптического диапазона в присутствии одного или нескольких фотохимических агентов, введение обработанной биологической жидкости, обогащенной ПБА-элементами, в лимфатическую систему организма.

Предпочтительно, чтобы в качестве биологической жидкости, обогащаемой ПБА-элементами, использовали кровь, или компоненты крови, или лимфу, или компоненты лимфы.

Предпочтительно, чтобы подачу излучения оптического диапазона осуществляли в импульсной форме или в виде постоянного потока излучения.

Предпочтительно, чтобы облучение биологической жидкости, обогащенной ПБА-элементами, осуществляли в присутствии кислорода.

Предпочтительно также, чтобы введение обработанной жидкости, обогащенной ПБА-элементами, осуществляли путем катетеризации или пункции лимфатической системы в области нижних конечностей.

В одних случаях введение обработанной суспензии может осуществляться постепенно в течение интервала времени от 0,5 до 24 часов.

Указанный результат достигается тем, что часть ПБЭ, полученных ex vivo из организма млекопитающего тем или иным образом (в случае солидных опухолей, например, с помощью инвазивных технологий) трансформируют стандартными методами иммунологии в жидкую суспензию, облучают указанную суспензию в присутствии фотохимического агента излучением оптического диапазона с целью инактивации и альтерации антигенных структур и вводят обработанную суспензию в лимфатическую систему организма. При введении обработанной жидкости в лимфатическую систему наблюдается выраженный иммунный ответ. Возможность контакта иммуногенных фотоаддуктов с определенными группами клеток лимфоидных органов обусловлена анатомическим положением этих клеток. В случае введения иммуногенного фотоаддукта эндолимфатически (или в окружающую лимфоузлы жировую клетчатку или в лимфоузлы, что технически более сложно) этот иммунореагент доставляется лимфой в дренирующие данную область лимфоузлы, где он взаимодействует с дендритными клетками лимфоидных фолликулов и почти полностью проходит через регионарные лимфатические узлы. Это вызывает мощный генерализованный иммунный ответ. В лимфе отсутствуют компоненты, способные экранировать находящиеся в ней интактные здоровые лимфоциты от взаимодействия с иммуногенным фотоаддуктом (в отличие от кровеносного русла), поэтому возможно прямое взаимодействие между здоровыми интактными лимфоцитами и иммуногенными фотоаддуктами. В результате реакции со стороны здоровых интактных лимфоцитов, направленной против патологических клеток, вирусов, бактерий, развивается системный иммунный ответ. При этом для достижения выраженного терапевтического эффекта достаточно использовать небольшое количество иммунореагента (10-20 куб.см.).Таким образом, одним из механизмов, реализующих терапевтический эффект предлагаемого способа является, вероятно, образование порогового количества циркулирующих в лимфатической системе комплексов ИДК с презентируемыми Т-клеткам специфическими антигенными структурами патологических клеток, бактерий, вирусов. Под патологическими клетками здесь и далее понимаются клетки опухолей организма различной локализации, клетки, пораженные вирусами или бактериями.

Консистенцию суспензии можно менять добавлением аутоплазмы или сыворотки.

В качестве фотоактивного химического агента могут быть использованы активные фурокумарины, в частности, псоралены и их производные, порфирины и протопорфирины, флуоресцеин, родамин, комплексы полипептидов с фотоактивными соединениями и ряд других.

Наибольшее применение в практике на сегодняшний день нашли препараты 8-метоксипсоралена, интенсивно поглощающие ультрафиолет в диапазоне от 300 до 400 нм. Терапевтический эффект достигается при любом виде подачи ультрафиолетовой радиации - как в импульсной форме, так и в виде постоянного потока излучения.

Терапевтический эффект может быть несколько повышен, если катетеризацию или пункцию лимфатической системы проводить в области нижних конечностей: поступающие в лимфатическую систему фотоаддукты в этом случае проходят значительно больший путь по лимфатическим каналам, чем в случае катетеризации верхних отделов лимфатической системы.

В предлагаемом способе индукции иммунного ответа нет необходимости в длительной и сложной инкубации моноцитов, предварительно выделенных из крови организма и антигенов, ассоциированных со структурами ПБЭ, с целью дифференциации моноцитов в АПК, способные представить указанные антигены Т-клеткам (именно эта процедура является центральной в разработках-аналогах (см. абзац 59, заявка на изобретение US №20030219420)). Процесс презентации специфичных антигенов ПБЭ Т-клеткам происходит непосредственно в самой лимфатической системе естественным образом со значительно более высокой эффективностью.

Следует иметь ввиду, что для формирования иммунного отклика организма, направленного против ассоциированных с ПБЭ антигенов, в "щадящем" для организма режиме и с целью оптимизации развития иммунного ответа целесообразно вводить суспензию обработанных ПБЭ не сразу, а постепенно в течение длительного времени - от нескольких десятков минут до одних суток и более. Длительность введения определяется дозой "аутостимула" и может изменяться в зависимости от техники исполнения метода.

Заявляемый способ прост в исполнении. На протяжении всего времени закрепления катетера в лимфатическом протоке возможно проведение процедур по любому алгоритму, назначенному врачом.

Перед введением в организм суспензии, приготовленной из опухолевых клеток, проводят тестирование того, что все опухолевые клетки обработаны в достаточной степени (например, с помощью теста РБТЛ (реакция бласттрансформации лимфоцитов)). В случае вирусов или бактерий оценивают степень их инактивации по соответствующим тестам.

Обработка ПБЭ, имеющих специфические антигенные маркеры, необходима с целью полной инактивации этих объектов, чтобы исключить возможность вторичного инфицирования организма при проведении терапии по предлагаемому методу. Вместе с тем, интенсивность воздействия должна обеспечивать сохранность определенной части специфичных антигенов, ассоциированных с ПБЭ.

Вид воздействия может не ограничиваться облучением фракций ПБЭ в присутствии того или иного фотохимического агента. Деструкции компонентов ПБЭ, несовместимые с их функциональными способностями и способностями размножаться с одновременной альтерацией их антигенных детерминант можно достичь также облучением указанных объектов ультрафиолетовым излучением без использования фотохимических агентов (см. патент СССР 1802922, А 61 М 1/36), термовоздействием (см. патент US 4787883, А 61 М 1/03), использованием химических соединений, известных биохимических методов (ферментативное разрушение биологических структур) и т.д.

При использовании для обработки фракций ПБЭ ультрафиолетового излучения (независимо от присутствия фотохимического агента) целесообразно проведение облучения в присутствии кислорода - таким образом, как это описано в патенте РФ 2069573, А 61 N 5/06 и патенте РФ 2091092, А 61 N 5/06, А 61 М 1/00.

При индукции генерализованной иммунной реакции организма в соответствии с предлагаемым методом можно обрабатывать не только антигенны, ассоциированные с ПБЭ, полученными ex vivo. Можно также проводить обработку суспензии экзогенных культур ПБЭ физическими или химическими методами с последующим введением такой суспензии в организм эндолимфатическим способом, тем самым осуществляя некую "вакцинацию" организма.

Некоторые примеры технического осуществления предлагаемого способа в серии предварительных экспериментов приведены ниже. Эксперименты проводились на особях крупного рогатого скота черно-пестрой породы в животноводческом комплексе Тосненского района Ленинградской области России.

Пример 1. Объект: бык, возраст 1.5 года.

Диагноз: обширный фибропапилломатоз (папилломы фиброзной соединительной ткани) в области препуция.

Хирургическим образом удаляли часть бородавок. Общий вес удаленной ткани составлял около 1 грамма.

Предварительно животное не получало обычного в таких случаях лечения - 3-5 внутривенных введений 1% раствора новокаина объемом 50-80 мл с интервалами между введениями 4-5 дней.

Из яремной вены животного забирали около 100 мл цельной крови, центрифугированием удаляли из нее большую часть плазмы, а оставшуюся часть форменных элементов реинфузировали животному обратно.

Далее помещали удаленную патологическую ткань в стандартный гомогенизатор и гомогенизировали ее.

К полученному образцу добавляли 10 мл аутоплазмы и 10 мл физиологического раствора. После интенсивного перемешивания образованную суспензию центрифугировали и удаляли надосадочную жидкость. Процедуру повторяли дважды.

После вторичной "отмывки" патологических клеток к ним еще раз добавляли 10 мл аутоплазмы и 10 мл. физиологического раствора. Образованную смесь облучали ультрафиолетовым излучением без какого-либо фотохимического агента, в камере, обеспечивающей наличие свободного кислорода в момент облучения (см. патент РФ 2038105, А 61 N 5/06), а источником излучения служил аппарат ОСМ-1 (производство фирмы "Люмэкс" (СПб, РФ), максимум мощности излучения приходится на длину волны 254 нм). Энергетическая освещенность на поверхности облучаемой смеси составляла 2.3 мВт/кв.см.

Обработанную суспензию вводили путем пункции пахового лимфопротока в лимфатическую систему в течение 3 часов капельным методом. Животное в процессе введения фиксировалось стандартным в ветеринарной практике методом к вертикальным стойкам загона.

Процедуру повторяли через 7 дней. Уже через 2-3 дня после проведения 1-й процедуры наблюдалось уменьшение размеров большей части папиллом и исчезновение некоторых папиллом. К 12-му дню с момента начала лечения исчезали все папилломы.

Пример 2. Объект: корова, 2.5 года и корова, 2 года.

Диагноз: вирусный лейкоз В-формы. Общий объем лейкофракции крови более, чем в 2.5 раза превышал норму.

Диагностика: серологическую диагностику проводили на основе стандартных наборов для исследования сыворотки крови в реакции иммунодиффузии (РИД) в геле агара.

Шприцем емкостью 250 мл забирали кровь из яремной вены первой коровы - донора, имеющей антигенную совместимость по крови со второй коровой. Кровь забирали три раза подряд до общего объема 750 мл. Из забранной кровь путем центрифугирования отбирали фракцию лейкоцитов.

У второй коровы из яремной вены забирали 50 мл крови, путем центрифугирования разделяли на фракции и отбирали плазму, а остальную часть вводили обратно в яремную вену.

Полученную от первой коровы суспензию лейкоцитов разводили плазмой крови второй коровы, туда же добавляли раствор промышленного препарата "Oxoralen" (8-метоксипсорален) из расчета 1 мг фотохимического агента на 1 мл полученной суспензии.

Суспензию с растворенным в ней псораленом облучали в проточном режиме в присутствии кислорода воздуха при скорости течения 1 мл/мин в режиме "туда-обратно"). Облучение проводили источником Q-139 (производства Венгрии, максимум мощности излучения приходится на длину волны 365 нм). Энергетическая освещенность на поверхности облучаемой суспензии составляла 2.5 мВт/кв.см.

Облученную суспензию вводили в паховый лимфопроток второй коровы в течение 150 минут методом "капельницы".

Процедуру повторяли каждые 5 дней.

У тестируемой второй коровы после 4 процедур наблюдалось значительное улучшение общего состояния. Показатели РИД от "положительно" и неспецифическая реакция" на первом этапе лечения в конце лечения демонстрировали значение "отрицательно", что зафиксировано в описи проводимых в животноводческом комплексе тестов ветеринарной службой комплекса.

Полученный феномен требует в дальнейшем тщательного изучения и проведения статистически значимых экспериментов, а также оптимизации процедуры с целью ее промышленного тиражирования.

Реферат

Способ относится к области иммунологии, а именно к способам воздействия на иммунную систему, и может быть использован при иммунотерапии заболеваний людей и животных, в том числе и при терапии онкологических, аутоиммунных и вирусных заболеваний. Получают из организма или из экзогенного источника патологические биологически активные элементы (ПБА-элементы), преобразуют ПБА-элементы в жидкую суспензию или обогащают биологическую жидкость организма ПБА-элементами. Обрабатывают полученную суспензию или обогащенную ПБА-элементами биологическую жидкость светом оптического диапазона или светом оптического диапазона в присутствии одного или нескольких фотохимических агентов. Вводят обработанную жидкую суспензию ПБА-элементов или обработанную биологическую жидкость, обогащенную ПБА-элементами в лимфатическую систему организма. Способ позволяет добиться выраженного генерализованного иммунного ответа. 2 н. и 14 з.п. ф-лы.

Формула