Лечение с применением перепрограммированных зрелых и дифференцированных клеток - RU2635317C2

Чертежи

Показать все 22 чертежа(ей)

Описание

Включение ссылкой

Все документы, которые цитируются или на которые ссылаются в документах, цитированных здесь, вместе с любыми инструкциями на продукт, описаниями, спецификациями продукта и технологическими картами для любого продукта, упомянутого здесь, или в любом документе, включенном ссылкой здесь, тем самым включаются здесь ссылкой, и могут использоваться на практике изобретения.

Область техники, к которой относится изобретение

Способ лечения различных болезней, нарушений или состояний у больного, путем использования перепрограммированных клеток, таких как ретродифференцированные, трансдифференцированные или передифференцированные клетки. Способ включает, получение коммитированных клеток-предшественников больного (пациента), ретродифференцирование коммитированных клеток-предшественников с получением ретродифференцированных клеток-мишеней и введение ретродифференцированных клеток больному. В определенных вариантах осуществления метод включает получение коммитированных клеток-предшественников больного, трансдифференцирование коммитированных клеток-предшественников с получением трансдифференцированных клеток-мишеней, и введение трансдифференцированных клеток-мишеней больному. Ретродифференцированные или трансдифференцированные клетки-мишени восстанавливают или обновляют ткань или клетки больного.

Уровень техники

Стволовые клетки характеризуются их способностью обновлять себя через митотическое деление клеток и дифференцироваться в разнообразные линии специализированных типов клеток. Два широких типа стволовых клеток млекопитающих являются эмбриональными стволовыми клетками, которые выделяют из внутренней клеточной массы бластоцистов, и дифференцированных стволовых клеток, которые найдены в зрелых тканях. В развивающемся эмбрионе стволовые клетки могут дифференцироваться во все специализированные эмбриональные ткани. Во взрослых организмах стволовые клетки и клетки-предшественники обновляют специализированные клетки и поддерживают нормальное обновление восстанавливающихся органов, таких как кровь, кожа или кишечные ткани.

Стволовые клетки широко распространены в развивающихся эмбрионах, хотя, количество стволовых клеток уменьшается, по мере того как развитие прогрессирует. Напротив, взрослый организм содержит ограниченное число стволовых клеток, которые ограничены определенными компартментами организма.

Терапевтическое применение стволовых клеток имеет потенциал изменять лечение многих болезней или нарушений. В то время как некоторые способы лечения зрелыми стволовыми клетками, такие как трансплантаты костного мозга, уже существуют, медицинские исследователи ожидают использования стволовых клеток, чтобы лечить более широкое разнообразие болезней, включая рак, болезнь Паркинсона, повреждения спинного мозга, амиотрофический боковой склероз, рассеянный склероз, и повреждение мышц, среди прочих заболеваний. Такие методы лечения могут использовать в своих интересах способность стволовых клеток к дифференциации в типы клеток, которые необходимы, чтобы лечить болезнь.

Однако есть неопределенность относительно успеха в лечении таких болезней, используя исходные клетки, а также того, что касается легкости получения стволовых клеток. Например, гематопоэтические стволовые клетки традиционно извлекают из костного мозга, периферической крови, мобилизующей фактор роста или пуповинной крови (плацента). Гематопоэтические стволовые клетки могут также быть получены из эмбриональных стволовых клеток, которые извлечены из эмбрионов, полученных с использованием методики оплодотворения in vitro. Однако извлечение из этих источников является тяжелым и иногда опасным, и может быть оспорено возникающими этическими проблемами. Далее, число стволовых клеток, которые могут быть получены из этих источников, ограничено. Кроме того, стволовые клетки могут испытывать трудности при дифференциации в клетки, необходимые для лечения болезни.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к использованию перепрограммированных клеток для восстановления или обновления ткани или клеток больного. Например, настоящее изобретение относится к использованию ретродифференциации дифференцированных или коммитированных клеток-предшественников для восстановления ткани или обновления ткани или клеток больного. Настоящее изобретение также относится к использованию трансдифференцированных клеток, полученных трансдифференциацией дифференцированных коммитированных клеток-предшественников, чтобы восстанавливать ткань или обновлять ткань или клетки больного.

Применение базируется, частично, на открытии заявителя, что коммитированные клетки-предшественники или соматические клетки, полученные от больного, могут быть перепрограммированы с получением клеток различных линий, и эти перепрограммированные клетки могут быть введены больному, чтобы восстанавливать или обновлять ткани или клетки. Примеры процесса перепрограммирования включают ретродифференциацию и трансдифференциацию.

Следовательно, заявители обнаружили, что коммитированные клетки-предшественники могут подвергаться перепрограммированию с получением различных клеточных линий. Например, коммитированные клетки-предшественники могут подвергаться ретродифференциации с получением ретродифференцированных клеток, например, клеток, которые менее дифференцированы, таких как плюрипотенциальные (плюрипотентные) стволовые клетки, и что эти ретродифференцированные клетки могут быть введены больному, чтобы восстанавливать или обновлять ткани или клетки. Другой пример, коммитированные клетки-предшественники, полученные от больного, могут подвергаться трансдифференциации с получением трансдифференцированных клеток, например, клеток других клеточных линий, чем коммитированные клетки-предшественники, и что эти трансдифференцированные клетки могут быть введены больному, чтобы восстанавливать или обновлять ткани или клетки.

Изобретение охватывает метод восстановления или обновления ткани или клеток клеточных линий в больном введением перепрограммированных клеток больному. В частности, изобретение охватывает метод восстановления или обновления ткани или клеток клеточных линий больному, включающий (i) получение коммитированных клеток-предшественников, (ii) ретродифференциацию коммитированных клеток-предшественников с получением ретродифференцированных клеток- мишеней и (iii) введение ретродифференцированных клеток-мишеней больному, в котором ретродифференцированные клетки-мишени повторно передифференцируются в клетки клеточных линий. Эти передифференцированные клетки могут быть той же самой клеточной линии или отличной клеточной линии, такой как коммитированные клетки-предшественники.

Изобретение также охватывает метод восстановления или обновления ткани или клеток клеточной линии больного, включающий (i) получение коммитированных клеток-предшественников, (ii) трансдифференциацию коммитированных клеток-предшественников, чтобы получить трансдифференцированных клетки-мишени, и (iii) введение трансдифференцированных клеток-мишеней больному.

В некоторых вариантах осуществления больной может страдать от болезни, нарушения или состояния, включая, но не ограничиваясь ими, расстройство костного мозга, гематологические состояния, апластическую анемию, бета-талассемию, диабеты, болезнь мотонейрона, болезнь Паркинсона, повреждение спинного мозга, мышечную дистрофию, почечную болезнь, рассеянный склероз, застойную сердечную недостаточность, вирус гепатита С, вирус иммунодефицита человека, травму головы, повреждения спинного мозга, болезнь легкого, депрессию, необструктивную азооспермию, андропаузу, менопаузу и бесплодие, омолаживание, язву склеродермы, псориаз, морщины, цирроз печени, аутоиммунную болезнь, облысение, пигментозный ретинит, кристаллическую дистрофию/слепоту, диабет и бесплодие. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления перепрограммированные клетки могут быть клетками костного мозга, которые лечат апластическую анемию, лейкемию, лимфому или вирус иммунодефицита человека больного.

В некоторых вариантах осуществления перепрограммированные клетки-мишени, такие как ретродифференцированные клетки, трансдифференцированные клетки-мишени или передифференцированные клетки, могут включать, но не ограничиваются ими, плюрипотенциальные стволовые клетки, плюрипотенциальные зародышевые клетки, гематопоэтические стволовые клетки, нейронные стволовые клетки, эпителиальные стволовые клетки, мезенхимные стволовые клетки, стволовые клетки эндодермы и нейроэктодермы, зародышевые клетки, экстраэмбриональные, эмбриональные стволовые клетки, почечные клетки, клетки альвеолярного эпителия, клетки эндодермы, нейроны, эктодермные клетки, островковые клетки, ацинарные клетки, овоциты, сперма, гематопоэтические клетки, гепатоциты, кожа/кератиноциты, меланоциты, кость/остеоциты, волосы/клетки сосочков дермы, хрящ/хондроциты, жировые клетки/адипоциты, скелетные мышечные клетки, клетки эндотелия, сердечная мышца/кардиомиоциты и тропобласты.

В определенных вариантах осуществления коммитированные клетки-предшественники получают из крови или близких тканей, включая костный мозг. Коммитированные клетки- предшественники могут быть получены из цельной крови, и/или могут быть получены через аферезис. Кровь может быть мобилизованной или немобилизованной кровью. Такие коммитированные клетки-предшественники включают, но не ограничиваются ими, Т-клетки, В-клетки, ацидофильные гранулоциты, базофилы, нейтрофилы, мегакариоциты, моноциты, эритроциты, гранулоциты, мастоциты, лимфоциты, лейкоциты, тромбоциты и красные клетки крови. Альтернативно, коммитированные клетки- предшественники могут быть получены из нейронной ткани центральной нервной системы или периферийной нервной системы, мышечной ткани или эпидермиса и/или дермы кожи.

В определенных вариантах осуществления коммитированные клетки-предшественники получают из крови или ткани больного. В некоторых вариантах осуществления больной, от которого получают коммитированные клетки-предшественники, и которому вводят перепрограммированные клетки-мишени, такие как ретродифференцированные клетки-мишени или трансдифференцированные клетки-мишени, является тем же самым больным.

В некоторых вариантах осуществления коммитированные клетки-предшественники ретродифференцируют контактированием коммитированных клеток-предшественников со средством. Например, коммитированные клетки- предшественники могут быть культивированы со средством (с агентом). В определенных вариантах осуществления средство сцепляется с рецептором, который является посредником захвата, узнавания или представления антигена на поверхности коммитированных клеток. Рецептор может быть антигеном МНС класса I или антигеном МНС класса II. В некоторых вариантах осуществления, антигеном класса I является рецептор HLA-A, рецептор HLA-B, рецептор HLA-C, рецептор HLA-E, рецептор HLA-F или рецептор HLA-G, а указанным антигеном класса II является рецептор HLA-DM, рецептор HLA-DP, рецептор HLA-DQ или рецептор HLA-DR.

В определенных вариантах осуществления средство может быть антителом к рецептору, таким как моноклональное антитело к рецептору. В некоторых вариантах осуществления антителом является моноклональное антитело CR3/43 или моноклональное антитело TAL 1В5. В дальнейших вариантах осуществления средство модулирует экспрессию гена МНС, такую как экспрессия МНС класса I⁺ и/или МНС класса II⁺

В некоторых вариантах осуществления ретродифференцированные клетки могут подвергаться передифференцированию в отдельной стадии. Например, ретродифференцированные клетки могут быть передифференцированы контактированием ретродифференцированных клеток с факторами роста, включающими, но не ограничивающимися ими, основной фактор роста фибробласта, эпидермальный фактор роста, колониестимулирующий фактор макрофага гранулоцита, фактор стволовых клеток, интерлейкины-1, -3, -6 и -7, основной фактор роста фибробласта, эпидермальный фактор роста, колониестимулирующий фактор макрофага гранулоцита, колониестимулирующий фактор гранулоцита, эритропоэтин, фактор стволовых клеток, и морфогенетические белки кости. Образующиеся передифференцированные клетки- мишени затем могут быть введены больному.

В вариантах осуществления изобретения коммитированные клетки-предшественники могут быть трансдифференцированы культивированием коммитированных клеток-предшественников в специфических условиях культивирования. Например, коммитированные клетки могут быть культивированы в специфических типах культуральных сред в соединении со средствами ретродифференцирования. Примеры этих культуральных сред могут включать среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM), или среду IMDM и другие. Культуральные среды ткани могут также включать средство, промотирующее дифференцирование, такое как витамин и/или минеральные добавки, гидрокортизон, дексаметазон, бета-меркаптоэтанол и т.д. Кроме того, дополнительные условия культивирования включают хелатирующие агенты или антибиотики, культивирование при определенных температурах или уровнях диоксида углерода или кислорода, и культивирование в определенных сосудах. Условия культивирования могут определять тип возникающих трансдифференцированных клеток-мишеней.

Одним аспектом изобретения является, таким образом, способ получения клеток-мишеней. Способ может включать, получение коммитированных клеток-предшественников и затем перепрограммирование коммитированных клеток. Эти способы описаны в этой заявке. В некоторых вариантах осуществления способ может включать ретродифференциацию коммитированных клеток. В других вариантах осуществления способ может включать трансдифференциацию коммитированных клеток. В других вариантах осуществления способ может включать ретродифференциацию коммитированных клеток, и затем передифференциацию ретродифференцированных клеток.

Другим аспектом изобретения является использование одних или больше перепрограммированных клеток-мишеней для получения лекарственного средства для восстановления или обновления ткани или клеток клеточных линий больного, или для лечения болезни или повреждения ткани.

Еще, другим аспектом изобретения является способ лечения болезни или повреждения ткани больного, нуждающегося в этом. В определенных вариантах осуществления способ включает получение коммитированных клеток-предшественников, перепрограммирование коммитированных клеток, чтобы получить перепрограммированные клетки-мишени, и введение перепрограммированных клеток-мишеней больному. В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени могут быть перепрограммированы через ретродифференцирование, трансдифференцирование и/или передифференцирование. В определенных вариантах осуществления клетками-мишенями являются ретродифференцированные клетки-мишени, трансдифференцированные клетки-мишени и/или передифференцированные клетки-мишени. Способы получения коммитированных клеток- предшественников и перепрограммирование коммитированных клеток являются такими, как описаны в этой заявке.

В некоторых вариантах осуществления перепрограммированные клетки-мишени, такие как ретродифференцированные клетки-мишени, трансдифференцированные клетки-мишени или передифференцированные клетки-мишени могут быть введены путем инъекции, имплантации или инфузии. Эти клетки могут быть введены парентеральной, внутримышечной, внутривенной, подкожной, внутриглазной, пероральной, трансдермальной инъекцией, или инъекцией в спинную жидкость. В определенных вариантах осуществления ретродифференцированные клетки- мишени или трансдифференцированные клетки-мишени вводят в фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция может включать ретродифференцированные клетки-мишени или трансдифференцированные клетки-мишени и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый эксципиент.

Одним аспектом изобретения является фармацевтическая композиция для введения перепрограммированных клеток-мишеней, таких как ретродифференцированные клетки-мишени или трансдифференцированные клетки-мишени. Фармацевтическая композиция может включать один или больше типов клеток-мишеней и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель. Необязательно, фармацевтическая композиция может включать вспомогательные средства и/или другие эксципиенты, пригодные для введения больному.

Другим вариантом изобретения является способ получения фармацевтической композиции или лекарственного средства, включающий (i) получение коммитированных клеток-предшественников, (И) перепрограммирование коммитированных клеток, чтобы получать перепрограммированные клетки-мишени, и (in) необязательно, комбинирование перепрограммированных клеток-мишеней с одним или больше фармацевтическим эксципиентом. В некоторых вариантах осуществления перепрограммированные клетки-мишени комбинируют с одним или больше фармацевтическими эксципиентами. В других вариантах осуществления перепрограммированные клетки-мишени не комбинируют с одним или больше фармацевтическими эксципиентами. Способы получения коммитированных клеток- предшественников и перепрограммирования коммитированных клеток описаны в этой заявке.

Необходимо иметь в виду, что в этом описании и, особенно, в формуле изобретения термины, такие как "содержит", "содержащий" и т.д., могут иметь значение, приписанное им в американском Патентном праве; например, они могут подразумевать, "включает", "включающей", и т.д.; и что термины, такие как "состоящий по существу из" и "состоит по существу из" имеют значение, приписанное им в американском Патентном праве, например, что они учитывают элементы, не явно описанные, но исключают элементы, которые найдены в предшествующем уровне техники, или которые воздействуют на основную или новую характеристику изобретения.

Эти и другие варианты осуществления раскрыты или очевидны и охвачены следующим подробным описанием.

Краткое описание чертежей

Следующее подробное описание приведено как пример, но не предназначено ограничивать изобретение исключительно конкретными описанными вариантами осуществления, и может лучше всего быть понято в сочетании с сопутствующим чертежом, в котором:

фиг.1 показывает иммунофенотипирование аферезованных одноядерных клеток до (верхняя панель) и после (нижняя панель) начала перепрограммирования. Клетки маркировали моноклональными антителами, сопряженными с R-фикоэритрином (RPE) Cy-5 или фикоэритринами (РЕ) (вертикальные обозначения) для изотипного контроля иммуноглобулина Gl (IgGI) и CD34 или CD 19, соответственно. Клетки были также окрашены для изотипных контролей CD45, CD38, CD61 и IgGI моноклональных антител, сопряженных с изотиоцианатом флуоресцеина (FITC) (горизонтальные обозначения). Нижняя панель показывает увеличение гематопоэтических стволовых клеток, как показано увеличением относительного числа CD34 и CD34CD38-ioieTOK, сопровождаемым уменьшением зрелых маркеров лейкоцитов, таких как CD45 и CD 19;

фиг.2А показывает последовательное иммунофенотипирование образцов периферической крови больного с серьезной апластической анемией, за которым следует инфузия аутологических HRSC (после день 1, день 2, день 3, день 6, и день 14). Клетки маркировали моноклональными антителами против CD34 и CD45 (2^-ая горизонтальная панель), и CD34 и CD38 (3^-ья горизонтальная панель). Верхняя горизонтальная панель показывает, что переднее и боковое рассеяние является цитометрией потока, мазком костного мозга, и сечением tehphin аутологических HRSC. День 1 - день 14 показывают увеличение клеток, имеющих большое переднее и боковое рассеяние, которое указывает на гранулоциты, и день 1 - день 3 показывают увеличение относительного числа циркулирующих CD34 гематопоэтических стволовых клеток. Фиг.2b показывает последовательное иммунофенотипирование образцов периферической крови больного тяжелой формой апластической анемии, за которым следует инфузия аутологических перепрограммированных стволовых клеток человека (HRSC) (после день 1, день 2, день 3, день 6 и день 14). Клетки маркировали моноклональными антителами против CD34 и CD61 (1^-ая горизонтальная панель), CD19 и CD3 (2^-ая панель), и CD33&13 и CD7 (3^-ья горизонтальная панель). График FACScan показывает увеличение числа миелоидных клеток, как показано постепенным увеличением клеток, экспрессирующих CD33&, включая клетки-предшественники, которое показано постепенным увеличением относительного числа клеток, со-экспрессирующих CD33&13 с CD7. Кроме того, имелось постепенное увеличение относительного числа лимфоцитов, как показано увеличением относительного числа лимфоцитов CD19 и CD3;

фиг.3 показывает анализ костного мозга больного тяжелой апластической анемией до и после инфузии аутологических HRSC. Мазок костного мозга до и после терапии (а и b) показывает увеличение красных кровяных клеток; сечение terphine до и после терапии (с и d) показывает увеличение насыщенности клетками костного мозга; клоновый анализ костного мозга, за которым следует инфузия HRSC, показывает увеличенный рост колониеобразующей единицы мегакариоцита (е); колониеобразующих моноцитов (f); колониеобразующих гранулоцитов-макрофагов (g); и колониеобразующих миелоцитов-эритроидов (h); и взрывообразующих эритроидов (i);

фиг.4 показывает кариотипирование и G-диапазон образца периферической крови больного тяжелой апластической анемией, за которыми следует 4 года инфузии аутологических HRSC, показывающие отсутствие генетических аномалий;

фиг.5 показывает увеличение абсолютных средних уровней фетального гемоглобина у больных талассемией с последующим лечением аутологическими перепрограммированными клетками;

фиг.6 показывает увеличение среднего показателя гематокрита, который представляет собой средний размер красных кровяных клеток (эритроцитов), представленный в фемтолитрах, у больных талассемией с последующим лечением аутологическими перепрограммированными клетками;

фиг.7 показывает увеличение среднеклеточного гемоглобина, который представляет собой вес гемоглобина на клетку, представленный в пикограммах, у больных талассемией после лечения аутологическими перепрограммированными клетками;

фиг.8 показывает уменьшение уровня сывороточного ферритина, представленного в нанограммах на миллилитр, у больных талассемией после лечения аутологическими перепрограммированными клетками;

фиг.9 показывает увеличение уровней С-пептида натощак и после усвоения смешанной мучной пищи у больных диабетом после лечения аутологическими перепрограммированными клетками;

фиг.10 показывает уменьшение уровней гликозилированного гемоглобина (HbA1C) у больных диабетом после лечения аутологическими перепрограммированными клетками;

фиг.11 показывает уменьшение уровней креатинфосфокиназы (СРК) и лактатдегидрогеназы (LDH) у больных мышечной дистрофией после лечения аутологическими перепрограммированными клетками;

фиг.12 показывает уменьшение уровней ферментов печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST), у больных. мышечной дистрофией после лечения аутологическими перепрограммированными клетками;

фиг.13 показывает уменьшение уровней микроальбумин-мочевины у 12 больных с болезнью почек после лечения аутологическими перепрограммированными клетками;

фиг.14 показывает уменьшение уровней гликозилированного гемоглобина (HbA1C) у 12 больных с болезнью почек вследствие диабета после лечения аутологическими перепрограммированными клетками;

фиг.15 а показывает сканограммы изображений магнитного резонанса (MRI) мозга больного рассеянным склерозом до (левая сканограмма) и спустя три месяца после (правая сканограмма) лечения аутологическими перепрограммированными клетками, и демонстрирует уменьшение усиления состояния повреждения после терапии стволовыми клетками;

фиг.15b показывает сканограммы MRI различных участков мозга больного до (левая сканограмма) и спустя три месяца после (правая сканограмма) лечения аутологическими перепрограммированными клетками. На сканограммах, изображающих состояние до обработки, стрелки указывают повреждение в мозге, в то время как в сканограммах, сделанных после обработки, стрелки показывают улучшение состояния повреждений;

фиг.16а показывает сканограмму изображений магнитного резонанса (MRI) мозга больного рассеянным склерозом до (верхние сканограммы) и спустя шесть месяцев после (нижние сканограммы) лечения аутологическими перепрограммированными клетками. Фиг.16b показывает дополнительные сканограммы MRI мозга больного до (верхние сканограммы) и спустя шесть месяцев после (нижние сканограммы) лечения аутологическими перепрограммированными клетками. В сканограммах, показывающих состояние до лечения, стрелки указывают повреждение в мозге, в то время как в сканограммах, показывающих состояние после лечения, стрелки указывают на улучшение состояния повреждения со снижением атрофии мозга, как показано уменьшением желудочка и расширением извилин;

фиг.17а показывает сканограммы изображений сагиттального магнитного резонанса больного рассеянным склерозом до (левая сканограмма) и спустя шесть месяцев после (правая сканограмма) лечения аутологическими перепрограммированными клетками. Фиг.17b показывает поперечные MRI сканограммы спинного мозга больного до (левая сканограмма) и спустя шесть месяцев после (правая сканограмма) лечения аутологическими перепрограммированными клетками. В сканограммах, показывающих состояние до лечения, стрелки указывают повреждение спинного мозга, в то время как в сканограммах, показывающих состояние после лечения, стрелки указывают на улучшение повреждения;

фиг.18а показывает уменьшение уровней фермента печени аланинаминотрансферазы (ALT), а фиг.18b показывает уменьшение уровней аспартаттрансферазы (AST) у больных, зараженных гепатитом С с последующим лечением аутологическими перепрограммированными клетками;

фиг.19а показывает сканограммы изображений магнитного резонанса (MRI) мозга больного с травмой головы вследствие автомобильной аварии. До лечения (верхние сканограммы), желудочки показывают расширение и смещение с широкой, острой гематомой. После лечения аутологическими перепрограммированными клетками (нижние сканограммы) желудочки показывают уменьшение параметров атрофии мозга, такое как уменьшение желудочка и расширение извилин с улучшением состояния гематомы. Фиг.19b показывает дополнительные сканограммы MRI мозга больного до (верхние сканограммы) и после (нижние сканограммы) лечения;

фиг.20 показывает рентгеновский снимок больного болезнью легких до (левый снимок) и после (правый снимок) лечения аутологическими перепрограммированными клетками. После лечения больной показывает улучшение объема легкого и уменьшение размера повреждения, как показывает уменьшение областей гипо-плотности;

фиг.21 показывает уровни полового гормона - фолликулостимулирующего гормона (fsh), лютеинизирующего гормона (1h), прогестерона (pro) и тестостерона (test) у больных с закупоривающей азооспермией, подвергнутых лечению аутологическими перепрограммированными клетками. Уровни показывают значительное увеличение свободного тестостерона параллельно с увеличением размера яичка (данные не показаны), определенные ультразвуком;

фиг.22 показывает чувствительность сетчатки и потерю зрения у больного, страдающего от ослабленного зрения до (верхняя панель) и после (нижняя панель) лечения аутологическими перепрограммированными клетками.

Из данных по чувствительности сетчатки следует, что оранжевая область указывает на пониженную чувствительность сетчатки. Из данных по ухудшению зрения следует, что белые области указывают на нормальное зрение, а розовая, оранжевая и черная области указывают на повышенную потерю зрения. После лечения больной испытал улучшение своего поля зрения, так как оранжевые области в результатах по чувствительности сетчатки до лечения становились зелеными и белыми после лечения, а черные области при потере зрения до лечения становились белыми после лечения.

Осуществление изобретения

Определения

Как используется здесь, "коммитированные клетки-предшественники" являются клетками, которые показывают дифференцированный характер. Эти клетки часто считают зрелыми и специализированными. Примеры включают белые клетки крови, красные клетки крови, клетки эпителия, нейроны и хондроциты.

Как используется здесь, "некоммитированные клетки" являются клетками, которые не показывают зрелый дифференцированный характер. Эти клетки часто считают незрелыми и неспециализированными. Примером некоммитированной клетки-предшественника является стволовая клетка, которая является незрелой клеткой, которая способна к самообновлению (деление без предела) и дифференциации (специализация). Как используется здесь, "перепрограммирование" относится к процессу, в котором коммитированная клетка первой линии дифференцировки изменяется в клетку другого клеточного типа. Этот другой тип клетки может иметь другую линию клеточной дифференцировки. Перепрограммирование может происходить через такие процессы как ретродифференцирование, трансдифференцирование, передифференцирование.

Как используется здесь, "перепрограммированная клетка" является клеткой, которая является коммитированной клеткой, подвергшейся перепрограммированию. Перепрограммированная клетка может включать ретродифференцированную клетку, трансдифференцированную клетку и/или передифференцированную клетку.

Как используется здесь, "ретродифференцирование" является процессом, которым коммитированная клетка, то есть, зрелая, специализированная клетка, реверсирует назад, к более примитивной стадии клеток. "Ретродифференцированная клетка" является клеткой, которая происходит из ретродифференцирования коммитированной клетки.

Как используется здесь, "трансдифференцирование" является процессом, в котором коммитированная клетка первой линии дифференцировки изменяется в другую клетку другого клеточного типа. В некоторых вариантах осуществления трансдифференцирование может быть комбинацией ретродифференцирования и передифференцирования. "Трансдифференцированная клетка" является клеткой, которая происходит из трансдифференцирования коммитированной клетки. Например, коммитированная клетка, такая как клетка цельной крови может быть трансдифференцирована в нейрон.

Как используется здесь, "передифференцирование" относится к процессу, в котором некоммитированная клетка или ретродифференцированная клетка дифференцируется в более зрелую, специализированную клетку. "Передифференцированная клетка" относится к клетке, которая происходит из передифференцирования некоммитированной клетки или ретродифференцированной клетки. Если передифференцированную клетку получают в результате передифференцирования ретродифференцированной клетки, передифференцированная клетка может иметь ту же самую или другую линию дифференцировки как коммитированная клетка, которая подверглась ретродифференцированию. Например, коммитированная клетка, такая как белая клетка крови, может быть ретродифференцирована с получением ретродифференцированной клетки, такой как плюрипотенциальная стволовая клетка, а затем ретродифференцированная клетка может быть передифференцирована с получением лимфоцита той же самой клеточной линии, что и белая клетка крови (коммитированная клетка), или передифференцирована с получением нейрона, который имеет другую линию дифференцировки, чем белая клетка крови (коммитированная клетка).

Как используется здесь, "клетка-мишень" является клеткой, которую получают для введения больному, чтобы восстанавливать или обновлять ткань или клетки. Например, клетка-мишень может быть перепрограммированной клеткой-мишенью, такой как ретродифференцированная клетка-мишень или Трансдифференцированная клетка-мишень, тем самым ретродифференцированные или трансдифференцированные клетки-мишени вводят больному.

Коммитированные клетки

Как описано выше, коммитированные клетки по изобретению являются клетками, которые показывают дифференцированный характер. Коммитированная клетка может включать любые компоненты, которые касаются индикации антигена, захвата или узнавания. Например, коммитированная клетка может быть клеткой МНС класса I⁺ и/или МНС класса II⁺.

Коммитированная клетка может также быть любой клеткой, полученной или получаемой из недифференцированной клетки. Таким образом, в одном варианте осуществления, некоммитированная клетка является также недифференцированной клеткой. В качестве примера, следовательно, коммитированная клетка может быть лимфоидной стволовой клеткой или миелоидной стволовой клеткой, которую дифференцируют относительно плюрипотенциальной стволовой клетки. Коммитированные клетки могут быть получены из биологического материала, такого как кровь или близкие ткани, включая костный мозг или пуповинную кровь, нейронную ткань из центральной нервной системы или периферийной нервной системы, мышечную ткань, или эпидермис и/или ткань кожи (то есть, соскоб из ротовой полости, например). Биологический материал может иметь послеродовое происхождение.

Биологический материал может быть получен, используя способы, известные в технологии, которые соответствуют типу ткани. Примеры включают, но не ограничиваются ими, вырезание, изъятие иглой, мазок и аферезис.

В определенных вариантах осуществления коммитированные клетки получают из цельной крови или переработанных продуктов крови, таких как плазма или светлый слой кровяного сгустка, так как их удаление из субъектов может быть выполнено при минимальном медицинском наблюдении. Образцы крови обычно обрабатывают антикоагулянтами, такими как гепарин или цитрат. Клетки биологического образца могут быть обработаны, чтобы обогатить определенные типы клеток, удалить определенные типы клеток или отделить клетки от массы ткани. Полезные способы очищения и отделения клеток включают центрифугирование (такое как центрифугирование с градиентом плотности), цитометрия потока и аффинная хроматография (такая как использование магнитных гранул, включающих моноклональные антитела к маркерам поверхности клеток или пэннинг) (см. Vettese-Dadey, The Scientist 1999, 13:21). Например, разделение в градиенте фиколл-гипак полезно для удаления эритроцитов и гранулоцитов, чтобы оставить одноядерные клетки, такие как лимфоциты и моноциты.

Примеры коммитированных клеток, которые могут быть получены из крови, включают, но не ограничиваются ими, клетки CFC-T, клетки CFC-B, клетки CFC-Эозин, клетки CFC-Bas, клетки CFC-Bas, клетки CFC-GM, CFC-M, клетки CFC-MEG, клетки BFC-E, клетки CFC-E, Т-клетки, В-клетки, эозинофилы, гранулоциты, базофилы, нейтрофилы, моноциты, мегакариоциты и эритроциты.

Полученные коммитированные клетки крови могут быть идентифицированы по экспрессии определенных антигенов. Например, В клетками являются клетки CD 19⁺, CD²¹, CD22⁺ и DR⁺. Т-клетками являются клетки CD2⁺, CD3⁺, и либо CD4⁺, либо CD8⁺. Незрелыми лимфоцитами являются клетки CD4⁺ и CD8⁺ Активированными Т-клетками являются клетки DR⁺. Природными клетками-киллерами (NK) являются клетки CD56⁺ и CD16⁺. Т-лимфоцитами являются клетки CD7⁺. Лейкоцитами являются клетки CD45⁺. Гранулоцитами являются клетки CD13⁺ и СО33⁺. Клетками макрофага моноцита являются клетки CD14⁺ и DR⁺.

В определенных вариантах осуществления коммитированная клетка может быть В-лимфоцитом (активированным или неактивированным), Т-лимфоцитом (активированным или неактивированным), клеткой из клеточной линии моноцита макрофага, ядросодержащей клеткой, способной экспрессировать антигены класса I или класса II, клеткой, которая может быть стимулирована экспрессировать антигены класса I или класса II или энуклеированной клеткой (то есть, клеткой, которая не содержит ядро, такой как красная кровяная клетка).

В альтернативных вариантах осуществления коммитированная клетка может быть выбрана из любой группы клеток, включающей большие гранулярные лимфоциты, нуль-лимфоциты и природные клетки-киллеры, каждая экспрессирующая поверхностные рецепторы клеток CD56 и/или CD16.

Так как коммитированные клетки являются по существу первичными культурами, может быть необходимо дополнить популяции клеток соответствующими питательными веществами, чтобы поддержать жизнеспособность. Соответствующие условия культивирования известны специалисту в технологии. Тем не менее, обработку популяции клеток предпочтительно инициируют как можно скорее после удаления биологических образцов от больных, обычно в течение 12 часов, предпочтительно в течение 2-4 часов. Жизнеспособность клетки может быть проверена, используя известные методики, такие как исключение трипанового синего или пропидийиодид.

Ретродифференцированные клетки

Ретродифференцирование является типом способа перепрограммирования, посредством которого структуры и функции клеток прогрессивно изменяются, чтобы дать начало менее специализированным клеткам.

Ретродифференцирование может происходить естественно, причем клетки могут подвергаться ограниченному обратному дифференцированию in vivo в ответ на повреждение ткани. Альтернативно, Ретродифференцирование может быть вызвано, используя способы, описанные в заявке US 08/594,164, сейчас патент US 6090625; заявка US 09/742,520, сейчас патент US 7112440; заявка US 10/140,978, сейчас патент US 7220412; заявка US 10/150,789, сейчас патент US 7410773; и заявка US No. 09/853,188, которые все включены здесь ссылкой.

Ретродифференцированные клетки по изобретению могут включать, но не ограничиваться ими, плюрипотенциальные стволовые клетки, лимфоидные стволовые клетки, миелоидные стволовые клетки, невральные стволовые клетки, сателлитные клетки скелетной мышцы, эпителиальные стволовые клетки, эндодермальные стволовые клетки, мезенхимные стволовые клетки и эмбриональные стволовые клетки.

В определенных вариантах осуществления коммитированные клетки получают из крови и ретродифференцируют с получением ретродифференцированных клеток гематопоэтической клеточной линии.

Примеры этих ретродифференцированных клеток включают, но не ограничиваются ими, плюрипотенциальные стволовые клетки, лимфоидные стволовые клетки и миелоидные стволовые клетки.

Коммитированные клетки могут быть ретродифференцированы контактированием клеток со средством, которое реально соприкасается с клетками. Клетки затем культивируют, чтобы позволить этим клеткам, которые реально соприкасались со средством, развиваться через процесс ретродифференциации и, в конечном счете, становиться недифференцированными.

Стадия контактирования может включить средство зацепления с поверхностными антигенами на коммитированных клетках. Средство может действовать в прямом зацеплении или в косвенном зацеплении с коммитированной клеткой. Примером прямого зацепления является то, что коммитированная клетка имеет, по меньшей мере, один поверхностный рецептор клетки на ее поверхности, такой как β-цепь, имеющая гомологические области (области, которые обычно имеют ту же самую или подобную последовательность), такую как последовательности, которые могут быть найдены на В-клетках, и в котором средство прямо зацепляет поверхностный рецептор клетки. Другим примером является то, что коммитированная клетка имеет поверхностный рецептор клетки на ее клеточной поверхности, такой как α-цепь, имеющая гомологические области, такие как области, которые могут быть найдены на Т-клетках, и в котором средство прямо зацепляет поверхностный рецептор клетки.

Примером непрямого зацепления является то, что коммитированная клетка имеет, по меньшей мере, два поверхностных рецептора клетки на ее клеточной поверхности и зацепление средства с одним из рецепторов влияет на другой рецептор, который затем вызывает ретродифференцирование коммитированной клетки.

Средство для ретродифференцирования коммитированной клетки может быть химическим соединением или композицией. Например, средство может быть способно к зацеплению поверхностного рецептора клетки на поверхности коммитированной клетки. В определенных вариантах осуществления средство реально зацепляет рецептор, присутствующий на поверхности коммитированной клетки - этот рецептор может быть экспрессирован коммитированной клеткой.

Например, средства могут включать, но не ограничиваться ими, любой один или больше циклический аденозинмонофосфат (сАМР), молекулу CD4, молекулу CD8, часть или весь рецептор Т-клетки, лиганд (закрепленный или свободный), пептид, рецептор Т-клетки (TCR), антитело, перекрестно-реагирующее антитело, моноклональное антитело или поликлональное антитело. Факторы роста могут также использоваться, такие как гематопоэтические факторы роста, например, эритропоэтин и гранулоцит-моноцит колониестимулирующий фактор (GM-CSF).

Если средством является антитело, перекрестно-реагирующее антитело, моноклональное антитело или поликлональное антитело, то средство может быть одним или больше из средств, таких как антитело, перекрестно-реагирующим антитело, моноклональное антитело или поликлональное антитело к любому одному или больше из: бета-цепи антигена MHC класса II, бета-цепи антигена МНС HLA-DR, α-цепи антигена МНС класса I или класса II, α-цепи антигена HLA-DR, α- и β-цепи антигена МНС класса II или антигена МНС класса I. Примером антитела является CR3/43 (поставляется Дэко (Dako)).

Термин "антитело" может включать различные фрагменты (получены ли они протеолитическим расщеплением или рекомбинантной технологией) и производные, которые сохраняют связывающую активность, такие как антитела Fab, F(ab’)₂ и scFv, a также их миметики или биоизостеры. Также включенными в качестве антител являются генно-инженерные варианты, где некоторые из последовательностей аминокислот были изменены, например, заменой аминокислотных остатков, чтобы усилить связывание, или, где антитела были получены в различных видах для организма, клетки которых являются желательными, чтобы лечить согласно методам по изобретению, чтобы уменьшить возможность неблагоприятных иммунных реакций (примером этого являются гуманизированные мышиные моноклональные антитела).

Средства, используемые, чтобы вызвать преобразование коммитированной клетки в ретродифференцированную клетку предпочтительно могут действовать внеклеточно по отношению к коммитированной клетке. Например, коммитированная клетка может включать рецептор, который реально зацепляется средством, и средство реально зацепляет рецептор.

Например, рецептор может быть поверхностным рецептором клетки. Конкретные примеры поверхностных рецепторов клетки включают, но не ограничиваются ими, рецепторы МНС класса I и МНС класса II. Рецептор может включать α-компонент и/или β-компонент, как имеет место для рецепторов МНС класса I и МНС класса II.

Рецептор может включать β-цепь, имеющую гомологические области, например, по меньшей мере, гомологические области к β-цепи HLA-DR.

Альтернативно, или кроме того, рецептор может включать α-цепь, имеющую гомологичные области, например, по меньшей мере, гомологичные области к α-цепи HLA-DR. Рецептор может быть антигеном класса I или класса II главного комплекса тканевой совместимости (МНС). В определенных вариантах осуществления поверхностный рецептор клетки может включать, но не ограничиваться ими, рецептор HLA-DR, рецептор DM, рецептор DP, рецептор DQ, рецептор HLA-A, рецептор HLA-B, рецептор HLA-C, рецептор HLA-E, рецептор HLA-F, или рецептор HLA-G. В некоторых вариантах осуществления поверхностный рецептор клетки может быть рецептором HLA-DR.

Средство может быть антителом к рецептору, таким как моноклональное антитело к рецептору.

Примером средства может быть средство, которое модулирует экспрессию гена МНС, такую как экспрессия МНС класса I⁺ и/или МНС класса II⁺.

В определенных вариантах осуществления средство может использоваться в соединении с модификатором биологической реакции. Примеры модификаторов биологической реакции включают, но не ограничиваются ими, алкилирующее средство, иммуномодулятор, фактор роста, цитокин, поверхностный рецептор клетки, гормон, нуклеиновую кислоту, последовательность нуклеотидов, антиген или пептид. Например, алкилирующее средство может быть или может включать циклофосфоамид.

Другие модификаторы биологической реакции могут включать соединения, способные к повышающей регуляции экспрессии антигена МНС класса I и/или класса II, которая, в некоторых вариантах осуществления, может позволить средству, которое связывается с рецептором МНС, работать более эффективно.

Поскольку любой тип клетки может быть получен, чтобы экспрессировать антигены МНС класса I и/или класса II, то это может обеспечить метод ретродифференцирования большого разнообразия типов клеток, экспрессируют ли они в основном, антигены МНС класса I и/или класса II или нет.

Коммитированные клетки обычно культивируют со средством в течение, по меньшей мере, двух часов, обычно от 2 до 24 часов, предпочтительно от 2 до 12 часов. Культивирование обычно выполняют при температуре от приблизительно комнатной или, например, приблизительно 22°С, до приблизительно 37°С, включая 33°С. Течение процедуры ретродифференцирования может быть проверено периодически удалением малой аликвоты образца и исследованием клеток, используя микроскопию и/или цитометрию потока. Альтернативно, устройство может включить средства слежения для он-лайн мониторинга течения процедуры ретродифференцирования.

В дополнение к использованию ретродифференцирующих средств коммитированные клетки могут быть культивированы в аутологической плазме или сыворотке, или в эмбриональной сыворотке крови или сыворотке лошади. Необязательно, коммитированные клетки могут быть культивированы с антикоагулянтами, хелатирующими средствами или антибиотиками. Диапазон температур для культивирования клеток может быть расширен до 18-40°С, и может также включать 4-10% CO₂ и/или 10-35% О₂. Кроме того, культивирование может происходить в мешках для крови, мешках разведения ткани, или пластмассовых сосудах, которые покрыты или непокрыты.

Определенные типы ретродифференцированных клеток могут быть получены ретродифференцированием, применяя определенные условия культивирования. Например, коммитированные клетки могут быть ретродифференцированы в плюрипотенциальные клетки культивированием коммитированных клеток в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), несущественных аминокислот (NEAA), L-глутамина (L-glu) и β-меркаптоэтанола (2 β-МЕ), в соединении с ретродифференцирующими средствами. Коммитированные клетки могут также быть первоначально подвергнуты действию хелатирующих средств.

В качестве другого примера, чтобы получить мезенхимные клетки, коммитированные клетки могут быть культивированы - в соединении с ретродифференцирующим средством (средствами) - используя DMEM (низкая глюкоза) и L-glu, или DMEM (низкая глюкоза), L-glu, 2 β-МЕ и NEAA. Далее, антибиотик гентамицин может также использоваться в культивировании клеток.

Трансдифференцированные клетки

Трансдифференцированные клетки получают культивированием коммитированных клеток со средой культивирования ткани в соединении с ретродифференцирующими средствами. Коммитированные клетки, таким образом, подвергаются трансдифференцированию, в котором коммитированные клетки преобразуются в клетки другого клеточного типа; в некоторых вариантах осуществления коммитированные клетки преобразуются в клетки другой линии дифференцировки.

Тип клетки-мишени, полученный трансдифференцированием, зависит от условий культивирования. Эти условия изменяются согласно типу культуральной среды ткани, присутствию/отсутствию различных средств, промотирующих дифференцирование, присутствию/отсутствию различных сывороток, температуры культивирования, присутствия/ отсутствия кислорода или диоксида углерода, и типа емкости или сосуда, используемого для культивирования.

Примеры культуральной среды ткани, используемой для трансдифференцирования, включают, но не ограничиваются ими, среду IMDM, среду DMEM, минимальную необходимую среду Игла (ЕМЕ), α-МЕМ, RPMI, где среда была разработана), 1640, Ham-F-12, E199, MCDB, Leibovitz L-15, среда Е Вильямса, или любая коммерчески составленная культуральная среда ткани.

Средства, промотирующие дифференцирование, включают антикоагулянты, хелатирующие средства и антибиотики. Примерами таких средств могут быть одно или больше из следующих: витамины и минералы или их производные, такие как А (ретинол), B₃, С (аскорбат), аскорбат-2-фосфат, D₂, D₃, K, ретиноевая кислота, никотинамид, цинк или соединение цинка, и кальций или соединения кальция; природные или синтетические гормоны, такие как гидрокортизон и дексаметазон; аминокислоты или их производные, такие как L-глутамин (L-glu), этиленгликольтетрауксусная кислота (EGTA), пролин и несущественные аминокислоты (NEAA); соединения или их производные, такие как β-меркаптоэталь, дибутил циклический аденозинмонофосфат (db-cAMP), монотиоглицерин (MTG), путресцин, диметилсульфоксид (DMSO), гипоксантин, аденин, форсколин, силостамид и 3-изобутил-1-метилксантин; нуклеозиды и их аналоги, такие как 5-азацитидин; кислоты или их соли, такие как аскорбиновая кислота, пируват, щавелевая кислота, линолевая кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), антикоагулянт цитратдекстроза формулы A (ACDA), диннатрий EDTA, бутират натрия, и глицерофосфат; антибиотики или лекарственные средства, такие как G418, гентамицин, Пентоксифиллин (1-(5-оксогексил)-3,7-диметилксантин) и индометацин и белки, такие как активатор плазминогена ткани (ТРА).

Эти средства, промотирующие дифференцирование, могут использоваться, чтобы получить определенные типы клеток-мишеней. Например, витамин B₃ может использоваться, чтобы получить ацинарные клетки, такие как островковые клетки, или гидрокортизон; дексаметазон может использоваться, чтобы получить клетки мезенхимной природы или эпителиальной природы (например, почечные эпителиальные клетки, кожа и близкие структуры, такие как клетки кожного сосочка); и β-меркаптоэталь может использоваться, чтобы привести к эктодермальным клеткам, таким как нейронные клетки, включая антиген-представляющие клетки ЦНС.

Культуральная среда может содержать аутологическую плазму; тромбоциты; сыворотку, такую как забор крови плода; или сыворотки, происходящие от млекопитающих, такие как сыворотка лошади. Кроме того, конверсионный процесс может происходить внутри мешка с кровью, подложки, мешка с культурой ткани или пластмассовых сосудов с культурой ткани. Сосуды с культурой ткани могут быть прикрепленными или неприкрепленными сосудами с культурой ткани, или могут быть покрыты или непокрыты средствами, такими как желатин, коллаген, матригели или внеклеточные матрицы, которые поддерживают прикрепление или плавучесть в зависимости от заданного типа ткани или определенных клеток, которые надо получить.

Дополнительные условия культивирования включают температуру, которая может быть от приблизительно 10 до приблизительно 60°С, или от приблизительно 18 до приблизительно 40°С; уровень диоксида углерода (СО₂), который может быть от приблизительно 0 до приблизительно 20%, или от приблизительно 4 до приблизительно 10%; и кислород (О₂), который может быть от приблизительно 0 до приблизительно 50%, или от приблизительно 10 до приблизительно 35%.

Примеры способов получения клетки-мишени и используемых в соединении с ретродифференцирующими средствами обсуждаются в таблице 1.

Примечательно, что для условий культивирования, описанных для каждого типа клеток в таблице 1, удаление средства ретродифференцирования последовательным разбавлением среды культивирования соответствующей культуральной средой приводит к более сильному трансдифференцированию. Во время культивирования культуральная среда, необязательно содержащая различные промоторы дифференцирования, может быть разбавлена добавлением большего количества среды, но без ретродифференцирующего средства. Без связи с теорией, разбавление, кажется, увеличивает дифференцирование, поскольку клетки становятся менее плотными, а факторы, стимулирующие пролиферацию, становятся менее концентрированными. Таким образом, добавление среды может далее усилить трансдифференцирование и будет влиять на то, какой тип клеток в пределах клеток клеточной линии получают.Например, если клеткой-мишенью является нейрон, добавление культуральной среды может приводить к сдвигу в развитии к более зрелому нейрону, а не клетке-предшественнику нейрона (обе имеют ту же самую клеточную линию). В качестве другого примера, прямого дифференцирования клетки-предшественники скелетной мышцы будут дифференцироваться только последовательным разбавлением культуральной среды, которое достигают, постепенно снижая концентрацию сыворотки.

Передифференцированные клетки

Ретродифференцированные клетки могут использоваться, чтобы получить клетки-мишени перекоммитированием или передифференцированием ретродифференцированных клеток в тип клетки-мишени. Это может быть выполнено контактированием ретродифференцированных клеток с факторами роста. Например, ретиноевая кислота использовалась, чтобы дифференцировать стволовые клетки в нейронные клетки. Метилцеллюлозу с последующим сокультивированием со стромальной линией костного мозга, и IL-7 использовали, чтобы дифференцировать стволовые клетки в предшественники лимфоцитов (Nisitani et al., Int Immuno 1994, 6: 909-916). Le Page (New Scientist Dec. 16, 2000) учит, что стволовые клетки могут быть дифференцированы в эпителиальные клетки легкого. Bischoff (Dev Biol 1986, 115: 129-39), учит, как дифференцировать мышечные клетки-сателлиты в зрелые мышечные волокна. Нервные клетки-предшественники могут развиваться с основным фактором роста фибробласта и эпидермальным фактором роста (Nakafuku and Nakamwa, J Neurosci Res 1995, 41: 153-168). Гематопоэтические стволовые клетки могут развиваться, используя ряд факторов роста, включая GM-CSF, эритропоэтин, фактор стволовых клеток и интерлейкины (IL-1, IL-3, IL-6) - смотри Metcalf (Nature 1989,339: 27-30) для обзора этих различных факторов.

Potocnik et al., (EMBO J 1994, 13: 5274-83), даже продемонстрировал дифференцирование стволовых клеток в гематопоэтические клетки, используя низкокислородные (5%) условия.

Передифференцированная клетка может быть той же самой клеточной линии, что и коммитированная клетка, из которой была получена ретродифференцированная клетка. Альтернативно, передифференцированная клетка может быть другой клеточной линии, чем коммитированная клетка, из которой была получена ретродифференцированная клетка. Например, В лимфоцит может быть ретродифференцирован в стволовую клетку CD34⁺CD38 HLA-DR⁺. Эта стволовая клетка может быть затем передифференцирована или перекоммитирована в направлении клеточной линии В клетки (та же самая клеточная линия) или лимфоидной клеточной линии (другая клеточная линия).

Клетки-мишени

Клетки-мишени по изобретению являются перепрограммированными клетками, которые могут быть получены ретродифференцированием, трансдифференцированием или передифференцированием, как описано выше. Согласно изобретению, клетки-мишени могут включать, но не ограничиваться ими, плюрипотенциальные стволовые клетки, лимфоидные стволовые клетки, миелоидные стволовые клетки, нервные стволовые клетки, клетки-сателлиты скелетной мышцы, эпителиальные стволовые клетки, эндодермальные и нейроэктодермальные стволовые клетки, зародышевые клетки, экстраэмбриональные и эмбриональные стволовые клетки, мезенхимные стволовые клетки, почечные клетки, альвеолярные клетки эпителия, клетки эндодермы, нейроны, клетки эктодермы, островковые клетки, ацинарные клетки, овоциты, сперматозоиды, гематопоэтические клетки, гепатоциты, кожа/кератиноциты, меланоциты, кость/остеоциты, волосы/кожные клетки сосочков, хрящ/хондроциты, жировые клетки/адипоциты, скелетные мышечные клетки, клетки эндотелия, сердечная мышца/кардиомиоциты и тропобласты.

Как описано выше, коммитированные клетки и/или ретродифференцированные клетки культивируют в определенных условиях, чтобы вызвать ретродифференцирование и/или трансдифференцирование и/или передифференцирование и получить клетки-мишени. Продолжительность, в течение которой коммитированные клетки и/или ретродифференцированные клетки культивируют, не контролируется определенным отрезком времени, а скорее определением, что клетки-мишени были продуцированы.

Определение продуцирования или изменения числа ретродифференцированных, трансдифференцированных или передифференцированных клеток-мишеней может быть выполнено, контролируя изменения в относительном числе коммитированных клеток, которые понижающее регулировали экспрессию маркеров, ассоциированных с клеточной линией, или факторов транскрипции, и/или изменения относительного числа клеток, имеющих маркеры клеточной поверхности, являющиеся характеристикой клеток-мишеней. Альтернативно, или, кроме того, уменьшение числа клеток, имеющих маркеры клеточной поверхности, типичные для коммитированных клеток, а не клеток- мишеней, может быть контролировано. Например, клетка-мишень может быть эмбриональной стволовой клеткой, которая характеризуется многостадийно-специфическими маркерами, такими как POU5F1 (ОСТ-4), TERT, KLF4, UTF1, SOX2, Nanog, или стадиеспецифическими эмбриональными маркерами 3 и 4 (SSEA-3 и SSEA-4), высокомолекулярными гликопротеинами TRA-1-60 и TRA-1-81 и щелочной фосфатазой (Andrews et al., Hydridoma 1984, 3: 347-361; Kannagi et aL, EMBO J 1983, 2: 2355-2361; Fox et al., Dev Biol 1984,103: 263-266; Ozawa et al., Cell Differ 1985, 16: 169-173). Они также не экспрессируют SSEA-1, присутствие которого является индикатором дифференцирования. Другие маркеры известны для других типов стволовых клеток, такие как нестеин (Nestein) для нейроэпителиальных стволовых клеток (J Neurosci 985, 5: 3310). Мезенхимные стволовые клетки являются позитивными для SH2, SH3, CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a и CD124, например, и негативными для CD34, CD45 и CD14. Плюрипотентными стволовыми клетками являются клетки CD34⁺ DR^- TdT⁺ (другими полезными маркерами являются CD38^- и CD36⁺). Лимфоидными стволовыми клетками являются клетки DR⁺, CD34⁺ и TdT⁺ (также CD38⁺). Миелоидными стволовыми клетками являются клетки CD34⁺, DR⁺, CD13⁺, CD33⁺, CD7⁺ и TdT⁺.

Дополнительные клеточные маркеры для клеток-мишеней могут быть обнаружены микроматричным анализом. Анализ может включать выделение РНК из клеток-мишеней, которые были ретродифференцированы, и/или трансдифференцированны и/или передифференцированы, маркируя изолированную РНК краской, и гибридизируя изолированную РНК с микроматрицей. Микроматрица может включать гены или олигонуклеотиды, представляющие целый геном, или может включить гены или олигонуклеотиды, направленные к определенному органу системы, ткани системы, болезни, патологии, и т.д. Клеточные маркеры могут быть идентифицированы тем, что гены/олигонуклеотиды показывают высокую сигнальную интенсивность, и, тем самым, повышающе регулируются или понижающе регулируются в клетках-мишенях. Эта информация может тогда быть применена к определению клеток-мишеней, на основе присутствия маркеров, или даже групп или характерных участков маркеров, которые были идентифицированы микроматричным анализом.

Подтверждение клеток-мишеней может также быть выполнено, используя ряд in vitro анализов, таких как анализы CFC (см. также, примеры). Очень примитивные гематопоэтические стволовые клетки часто измеряют, используя анализ инициирование клеток долговременным разведением (LTC-IC) (Eaves et al., J Tiss Cult Meth 1991, 13: 55-62). LTC-IC поддерживает гемопоэз в течение 5-12 недель.

Для других клеточных типов, таких как клетки центральной нервной системы, поджелудочной железы, печени, почки, кожи и т.д., культивирование клеток может продолжаться до тех пор, пока не появятся клетки-мишени, как характеризуется иммуногистохимией, проточной цитометрией, микроматричным анализом, или полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (RT-PCR), которые являются методиками, известными в технологии. Это может также включать функциональные анализы, например, делая прививку иммунодефицитному реципиенту или исправляя или повышая качество основного клинического состояния, как наблюдая здесь.

Клетки-мишени могут быть идентифицированы микроматричным анализом или RT-PCR, которые показывают приобретение новых факторов транскрипции, специфических к клеточным линиям, белков и сигналов в клетках-мишенях. Например, ретродифференцированные стволовые клетки, преобразованные в клетки-мишени эктодермальной клеточной линии, могут экспрессировать гены, такие как Nestin, Criptol, is 11, LHX1 и/или EN1, и если далее дифференцировать в нейроны, будут экспрессировать нейрофиламенты (NF), С другой стороны, клетки, преобразованные в клетки-мишени эндодермальной клеточной линии, могут экспрессировать гены, такие как sox7, soxl7, Nodal, PDX1 и/или FOXA2; но клетки-мишени, далее дифференцированные в панкреатические островковые клетки, могут экспрессировать гены, такие как инсулин (INS) и neurog3 (NGN3). Особенно, преобразование в желательные клетки- мишени может сопровождаться понижающей регуляцией зрелых факторов транскрипции, связанных с первоначальной исходной популяцией, которая подверглась преобразованию.

Кроме того, определение продуцирования клеток-мишеней может иметь место путем распознавания определенных структурных и/или морфологических характеристик клеток-мишеней, например, формы клетки, размера, и т.д. Эти характеристики известны в технологии для клеток-мишеней по изобретению.

Как только относительные числа желательного клеточного типа увеличились до соответствующего уровня, который может, например, быть столь же низким, как 0,1% или столь же высоким как 5%, результатные измененные популяции клеток могут использоваться многими способами. Относительно чисел клеток- мишеней, например, плюрипотенциальных стволовых клеток, образованных, и это важно, чтобы оценить пролиферативную способность стволовых клеток. Хотя при некоторых обстоятельствах, число стволовых клеток или других образованных ретродифференцированных клеток, как может оказаться, является низким, изучения показали, что только 50 плюрипотенциальных гематопоэтических стволовых клеток могут воссоздать всю гематопоэтическую систему в мышином доноре. Таким образом, терапевтическая полезность не требует образования большого количества клеток.

Преобразование коммитированных клеток в ретродифференцированные, трансдифференцированные или передифференцированные клетки-мишени может также быть выполнено in vivo введением средства, смешанного с фармацевтическим носителем или растворителем, больному. Однако, предпочтительно во многих случаях, что ретродифференцирование, трансдифференцирование или передифференцирование выполняют in vitro/ex vivo (в пробирке, вне организма).

Обработанные популяции клеток, полученных in vitro могут использоваться впоследствии с минимальной переработкой. Например, они могут быть просто комбинированы с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем и введены больному, нуждающемуся в стволовых клетках. Однако может быть желательно обогатить популяцию клеток для ретродифференцирования, трансдифференцирования или передифференцирования клеток-мишеней или очистить клетки от популяции клеток. Это может обычно быть выполнено, используя ряд методов (см. Vattese-Dadey-The Scientist 1999, 13). Например, клетки могут быть очищены на основе маркеров поверхности клетки, используя хроматографию и/или проточную цитометрию. Тем не менее, часто не будет ни необходимо, ни желательно экстенсивно очищать ретродифференцированные, трансдифференцированные или передифференцированные клетки-мишени от популяции клеток, так как другие клетки, присутствующие в популяции (например, клетки стромы) могут поддержать жизнеспособность стволовых клеток и функцию. Проточная цитометрия потока является известной, достоверной и сильной методикой для характеристики клеток в пределах смешанных популяций, а также для сортировки клеток. Таким образом, средства очистки или выделения могут включать проточную цитометрию. Проточная цитометрия функционирует на основе физических свойств частиц в жидкой суспензии, которые можно различить при исследовании пучком света. Конечно, такие частицы могут быть клетками. Физические свойства включают размер и структуру клеток или, как стало очень популярным в последние годы, маркеры клеточной поверхности клетки, связаны моноклональными антителами, сопряженными с флуоресцентными молекулами.

Kreisseg et al., (J Hematother 1994, 3: 263-89) утверждает, "из-за доступности моноклональных антител anti-CD34, многопараметрическая проточная цитометрия стала инструментом выбора для определения гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников." Kreisseg далее описывает общие методики для разбивки на подгруппы и исследования клеток, экспрессирующих CD34, проточной цитометрией. Далее, Korbling et al., (Bone Marrow Transplant 1994, 13: 649-54), описывает очистку клеток CD34"¹" иммуноадсорбцией, за которой следует проточная цитометрия на основе экспрессии HLA-DR. Как обсуждено выше, CD34"*" является полезным маркером в соединении со стволовыми клетками/ клетками- предшественниками. Методики проточной цитометрии для сортировки стволовых клеток на основе других физических свойств, также доступны. Например, Visser et al., (Blood Cells 1980, 6:391-407) учат, что стволовые клетки могут быть изолированы на основе их размера и степени структурированности. Grogan et al., (Blood Cells 1980, 6: 625-44), также учат, что "жизнеспособные стволовые клетки могут быть отсортированы от простых гематопоэтических тканей с высокой и поддающейся проверке чистотой".

Так же как выбор для клеток на основе присутствия маркера клеточной поверхности или другого физического свойства (позитивный выбор), популяции клеток могут быть обогащены, очищены, используя негативные критерии, Например, клетки, которые обладают маркерами специфических клеточных линий, такими как CD4, CD8, CD42 и CD3, могут быть удалены из клеточной популяции проточной цитометрией или афинной хроматографией.

Очень полезная методика для очистки клеток включает использование антител или других аффинных лигандов, связанных с магнитными гранулами. Гранулы культивируют с популяцией клеток и клетки, которые имеют маркер клеточной поверхности, такой как CD34, с которым связывается аффинный лиганд, захватываются. Пробирку с образцом, содержащим клетки, помещают в магнитный концентратор образца, где гранулы притягиваются к периферии пробирки. После одной или больше стадий промывки, интересующие клетки частично или в основном полностью очищают от других клеток. Когда используют негативный формат выбора, вместо промытых клеток, связанных с гранулами устранением жидкой фазы, сохраняют жидкую фазу, и, следовательно, клетки, связанные с гранулами, эффективно удаляются из клеточной популяции.

Эти методы очистки, основанные на аффинных лигандах могут использоваться с любым типом клетки, для которого соответствующие маркеры были охарактеризованы или могут быть охарактеризованы. Urbankova et al., (J Chromatogr В Biomed Appi 1996, 687: 449-52) описывают микрополучение гематопоэтических стволовых клеток из суспензии костного мозга мыши проточным фракционированием в поле тяготения. Urbankova и другие далее комментируют, что метод использовался для исследования стволовых клеток костного мозга мыши, потому что эти клетки больше, чем другие клетки костного мозга и, следовательно, возможно отделить их от смеси. Таким образом, физические параметры, отличные от маркера клеточной поверхности, могут использоваться, чтобы очистить/обогатить стволовые клетки.

Популяции клеток, включающие перепрограммированные клетки-мишени, такие как ретродифференцированны, трансдифференцированные или передифференцированные клетки-мишени, и/или очищенные перепрограммированные клетки-мишени, такие как ретродифференцированные, трансдифференцированные или передифференцированные клетки-мишени, произведенные способами по изобретению, могут быть сохранены in vitro, используя известные методики. Как правило, обычно применяют минимальные ростовые среды, такие как Hanks, RPMI 1640, DMEM или IMDM, дополненной сывороткой млекопитающего, такой как FBS, и необязательно аутологической плазмой, чтобы обеспечить соответствующую ростовую среду для клеток. Стволовые клетки могут быть культивированы на фидерных питающих слоях, таких как слои клеток стромы (см. Deryugina et al., Crit Rev Immunology 1993, 13: 115-150). Клетки стромы, как полагают, секретируют факторы, которые поддерживают клетки-предшественники в недифференцированном состоянии.

Долговременные культуральные системы для стволовых клеток описаны Dexter et al., (J Cell Physiol 1977, 91: 335) и Dexter et al., (Acta Haematol 1979, 62: 299).

Например, Lebkowski et al., (Transplantation 1992, 53: 1011-9), учат, что человеческие гематопоэтические клетки CD34⁺ могут быть очищены, используя технологию, основанную на использовании моноклональных антител, которые ковалентно иммобилизуют на поверхности полистирола, и что клетки CD34⁺, очищенные этим способом, могут быть поддержаны с жизнеспособностью больше, чем 85%. Lebkowski et al., (J Hematother 1993, 2: 339-42) также учат, как изолировать и культивировать клетки человека CD34⁺. См. также Haylock et al., (linmunomethods 1994, 5: 217-25) для обзора различных способов.

Популяции клеток, включающие стволовые клетки и очищенные препараты, включающие стволовые клетки, могут быть заморожены/законсервированы замораживанием для будущего использования. Соответствующие методики для замораживания клеток и их последующего оживления известны в технологии.

В одном варианте осуществления, ретродифференцирование, трансдифференцирование или передифференцирование происходит с клетками из или в образцах лейкоцитной пленки. Термин "лейкоцитная пленка" означает слой белых клеток, который формируется между слоем красных клеток и плазмой, когда несвернувшуюся кровь центрифугируют или отстаивают.

Методы лечения

Перепрограммированные клетки-мишени по настоящему изобретению, такие как ретродифференцированные клетки-мишени, трансдифференцированные клетки-мишени и передифференцированные клетки-мишени могут быть комбинированы с различными компонентами, чтобы производить композиции по изобретению. Композиции могут быть комбинированы с одним или больше фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, чтобы производить фармацевтическую композицию (которая может быть для человеческого или ветеринарного использования). Соответствующие носители и растворители включают, но не ограничиваются ими, изотонические солевые растворы, например, забуференные фосфатом солевые растворы. Композиция по изобретению может быть введена прямой инъекцией. Композиция может быть изготовлена для парентерального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, внутриглазного, перорального и трансдермального введения, или инъекцией в цереброспинальную жидкость. Композиции, включающие клетки-мишени, могут быть добавлены инъекцией или имплантацией.

Клетки могут быть добавлены в суспензии или заделаны в матрицы носителя, такие как природные и/или синтетические биоразлагаемые матрицы. Природные матрицы включают, но не ограничиваются ими, коллагеновые матрицы. Синтетические биоразлагаемые матрицы включают, но не ограничиваются ими, полиангидриды и полимолочную кислоту. Эти матрицы могут быть носителем для хрупких клеток в естественных условиях.

Композиции могут также включать ретродифференцированные, трансдифференцированные или передифференцированные клетки-мишени по настоящему изобретению и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый инертный эксципиент, носитель или наполнитель.

Доставка может также быть регулируемой, то есть, доставляемой в течение времени, которое может быть от нескольких минут до нескольких часов или дней. Доставка может быть системной (например, внутривенной инъекцией) или направленной к определенному месту интереса. Клетки могут быть введены в естественных условиях, используя липосомный перенос.

Клетки-мишени могут быть введены в дозах от 1×10⁵ до 1×10⁷ клеток на кг. Например, 70-килограммововому больному может быть введено 14×10⁶ клеток CD34⁺ для восстановления тканей. Дозировки могут быть любой комбинацией клеток- мишеней, перечисленных в этой заявке.

Методы по изобретению могут использоваться, чтобы лечить множество болезней, состояний или нарушений. Такие состояния включают, но не ограничиваются ими, расстройство костного мозга, гематологические состояния, апластическую анемию, бета-талассемию, диабет, болезнь мотонейрона, болезнь Паркинсона, повреждение спинного мозга, мышечную дистрофию, почечную болезнь, болезнь печени, рассеянный склероз, застойную сердечную недостаточность, вирус гепатита С, вирус иммунодефицита человека, травму головы, болезнь легких, депрессию, необструктивную азооспермию, андропаузу, менопаузу и бесплодие, омоложение, язвы склеродермы, псориаз, морщины, цирроз печени, аутоиммунную болезнь, облысение, ретинит и кристаллическую дистрофию/слепоту или любое нарушение, связанное с дегенерацией ткани. Апластическая анемия является редким, но фатальным нарушением костного мозга, отмеченным панцитопенией и недостаточностью клеток костного мозга (Young et al., Blood 2006, 108: 2509-2519). Нарушение может быть вызвано иммунопатологическим заболеванием с активированными цитотоксическими Т клетками типа I, экспрессирующими цитокин Th1, особенно γ-интерферон, нацеленный на гематопоэтический компартмент стволовых клеток, приводящий к расстройству костного мозга и, следовательно, ангематопозу (Bacigalupo et al., Hematology 2007, 23-28). Большинство больных апластической анемией можно лечить трансплантацией стволовых клеток, полученных из потомства одних родителей, согласованных по HLA (Locasciulli et al., Haematologica. 2007; 92:11-18.), хотя, расширение этого подхода на более старых больных или больных, у которых семейные доноры отсутствуют, остается под большим вопросом. Несмотря на приемлемую выживаемость после трансплантации аллогенных стволовых клеток, согласованных по HLA, процедура имеет некоторые потенциальные риски, обусловленные иммунодепрессивным режимом, используемым, чтобы предотвратить болезнь трансплантат против хозяина (GVDH). Например, большая доза циклофосфамида с антитимоцитглобулином (ATG) или без него приводит к длительному периоду иммунодепрессии и предрасполагает больного к условно-патогенной инфекции. Другим потенциальным риском является отказ трансплантата, который может последовать спустя недели или месяцы после трансплантации стволовых клеток (Gottdiener et al., Arch Intern Med 1981, 141: 758-763; Sanders et al., Semin Hematol 1991, 28: 244-249). Кроме того, риск отказа трансплантата увеличивается с числом переливаний крови, полученных до трансплантации стволовых клеток.

Талассемия является наследственной аутосомной рецессивной болезнью крови, отмеченной пониженной скоростью синтеза одной из цепей глобина, которые составляют гемоглобин. Таким образом, есть недопроизводство нормальных белков глобина, часто вызванных мутациями в регуляторных генах, которое приводят к образованию аномальных молекул гемоглобина, вызывая анемию. Различные типы талассемий включают альфа-талассемию, бета-талассемию и дельта-талассемию, которые влияют на производство альфа-глобина, бета-глобина и дельта-глобина, соответственно. Лечение включают постоянное переливание крови, хелатирование железа, удаление селезенки и аллогенную гематопоэтическую трансплантацию. Однако, постоянное переливание крови недоступно для большинства больных из-за отсутствия доноров костного мозга, согласованных по HLA, в то время как аллогенная гематопоэтическая трансплантация связана со многими возможными осложнениями, такими как инфекции и болезнь трансплантат-против-хозяина.

Диабетом является синдром, приводящий к ненормально высоким уровням сахара в крови (гипергликемия). Диабет относится к группе болезней, которые приводят к высокому уровню глюкозы в крови, вызванном дефектами либо в секреции инсулина, либо в действии инсулина в организме. Диабет обычно разделяют на два типа: диабет 1 типа, отмеченный уменьшенным производством инсулина, или диабет 2 типа, отмеченный устойчивостью к действию инсулина. Оба типа приводят к гипергликемии, которая в значительной степени вызывает признаки, обычно связанные с диабетом, например, чрезмерное производство мочи, последующая компенсирующая жажда и повышенное поглощение жидкости, затуманенное зрение, необъяснимая потеря веса, летаргия и изменения в энергетическом метаболизме. Диабет, как полагают, является хронической болезнью, без лечения. Варианты лечения ограничиваются инъекциями инсулина, упражнением, соответствующей диетой, или, для больных диабетом 2 типа, некоторыми лекарствами, например, лекарственными средствами, которые поддерживают секрецию инсулина поджелудочной железой, уменьшают глюкозу, производимую печенью, увеличивают чувствительность клеток к инсулину и т.д.

Болезни мотонейрона относятся к группе неврологических нарушений, которые воздействуют на мотонейроны. Такие болезни включают амиотрофический боковой склероз (ALS), главный боковой склероз (PLS) и прогрессирующую мышечную атрофию (РМА). Для ALS характерна дегенерация как верхних, так и нижних мотонейронов, которая прекращает передачу сигнала мышцам и приводит к их ослаблению и возможной атрофии. PLS является редкой болезнью мотонейронов, воздействующей только на верхние мотонейроны, которая вызывает трудности с равновесием, слабость и тугоподвижность ног, спастичность и речевые проблемы. РМА является подтипом ALS, которая воздействует только на нижние мотонейроны, которые могут вызвать мышечную атрофию, фасцикуляцию и слабость. Лечение болезней мотонейрона неизвестно. Рилузол (rilusole), который, как полагают, снижает повреждение мотонейронов, был одобрен как лечение для ALS, хотя он замедляет развитие ALS, а не улучшает ее состояние. Для PLS, лечение направлено только на синдромы, например, баклофен (baclofen) может уменьшить спастичность или хинин, который может уменьшить судороги.

Болезнь Паркинсона (PD) является нейродегенеративным нарушением, характеризующимся потерей нигростриатного пути, возникающей из-за дегенерации допаминергических нейронов в пределах черного вещества. Причина PD не известна, но связана с прогрессирующей смертью допаминергических (тирозингидроксилаза (ТН) позитивная) мезэнцефалических нейронов, вызывая моторные повреждения. Следовательно, PD характеризуется неподвижностью мышц, дрожанием, брадикинезией и потенциальной акинезией. Таким образом, в настоящее время нет никакого удовлетворительного лечения болезни Паркинсона или лечений для профилактики или лечения болезни Паркинсона или ее симптомов. Симптоматическое лечение моторных повреждений, связанных с болезнью, включает пероральное введение дигидроксифенилаланина (L-DOPA), которое может привести к реальному улучшению моторной функции, но его эффект снижается по мере того, как дегенерация допаминергических нейронов прогрессирует. Альтернативные стратегии включают трансплантацию нервной ткани, которая основана на идее, что допамин, поставляемый из клеток, внедренных в полосатое тело, может заместить потерянные нигростриатные клетки, и генную терапию, которая может использоваться, чтобы заменить допамин в полосатом теле, на которое влияют, введением ферментов, ответственных за L-DOPA или синтез допамина, таким как введение потенциально нейропротекторных молекул, которые могут либо препятствовать умиранию ТН-позитивных нейронов, или стимулировать регенерацию и функциональное восстановление в поврежденной нигростриатной системе.

Травма спинного мозга характеризуется повреждением спинного мозга и, в частности, нервного волокна, приводящего к повреждению части или всех мышц или нервов ниже местонахождения повреждения. Такое повреждение может произойти через травму позвоночника, которая приводит к трещине, смещает, измельчает или сжимает один или больше позвонков, или через нетравмирующие повреждения, вызванные артритом, раком, воспалением или дегенерацией диска. В то время как лечение после повреждения спинного мозга могут включать лекарства, такие как метилпреднизолон, который является кортикостероидом, который снижает повреждение нервных клеток и уменьшает воспаление в травмированной области, или лекарства, которые регулируют боль и мышечную спастичность, так же как иммобилизацию позвоночника или хирургию, чтобы удалить грыжу межпозвоночного диска или любые объекты, которые могут повреждать позвоночник, нет никаких известных средств полностью изменить повреждение спинного мозга.

Мышечная дистрофия (MD) относится к ряду наследственных мышечных заболеваний, которые ослабляют скелетные мышцы. MD может характеризоваться прогрессирующей слабостью мышц, дефектами в мышечных белках, апоптозом мышечных клеток и атрофией ткани. Есть более чем 100 болезней, которые показывают характеристики MD, хотя девять болезней, в особенности: болезнь Дюшенна (Duchenne), болезнь Беккера (Becker), болезнь тазового пояса, плече-лопаточно-лицевая миопатия, миотоническая дистрофия, окулофарингеальная дистрофия, периферическая дистрофия и болезнь Эмери-Дрейфуса, классифицируют как MD. Нет никаких известных лечений для MD, и при этом нет никаких специальных лечений. Физическая терапия может поддерживать мышечный тонус, а хирургия может использоваться, чтобы улучшить качество жизни. Далее, симптомы, такие как миотония могут лечиться лекарствами, но нет никаких долговременных методов лечения.

Почечная болезнь относится к состояниям, которые повреждают почки и уменьшают их способность функционировать, что включает удаление отходов и избыточной воды из крови, стабилизацию электролитов, кровяного давления, кислотно-основного баланса, и обратное всасывание глюкозы и аминокислот. Двумя главными причинами почечной болезни являются диабет и высокое давление крови, хотя другие причины включают громелуронефрит, волчанку, пороки развития и закупорки в почке. Нет никакого лечения для почечной болезни, и, таким образом, терапия сосредотачивается на том, чтобы замедлять прогрессию болезни и лечить причины болезни, такие как регулирование глюкозы крови и высокого давления крови и соблюдение диеты; лечить осложнения болезни, например, адресное задержание жидкости, анемии, болезни кости; и замена утраченной почечной функции, например, через диализ или трансплантацию.

Рассеянный склероз (MS) является аутоиммунным состоянием, в котором иммунная система воздействует на центральную нервную систему, приводя к демиелинизации. MS воздействует на способность нервных клеток в мозге и спинном мозге сообщаться друг с другом, поскольку собственная иммунная система тела воздействует и повреждает миелин, который окутывает аксоны нейрона. Когда миелин потерян, аксоны больше не могут эффективно проводить сигналы. Это может приводить к различным неврологическим симптомам, которые обычно развиваются в физическую и познавательную неспособность. Нет никакого известного лечения MS; лечения пытаются возвратить функцию после приступа (внезапное начало или ухудшение признаков MS), предотвратить новый приступ, и нетрудоспособность. Например, лечение кортикостероидами могут помочь закончить приступ, в то время как лечение интерфероном во время начального разъедания, как было показано, уменьшает шанс, что клинический MS будет развиваться.

Вирус иммунодефицита человека (HIV, ВИЧ) является лентивирусом, который может привести к синдрому приобретенного иммунодефицита (AIDS, СПИД), состоянию, в котором, иммунная система начинает ослабевать. HIV прежде всего заражает жизненноважные клетки в человеческой иммунной системе, такие как хелперные Т-клетки, макрофаги, и дендритные клетки. HIV инфекция приводит к низким уровням Т-клеток CD4⁺ прямым вирусным уничтожением зараженных клеток, повышенной скоростью апоптоза в зараженных клетках, или уничтожением зараженных Т-клеток CD4⁺ цитотоксическими лимфоцитами CD8, которые узнают зараженные клетки. В настоящее время, нет никакой вакцины или лечения HIV (ВИЧ) или AIDS (СПИД). Лечение HIV (ВИЧ) инфекции состоит в очень активной антиретровирусной терапии или HAART (highly active antiretrovirus therapy). Современные варианты HAART являются комбинациями (или "коктейлями"), состоящими из, по меньшей мере, трех лекарственных средств из, по меньшей мере, двух типов антиретровирусных средств. Как правило, эти классы являются двумя нуклеозидными аналогами ингибитора обратной транскриптазы (NARTI или NRTI, nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitor) плюс либо ингибитор протеазы, либо ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (NNRTI).

Застойная сердечная недостаточность относится к состоянию, в котором сердце не может накачать достаточно крови в другие органы организма. Это состояние может следовать из болезни коронарной артерии, рубцовой ткани на сердце, вызванной инфарктом миокарда, высокого давления крови, болезни сердечного клапана, сердечными дефектами, и инфекции сердечного клапана. Программы лечения обычно состоят из покоя, соответствующей диеты, измененной ежедневной активности, и лекарственных средств, таких как ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ), бета-блокаторы, дигиталис, диуретики, вазодилататоры. Однако, программа лечения не будет полностью обращать повреждение или состояние сердца.

Гепатит С является инфекционной болезнью печени, вызываемой вирусом гепата С. Гепатит С может развиваться в рубцевание (фиброз) и расширенное рубцевание (цирроз). Цирроз печени может приводить к печеночной недостаточности и другим осложнениям, таким как рак печени. Современное лечение включает использование комбинации пегилированного альфа-интерферона и противовирусного лекарственного средства рибавирин. Коэффициенты успеха могут изменяться от 50 до 80% в зависимости от вирусного генотипа.

Травма головы относится к повреждению головы, которое, возможно, не вызывает повреждение мозга. Частые причины травмы головы включают дорожные происшествия, домашние и профессиональные инценденты, падения, и нападения. Различные типы проблем могут следовать из травмы головы, включая трещину черепа, рваную рану черепа, субдуральную гематому (кровотечение ниже твердой мозговой оболочки), эпидуральную гематому (кровотечение между твердой мозговой оболочкой и черепом), контузию мозга (ушиб мозга), сотрясение (временная потеря функции вследствие травмы), кому или даже смерть. Лечение травмы головы будет меняться в зависимости от типа повреждения. Если мозг поврежден, нет никакого быстрого средства восстановить его, и часто повреждение может быть необратимым для доступных средств лечения.

Болезнь легкого является широким термином для болезней дыхательной системы, которая включает легкое, плевральную полость, бронхиолы, трахею, верхние дыхательные пути, и нервы и мышцы для того, чтобы дышать. Примеры болезней легкого включают обструктивную болезнь легкого, в которой бронхиолы становятся суженными; сдерживающие или фиброзные болезни легкого, в которых легкое теряет податливость, что приводит к неполному расширению легкого и к увеличенной жесткости легкого; инфекции дыхательных путей, которые могут быть вызваны простудой или пневмонией; дыхательные опухоли, такие как вызванные раком; болезни плевральной полости; и легочные сосудистые болезни, которые воздействуют на легочное кровообращение. Лечение болезни легкого изменяется от типа болезни, но может включать лечение, такое как кортикостероиды и антибиотики, кислород, механическая вентиляция, радиотерапия, и хирургия.

Депрессия является расстройством психики, характеризующимся низким настроением, сопровождаемым низким чувством собственного достоинства и потерей интереса или удовольствия в обычно приятных действиях. Биологически, депрессия сопровождается изменением активности во многих частях мозга, включая сращения ядер, которые являются группой малых ядер в верхнем стволе мозга, который является источником серотонина; супракаезматическое ядро, которое управляет биологическими ритмами, такими как цикл сна и бодрствования; гипоталамическо-гипофизарно-надпочечную ось, которая является цепью структур, которые активируются во время реакции тела на различные стрессоры; вентральную тегментальную область, которая, как полагают, ответственна за электрическую схему "подкрепление условного рефлекса" мозга; ядро прилегающее, которое, как думают, играют роль в поощрении, смехе, удовольствии, склонности, и страхе; и антериальный поясной кортекс, который активируется негативными событиями. Лечение депрессии включает антидепрессанты, которые увеличивают количество внеклеточного серотонина в мозге, упражнения и психотерапию. Однако, эффективность этого лечения продолжает подвергаться сомнению.

Необструктивная азоспермия является заболеванием мужчины, не имеющего какой-либо измеримый уровень спермы в его семенной жидкости, обусловленный сперматогенезом. Это заболевание часто вызывается гормональной неустойчивостью и может лечиться, используя лекарства, которые восстанавливают прежнее состояние.

Андропауза является состоянием, подобным менопаузе, испытываемое мужчиной средних лет, которое включает снижение производства гормонального тестостерона и дегидроэпиандростерона. Лечение включает гормональную терапию замены и упражнения.

Склеродерма является хроническим аутоиммунным заболеванием, которое воздействует на соединительную ткань. Отвердевание кожи является самым видимым проявлением болезни, хотя она может воздействовать на соединительную ткань по всему организму. Нет никакого известного прямого лечения склеродермы.

Псориаз является хроническим аутоиммунным заболеванием, которое вызывает появление красных, чешуйчатых участков на коже. Причина псориаза связана с чрезмерным ростом клеток кожи. Одна гипотеза предполагает, что причина связана с Т-клетками, которые мигрируют к коже и вызывают выделение цитокинов, которые вызывают быстрое производство клеток кожи. Лечение псориаза включает лекарственные средства, которые имеют целью Т-клетки.

Ретинит является типом прогрессирующей дистрофии ретинали, в которой фоторецепторы или ретинальный пигмент эпителия является аномальным и приводит к потере зрения. Методы лечения ретинита ограничены.

Состояния, описанные здесь, можно лечить определенным типом, или комбинацией типов клеток-мишеней. В предпочтительных вариантах осуществления состояние, описанное здесь, можно лечить инфузией типов клеток, выделенных в таблице 2.

В качестве примера больного можно лечить от состояния, описанного выше, применяя следующие стадии:

1) фистулу-канюлю вставляют в руку больного;

2) урожай белых клеток крови собирают путем аферезиса, используя автоматизированную систему, такую как спектральное устройство СОВЕ® (Gambro PCT;

3) аутологические ретродифференцированные стволовые клетки производят из белых клеток крови больного;

4) аутологические ретродифференцированные стволовые клетки промывают и затем вводят внутривенно больному;

5) прогресс контроля состояния больного включает взятие анализов крови и оценку травмированных областей.

Изобретение будет далее описано посредством следующих неограничивающих примеров, которые дополнительно поясняют изобретение, и не предназначены, и не должны быть интерпретированы, ограничить охват изобретения.

Примеры

Пример 1

Материалы и методы

Это клиническое изучение позволило оценить безопасность введения единичной дозы аутологических перепрограммированных 3 час.клеток с последующим воздействием гематопоэтической индуктивной культуральной среды у четырех больных апластической анемией.

Это клиническое изучение было одобрено этическим комитетом Мемориальной больницы короля Эдварда (King Edward Memorial (КЕМ) Hospital) и было выполнено в сотрудничестве с Институтом иммуногематологии (Instutute of Immunohematology (IIH)). Больные были обязаны выполнять критерии, изложенные в таблице 3.

В результате четверо больных с тяжелой (3 мужчины) и гипопластической (1 женщина) анемией приняли участие в исследовании. Эти 4 больных были отобраны и наблюдались персоналом ПН/КЕМ. Клиническая и лечебная история описаны в таблице 4, в то время как дозировка им инфузии клеток CD34⁺ показаны в таблице 5.

Больным переливали 2 единицы облученных упакованных красных клеток крови и 4 единицы тромбоцитов, чтобы поддержать уровень гемоглобина выше 8 г/дл и количество тромбоцитов выше 50000. Больной был подвергнут аферезу путем переработки 2-3 раза полного объема крови, используя устройство Cobe Spectra для афереза и набор для отделения белых клеток крови (оба от Gambro BCT). Аферез включал шейное и anticubetal венозное зондирование однопросветным катетером для венозной катетеризации.

Аликвоту клеток собирали асептически для анализа на CD34, за которым следует сбор 150-200 мл светлого слоя кровяного сгустка. После того, светлый слой кровяного сгустка был подвергнут перепрограммированию в условиях гематопоэтического индуктивного культивирования. Кратко, методика перепрограммирования включала добавление 1000 мкг очищенных CR3/43 (конкретно полученных DakoCytomation для TriStem Corp.), разбавленных 30 мл среды, IMDM, асептически в мешок с белыми клетками крови. Мешок затем культивировали в стерильном термостате культуры ткани, поддерживаемом при 37°С и 5% CO₂ в течение трех часов. После завершения процесса перепрограммирования, преобразованные клетки были анализированы на содержание клеток CD34⁺. Затем, клетки дважды промывали солевым раствором, используя клеточный процессор cobe 2991. После перемешивания и повторного суспендирования в солевом растворе, суспензию клеток вводили больному через шейную вену под действием силы тяжести, используя набор для инфузии. Основные показатели состояния организма, включая клинический анализ крови больных, непрерывно контролировали до и после инфузии аутологических перепрограммированных клеток.

Таблица 4. Клиническая и лечебная история больных апластической анемией до инфузии аутологических перепрограммированных клеток человека (HRSC)

Весь клинический контроль был выполнен персоналом ПН/КЕМ. Требования к переливанию определяли до и после инфузии из отчетов о переливании, полученных после приема любой единицы препарата крови. Единицы переливания используются только после получения согласия от больных и непосредственных близких родственников в качестве свидетелей. До переливания больному все препараты крови облучали в Мемориальной Больнице Тата (Tata Memorial Hospital). Больным также задавали вопросы относительно их самочувствия до и после инфузии перепрограммированных клеток. Все пациенты получили копию или первоначальные отчеты об их состояниях и всех лабораторных и клинических последствиях. Продолжительность наблюдения этих больных была первоначально установлена как 2 года, но была увеличена. В течение первого месяца после инфузии больных содержали в больнице в стерильных комнатах при давлении выше атмосферного.

Один миллион клеток был окрашен согласно инструкциям изготовителя со следующими панелями моноклональных антител (все от DakoCytomation):

Панель 1 состояла из изотипных коньюгатов негативного контроля IgGl-FITC, IgGl-PE-Cy5HlgGl-RPE;

Панель 2 состояла из человеческих анти-CD45-ПТС и CD34-RPE-Cy5;

Панель 3 состояла из человеческих анти-CD38-ПТС и CD34-RPE-Cy5;

Панель 4 состояла из CD61-FITC и CD34-RPE-Cy5;

Панель 5 состояла из CD33/13 RPE и CD7-FITC;

Панель 6 состояла из CD45 и Glycophorin-A-RPE;

Панель 7 состояла из CD3-FITC и CD19-RPE.

Анализ клеток выполняли с применением системы FACSCalibur (BD bioscience), используя программное обеспечение BD cell Quest.

Для кленового микроматричного анализа одноядерные клетки (MNC) костного мозга больного до и после инфузии перепрограммированных клеток были посеяны в среду метокульт GFH4434, дополненную рекомбинантными факторами роста согласно инструкциям изготовителя (Stem Cell Tehnjiogies). Дифференцирование в гематопоэтические колонии клеток было оценено и посчитано во времени, используя фазово-контрастную обращенную микроскопию.

Клинический анализ крови, ферменты печени и варианты гемоглобина больных непрерывно контролировали до и после процедуры. Поле оставления больницы больными клинический анализ крови, ферменты печени, варианты гемоглобина и кариотипирование периферической крови и G диапазон контролировала независимая лаборатория для целей переподтверждения. Эти тесты часто выполнялись после инфузии аутологических перепрограммированных клеток.

Образцы периферической крови и клетки костного мозга анализировались до и после инфузии аутологических перепрограммированных клеток. Этот тест повторяли через шестимесячные интервалы в течение первого года и ежегодно следующие 2 года после начала терапии аутологическими перепрограммированными стволовыми клетками. Кроме того, перепрограммированные клетки анализировали до инфузии, чтобы изучить стабильность клеток, анализ был также выполнен после 3-часовой стадии конверсии, так же как после культивирования преобразованных клеток в течение срока длиной максимум 1 месяц. Кариотипирование и G диапазон контролировала третья независимая лаборатория.

Мазки костного мозга и сечение трепанации выполняли до и после инфузии аутологических перепрограммированных клеток. Этот тест выполняли через 14-20 дней после инфузии аутологических перепрограммированных клеток и затем ежегодно.

Весь мазок и сечения трепанации сканировали, используя микроскоп, связанный с видеокамерой, до и после инфузии перепрограммированных стволовых клеток, чтобы оценить и контролировать приживление трансплантата.

Результаты

Все больные переносили аферез и единственную процедуру инфузии перепрограммированных стволовых клеток без неблагоприятных явлений. Больной А и больной D стали независимы от переливания после единственной инфузии перепрограммированных гематопоэтических стволовых клеток (RHSC) (см. таблицы 6 и 7). Приживление тромбоцитов, нейтрофилов и красных клеток крови последовало после 3 и 6 дней у больного А и больного D, соответственно. Включение эмбрионального гемоглобина отмечено у больного А и больного D (см. таблицы 4 и 5), но не у больного В и больного С (данные не показаны). До инфузии ферменты печени повысились у больного А и больного D, несмотря на отсутствие вируса гепатита С (HCV) (как измерено иммуноферментным твердофазным анализом (ELISA). Ферменты печени начинали нормализоваться после инфузии RHSC и достигали нормальных уровней через 4 года после инфузии RHSC. Больной В и больной С умерли через 2 года и шесть месяцев после инфузии, соответственно. Включение эмбрионального Hb отмечено у больных 001 и 004 (см. таблицы 6 и 7). Эти двое больных показали долговременное приживление трансплантата после единственной инфузии аутологического HRSC. Таб 7 4646

Проточная цитометрия аферезованных одноядерных клеток до и 3 часа после начала гематопоэтического перепрограммирования показаны на фиг.1. Число позитивных клеток CD34, генерированных после гематопоэтического перепрограммирования внесено в список в таблице 4. Представляющая проточная цитометрия аферезованных одноядерных клеток до и после гематопоэтического перепрограммирования показывает значительное увеличение числа положительных клеток CD34 с и без экспрессии CD45, CD38 и CD7 (фиг.1). При инфузии клетки CD34 циркулировали в периферической крови в течение 3-6 дней и затем дифференцировались на жизнеспособном уровне в миелоциты, как показывает значительное увеличение клеток, экспрессирующих CD33&13 с и без CD7, имеющих высокое переднее и боковое рассеяние (см. фиг.2). Эта модель перепрограммирования наблюдалась у всех больных.

Едва ли не любые колонии формировались из аспирата костного мозга больного до инфузии аутологических HRSC с последующим посевом в метилцеллюлозную клеточную культуру (см. фиг.3).

Клоновый микроматричный анализ только у больного В, страдающего от гипопластической анемии, показал подавленный гемопоэз. Однако, в течение 14-20 дней после инфузии все аспираты костного мозга, полученные от больных, давали начало нормальному уровню множества гематопоэтических колоний с умеренным ростом числа взрывообразующих единиц-эритроидов (BFU-erythroid). Мазки костного мозга и сечения трепанации (см. фиг.3) через 14-20 дней после инфузии аутологических HRSC показали значительное увеличение числа миелоцитов на различных стадиях дифференцирования со зрелыми и незрелыми мегакариоцитами у всех больных при сравнении с исходным показателем. Гиперплазия эритроидов на различных стадиях дифференцирования также замечена во всех образцах. Отсутствуют изменения в кариотипировании и характере G диапазона в периферической крови или образцах костного мозга, полученных до и после инфузии (у больного А и больного D в течение больше, чем 4 лет) аутологических HRSC у всех больных (см. фиг.4).

После инфузии аутологических HRSC больным апластической анемией примитивные (CD38 негативные) и коммитированные (CD38 позитивные) клетки CD34 циркулировали по периферийному кровообращению в течение трех дней до перепрограммирования в миелоциты (фиг.2). Приживление миелоидного трансплантата последовало в течение 3 дней после инфузии HRSC больному А, больному В и больному D. С другой стороны, приживление миелоидного трансплантата последовало на 20 день для больного 003 при анализе проточной цитометрией. Единственная инфузия HRSC, без использования любого режима предварительного кондиционирования, приводит к долгосрочному приживлению трансплантата у 2 из 4 больных апластической анемией. Больной А и больной В показали долгосрочное приживление трансплантата без какого-либо переливания после инфузии HRSC. Приживление трансплантата нейтрофилов, красных клеток крови и тромбоцитов у такого больного сопровождалось включением или увеличением уровня гемоглобина F (таблицы 6 и 7). Это не было замечено у других 2 больных, которые умерли. Включение HbF этим обоим больным подтверждает перепрограммирующие способности инфундированных HRSC в ювенильный фенотип Hb и, следовательно, приживление трансплантата и восстановление, как наблюдалось с трансплантатом стволовых клеток пуповинной крови (Elhasid et al., Leukemia 2000, 14; 931-934; Locatelli et al., Bone Marrow Transpant 1996,18: 1095-101).

Долговременное приживление трансплантата с сохранением числа хромосом и связывания отражает ясно безопасность инфузии HRSC в гематопоэтическом состоянии, где клональная эволюция не редкий случай в обычной терапии.

Важно, что аутологические HRSC способны к долгосрочному приживлению трансплантата, а коэффициент выживаемости в подгруппе тяжелых больных апластической анемией без использования какого-либо иммуноподавляющего режима, подобен коэффициентам, отмеченным для сингенных стволовых клеток.

Таким образом, спустя четырнадцать дней после инфузии, анализ костного мозга инфундированных больных показал увеличение насыщенности клетками костного мозга, и миелоидной, эритроидной и мегакариоцитной клеточными линиями на различных стадиях дифференцирования с понижением жировых и стромальных клеток, которые являются преобладающими жителями костного мозга с тяжелой апластической анемией. Имелось значительное увеличение массы красных клеток крови в костном мозге с соответствующим увеличением уровня гемоглобина, а также количества ретикулоцитов. Имелось также установившееся увеличение фетального гемоглобина - важного соединения в улучшении серповидно-клеточной анемии и бета-талассемии - и красных клеток крови, экпрессирующих фетальный гемоглобин, после инфузии. Кроме того, имелось значительное улучшение показателей красных клеток крови, как определено размером красных клеток крови, содержанием гемоглобина и концентрацией. Перепрограммированные клетки показали нормальный кариотип и генетическую стабильность после инфузии. Наконец, приживление трансплантата и долгосрочное вторичное заселение наблюдали у 3 больных, страдающих от апластической анемии.

Пример 2

Материалы и методы

Аутологические перепрограммированные гематопоэтические клетки (клетки-мишени) тестировали на 21 больном бета-талассемией. У девятнадцати больных была основная бета-талассемия и у 2 была промежуточная талассемия. Один из больных промежуточной бета-талассемией был вариантом талассемии/НЬЕ (обычным у больных дальневосточного и индийского происхождения), а другой имел талассемию/ серповидно-клеточную анемию.

Больные были аферезованы переработкой 2-3 раза их полного объема крови. Аутологические перепрограммированные клетки генерировали путем перепрограммирования белых клеток крови, до тех пор, пока клетки- мишени не были получены, как указывают их различные характеристики, как описано выше. Больным вводили аутологические перепрограммированные клетки путем внутривенной инфузии в шейную вену или вены руки или бедра.

Результаты

Никаких токсических или неблагоприятных побочных эффектов не наблюдалось после инфузии перепрограммированных клеток у больных бета-талассемией, как показал мониторинг основных показателей состояния организма, эхокардиограммы, плотности кости, ферментов печени и почек, включая кариотипирование и G диапазон, при сравнении с исходными показателями. Имелось статистически значительное среднее снижение (50%) требования переливания крови у больных главной бета-талассемией сейчас, почти 9 месяцев после инфузии перепрограммированных клеток, при сравнении с исходными показателями. Два больных талассемией, которая является промежуточной бета-талассемией (у одного была талассемия/HbE, а у другого талассемия/ серповидно-клеточная анемия) были независимы от переливания уже спустя почти 9 месяцев после инфузии перепрограммированных клеток.

Средний вес и высота после инфузии перепрограммированных клеток были значительно больше, по сравнению с исходным материалом, и размер органа у больных талассемией с увеличенной селезенкой и/или печенью был нормализован. Абсолютная средняя концентрация эмбрионального гемоглобина значительно увеличилась у больных главной и промежуточной талассемией после инфузии перепрограммированных клеток, если сравнивают с исходными показателями (фиг.5). Кроме того, средние показатели красных клеток крови, как отражено улучшением содержания гемоглобина размера красных клеток крови (фиг.6), и концентрация (фиг.7) была также значительно улучшена по сравнению с исходными показателями.

Наконец, средний ферритин сыворотки (биомаркер для избытка железа) значительно уменьшался у больных талассемией после инфузии перепрограммированных клеток (фиг.8). Избыток железа является главной причиной смертности и заболеваемости у больных талассемией; серповидно-клеточной анемией; и любым нарушением, вызванным избытком железа при переливании.

Пример 3

Материалы и методы

Двое больных диабетом были аферезованы переработкой 2-3 раза их полного объема крови. Аутологические перепрограммированные мезенхимные стволовые клетки, плюрипотенциальные стволовые клетки и островковые клетки (клетки-мишени) были получены путем перепрограммирования аферезованных белых клеток крови, до тех пор, пока клетки-мишени не развились, как показано их различными характеристиками как описано выше. Больным вводили аутологические перепрограммированные клетки путем внутривенной инфузии в шейную вену или вены руки или бедра.

Результаты

После инфузии аутологических перепрограммированных клеток больные синтезировали нормальный уровень инсулина, как измерено натощак и при приеме пищи в течение 90 минут, стимулированного с-пептидом. Этот нормальный уровень с-пептида поддерживается до 3 месяцев после инфузии перепрограммированных клеток (фиг.9). Кроме того, уровни HbAlC, которые указывают на гликемический контроль, нормализовались после инфузии перепрограммированных клеток (фиг.10). Например, больные с HbAlC выше 10% до инфузии имеют сейчас HbAlC 5,8% после получения перепрограммированных клеток. Кроме того, уровни глюкозы крови этих больных, как оказалось, достигают нормальных уровней после инфузии, при сравнении с исходными показателями. Кроме того, решительное снижение приема/ инъекции инсулина диабетическим пациентом было отмечено после инфузии перепрограммированных клеток.

Пример 4

Материалы и методы

Четверо больных амиотрофическим боковым склерозом (ALS) получали аутологические перепрограммированные клетки. Диагноз этой болезни не включает определенный биомаркер. Эту болезнь диагностируют клиническим исключением других подобных нарушений.

Больные были аферезованы переработкой 2-3 раза их полного объема крови. Аутологические перепрограммированные плюрипотенциальные стволовые клетки, эпителиальные клетки легочной альвеолы и нейроны (клетки-мишени) получали путем перепрограммирования аферезованных белых клеток крови, до тех пор, пока клетки-мишени не были получены, как указывают их различные характеристики, как описано выше. Больным вводили аутологические перепрограммированные клетки путем внутривенной инфузии в шейную вену или вены руки или бедра.

Результаты

У больных, страдающих от ALS и подвергшихся лечению аутологическими перепрограммированными клетками, имелось значительное улучшение по данным Легочного функционального теста (PFT). Повреждение по данным этого теста функции легкого является одной из причин, которые приводят к ранней смертности. Большинство больных испытывало меньшую тугоподвижность в конечностях и шее, и некоторые сообщали об улучшении речи. Другие показали улучшение способности ходить, а также поднимать голову.

Пример 5

Материалы и методы

Четыре пациента с болезнью Паркинсона были аферезованы переработкой 2-3 раза их полного объема крови. Аутологические перепрограммированные плюрипотенциальные стволовые клетки и нейроны (клетки-мишени) получали путем перепрограммирования аферезованных белых клеток крови, до тех пор, пока клетки-мишени не развились, как указывают их различные характеристики, как описано выше. Больным вводили аутологические перепрограммированные клетки путем внутривенной инфузии в шейную вену или вены руки или бедра.

Результаты

Больные, у которых такой эффект болезни, как дрожание ярко выражен, испытывали значительное снижение дрожания, и применялись обычные лекарственные средства, чтобы лечить это нарушение. Первый больной получал 4 таблетки Sinemet (регулятор допамина Синемет) ежедневно, а после переливания 4 месяца только 1 таблетку в день.

Пример 6

Материалы и методы

Двое больных с повреждением спинного мозга были аферезованы переработкой 2-3 раза их полного объема крови. Аутологические перепрограммированные плюрипотенциальные стволовые клетки и нейроны (клетки-мишени) получали путем перепрограммирования аферезованных белых клеток крови, до тех пор, пока клетки-мишени не развились, как указывают их различные характеристики, как описано выше. Больным вводили аутологические перепрограммированные клетки путем внутривенной инфузии в шейную вену или вены руки или бедра.

Результаты

Один пациент был потерян для отслеживания. Другой пациент был паралитиком с С5-С6 повреждением спинного мозга. Этот пациент был неспособен сидеть или вращать туловище в кровати. После лечения он был способен сидеть прямо в течение очень длинных промежутков времени и поворачивать свое тело в кровати. Он был также способен стоять один после установки его тела у стены. Далее, он был способен шевелить пальцем и сообщать ощущение в своем мочевом пузыре.

Анализ MRI (магнитное резонансное изображение) до и после инфузии перепрограммированных клеток показал слабое снижение размера повреждения после инфузии перепрограммированных клеток. Больной начал активно подвергаться физиотерапии и вообще чувствовал себя намного лучше, чем прежде.

Пример 7

Материалы и методы

Двух больных мышечной дистрофией (MD) лечили аутологическими перепрограммированными плюрипотенциальными стволовыми клетками, мезенхимными стволовыми клетками и клетками скелетных мышц (клетки-мишени), полученных путем перепрограммирования аферезованных белых клеток крови, до тех пор, пока клетки-мишени не развились, как указывают их различные характеристики, как описано выше.

Первый пациент был поражен MD мышц плечевого и тазового пояса, которая относится к классу MD, в котором мышцы наиболее тяжело поражаются, обычно, мышцы бедра и плечей, а второй больной был поражен немалиновой MD.

Больные были аферезованы переработкой 2-3 раза их полного объема крови. Аутологические перепрограммированные клетки получали путем перепрограммирования по изобретению. Больным вводили аутологические перепрограммированные клетки путем внутривенной инфузии в шейную вену или вены руки или бедра.

Результаты

Мышечная атрофия, связанная с MD, может быть измерена, контролируя уровень мышечного фермента креатинфосфокиназа (СРК). Этот фермент уменьшился в ответ на инфузию ретродифференцированных стволовых клеток (фиг.11). Лактатдегидрогеназа, фермент, который повышается во время отторжения ткани, также уменьшилась (фиг.11). Больные также испытывали снижение ферментов печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST), которые оба связаны с воспалением и повреждением клеток печени, а также скелетной мышцы.

Кроме того, больные показали улучшение подвижности, как определено из записи видеокамеры до и после инфузии перепрограммированных клеток, и в тесте на легочную функцию после инфузии перепрограммированных клеток, если сравнивают с исходными показателями.

Пример 8

Материалы и методы

Больных почечной болезнью лечили аутологическими перепрограммированными плюрипотенциальными стволовыми клетками, мезенхимными стволовыми клетками и клетками почки (клетки-мишени), полученными путем перепрограммирования аферезованных белых клеток крови, пока клетки-мишени не развились, как указывают их различные характеристики, как описано выше. Больных подвергали аферезу переработкой 2-3 раза их полного объема крови. Аутологические перепрограммированные клетки генерировали путем перепрограммирования в соответствии с изобретением. Больным вводили аутологические перепрограммированные клетки путем внутривенной инфузии в шейную вену или вены руки или бедра.

Результаты

Больные, получающие инфузию аутологических перепрограммированных клеток, испытывали улучшение уровней маркеров в различных флюидах, которые указывали на более здоровую почечную функцию, такую как выход мочи, креатинин сыворотки и азот мочевины крови (BUN) или UREA. Например, 75-летний мужчина, больной диабетом, показал улучшенную почечную функцию спустя 24 месяца после лечения аутологическими перепрограммированными клетками (см. таблицу 8). Больной показал увеличенные уровни гемоглобина, который является молекулой белка в красных клетках крови, которые переносят кислород, и инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), фактора роста. Больной также показал уменьшение мочевины, которая является органическим соединением, креатинина, который является продуктом деструкции креатинфосфата в мышцах, мочевой кислоты, которая является органическим соединением, выделяемым в моче, и фосфора, который является минералом, найденным в кости; высокое количество этих маркеров указывает на недостаточную почечную функцию. Далее, больной показал уменьшение гликозилированного гемоглобина (HbAlC), который является формой гемоглобина и обычно используется в качестве индикатора на концентрацию глюкозы плазмы у людей, страдающих диабетом.

Точно так же 51-летний мужчина-диабетик показал подобное улучшение спустя 12 месяцев после начала лечения (см. таблицу 8). Этот больной показал повышенные уровни гемоглобина и пониженные уровни креатинина, HbAlC, и азота мочевины крови (BUN), который является мерой количества азота в крови в форме мочевины.

Анализы по 12 больным, имеющим диабет II типа и подвергшихся лечению аутологическими перепрограммированными клетками, выявил пониженные уровни микроальбумина (фиг.13), которые связаны с утечкой альбумина в мочу и являются индикатором почечной болезни, а также дисфункции эндотелия сосудов и сердечнососудистой болезни. Эти 12 больных также испытывали пониженные уровни HbAlC (фиг.14).

Кроме того, 45-летняя женщина, больная аутоиммунным гломерулонефритом, показала улучшение почечной функции в пределах 18 месяцев после лечения аутологическими перепрограммированными клетками (см. таблицу 9).

Кроме того, 59-летняя женщина, больная терминальной стадией хронической почечной недостаточности, показала улучшение уровня креатинина, мочевины, уровня гемоглобина и паратиреоидного гормона (РТН) после лечения перепрограммированными клетками (см. таблицу 10). Маркер почечной функции выравнивается у 45-летней женщины, страдающей от аутоиммунной (аутоаллегической) болезни. Больной также снизили число сеансов гемодиализа, которые она посетила в месяц, от 12 до приблизительно 8 сеансов.

46-летний больной хронической почечной недостаточностью вследствие диабета также показал улучшение уровня креатинина, мочевины и уровня гемоглобина после лечения перепрограммированными клетками (см. таблицу 11). Больному также снизили число сеансов гемодиализа, которые он посетил в месяц, от 12 до приблизительно 5 сеансов, и уменьшили лечение эпоэтином альфа (EPREX®), вводимым подкожно, от 4000 единиц два раза в неделю до 4000 единиц один раз каждые две недели.

Пример 9

Материалы и методы

Больных рассеянным склерозом лечили аутологическими перепрограммированными плюрипотенциальными стволовыми клетками, мезенхимными стволовыми клетками и нейронами (клетки-мишени). Клетки-мишени получали путем перепрограммирования аферезованных белых клеток крови, пока клетки-мишени не развились, как указывают их различные характеристики, как описано выше. Больные были аферезованы переработкой 2-3 раза их полного объема крови. Аутологические перепрограммированные клетки генерировали путем перепрограммирования согласно изобретению. Больным вводили аутологические перепрограммированные клетки путем внутривенной инфузии в шейную вену или вены руки или бедра.

Результаты

Больные, которых лечили аутологическими перепрограммированными клетками, показали снижение поражения мозга и спинного мозга. Снижение поражения может происходить в пределах трех месяцев от начала получения лечения (фиг.15а-b). Снижение повреждения ткани мозга происходило в пределах шести месяцев (фиг.16а-b).

Больные, которых лечили аутологическими перепрограммированными клетками, также показали устранение поражений спинного мозга (фиг.17а-b). Далее, эти больные показали улучшение относительно оценки нетрудоспособности согласно расширенной шкале оценки состояния инвалидности по Куртцке (EDSS), показали ремиссию и не участвовали в обычной терапии до четырех лет после получения единственной инфузии.

Пример 10

Материалы и методы

Женщину, больную HIV, лечили аутологическими перепрограммированными гематопоэтическими стволовыми клетками. Больная была аферезована переработкой 2-3 раза ее полного объема крови. Клетки-мишени получали путем перепрограммирования аферезованных белых клеток крови, до тех пор, пока клетки-мишени не развились, как указывают их различные характеристики, как описано выше. Больной вводили аутологические перепрограммированные клетки путем внутривенной инфузии в шейную вену или вены руки или бедра.

Результаты

До лечения скриннинг-тест на антитела к HIV-1 и HIV-2 показал значение 3,68. Значения 1,0 или больше считаются положительными.

Спустя два месяца после начала лечения аутологическими перепрограммированными клетками значение теста на антитела к HIV-1 и HIV-2 было 0,46, что указывает, что больной не показывал положительный результат на HIV-1 и HIV-2. В шесть месяцев после начала лечения значение скриннинг-теста для HIV-1 и HIV-2 было 0,48, далее демонстрируя, что больной не показывал положительный результат на HIV.

Пример 11

Эффекты лечения аутологически перепрограммированными клетками продемонстрированы на больных, страдающих от других состояний и болезней. Клетки-мишени, внесенные в список здесь, были получены путем перепрограммирования аферезованных белых клеток крови, до тех пор, пока клетки-мишени не развились, как указывают их различные характеристики, как описано выше.

Застойная сердечная недостаточность

61-летнему мужчине, больному застойной сердечной недостаточностью, ввели аутологические перепрограммированные кардиомиоциты, плюрипотенциальные стволовые клетки, мезенхимные стволовые клетки и клетки эндотелия.

Лечение привело к улучшению фракции выброса (EF); уровней предшественника натрийуретического пептида мозга (Pro BNP), который является прогностическим фактором, связанным с болезнью коронарной артерии; уровней глюкозы крови натощак; и уровней HbAlC (см. таблицу 12). Кроме того, сердце, которое было ранее расширено, возвратилось к нормальному размеру, как показано в таблице 12 по уменьшению конечно-диастолического внутреннего размера левого желудочка (LVID/D), конечно-систолического внутреннего размера левого желудочка (LVID/S), и конечно-диастолической толщины внутрижелудочковой перегородки (IVSD), как измерено эхокардиограммой.

Гепатит С

Тринадцати больным с вирусом гепатита С (HCV) и имеющим бета-талассемию вводили инфузию аутологических перепрограммированных гематопоэтических клеток, плюрипотенциальных стволовых клеток, мезенхимных стволовых клеток и гепатоцитов. Эффекты лечения выявили понижение или выведение нагрузки HCV (см. таблицу 13), а также улучшенные маркеры крови (см. таблицу 14), такие как ферменты печени, билирубин, альбумин, протромбиновое время, и международное нормализованное отношение (для свертывания крови). В частности, больные испытали нормализацию ферментов печени аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотранфераы (AST), которые связаны с воспалением и повреждением клеток печени (фиг.18а-b).

Например, 44-летний мужчина, больной циррозом печени вследствие инфекции вирусом гепатита С, также показал положительную динамику ферментов печени аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотранфераы (AST), улучшение международного нормализованного отношения (для свертывания крови), билирубина и альбумина, а также случайно обнаруженного сахара в крови (см. таблицу 15). Фактически, этот пациент был на лечение альбумином до терапии перепрограммированными клетками, но не получал альбумин после терапии.

Травма головы

Больного с травмой головы после автомобильной катастрофы лечили инфузией аутологических перепрограммированных плюрипотенциальных стволовых клеток и нейронов. Лечение привело к восстановлению поврежденной мозговой ткани (фиг.19а-b), улучшению фракции выброса (EF); уровней предшественника натрийуретического пептида мозга (Pro BNP), который является прогностическим фактором, связанным с болезнью коронарной артерии; уровня глюкозы крови натощак; и уровней HbAlC (см. таблицу 10).

Болезнь легкого

Больного с ограниченной болезнью легкого, связанной с болезнью мотонейрона, лечили инфузией аутологических перепрограммированных плюрипотенциальных стволовых клеток, мезенхимных стволовых клеток, альвеолярных клеток эпителия, и клеток эндотелия. Через шесть месяцев после начала лечения вынужденная жизненная емкость (FVC), который является объемом воздуха, который может быть сильно выдохнут после полного вдоха, увеличилась от 50% до 71%, в то время как форсированный объем выдоха за 1 секунду (FEV1), который является объемом воздуха, который можно сильно выдохнуть за одну секунду, увеличился от 64% до 68%. Далее, отношение FEV1 к FVC, которое составляет приблизительно 75-80% у здоровых взрослых людей, уменьшилось от 100% до 82%. Рентгеновский снимок легких показал меньше затемненности полости легкого после лечения (фиг.20).

Менопауза

51-летней больной в менопаузе вводили инфузию аутологических перепрограммированных плюрипотенциальных стволовых клеток, плюрипотенциальных эмбриональных клеток и овоцитов. После лечения больной испытал увеличение различных гормонов и уровней белка, включая инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), esterdiaol, и липопротеин низкой плотности (LDL) (см. таблицу 16).

Депрессия

Больного с дероссией лечили инфузией аутологических перепрограммированных плюрипотенциальных стволовых клеток и нейронов. После лечения больной испытал увеличение различных гормонов и уровней белка, включая подобный инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), кортизол и тестостерон (см. таблицу 17).

Необструктивная азооспермия

Больного с необструктивной азооспермией лечили инфузией аутологических перепрограммированных плюрипотенциальных стволовых клеток, плюрипотенциальных эмбриональных клеток и спермы. После лечения больной испытал увеличение тестостерона в течение восьми месяцев (фиг.21).

Потеря зрения

Больного, страдающего от потери зрения вследствие доброкачественной опухоли, которая была удалена, лечили инфузией аутологических перепрограммированных плюрипотенциальных стволовых клеток и нейронами. После лечения больной испытал увеличенную чувствительность ретинали и улучшение зрения (фиг.22).

Таким образом, имея описанные подробно предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, нужно понимать, что изобретение, определенное вышеупомянутыми параграфами, не должно быть ограничено конкретными деталями, сформулированными в вышеупомянутом описании, так как много очевидных изменений возможны, не отступая от сущности или объема настоящего изобретения.

Реферат

Группа изобретений относится к области медицины и используется для восстановления и обновления клеток и ткани больного. Способ лечения различных болезней, нарушений и состояний больного включает получение коммитированных клеток афферизацией полного объема крови больного, перепрограммирование коммитированных клеток путем ретродифференцирования, редифференцирования или трансдифференцирования и введение перепрограммированных клеток больному путем внутривенной инфузии в шейную вену или вены руки или бедра. При этом перепрограммирование осуществляют путем контактирования коммитированных клеток с ретродифференцирующим агентом, представляющим собой моноклональное антитело из группы CR 3/43, TAL 1B5. Также раскрыта фармацевтическая композиция для восстановления или обновления ткани и клеток больного, которая содержит ретродифференцированные, редифференцированные или трансдифференцированные клетки и фармацевтически приемлемый носитель. Группа изобретений позволяет осуществлять лечение пациентов определенным типом или комбинацией типов перепрограммированных клеток от различных болезней и нарушений. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 22 ил., 17 табл., 11 пр.

Формула