Пептиды ube2t и содержащие их вакцины - RU2663350C2

Код документа: RU2663350C2

Чертежи

Показать все 26 чертежа(ей)

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

[0001] Настоящее изобретение относится к области биологической науки, более конкретно, к области терапии злокачественных опухолей. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые являются эффективными в качестве противораковых вакцин, а также к лекарственным средствам для лечения или профилактики опухолей или для того и другого.

[0002] Приоритет

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США №61/699550, зарегистрированной 11 сентября 2012 года, полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

[0003] Было продемонстрировано, что CD8-положительные цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) распознают пептиды-эпитопы, получаемые из опухолеассоциированных антигенов (TAA) на молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, а затем вызывают цитолиз этих опухолевых клеток. Со времени открытия семейства антигенов меланомы (MAGE) в качестве первого примера TAA, были обнаружены многие другие TAA, преимущественно посредством иммунологических подходов (NPL 1-2). В настоящее время некоторые из TAA находятся в клинической разработке в качестве иммунотерапевтических мишеней.

[0004] Для пролиферации и выживания злокачественных клеток необходимыми являются подходящие TAA. Использование таких TAA в качестве мишеней для иммунотерапии может минимизировать хорошо описанный риск ускользания от иммунологического надзора злокачественных клеток, свойственный для делеции, мутации и/или подавления ТАА, такой как последствие терапевтически запускаемой иммунной селекции. Таким образом, необходимо дальнейшее развитие идентификации новых TAA, способных индуцировать сильный и специфический противоопухолевый иммунный ответ, и, таким образом, продолжается клиническое применение стратегий пептидной вакцинации для различных типов злокачественных опухолей (NPL 3-10). К настоящему времени существует несколько публикаций о клинических исследованиях с использованием этих получаемых из ТАА пептидов. К сожалению, в этих испытаниях вакцин для злокачественных опухолей наблюдали только низкую частоту объективных ответов (NPL 11-13). Таким образом, остается необходимость в новых TAA в качестве иммунотерапевтических мишеней.

[0005] UBE2T (конъюгированный с убиквитином фермент E2T: типичная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 65; типичная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 64 (номер доступа GeneBank NM_014176)) представляет собой один из конъюгированных с убиквитином ферментов (E2). Опубликовано, что UBE2T является одним из генов, экспрессия которого повышается при стимуляции фибробластов человека сывороткой (NPL 14). В метаболическом пути анемии Фанкони UBE2T связывает FANCL и необходим для индуцированного повреждением ДНК моноубиквитинирования FANCD2 (NPL 15-16). В недавних исследованиях выявлено, что UBE2T часто активирован при раке молочной железы и взаимодействует и солокализуется с комплексом BRCA1/ассоциированный с BRCA1 домен белка RING (BARD1) (PTL 1, NPL 17). Анализ "нозерн"-блот в этих исследованиях выявил, что в линиях злокачественных клеток молочной железы транскрипт UBE2T детектировали на очень высоком уровне, но его почти не детектируют в жизненно важных органах. Кроме того, показано, что нокдаун эндогенного UBE2T в линиях злокачественных клеток посредством миРНК значимо подавляет рост этих линий клеток (PTL 1-2, NPL 17).

Список цитированных документов

Патентная литература

[PTL 1] W02005/029067

[PTL 2] W02009/001562

Непатентная литература

[NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993, 54(2): 177-80

[NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996, 183(3): 725-9

[NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996, 88(20): 1442-55

[NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999, 59(13): 3134-42

[NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999, 59(21): 5554-9

[NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996, 156(9): 3308-14

[NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997, 57(20): 4465-8

[NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999, 80(2): 169-72

[NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999, 81(3): 459-66

[NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999, 81(3): 387-94

[NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002, 20(20): 4169-80

[NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002, 188: 33-42

[NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004, 10(9): 909-15

[NPL 14] Iyer VR et al., Science 1999, 283: 83-7

[NPL 15] Machida YJ et al., Mol Cell 2006, 23: 589-96

[NPL 16] Alpi A et al., Mol Cell Biol 2007, 27: 8421-30

[NPL 17] Ueki T et.al., Cancer Res. 2009, 69: 8752-60

Сущность изобретения

[0008] Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на открытии новых пептидов, которые могут служить в качестве подходящих мишеней иммунотерапии. Поскольку ТАА, как правило, воспринимаются иммунной системой как "свое" и, таким образом, часто не имеют врожденной иммуногенности, обнаружение подходящих мишеней все еще является важным.

В связи с этим настоящее изобретение, по меньшей мере частично, относится к идентификации среди пептидов, полученных из UBE2T, специфических пептидов-эпитопов, которые способны индуцировать CTL, специфичные к UBE2T.

[0009] Результаты, описанные в настоящем описании, демонстрируют, что идентифицированные пептиды являются рестриктированными по HLA-A24- или HLA-A2 пептидами-эпитопами, которые могут индуцировать сильный и специфический иммунный ответ против экспрессирующих UBE2T клеток.

[0010] Таким образом, задачей настоящего изобретения является предоставление получаемых из UBE2T пептидов, которые можно использовать для индукции CTL in vitro, ex vivo или in vivo, или вводить индивидууму для индукции иммунного ответа против злокачественных опухолей, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль семенников. Предпочтительные пептиды являются нонапептидами и декапептидами, более предпочтительно нонапептидами и декапептидами, содержащими аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58. Из них особенно предпочтительными являются пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58.

[0011] Настоящее изобретение также относится к модифицированным пептидам, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58, в которых заменены, удалены, вставлены и/или добавлены одна, две или более аминокислот при условии, что получаемые модифицированные пептиды сохраняют необходимую способность к индукции CTL исходного немодифицированного пептида. В одном из вариантов осуществления, когда исходные пептиды представляют собой 9-мер (SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 29, 30, 32, 36, 38 и 41), размер модифицированного пептида предпочтительно находится в диапазоне от 9 до 40 аминокислот, например, в диапазоне от 9 до 20 аминокислоты, например, в диапазоне от 9 до 15 аминокислот. Подобным образом, когда исходные пептиды представляют собой 10-мер (SEQ ID NO: 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58), размер модифицированного пептида предпочтительно находится в диапазоне от 10 до 40 аминокислот, например, в диапазоне от 10 до 20 аминокислот, например, в диапазоне от 10 до 15 аминокислот.

[0012] Настоящее изобретение дополнительно включает выделенные полинуклеотиды, кодирующие любой из пептидов по настоящему изобретению. Эти полинуклеотиды можно использовать для индукции или получения антигенпрезентирующих клеток (APC), обладающих способностью к индукции CTL. Также как пептиды по настоящему изобретению, такие АРС можно вводить индивидууму для индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли.

[0013] При введении индивидууму пептиды по настоящему изобретению могут презентироваться на поверхности APC таким образом, чтобы индуцировать нацеливание CTL на соответствующие пептиды. Таким образом, одной из задач настоящего изобретения является предоставление средств или композиций, включающих один или более пептидов по настоящему изобретению или полинуклеотидов, кодирующих такие пептиды. Средство или композицию можно использовать для индукции CTL. Такие средства или композиции можно использовать для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли и/или предотвращении метастазирования или послеоперационного рецидива рака. Примеры злокачественных опухолей, предусматриваемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль семенников.

[0014] Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтические композиции или средства, которые содержат один или более пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению. Фармацевтическую композицию предпочтительно формулируют для применения в лечении и/или профилактике злокачественной опухоли и/или предотвращении ее метастазирования или послеоперационного рецидива. Наряду или в дополнение к пептидам или полинуклеотидам по настоящему изобретению фармацевтические средства и/или композиции по настоящему изобретению могут содержать в качестве активных ингредиентов APC и/или экзосомы, которые предоставляют любой из пептидов по настоящему изобретению.

[0015] Пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для индукции APC, которые презентируют на поверхности комплекс лейкоцитарного антигена человека (HLA) и пептида по настоящему изобретению, например, приведением APC, получаемых у индивидуума, в контакт с пептидом по настоящему изобретению или введением полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC. Такие APC имеют способность к индукции CTL, которые специфически распознают клетки, которые презентируют на поверхности пептиды-мишени и являются пригодными для иммунотерапии злокачественных опухолей. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам индукции APC со способностью к индукции CTL, а также APC, полученным такими способами.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к средствам или композициям для индукции APC со способностью индуцировать CTL, где такие средства или композиции включают любые пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению.

[0016] Дополнительной задачей настоящего изобретения является обеспечение способов индукции CTL, где такие способы предусматривают стадию совместного культивирования CD8-положительных Т-клеток с APC, которые презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению, стадию совместного культивирования CD8-положительных Т-клеток с экзосомами, презентирующими на их поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению, или стадию введения полинуклеотида, кодирующего субъединицы Т-клеточного рецептора (TCR), или полинуклеотидов, кодирующих каждую из субъединиц TCR, где TCR может связываться с комплексом пептида по настоящему изобретению и антигена HLA, презентированным на клеточной поверхности. CTL, получаемые такими способами, могут находить применение при лечении и/или профилактике злокачественных опухолей, примеры которых могут включать, но не ограничиваться ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль семенников. Таким образом, настоящее изобретение также относится к CTL, получаемым описанными выше способами.

[0017] Еще одной задачей настоящего изобретения является предоставление выделенных APC, которые презентируют на поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным CTL, которые направлены на пептиды по настоящему изобретению. Такие АРС и CTL можно использовать для иммунотерапии злокачественных опухолей. Такие CTL также можно определить как CTL, которые могут распознавать (или связываться) комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA на клеточной поверхности. Эти APC и CTL можно использовать для иммунотерапии злокачественных опухолей.

[0018] Еще одной задачей настоящего изобретения является предоставление способов индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли у нуждающегося в этом индивидуума, где такие способы включают стадию введения индивидууму средства или композиции, содержащих по меньшей мере один компонент, выбранный из пептида по настоящему изобретению или полинуклеотида, кодирующего его, APC или экзосомы, презентирующей его и CTL, которая может распознавать клетку, презентирующую пептид по настоящему изобретению на поверхности.

[0019] Один из аспектов настоящего изобретения относится к пептиду по настоящему изобретению или композиции, содержащей пептид по настоящему изобретению, для применения в качестве лекарственного средства.

Применимость настоящего изобретения распространяется на любое из ряда заболеваний, связанных со сверхэкспрессией UBE2T или возникающих в результате сверхэкспрессии UBE2T, такое как злокачественная опухоль, примеры которой включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль семенников.

[0020] Более конкретно, настоящее изобретение относится к следующему:

[1] Выделенный пептид, обладающий способностью к индукции цитотоксических T-лимфоцитов (CTL), где пептид содержит аминокислотную последовательность (a) или (b), ниже:

(a) аминокислотная последовательность иммунологически активного фрагмента UBE2T;

(b) аминокислотная последовательность, в которой в аминокислотной последовательности иммунологически активного фрагмента UBE2T заменены, введены, удалены и/или добавлены 1, 2 или более аминокислот,

где CTL, индуцируемые пептидом, обладают специфической цитотоксической активностью против клеток, которые презентируют фрагмент, получаемый из UBE2T.

[2] Пептид по [1], где пептид содержит аминокислотную последовательность (a) или (b), ниже:

(a) аминокислотная последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58;

(b) аминокислотная последовательность, в которой в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58, заменены, введены, удалены и/или добавлены 1, 2 или более аминокислот; размер модифицированного пептида предпочтительно находится в диапазоне от 9 до 40 аминокислот, например, в диапазоне от 9 до 20 аминокислот, например, в диапазоне от 9 до 15 аминокислот.

[3] Пептид по [2], где пептид представляет собой следующий олигопептид (i) или (ii):

(i) пептид, обладающий одной или обеими из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 27 заменена на фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан; и

(b) C-концевая аминокислота аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 27 заменена на фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин;

(ii) пептид, обладающий одной или обеими из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58 заменена на лейцин или метионин; и

(b) C-концевая аминокислота аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58 заменена на валин или лейцин.

[4] Пептид по любому из [1]-[3], где пептид представляет собой нонапептид или декапептид.

[5] Пептид по [4], где пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58.

[6] Выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из [1]-[5].

[7] Композиция для индукции CTL, где композиция содержит по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из:

(a) пептида по любому из [1]-[5];

(b) полинуклеотида по [6];

(d) экзосомы, которая презентирует на своей поверхности пептид по любому из [1]-[5].

[8] Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли и/или профилактики ее послеоперационного рецидива, где композиция содержит по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из:

(a) пептида по любому из [1]-[5];

(b) полинуклеотида по [6];

(d) экзосомы, которая презентирует на своей поверхности пептид по любому из [1]-[5]; и

(e) CTL, который может распознавать клетку, презентирующую пептид по любому из [1]-[5].

[9] Фармацевтическая композиция по [8], где фармацевтическую композицию формулируют для введения индивидууму, антиген HLA которого представляет собой HLA-A24 или HLA-A2.

[10] Способ индукции APC со способностью к индукции CTL, где способ включает стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(a) приведения APC в контакт с пептидом по любому из [1]-[5], и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из [1]-[5], в APC.

[11] Способ индукции CTL, где способ включает стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(a) совместного культивирования CD8-положительной T-клетки с APC, которая презентирует на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по любому из [1]-[5];

(b) совместного культивирования CD8-положительной T-клетки с экзосомой, которая презентирует на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по любому из [1]-[5]; и

(c) введения в CD8-положительную T-клетку полинуклеотида, кодирующего обе субъединицы TCR, или полинуклеотидов, кодирующих каждую из субъединиц TCR, где TCR, сформированный указанными субъединицами, способен связываться с комплексом пептида по любому из [1]-[5] и антигена HLA на клеточной поверхности.

[12] Выделенная APC, которая презентирует на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по любому из [1]-[5].

[13] APC по [12], которую индуцируют способом по [10].

[14] Выделенный CTL, который нацелен на пептид по любому из [1]-[5].

[15] CTL по [14], который индуцируют способом по [11].

[16] Способ индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли у индивидуума, где способ включает стадию введения индивидууму композиции, содержащей пептид по любому из [1]-[5] или полинуклеотид, кодирующий этот пептид.

[17] Антитело или его иммунологически активный фрагмент против пептида по любому из [1]-[5].

[18] Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид по любому из [1]-[5]; предпочтительно вектор адаптирован для экспрессии указанного пептида (обозначаемый как экспрессирующий вектор), например, кодирующая нуклеотидная последовательность встроена в вектор ниже промоторной последовательности и функционально связана с указанной промоторной последовательностью. Термин "функционально связан" предназначен для обозначения того, что нуклеотидная последовательность связана с промоторной последовательностью (регуляторной последовательностью) так, что это обеспечивает экспрессию нуклеотидной последовательности in vitro или в клетке-хозяин, в которую введен вектор.

[19] Клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная вектором по [18] или экспрессирующим вектором, описываемым в настоящем документе.

[20] Диагностический набор, содержащий пептид по любому из [1]-[5], полинуклеотид по [6] или антитело или иммунологически активный фрагмент по [17]; и

[21] способ скрининга пептида, обладающего способностью к индукции CTL, которые обладают специфической цитотоксической активностью против клеток, которые презентируют фрагмент, получаемый из UBE2T, где способ включает стадии:

(i) предоставления последовательности-кандидата, состоящей из аминокислотной последовательности, модифицированной заменой, удалением, встраиванием и/или добавлением одного, двух или более аминокислотных остатков к исходной аминокислотной последовательности, где исходная аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58;

(ii) отбора последовательности-кандидата, которая не обладает по существу значимой гомологией (или идентичностью последовательности) с пептидами, получаемыми из любых известных продуктов генов человека, отличных от UBE2T;

(iii) приведения пептида, состоящего из последовательности-кандидата, отобранной на стадии (ii), в контакт с антигенпрезентирующей клеткой

(iv) приведения антигенпрезентирующей клетки после стадии (iii) в контакт с CD8-положительной T-клеткой, и

(v) идентификации пептида, способность к индукции CTL которого является такой же, как у пептида, состоящего из исходной аминокислотной последовательности, или более высокой.

[22] Фармацевтическая композиция, содержащая пептид по любому из [1]-[5].

[23] Пептид по любому из [1]-[5] для применения в качестве лекарственного средства.

[24] Полинуклеотид по [6] или вектор по [18] для применения в качестве лекарственного средства.

[0021] В дополнение к указанному выше, другие задачи и признаки изобретения станут более понятными при чтении приведенного ниже подробного описания совместно с сопровождающими фигурами и примерами. Однако следует понимать, что как предыдущий раздел "Сущность настоящего изобретения", так и следующее ниже подробное описание являются только иллюстративными вариантами осуществления и не являются ограничивающими изобретение или другие альтернативные варианты осуществления изобретения.

[0022] В частности, хотя изобретение описано в настоящем описании со ссылкой на ряд конкретных вариантов осуществления, следует понимать, что описание является иллюстративным описанием изобретения, и его не следует понимать как ограничивающее изобретение. Специалисты в данной области могут находить различные модификации и применения, не выходя за рамки сущности и объема изобретения, как описано в прилагаемой формуле изобретения. Подобным образом, другие задачи, признаки, эффекты и преимущества будут очевидными из описанных ниже сущности изобретения и определенных вариантов осуществления, и специалист в данной области легко поймет их. Такие задачи, признаки, эффекты и преимущества изобретения станут понятны из указанного выше совместно с сопровождающими примерами, данными, фигурами и разумными выводами, извлеченными из них, отдельно или с рассмотрением включенных в настоящее описание ссылок.

Краткое описание чертежей

[0023] Различные аспекты и применения настоящего изобретения станут очевидными специалисту в данной области после рассмотрения краткого описания фигур и подробного описания настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, которые следуют далее.

[0024] [фиг. 1a-l] Фигура 1a-l состоит из ряда фотографий, (a)-(l), отображающих результаты анализа иммуноферментных пятен (ELISPOT) (IFN)-гамма на CTL, которые индуцировали пептидами, получаемыми из UBE2T. CTL в лунке №8, стимулируемые UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1) (a), №1, стимулируемые UBE2T-A24-9-45 (SEQ ID NO: 2) (b), №6, стимулируемые UBE2T-A24-9-133 (SEQ ID NO: 4) (c), №6, стимулируемые UBE2T-A24-9-138 (SEQ ID NO: 6) (d), №4, стимулируемые UBE2T-A24-9-43 (SEQ ID NO: 11) (e), №2, стимулируемые UBE2T-A24-9-106 (SEQ ID NO: 12) (f), №6, стимулируемые UBE2T-A24-9-3 (SEQ ID NO: 13) (g), №3, стимулируемые UBE2T-A24-9-105 (SEQ ID NO: 15) (h), №2, стимулируемые UBE2T-A24-10-130 (SEQ ID NO: 17) (i), №1, стимулируемые UBE2T-A24-10-131 (SEQ ID NO: 19) (j), №3, стимулируемые UBE2T-A24-10-133 (SEQ ID NO: 20) (k), и №6, стимулируемые UBE2T-A24-10-99 (SEQ ID NO: 21) (l), показали эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем, соответственно. Квадрат на лунке на этих изображениях означает, что клетки из соответствующей лунки размножали для получения линий CTL. В противоположность этому, в качестве характерного случая отрицательных данных, специфической продукции IFN-гамма CTL, стимулированными UBE2T-A24-9-124 (SEQ ID NO: 3) (r), не наблюдали. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами.

[0025] [фиг. 1m-r] Фигура 1m-r состоит из ряда фотографий, (m)-(r), отображающих результаты анализа иммуноферментных пятен (ELISPOT) (IFN)-гамма на CTL, которые индуцировали пептидами, получаемыми из UBE2T. CTL в лунке №7, стимулируемые UBE2T-A24-10-154 (SEQ ID NO: 22) (m), №8, стимулируемые UBE2T-A24-10-105 (SEQ ID NO: 23) (n), №1, стимулируемые UBE2T-A24-10-115 (SEQ ID NO: 24) (o), №4, стимулируемые UBE2T-A24-10-177 (SEQ ID NO: 25) (p) и №7, стимулируемые UBE2T-A24-10-44 (SEQ ID NO: 27) (q), показали эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем, соответственно. Квадрат на лунке на этих изображениях означает, что клетки из соответствующей лунки размножали для получения линий CTL. В противоположность этому, в качестве характерного случая отрицательных данных, специфической продукции IFN-гамма CTL, стимулированными UBE2T-A24-9-124 (SEQ ID NO: 3) (r), не наблюдали. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами.

[0026] [фиг. 2a-l] Фигура 2a-l состоит из ряда фотографий, (a)-(l), отображающих результаты анализа ELISPOT на CTL, которые индуцировали пептидами, получаемыми из UBE2T. CTL в лунке №4, стимулируемые UBE2T-A02-9-107 (SEQ ID NO: 29) (a), №5, стимулируемые UBE2T-A02-9-30 (SEQ ID NO: 30) (b), №7, стимулируемые UBE2T-A02-9-106 (SEQ ID NO: 32) (c), №5, стимулируемые UBE2T-A02-9-49 (SEQ ID NO: 36) (d), №3, стимулируемые UBE2T-A02-9-13 (SEQ ID NO: 38) (e), №4, стимулируемые UBE2T-A02-9-132 (SEQ ID NO: 41) (f), №6, стимулируемые UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48) (g), №7, стимулируемые UBE2T-A02-10-6 (SEQ ID NO: 49) (h), №8, стимулируемые UBE2T-A02-10-106 (SEQ ID NO: 51) (i), №2, стимулируемые UBE2T-A02-10-102 (SEQ ID NO: 52) (j), №1, стимулируемые UBE2T-A02-10-30 (SEQ ID NO: 53) (k), и №8, стимулируемые UBE2T-A02-10-101 (SEQ ID NO: 55) (l), показали эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем, соответственно. Квадрат на лунке на этих изображениях означает, что клетки из соответствующей лунки размножали для получения линий CTL. В противоположность этому, в качестве характерного случая отрицательных данных, специфической продукции IFN-гамма CTL, стимулированными UBE2T-A02-9-161 (SEQ ID NO: 28) (o), не наблюдали. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами.

[0027] [фиг. 2m-o] Фигура 2m-o состоит из ряда фотографий, (m)-(o), отображающих результаты анализа ELISPOT на CTL, которые индуцировали пептидами, получаемыми из UBE2T. CTL в лунке №5, стимулируемые UBE2T-A02-10-29 (SEQ ID NO: 56) (m) и №3, стимулируемые UBE2T-A02-10-38 (SEQ ID NO: 58) (n), показали эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем, соответственно. Квадрат на лунке на этих изображениях означает, что клетки из соответствующей лунки размножали для получения линий CTL. В противоположность этому, в качестве характерного случая отрицательных данных, специфической продукции IFN-гамма CTL, стимулированными UBE2T-A02-9-161 (SEQ ID NO: 28) (o), не наблюдали. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами.

[0028] [фиг. 3] Фигура 3 состоит из ряда линейных графиков, (a)-(d), отображающих продукцию IFN-гамма линиями CTL, стимулируемыми UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1) (a), UBE2T-A24-9-45 (SEQ ID NO: 2) (b), UBE2T-A24-9-3 (SEQ ID NO: 13) (c) и UBE2T-A24-10-44 (SEQ ID NO: 27) (d). Количество IFN-гамма, который продуцировали CTL, измеряли твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) для IFN-гамма. Результаты демонстрируют, что линии CTL, получаемые стимуляцией каждым пептидом, демонстрируют эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами. Отношение R/S означает отношение числа иммунокомпетентных клеток (линии CTL) к клеткам-стимуляторам.

[0029] [фиг. 4] Фигура 4 состоит из ряда линейных графиков, (a)-(c), отображающих продукцию IFN-гамма клонами CTL, получаемыми лимитирующим разведением из линий CTL, стимулированных UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1) (a), UBE2T-A24-9-45 (SEQ ID NO: 2) (b) и UBE2T-A24-9-3 (SEQ ID NO: 13) (c). Результаты демонстрируют, что клоны CTL, получаемые стимуляцией каждым пептидом, демонстрируют эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами. Отношение R/S означает отношение числа иммунокомпетентных клеток (клона CTL) к клеткам-стимуляторам.

[0030] [фиг. 5] Фигура 5 состоит из ряда линейных графиков, (a)-(e), отображающих продукцию IFN-гамма линиями CTL, стимулируемыми UBE2T-A02-9-107 (SEQ ID NO: 29) (a), UBE2T-A02-9-13 (SEQ ID NO: 38) (b), UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48) (c), UBE2T-A02-10-102 (SEQ ID NO: 52) (d) и UBE2T-A02-10-101 (SEQ ID NO: 55) (e). Количество IFN-гамма, который продуцировали CTL, измеряли посредством ELISA для IFN-гамма. Результаты демонстрируют, что линии CTL, получаемые стимуляцией каждым пептидом, демонстрируют эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами. Отношение R/S означает отношение числа иммунокомпетентных клеток (линии CTL) к клеткам-стимуляторам.

[0031] [фиг. 6] Фигура 6 состоит из ряда линейных графиков, (a)-(e), отображающих продукцию IFN-гамма клонами CTL, получаемыми лимитирующим разведением из линий CTL, стимулированных UBE2T-A02-9-107 (SEQ ID NO: 29) (a), UBE2T-A02-9-13 (SEQ ID NO: 38) (b), UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48) (c), UBE2T-A02-10-102 (SEQ ID NO: 52) (d) и UBE2T-A02-10-101 (SEQ ID NO: 55) (e). Результаты демонстрируют, что клоны CTL, получаемые стимуляцией каждым пептидом, демонстрируют эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами. Отношение R/S означает отношение числа иммунокомпетентных клеток (клона CTL) к клеткам-стимуляторам.

[0032] [фиг. 7] Фигура 7 представляет собой линейный график, изображающий специфическую активность CTL против клеток-мишеней, которые экспрессируют UBE2T и HLA-A*2402. В качестве контроля получали клетки COS7, трансфицированные HLA-A*2402 или полноразмерным геном UBE2T. Клон CTL, получаемый с использованием UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1), демонстрировал специфическую активность CTL против клеток COS7, трансфицированных UBE2T и HLA-A*2402 (черный ромб). С другой стороны, не детектировали значимой специфической активности CTL против клеток COS7, трансфицированных HLA-A*2402 (треугольник) или UBE2T (круг).

[0033] [фиг. 8] Фигура 8 представляет собой линейный график, изображающий специфическую активность CTL против клеток-мишеней, которые экспрессируют UBE2T и HLA-A*0201. В качестве контроля получали клетки COS7, трансфицированные HLA-A*0201 или полноразмерным геном UBE2T. Линия CTL, получаемая с использованием UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48), демонстрировала специфическую активность CTL против клеток COS7, трансфицированных UBE2T и HLA-A*0201 (черный ромб). С другой стороны, не детектировали значимой специфической активности CTL против клеток COS7, трансфицированных HLA-A*0201 (треугольник) или UBE2T (круг).

Описание вариантов осуществления

[0034] Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем описании, можно использовать в практике или тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения, теперь описываются предпочтительные способы, устройства и материалы. Однако перед описанием этих материалов и способов следует понимать, что эти описания являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения. Также следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается описанными в настоящем описании конкретными размерами, формами, размерностями, методологиями, протоколами и т.д., так как они могут варьироваться в соответствии с рутинным экспериментированием и оптимизацией. Также следует понимать, что терминология, используемая в описании, предназначена только для цели описания конкретных версий или вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.

Описание каждой публикации, патента или заявки на патент, указанные в этом описании изобретения, конкретно полностью включено в настоящем описании посредством ссылки. Однако ничто в настоящем описании не следует понимать как признание того, что это изобретение не дает права на датирование задним числом такого раскрытия на основании предыдущего изобретения.

[0035] Если нет другого определения, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же самое значение, что и значение, как правило, понимаемое специалистом в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. В случае противоречия, данное описание изобретения, в том числе определения, будет служить контролем. Кроме того, эти материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

[0036] I. Определения

Как используют в настоящем описании, если конкретно не указано иное, термины в форме единственного числа означают "по меньшей мере один".

Термины "выделенный" и "очищенный", используемые в отношении вещества (например, пептида, антитела, полинуклеотида и т.д.), указывают, что вещество является по существу свободным от по меньшей мере одного вещества, которое может еще содержаться в природном источнике. Таким образом, выделенным или очищенным пептидом называют пептид, который по существу не содержит клеточный материал, такой как углевод, липид или другие загрязняющие белки из источника клеток или ткани, из которого получен пептид, или по существу не содержит химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе. Термин "по существу не содержит клеточный материал" включает препараты пептида, в которых пептид отделен от клеточных компонентов тех клеток, из которых он изолирован или рекомбинантно получен. Таким образом, пептид, который по существу не содержит клеточный материал, включает препараты полипептида, содержащие менее чем приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (в расчете на сухую массу) гетерологичного белка (также называемого "загрязняющим белком"). При рекомбинантно получаемом пептиде, он также предпочтительно по существу не содержит культуральной среды, которая включает препараты пептида с культуральной средой в количестве приблизительно 20%, 10% или 5% объема этого пептидного препарата. При получении пептида химическим синтезом, он предпочтительно по существу не содержит химических предшественников или других химических веществ, включающих препараты пептида с химическими предшественниками или другими химическими веществами, участвующими в синтезе этого пептида, в количестве менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% (в расчете на сухую массу) объема этого пептидного препарата. То, что конкретный пептидный препарат содержит выделенный или очищенный пептид, может быть показано, например, появлением единственной полосы после электрофореза препарата белка в (ДСН)-полиакриламидном геле и окрашиванием Кумасси бриллиантовым синим или т.п. этого геля. В одном предпочтительном варианте осуществления пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению являются выделенными или очищенными.

[0037] Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в настоящем описании взаимозаменяемо для ссылки на полимер аминокислотных остатков. Термины применяют к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков могут представлять собой модифицированный остаток(и) или не встречающийся в природе остаток, такой как искусственный химический миметик(и) соответствующей встречающейся в природе аминокислоты(от), а также к встречающимся в природе полимерам аминокислот.

[0038] Как используют в настоящем документе, термин "олигопептид" относится к пептиду, который состоит из 20 аминокислотных остатков или менее, как правило, 15 аминокислотных остатков или менее. Как используют в настоящем документе, термин "нонапептид" относится к пептиду, который состоит из 9 аминокислотных остатков, а термин "декапептид" относится к пептиду, который состоит из 10 аминокислотных остатков.

[0039] Термин "аминокислота" в данном контексте относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также аминокислотным аналогам и миметикам аминокислот, которые функционируют сходно с встречающимися в природе аминокислотами. Аминокислоты могут представлять собой L-аминокислоты или D-аминокислоты. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые в генетическом коде, а также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и О-фосфосерин). Фраза "аналог аминокислот" относится к соединениям, которые имеют одну и ту же базовую химическую структуру (альфа-углерод, связанный с водородом, карбоксигруппу, аминогруппу и R-группу), что и встречающаяся в природе аминокислота, но имеют модифицированную R-группу или модифицированные скелеты макромолекулы (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионинметилсульфоний). Фраза "миметики аминокислот" относится к химическим соединениям, которые имеют отличающиеся структуры, но сходные с основными аминокислотами функции.

Аминокислоты в настоящем описании могут быть обозначены их общеизвестными трехбуквенными символами или однобуквенными символами, рекомендуемыми IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.

[0040] Термины "полинуклеотид", "олигонуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используются в настоящем документе взаимозаменяемо и, если конкретно не указано иное, называются с использованием их общепринятых однобуквенных кодов.

[0041] Термины "средство", "вещество" и "композиция" используются в настоящем описании взаимозаменяемо в отношении продукта, который содержит указанные ингредиенты в указанных количествах, а также любого продукта, который происходит прямо или косвенно из комбинации указанных ингредиентов в указанных количествах. Такой термин при использовании в отношении модификации "фармацевтической" (как в "фармацевтическом средстве" и "фармацевтической композиции") предназначен включать продукт, в том числе активный ингредиент(ы) и инертный ингредиент(ы), которые составляют этот носитель, а также любой продукт, который происходит прямо или косвенно из объединения, комплексообразования или агрегации любых двух или более ингредиентов, или из диссоциации одного или более ингредиентов, или из других типов реакций или взаимодействий одного или более ингредиентов. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термины "фармацевтическое средство" и "фармацевтическая композиция" относятся к любому продукту, получаемому смешиванием молекулы или соединения по настоящему изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемого носителя.

[0042] Термин "активный ингредиент" в настоящем описании относится к веществу в средстве или композиции, которое является биологически или физиологически активным. В частности, в контексте фармацевтического средства или композиции, термин "активный ингредиент" относится к веществу, которое проявляет объективный фармакологический эффект. Например, в случае фармацевтических средств или композиций для использования в лечении или профилактике злокачественной опухоли, активные ингредиенты в средствах или композициях могут приводить по меньшей мере к одному биологическому или физиологическому действию на злокачественные клетки и/или ткани прямо или опосредованно. Предпочтительно, такое действие может включать уменьшение или ингибирование роста злокачественных клеток, повреждение или цитолиз злокачественных клеток и/или тканей и т.д. Как правило, непрямыми действиями активных ингредиентов являются индукция CTL, распознающих или вызывающих цитолиз злокачественных клеток. Перед составлением "активный ингредиент" может также называться "основной массой", "лекарственным веществом" или "техническим продуктом".

[0043] Фраза "фармацевтически приемлемый носитель" или "физиологически приемлемый носитель", как используют в настоящем описании, означает фармацевтически или физиологически приемлемый материал, композицию, вещество или носитель, включая, но, не ограничиваясь ими, жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель и инкапсулирующий материал.

[0044] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению находят конкретное применение в качестве вакцин. В контексте настоящего изобретения термин "вакцина" (также обозначаемая как "иммуногенная композиция") относится к средству или композиции, которые обладают действием улучшать, усиливать и/или индуцировать противоопухолевый иммунитет после инокуляции животным.

[0045] Если не указано иначе, термин "злокачественная опухоль" относится к злокачественным опухолям или опухолям, в которых сверхэкспрессируется ген UBE2T, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль семенников.

[0046] Если не указано иное, термины "цитотоксический Т-лимфоцит", "цитотоксическая Т-клетка" и "CTL" используются в настоящем описании взаимозаменяемо и, если не указано иное, относятся к подгруппе Т-лимфоцитов, которые способны распознавать не-свои клетки (например, опухолевые клетки, инфицированные вирусом клетки) и индуцировать гибель таких клеток.

[0047] Если не указано иное, термин "HLA-A24", как используют в настоящем документе, репрезентативно относится к подтипам, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, HLA-A*2401, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2404, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2420, HLA-A*2425 и HLA-A*2488.

[0048] Если не указано иное, термин "HLA-A2", в данном контексте, относится репрезентативно к подтипам, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0213, HLA-A*0216, HLA-A*0218, HLA-A*0219, HLA-A*0228 и HLA-A*0250.

[0049] Если не указано иное, термин "набор" используется в данном контексте по отношению к комбинации реагентов и других материалов. В настоящем описании предусматривается, что набор может содержать микроэррей (микрочип), чип, маркер и т.д. Не предполагают, что термин "набор" ограничен конкретной комбинацией реагентов и/или материалов.

[0050] Как используют в настоящем описании, по отношению к индивидууму или пациенту фраза "HLA-антигеном индивидуума (или пациента) является HLA-А24 или HLA-А2" относится к индивидууму или пациенту, гомозиготно или гетерозиготно имеющему ген антигена HLA-А24 или HLA-A2, и антиген HLA-А24 или антиген HLA-A2-антиген экспрессируется в клетках этого индивидуума или пациента в виде HLA-антигена.

[0051] В тех случаях, когда способы и композиции по настоящему изобретению находят применение для "лечения" злокачественной опухоли, лечение считается "эффективным", если оно приводит к клинической эффективности, уменьшению размера, распространенности или метастатического потенциала злокачественной опухоли у индивидуума, увеличению времени выживания, подавлению послеоперационного рецидива рака и т.д. При профилактическом применении лечения "эффективное" означает, что лечение замедляет или предотвращает возникновение злокачественной опухоли или предотвращает или облегчает клинический симптом злокачественной опухоли. Эффективность определяют любым известным способом диагностики или лечения конкретного типа опухоли.

[0052] В тех случаях, когда способы и композиции по настоящему изобретению находят применение для "предотвращения" и "профилактики" злокачественной опухоли, такие термины в настоящем описании используются взаимозаменяемо в отношении любой активности, которая уменьшает смертность и заболеваемость, связанные с заболеванием. Предотвращение и профилактика могут проходить "на первичном, вторичном и третичном уровнях предотвращения". В то время как первичные предотвращение и профилактика устраняют возможность развития заболевания, вторичный и третичный уровни предотвращения и профилактики включают активности, направленные на предотвращение и профилактику прогрессирования заболевания и появления симптомов, а также уменьшение отрицательного действия уже установившегося заболевания посредством восстановления функции и уменьшения связанных с заболеванием осложнений. Альтернативно, предотвращение и профилактика могут включать в себя широкий диапазон профилактических способов лечения, направленных на облегчение тяжести конкретного нарушения, например, уменьшение пролиферации и метастазирования опухолей.

[0053] В контексте настоящего изобретения лечение и/или профилактика злокачественной опухоли и/или профилактика послеоперационного рецидива рака включают любую активность, которая приводит к следующим событиям, таким как хирургическое удаление злокачественных клеток, ингибирование роста злокачественных клеток, инволюция или регресс опухоли, индукция ремиссии и подавление частоты возникновения злокачественной опухоли, регрессия опухоли и снижение или ингибирование метастазирования, подавление послеоперационного рецидива рака и увеличение времени выживания. Эффективное лечение и/или профилактика злокачественной опухоли уменьшает смертность и улучшает прогноз у индивидуумов, страдающих злокачественной опухолью, снижает уровни опухолевых маркеров в крови и ослабляет детектируемые симптомы, сопутствующие злокачественной опухоли. Например, эффективное лечение включает уменьшение или улучшение симптомов, и/или профилактика включает 10%, 20%, 30% или большее уменьшение или достижение стабильного состояния заболевания.

[0054] В контексте настоящего изобретения термин "антитело" относится к иммуноглобулинам и их фрагментам, которые являются специфически реактивными в отношении указанного белка или его пептида. Антитело может включать антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела, антитела, слитые с другими белками или радиоактивными метками, и фрагменты антител. Кроме того, антитело в настоящем описании используется в самом широком смысле и конкретно охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител и фрагментов антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. "Антитело" означает все классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM).

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же самое значение, что и значение, как правило, понимаемое специалистом в области, к которой принадлежит настоящее изобретение.

[0055] II. Пептиды

Пептиды по настоящему изобретению, описанные подробно ниже, могут называться "пептидом(ами) UBE2T" или "полипептидом(ами) UBE2T".

[0056] Для демонстрации того, что пептиды, получаемые из UBE2T, функционируют как антиген, распознаваемый CTL, пептиды, получаемые из UBE2T (SEQ ID NO: 65), анализировали для определения, являлись ли они антигенными эпитопами, рестриктированными по HLA-A24 или HLA-А2, с которыми, как правило, встречаются аллели HLA (Date Y. et al., Tissue Antigens, 47: 93-101, 1996; Kondo A. et al., J. Immunol., 155: 4307-12, 1995; Kubo R.T. et al., J. Immunol., 152: 3913-24, 1994).

[0057] Кандидаты HLA-A24-связывающих пептидов, получаемых из UBE2T, идентифицировали на основании их аффинностей связывания с HLA-А24. Идентифицированы следующие пептиды-кандидаты: SEQ ID NO: 1, 2 и 4-27.

Кроме того, после стимуляции in vitro T-клеток дендритными клетками (DC), активированными (нагруженными) этими пептидами, CTL успешно получали с использованием следующих пептидов:

UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1), UBE2T-A24-9-45 (SEQ ID NO: 2), UBE2T-A24-9-133 (SEQ ID NO: 4), UBE2T-A24-9-138 (SEQ ID NO: 6), UBE2T-A24-9-43 (SEQ ID NO: 11), UBE2T-A24-9-106 (SEQ ID NO: 12), UBE2T-A24-9-3 (SEQ ID NO: 13), UBE2T-A24-9-105 (SEQ ID NO: 15), UBE2T-A24-10-130 (SEQ ID NO: 17), UBE2T-A24-10-131 (SEQ ID NO: 19), UBE2T-A24-10-133 (SEQ ID NO: 20), UBE2T-A24-10-99 (SEQ ID NO: 21), UBE2T-A24-10-154 (SEQ ID NO: 22), UBE2T-A24-10-105 (SEQ ID NO: 23), UBE2T-A24-10-115 (SEQ ID NO: 24), UBE2T-A24-10-177 (SEQ ID NO: 25) и UBE2T-A24-10-44 (SEQ ID NO: 27).

[0058] Кандидаты HLA-A2-связывающих пептидов, получаемых из UBE2T, идентифицировали на основании их аффинностей связывания с HLA-A2. Идентифицированы следующие пептиды-кандидаты: SEQ ID NO: 29 до 63.

UBE2T-A02-9-107 (SEQ ID NO: 29), UBE2T-A02-9-30 (SEQ ID NO: 30), UBE2T-A02-9-106 (SEQ ID NO: 32), UBE2T-A02-9-49 (SEQ ID NO: 36), UBE2T-A02-9-13 (SEQ ID NO: 38), UBE2T-A02-9-132 (SEQ ID NO: 41), UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48), UBE2T-A02-10-6 (SEQ ID NO: 49), UBE2T-A02-10-106 (SEQ ID NO: 51), UBE2T-A02-10-102 (SEQ ID NO: 52), UBE2T-A02-10-30 (SEQ ID NO: 53), UBE2T-A02-10-101 (SEQ ID NO: 55), UBE2T-A02-10-29 (SEQ ID NO: 56) и UBE2T-A02-10-38 (SEQ ID NO: 58).

[0059] Эти получаемые CTL демонстрируют сильную специфическую CTL-активность против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующими пептидами. Эти приводимые в настоящем документе результаты демонстрируют, что UBE2T является антигеном, распознаваемым CTL, и что приведенные выше пептиды являются пептидами-эпитопами UBE2T, рестриктированными по HLA-А24 или HLA-A2.

[0060] Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления пептиды с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 27 можно использовать для индукции CTL у индивидуума, который до индукции идентифицирован, как имеющий HLA-A24. Подобным образом, пептиды с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58 можно использовать для индукции CTL у индивидуума, который до индукции идентифицирован, как имеющий HLA-A2.

[0061] Поскольку ген UBE2T сверхэкспрессируется в злокачественных клетках и тканях, включающих, например, клетки и ткани рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярной карциномы, CML, колоректального рака, рака пищевода, рака желудка, рака желудка диффузного типа, NSCLC, лимфомы, остеосаркомы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, SCLC, опухоли мягких тканей и опухоли семенников, и не экспрессируется в большинстве нормальных органов, он представляет собой хорошую мишень для иммунотерапии. Таким образом, настоящее изобретение относится к нонапептидам (пептидам, состоящим из девяти аминокислотных остатков) и декапептидам (пептидам, состоящим из десяти аминокислотных остатков), соответствующим CTL-распознаваемым эпитопам из UBE2T. Альтернативно, настоящее изобретение относится к выделенным пептидам, которые могут индуцировать CTL, где пептид состоит из иммунологически активного фрагмента UBE2T. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептидам, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58. В предпочтительных вариантах осуществления пептиды по настоящему изобретению представляют собой нонапептиды или декапептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58. Предпочтительные примеры пептидов по настоящему изобретению включают пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58.

[0062] Пептиды по настоящему изобретению, в частности, нонапептиды и декапептиды по настоящему изобретению, могут быть фланкированы дополнительными аминокислотными остатками при условии, что получаемые пептиды сохраняют свою способность к индукции CTL. Конкретные дополнительные аминокислотные остатки могут состоять из любого типа аминокислот при условии, что они не уменьшают способность к индукции CTL исходного пептида. Таким образом, настоящее изобретение также относится к пептидам, обладающим способностью к индукции CTL, в частности пептидам, получаемым из UBE2T (например, пептидам, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58). Такие пептиды содержат, например, менее приблизительно 40 аминокислот, часто даже менее приблизительно 20 аминокислот, как правило, приблизительно менее 15 аминокислот. Более конкретно, размер каждого пептида предпочтительно находится в диапазоне от 10 до 40 аминокислот, например, в диапазоне от 10 до 20 аминокислот, например, в диапазоне от 10 до 15 аминокислот.

[0063] Как правило, известно, что модификация одной, двух или более аминокислот в пептиде не влияет на функцию этого пептида или, в некоторых случаях, даже увеличивает желаемую функцию исходного пептида. Фактически, известно, что модифицированные пептиды (т.е. пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, в которой 1, 2 или более аминокислотных остатков были модифицированы (т.е. являются замененными, добавленными, удаленными и/или введенными) по сравнению с исходной эталонной последовательностью) сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81:5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res., 1982, 10:6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 79:6409-13). Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пептиды по настоящему изобретению обладают способностью к индукции CTL и содержат аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58, в которой одна, две или более аминокислот являются добавленными, удаленными, введенными и/или замененными. Другими словами, пептиды по настоящему изобретению обладают способностью к индукции CTL и содержат аминокислотную последовательность, в которой одна, две или более аминокислот являются замененными, удаленными, введенными и/или добавленными в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58, при условии, что модифицированные пептиды сохраняют способность к индукции CTL исходного пептида.

[0064] Специалистам в данной области понятно, что индивидуальные модификации (т.е. удаления, введения, добавления или замены) аминокислотной последовательности, которые изменяют одну аминокислоту или небольшой процент от всей аминокислотной последовательности, как правило, приводит к сохранению свойств боковой цепи исходной аминокислоты. Таким образом, они традиционно называются "консервативными заменами" или "консервативными модификациями", в которых изменение белка приводит к белку со сходными с исходным белком функциями. Таблицы консервативных замен, предоставляющих функционально сходные аминокислоты, известны в данной области. Примеры характеристик боковых цепей аминокислот, которые желательно сохранять, включают, например, гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) и боковые цепи, имеющие следующие функциональные группы или характеристики в целом: алифатическую боковую цепь (G, A, V, L, I, P); гидроксильную группу, содержащую боковую цепь (S, T, Y); атом серы, содержащий боковую цепь (C, M); карбоксильную кислоту и амидсодержащую боковую цепь (D, N, E, Q); содержащую основание боковую цепь (R, K, H) и содержащую ароматическую группу боковую цепь (H, F, Y, W). Кроме того, каждые из следующих восьми групп содержат аминокислоты, которые являются приемлемыми в области консервативными заменами друг для друга:

1) аланин (A), глицин (G);

2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);

3) аспарагин (N), глутамин (Q);

4) аргинин (R), лизин (K);

5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V);

6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W);

7) серин (S), треонин (T); и

8) цистеин (C), метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins 1984).

[0065] Считается также, что такие консервативно модифицированные пептиды являются пептидами по настоящему изобретению. Однако пептиды по настоящему изобретению не ограничиваются ими и могут содержать неконсервативные модификации при условии, что получаемый модифицированный пептид сохраняет требуемую способность к индукции CTL исходного немодифицированного пептида. Кроме того, модифицированные пептиды не должны исключать способные к индукции CTL пептиды, получаемые из полиморфных вариантов, межвидовых гомологов и аллелей UBE2T.

[0066] Аминокислотные остатки можно вводить, заменять и/или добавлять к пептидам по настоящему изобретению, или, альтернативно, аминокислотные остатки можно удалять из них для получения более высокой аффинности связывания. Для сохранения необходимой способности к индукции CTL специалист в данной области предпочтительно модифицирует (т.е. удаляет, вводит, добавляет и/или заменяет) только небольшое число (например, 1, 2 или более) или небольшой процент аминокислот. В настоящем описании термин "более" означает 5 или менее аминокислот, например, 4 или 3, или менее. Процент аминокислот, которые необходимо модифицировать, может составлять, например, 30% или менее, предпочтительно 20% или менее, более предпочтительно 15% или менее, даже более предпочтительно 10% или менее, например, 1-5%.

[0067] При использовании в отношении иммунотерапии злокачественных опухолей пептиды по настоящему изобретению могут быть презентированы на поверхности клетки или экзосомы в виде комплекса с HLA-антигеном. Таким образом, предпочтительно выбирать пептиды, которые не только индуцируют CTL, а также обладают высокой аффинностью связывания с HLA-антигеном. С этой целью пептиды можно модифицировать заменой, введением, удалением и/или добавлением аминокислотных остатков для получения модифицированного пептида, имеющего улучшенную аффинность связывания с HLA-антигеном. Вследствие того, что регулярность последовательностей пептидов, представляемых посредством связывания с HLA-антигенами, уже была известна (Kubo RT et al., J. Immunol. 1994, 152: 3913-24; Rammensee HG et al., Immunogenetics 1995, 41: 178-228; Kondo et al., J. Immunol. 1994, 155: 4307-12; Falk K, et al., Nature. 1991 May 23; 351(6324): 290-6.) наряду с пептидами, которые презентированы в природе, в иммуногенные пептиды по настоящему изобретению можно вводить модификации, основанные на такой регулярности.

[0068] Например, пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с HLA-А24, как правило, содержат вторую аминокислоту от N-конца, замененную фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном. Аналогично, пептиды, в которых С-концевая аминокислота заменена фенилаланином, лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином, как правило, обладают высокой аффинностью связывания с HLA-A24. Таким образом, желательной может являться замена второй аминокислоты от N-конца фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном и/или замена аминокислоты на С-конце лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином для повышения аффинности связывания с HLA-А24. Таким образом, пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 27, в которой вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменена фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном, и/или в которой С-конец аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменен лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином, находятся в объеме настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к пептидам, содержащим аминокислотную последовательность, в которой одна, две или более аминокислот являются замененными, удаленными, введенными и/или добавленными в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 27, где такие пептиды обладают одной или обеими следующими характеристиками: (a) вторая аминокислота от N-конца представляет собой фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан, и (b) C-концевая аминокислота представляет собой фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин. В предпочтительных вариантах осуществления пептиды по настоящему изобретению содержат аминокислотную последовательность, в которой вторую аминокислоту от N-конца заменяют фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном, и/или C-концевую аминокислоту заменяют фенилаланином, лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 27.

[0069] Аналогично, пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с HLA-А2, как правило, содержат вторую аминокислоту от N-конца, замененную лейцином или метионином, и/или аминокислоту на С-конце, замененную валином или лейцином. Таким образом, для повышения аффинности связывания с HLA-А2 желательной может являться замена второй аминокислоты от N-конца лейцином или метионином, и/или на С-конце валином или лейцином. Таким образом, пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58, в которой вторую аминокислоту от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменяют лейцином или метионином, и/или где C-конец аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменен валином или лейцином, находятся в объеме настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к пептидам, содержащим аминокислотную последовательность, в которой одна, две или более аминокислот являются замененными, удаленными, введенными и/или добавленными в SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58, где такие пептиды обладают одной или обеими следующими характеристиками: (a) вторая аминокислота от N-конца представляет собой лейцин или метионин, и (b) C-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин. В предпочтительных вариантах осуществления пептиды по настоящему изобретению содержат аминокислотную последовательность, в которой вторую аминокислоту от N-конца заменяют лейцином или метионином, и/или C-концевую аминокислоту заменяют валином или лейцином в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58.

[0070] Замены можно вводить не только в концевые аминокислоты, а также в положения участков потенциального распознавания Т-клеточным рецептором (TCR) пептидов. Несколько исследований продемонстрировали, что пептид с аминокислотными заменами может иметь равное или лучшее функционирование, чем функционирование исходного белка, например, CAP1, p53_(204-272), Her-2/neu_(369-377) или gp100_(209-217) (Zaremba et al. Cancer Res., 57, 4570-4577, 1997, T.K. Hoffmann et al., J. Immunol., (2002) Feb 1; 168(3): 1338-47., Dionne SO et al., Cancer Immunol. Immunother., (2003) 52: 199-206 и Dionne SO et al., Cancer Immunology Immunotherapy, (2004) 53, 307-314).

[0071] Настоящее изобретение также предусматривает добавление 1, 2 или более аминокислот к N- и/или C-концу пептидов по настоящему изобретению. Такие модифицированные пептиды, обладающие способностью к индукции CTL, также находятся в объеме настоящего изобретения.

[0072] Например, настоящее изобретение относится к выделенному пептиду с длиной менее чем 15, 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислот, который обладает способностью к индукции CTL и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) аминокислотной последовательности, в которой 1, 2 или более аминокислот являются модифицированными в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13 и 15,

(ii) аминокислотной последовательности (i), где аминокислотная последовательность обладает одной или обеими следующими характеристиками:

(a) вторая аминокислота от N-конца указанных SEQ ID NO представляет собой или является модифицированной, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, метионина и триптофана, и

(b) C-концевая аминокислота указанных SEQ ID NO представляет собой или является модифицированной, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, триптофана и метионина, и

(iii) аминокислотной последовательности, в которой 1, 2 или более аминокислот являются модифицированными в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38 и 41,

(iv) аминокислотной последовательности (iii), где аминокислотная последовательность обладает одной или обеими следующими характеристиками:

[0073] Кроме того, настоящее изобретение также относится к выделенному пептиду длиной менее чем 15, 14, 13, 12 или 11 аминокислот, который обладает способностью к индукции CTL и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i') аминокислотной последовательности, в которой 1, 2 или более аминокислот являются модифицированными в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 27,

(ii') аминокислотной последовательности (i'), где аминокислотная последовательность обладает одной или обеими следующими характеристиками:

(iii') аминокислотной последовательности, в которой 1, 2 или более аминокислот являются модифицированными в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58,

(iv') аминокислотной последовательности (iii'), где аминокислотная последовательность обладает одной или обеими следующими характеристиками:

Когда эти пептиды приводят в контакт или вводят в APC, эти пептиды процессируются в APC с презентацией на них пептида, выбранного из группы, состоящей из (i)-(iv) и (i')-(iv').

[0074] Однако, когда пептидная последовательность является идентичной части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, имеющего отличающуюся функцию, могут быть индуцированы побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения и/или аллергические симптомы против конкретных веществ. Таким образом, предпочтительным является проведение сначала исследования гомологии с использованием доступных баз данных во избежание ситуаций, в которых последовательность пептида совпадает с аминокислотной последовательностью другого белка. Когда из исследования гомологии становится ясно, что даже не существует пептида с отличием в 1 или 2 аминокислоты по сравнению с целевым пептидом, целевой пептид можно модифицировать для повышения его аффинности связывания с HLA-антигенами и/или для повышения его способности к индукции CTL без какого-либо риска таких побочных эффектов.

[0075] Хотя ожидается, что пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с HLA-антигенами, являются эффективными, пептиды-кандидаты, которые выбраны в соответствии с наличием высокой аффинности связывания в качестве индикатора, в дальнейшем анализируют на наличие способности к индукции CTL. В настоящем описании фраза "способность к индукции CTL" означает способность пептида индуцировать цитотоксические T-лимфоциты (CTL) при презентации его на антигенпрезентирующих клетках (APC). Кроме того, "способность к индукции CTL" включает способность пептида индуцировать активацию CTL, пролиферацию CTL, стимулировать лизис CTL клеток-мишеней и увеличивать продукцию IFN-гамма посредством CTL.

[0076] Подтверждение способности к индукции CTL проводят индукцией APC (антигенпрезентирующих клеток), несущих MHC-антигены человека (например, B-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (DC)), или более конкретно DC, получаемых из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, и после стимуляции АРС тестируемыми пептидами, смешиванием АРС с CD8-положительными T-клетками для индукции CTL, а затем измерением IFN-гамма против клеток-мишеней, продуцируемого и высвобождаемого CTL. В качестве реакционной системы можно использовать трансгенных животных, которых получали для экспрессии HLA-антигена человека (например, такие, как описанные у BenMohamed L et al., Hum. Immunol., 2000, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Альтернативно, клетки-мишени можно радиоактивно метить⁵¹Cr и т.п., и можно рассчитывать цитотоксическую активность CTL из радиоактивности, высвобождаемой из этих клеток-мишеней. Альтернативно, способность к индукции CTL можно оценивать измерением продуцирования и высвобождения IFN-гамма CTL в присутствии антигенпрезентирующих клеток (APC), которые несут иммобилизованные пептиды, и визуализацией зоны ингибирования на среде с использованием моноклональных антител против IFN-гамма.

[0077] Наряду с описанными выше модификациями пептиды по настоящему изобретению также можно связывать с другими пептидами при условии, что получаемый связанный пептид сохраняет необходимую способность к индукции CTL исходного пептида, и более предпочтительно также сохраняет необходимую способность его связывания с HLA. Примеры подходящих "других" пептидов включают: пептиды по настоящему изобретению или способные к индукции CTL пептиды, получаемые из других TAA. Пептид по настоящему изобретению может связываться с "другим" пептидом прямо или опосредованно через линкер. Межпептидные линкеры хорошо известны в данной области и включают, например, AAY (Daftarian PM, et al., J. Trans. Med. 2007, 5:26), AAA, NKRK (Sutmuller RP, et al., J. Immunol. 2000, 165: 7308-7315) или K (Ota S, et al., Can. Res. 62, 1471-1476, Kawamura KS, et al., J. Immunol. 2002, 168: 5709-5715).

[0078] Описанные выше связанные пептиды называют в настоящем описании "политопами", т.е. группами из двух или более потенциально иммуногенных или стимулирующих иммунный ответ пептидов, которые могут быть соединены вместе в различных расположениях (например, в виде цепочки, с перекрыванием). Политоп (или нуклеиновая кислота, кодирующая этот эпитоп) можно вводить в соответствии со стандартным протоколом иммунизации, например, животным для тестирования эффективности политопа при стимуляции, усилении и/или вызове иммунного ответа.

[0079] Пептиды могут быть соединены вместе непосредственно или посредством использования фланкирующих последовательностей с образованием политопов, и применение политопов в качестве вакцин хорошо известно в данной области (см., например, Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(13): 5845-5849, 1995; Gilbert et al., Nature Biotechnol., 15(12): 1280-1284, 1997; Thomson et al., J. Immunol., 157(2): 822-826, 1996; Tarn et al., J. Exp. Med., 171(1): 299-306, 1990). Политопы, содержащие различные количества и различные комбинации эпитопов, можно получать и тестировать в отношении распознавания цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) и в отношении эффективности повышения иммунного ответа.

[0080] Пептиды по настоящему изобретению также можно связывать с другими веществами, при условии, что получаемый связанный пептид сохраняет необходимую способность к индукции CTL исходного пептида. Примеры подходящих веществ включают, например: пептиды, липиды, сахар и цепи сахаров, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и т.д. Пептиды могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление или фосфорилирование боковой цепи и т.д., при условии, что модификации не нарушают биологическую активность исходного пептида. Эти типы модификаций можно проводить для придания дополнительных функций (например, функции нацеливания и функции доставки) или для стабилизации пептида.

[0081] Например, в данной области известно, что для увеличения стабильности полипептида in vivo вводят D-аминокислоты, миметики аминокислот или неприродные аминокислоты; эта концепция может быть также адаптирована для пептидов по настоящему изобретению. Стабильность пептида можно анализировать рядом способов. Например, пептидазы и различные биологические среды, такие как плазма и сыворотка человека, можно использовать для тестирования стабильности (см., например, Verhoef et al., Eur. J. Drag. Metab. Pharmacoki., 1986, 11: 291-302).

[0082] Кроме того, как отмечалось выше, среди модифицированных пептидов, в которых 1, 2 или более аминокислотных остатков заменены, удалены, введены или добавлены, пептиды, имеющие ту же самую или более высокую активность по сравнению с исходными пептидами, можно подвергать скринингу или отбору. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу скрининга или отбора модифицированных пептидов, имеющих ту же самую или более высокую активность по сравнению с исходными пептидами. Иллюстративный способ включает стадии:

a: замены, удаления, введения и/или добавления по меньшей мере одного аминокислотного остатка пептида по настоящему изобретению,

b: определения активности пептида, модифицированного на стадии a, и

c: отбора пептида, имеющего ту же самую или более высокую активность по сравнению с исходным пептидом.

Предпочтительно, оцениваемой активностью пептида является способность к индукции CTL.

[0083] В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу скрининга пептида, обладающего способностью индуцировать CTL, который обладает специфической цитотоксической активностью против клетки, которая презентирует фрагмент, получаемый из UBE2T, где способ включает стадии:

(i) предоставления последовательности-кандидата, состоящей из аминокислотной последовательности, модифицированной заменой, удалением, введением и/или добавлением одного, двух или более аминокислотных остатков к исходной аминокислотной последовательности, где исходная аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58;

(ii) отбора последовательности-кандидата, которая не имеет по существу значительной гомологии (или идентичности последовательности) с пептидами, получаемыми из продуктов любых известных генов человека, отличных от UBE2T;

(iii) приведения пептида, состоящего из последовательности-кандидата, отобранной на стадии (ii), в контакт с антигенпрезентирующей клеткой;

(iv) приведения антигенпрезентирующей клетки со стадии (iii) в контакт с CD8-положительной T-клеткой, и

(v) идентификации пептида, способность к индукции CTL которого является такой же или более высокой, чем у пептида, состоящего из исходной аминокислотной последовательности.

[0084] III. Получение пептидов UBE2T

Пептиды по настоящему изобретению можно получать хорошо известными способами. Например, пептиды можно получать синтетически с использованием технологии рекомбинантных ДНК или химического синтеза. Пептиды по настоящему изобретению можно синтезировать индивидуально или в виде более длинных полипептидов, состоящих из двух или более пептидов. Затем можно выделять пептиды, то есть очищать или выделять таким образом, чтобы они по существу не содержали других природных белков клетки-хозяина и их фрагментов или любых других химических веществ.

[0085] Пептиды по настоящему изобретению могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление или фосфорилирование боковой цепи, при условии, что такие модификации не нарушают биологическую активность исходного пептида. Другие иллюстративные модификации включают введение одной или более D-аминокислот или других миметиков аминокислот, которые можно использовать, например, для увеличения полупериода выведения из сыворотки пептидов.

[0086] Пептид по настоящему изобретению можно получать химическим синтезом на основе выбранной аминокислотной последовательности. Например, общепринятые способы пептидного синтеза, которые можно адаптировать для синтеза, включают:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1975;

(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1985;

(v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;

(vi) WO99/67288, и

(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

[0087] Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению можно получать, адаптируя любые известные способы генетической инженерии для получения пептидов (например, Morrison J., J. Bacteriology, 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds Wu et al.) 1983, 101:347-62). Например, сначала получают подходящий вектор, несущий полинуклеотид, кодирующий целевой мишень в экспрессируемой форме (например, после регуляторной последовательности, соответствующей последовательности промотора), и трансформируют подходящую клетку-хозяина. Такие векторы и клетки-хозяева также могут быть предоставлены в настоящем изобретении. Затем эту клетку-хозяина культивируют для получения представляющего интерес пептида. Пептид также можно получать in vitro адаптацией системы трансляции in vitro.

[0088] IV. Полинуклеотиды

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, которые кодируют любой из указанных выше пептидов по настоящему изобретению. Эти полинуклеотиды включают полинуклеотиды, получаемые из природного гена UBE2T (например, номер доступа GenBank NM_014176 (SEQ ID NO: 64)), а также полинуклеотиды с консервативно модифицированной своей нуклеотидной последовательностью. В настоящем описании фраза "консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность" относится к последовательностям, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности. Вследствие вырожденности генетического кода, большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют любой конкретный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин указан кодоном, кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот являются "молчащими вариациями", которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариаций. В настоящем описании каждая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который, как правило, является единственным кодоном для метионина, и TGG, который, как правило, является единственным кодоном для триптофана) можно модифицировать с получением функционально идентичной молекулы. Таким образом, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид, полностью описана в каждой предоставленной последовательности.

[0089] Полинуклеотид по настоящему изобретению может состоять из ДНК, РНК и их производных. Как хорошо известно в данной области, ДНК соответственно состоит из оснований, таких как A, T, C и G, и Т заменен на U в РНК. Специалисту в данной области будет понятно, что основания, не встречающиеся в природе, также можно вводить в полинуклеотиды.

[0090] Полинуклеотид по настоящему изобретению может кодировать несколько пептидов по настоящему изобретению с промежуточными аминокислотными последовательностями или без них. Например, промежуточная аминокислотная последовательность может обеспечивать участок расщепления (например, последовательность, распознаваемую ферментом) полинуклеотида или транслируемых пептидов. Кроме того, полинуклеотид по настоящему изобретению может содержать любые дополнительные последовательности в кодирующей последовательности, кодирующей пептид по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению может представлять собой рекомбинантный полинуклеотид, который содержит регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии этого пептида, или может представлять собой экспрессирующий вектор (плазмиду) с маркерными генами и т.п. Как правило, такие рекомбинантные полинуклеотиды можно получать манипуляцией полинуклеотидов общепринятыми способами рекомбинации с использованием, например, полимераз и эндонуклеаз.

[0091] Для получения полинуклеотидов по настоящему изобретению можно использовать как рекомбинантные способы, так и способы химического синтеза. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению можно получать встраиванием в подходящий вектор, который может экспрессироваться при трансфицировании в компетентную клетку. Альтернативно, полинуклеотид по настоящему изобретению можно амплифицировать способами ПЦР или экспрессией в подходящих хозяевах (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Альтернативно, полинуклеотид по настоящему изобретению можно синтезировать твердофазными способами, как описано у Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J. 1984, 3: 801-5.

[0092] V. Экзосомы

Настоящее изобретение дополнительно относится к внутриклеточным везикулам, называемым экзосомами, которые презентируют комплексы, образованные пептидами по настоящему изобретению и HLA-антигенами, на своей поверхности. Экзосомы можно получать, например, способами, подробно описанными в публикации патентной заявки Японии H11-510507 и WO99/03499, и можно получать с использованием APC, получаемых у пациентов, которые подвергаются лечению и/или профилактике. Экзосомы по настоящему изобретению можно инокулировать в виде вакцины аналогичным образом, как пептиды по настоящему изобретению.

[0093] Тип HLA-антигенов, содержащихся в этих комплексах, должен соответствовать типу HLA-антигенов индивидуума, требующего лечения и/или профилактики. Например, в японской популяции часто преобладают HLA-А24 или HLA-А2, в частности HLA-A*2402 и HLA-A*0201, и HLA-A*0206, и, таким образом, они будут подходящими для лечения японских пациентов. Применение типа HLA-A24 или HLA-A2, который является высокоэкспрессируемым среди японцев и индивидуумов, принадлежащих к индоевропейской расе, является благоприятным для получения эффективных результатов, а также применение находят подтипы, такие как HLA-A*2402, HLA-A*0201 и HLA-A*0206. Как правило, в клинике тип HLA-антигена пациента, которому необходимо лечение, исследуют заранее, что позволяет сделать подходящий выбор пептидов, имеющих высокие уровни аффинности связывания с конкретным антигеном или имеющих способность к индукции CTL, посредством презентации антигена. Кроме того, для получения пептидов, обладающих высокой аффинностью связывания и способностью к индукции CTL, можно проводить замену, введение, удаление или добавление 1, 2 или более аминокислот на основании аминокислотной последовательности природного неполного пептида UBE2T.

При использовании для экзосомы по настоящему изобретению типа HLA-A24 антигена HLA, особой ценностью обладают пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 27.

[0094] Альтернативно, при использовании для экзосомы по настоящему изобретению типа HLA-A2 антигена HLA, особой ценностью обладают пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58.

[0095] В некоторых вариантах осуществления экзосомы по настоящему изобретению презентируют комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA-A24 или HLA-A2 на своей поверхности. В иллюстративных вариантах осуществления экзосома по настоящему изобретению презентирует комплекс пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 27, (или его модифицированный пептид) и HLA-A24 на своей поверхности. В других вариантах осуществления экзосома по настоящему изобретению презентирует комплекс пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58, (или его модифицированный пептид) и HLA-A2 на своей поверхности.

[0096] VI. Антигенпрезентирующие клетки (APC)

Настоящее изобретение также относится к выделенным антигенпрезентирующим клеткам (APC), которые презентируют на своей поверхности комплексы, образованные между HLA-антигенами и пептидами по настоящему изобретению. APC можно получать у пациентов, которых подвергают лечению и/или профилактике, и их можно вводить в виде вакцин сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, содержащими пептиды, экзосомы или CTL по настоящему изобретению.

[0097] APC не ограничены конкретным видом клеток и включают дендритные клетки (DC), клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки и активированные T-клетки, для которых известно, что они презентируют белковые антигены на своей клеточной поверхности таким образом, чтобы их распознавали лимфоциты. Поскольку DC являются репрезентативными APC, имеющими самую сильную CTL-индуцирующую активность среди APC, DC являются подходящими для APC по настоящему изобретению.

[0098] Например, APC по настоящему изобретению можно получать индукцией DC из моноцитов периферической крови, а затем приведением (стимулированием) их в контакт с пептидами по настоящему изобретению in vitro, ex vitro или in vivo. При введении пептидов по настоящему изобретению индивидуумам, в организме индивидуума индуцируются APC, которые презентируют пептиды по настоящему изобретению. Таким образом, APC по настоящему изобретению можно получать путем сбора APC у индивидуума после введения пептидов по настоящему изобретению индивидууму. Альтернативно, APC по настоящему изобретению можно получать путем приведения APC, собранных у индивидуума, в контакт с пептидом по настоящему изобретению.

[0099] APC по настоящему изобретению можно вводить индивидууму для индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли у индивидуума сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, содержащими пептиды, экзосомы или CTL по настоящему изобретению. Например, введение ex vivo может включать стадии:

a: сбора APC у первого индивидуума;

b: приведения APC стадии a в контакт с пептидом по настоящему изобретению; и

c: введения APC стадии b второму индивидууму.

[0100] Первый индивидуум и второй индивидуум могут представлять собой одного и того же индивидуума или могут представлять собой различных индивидуумов. APC, получаемые на стадии b, можно составлять и вводить вакцину для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, такой как рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль половых клеток яичка, но не ограничиваются ими.

[0101] В контексте настоящего изобретения можно использовать пептиды по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для индукции антигенпрезентирующей клетки. В настоящем изобретении также предоставлен способ или процесс получения фармацевтической композиции для индукции антигенпрезентирующей клетки, где способ включает стадию смешивания или составления пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.

Настоящее изобретение также относится к использованию пептидов по настоящему изобретению для индукции антигенпрезентирующей клетки.

[0102] По одному из аспектов настоящего изобретения APC по настоящему изобретению обладают способностью к индукции CTL. В отношении APC фраза "способность к индукции CTL" относится к способности APC индуцировать CTL при контакте с CD8-положительной T-клеткой. Кроме того, "способность к индукции CTL" включает способность APC индуцировать активацию CTL, пролиферацию CTL, способствовать опосредуемому CTL лизису клетки-мишени и повышать продукцию IFN-гамма CTL. В частности, APC по настоящему изобретению обладают способностью индуцировать CTL, специфичные к UBE2T. Такие APC, имеющие высокий уровень способности к индукции CTL, можно получать способом, который включает стадию переноса полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC in vitro, а также способом, упомянутым выше. Вводимый ген может находиться в форме ДНК или РНК. Примеры способов введения включают без конкретных ограничений различные способы, общепринято применяемые в данной области, такие как липофекция, электропорация и способ с использованием фосфата кальция. Более конкретно, это можно выполнять, как описано в Reeves ME et al., Cancer Res. 1996, 56: 5672-7; Butterfield LH et al., J. Immunol. 1998, 161: 5607-13; Boczkowski D et al., J. Exp. Med. 1996, 184: 465-72; патентной публикации Японии №JP2000-509281. При переносе гена в APC, ген в клетке подвергается транскрипции, трансляции и т.д., а затем получаемый белок процессируется MHC класса I или класса II, и проходит через путь презентации до неполных пептидов по настоящему изобретению.

[0103] В некоторых вариантах осуществления APC по настоящему изобретению презентируют комплексы антигена HLA-A24 или HLA-A2 и пептида по настоящему изобретению на своей поверхности. В иллюстративных вариантах осуществления APC по настоящему изобретению презентирует комплекс пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 27, (или его модифицированного пептида), и HLA-A24 на своей поверхности. В других вариантах осуществления APC по настоящему изобретению презентирует комплекс пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58, (или его модифицированного пептида), и HLA-A2 на своей поверхности.

[0104] VII. Цитотоксические T-лимфоциты (CTL)

CTL (цитотоксический T-лимфоцит), индуцированный против любого из пептидов по настоящему изобретению, усиливает иммунный ответ, направленный на злокачественные клетки in vivo, и, таким образом, его можно использовать в качестве вакцины аналогичны образом, как пептиды per se. Таким образом, настоящее изобретение относится к выделенным CTL, которые являются специфически индуцированными или активированными любым из пептидов по настоящему изобретению.

[0105] Такие CTL (цитотоксические T-клетки) можно получать (1) введением пептида(ов) по настоящему изобретению индивидууму, (2) приведением в контакт (стимулированием) in vitro получаемых у индивидуума APC и CD8-положительных клеток или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с пептидом(ами) по настоящему изобретению, (3) приведением в контакт in vitro CD8-положительных клеток или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с АРС или экзосомами, презентирующими комплекс HLA-антигена и пептида на своей поверхности, или (4) введением в CD8-положительную T-клетку полинуклеотида, кодирующего обе субъединицы Т-клеточного рецептора (TCR), или полинуклеотидов, кодирующих каждую из субъединиц TCR, где TCR, образуемый такими субъединицами, может связываться с комплексом пептида по настоящему изобретению и антигена HLA на клеточной поверхности. Такие АРС или экзосомы можно получать способами, описанными выше. Подробное описание способа (4) описано ниже в разделе "VIII. Т-клеточный рецептор (TCR)".

[0106] CTL по настоящему изобретению можно получать у пациентов, которые подвергаются лечению и/или профилактике, и их можно вводить сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, содержащими пептиды, APC или экзосомы по настоящему изобретению, для регулирующего действия. Получаемые CTL действуют специфически против клеток-мишеней, презентирующих пептиды по настоящему изобретению или, например, аналогичные пептиды, используемые для индукции. Клетки-мишени могут представлять собой клетки, которые эндогенно экспрессируют UBE2T, такие как злокачественные клетки, или клетки, которые являются трансфицированными в геном совместно с геном UBE2T, и клетки, в качестве мишеней атаки активированного CTL, также могут служить клетки, которые презентируют пептид по настоящему изобретению на клеточной поверхности вследствие стимуляции пептидом.

[0107] В некоторых вариантах осуществления CTL по настоящему изобретению представляют собой CTL, которые распознают клетки, презентирующие комплексы антигенов HLA-А24 или HLA-А2 и пептида по настоящему изобретению. В отношении CTL фраза "распознают клетку" относится к связыванию комплекса антигена HLA-А24 или HLA-А2 и пептида по настоящему изобретению на клеточной поверхности через его TCR и проявлению специфической цитотоксической активности против клетки. В настоящем описании "специфической цитотоксической активностью" относится к проявлению цитотоксической активности против клетки, презентирующей комплекс антигена HLA-А24 или HLA-А2 и пептида по настоящему изобретению, но не против других клеток. Таким образом, CTL, которые проявляют специфическую цитотоксическую активность против клетки, презентирующей пептид по настоящему изобретению, входят в объем настоящего изобретения.

[0108] В иллюстративных вариантах осуществления CTL по настоящему изобретению могут распознавать клетку, презентирующую пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 27, (или его модифицированный пептид) через HLA-A24. В предпочтительных вариантах осуществления такие CTL по настоящему изобретению могут распознавать клетку, экспрессирующую UBE2T и HLA-A24 (например, HLA-A24-положительную злокачественную клетка), и демонстрируют цитотоксическую активность против такой клетки.

[0109] В других вариантах осуществления CTL по настоящему изобретению могут распознавать клетку, презентирующую пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58, (или его модифицированный пептид) через HLA-A2. В предпочтительных вариантах осуществления такие CTL по настоящему изобретению могут распознавать клетку, экспрессирующую UBE2T и HLA-A2 (например, HLA-A2-положительную злокачественную клетку), и демонстрируют цитотоксическую активность против такой клетки.

[0110] VIII. T-клеточный рецептор (TCR)

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей полинуклеотид, кодирующий обе субъединицы TCR, или полинуклеотиды, кодирующие каждую из субъединиц TCR, где TCR, сформированный такими субъединицами, способен связываться с комплексом антигена HLA и пептида по настоящему изобретению на клеточной поверхности, и к способам ее применения. Субъединицы TCR обладают способностью формировать TCR, которые придают специфичность Т-клеткам против опухолевых клеток, экспрессирующих UBE2T. Известными в данной области способами можно идентифицировать полинуклеотид, кодирующий каждую из альфа- и бета-цепей субъединиц TCR CTL, индуцированного одним или несколькими пептидами по настоящему изобретению (WO2007/032255 и Morgan R.A. et al., J. Immunol., 171, 3287 (2003)). Например, способ ПЦР является предпочтительным для анализа TCR. Праймеры ПЦР для анализа могут представлять собой, например, 5'-R праймеры (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3') в качестве 5'-концевых праймеров (SEQ ID NO: 66) и праймеры к 3-TRa-C (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3'), специфичные к C-области альфа-цепи TCR (SEQ ID NO: 67), праймеры к 3-TRb-C1 (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3'), специфичные к С1-области бета-цепи TCR (SEQ ID NO: 68), или праймеры к 3-TRbeta-C2 (5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3'), специфичные к C2-области бета-цепи TCR (SEQ ID NO: 69), в качестве 3'-концевых праймеров, но не ограничиваются ими. Производные TCR могут с высокой авидностью связываться с клетками-мишенями, презентирующими пептид по настоящему изобретению, и необязательно опосредовать эффективный цитолиз клеток-мишеней, презентирующих пептид по настоящему изобретению in vivo и in vitro.

[0111] Полинуклеотид, кодирующий обе субъединицы TCR, или полинуклеотиды, кодирующие каждую из субъединиц TCR, можно вводить в подходящие векторы, например, ретровирусные векторы. Эти векторы хорошо известны в данной области. Полинуклеотиды или содержащие их векторы можно эффективно переносить в Т-клетку (например, CD8-положительную Т-клетку). Предпочтительно, настоящее изобретение относится к готовой к использованию композиции, обеспечивающей возможность быстрой модификации собственных Т-клеток пациента (или Т-клеток другого млекопитающего), для быстрого и простого получения модифицированных Т-клеток, обладающих превосходными свойствами цитолиза злокачественных клеток.

[0112] TCR, специфичный против пептида по настоящему изобретению, представляет собой рецептор, способный специфически распознавать комплекс пептида по настоящему изобретению и молекулы HLA, обеспечивающий специфическую активность T-клеток против клеток-мишеней, презентирующих комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-антигена, когда TCR презентирован на поверхности T-клетки. Специфичное распознавание указанного выше комплекса можно подтверждать любыми известными способами, предпочтительные примеры которых включают анализ окрашивания мультимера HLA с использованием молекул HLA и пептидов по настоящему изобретению и анализ ELISPOT. Проводя анализ ELISPOT, можно подтверждать, что T-клетка, экспрессирующая TCR на клеточной поверхности, распознает клетку посредством TCR, и что сигналы передаются внутриклеточно. Подтверждение того, что указанный выше TCR может обеспечивать цитотоксическую активность T-клеток, когда TCR присутствует на поверхности T-клеток, также можно проводить любым известным способом. Предпочтительный способ включает, например, определение цитотоксической активности против клетки-мишени, такое как анализ высвобождения хрома.

[0113] Также настоящее изобретение относится к CTL, которые получают трансдукцией полинуклеотидами, кодирующими обе субъединицы TCR, или полинуклеотидами, кодирующими каждую из субъединиц TCR, где TCR, образованный такими субъединицами TCR, способен связываться с пептидом UBE2T, например, пептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 27, в отношении HLA-A24, а также пептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58, в отношении HLA-A2.

[0114] Трансдуцированные CTL способны к хомингу к злокачественным клеткам in vivo, и их можно выращивать хорошо известными способами культивирования in vitro (например, Kawakami et al., J. Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). CTL по настоящему изобретению можно использовать для получения иммуногенной композиции, пригодной для лечения или предотвращения рака у пациента, нуждающегося в терапии или защите (см. WO2006/031221, содержание которой включено в настоящем описании посредством ссылки).

[0115] IX. Фармацевтические средства или композиции

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим средствам или композициям, содержащим по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(d) экзосомы по настоящему изобретению; и

(e) CTL по настоящему изобретению.

[0116] Поскольку экспрессия UBE2T является специфически повышенной в злокачественных опухолях, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль семенников, пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики злокачественных опухолей и/или профилактики ее послеоперационного рецидива. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции или средству, которые составлены для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли и/или для профилактики ее послеоперационного рецидива, где такие композиция или средство содержат по меньшей мере один из пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению можно экспрессировать на поверхности любой из указанных выше экзосом или клеток, таких как APC, для использования в качестве фармацевтических композиций или средств. Кроме того, в качестве активного ингредиента фармацевтических композиций или средств по настоящему изобретению также можно использовать указанные выше CTL, которые направлены на любой из пептидов по настоящему изобретению.

[0117] Таким образом, настоящее изобретение относится к средствам или композициям, содержащим по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотида, кодирующий такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(d) экзосомы по настоящему изобретению; и

(e) CTL по настоящему изобретению.

В фармацевтическом средстве или композиции такой активный ингредиент находится в терапевтически или фармацевтически эффективном количестве.

[0118] Фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению также находят применение в качестве вакцины. В контексте настоящего изобретения фраза "вакцина" (также обозначаемая "иммуногенной композицией") относится к средству или композиции, которая обладает функцией индукции противоопухолевого иммунитета после инокуляции животного. Другими словами, настоящее изобретение относится к фармацевтическим средствам и композициям для индукции у индивидуума иммунного ответа против злокачественной опухоли. Количество пептида в таких средстве или композиции может представлять собой количество, которое эффективно для значительного усиления или стимуляции иммунного ответа у индивидуума, у которого присутствует злокачественная опухоль, экспрессирующая UBE2T.

[0119] Фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики злокачественных опухолей и/или профилактики ее послеоперационного рецидива у индивидуумов или пациентов, включающих человека и любых других млекопитающих, включая, но, не ограничиваясь ими, мышей, крыс, морских свинок, кроликов, кошек, собак, овец, коз, свиней, крупный рогатый скот, лошадей, обезьян, бабуинов и шимпанзе, особенно коммерчески важных животных или одомашненных животных. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению можно составлять для введения индивидууму, у которого HLA-антиген представляет собой HLA-A24 или HLA-A2.

[0120] В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к использованию активного ингредиента в производстве фармацевтических композиций или средства для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли или опухоли и/или профилактики ее послеоперационного рецидива, где указанный активный ингредиент выбран из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(d) экзосомы, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) CTL по настоящему изобретению.

[0121] Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к активному ингредиенту для применения в лечении и/или профилактике злокачественных опухолей или опухолей и/или профилактики их послеоперационного рецидива, где указанный активный ингредиент выбран из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(d) экзосомы, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) CTL по настоящему изобретению.

[0122] Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к способу или процессу для производства фармацевтических композиций или средства для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли или опухоли и/или профилактики ее послеоперационного рецидива, где способ или процесс включают стадию составления фармацевтически или физиологически приемлемого носителя с активным ингредиентом, выбранным из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(d) экзосомы, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) CTL по настоящему изобретению.

[0123] В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу или процессу для производства фармацевтических композиции или средства для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли или опухоли и/или профилактики ее послеоперационного рецидива, где способ или процесс включают стадии смешивания активного ингредиента с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем, где активный ингредиент выбран из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(d) экзосомы, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) CTL T-клетки по настоящему изобретению.

[0124] В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу лечения и /или профилактики злокачественной опухоли или опухоли и/или профилактики ее послеоперационного рецидива, где способ включает стадию введения индивидууму по меньшей мере одного активного ингредиента, выбранного из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(d) экзосомы, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) CTL по настоящему изобретению.

[0125] По настоящему изобретению выявлено, что пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 27, представляют собой рестриктированные по HLA-A24 пептиды-эпитопы, которые могут индуцировать сильный и специфический иммунный ответ у индивидуума против злокачественной опухоли, экспрессирующей HLA-A24 и UBE2T. Также выявлено, что пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58, представляют собой рестриктированные по HLA-A2 пептиды-эпитопы, которые могут индуцировать сильный и специфический иммунный ответ у индивидуума против злокачественной опухоли, экспрессирующей HLA-A2 и UBE2T. Таким образом, фармацевтические композиции или средства, которые содержат любой из пептидов с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 27, являются особенно пригодными для введения индивидуумам, у которых HLA-антиген представляет собой HLA-A24. С другой стороны, фармацевтические композиции или средства, которые содержат любой из пептидов с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58, являются особенно пригодными для введения индивидуумам, у которых HLA-антиген представляет собой HLA-A2. То же самое относится к фармацевтическим композициям или средствам, которые содержат полинуклеотиды, кодирующие любой из этих пептидов (т.е. полинуклеотиды по настоящему изобретению).

[0126] Злокачественные опухоли, подлежащие лечению и/или профилактике фармацевтическими композициями или средствами по настоящему изобретению, не ограничены и включают все типы злокачественных опухолей, где участвует UBE2T, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль семенников.

[0127] Фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению в дополнение к указанным выше активным ингредиентам могут содержать другие пептиды, которые обладают способностью индуцировать CTL против злокачественных клеток, другие полинуклеотиды, кодирующие другие пептиды, другие клетки, которые презентируют другие пептиды, или и т.п. Примеры таких "других" пептидов, обладающих способностью индуцировать CTL против злокачественных клеток, включают, но не ограничиваются ими, пептиды, получаемые из специфических для злокачественной опухоли антигенов (например, идентифицированных TAA).

[0128] При необходимости фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению могут в качестве активного ингредиента необязательно содержать другие терапевтические вещества при условии, что вещество не ингибирует противоопухолевый эффект активного ингредиента по настоящему изобретению, например, любого из пептидов, полинуклеотидов, экзосом, APC, CTL по настоящему изобретению. Например, составы могут содержать противовоспалительные вещества, болеутоляющие средства, химиотерапевтические средства и т.п. Наряду с введением других терапевтических веществ в само лекарственное средство, лекарственные средства по настоящему изобретению также можно вводить последовательно или одновременно с одной или более другими фармакологическими композициями. Количества лекарственного средства и фармакологической композиции зависят, например, от того, какой тип фармакологической композиции(ий) используют, от подлежащего лечению заболевания и от схемы и путей введения.

[0129] Следует понимать, что наряду с ингредиентами, в частности указанными в настоящем описании, фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению могут содержать другие вещества, общепринятые в данной области, в зависимости от типа рассматриваемого состава.

[0130] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению могут содержаться в промышленных изделиях и наборах, содержащих вещества, пригодные для лечения подлежащего лечению состояния заболевания, например, злокачественной опухоли. Промышленное изделие может содержать контейнер с любой из фармацевтических композиций или средств по настоящему изобретению с этикеткой. Подходящие контейнеры включают бутылки, флаконы и тест-пробирки. Контейнеры могут быть выполнены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Этикетка на контейнере должна указывать композицию или средство, которое используют для лечения или профилактики одного или более состояний заболевания. Этикетка также может содержать инструкции по введению и т.д.

[0131] В дополнение к описанному выше контейнеру, набор, содержащий фармацевтическую композицию или средство по настоящему изобретению, может необязательно дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель. Он может дополнительно содержать другие вещества, желательные с коммерческой или пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыш в упаковку с инструкциями по применению.

[0132] Фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению при желании можно предоставлять в упаковке или дозирующем устройстве, которые могут содержать одну или более стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, содержать металлическую фольгу или полимерную пленку, такую как блистерная упаковка. Упаковка или дозирующее устройство может содержать инструкции по введению.

[0133] (1) Фармацевтические композиции, содержащие пептиды в качестве активных ингредиентов

Пептид по настоящему изобретению можно вводить непосредственно в виде фармацевтической композиция или средства или при необходимости можно составить общепринятыми способами составления. В последнем случае, в дополнение к пептидам по настоящему изобретению, при необходимости можно вводить носители, эксципиенты и такие носители, которые, как правило, используют для лекарственных средств, без конкретных ограничений. Примеры таких носителей представляют собой стерилизованную воду, физиологический раствор, фосфатный буфер, культуральную жидкость и т.д. Кроме того, фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению могут по мере необходимости содержать стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества и т.д. Фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению можно использовать для противораковой терапии.

[0134] Пептиды по настоящему изобретению можно получать в комбинации, которая содержит два или более пептидов по настоящему изобретению, для индукции CTL in vivo. Пептиды могут находиться в форме смеси или их можно конъюгировать друг с другом стандартными способами. Например, пептиды можно химически связывать или экспрессировать в виде одного слитого полипептида. Пептиды в комбинации могут являться одинаковыми или различными. В результате введения пептидов по настоящему изобретению, пептиды презентируются с высокой плотностью HLA-антигенами на APC, а затем индуцируются CTL, которые специфически взаимодействуют с комплексом, образованным презентируемым пептидом и HLA-антигеном. Альтернативно, APC (например, DC) можно получать у индивидуума, а затем стимулировать пептидами по настоящему изобретению для получения APC, которые презентируют любой из пептидов по настоящему изобретению на своей клеточной поверхности. Эти APC можно снова вводить индивидууму для индукции CTL у индивидуума, и в результате можно повышать агрессивность к опухолеассоцированному эндотелию.

[0135] Фармацевтические композиции или средства для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащие любой из пептидов по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов, также могут содержать адъювант, для того чтобы эффективно усиливать клеточный иммунитет. Альтернативно, фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению можно вводить совместно с активными ингредиентами или можно вводить путем составления в гранулы. Адъювант относится к любому соединению, веществу или композиции, которые усиливают иммунный ответ против белка при совместном (или последовательном) введении с белком с иммунологической активностью. Предусматриваемые в настоящем описании адъюванты включают адъюванты, описанные в литературе (Johnson AG, Clin. Microbiol. Rev., 1994, 7: 277-89). Примеры подходящих адъювантов включают, но не ограничиваются ими, фосфат алюминия, гидроксид алюминия, квасцы, холерный токсин, токсин сальмонеллы, IFA (неполный адъювант Фрейнда), CFA (полный адъювант Фрейнда), ISCOMatrix, GM-CSF, CpG, эмульсия м/в и т.п.

Кроме того, можно подходящим способом использовать липосомные составы, гранулярные составы, в которых пептиды связаны с гранулами диаметром несколько микрометров, и составы, в которых липид связан с пептидом.

[0136] В другом варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению также можно вводить в форме фармацевтически приемлемой соли. Примеры предпочтительных солей включают, но не ограничиваются ими, соли с щелочным металлом, соли с металлом, соли с органическим основанием, соли с амином, соли с органической кислотой (уксусной кислотой, муравьиной кислотой, пропионовой кислотой, фумаровой кислотой, малеиновой кислотой, янтарной кислотой, винной кислотой, лимонной кислотой, яблочной кислотой, щавелевой кислотой, бензойной кислотой, метансульфоновой кислотой и т.д.) и соли с неорганической кислотой (соляной кислотой, фосфорной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, азотной кислотой и т.д.). Как используют в настоящем описании, фраза "фармацевтически приемлемая соль" относится к таким солям, которые сохраняют биологическое действие и свойства соединений, и которые получают реакцией с неорганическими или органическими кислотами или основаниями, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, пара-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и т.п.

[0137] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению могут дополнительно содержать компонент, который праймирует CTL. Липиды идентифицированы как вещества, способные праймировать CTL in vivo против вирусных антигенов. Например, остатки пальмитиновой кислоты можно связывать с эпсилон- и альфа-аминогруппами остатка лизина, а затем связывать с пептидом по настоящему изобретению. Затем липидированный пептид можно вводить непосредственно в мицелле или частице, заключенной в липосоме или эмульгированной в адъюванте. В качестве других примеров праймирования липидами ответов CTL, можно использовать липопротеины E. coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеинилсерилсерин (P3CSS), ковалентно связанные подходящим пептидом, для праймирования CTL (см., например, Deres et al., Nature, 1989, 342: 561-4).

[0138] Примеры подходящих способов введения включают, но не обязательно являются ограниченными ими, пероральную и интрадермальную, подкожную, внутримышечную, внутрикостную, перитонеальную и внутривенную инъекцию или т.д. и системное введение или местное введение вблизи целевых участков. Введение можно проводить посредством однократного введения или усиливать посредством многократных введений. Индивидууму с необходимостью в лечении злокачественной опухоли, экспрессирующей UBE2T, можно вводить фармацевтически или терапевтически эффективное количество пептида по настоящему изобретению. Альтернативно, индивидууму со злокачественной опухолью, экспрессирующей UBE2T, можно вводить количество пептида по настоящему изобретению, достаточное для усиления или стимуляции иммунного ответа, опосредованного CTL, и/или для индукции CTL против злокачественной опухоли или опухоли, экспрессирующей UBE2T. Дозу пептидов по настоящему изобретению можно регулировать соответствующим образом в соответствии с подлежащим лечению заболеванием, возрастом пациента, массой, способом введения и т.д., и, как правило, она составляет от 0,001 мг до 1000 мг, например, от 0,01 мг до 100 мг, например, от 0,1 мг до 30 мг, например, от 0,1 до 10 мг, например, от 0,5 мг до 5 мг, и ее можно вводить однократно в период от нескольких суток до нескольких месяцев, например, раз в неделю. Подходящую дозу должным образом может выбрать специалист в данной области.

[0139] (2) Фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активных ингредиентов

Фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению также могут содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие пептид(ы) по настоящему изобретению, в экспрессируемой форме. В настоящем описании фраза "в экспрессируемой форме" означает, что полинуклеотид при введении в клетку экспрессируется in vivo в виде полипептида, который индуцирует противоопухолевый иммунитет. В одном из иллюстративных вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты представляющего интерес полинуклеотида содержит регуляторные элементы, необходимые для экспрессии полинуклеотида. Полинуклеотид(ы) можно конструировать таким образом, чтобы обеспечивать стабильное встраивание в геном клетки-мишени (для описания гомологичных рекомбинантных кассетных векторов см., например, Thomas K.R. & Capecchi M.R., Cell, 1987, 51: 503-12). См., например, Wolff et al., Science, 1990, 247: 1465-8; патенты США №№5580859, 5589466, 5804566, 5739118, 5736524, 5679647 и WO 98/04720. Примеры технологий доставки на основе ДНК включают "голую ДНК", облегченную (опосредованную бупивакаином, полимерами, пептидами) доставку, комплексы катионных липидов и опосредованную частицами ("генную пушку") или опосредованную давлением доставку (см., например, патент США №5922687).

[0140] Пептиды по настоящему изобретению также могут экпрессироваться вирусными или бактериальными векторами. Примеры экспрессирующих векторов включают хозяев аттенуированных вирусов, таких как вирус коровьей оспы или вирус оспы кур. Этот подход включает использование вируса коровьей оспы, например, в качестве вектора для экспрессии нуклеотидных последовательностей, которые кодируют этот пептид. После введения хозяину рекомбинантный вирус коровьей оспы экспрессирует иммуногенный пептид и, таким образом, индуцирует иммунный ответ. Векторы на основе вируса коровьей оспы и способы, пригодные для протоколов иммунизации, описаны, например, в патенте США №4722848. Другой вектор представляет собой BCG (Bacille Calmette Guerin). Векторы на основе BCG описаны у Stover et al., Nature, 1991, 351: 456-60. Известен широкий спектр других векторов, пригодных для терапевтического введения или иммунизации, например, векторы на основе аденовируса и аденоассоциированного вируса, ретровирусные векторы, векторы на основе Salmonella typhi, векторы на основе обезвреженного токсина сибирской язвы и т.п. См., например, Shata et al., Mol. Med. Today, 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J. Leukoc. Biol., 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo, 2000, 14: 571-85.

[0141] Доставка полинуклеотида пациенту может быть прямой, в случае которой пациент непосредственно подвергается воздействию несущего полинуклеотид вектора, или опосредованной, в случае которой клетки сначала трансформируют представляющим интерес полинуклеотидом in vitro, затем клетки трансплантируют пациенту. Эти два подхода известны соответственно как виды генотерапии in vivo и ex vivo.

[0142] Для общего обзора способов генотерапии см. Goldspiel et al., Clinical Pharmacy, 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy, 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science, 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann. Rev. Biochem., 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology, 1993, 11(5): 155-215). Способы, общеизвестные в данной области технологии рекомбинантных ДНК, которые можно применять к настоящему изобретению, описаны Ausubel et al. в Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY, 1993) и Krieger в Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual (Stockton Press, NY, 1990).

[0143] Введение можно проводить посредством пероральной, интрадермальной, подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутрикостной и/или перитонеальной инъекции или т.д., и применение находит системное введение или местное введение вблизи целевых участков. Введение можно проводить посредством однократного введения или повторного введения посредством многократных введений. Альтернативно, индивидууму со злокачественной опухолью, экспрессирующей UBE2T можно вводить количество полинуклеотида по настоящему изобретению, достаточное для усиления или стимуляции иммунного ответа, опосредованного CTL, и/или для индукции CTL против злокачественной опухоли или опухоли, экспрессирующей UBE2T. Дозу полинуклеотида в подходящем носителе или клетках, трансформированных полинуклеотидом, кодирующим пептиды по настоящему изобретению, можно регулировать соответствующим образом в зависимости от подлежащего лечению заболевания, возраста пациента, массы, способа введения и т.д., и, как правило, она составляет от 0,001 мг до 1000 мг, например, от 0,01 мг до 100 мг, например, от 0,1 мг до 30 мг, например, от 0,1 до 10 мг, например, от 0,5 мг до 5 мг, и ее можно вводить от одного раза в несколько дней до одного раза в несколько месяцев, например, раз в неделю. Подходящую дозу должным образом может выбрать специалист в данной области.

[0144] X. Способы применения пептидов, полинуклеотидов, экзосом, APC и CTL

Пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для получения или индукции APC и CTL. Экзосомы и APC по настоящему изобретению также можно использовать для получения или индукции CTL. Пептиды, полинуклеотиды, экзосомы и APC можно использовать в комбинации с любыми другими соединениями при условии, что дополнительное соединения не ингибирует их способность к индукции CTL. Таким образом, любую из указанных выше фармацевтических композиций или средств по настоящему изобретению можно использовать для получения или индукции CTL. Кроме того, такие соединения, содержащие пептиды или полинуклеотиды, также можно использовать для получения или индукции APC, как описано ниже.

[0145] (1) Способы индукции антигенпрезентирующих клеток (APC)

Настоящее изобретение относится к способам индукции APC со способностью к индукции CTL с использованием пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению.

Способы по настоящему изобретению включают стадию приведения APC в контакт с пептидами по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo. Например, способ приведения APC в контакт с пептидом ex vivo может включать стадии:

a: получения APC у индивидуума, и

b: приведения APC со стадии "a" в контакт с пептидом по настоящему изобретению.

[0146] APC не ограничены конкретным типом клеток и включают DC, клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки и активированные T-клетки, для которых известно, что они презентируют белковые антигены на своей клеточной поверхности таким образом, чтобы их могли распознавать лимфоциты. Предпочтительно можно использовать DC, т.к. они обладают наибольшей способностью к индукции CTL среди APC. Любой из пептидов по настоящему изобретению можно использовать сам по себе или в комбинации с одним или более из других пептидов по настоящему изобретению и/или одним или более индуцирующими CTL пептидами, получаемыми из TAA, отличных от UBE2T.

[0147] С другой стороны, когда пептиды по настоящему изобретению вводят индивидууму, APC контактируют с пептидами in vivo, и, таким образом, в организме индивидуума происходит индукция APC со способностью к индукции CTL. Таким образом, способ по настоящему изобретению может включать введение пептида по настоящему изобретению индивидууму для индукции APC со способностью к индукции CTL в организме индивидуума. Аналогично, когда индивидууму вводят полинуклеотид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме, экспрессируется пептид по настоящему изобретению и контактирует с APC in vivo, и, таким образом, индуцируется APC со способностью к индукции CTL в организме индивидуума. Таким образом, настоящее изобретение также может включать введение полинуклеотида по настоящему изобретению индивидууму для индукции APC со способностью к индукции CTL в организме индивидуума. Фраза "экспрессируемая форма" описана выше в разделе "IX. Фармацевтические средства или композиции (2) Фармацевтические средства или композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активных ингредиентов".

[0148] Кроме того, способ по настоящему изобретению может включать введение полинуклеотида по настоящему изобретению в APC для индукции APC со способностью к индукции CTL. Например, способ может включать стадии:

a: получения APC у индивидуума, и

b: введения полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC, полученные на стадии "a".

Стадию b можно проводить, как описано выше в разделе "VI. Антигенпрезентирующие клетки".

[0149] Альтернативно, настоящее изобретение относится к способу получения антигенпрезентирующей клетки (APC), которая может специфически индуцировать активность CTL против UBE2T, где способ может включать одну из следующих стадий:

(a) приведение APC в контакт с пептидом по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo; и

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC.

[0150] Альтернативно, настоящее изобретение относится к способам индукции APC со способностью к индукции CTL, где способы включают стадию, выбранную из:

(a) приведения APC в контакт с пептидом по настоящему изобретению; и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC.

[0151] В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индукции или получения APC, обладающих способностью к индукции CTL, где такой способ включает одну из следующих ниже стадий:

(a) приведение APC, экспрессирующей HLA-A24, в контакт с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 27, или его модифицированным пептидом in vitro, ex vivo или in vivo, и

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 27, или его модифицированный пептид, в APC, экспрессирующие HLA-A24.

[0152] Индуцируемые указанным выше способом APC презентируют такие пептиды посредством HLA-A24 на своей поверхности, и могут индуцировать CTL, обладающие специфической цитотоксической активностью против клеток, экспрессирующих HLA-A24 и UBE2T.

[0153] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индукции или получения APC со способностью к индукции CTL, где такой способ включает одну из следующих стадий:

(a) приведение APC, экспрессирующей HLA-A2, в контакт с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58, или его модифицированным пептидом in vitro, ex vivo или in vivo, и

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58, или его модифицированный пептид, в APC, экспрессирующую HLA-A2.

[0154] Индуцируемые указанным выше способом APC презентируют такие пептиды посредством HLA-A2 на своей поверхности, и могут индуцировать CTL, обладающие специфической цитотоксической активностью против клеток, экпрессирующих HLA-A2 и UBE2T.

[0155] Способы по настоящему изобретению можно проводить in vitro, ex vivo или in vivo. Предпочтительно, способы по настоящему изобретению можно проводить in vitro или ex vivo. APC, используемые для индукции APC, обладающих способностью к индукции CTL, предпочтительно могут представлять собой APC, экспрессирующие антиген HLA-A24 или HLA-A2. Такие APC можно получать способами, хорошо известными в данной области, из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), получаемых у индивидуума, у которого HLA-антиген представляет собой HLA-A24 или HLA-A2. APC, индуцируемые способом по настоящему изобретению, могут представлять собой APC, которые презентируют комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-антигена (антигена HLA-A24 или HLA-A2) на своей поверхности. Когда APC, индуцируемые способом по настоящему изобретению, вводят индивидууму для индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли у индивидуума, индивидуум предпочтительно представляет собой одного и того же индивидуума, у которого получали APC. Однако индивидуум может отличаться от донора APC при условии, что индивидуум обладает аналогичным типом HLA с донором APC.

[0156] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к средствам или композициям для применения для индукции APC, обладающей способностью к индукции CTL, и такие средства или композиции содержат один или более пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению.

[0157] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к использованию пептида по настоящему изобретению или полинуклеотида, кодирующего пептид, в производстве средства или композиции, составленной для индукции APC.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к пептиду по настоящему изобретению или полипептиду, кодирующему пептид, для применения для индукции APC, обладающих способностью к индукции CTL.

[0158] (2) Способ индукции CTL

Настоящее изобретение также относится к способам индукции CTL с использованием пептидов, полинуклеотидов или экзосом или APC по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способам индукции CTL с использованием полинуклеотида, кодирующего обе субъединицы TCR, или полинуклеотидов, кодирующих каждую из субъединиц TCR, где TCR, образованный такими субъединицами, может распознавать (связываться) комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA на клеточной поверхности. Предпочтительно, способы индукции CTL могут включать по меньшей мере одну стадию, выбранную из:

a: приведения CD8-положительной T-клетки в контакт с антигенпрезентирующей клеткой, которая презентирует на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению;

b: приведения CD8-положительной T-клетки в контакт с экзосомой, которая презентирует на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению; и

c: введения полинуклеотида, кодирующего обе субъединицы TCR, или полинуклеотидов, кодирующих каждую из субъединиц TCR, в CD8-положительную T-клетку, где TCR, образованный такими субъединицами, может распознавать (связываться) комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA на клеточной поверхности.

[0159] Когда пептиды, полинуклеотиды, APC или экзосомы по настоящему изобретению вводят индивидууму, в организме индивидуума индуцируются CTL, и повышается эффективность иммунного ответа, направленного на злокачественные клетки, экспрессирующие UBE2T. Таким образом, способы по настоящему изобретению могут включать стадию введения индивидууму пептидов, полинуклеотидов, APC или экзосом по настоящему изобретению.

[0160] Альтернативно, CTL также можно индуцировать с использованием их ex vivo или in vivo и, после индукции CTL, активированные CTL можно возвращать индивидууму. Например, способ может включать стадии:

a: получения APC у индивидуума,

b: приведения APC после стадии "a" в контакт с пептидом по настоящему изобретению, и

c: совместного культивирования APC после стадии "b" с CD8-положительными T-клетками.

[0161] APC, которые необходимо совместно культивировать с CD8-положительными T-клетками на указанной выше стадии, также можно получать посредством переноса полинуклеотида по настоящему изобретению в APC, как описано выше в разделе "VI. Антигенпрезентирующие клетки", хотя настоящее изобретение не ограничено этим и, таким образом, включает любые APC, которые эффективно презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению.

[0162] Необязательно можно использовать экзосомы, которые презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению, вместо указанных выше APC. Таким образом, настоящее изобретение может включать стадию совместного культивирования экзосом, презентирующих на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению, и CD8-положительных T-клеток. Такие экзосомы можно получать способами, описанными выше в разделе "V. Экзосомы". Подходящие APC и экзосомы для способа по настоящему изобретению презентируют комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-A24 или HLA-A2 на своей поверхности.

[0163] Например, APC или экзосома, которая презентирует комплекс HLA-A24 и пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 27, (или его модифицированного пептида) на своей поверхности, предпочтительно можно использовать для индукции CTL, обладающего специфической цитотоксической активностью против клетки, экспрессирующей HLA-A24 и UBE2T. Аналогично, APC или экзосому, которые презентируют комплекс HLA-A2 и пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58, (или его модифицированного пептида) на своей поверхности, предпочтительно можно использовать для индукции CTL, обладающего специфической цитотоксической активностью против клетки, экспрессирующей HLA-A2 и UBE2T.

[0164] Кроме того, CTL можно индуцировать введением в CD8-положительную T-клетку полинуклеотида, кодирующего обе субъединицы TCR или полинуклеотидов, кодирующих каждую из субъединиц TCR, где TCR, образованный такими субъединицами, способен связываться с комплексом пептида по изобретению и HLA-антигена на клеточной поверхности. Такую трансдукцию можно проводить, как описано выше в разделе "VIII. T-клеточный рецептор (TCR)".

[0165] Способы по настоящему изобретению можно проводить in vitro, ex vivo или in vivo. Предпочтительно способы по настоящему изобретению можно проводить in vitro или ex vivo. CD8-положительные T-клетки, используемые для индукции CTL, можно получать хорошо известными в данной области способами из PBMC, получаемых у индивидуума. В предпочтительных вариантах осуществления донор CD8-положительных T-клеток может представлять собой индивидуума, у которого HLA-антиген представляет собой HLA-A24 или HLA-A2. CTL, индуцируемые способом по настоящему изобретению, могут представлять собой CTL, которые могут распознавать клетки, презентирующие комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-антигена на своей поверхности. Такие CTL могут проявлять специфическую цитотоксическую активность против клеток, которые презентируют пептид по настоящему изобретению на своей поверхности, и, таким образом, могут проявлять специфическую цитотоксическую активность против клеток, экспрессирующих UBE2T, (например, злокачественных клеток). Когда CTL, индуцируемые способом по настоящему изобретению, вводят индивидууму для индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли у индивидуума, индивидуум предпочтительно представляет собой того же самого индивидуума, у которого получают CD8-положительные T-клетки. Однако индивидуум может представлять собой индивидуума, отличного от донора CD8-положительных T-клеток при условии, что индивидуум имеет одинаковый тип HLA с донором CD8-положительных T-клеток.

[0166] Кроме того, настоящее изобретение относится к способу или процессу производства фармацевтической композиции или средства для индукции CTL, где способ или процесс включает стадию смешивания или составления пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.

[0167] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к средству или композиции для индукции CTL, где средство или композиция содержит один или более пептидов, один или более полинуклеотидов, одну или более APC и/или одну или более экзосом по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению пептида, полинуклеотида, APC или экзосомы по настоящему изобретению для производства средства или композиции, составляемой для индукции CTL.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к пептиду, полинуклеотиду, APC или экзосоме по настоящему изобретению для применения для индукции CTL.

[0168] XI. Способы индукции иммунного ответа

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам индукции иммунного ответа против заболеваний, связанных с UBE2T. Подходящие заболевания включают злокачественную опухоль, примеры которой включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль семенников.

[0169] Способы по настоящему изобретению могут включать стадию введения средства или композиции, содержащих любые пептиды по настоящему изобретению или полинуклеотиды, кодирующие их. Способы по изобретению также предусматривают введение экзосом или APC, презентирующих любые пептиды по настоящему изобретению. Для более подробного описания см. раздел "IX. Фармацевтические средства или композиции", в частности часть, описывающую применение фармацевтических композиций по настоящему изобретению в качестве вакцин. Кроме того, экзосомы и APC, которые можно применять в способах по настоящему изобретению для индукции иммунного ответа, подробно описаны выше в разделах "V. Экзосомы", "VI. Антигенпрезентирующие клетки (APC)" и (1) и (2) из "X. Способы применения пептидов, экзосом, APC и CTL".

[0170] Настоящее изобретение также относится к способу или процессу для производства фармацевтической композиции или средства, которые индуцируют иммунный ответ против злокачественной опухоли, где способ может включать стадию смешивания или составления пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.

[0171] Альтернативно, способ по настоящему изобретению может включать стадию введения вакцины или фармацевтической композиции или средства по настоящему изобретению, которые содержат:

(a) пептид по настоящему изобретению,

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме,

(d) экзосомы, презентирующие пептид по настоящему изобретению на своей поверхности, или

(e) CTL по настоящему изобретению.

[0172] В контексте настоящего изобретения злокачественную опухоль, сверхэкспрессирующую UBE2T, можно лечить этими активными ингредиентами. Примеры такой злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль семенников. Таким образом, перед введением вакцин или фармацевтических композиций или средств, содержащих указанные выше активные ингредиенты, предпочтительно подтверждать, является ли уровень экспрессии UBE2T в злокачественных клетках или тканях, получаемых у индивидуума, подлежащего лечению, повышенным по сравнению с нормальными клетками или тканями, получаемыми у того же индивидуума. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, (сверх)экспрессирующей UBE2T, у нуждающегося в этом пациента, где такой способ включает стадии:

i) определения уровня экспрессии UBE2T в биологическом образце, получаемом у подлежащего лечению индивидуума со злокачественной опухолью;

ii) сравнения уровня экспрессии UBE2T с нормальным контролем, и

iii) введения по меньшей мере одного компонента, выбранного из описанных выше (a)-(e), индивидууму со злокачественной опухолью, сверхэкспрессирующей UBE2T по сравнению с нормальным контролем.

[0173] Альтернативно, настоящее изобретение относится к вакцине или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из описанных выше (a)-(e), для введения индивидууму, страдающему злокачественной опухолью, сверхэкспрессирующей UBE2T. Другими словами, настоящее изобретение дополнительно относится к способу идентификации индивидуума, подлежащего лечению пептидом UBE2T по настоящему изобретению, где такой способ включает стадию определения уровня экспрессии UBE2T в получаемом у индивидуума биологическом образце, где повышение уровня экспрессии по сравнению с нормальным контрольным уровнем гена свидетельствует о том, что индивидуум может страдать злокачественной опухолью, которую можно лечить пептидом UBE2T по настоящему изобретению.

[0174] Кроме того, в предпочтительных вариантах осуществления до введения пептидов по настоящему изобретению у индивидуума можно идентифицировать тип HLA. Например, пептиды, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 27, предпочтительно вводить индивидууму, идентифицированному как носитель HLA-A24. Альтернативно, пептиды, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58, предпочтительно вводить индивидууму, идентифицированному как носителя HLA-A2.

[0175] Любую получаемую у индивидуума клетку или ткань можно использовать для определения уровня экспрессии UBE2T при условии, что они могут содержать продукт транскрипции или трансляции UBE2T. Примеры подходящих образцов включают, но не ограничиваются ими, ткани и жидкости организма, такие как кровь, мокрота и моча. Предпочтительно, получаемый у индивидуума образец клетки или ткани содержит популяцию клеток, содержащих эпителиальную клетку, более предпочтительно злокачественную эпителиальную клетку или эпителиальную клетку, получаемую из злокачественной ткани. Кроме того, при необходимости клетку можно выделять из получаемых тканей и жидкостей организма, а затем использовать в качестве образца, получаемого у индивидуума.

[0176] В соответствии с настоящим изобретением можно определять уровень экспрессии UBE2T в биологическом образце, получаемом у индивидуума. Уровень экспрессии UBE2T можно определять по уровню транскрипции продукта (нуклеиновой кислоты) известными в данной области способами. Например, мРНК UBE2T можно количественно определять с использованием зондов гибридизации способами (например, нозерн-гибридизацией). Детекцию можно проводить на чипе или микропанели. Для детекции уровня экспрессии UBE2T использование микропанели является предпочтительным. Специалисты в данной области могут получать такие зонды с использованием информации о последовательности UBE2T. Например, в качестве зондов можно использовать кДНК UBE2T. При необходимости зонд можно метить подходящей меткой, такой как красители, флуоресцентные вещества и изотопы, и уровень экспрессии UBE2T можно детектировать как интенсивность гибридизуемых меток.

[0177] Кроме того, продукт транскрипции UBE2T можно количественно определять с использованием праймеров способами детекции на основе амплификации (например, ПЦР с обратной транскрипцией). Такие праймеры можно получать на основе доступной информации о последовательности UBE2T.

В частности, зонд или праймер, используемый для способа по настоящему изобретению, гибридизуется с мРНК UBE2T в жестких, умеренно жестких условиях или условиях с низкой жесткостью. Как используют в настоящем описании, фраза "жесткие условия (гибридизация)" относится к условиям, при которых зонд или праймер гибридизуется со своей последовательностью-мишенью, но не с другими последовательностями. Жесткости условия зависят от последовательности и являются различными при различных обстоятельствах. Специфическую гибридизацию более длинных последовательностей наблюдают при более высоких температурах по сравнению с более короткими последовательностями. Как правило, температуру жестких условий выбирают, чтобы она являлась приблизительно на 5 градусов Цельсия ниже температуры теплового плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и pH. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных их последовательности-мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью в равновесном состоянии. Вследствие того, что последовательности-мишени, как правило, содержатся в избытке, при Tm 50% зондов участвуют в равновесном состоянии. Как правило, жесткие условия представляют собой такие, при которых концентрация солей составляет менее приблизительно 1,0 M иона натрия, как правило, приблизительно от 0,01 до 1,0 M иона натрия (или других солей) при pH от 7,0 до 8,3, и температура составляет по меньшей мере приблизительно 30 градусов Цельсия для коротких зондов или праймеров (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60 градусов Цельсия для более длинных зондов или праймеров. Жесткие условия также можно получать при добавлении дестабилизирующих веществ, таких как формамид.

[0178] Зонд или праймер по настоящему изобретению, как правило, представляет собой в значительной степени очищенный олигонуклеотид. Олигонуклеотид, как правило, содержит область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях по меньшей мере с приблизительно 2000, 1000, 500, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 или 25 последовательной нуклеотидной последовательностью смысловой цепи нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность UBE2T, или нуклеотидной последовательностью антисмысловой цепи нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность UBE2T, или природным мутантом таких последовательностей. В частности, например, в предпочтительном варианте осуществления в качестве праймера для амплификации генов, которые необходимо детектировать, можно использовать олигонуклеотид длиной 5-50 нуклеотидов. Более предпочтительно, мРНК или кДНК гена UBE2T можно детектировать с использованием олигонуклеотидного зонда или праймера конкретного размера, как правило, длиной 15-30 пар оснований. Размер может находиться в диапазоне по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 12 нуклеотидов, по меньшей мере 15 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 25 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, и размер зондов и праймеров может находиться в диапазоне 5-10 нуклеотидов, 10-15 нуклеотидов, 15-20 нуклеотидов, 20-25 нуклеотидов и 25-30 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления длину олигонуклеотидного зонда или праймера можно выбирать из 15-25 нуклеотидов. Способ анализа, устройство или реагенты для детекции гена с использованием такого олигонуклеотидного зонда или праймера хорошо известны (например, олигонуклеотидная микропанель или ПЦР). В таких анализах зонды или праймеры также могут содержать метку или линкерные последовательности. Кроме того, зонды или праймеры можно модифицировать детектируемой меткой или аффинным лигандом, который захватывают. Альтернативно, в способах детекции на основе гибридизации для зонда также можно использовать полинуклеотид длиной от нескольких сотен (например, приблизительно 100-200) оснований до нескольких тысяч (например, приблизительно 1000-2000) оснований (например, анализ "нозерн"-блоттинг или анализ на основе кДНК-микропанели).

[0179] Альтернативно, продукт трансляции UBE2T можно детектировать для идентификации индивидуума, подлежащего лечению способом по настоящему изобретению. Например, можно определять количество белка UBE2T (SEQ ID NO: 65). Примеры способов определения количества белка UBE2T в виде продукта трансляции включают способы иммунологического анализа с использованием антитела, специфически распознающего белок UBE2T. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Кроме того, для детекции можно использовать любой фрагмент или модификацию (например, химерное антитело, scFv, Fab, F(ab')₂, Fv и т.д.) антитела при условии, что фрагмент или модифицированное антитело сохраняет способность связываться с белком UBE2T. Способы получения таких типов антител хорошо известны в данной области, и можно использовать любой способ для получения таких антител и их эквивалентов.

[0180] В качестве другого способа детекции уровня экспрессии UBE2T на основе продукта его трансляции, интенсивности окрашивания можно измерять иммуногистохимическим анализом с использованием антитела против белка UBE2T. Таким образом, в этом измерении интенсивное окрашивание указывает на повышенное содержание/уровень белка UBE2T и одновременно на высокий уровень экспрессии UBE2T.

[0181] Можно определять, что уровень экспрессии гена UBE2T в полученном у индивидуума образце повышен, если уровень повышается от контрольного уровня (например, уровня в нормальных клетках) UBE2T, например, на 10%, 25% или 50%, или повышается более чем в 1,1 раза, более чем в 1,5 раза, более чем в 2,0 раза, более чем в 5,0 раз, более чем в 10,0 раз или более.

[0182] Контрольный уровень можно определять одновременно с уровнем в злокачественных клетках с использованием предварительно полученного у здорового индивидуума/индивидуумов и хранящегося образца(ов). Кроме того, в качестве нормального контроля можно использовать нормальные клетки, получаемые из незлокачественных областей органа, который содержит злокачественную опухоль, подлежащую лечению. Альтернативно, контрольный уровень можно определять статистическим способом на основе результатов, получаемых посредством анализа предварительно определяемого уровня(ей) экспрессии UBE2T в образцах у индивидуумов, для которых известны состояния болезни. Кроме того, контрольный уровень можно получать из базы данных профилей экспрессии из ранее тестированных клеток. Кроме того, по одному из аспектов настоящего изобретения уровень экспрессии UBE2T в биологическом образце можно сравнивать со многими контрольными уровнями, которые определяют во многих эталонных образцах. Предпочтительно использовать контрольный уровень, определяемый в эталонном образце, получаемом из ткани аналогичного типа ткани биологического образца, получаемого у индивидуума. Кроме того, предпочтительно использовать стандартные уровни экспрессии гена UBE2T в популяции с известным состоянием болезни. Стандартное значение можно получать любым известным в данной области способом. Например, в качестве стандартного значения можно использовать диапазон значений +/-2 стад. откл. или среднее значение +/-3 станд. откл.

[0183] Разницу между уровнем экспрессии образца и контрольным уровнем можно нормализовать на уровень экспрессии контрольной нуклеиновой кислоты, например, генов "домашнего хозяйства", для которых известно, что их уровни экспрессии не отличаются в зависимости от злокачественного или незлокачественного состояния клетки. Иллюстративные контрольные гены включают, но не ограничиваются ими, бета-актин, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу и рибосомальный белок P1.

Когда уровень экспрессии UBE2T повышается по сравнению с нормальным контрольным уровнем, индивидуума можно идентифицировать как индивидуума со злокачественной опухолью, подлежащего лечению посредством введения фармацевтической композиции или средства по настоящему изобретению.

[0184] Настоящее изобретение также относится к способу отбора индивидуума для лечения злокачественных опухолей с использованием указанных выше фармацевтических композиций или средств по настоящему изобретению, где такой способ включает стадии:

a) определения уровня экспрессии UBE2T в биологическом образце(ах), полученных у индивидуума со злокачественной опухолью;

b) сравнения уровня экспрессии UBE2T, определенного на стадии a), с нормальным контрольным уровнем; и

c) отбора индивидуума для лечения злокачественных опухолей посредством фармацевтических композиций или средств по настоящему изобретению, если уровень экспрессии UBE2T повышен по сравнению с нормальным контрольным уровнем.

[0185] В некоторых вариантах осуществления такой способ после или до стадий a)-c), определенных выше, может дополнительно включать стадию идентификации индивидуума, несущего HLA, выбранный из группы, состоящей из HLA-A24 и HLA-A2. Лечение злокачественных опухолей по настоящему изобретению предпочтительно проводить у индивидуума, который страдает злокачественной опухолью, сверхэкспрессирующей UBE2T, и несет HLA-A24 или HLA-A2. Способы типирования HLA хорошо известны в данной области. Например, хорошо известны способы типирования аллелей HLA на основе ПЦР. Также подходящим средством для идентификации типов HLA индивидуума являются антитела, специфичные для каждой молекулы HLA.

[0186] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к диагностическому набору, содержащему один или более пептидов по настоящему изобретению.

Злокачественную опухоль можно диагностировать посредством детекции антител против пептида по настоящему изобретению в полученном у индивидуума образце (например, крови) с использованием пептида по настоящему изобретению.

Индивидуума полагают страдающим злокачественной опухолью, если полученный у индивидуума образец (например, образец крови) содержит антитела против пептида по настоящему изобретению, и определяют, что количество антител составляет более чем пороговое значение по сравнению с контрольным уровнем.

[0187] В другом варианте осуществления диагностический набор по настоящему изобретению может содержать пептид по настоящему изобретению и молекулу HLA, связывающуюся с ним. Уже установлен способ детекции антигенспецифических CTL с использованием антигенных пептидов и молекул HLA (например, Altman J.D. et al., Science, 1996, 274(5284): 94-6). Таким образом, комплекс пептида по настоящему изобретению и молекулы HLA можно применять для способа детекции для детекции специфических к опухолевым антигенам CTL, таким образом, обеспечивая раннюю детекцию рецидива и/или метастазирования злокачественной опухоли. Кроме того, его можно применять для отбора индивидуумов, для которых можно применять фармацевтическую композицию или средство, содержащие в качестве активного ингредиента пептид по настоящему изобретению, или оценки эффекта лечения фармацевтической композицией или средством.

[0188] В частности, известным способом (см., например, Altman J.D. et al., Science, 1996, 274(5284): 94-6) можно получать олигомерный комплекс, такой как тетрамер, радиоактивно меченой молекулы HLA и пептида по настоящему изобретению. С использованием комплекса можно проводить диагностику, например, путем количественного определения специфических к антигену-пептиду CTL в лимфоцитах периферической крови, получаемых у индивидуума, у которого подозревают злокачественную опухоль.

[0189] Настоящее изобретение дополнительно относится к способам и диагностическим средствам для оценки иммунного ответа индивидуума с использованием пептида по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления изобретения пептиды по настоящему изобретению используют в качестве реагентов для оценки или прогнозирования иммунного ответа индивидуума. Подлежащий оценке иммунный ответ индуцируют путем приведения иммуногена (т.е. пептида по настоящему изобретению) в контакт с иммунокомпетентными клетками in vitro или in vivo. В предпочтительных вариантах осуществления иммунокомпетентные клетки для индукции иммунного ответа можно выбирать из клетки периферической крови, лимфоцита периферической крови (PBL) и мононуклеарной клетки периферической крови (PBMC). Системы анализа, которые используют для такого анализа, включают относительно недавние технические открытия, такие как анализы окрашивания тетрамеров, анализы внутриклеточного окрашивания на лимфокины и анализы высвобождения интерферона или анализы ELISPOT. В предпочтительном варианте осуществления иммунокомпетентные клетки, которые необходимо приводить в контакт с пептидным реагентом, могут представлять собой антигенпрезентирующие клетки, включая дендритные клетки.

[0190] Например, пептиды по настоящему изобретению можно использовать в анализах с окрашиванием тетрамерами для оценки мононуклеарных клеток периферической крови на наличие антигенспецифических CTL после экспонирования антигеном или иммуногеном опухолевой клетки. Тетрамерный комплекс HLA можно использовать для непосредственной визуализации антигенспецифических CTL (см., например, Ogg et al., Science, 279: 2103-2106, 1998; и Altman et al., Science, 174: 94-96, 1996) и определения частоты популяции антигенспецифических CTL в образце мононуклеарных клеток периферической крови. Тетрамерный реагент, в котором используют пептид по изобретению, можно получать, как описано ниже.

[0191] Пептид, который связывается с молекулой HLA, повторно сворачивается в присутствии соответствующей тяжелой цепи HLA и бета-2-микроглобулина с образованием трехмолекулярного комплекса. В комплексе карбоксильный конец тяжелой цепи является биотинилированным на участке, который предварительно встраивали в белок. Затем к комплексу добавляют стрептавидин с образованием тетрамера, состоящего из трехмолекулярного комплекса и стрептавидина. Посредством флуоресцентно меченого стрептавидина тетрамер можно использовать для окрашивания антигенспецифических клеток. Затем можно идентифицировать клетки, например, посредством проточной цитометрии. Такой анализ можно использовать для диагностических или прогностических целей. Идентифицированные таким способом клетки также можно использовать для терапевтических целей.

[0192] Пептиды по настоящему изобретению также можно использовать для получения антител хорошо известными в данной области способами (см., например, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, и Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), которые могут являться пригодными в качестве реагентов для диагностики или наблюдения за злокачественной опухолью. Такие антитела могут включать антитела, которые распознают пептид в отношении молекулы HLA, т.е. антитела, которые связываются с комплексом пептид-MHC.

[0193] Пептиды и композиции по настоящему изобретению имеют ряд дополнительный применений, некоторые из которых описаны в настоящем описании. Например, настоящее изобретение относится к способу диагностики или детекции нарушения, характеризующегося экспрессией полипептида UBE2T.

[0194] Например, диагностику можно проводить способом, который обеспечивает прямое количественное определение антигенспецифических T-клеток путем окрашивания меченных флуоресцеином мультимерных комплексов HLA (например, Altman J.D. et al., 1996, Science, 274: 94; Altman J.D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10330). Также можно использовать окрашивание на внутриклеточные лимфокины и анализы выделения интерферона-гамма или анализы ELISPOT. Показано, что окрашивание тетрамерами, окрашивание внутриклеточных лимфокинов и анализы ELISPOT являются по меньшей мере в 10 раз более чувствительными, чем общепринятые анализы (Murali-Krishna K. et al., 1998, Immunity, 8: 177; Lalvani A. et al., 1997, J. Exp. Med., 186: 859; Dunbar P.R. et al., 1998, Curr. Biol., 8: 413). Также можно использовать пентамеры (например, US 2004-209295A), декстрамеры (например, WO 02/072631) и стрептамеры (например, Nature medicine, 6, 631-637 (2002)).

[0195] Например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики или оценки иммунного ответа индивидуума, которому вводили по меньшей мере один из пептидов UBE2T по настоящему изобретению, где способ включает стадии:

(a) приведения иммуногена в контакт с иммунокомпетентными клетками в условиях, подходящих для индукции CTL, специфического к иммуногену;

(b) детектирования или детекции индуцируемого уровня CTL, индуцируемого на стадии (a), и

[0196] В настоящем изобретении иммуноген представляет собой по меньшей мере один из пептидов UBE2T, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58, и пептидов, в которых такие аминокислотные последовательности модифицировали 1, 2 или более заменами аминокислот. В то же время условия, подходящие для индукции иммуногенных специфических CTL, хорошо известны в данной области. Например, иммунокомпетентные клетки можно культивировать in vitro в присутствии иммуногена(ов) для индукции специфических к иммуногену CTL. Для индукции специфических к иммуногену CTL к культуре клеток можно добавлять любые стимулирующие факторы. Например, для индукции CTL IL-2 представляют собой предпочтительные стимулирующие факторы.

[0197] В некоторых вариантах осуществления стадию мониторинга или оценки иммунного ответа индивидуума, подлежащего лечению пептидной терапией злокачественной опухоли, можно проводить до, во время и/или после лечения. Как правило, в условиях протокола терапии злокачественной опухоли иммуногенные пептиды многократно вводят индивидууму, подлежащего лечению. Например, иммуногенные пептиды можно вводить каждую неделю в течение 3-10 недель. Таким образом, иммунный ответ индивидуума можно оценивать или наблюдать в условиях протокола терапии злокачественной опухоли. Альтернативно, стадию оценки или мониторинга иммунного ответа на терапию злокачественной опухоли можно проводить по окончанию протокола терапии.

[0198] По настоящему изобретению усиленная индукция специфического к иммуногену CTL по сравнению с контролем свидетельствует о том, что индивидуум, для которого проводили оценку или диагностику, иммунологически реагировал на иммуноген(ы), которые вводили. Подходящие контроли для оценки иммунного ответа могут включать, например, уровень индукции CTL, когда иммунокомпетентные клетки не приводят в контакт с пептидом, или контрольный пептид(ы), содержащий аминокислотные последовательности, отличные от любых пептидов UBE2T (например, случайную аминокислотную последовательность).

[0199] XII. Антитела

Настоящее изобретение дополнительно относится к антителам, которые связываются с пептидами по настоящему изобретению. Предпочтительные антитела специфически связываются с пептидами по настоящему изобретению и не связываются (или слабо связываются) с пептидами, отличными от пептидов по настоящему изобретению.

[0200] Антитела против пептидов по настоящему изобретению могут находить применение в диагностике злокачественной опухоли и прогностических анализах. Аналогично, такие антитела могут находить применение при лечении, диагностике и/или прогнозировании злокачественных опухолей в тех случаях, когда UBE2T также экспрессируется или сверхэкспрессируется при злокачественной опухоли. Кроме того, внутриклеточно экспрессируемые антитела (например, одноцепочечные антитела) можно терапевтически использовать для лечения злокачественных опухолей, в которых участвует сверхэкспрессия UBE2T, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль семенников.

[0201] Настоящее изобретение также относится к различным иммунологическим анализам для детекции и/или количественного определения белка UBE2T (SEQ ID NO: 65) или его фрагментов, включая пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58. В контексте настоящего изобретения антитела, связывающиеся с полипептидом UBE2T, предпочтительно распознают полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58. Специфичность связывания антитела можно подтверждать тестом ингибирования. Таким образом, когда связывание анализируемого антитела и полноразмерного полипептида UBE2T ингибируется в присутствии любого фрагмента, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58, считается, что оно специфически связывается с фрагментом. В контексте настоящего изобретения такие иммунологические анализы проводят в различных форматах иммунологического анализа, известного в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, различные типы радиоиммунологического анализа, иммунохроматографического способа, твердофазных иммуноферментных анализов (ELISA), твердофазных иммунофлуоресцентных анализов (ELIFA) и т.п.

[0202] Связанные иммунологические анализы, но не на основе антител, могут включать анализы иммуногенности T-клеток (ингибирования или стимуляции), а также анализы связывания MHC. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает способы иммунологической визуализации, которыми можно детектировать злокачественные опухоли, экспрессирующие UBE2T, пример которых включает, но не ограничивается ими, способы радиосцинтиграфической визуализации с использованием меченых антител по настоящему изобретению. Такие анализы находят клиническое применение при детекции, мониторинге и прогнозировании экспрессирующих UBE2T злокачественных опухолей, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль семенников.

[0203] Антитело по настоящему изобретению можно использовать в любой форме, например, в виде моноклонального или поликлонального антитела, и оно может дополнительно включать антисыворотку, получаемую иммунизацией животного, такого как кролик, пептидом по настоящему изобретению, все классы поликлональных и моноклональных антител, антитела человека и гуманизированные антитела, получаемые генетической рекомбинацией.

[0204] Антитело по настоящему изобретению может распознавать пептиды UBE2T, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58. Способы синтеза олигопептида хорошо известны в данной области. После синтеза пептиды можно необязательно очищать перед использованием в качестве иммуногена. В контексте настоящего изобретения олигопептид (например, 9- или 10-мер) можно конъюгировать или связывать с носителями для повышения иммуногенности. В качестве носителя хорошо известным является гемоцианин фиссуреллы (KLH). Способ конъюгации KLH и пептида также хорошо известен в данной области.

[0205] Альтернативно, ген, кодирующий пептид по настоящему изобретению, можно встраивать в известный экспрессирующий вектор, который затем используют для трансформации клетки-хозяина, как описано в настоящем описании. Желаемый пептид можно выделять из внешней или внутренней частей клеток-хозяев любым стандартным способом, а затем можно использовать в качестве антигена. Альтернативно, в качестве антигена можно использовать цельные клетки, экспрессирующие пептид, или их лизаты и химически синтезированный пептид.

[0206] Антигеном можно иммунизировать любое млекопитающее животное, однако предпочтительно учитывать совместимость с клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, можно использовать животных семейства Rodentia, Lagomorpha или Primate. Животные семейства Rodentia включают, например, мышь, крысу и хомяка. Животные семейства Lagomorpha включают, например, кролика. Животные семейства Primate включают, например, обезьяну Catarrhini (обезьяна Старого Света), такую как Macaca fascicularis, макака-резус, гамадрил и шимпанзе.

[0207] Способы иммунизации животных антигенами являются известными в данной области. Внутрибрюшинная инъекция или подкожная инъекция антигенов представляет собой стандартный способ иммунизации млекопитающих. Более конкретно, антигены можно разбавлять и суспендировать в подходящем количестве фосфатно-солевого буфера (PBS), физиологического раствора и т.д. При необходимости суспензию антигена можно смешивать с подходящим количеством стандартного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда, составлять в виде эмульсии, а затем вводить млекопитающим животным. Предпочтительно с последующими несколькими введениями антигена, смешанного с подходящим количеством неполного адъюванта Фрейнда на каждые 4-21 сутки. Для иммунизации также можно использовать подходящий носитель. После иммунизации, как описано выше, можно анализировать сыворотку стандартным способом в отношении увеличения количества желаемых антител.

[0208] Поликлональные антитела против пептидов по настоящему изобретению можно получать путем сбора крови у иммунизированного млекопитающего, у которого анализируют повышение уровня желаемых антител в сыворотке, и отделения сыворотки от крови любым общепринятым способом. Поликлональные антитела могут включать сыворотку, содержащую поликлональные антитела, а также из сыворотки можно выделять фракцию, содержащую поликлональные антитела. Иммуноглобулин G или M можно получать из фракции, которая распознает только пептид по настоящему изобретению, например, с использованием аффинной колонки, связанной с пептидом по настоящему изобретению, и дополнительно очищая такую фракцию с использованием колонки с белком A или белком G.

[0209] Для получения моноклональных антител иммунные клетки собирают у млекопитающего, иммунизированного антигеном, и исследуют на повышенный уровень желаемого антитела в сыворотке, как описано выше, и подвергают слиянию клеток. Иммунные клетки, используемые для слияния клеток, можно предпочтительно получать из селезенки. Другие предпочтительные родительские клетки для слияния с указанным выше иммуноцитом включают, например, миеломные клетки млекопитающих, и более предпочтительно миеломные клетки, обладающие приобретенным свойством для отбора слитых клеток посредством лекарственных средств.

Указанные выше иммуноциты и миеломные клетки можно подвергать слиянию известными способами, например, способом Milstein et al. (Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).

[0210] Гибридомы, получаемые слиянием клеток, можно отбирать путем их культивирования в стандартной селективной среде, такой как среда HAT (содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин среда). Культуру клеток, как правило, поддерживают в среде HAT в течение от нескольких суток до нескольких недель, где период времени является достаточным для обеспечения гибели всех других клеток (неслитых клеток) за исключением желаемой гибридомы. Затем можно проводить стандартное лимитирующее разведение для скрининга и клонирования гибридомной клетки, продуцирующей желаемое антитело.

[0211] В дополнение к указанному выше способу, где не являющееся человеком животное иммунизируют антигеном для получения гибридомы, лимфоциты человека, такие как лимфоциты, инфицированные вирусом EB, можно иммунизировать пептидом, экспрессирующими пептид клетками или их лизатами in vitro. Затем иммунизированные лимфоциты подвергают слиянию с получаемыми у человека миеломными клетками, которые способны к неограниченному делению, такими как U266, с получением гибридомы, продуцирующей желаемое антитело человека, которое способно связываться с пептидом (нерассматриваемая опубликованная патентная заявка Японии №S 63-17688).

[0212] Затем получаемые гибридомы трансплантируют в брюшную полость мыши и отбирают асцит. Получаемые моноклональные антитела можно очищать, например, осаждением сульфатом аммония, на колонке с белком A или белком G, ионообменной хроматографией DEAE или на аффинной колонке, с которой связан пептид по настоящему изобретению. Антитело по настоящему изобретению можно использовать не только для очистки и детекции пептида по настоящему изобретению, а также в качестве кандидата для агонистов и антагонистов пептида по настоящему изобретению.

[0213] Моноклональные антитела, получаемые таким образом, также можно получать рекомбинантно способами генетической инженерии (см., например, Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, опубликованных в the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD (1990)). Например, кодирующую антитело ДНК можно клонировать из иммунной клетки, такой как гибридома или иммунизированный лимфоцит, продуцирующий антитело, встраивать в подходящий вектор и вводить в клетки-хозяева для получения рекомбинантного антитела. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным антителам, получаемым, как описано выше.

[0214] Кроме того, антитело по настоящему изобретению может представлять собой фрагмент антитела или модифицированное антитело при условии, что оно связывается с одним или более пептидов по изобретению. Например, фрагмент антитела может представлять собой Fab, F(ab')₂, Fv или одноцепочечный Fv (scFv), в котором фрагменты Fv из H- и L-цепей лигированы с подходящим линкером (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83 (1988)). Более конкретно, фрагмент антитела можно получать обработкой антитела ферментом, таким как папаин или пепсин. Альтернативно, ген, кодирующий фрагмент антитела, можно конструировать, встраивать в экспрессирующий вектор и экспрессировать в подходящей клетке-хозяине (см., например, Co et al., J. Immunol., 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol., 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol., 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol., 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol., 121: 663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol., 9: 132-7 (1991)).

[0215] Антитело можно модифицировать конъюгацией с рядом молекул, таких как полиэтиленгликоль (PEG). Настоящее изобретение относится к таким модифицированным антителам. Модифицированное антитело можно получать химической модификацией антитела. Такие способы модификации являются общепринятыми в данной области.

[0216] Альтернативно, антитело по настоящему изобретению можно получать в виде химерного антитела, между вариабельной областью, получаемой из не принадлежащего человеку антитела, и константной областью, получаемой из антитела человека, или в виде гуманизированного антитела, содержащего определяющую комплементарность область (CDR), получаемую из не принадлежащего человеку антитела, каркасную область (FR) и константную область, получаемые из антитела человека. Такие антитела можно получать известным способом. Гуманизацию можно проводить путем замены CDR грызуна или последовательностей CDR на соответствующие последовательности антитела человека (см., например, Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)). Таким образом, такие гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела, в котором по существу менее одного интактного вариабельного домена человека заменяли соответствующей последовательностью от не являющихся человеком видов.

[0217] Также можно использовать полностью человеческие антитела, содержащие вариабельные области человека в дополнение к каркасной и константной областям человека. Такие антитела можно получать различными известными в данной области способами. Например, способы in vitro включают использование рекомбинантных библиотек фрагментов антител человека, представленных на бактериофаге (например, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)). Аналогично, антитела человека можно получать введением локуса иммуноглобулина человека трансгенным животным, например, мышам, у которых полностью или частично инактивировали гены эндогенного иммуноглобулина. Такой подход описан, например, в патентах США №№6150584, 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016.

[0218] Получаемые, как указано выше, антитела можно очищать до однородного состояния. Например, разделение и очистку антител можно проводить способами разделения и очистки для основных белков. Например, антитело можно разделять и выделять соответствующим образом отобранным и комбинированным применением хроматографических колонок, таких как аффинная хроматография, фильтр, ультрафильтрация, высаливание, диализ, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS и изоэлектрофокусирование (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), но не ограничены ими. В качестве аффинной колонки можно использовать колонку с белком A и колонку с белком G. Иллюстративные колонки с белком A, которые можно использовать, включают, например, Hyper D, POROS и Sepharose F.F. (Pharmacia).

[0219] Иллюстративная хроматография кроме аффинной включает, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию с обращенной фазой, адсорбционную хроматографию и т.п. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Хроматографические способы можно проводить посредством жидкофазной хроматографии, такой как ВЭЖХ и ЖХБР.

[0220] Например, для измерения активности связывания с антигеном антител по изобретению можно использовать измерение оптической плотности, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), ферментный иммунологический анализ (EIA), радиоиммунологический анализ (RIA) и/или иммунофлуоресценцию. В ELISA антитело по настоящему изобретению иммобилизуют на планшете, на планшет наносят пептид по настоящему изобретению, а затем наносят образец, содержащий желаемое антитело, такой как культуральный супернатант от продуцирующих антитела клеток или очищенные антитела. Затем наносят вторичное антитело, которое распознает первичное антитело и является меченым ферментом, таким как щелочная фосфатаза, и инкубируют планшет. Затем после промывания к планшету добавляют субстрат фермента, такой как пара-нитрофенилфосфат, и измеряют оптическую плотность для оценки активности связывания с антигеном образца. Для оценки активности антитела по настоящему изобретению можно использовать BIAcore (Pharmacia).

[0221] XIII. Векторы и клетки-хозяева

Настоящее изобретение также относится к вектору и клетке-хозяину, в которые вводят полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению. Вектор по настоящему изобретению можно использовать для удержания полинуклеотида, особенно ДНК, по настоящему изобретению в клетке-хозяине для экспрессии пептида по настоящему изобретению или для введения полинуклеотида по настоящему изобретению для генотерапии.

[0222] Когда клеткой-хозяином является E. coli и вектор амплифицируют и в большом количестве получают в E. coli (например, JM109, DH5-альфа, HB101 или XL1Blue), вектор для амплификации в E. coli должен содержать "ori" и маркерный ген для отбора трансформированных E. coli (например, ген устойчивости к лекарственному средству, отбираемый посредством лекарственного средства, такого как ампициллин, тетрациклин, канамицин, хлорамфеникол или т.п.). Например, можно использовать векторы серии M13, векторы серии pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script и т.д. Кроме того, pGEM-T, pDIRECT и pT7 также можно использовать для субклонирования и выделения кДНК, а также описанные выше векторы. Когда вектор используют для получения пептида по настоящему изобретению, можно использовать экспрессирующий вектор. Например, экспрессирующий вектор, который необходимо экспрессировать в E. coli, должен обладать указанными выше характеристиками, чтобы амплифицироваться в E. coli. Когда в качестве клетки-хозяина используют E. coli, такую как JM109, DH5-альфа, HB101 или XL1Blue, вектор должен содержать промотор, например, промотор lacZ (Ward et al., Nature, 341: 544-6 (1989); FASEB J., 6: 2422-7 (1992)), промотор araB (Better et al., Science, 240: 1041-3 (1988)), промотор T7 или т.п., который может эффективно экспрессировать желаемый ген в E. coli. При этом можно использовать, например, pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP и pET (в этом случае хозяин предпочтительно представляет собой BL21, который экспрессирует РНК-полимеразу T7), вместо указанных выше векторов. Кроме того, вектор также может содержать сигнальную последовательность для секреции пептида. Иллюстративная сигнальная последовательность, которая направляет секрецию пептида в периплазму E. coli, представляет собой сигнальную последовательность pelB (Lei et al., J. Bacteriol., 169: 4379 (1987)). Способы введения векторов в целевые клетки-хозяева включают, например, способ с хлоридом кальция и способ электропорации.

[0223] В дополнение к E. coli для получения пептида по настоящему изобретению можно использовать, например, экспрессирующие векторы, получаемые у млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen) и pEGF-BOS (Mizushima S,et al., Nucleic Acids Res., 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), экспрессирующие векторы, получаемые из клеток насекомых (например, "бакуловирусную экспрессирующую систему Bac-to-BAC" (GIBCO BRL), pBacPAK8), экспрессирующие векторы, получаемые из растений (например, pMH1, pMH2), экспрессирующие векторы, получаемые из вирусов животных (например, pHSV, pMV, pAdexLcw), экспрессирующие векторы, получаемые из ретровирусов (например, pZIpneo), экспрессирующий вектор, получаемый из дрожжей (например, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01), и экспрессирующие векторы, получаемые из Bacillus subtilis (например, pPL608, pKTH50).

[0224] Для экспрессии вектора в животных клетках, таких как клетки CHO, COS или NIH3T3, вектор должен содержать промотор, необходимый для экспрессии в таких клетках, например, промотор SV40 (Mulligan et al., Nature, 277: 108 (1979)), промотор MMLV-LTR, промотор EF1-альфа (Mizushima et al., Nucleic Acids Res., 18: 5322 (1990)), промотор CMV и т.п., и предпочтительно маркерный ген для отбора трансформантов (например, ген устойчивости к лекарственному средству, отбираемый посредством лекарственного средства (например, неомицина, G418)). Примеры известных векторов с такими характеристиками включают, например, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.

[0225] Хотя в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать способы и вещества, аналогичные или эквивалентные способам и веществам, описываемым в настоящем документе, описаны подходящие способы и вещества. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, приводимые в настоящем документе, полностью включены в качестве ссылки. В случае конфликта преимущество имеет настоящее описание, включая определения. Кроме того, вещества, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Примеры

[0226] Эксперимент 1

Вещества и способы

Линии клеток

TISI, HLA-A*2402-положительную B-лимфобластоидную линию клеток приобретали в IHWG Cell and Gene Bank (Seattle, WA). T2, HLA-A*0201-положительную B-лимфобластоидную линию клеток, и COS7, линию клеток почки африканской зеленой мартышки приобретали в ATCC.

[0227] Отбор пептидов-кандидатов, получаемых из UBE2T

9-мерные и 10-мерные пептиды, получаемые из UBE2T, которые связываются с молекулой HLA-A*2402 или HLA-A*0201, теоретически рассчитывали с использованием сервера для теоретического расчета связывания "NetMHC3.2" (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus et al., Tissue Antigens., 2003 Nov, 62(5): 378-84; Nielsen et al., Protein Sci., 2003 May, 12(5): 1007-17, Bioinformatics., 2004, Jun 12, 20(9): 1388-97) и "BIMAS" (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker et al., J. Immunol. 1994, 152(1): 163-75, Kuzushima et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81). Эти пептиды синтезировали посредством Biosynthesis (Lewisville, Texas) стандартным способом твердофазного синтеза и очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с обращенной фазой. Чистоту (>90%) и идентичность пептидов определяли аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрическим анализом соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде при 20 мг/мл и хранили при -80 градусов Цельсия.

[0228] Индукция CTL in vitro

Получаемые из моноцитов дендритные клетки (DC) использовали в качестве антигенпрезентирующих клеток для индукции ответов цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) против пептидов, презентируемых на лейкоцитарном антигене человека (HLA). DC получали in vitro, как описано в другом месте (Nakahara S. et al., Cancer Res, 2003, 63(14): 4112-8). В частности, выделяли мононуклеарные клетки периферической крови у здорового добровольца (HLA-A*2402- или HLA-A*0201-положительные) посредством раствора Ficoll-Plaque (Pharmacia), отделяли посредством прикрепления к пластиковой чашке для тканевой культуры (Becton Dickinson), таким образом, чтобы обогащать их в виде фракции моноцитов. Обогащенную моноцитами популяцию культивировали в присутствии 1000 Ед/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (R&D System) и 1000 Ед/мл интерлейкина (IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированной нагреванием аутологичной сыворотки (AS). Через 7 суток культивирования индуцированные цитокином DC сенсибилизировали 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в присутствии 3 мкг/мл бета-2-микроглобулина в течение 3 часов при 37 градусах Цельсия в среде AIM-V. Показано, что получаемые клетки экспрессируют DC-ассоциированные молекулы, такие как CD80, CD83, CD86 и HLA класс II, на своей клеточной поверхности (данные не показаны). Такие сенсибилизированные пептидом DC затем инактивировали рентгеновским облучением (20 Гр) и смешиванием в отношении 1:20 с аутологическими CD8⁺ T-клетками, получаемыми положительным отбором с использованием набора CD8 Positive Isolation (Dynal). Эти культуры устанавливали в 48-луночных планшетах (Corning), каждая лунка содержала 1,5×10⁴ сенсибилизированных пептидом DC, 3×10⁵ CD8⁺ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл среды AIM-V/2% AS. Через трое суток к этим культурам добавляли IL-2 (CHIRON) до конечной концентрации 20 МЕд/мл. На сутки 7 и 14 T-клетки дополнительно стимулировали аутологическими сенсибилизированными пептидом DC. Каждый раз DC получали одним и тем же способом, описанным выше. CTL тестировали против сенсибилизированных пептидом клеток TISI или сенсибилизированных пептидом клеток T2 после 3-ей стадии стимуляции пептида на сутки 21 (Tanaka H. et al., Br. J. Cancer, 2001, 84(1): 94-9; Umano Y. et al., Br. J. Cancer, 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N. et al., Clin. Cancer Res., 2004, 10(24): 8577-86; Suda T. et al., Cancer Sci., 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T. et al., Cancer Sci., 2005, 96(8): 498-506).

[0229] Способ размножения CTL

CTL размножали в культуре способом, аналогичным способу, описанному Riddell et al. (Walter E.A. et al., N. Engl. J. Med., 1995, 333(16): 1038-44; Riddell S.R. et al., Nat. Med., 1996, 2(2): 216-23). Общий объем 5×10⁴ CTL суспендировали в 25 мл среды AIM-V/5% AS с 2 типами B-лимфобластоидных линий клеток человека, инактивированных митомицином C, в присутствии 40 нг/мл моноклонального антитела против CD3 (Pharmingen). Через сутки после инициации культур к культурам добавляли 120 МЕд/мл IL-2. Культуры подпитывали свежей средой AIM-V/5% AS, содержащей 30 МЕд/мл IL-2, на сутки 5, 8 и 11 (Tanaka H. et al., Br. J. Cancer, 2001, 84(1): 94-9; Umano Y. et al., Br. J. Cancer, 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N. et al., Clin. Cancer Res., 2004, 10(24): 8577-86; Suda T. et al., Cancer Sc., 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T. et al., Cancer Sci., 2005, 96(8): 498-506).

[0230] Получение клонов CTL

Проводили разведения с получением 0,3, 1 и 3 CTL/лунку в 96-луночном микротитрационном планшете с лунками с круглым дном (Nalge Nunc International). CTL культивировали с 1×10⁴ клеток/лунку 2 типами B-лимфобластоидных линий клеток человека, 30 нг/мл антител против CD3 и 125 Ед/мл IL-2 всего 150 мкл/лунку среды AIM-V, содержащей 5% AS. Через 10 суток к среде добавляли 50 мкл/лунку IL-2 с получением конечной концентрации 125 Ед/мл IL-2. Активность CTL тестировали на 14 сутки, и размножали клоны CTL аналогичным способом, как описано выше (Uchida N. et al., Clin. Cancer Res., 2004, 10(24): 8577-86; Suda T. et al., Cancer Sci., 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T. et al., Cancer Sci., 2005, 96(8): 498-506).

[0231] Специфическая активность CTL

Для анализа специфической активности CTL проводили анализ иммуноферментных пятен (ELISPOT) интерферона (IFN)-гамма и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) IFN-гамма. Конкретно, в качестве клеток-стимуляторов получали сенсибилизированные пептидом клетки TISI или сенсибилизированные пептидом клетки T2 (1×10⁴/лунку). В качестве иммунореактивных клеток использовали культивируемые клетки в 48 лунках. Анализ ELISPOT IFN-гамма и анализ ELISA IFN-гамма проводили в соответствии с инструкциями производителя.

[0232] Получение клеток, эффективно экспрессирующих целевой ген HLA-A24 или HLA-A2 или оба

кДНК, кодирующую открытую рамку считывания UBE2T, HLA-A*2402 или HLA-A*0201, амплифицировали ПЦР. ПЦР-продукт амплификации клонировали в экспрессирующий вектор. Векторы трансфицировали в клетки COS7, которые представляют собой линию клеток, "нулевую" по отношению к UBE2T, HLA-A*0201 и HLA-A*2402, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Через 2 суток после трансфекции трансфицированные клетки собирали с использованием версена (Invitrogen) и использовали в качестве клеток-мишеней (5×10⁴ клеток/лунку) для анализа активности CTL.

[0233] Результаты

Усиленная экспрессия UBE2T в злокачественных опухолях

Данные широкого профиля экспрессии гена, получаемые из различных злокачественных опухолей с использованием кДНК-микропанели, выявили, что экспрессия UBE2T (номер доступа GeneBank NM_014176 (SEQ ID No: 64)) являлась повышенной. Экспрессия UBE2T по сравнению с соответствующими нормальными тканями являлась достоверно повышенной в 24 из 24 случаев рака мочевого пузыря, 44 из 50 случаев рака молочной железы, 14 из 15 случаев рака шейки матки, 12 из 12 случаев холангиоцеллюлярной карциномы, 9 из 16 случаев CML, 9 из 9 случаев колоректального рака, 31 из 47 случаев рака пищевода, 5 из 8 случаев рака желудка, 2 из 2 случаев рака желудка диффузного типа, 23 из 27 случаев NSCLC, 3 из 3 случаев лимфомы, 9 из 16 случаев остеосаркомы, 3 из 7 случаев рака яичника, 3 из 3 случаев рака поджелудочной железы, 21 из 23 случаев рака предстательной железы, 12 из 12 случаев SCLC, 11 из 26 случаев опухоли мягких тканей и 7 из 9 случаев опухоли семенников (таблица 1).

[0234]

Таблица 1
Отношение случаев наблюдаемой повышенной экспрессии UBE2T в тканях злокачественных опухолей по сравнению с соответствующими нормальными тканямиЗлокачественная опухоль/ОпухольОтношениеРак мочевого пузыря24/24Рак молочной железы44/50Рак шейки матки14/15Холангиоцеллюлярная карцинома12/12CML9/16Колоректальный рак9/9Рак пищевода31/47Рак желудка5/8Рак желудка диффузного типа2/2NSCLC23/27Лимфома3/3Остеосаркома9/16Рак яичника3/7Рак поджелудочной железы3/3Рак предстательной железы21/23SCLC12/12Опухоль мягких тканей11/26Опухоль семенников7/9

[0235] Прогнозирование связывающихся с HLA-A24 пептидов, получаемых из UBE2T

В таблице 2а и 2b представлено связывание с HLA-A24 9-мерных и 10-мерных пептидов UBE2T в порядке повышения аффинности связывания. Выбирали всего 27 пептидов с потенциальной способностью связываться с HLA-A24, и исследовали для определения пептидов-эпитопов.

[0236]

[0237]

Начальное положение указывает на число аминокислотных остатков от N-конца UBE2T.

Показатели связывания и константу диссоциации [Kd (нМ)] получают из "BIMAS" и "NetMHC3.2", соответственно.

[0238] Прогнозирование связывающихся с HLA-A02 пептидов, получаемых из UBE2T

В таблицах 3а и 3b представлены связывающиеся с HLA-A029-мерные и 10-мерные пептиды UBE2T в порядке повышения аффинности связывания. Выбирали всего 36 пептидов с потенциальной способностью связываться с HLA-A02 и исследовали для определения пептидов-эпитопов.

[0239]

[0240]

Начальное положение указывает на число аминокислотных остатков от N-конца UBE2T.

Показатели связывания и константу диссоциации [Kd (нМ)] получают из "BIMAS" и "NetMHC3.2", соответственно.

[0241] Индукция CTL теоретически рассчитанными пептидами из UBE2T, рестриктированными по HLA-A*2402

В соответствии с протоколами, как описано в "Веществах и способах", получали CTL для таких пептидов, получаемых из UBE2T. Пептид-специфическую активность CTL детектировали анализом ELISPOT на IFN-гамма (фигура 1). Показано, что в лунке №8, стимулируемой UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1) (а), №1, стимулируемой UBE2T-A24-9-45 (SEQ ID NO: 2) (b), №6, стимулируемой UBE2T-A24-9-133 (SEQ ID NO: 4) (с), №6, стимулируемой UBE2T-A24-9-138 (SEQ ID NO: 6) (d), №4, стимулируемой UBE2T-A24-9-43 (SEQ ID NO: 11) (e), №2, стимулируемой UBE2T-A24-9-106 (SEQ ID NO: 12) (f), №6, стимулируемой UBE2T-A24-9-3 (SEQ ID NO: 13) (g), №3, стимулируемой UBE2T-A24-9-105 (SEQ ID NO: 15) (h), №2, стимулируемой UBE2T-A24-10-130 (SEQ ID NO: 17) (i), №1, стимулируемой UBE2T-A24-10-131 (SEQ ID NO: 19) (j), №3, стимулируемой UBE2T-A24-10-133 (SEQ ID NO: 20) (k), №6, стимулируемой UBE2T-A24-10-99 (SEQ ID NO: 21) (l), №7, стимулируемой UBE2T-A24-10-154 (SEQ ID NO: 22) (m), №8, стимулируемой UBE2T-A24-10-105 (SEQ ID NO: 23) (n), №1, стимулируемой UBE2T-A24-10-115 (SEQ ID NO: 24) (o), №4, стимулируемой UBE2T-A24-10-177 (SEQ ID NO: 25) (p), и №7, стимулируемой UBE2T-A24-10-44 (SEQ ID NO: 27) (q), продемонстрирована эффективная продукцию IFN-гамма по сравнению с контрольными лунками. С другой стороны, специфической активности CTL при стимуляции другими пептидами, представленными в таблицах 2а и 2b, не детектировали, несмотря на то, что эти пептиды обладали вероятной активностью связывания с HLA-А*2402. В качестве характерного случая отрицательных данных, не наблюдали специфической продукции IFN-гамма CTL, стимулированными UBE2T-A24-9-124 (SEQ ID NO: 3) (г). Как результат показано, что в качестве пептидов, которые могут индуцировать эффективные CTL, выбирали 17 пептидов, получаемых

из UBE2T.

[0242] Индукция CTL теоретически рассчитанными пептидами из UBE2T, рестриктированного по HLA-A*0201

В соответствии с протоколами, как описано в "Веществах и способах", получали CTL для таких пептидов, получаемых из UBE2T. Пептид-специфическую активность CTL детектировали анализом ELISPOT на IFN-гамма (фигура 2). Показано, что в лунке №4, стимулируемой UBE2T-A02-9-107 (SEQ ID NO: 29) (a), №5, стимулируемой UBE2T-A02-9-30 (SEQ ID NO: 30) (b), №7, стимулируемой UBE2T-A02-9-106 (SEQ ID NO: 32) (c), №5, стимулируемой UBE2T-A02-9-49 (SEQ ID NO: 36) (d), №3, стимулируемой UBE2T-A02-9-13 (SEQ ID NO: 38) (e), №4, стимулируемой UBE2T-A02-9-132 (SEQ ID NO: 41) (f), №6, стимулируемой UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48) (g), №7, стимулируемой UBE2T-A02-10-6 (SEQ ID NO: 49) (h), №8, стимулируемой UBE2T-A02-10-106 (SEQ ID NO: 51) (i), №2, стимулируемой UBE2T-A02-10-102 (SEQ ID NO: 52) (j), №1, стимулируемой UBE2T-A02-10-30 (SEQ ID NO: 53) (k), №8, стимулируемой UBE2T-A02-10-101 (SEQ ID NO: 55) (l), №5, стимулируемой UBE2T-A02-10-29 (SEQ ID NO: 56) (m), и №3, стимулируемой UBE2T-A02-10-38 (SEQ ID NO: 58) (n), продемонстрирована эффективная продукция IFN-гамма по сравнению с контрольными лунками. С другой стороны, специфической активности CTL при стимуляции другими пептидами, представленными в таблицах 3a и 3b, не детектировали, несмотря на то, что эти пептиды обладали вероятной активностью связывания с HLA-A*0201. В качестве характерного случая отрицательных данных, не наблюдали специфической продукции IFN-гамма CTL, стимулированными UBE2T-A02-9-161 (SEQ ID NO: 28) (o). Как результат показано, что в качестве пептидов, которые могут индуцировать эффективные CTL, выбирали 14 пептидов, получаемых из UBE2T.

[0243] Выведение линии и клона CTL против получаемого из UBE2T пептида

Клетки в лунке №8, стимулируемые UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1) (a), №1, стимулируемые UBE2T-A24-9-45 (SEQ ID NO: 2) (b), №6, стимулируемые UBE2T-A24-9-3 (SEQ ID NO: 13) (c) и №7, стимулируемые UBE2T-A24-10-44 (SEQ ID NO: 27), которые продемонстрировали пептид-специфическую активность CTL в анализе ELISPOT на IFN-гамма, размножали и получали линии CTL. Активности CTL этих линий CTL измеряли ELISA IFN-гамма (фигура 3). Показано, что линии CTL демонстрировали эффективную продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, по сравнению с клетками-мишенями без сенсибилизации пептидом. Кроме того, выводили клоны CTL путем лимитирующего разведения из линий CTL, как описано в "Веществах и способах", и измеряли продукцию IFN-гамма клонами CTL против клеток TISI, сенсибилизированных соответствующим пептидом, посредством ELISA IFN-гамма. Наблюдали эффективную продукцию IFN-гамма клонами CTL, стимулированными UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1) (a), UBE2T-A24-9-45 (SEQ ID NO: 2) (b) и UBE2T-A24-9-3 (SEQ ID NO: 13) (c) (фигура 4).

[0244] Клетки в лунке №4, стимулируемые UBE2T-A02-9-107 (SEQ ID NO: 29) (a), №3, стимулируемые UBE2T-A02-9-13 (SEQ ID NO: 38) (b), №6, стимулируемые UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48) (c), №2, стимулируемые UBE2T-A02-10-102 (SEQ ID NO: 52) (d), и №8, стимулируемые UBE2T-A02-10-101 (SEQ ID NO: 55) (e), которые продемонстрировали пептид-специфическую активность CTL в анализе ELISPOT на IFN-гамма, размножали и получали линии CTL. Активности CTL этих линий CTL измеряли ELISA IFN-гамма (фигура 5). Показано, что линии CTL демонстрировали эффективную продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, по сравнению с клетками-мишенями без сенсибилизации пептидом. Кроме того, выводили клоны CTL путем лимитирующего разведения из линий CTL, как описано в "Веществах и способах", и измеряли продукцию IFN-гамма клонами CTL против клеток T2, сенсибилизированных соответствующим пептидом, посредством ELISA IFN-гамма. Наблюдали эффективную продукцию IFN-гамма клонами CTL, стимулированными UBE2T-A02-9-107 (SEQ ID NO: 29) (a), UBE2T-A02-9-13 (SEQ ID NO: 38) (b), UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48) (c), UBE2T-A02-10-102 (SEQ ID NO: 52) (d) и UBE2T-A02-10-101 (SEQ ID NO: 55) (e) (фигура 6).

[0245] Специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих UBE2T и HLA-A*2402 или HLA-A*0201

Выведенные клоны CTL против пептида UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1) анализировали на способность распознавать клетки-мишени, которые экспрессируют UBE2T и молекулу HLA-A*2402. В качестве клеток-стимуляторов получали клетки COS7, трансфицированные полноразмерным UBE2T и геном HLA-A*2402 (конкретная модель для клеток-мишеней, которые экспрессируют UBE2T и ген HLA-A*2402), и в качестве контролей использовали клетки COS7, трансфицированные полноразмерным UBE2T или HLA-A*2402. На фигуре 7 клон CTL, стимулированный UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1), демонстрировал сильную активность CTL против клеток COS7, экспрессирующих UBE2T и HLA-A*2402. С другой стороны, не детектировали значительной специфической активности CTL против контролей. Таким образом, эти данные ясно демонстрируют, что пептид UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1) эндогенно процессируется и экспрессируется на клетках-мишенях с молекулой HLA-A*2402, и его распознают CTL. Эти результаты свидетельствуют о том, что этот пептид, получаемый из UBE2T, может быть доступными для применения противораковых вакцин для пациентов с опухолями, экспрессирующими UBE2T.

[0246] Получаемую линию CTL против пептида UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48) анализировали на способность распознавать клетки-мишени, которые экспрессируют UBE2T и молекулу HLA-A*0201. В качестве клеток-стимуляторов получали клетки COS7, трансфицированные полноразмерным UBE2T и геном HLA-A*0201 (конкретная модель для клеток-мишеней, которые экспрессируют UBE2T и ген HLA-A*0201), и в качестве контролей использовали клетки COS7, трансфицированные полноразмерным UBE2T или HLA-A*0201. На фигуре 8 линия CTL, стимулированная UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48), демонстрировала сильную активность CTL против клеток COS7, экспрессирующих UBE2T и HLA-A*0201. С другой стороны, не детектировали значительной специфической активности CTL против контролей. Таким образом, эти данные ясно демонстрируют, что пептид UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48) эндогенно процессируется и экспрессируется на клетках-мишенях с молекулой HLA-A*0201, и его распознают CTL. Эти результаты свидетельствуют о том, что этот пептид, получаемый из UBE2T, может быть доступным для применения противораковых вакцин для пациентов с опухолями, экспрессирующими UBE2T.

[0247] Анализ гомологии антигенных пептидов

CTL, стимулированные UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1), UBE2T-A24-9-45 (SEQ ID NO: 2), UBE2T-A24-9-133 (SEQ ID NO: 4), UBE2T-A24-9-138 (SEQ ID NO: 6), UBE2T-A24-9-43 (SEQ ID NO: 11), UBE2T-A24-9-106 (SEQ ID NO: 12), UBE2T-A24-9-3 (SEQ ID NO: 13), UBE2T-A24-9-105 (SEQ ID NO: 15), UBE2T-A24-10-130 (SEQ ID NO: 17), UBE2T-A24-10-131 (SEQ ID NO: 19), UBE2T-A24-10-133 (SEQ ID NO: 20), UBE2T-A24-10-99 (SEQ ID NO: 21), UBE2T-A24-10-154 (SEQ ID NO: 22), UBE2T-A24-10-105 (SEQ ID NO: 23), UBE2T-A24-10-115 (SEQ ID NO: 24), UBE2T-A24-10-177 (SEQ ID NO: 25), UBE2T-A24-10-44 (SEQ ID NO: 27), UBE2T-A02-9-107 (SEQ ID NO: 29), UBE2T-A02-9-30 (SEQ ID NO: 30), UBE2T-A02-9-106 (SEQ ID NO: 32), UBE2T-A02-9-49 (SEQ ID NO: 36), UBE2T-A02-9-13 (SEQ ID NO: 38), UBE2T-A02-9-132 (SEQ ID NO: 41), UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48), UBE2T-A02-10-6 (SEQ ID NO: 49), UBE2T-A02-10-106 (SEQ ID NO: 51), UBE2T-A02-10-102 (SEQ ID NO: 52), UBE2T-A02-10-30 (SEQ ID NO: 53), UBE2T-A02-10-101 (SEQ ID NO: 55), UBE2T-A02-10-29 (SEQ ID NO: 56) и UBE2T-A02-10-38 (SEQ ID NO: 58), демонстрировали значительную и специфическую активность CTL. Этот результат может быть обусловлен тем фактом, что последовательности UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1), UBE2T-A24-9-45 (SEQ ID NO: 2), UBE2T-A24-9-133 (SEQ ID NO: 4), UBE2T-A24-9-138 (SEQ ID NO: 6), UBE2T-A24-9-43 (SEQ ID NO: 11), UBE2T-A24-9-106 (SEQ ID NO: 12), UBE2T-A24-9-3 (SEQ ID NO: 13), UBE2T-A24-9-105 (SEQ ID NO: 15), UBE2T-A24-10-130 (SEQ ID NO: 17), UBE2T-A24-10-131 (SEQ ID NO: 19), UBE2T-A24-10-133 (SEQ ID NO: 20), UBE2T-A24-10-99 (SEQ ID NO: 21), UBE2T-A24-10-154 (SEQ ID NO: 22), UBE2T-A24-10-105 (SEQ ID NO: 23), UBE2T-A24-10-115 (SEQ ID NO: 24), UBE2T-A24-10-177 (SEQ ID NO: 25), UBE2T-A24-10-44 (SEQ ID NO: 27), UBE2T-A02-9-107 (SEQ ID NO: 29), UBE2T-A02-9-30 (SEQ ID NO: 30), UBE2T-A02-9-106 (SEQ ID NO: 32), UBE2T-A02-9-49 (SEQ ID NO: 36), UBE2T-A02-9-13 (SEQ ID NO: 38), UBE2T-A02-9-132 (SEQ ID NO: 41), UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48), UBE2T-A02-10-6 (SEQ ID NO: 49), UBE2T-A02-10-106 (SEQ ID NO: 51), UBE2T-A02-10-102 (SEQ ID NO: 52), UBE2T-A02-10-30 (SEQ ID NO: 53), UBE2T-A02-10-101 (SEQ ID NO: 55), UBE2T-A02-10-29 (SEQ ID NO: 56) и UBE2T-A02-10-38 (SEQ ID NO: 58) являются гомологичными пептиду, получаемому из других молекул, для которых известно, что они сенсибилизируют иммунную систему человека. Для исключения этой возможности проводили анализ гомологии для этих пептидных последовательностей с использованием в качестве запроса алгоритма BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi), который не выявил последовательностей со значительной гомологией. Результаты анализов гомологии свидетельствуют о том, что последовательности UBE2T-A24-9-60 (SEQ ID NO: 1), UBE2T-A24-9-45 (SEQ ID NO: 2), UBE2T-A24-9-133 (SEQ ID NO: 4), UBE2T-A24-9-138 (SEQ ID NO: 6), UBE2T-A24-9-43 (SEQ ID NO: 11), UBE2T-A24-9-106 (SEQ ID NO: 12), UBE2T-A24-9-3 (SEQ ID NO: 13), UBE2T-A24-9-105 (SEQ ID NO: 15), UBE2T-A24-10-130 (SEQ ID NO: 17), UBE2T-A24-10-131 (SEQ ID NO: 19), UBE2T-A24-10-133 (SEQ ID NO: 20), UBE2T-A24-10-99 (SEQ ID NO: 21), UBE2T-A24-10-154 (SEQ ID NO: 22), UBE2T-A24-10-105 (SEQ ID NO: 23), UBE2T-A24-10-115 (SEQ ID NO: 24), UBE2T-A24-10-177 (SEQ ID NO: 25), UBE2T-A24-10-44 (SEQ ID NO: 27), UBE2T-A02-9-107 (SEQ ID NO: 29), UBE2T-A02-9-30 (SEQ ID NO: 30), UBE2T-A02-9-106 (SEQ ID NO: 32), UBE2T-A02-9-49 (SEQ ID NO: 36), UBE2T-A02-9-13 (SEQ ID NO: 38), UBE2T-A02-9-132 (SEQ ID NO: 41), UBE2T-A02-10-70 (SEQ ID NO: 48), UBE2T-A02-10-6 (SEQ ID NO: 49), UBE2T-A02-10-106 (SEQ ID NO: 51), UBE2T-A02-10-102 (SEQ ID NO: 52), UBE2T-A02-10-30 (SEQ ID NO: 53), UBE2T-A02-10-101 (SEQ ID NO: 55), UBE2T-A02-10-29 (SEQ ID NO: 56) и UBE2T-A02-10-38 (SEQ ID NO: 58) являются уникальными, и, таким образом, по сведениям авторов существует небольшая вероятность того, что эти молекулы вызовут непредусмотренный иммунный ответ на какую-либо неродственную молекулу. В заключение, авторы идентифицировали новые пептиды-эпитопы HLA-A*2402 или HLA-A*0201, получаемые из UBE2T. Кроме того, продемонстрировано, что пептиды-эпитопы UBE2T можно применять для иммунотерапии злокачественных опухолей.

Применимость в промышленности

[0248] Настоящее изобретение относится к новым пептидам-эпитопам, получаемым из UBE2T, которые могут индуцировать сильный и специфический противоопухолевый иммунный ответ и находят применимость для широкого спектра типов злокачественных опухолей. Такие пептиды могут находить применение в качестве пептидных вакцин против заболеваний, ассоциированных с UBE2T, например, злокачественной опухоли, более конкретно, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярной карциномы, CML, колоректального рака, рака пищевода, рака желудка, рака желудка диффузного типа, NSCLC, лимфомы, остеосаркомы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, SCLC, опухоли мягких тканей и опухоли семенников.

[0249] Несмотря на то, что настоящее изобретение подробно и со ссылкой на его конкретные варианты осуществления описано в настоящем описании, следует понимать, что указанное выше описание является иллюстративным и пояснительным по природе и предназначено для иллюстрации настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. Посредством общепринятого экспериментирования специалист в данной области легко поймет, что в настоящем изобретении можно проводить различные изменения и модификации, не выходя за рамки сущности и объема настоящего изобретения, пределы и границы которого определены прилагаемой формулой изобретения.

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным эпитопам UBE2T, и может быть использовано в медицине для лечения пациента, страдающего раком. Получают модифицированные эпитопные пептиды UBE2T, которые связываются с HLA-A*2402 или HLA-A*0201 и обладают более высокой способностью индуцирования цитотоксических T-лимфоцитов (ЦТЛ), чем эпитопный пептид UBE2T дикого типа. 12 н.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл., 1 пр.

Формула

1. Выделенный пептид, обладающий способностью к индукции цитотоксических T-лимфоцитов (CTL), специфичных в отношении конъюгированного с убиквитином фермента E2T (UBE2T), в присутствии антигенпрезентирующих клеток (APC), несущих HLA-A*2402 или HLA-A*0201, где пептид выбран из группы, состоящей из пунктов (a) и (b) ниже:

(a) выделенный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58;

(b) выделенный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 и 58, в которой 1 или 2 аминокислоты заменены, где указанные замены выбраны из группы, состоящей из пунктов (1)-(4) ниже:

(1) вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 27 заменена на фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан;

(2) C-концевая аминокислота аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 27 заменена на фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин;

(3) вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58 заменена на лейцин или метионин; и

(4) C-концевая аминокислота аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29, 30, 32, 36, 38, 41, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56 или 58 заменена на валин или лейцин.

2. Выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид по п. 1.

3. Композиция для индукции CTL в присутствии APC, несущей HLA-A*2402 или HLA-A*0201, где композиция содержит от 0,001 до 1,000 мг пептида по п. 1.

4. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей UBE2T, где указанная фармацевтическая композиция содержит от 0,001 до 1,000 мг пептида по любому из пп. 1-4, где указанную фармацевтическую композицию формулируют для введения индивидууму, антиген HLA которого представляет собой HLA-A*2402 или HLA-A*0201.

5. Способ индукции APC со способностью к индукции CTL, где способ включает стадию приведения APC, несущей HLA-A*2402 или HLA-A*0201, в контакт с пептидом по п. 1 in vitro.

6. Способ индукции CTL, где способ включает стадию приведения APC, несущей комплекс HLA-A*2402 или HLA-A*0201 и пептида по п. 1, в контакт с CD8-положительной T-клеткой in vitro.

7. Выделенная APC, обладающая способностью к индукции CTL, которая презентирует на своей поверхности комплекс, образовавшийся между HLA-A*2402 или HLA-A*0201 и пептидом по п. 1, где указанная APC индуцирована способом по п. 5.

8. Выделенный CTL, мишенью которого являются HLA-A*2402- или HLA-A*0201 - положительные клетки, экспрессирующие UBE2T, где указанный CTL индуцирован способом по п. 6.

9. Способ индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли, экспрессирующей UBE2T, у индивидуума, антиген HLA которого представляет собой HLA-A*2402 или HLA-A*0201, где способ включает стадию введения индивидууму композиции, содержащей пептид по п. 1.

10. Способ индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли, экспрессирующей UBE2T, у индивидуума, антиген HLA которого представляет собой HLA-A*2402 или HLA-A*0201, где способ включает стадии:

(a) сбора APC у указанного индивидуума;

(b) приведения APC со стадии (a) в контакт с пептидом по п. 1; и

или

(d) сбора APC и CD8-положительной T-клетки у указанного

индивидуума;

(e) приведения APC со стадии (d) в контакт с пептидом по п. 1; и

(f) смешивания APC со стадии (e) с CD8-положительной T-клеткой со стадии (d) и совместного культивирования для индукции CTL; и

(g) введения CTL, индуцированного на стадии (f), указанному индивидууму.

11. Вектор для экспрессии пептида по п. 1, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид по п. 1.

12. Клетка-хозяин COS7 для получения пептида по п. 1, трансформированная или трансфицированная вектором по п. 11.

Документы, цитированные в отчёте о поиске

Пептидные вакцины для раков, экспрессирующих опухолеспецифические антигены

Патенты аналоги

Пептидные вакцины для раков, экспрессирующих опухолеспецифические антигены

Авторы

ЦУНОДА Такуя (JP)

ОСАВА Рюдзи (JP)

ЙОСИМУРА Сатико (JP)

ВАТАНАБЕ Томохиса (JP)

TSUNODA TAKUYA

OSAVA RYUDZI

JOSIMURA SATIKO

VATANABE TOMOKHISA

TSUNODA Takuya

OSAVA Ryudzi

JOSIMURA Satiko

VATANABE Tomokhisa

Патентообладатели

ONKOTERAPI SAJENS INK

ONKOTERAPI SAJENS, INK.

Заявители

ONKOTERAPI SAJENS INK

ONKOTERAPI SAJENS, INK.

СПК: A61K31/7088 A61K35/17 A61K39/001154 A61K2039/5154 A61P35/00 A61P37/04 C07K16/40 C12N5/0634 C12N5/0638 C12N9/93 C12N2501/515 C12N2501/70 C12N2502/11 C12N2502/1114 C12Y603/02019

МПК: A61K39/00 A61P35/00

Публикация: 2018-08-03

Дата подачи заявки: 2013-09-09

РОССТИП

Поиск по товарам

Добавить свой товар

Сообщества

Товары

Участники

Патенты

Запросов

Поставщикам

О сервисе

Блогерам

Помощь