Опухолеспецифичное антитело против egfr и его применение - RU2730605C2

Код документа: RU2730605C2

Чертежи

Показать все 97 чертежа(ей)

Описание

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области иммунологии, и, в частности, настоящее изобретение относится к опухолеспецифичным антителам против EGFR и их применению.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

EGFR подвержен сверхэкспрессии или мутации во многих опухолях, и, несомненно, избирательное распознавание таких сверхэкспрессируемых или мутированных EGFR представляет собой важный научный вопрос. До настоящего времени, антитела против эпитопа EGFR287-302 предполагались для распознавания EGFR, EGFRvIII и de4 EGFR, сверхэкспрессируемых на поверхности опухолей, вместо EGFR в нормальных клетках. К сожалению, антитела против этого эпитопа по-прежнему имеют побочные эффекты, такие как высыпания, в клинических испытаниях (http://meetinglibrary.asco.org/content/115945-132), из чего можно сделать вывод, что при нацеливании на этот эпитоп может происходить идентификация EGFR в нормальных клетках (таких как кератиноциты).

Таким образом, очень важно проверять антитела против EGFR на более высокую опухолеспецифичность. Высоко опухолеспецифичные антитела имеют очень большое потенциальное значение или для диагностики иммуносцинтиграфии опухолей, индивидуальной диагностики или противоопухолевой терапии.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является обеспечение опухолеспецифичных антител против EGFR и их применение.

Первым аспектом настоящего изобретения обеспечено антитело, специфически распознающее экспрессируемый опухолевыми клетками EGFRvIII или сверхэкспрессируемый EGFR , где антитело содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи,

CDR1 вариабельной области легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55;

CDR2 вариабельной области легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 53;

CDR3 вариабельной области легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57;

CDR1 вариабельной области тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44;

CDR2 вариабельной области тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52;

CDR3 вариабельной области тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50.

В предпочтительном варианте осуществления антитело включает:

антитело (а), вариабельная область легкой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 41, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 42, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 43, или вариабельная область тяжелой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 44, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 45, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 46,

антитело (b), вариабельная область легкой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 47, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 42, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 48, или вариабельная область тяжелой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 44, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 49, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 50,

антитело (с), вариабельная область легкой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 41, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 42, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 48, или вариабельная область тяжелой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 44, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 51, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 50,

антитело (d), вариабельная область легкой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 41, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 42, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 43, или вариабельная область тяжелой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 44, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 52, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 50,

антитело (e), вариабельная область легкой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 41, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 42, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 43, или вариабельная область тяжелой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 44, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 45, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 50,

антитело (f), вариабельная область легкой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 41, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 53, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 54, или вариабельная область тяжелой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 44, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 51, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 50,

антитело (g), вариабельная область легкой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 41, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 42, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 54, или вариабельная область тяжелой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 44, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 51, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 50,

антитело (h), вариабельная область легкой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 55, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 42, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 56, или вариабельная область тяжелой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 44, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 45, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 50,

антитело (i), вариабельная область легкой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 41, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 53, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 56, или вариабельная область тяжелой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 44, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 52, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 50,

антитело (j), вариабельная область легкой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 41, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 42, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 56, или вариабельная область тяжелой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 44, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 52, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 50,

антитело (k), вариабельная область легкой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 41, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 42, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 57, или вариабельная область тяжелой цепи которого имеет CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 44, CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 52, CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 50; или

антитело (l), которое распознает ту же антигенную детерминанту, которую распознает любое из антител (а) - (k).

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело, специфически распознающее экспрессируемый опухолевыми клетками EGFRvIII или сверхэкспрессируемый EGFR, может представлять собой: одноцепочечное антитело (scFV), моноклональное антитело, однодоменное антитело, Fab-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент и его производное или другие формы антител; предпочтительно одноцепочечное антитело.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело, специфически распознающее экспрессируемый опухолевыми клетками EGFRvIII или сверхэкспрессируемый EGFR, гуманизировано, полностью гуманизировано, представляет собой химерное или мышиное.

В другом предпочтительном варианте осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в положениях с 124 по 239 последовательности SEQ ID NO: 13; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в положениях с 1 по 108 последовательности SEQ ID NO: 13;

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в положениях с 124 по 239 последовательности SEQ ID NO: 59; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в положениях с 1 по 108 последовательности SEQ ID NO: 59;

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в положениях с 124 по 239 последовательности SEQ ID NO: 61; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в положениях с 1 по 108 последовательности SEQ ID NO: 61;

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в положениях с 124 по 239 последовательности SEQ ID NO: 63; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в положениях с 1 по 108 последовательности SEQ ID NO: 63;

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в положениях с 124 по 239 последовательности SEQ ID NO: 65; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в положениях с 1 по 108 последовательности SEQ ID NO: 65;

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в положениях с 124 по 239 последовательности SEQ ID NO: 67; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в положениях с 1 по 108 последовательности SEQ ID NO: 67;

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в положениях с 124 по 239 последовательности SEQ ID NO: 69; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в положениях с 1 по 108 последовательности SEQ ID NO: 69;

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в положениях с 124 по 239 последовательности SEQ ID NO: 71; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в положениях с 1 по 108 последовательности SEQ ID NO: 71;

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в положениях с 124 по 239 последовательности SEQ ID NO: 73; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в положениях с 1 по 108 последовательности SEQ ID NO: 73;

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в положениях с 124 по 239 последовательности SEQ ID NO: 75; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в положениях с 1 по 108 последовательности SEQ ID NO: 75; или

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в положениях с 124 по 239 последовательности SEQ ID NO: 77; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в положениях с 1 по 108 последовательности SEQ ID NO: 77.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой антитело (а); более предпочтительно, аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в положениях с 124 по 239 последовательности SEQ ID NO: 13; или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в положениях с 1 по 108 последовательности SEQ ID NO: 13.

В другом аспекте изобретения обеспечена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, как описано выше.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту. В другом предпочтительном варианте осуществления вектор экспрессии представляет собой вектор PH/DHFR.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечена клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии или в геном которой интегрирована нуклеиновая кислота. В другом предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку-хозяина или прокариотическую клетку-хозяина; предпочтительно эукариотическую клетку-хозяина, более предпочтительно клетку яичника китайского хомячка (СНО).

Другим аспектом изобретения обеспечено применение любого из вышеописанных антител для получения направленно действующего лекарственного средства, конъюгата антитела с лекарственным средством или многофункционального антитела, специфически направленного на опухолевые клетки, экспрессирующие EGFRvIII или сверхэкспрессирующие EGFR; или средства для диагностики опухолей, которые экспрессируют EGFRvIII или сверхэкспрессируют EGFR; или применение для получения иммунной клетки, модифицированной химерным антигенным рецептором; предпочтительно, иммунная клетка включает: Т-лимфоцит, естественную клетку-киллер или естественный киллерный Т-лимфоцит.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен многофункциональный иммуноконъюгат, включающий: любое из вышеописанных антител, и связанную с ним функциональную молекулу (включая ковалентно связанные, конъюгированные, присоединенные, адсорбированные); при этом функциональная молекула выбрана из группы, состоящей из молекулы, которая нацелена на маркер поверхности опухоли, молекулы, подавляющей опухоль, молекулы, которая нацелена на маркер поверхности иммунной клетки, или детектируемой метки.

В предпочтительном варианте осуществления молекула, которая нацелена на маркер поверхности опухоли, представляет собой антитело или лиганд, который связывается с маркером поверхности опухоли; или молекула, подавляющая опухоль представляет собой противоопухолевый цитокин или противоопухолевый токсин; предпочтительно цитокины включают, но не ограничиваются ими: IL-12, IL-15, IFN-бета, TNF-альфа.

В другом предпочтительном варианте осуществления в многофункциональном иммуноконъюгате детектируемая метка включает флуоресцентную метку и хромогенную метку.

В другом предпочтительном варианте осуществления в многофункциональном иммуноконъюгате молекула, нацеленная на маркер поверхности иммунной клетки, представляет собой антитело или лиганд, который связывается с маркером поверхности иммунной клетки; предпочтительно маркеры поверхности иммунной клетки включают, но не ограничиваются следующими: CD3, CD16, CD28.

В другом предпочтительном варианте осуществления в многофункциональном иммуноконъюгате молекула, которая нацелена на маркер поверхности иммунной клетки, представляет собой антитело, которое связывается с маркером поверхности Т-клеток, которое может образовывать с любым из вышеописанных антител способное связываться с Т-клеткой бифункциональное антитело (привлекающий T-клетки биспецифический активатор, BiTE).

В другом предпочтительном варианте осуществления в многофункциональном иммуноконъюгате антитело, которое связывается с маркером поверхности иммунной клетки, представляет собой антитело против CD3. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело против CD3 представляет собой одноцепочечное антитело (scFV), моноклональное антитело, Fab-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент и их производное; предпочтительно одноцепочечное антитело. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело против CD3 является гуманизированным, полностью человеческим, химерным или мышиным.

В другом предпочтительном варианте осуществления многофункциональный иммуноконъюгат представляет собой слитый полипептид и дополнительно содержит линкерный пептид (линкер) между любым из вышеописанных антител, и связанной с ним функциональной молекулой.

В другом предпочтительном варианте осуществления линкерный пептид имеет последовательность (GlyGlyGlyGlySer)n, где n представляет собой целое число от 1 до 5; более предпочтительно n равно 3.

В другом предпочтительном варианте осуществления многофункциональный иммуноконъюгат вводят в виде полипептида или способом введения гена.

В другом аспекте изобретения обеспечена нуклеиновая кислота, кодирующая многофункциональный иммуноконъюгат.

В другом аспекте изобретения обеспечено применение любого из вышеописанных многофункциональных иммуноконъюгатов для получения противоопухолевого средства или средства для диагностики опухолей, которые экспрессируют EGFRvIII или сверхэкспрессируют EGFR; или для получения иммунных клеток, модифицированных химерным антигенным рецептором. Предпочтительно иммунные клетки включают Т-лимфоцит, естественную клетку-киллер или естественный киллерный Т-лимфоцит.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен химерный антигенный рецептор, включающий любое из вышеописанных антител, и химерный антигенный рецептор экспрессируется на поверхности иммунной клетки и содержит последовательно связанные любое из вышеописанных антител, трансмембранную область и внутриклеточную сигнальную область; при этом внутриклеточная сигнальная область выбрана из группы, состоящей из последовательностей внутриклеточных сигнальных областей CD3ζ, FcεRIγ, CD27, CD28, CD137 и CD134 или их комбинации.

В предпочтительном варианте осуществления трансмембранная область содержит трансмембранную область CD8 или CD28.

В другом предпочтительном варианте осуществления иммунные клетки включают Т-лимфоцит, естественную клетку-киллер или естественный киллерный Т-лимфоцит.

В другом предпочтительном варианте осуществления химерный антигенный рецептор содержит следующие последовательно связанные антитело, трансмембранную область и внутриклеточную сигнальную область:

любое из вышеописанных антител, CD8 и CD3ζ;

любое из вышеописанных антител, CD8, CD137 и CD3ζ;

любое из вышеописанных антител, трансмембранную область молекулы CD28, внутриклеточную сигнальную область молекулы CD28 и CD3ζ; или

любое из вышеописанных антител, трансмембранную область молекулы CD28, внутриклеточную сигнальную область молекулы CD28, CD137 и CD3ζ.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой одноцепочечное антитело или однодоменное антитело.

В другом предпочтительном варианте осуществления химерный антигенный рецептор содержит:

SEQ ID NO: 36 или аминокислотную последовательность, представленную в положениях с 285 по 601; или

SEQ ID NO: 37 или аминокислотную последовательность, представленную в положениях с 285 по 702; или

SEQ ID NO: 38 или аминокислотную последовательность, представленную в положениях с 285 по 744; или

SEQ ID NO: 39 или аминокислотную последовательность, представленную в положениях с 285 по 749; или

SEQ ID NO: 40 или аминокислотную последовательность, представленную в положениях с 285 по 791.

В другом аспекте изобретения обеспечена нуклеиновая кислота, кодирующая любой из вышеописанных химерных антигенных рецепторов. В другом предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая химерный антигенный рецептор, содержит:

SEQ ID NO: 31 или нуклеотидную последовательность, представленную в положениях с 966 по 1916; или

SEQ ID NO: 32 или нуклеотидную последовательность, представленную в положениях с 966 по 2219; или

SEQ ID NO: 33 или нуклеотидную последовательность, представленную в положениях с 966 по 2345; или

SEQ ID NO: 34 или нуклеотидную последовательность, представленную в положениях с 966 по 2360; или

SEQ ID NO: 35 или нуклеотидную последовательность, представленную в положениях с 966 по 2486.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен вектор экспрессии, содержащий вышеописанную нуклеиновую кислоту.

В другом предпочтительном варианте осуществления вектор экспрессии получают из лентивирусной плазмиды pWPT (или pWPT-eGFP).

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен вирус, содержащий вышеописанный вектор.

Обеспечено применение любого из описанных выше химерных антигенных рецепторов или кодирующей его нуклеиновой кислоты, или вектора экспрессии или вируса, содержащего нуклеиновую кислоту, для получения генетически модифицированных иммунных клеток, которые нацелены на опухолевые клетки, экспрессирующие EGFRvIII или сверхэкспрессирующие EGFR.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечена генетически модифицированная иммунная клетка, которая трансдуцирована нуклеиновой кислотой или вектором экспрессии, или вирусом; или экспрессирует химерный антигенный рецептор на ее поверхности.

В предпочтительном варианте осуществления иммунная клетка дополнительно содержит экзогенную кодирующую последовательность для цитокина; предпочтительно цитокин включает: IL-12, IL-15 или IL-21.

В другом предпочтительном варианте иммунная клетка дополнительно экспрессирует другой химерный антигенный рецептор, который не содержит CD3ζ, но содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28, внутриклеточный сигнальный домен CD137 или их комбинацию.

В другом предпочтительном варианте иммунная клетка дополнительно экспрессирует хемокиновый рецептор; предпочтительно хемокиновый рецептор включает CCR2.

В другом предпочтительном варианте иммунная клетка дополнительно экспрессирует миРНК, которая может снижать экспрессию PD-1, или белок, который может блокировать PD-L1.

В другом предпочтительном варианте осуществления иммунная клетка дополнительно экспрессирует предохранитель; предпочтительно, предохранитель включает индуцируемую каспазу-9, процессированный EGFR или RQR8.

В другом аспекте изобретения обеспечено применение указанных генетически модифицированных иммунных клеток для получения лекарственного средства, ингибирующего опухоль, и указанная опухоль представляет собой опухоль, которая экспрессирует EGFRvIII или сверхэкспрессирует EGFR.

В другом аспекте изобретения обеспечена фармацевтическая композиция (включая лекарственное средство или средство для диагностики опухолей), включающая:

любое из вышеописанных антител или нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело; или

любой из вышеописанных иммуноконъюгатов или нуклеиновую кислоту, кодирующую конъюгат; или

любой из вышеописанных химерных антигенных рецепторов или нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный антигенный рецептор; или

любую из вышеописанных генетически модифицированных иммунных клеток.

Другие аспекты изобретения будут очевидны для специалиста в данной области техники в контексте представленного раскрытия.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Антитела 7B3 и Y022 могут специфически связываться с антигенами EGFRvIII и N1N2-806 (анализ в фаговом формате ELISA).

Фиг. 2. Кривая связывания антитела 7B3 с антигеном EGFRvIII.

Фиг. 3. Кривая связывания антитела Y022 с антигеном EGFRvIII.

Фиг. 4. Электрофорограмма очистки трех слитых антител scFv-Fc.

Фиг. 5. Обнаружение одноцепочечных антител scFv-Y022-Fc, scFv-806-Fc и scFv-C225-Fc по их способности связываться с EGFR поверхности клеток способом сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS).

Фиг. 6. Структурная схема вектора экспрессии pH-Y022/CD3.

Фиг. 7. Обнаружение одноцепочечных бифункциональных антител Y022/CD3, 806/CD3 и C225/CD3 с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ).

Фиг. 8. Обнаружение одноцепочечного бифункционального антитела Y022/CD3 по его антигенсвязывающей специфичности способом FACS.

Фиг. 9. Графики цитотоксичности одноцепочечных бифункциональных антител.

Фиг. 10. Схематическая иллюстрация последовательности лигирования различных частей химерного антигенного рецептора.

Способы осуществления изобретения

После интенсивных исследований и проверок, авторами настоящего изобретения было получено антитело, которое специфически распознает EGFRvIII или сверхэкспрессируемый EGFR в опухолевых клетках и практически не распознает EGFR в нормальных клетках. Антитело по настоящему изобретению можно применять для получения различных противоопухолевых лекарственных средств и лекарственных средств для диагностики опухолей.

Антитело против EGFR

Авторами настоящего изобретения дополнительно проведены скрининговые и аминокислотные мутации на основе гуманизированных антител, полученных на предыдущей стадии, и обнаружено антитело против EGFR, способное к нацеливанию на EGFR опухолевых клеток с более высокой специфичностью, которое избирательно связывается со сверхэкспрессирующимися опухолью EGFR или EGFRvIII, и в то же время не связывается с EGFR на нормальных клетках.

Антитела по изобретению могут быть интактными молекулами иммуноглобулина или антигенсвязывающими фрагментами, включая, но не ограничиваясь следующими: Fab-фрагменты, Fd-фрагменты, Fv-фрагменты, F(ab')₂ фрагменты, фрагменты области, определяющей комплементарность (CDR), одноцепочечное антитело (scFv), однодоменное антитело, двухвалентное одноцепочечное антитело, одноцепочечное фаговое антитело, биспецифическое диатело, антитело с тремя цепями, антитело с четырьмя цепями.

Антигенсвязывающие свойства антитела могут быть описаны тремя специфическими областями, расположенными в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей, называемыми областями, определяющими комплементарность (CDR), которые разделяют вариабельные области на четыре каркасные области (FR), а аминокислотные последовательности четырех FR являются относительно консервативными, и непосредственно не вовлечены в реакции связывания. Эти CDR образуют петлевую структуру, в которой β-складки, образованные FR, расположены близко друг к другу в пространстве, а антигенсвязывающий сайт антитела состоит из CDR на тяжелой цепи и CDR на соответствующей легкой цепи. Можно определить, какие аминокислоты составляют области FR или CDR, сравнивая аминокислотные последовательности того же типа антител. Области CDR представляют собой последовательности иммунологически интересных белков, а CDR области антител по изобретению являются совершенно новыми. Антитело может содержать два, три, четыре, пять или все шесть областей CDR, описанных в данном документе.

Другой аспект изобретения включает функциональные варианты антител, описанных в данном документе. Если вариант способен конкурировать с исходным антителом за специфическое связывание с SEQ ID NO: 1, и его способность распознавать EGFRvIII или сверхэкспрессируемый EGFR в опухолевых клетках близка к таковой для специфических антител, представленных в примерах настоящего изобретения. Функциональные варианты могут иметь модификации консервативных последовательностей, включая нуклеотидные и аминокислотные замены, добавления и делеции. Эти модификации могут быть введены стандартными способами, известными в данной области техники, такими как направленный мутагенез и случайный ПЦР-опосредованный мутагенез, и могут включать как природные, так и неприродные нуклеотиды и аминокислоты. Предпочтительно модификация последовательности происходит вне области CDR антитела.

Иммуноконъюгат

В настоящем изобретении также обеспечен многофункциональный иммуноконъюгат, содержащий антитела, описанные в настоящем документе, и дополнительно содержащий по меньшей мере одну функциональную молекулу другого типа. Функциональная молекула выбрана из, но не ограничивается следующими: молекулы, которая нацелена на маркер поверхности опухоли, молекулы, подавляющей опухоль, молекулы, которая нацелена на маркер поверхности иммунной клетки или детектируемой метки. Антитело и функциональная молекула могут образовывать конъюгат путем ковалентного связывания, спаривания, связывания, сшивания и т.п.

В качестве предпочтительного способа иммуноконъюгат может содержать антитело по изобретению и по меньшей мере одну молекулу, которая нацелена на маркер поверхности опухоли, или молекулу, подавляющую опухоль. Молекула, подавляющая опухоль, может представлять собой противоопухолевые цитокины или противоопухолевые токсины. Предпочтительно цитокины включают, но не ограничиваются следующими: IL-12, IL-15, IFN-бета, TNF-альфа. Молекулы, которые нацелены на маркеры поверхности опухоли, например, могут действовать синергетически с антителами по изобретению для того, чтобы более точно нацеливаться на опухолевые клетки.

В качестве предпочтительного способа иммуноконъюгат может содержать антитело по настоящему изобретению и детектируемую метку. Такие детектируемые метки включают, но не ограничиваются следующими: флуоресцентные метки, хромогенные метки, такие как ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, позитрон-излучающие металлы и нерадиоактивный парамагнитный ион металла. Также можно включить более одного маркера. Метка, применяемая для маркировки антитела с целью обнаружения и/или анализа и/или диагностики, зависит от применяемого конкретного способа обнаружения/анализа/диагностики техники и/или способа, например, иммуногистохимического окрашивания образцов (ткани), проточной цитометрии и т.п. Специалистам в данной области техники хорошо известны подходящие метки для способов обнаружения/анализа/диагностики и/или способов, известных в данной области техники.

В качестве предпочтительного способа иммуноконъюгат может содержать антитело по изобретению, а также молекулу, которая нацелена на маркер поверхности иммунной клетки. Молекула, которая нацелена на маркеры поверхности иммунных клеток, может распознавать иммунные клетки и переносить антитела по изобретению к иммунным клеткам, так что антитела по изобретению могут нацеливать иммунные клетки на опухолевые клетки и тем самым запускать иммуноциты для специфического уничтожения опухоли.

В качестве средства химического получения иммуноконъюгата путем конъюгации, прямо или косвенно (например, линкером), иммуноконъюгат может быть получен в виде слитого белка, содержащего антитело по изобретению и другие подходящие белки. Слитый белок может быть получен способом, известным в данной области техники, например, получен рекомбинантно путем конструирования и последующей экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело в рамке с нуклеотидной последовательностью, кодирующей подходящую метку.

В другом аспекте изобретения обеспечена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере одно антитело по изобретению, функциональный вариант или его иммуноконъюгат. После получения соответствующей последовательности, способ рекомбинации может быть применен для получения соответствующей последовательности в больших количествах. Обычно это делается путем клонирования ее в вектор, трансфекции его в клетку и последующего выделения соответствующей последовательности из пролиферирующих клеток-хозяев обычными способами.

Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим соответствующие последовательности ДНК, описанные выше, а также подходящие промоторы или контрольные последовательности. Эти векторы могут быть применены для трансформации соответствующей клетки-хозяина, для обеспечения экспрессии белка. Клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку, такую как бактериальная клетка; или низшую эукариотическую клетку, такую как дрожжевая клетка; или высшую эукариотическую клетку, такую как клетка млекопитающего.

Химерный антигенный рецептор

и генетически модифицированная иммунная клетка

В настоящем изобретении обеспечен химерный антигенный рецептор, экспрессируемый на поверхности иммунной эффекторной клетки (иммунной клетки), где химерный антигенный рецептор содержит последовательно связанные внеклеточную область связывания, трансмембранную область и внутриклеточную сигнальную область, при этом внеклеточная область связывания содержит антитело по изобретению. Путем экспрессии химерного антигенного рецептора на поверхности иммунных эффекторных клеток, иммунные эффекторные клетки могут оказывать высокоспецифическое цитотоксическое действие на опухолевые клетки, которые экспрессируют EGFRvIII или сверхэкспрессируют EGFR.

Используемый здесь термин "иммунные клетки" и "иммунные эффекторные клетки" используются взаимозаменяемо и включают: Т-лимфоцит, естественную клетку-киллер или естественный киллерный Т-лимфоцит и т.п.

В качестве предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения антитело, содержащееся в химерном антигенном рецепторе, представляет собой одноцепочечное антитело, которое связано с CD8 или трансмембранной областью CD28 через шарнирную область CD8, и за трансмембранной областью сразу же следует внутриклеточная сигнальная область.

Изобретение также включает нуклеиновые кислоты, кодирующие химерные антигенные рецепторы. Настоящее изобретение также относится к вариантам вышеописанных полинуклеотидов, которые кодируют полипептид или фрагмент, аналог и производное полипептида, имеющего ту же аминокислотную последовательность, что и по настоящему изобретению.

Трансмембранная область химерного антигенного рецептора может быть выбрана из трансмембранной области белка, такого как CD8 или CD28. Белок CD8 человека представляет собой гетеродимер, состоящий из двух цепей, αβ или γδ. В одном варианте осуществления изобретения трансмембранная область выбрана из трансмембранной области CD8α или CD28. Кроме того, шарнирная область CD8α является гибкой областью, так что CD8 или CD28 и трансмембранная область, а также шарнирная область используются для связывания целевого домена распознавания scFv химерного антигенного рецептора (CAR) с внутриклеточной сигнальной областью.

Внутриклеточная сигнальная область может быть выбрана из группы, состоящей из внутриклеточной сигнальной области белка CD3ζ, FcεRIγ, CD28, CD137, CD134 и их комбинаций. Молекула CD3 состоит из пяти субъединиц, в которых субъединица CD3ζ (также известная как CD3 zeta, сокращенно Z) содержит 3 мотива ITAM, которые являются важными областями сигнальной трансдукции в комплексе TCR-CD3. CD3δZ представляет собой укороченную последовательность CD3ζ без мотива ITAM и, в общем, сконструирована в настоящем изобретении в качестве отрицательного контроля. FcsRIγ в основном распределен на поверхности тучных клеток и базофилов, содержит мотив ITAM, похож на CD3ζ по структуре, распределению и функции. Кроме того, как упоминалось выше, CD28, CD137 и CD134 являются ко-стимулирующими сигнальными молекулами. Ко-стимулирующий эффект их внутриклеточных сигнальных сегментов при связывании с соответствующими лигандами приводит к продолжительной пролиферации иммунных эффекторных клеток, прежде всего Т-лимфоцитов, и увеличению уровня цитокинов, таких как IL-2 и IFN-γ, секретируемых иммунными эффекторными клетками, а также увеличению периода выживания и противоопухолевого действия химерного антигенного рецептора иммунных эффекторных клеток in vivo.

Химерный антигенный рецептор по настоящему изобретению может быть последовательно соединен следующим образом:

антитело по изобретению, CD8 и CD3ζ;

антитело по изобретению, CD8, CD137 и CD3ζ;

антитело по изобретению, трансмембранная область молекулы CD28, внутриклеточная сигнальная область молекулы CD28 и CD3ζ; или

антитело по изобретению, трансмембранная область молекулы CD28, внутриклеточная сигнальная область молекулы CD28, CD137 и CD3ζ.

И их комбинации, где CD28a в соответствующем белке химерного антигенного рецептора представляет собой трансмембранную область молекулы CD28, а CD28b представляет собой внутриклеточную сигнальную область молекулы CD28. Различные описанные выше химерные антигенные рецепторы в совокупности называются scFv (EGFR)-CAR.

Настоящее изобретение также обеспечивает вектор, содержащий вышеописанную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок химерного антигенного рецептора, экспрессируемого на поверхности иммунной эффекторной клетки. В конкретном варианте осуществления вектор, применяемый в настоящем изобретении, представляет собой лентивирусный плазмидный вектор pWPT-eGFP. Эта плазмида относится к третьему поколению самоинактивирующейся лентивирусной векторной системы. Система имеет три плазмиды, упаковочная плазмида psPAX2, кодирующая белок Gag/Pol, кодирующая белок Rev; плазмида оболочки PMD2.G, кодирующая белок VSV-G (гликопротеин вируса везикулярного стоматита); и пустой вектор pWPT-eGFP, который может быть применен для рекомбинантного введения, представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты, то есть нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор. В пустом векторе pWPT-eGFP экспрессия усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP) регулируется промотором фактора элонгации-1α (EF-1α). В то время как в рекомбинантном векторе экспрессии pWPT-eGFP-F2A-CAR, содержащем последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, совместная экспрессия eGFP и CAR достигается с помощью последовательности 2A (сокращенно F2A) вируса ящура (FMDV), вызывающей пропуск рибосомы.

Изобретение также включает вирусы, содержащие векторы, описанные выше. Вирусы по изобретению включают упакованные инфекционные вирусы, а также вирусы, подлежащие упаковке, которые содержат необходимые компоненты для упаковки в инфекционные вирусы. Другие вирусы, известные в данной области техники, которые могут быть применены для трансдукции экзогенных генов в иммунные эффекторные клетки и их соответствующие плазмидные векторы, также применимы в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение дополнительно включает генетически модифицированный Т-лимфоцит, который трансдуцируют нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению или трансдуцируют вышеописанной рекомбинантной плазмидой, содержащей нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, или вирусной системой, содержащей плазмиду. В настоящем изобретении могут быть применены обычные в данной области техники способы трансдукции нуклеиновой кислоты, включая способы невирусной и вирусной трансдукции. Способы невирусной трансдукции включают способы электропорации и транспозона. В последнее время, с помощью нуклеофектора, аппарата для ядерной трансфекции, разработанного Amaxa, можно непосредственно вводить чужеродные гены в ядро для достижения высокоэффективной трансдукции генов-мишеней. Кроме того, по сравнению с обычной электропорацией, была значительно улучшена эффективность трансдукции системы транспозонов на основе системы Sleeping Beauty или транспозона PiggyBac. Сообщалось о комбинации нуклеофектора для трансфекции и системы транспозона SB Sleeping Beauty (Davies JK., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res, 2010, 70(10): OF1-10.), и благодаря этому способу может быть достигнута высокая эффективность трансдукции и сайт-направленной интеграции генов-мишеней. В одном варианте осуществления изобретения способ трансдукции Т-лимфоцитов, модифицированных геном химерного антигенного рецептора, представляет собой способ трансдукции на основе вируса, такого как ретровирус или лентивирус. Способ имеет преимущества высокой эффективности трансдукции и стабильной экспрессии экзогенного гена, при этом время культивирования in vitro Т-лимфоцитов до клинического уровня может быть сокращено. Трансдуцированная нуклеиновая кислота экспрессируется, проходя этапы транскрипции и трансляции, на поверхности трансгенных Т-лимфоцитов. Анализ цитотоксичности in vitro, проведенный на различных культивируемых опухолевых клетках, показал, что иммунные эффекторные клетки по настоящему изобретению обладают высокоспецифическими эффектами уничтожения опухолевых клеток (также известными как цитотоксичность). Таким образом, нуклеиновая кислота, кодирующая белок химерного антигенного рецептора по настоящему изобретению, плазмида, содержащая нуклеиновую кислоту, вирус, содержащий плазмиду, и трансгенные иммунные эффекторные клетки, трансфицированные нуклеиновой кислотой, плазмидой или вирусом, описанными выше, могут эффективно применяться в иммунотерапии опухоли.

Иммунные клетки по настоящему изобретению также могут нести экзогенные кодирующие последовательности для цитокинов, включая, но не ограничиваясь следующими: IL-12, IL-15 или IL-21. Эти цитокины обладают иммуномодулирующей или противоопухолевой активностью, усиливают функцию эффекторных Т-клеток и активированных естественных клеток-киллеров, или непосредственно оказывают противоопухолевое действие. Таким образом, специалистам в данной области техники будет понятно, что применение этих цитокинов поможет иммунным клеткам функционировать лучше.

В дополнение к химерному антигенному рецептору, описанному выше, иммунные клетки по настоящему изобретению могут также экспрессировать другой химерный антигенный рецептор, который не содержит CD3ζ, но содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28 и внутриклеточный сигнальный домен CD137 или их комбинацию.

Иммунные клетки по настоящему изобретению могут также экспрессировать хемокиновые рецепторы; хемокиновые рецепторы включают, но не ограничиваются следующим: CCR2. Опытному специалисту будет понятно, что хемокиновый рецептор CCR2 может конкурентно связывать CCR2 в организме и применим для блокирования метастазирования опухоли.

Иммунные клетки по настоящему изобретению могут также экспрессировать миРНК, которая может уменьшить экспрессию PD-1 или блокирующий PD-L1 белок. Опытному специалисту будет понятно, что конкурентная блокировка взаимодействий между PD-L1 и его рецептором PD-1 будет способствовать восстановлению противоопухолевых Т-клеточных ответов, тем самым ингибируя рост опухоли.

Иммунные клетки по настоящему изобретению могут также экспрессировать предохранитель; предпочтительно, предохранитель включает индуцируемую каспазу-9, процессированный EGFR или RQR8.

Фармацевтическая композиция

Антитела, иммуноконъюгаты, содержащие антитела, и генетически модифицированные иммунные клетки по настоящему изобретению могут быть применены для получения фармацевтической композиции или средства для диагностики опухолей. В дополнение к эффективному количеству антитела, иммунологического конъюгата или иммунной клетки, композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый" означает, что, когда молекулярные субстанции и композиции правильно вводят животным или людям, они не вызывают неблагоприятных, аллергических или других нежелательных реакций.

Конкретными примерами некоторых веществ, которые могут быть применены в качестве фармацевтически приемлемых носителей или их компонентов, являются сахара, такие как лактоза, декстроза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлоза и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и метилцеллюлоза; трагант; солод; желатин; тальк; твердые смазывающие вещества, такие как стеариновая кислота и стеарат магния; сульфат кальция; растительные масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло какао; многоатомные спирты, такие как пропиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; альгиновая кислота; эмульгаторы, такие как Tween®; смачивающие агенты, такие как лаурилсульфат натрия; красители; ароматизаторы; таблетки, стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты; апирогенная вода; изотонические солевые растворы; и фосфатные буферы и т.п.

Композиция по настоящему изобретению может быть получена в различных лекарственных формах по мере необходимости, и дозировка, которую нужно вводить пациенту, может быть определена врачом в соответствии с факторами, такими как тип, возраст, масса тела и общее медицинское состояние пациента, способ введения и тому подобное. Например, можно применять инъекцию или другое лечение.

Далее настоящее изобретение описано конкретными вариантами осуществления. Следует понимать, что эти примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. В нижеследующих примерах, экспериментальные процедуры, там, где не указаны конкретные условия, обычно выполняются в соответствии с условиями, описанными в обычных условиях, такими как составленные J. Sambrook et al., Molecular Cloning Experiments Guide, Third Edition, Science Press, 2002, или согласно предлагаемым изготовителем условиям.

Пример 1. Конструирование библиотеки одноцепочечного антитела 7B3 с созревшей аффинностью

Одноцепочечное антитело 7B3 представляет собой гуманизированный фрагмент антитела, который специфически распознает криптический эпитоп (²⁸⁷CGADSYEMEEDGVRKC³⁰² (SEQ ID NO: 1)), образованный из аминокислотной последовательности положений 287-302 EGFR, представленного в опухолевых клетках. Нуклеотидные последовательности генов VL и VH были получены из последовательностей SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 13, как показано в патентной заявке 201210094008.x, и связаны в порядке VL7B3-линкер-VH7B3.

Нуклеотидная последовательность (717 пар оснований, SEQ ID NO: 2) одноцепочечного антитела 7B3:

GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGACCGTGTGACC

ATTACCTGCCATGCGAGCCAGGATATTAACAGCAACATTGGCTGGCTGCAGCAGAAACCG

GGCAAAGCGTTTAAAGGCCTGATTTATCATGGCAAAAACCTGGAAGATGGCGTGCCGAGC

CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG

GAAGATTTTGCGACCTATTATTGCGTTCAGTACGCCCAGTTCCCATATACATTTGGCCAG

GGCACCAAAGTGGAAATTAAACGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT

GGCGGATCGGATGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGC

CTGCGTCTGAGCTGCGCGGTGAGCGGCTATAGCATTACCAGCGATTATGCGTGGAACTGG

ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCTATATTAGCTATCGTGGCCGC

ACCAGCTATAACCCGAGCCTGAAAAGCCGTATTAGCATTACCCGTGATAACAGCAAAAAC

ACCTTTTTCCTGCAGCTGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCG

CGCCTGGGACGCGGCTTCCGCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

Аминокислотная последовательность одноцепочечного антитела 7B3 (239 аминокислот, SEQ ID NO: 3, подчеркнутая область представляла собой 7B3 VL CDR1, CDR2, CDR3, 7B3 VH CDR1, CDR2, CDR3, соответственно):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQDINSNIGWLQQKPGKAFKGLIYHGKNLEDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPYTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSDYAWNWIRQAPGKGLEWLGYISYRGRTSYNPSLKSRISITRDNSKNTFFLQLNSLRAEDTAVYYCARLGRGFRYWGQGTLVTVSS

Для повышения способности одноцепочечного антитела 7B3 связываться с EGFR, некоторые аминокислоты в CDR3 легкой цепи и CDR3 тяжелой цепи были случайным образом мутированы и были сконструированы соответствующие библиотеки с созревшей аффиностью.

1. Конструирование библиотеки 7B3 с созревшей аффинностью легкой цепи CDR3

После выравнивания последовательностей и анализа одноцепочечного антитела 7B3 была выбрана часть аминокислот в третьей области CDR легкой цепи 7B3, и случайные мутации были введены праймерами для создания библиотеки с созревшей аффинностью легкой цепи.

Для получения фрагмента ДНК, кодирующего библиотеку мутантного 7B3, два ДНК-фрагмента были соответственно получены с помощью ПЦР с применением плазмиды pCantab 5E-7B3 (вставка 7B3 в сайт sfiI/NotI pCantab 5E-7B3) в качестве матрицы с последующим сплайсированием способом обходного ПЦР. В частности, применяли следующую процедуру: для синтеза генов, реакции ПЦР выполняли в объеме по 50 мкл каждая с применением плазмиды pCantab 5E-7B3 в качестве матрицы с конечной концентрацией 0,2 мкМ для каждого праймера и добавляли 5 мкл 10 × KOD Plus буфера, 4 мкл dNTP (dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 2 мМ каждый), 2 мкл 25 мМ MgSO₄ и 1 ед. KOD Plus (Takara) и процедуру ПЦР запускали в термоциклере после доведения объема водой. Реакцию сначала нагревали до 94 °С в течение 5 минут, а затем инкубировали в течение 25 циклов при 94 °С в течение 30 с, 56 °С в течение 30 с и 68 °С в течение 30 с, и, наконец, при 68 °С в течение 10 минут. Первый фрагмент амплифицировали с применением праймеров pC7B3fw (SEQ ID NO: 4, ATAACAGGCCCAGCCGGCCATGGATATTCAGATGACCCAGAG) и LR3re (SEQ ID NO: 5, CACTTTGGTGCCCTGGCCAAATGTMNNTGGGNNMNNMNNMNNCTGMNNGCAATA ATAGGTCGCAAAATC), а второй фрагмент амплифицировали с применением праймеров LR3f2fw (SEQ ID NO: 6, ACATTTGGCCAGGGCACCAAAG) и pC7B3re (SEQ ID NO: 7, ATAAATGCGGCC GCGCTGCTCACGGTCAC).

Предполагаемые продукты ПЦР идентифицировали аналитическим электрофорезом в агарозном геле и очищали от образцов с помощью Wizard SV Gel и набора PCR Clean-Up (доступно от Promega). Оба фрагмента добавляли в эквимолярном отношении во второй цикл мостиковой ПЦР в качестве матрицы, и реакционная система все еще использовала указанную выше систему KOD Plus. Реакционную смесь сначала нагревали до 94 °С в течение 5 минут, а затем инкубировали в течение 10 циклов, причем каждый цикл включал следующие условия 94 °С в течение 30 с, 60 °С в течение 30 с, и 68 °С в течение 30 с, и, наконец, 68 °С в течение 10 минут. Затем праймеры pC7B3fw и pC7B3re непосредственно добавляли в реакционную систему при конечной концентрации 0,2 мкМ, и запускали программу ПЦР. Реакцию сначала нагревали до 94 °С в течение 5 минут, а затем инкубировали в течение 25 циклов при 94 °С в течение 30 с, 56 °С в течение 30 с, и 68 °С в течение 30 с, и, наконец, при 68 °С в течение 10 минут. Предполагаемые продукты ПЦР разделяли препаративным электрофорезом в агарозном геле и очищали наборами Wizard SV Gel и PCR Clean-up в соответствии с инструкциями производителя.

В библиотеке полные фрагменты ДНК, содержащие сайты распознавания рестриктазы sfiI и Notl на каждом конце, расщепляли с помощью рестрикционной эндонуклеазы sfiI/NotI (приобретено у New England Biolabs) для рестрикционного расщепления и вставляли в фагмидный вектор pCANTAB 5E, расщепляемый теми же двумя ферментами. Продукты лигирования выделяли и обессоливали с применением Wizard SV Gel и набора PCR Clean-Up для электротрансформации. Для электротрансформации применяли компетентный E. coli ER2738 собственного получения (доступный от New England Biolabs) с кюветой для электропорации и прибором для электропорации Gene Pulser II (от Bio-Rad). Наконец, была подтверждена библиотека, содержащая 1,9 × 10⁹ мутантов.

2. Конструирование библиотеки с созревшей аффинностью тяжелой цепи CDR3 7B3

После выравнивания последовательностей и анализа одноцепочечного антитела 7B3 была выбрана часть аминокислот в третьей области CDR тяжелой цепи 7B3, и случайные мутации были введены праймерами для конструирования библиотеки с созревшей аффинностью тяжелой цепи.

Для получения фрагмента ДНК, кодирующего библиотеку мутантного 7B3, два ДНК-фрагмента были соответственно получены с помощью ПЦР с применением плазмиды pCantab 5E-7B3 в качестве матрицы с последующим сплайсированием способом обходного ПЦР. В частности, применяли следующую процедуру: для синтеза генов, реакции ПЦР выполняли в объеме по 50 мкл каждая с применением плазмиды pCantab 5E-7B3 в качестве матрицы с конечной концентрацией 0,2 мкМ для каждого праймера и добавляли 5 мкл 10 × KOD Plus буфера, 4 мкл dNTP (dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 2 мМ каждый), 2 мкл 25 мМ MgSO₄ и 1 ед. KOD Plus и процедуру ПЦР запускали в термоциклере после доведения объема водой. Реакцию сначала нагревали до 94 °С в течение 5 минут, а затем инкубировали в течение 25 циклов при 94 °С в течение 30 с, 56 °С в течение 30 с и 68 °С в течение 30 с, и, наконец, при 68 °С в течение 10 минут. Первый фрагмент амплифицировали с применением праймеров HR3f1fw (SEQ ID NO: 8, TCGCAATTCCTTTAGTTGTTCC) и HR3f1re (SEQ ID NO: 9, CAGGGTGCCCTGGCCCCAGTAANNMNNMNNMNNMNNMNNGCGCGCGCAATAATACAC), а второй фрагмент амплифицировали с применением праймеров HR3f2fw (SEQ ID NO: 10, TACTGGGGCCAGGGCACCCTG) и HR3f2re (SEQ ID NO: 11, GGAATAGGTGTATCACCGTACTCAG).

Предполагаемые продукты ПЦР идентифицировали аналитическим электрофорезом в агарозном геле и очищали от образцов с помощью Wizard SV Gel и набора PCR Clean-Up. Оба фрагмента добавляли в эквимолярном отношении во второй цикл мостиковой ПЦР в качестве матрицы, и реакционная система все еще использовала указанную выше систему KOD Plus. Реакционную смесь сначала нагревали до 94 °С в течение 5 минут, а затем инкубировали в течение 10 циклов, причем каждый цикл включал следующие условия 94 °С в течение 30 с, 60 °С в течение 30 с, и 68 °С в течение 30 с, и, наконец, 68 °С в течение 10 минут. Затем праймеры HR3f1fw и HR3f2re непосредственно добавляли в реакционную систему при конечной концентрации 0,2 мкМ, и запускали программу ПЦР. Реакцию сначала нагревали до 94 °С в течение 5 минут, а затем инкубировали в течение 25 циклов при 94 °С в течение 30 с, 56 °С в течение 30 с, 68 °С в течение 30 с, и, наконец, при 68 °С в течение 10 минут. Предполагаемые продукты ПЦР разделяли препаративным электрофорезом в агарозном геле и очищали наборами Wizard SV Gel и PCR Clean-up в соответствии с инструкциями производителя.

В библиотеке полные фрагменты ДНК, содержащие сайты распознавания рестриктазы sfiI и Notl на каждом конце, расщепляли с помощью рестрикционной эндонуклеазы sfiI/NotI для рестрикционного расщепления и вставляли в фагмидный вектор pCANTAB 5E, расщепляемый теми же двумя ферментами. Продукты лигирования выделяли и обессоливали с применением Wizard SV Gel и набора PCR Clean-Up для электротрансформации. Для электротрансформации применяли компетентный E. coli ER2738 собственного получения с кюветой для электропорации и прибором для электропорации Gene Pulser II. Наконец, была подтверждена библиотека, содержащая 6,0 × 10⁹ мутантов.

Пример 2. Скрининг EGFRvIII с применением библиотеки 7B3 с созревшей аффинностью

Для получения мутантов 7B3 с более высокой аффинностью были проведены четыре цикла скрининга с применением библиотек мутантов легкой цепи и тяжелой цепи, соответственно, следующим образом: из вышеуказанной библиотеки получали соответствующую фаговую библиотеку путем заражения вспомогательного фага M13KO7. Фаговую библиотеку инкубировали с биотин-меченым антигеном EGFRvIII (приобретен у Shanghai raygene biotechnology Co., LTD) в течение 2 часов при комнатной температуре, а затем инкубировали с 2 мас./об.% магнитными частицами, блокированными БСА (бычий сывороточный альбумин, приобретен у Shanghai Bioengineering), покрытыми стрептавидином MyOne Cl (от Invitrogen) при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем частицы промывали буфером ФСБТ (фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,1 % Tween-20) для удаления фага, не связанного специфически или с более слабой связывающей способностью. Фаги с высокой связывающей способностью отделяли от магнитных частиц глицином-HCl (рН 2,2), нейтрализовали нейтрализующим раствором Триса (pH 9,1) и затем применяли для инфицирования E. coli ER2738 в средней логарифмической фазе роста для следующего цикла скрининга.

В вышеописанных четырех циклах скрининга количество магнитных частиц составляло 50 мкл, 25 мкл, 10 мкл и 10 мкл, концентрации биотин-меченого антигена EGFRvIII составляли 10 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ и 0,1 нМ, соответственно, и ФСБT применяли для промывки в течение 10, 10, 15 и 20 раз. Из второго цикла скрининга, 50-, 500- и 1000-кратный избыток немеченого антигена EGFRvIII, соответственно, добавляли в качестве конкурента перед элюированием для удаления мутантов с более слабой связывающей способностью.

Для получения фага, представляющего на поверхности мутантов одноцепочечных антител 7B3, штамм в глицерине, полученный в примере 1, инокулировали в 400 мл среды 2YT/ампициллина, чтобы плотность клеток составляла OD₆₀₀ = 0,1, и при 37 °C и 200 об/мин культивировали при встряхивании до достижения плотности клеток OD₆₀₀ = 0,5. Для инфицирования применяли 10¹² БОЕ вспомогательного фага M13KO7 и инкубировали при 30 °C и 50 об/мин в течение 30 минут. После добавления 50 мг/л канамицина и встряхивания при 37 °C и 200 об/мин в течение 30 минут гранулы отделяли центрифугированием (15 минут, 1600 × г, 4 °C) и ресуспендировали в 400 мл среды 2YT/ампициллин/канамицин и культивировали в течение 16 часов при 37 °С со встряхиванием при 200 об/мин. Наконец, гранулы отделяли центрифугированием (5000 об/мин, 4 °С в течение 20 минут) и отбрасывали. Супернатант фильтровали через фильтр 0,45 мкм и добавляли 1/4 объема 20 мас./об.% ПЭГ 8000, добавляли 2,5 М раствор NaCl и инкубировали на ледяной бане в течение 1 часа для осаждения фаговых гранул. Затем гранулы центрифугировали (20 мин, 8000 × g, 4 °С) и супернатант отбрасывали. Фаг ресуспендировали в 25 мл предварительно очищенного ФСБ (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na₂HPO₄, 2 мМ KH₂PO₄) и центрифугировали (5 минут, 20000 × g, 4 °C). К супернатанту добавляли 1/4 объема 20 мас./об.% ПЭГ 8000, 2,5 М раствор NaCl и инкубировали на ледяной бане в течение 30 минут для повторного осаждения фаговых частиц. Гранулы получали центрифугированием (30 мин при 20000 × g при 4 °С), повторно суспендировали в 2 мл предварительно охлажденный ФСБ, выдерживали на льду в течение 30 мин и центрифугировали (30 мин, 17000 × g, 4 °С). Супернатант смешивали с 4 мас./об.% БСА в ФСБ при соотношении 1:1, помещали в роторный смеситель и инкубировали на 30 минут при комнатной температуре, а затем применяли непосредственно для скрининга.

Пример 3. Идентификация мутантов 7B3, специфически связывающихся с EGFRvIII

После четырех циклов скрининга в отношении антигена EGFRvIII, случайным образом выбрали 96 клонов из клонов, полученных в четвертом цикле скрининга, и проанализировали их на комбинацию с антигенами EGFRvIII и N1N2-806 (приобретено у Shanghai raygene biotechnology Co., LTD) с применением ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ) с единичным фагом, где N1N2-806 представляет собой слитый белок домена N1N2 белка M13 фага PIII и аминокислот EGFR в положениях от 287 до 302. Для этой цели каждую отдельную колонию инокулировали в 300 мкл среды 2YT/ампициллин (содержащей 2 % глюкозы) на 96-луночном планшете с глубокими лунками и культивировали при встряхивании при 37 °C и 250 об/мин в течение 16 часов. 20 мкл культуры вносили в 500 мкл среды 2YT/ампициллина (содержащей 0,1 % глюкозы) и встряхивали при 37 °C и 250 об/мин в течение 1,5 часов. Для получения раствора вспомогательного фага брали 75 мкл M13KO7 (титр 3 × 10¹² БОЕ/мл) и смешивали с 15 мл среды 2YT и добавляли в планшет по 50 мкл/лунку. Инкубацию проводили при 37 °С и 150 об/мин в течение 30 минут, а затем добавляли 50 мкл/лунку готового раствора канамицина (180 мкл 50 мг/мл канамицина и добавляли в 15 мл среды 2YT) и культивировали при 37 °C и 250 об/мин в течение 16 часов при встряхивании. Наконец, клетки осаждали путем центрифугирования (30 минут при 5000 × g, 4 °C) и супернатант переносили в новый 96-луночный планшет с глубокими лунками.

Для проведения ELISA с единичным фагом в 96-луночный планшет MediSorp ELISA (приобретен у Nunc) размещали 100 нг/лунку антигена EGFRvIII, N1N2-806 и белки отрицательного контроля БСА и N1N2 (приобретены у Shanghai raygene biotechnology Co., LTD) по 50 мкл/лунку и покрывали, оставляя в течение ночи при 4 °С. Каждую лунку блокировали ФСБT, содержащим 2 % БСА (мас./об.). Затем лунки промывали ФСБT три раза. Затем каждый раствор фага, полученный выше, добавляли в каждую лунку планшета по 100 мкл/лунку. После инкубации в течение 2 часов при 37 °С его промывали три раза ФСБT. Для обнаружения связанного фага, конъюгат супероксиддисмутазы и антитела против M13 (приобретен у GE Healthcare) разводили в соотношении 1:5000 в ФСБT и в каждую лунку добавляли по 100 мкл. После инкубации при 37 °С в течение 1 часа, лунки промывали три раза ФСБT и затем три раза промывали ФСБ. Наконец, 50 мкл субстрата TMB добавляли в лунки и проводили визуализацию в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим добавлением 50 мкл 2М H₂SO₄ на лунку для остановки реакции окрашивания. Значения экстинкции измеряли при 450 нм с помощью иммуносорбента с иммобилизованными ферментами (Bio-Rad).

При проведении анализа ELISA, клоны с более сильным сигналом связывания антигена вместо БСА, были отобраны и использованы в последующем анализе оценки и секвенирования. Затем антитела, полученные из библиотеки с созревшей аффинностью легкой цепи, дополнительно объединяли с антителами, полученными из примера 2, в библиотеке с созревшей аффинностью тяжелой цепи в последовательности вариабельной области легкой цепи и последовательности вариабельной области тяжелой цепи, и полученные антитела также способны специфически связываться с антигенами EGFRvIII и N1N2-806 вместо контрольных белков БСА и N1N2.

По кристаллической структуре антитела и антигенной детерминанты в отношении структуры анализировали связывание комбинированных антител, полученных от мутаций легкой и тяжелой цепей 7B3 и EGFR_287-302, и, наконец, некоторые аминокислотные положения были выбраны для дальнейшей мутации для достижения более высокой аффинности и стабильности. Все измененные положения аминокислот включают S31 в области CDR1 легкой цепи, V89, A92, Q93, F94 и Y96 в области CDR3 легкой цепи, S182 в области CDR2 тяжелой цепи, L222, R224, G225, F226 и R227 в области CDR3 тяжелой цепи. На основании последовательностей комбинированных антител после мутагенеза легкой и тяжелой цепей, дополнительно вводили сайты мутации для получения антитела Y022. По сравнению с исходным антителом 7B3, Y022 содержит 12 сайтов мутаций аминокислот (S31V, V89N, A92E, Q93N, F94I, Y96L, S182Q, L222M, R224K, G225N, F226W и R227D). Как показано на фиг.1, при анализе ELISA с единичным фагом, Y022 способен специфически связываться с антигенами EGFRvIII и N1N2-806 без связывания с контрольными белками БСА и N1N2.

Нуклеотидная последовательность одноцепочечного антитела Y022 (717 оснований, SEQ ID NO: 12):

GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGACCGTGTGACC

ATTACCTGCCATGCGAGCCAGGATATTAACGTGAACATTGGCTGGCTGCAGCAGAAACCG

GGCAAAGCGTTTAAAGGCCTGATTTATCATGGCAAAAACCTGGAAGATGGCGTGCCGAGC

CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG

GAAGATTTTGCGACCTATTATTGCAATCAGTATGAAAATATCCCACTGACATTTGGCCAG

GGCACCAAAGTGGAAATTAAACGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT

GGCGGATCGGATGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGC

CTGCGTCTGAGCTGCGCGGTGAGCGGCTATAGCATTACCAGCGATTATGCGTGGAACTGG

ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCTATATTAGCTATCGTGGCCGC

ACCCAGTATAACCCGAGCCTGAAAAGCCGTATTAGCATTACCCGTGATAACAGCAAAAAC

ACCTTTTTCCTGCAGCTGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCG

CGCATGGGTAAGAATTGGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

Аминокислотная последовательность одноцепочечного антитела Y022 (239 аминокислот, SEQ ID NO: 13):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQDINVNIGWLQQKPGKAFKGLIYHGKNLEDGVPS

RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCNQYENIPLTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGG

GGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSDYAWNWIRQAPGKGLEWLGYISYRGR

TQYNPSLKSRISITRDNSKNTFFLQLNSLRAEDTAVYYCARMGKNWDYWGQGTLVTVSS

При этом легкая цепь находится в положениях с 1 по 108 и последовательность CDR1 легкой цепи: HASQDINVNIG (SEQ ID NO: 41), последовательность CDR2: HGKNLED (SEQ ID NO: 42), последовательность CDR3: NQYENIPLT (SEQ ID NO: 43).

При этом тяжелая цепь находится в положениях с 124 по 239 и последовательность CDR1 тяжелой цепи: GYSITSDYAWN (SEQ ID NO: 44), последовательность CDR2: YISYRGRTQYNPSLKS (SEQ ID NO: 45), последовательность CDR3: MGKNWDY (SEQ ID NO: 46).

Поскольку его подвергали скринингу в библиотеке мутантов, сконструированной ранее и подвергнуто сайт-направленному мутагенезу, нуклеотидная последовательность Y022 содержалась в pCantab 5E, названной плазмидой pCantab 5E-Y022.

Авторы изобретения также получили 10 дополнительных клонов антител со значительно улучшенными аффинностью и стабильностью, а именно M14, M15, M25, M26, S7, S8, S17, S22, S23 и S29, применяя тот же способ, что и для получения антитела Y022. По сравнению с исходным антителом 7B3 все одноцепочечные антитела содержали сайты мутаций аминокислот, как показано в таблице 1.

Таблица 1

АнтителоСайт мутации аминокислотY022S31V，V89N，A92E，Q93N，F94I，Y96L，S182Q，L222M，R224K，G225N，F226W，R227DM14V89N，A92E，Q93N，F94N，Y96I，S182NM15S31V，V89N，A92E，Q93N，F94N，Y96IM25S31V，V89N，A92E，Q93N，F94I，Y96L，S182RM26S31V，V89N，A92E，Q93N，F94I，Y96L，S182QS7S31V，K53T，V89N，A92E，Q93N，F94N，Y96IS8S31V，A44S，V89N，A92E，Q93N，F94N，Y96IS17S31T，V89N，A92E，Q93N，F94N，Y96L，S182QS22S31V，K53T，V89N，A92E，Q93N，F94N，Y96L，S182RS23S31V，A44S，V89N，A92E，Q93N，F94N，Y96L，S182RS29S31V，V89N，A92E，Q93N，Y96L，S182R

Нуклеотидная последовательность одноцепочечного антитела М14 (717 оснований; SEQ ID NO: 58):

GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGACCGTGTGACC

ATTACCTGCCATGCGAGCCAGGATATTAACAGCAACATTGGCTGGCTGCAGCAGAAACCG

GGCAAAGCGTTTAAAGGCCTGATTTATCATGGCAAAAACCTGGAAGATGGCGTGCCGAGC

CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG

GAAGATTTTGCGACCTATTATTGCAATCAGTATGAAAATAACCCAATTACATTTGGCCAG

GGCACCAAAGTGGAAATTAAACGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT

GGCGGATCGGATGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGC

CTGCGTCTGAGCTGCGCGGTGAGCGGCTATAGCATTACCAGCGATTATGCGTGGAACTGG

ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCTATATTAGCTATCGTGGCCGC

ACCAACTATAACCCGAGCCTGAAAAGCCGTATTAGCATTACCCGTGATAACAGCAAAAAC

ACCTTTTTCCTGCAGCTGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCG

CGCCTGGGACGCGGCTTCCGCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

Аминокислотная последовательность одноцепочечного антитела М14 (239 аминокислот; SEQ ID NO: 59):

Аминокислотные последовательности легкой цепи CDR1 M14 (HASQDINSNIG), CDR2 (HGKNLED), CDR3 (NQYENNPIT) и тяжелой цепи CDR1 (GYSITSDYAWN), CDR2 (YISYRGRTNYNPSLKS), CDR3 (LGRGFRY) представляют собой SEQ ID NO: 47, 42, 48, 44, 49, 50, соответственно.

Нуклеотидная последовательность одноцепочечного антитела М15 (717 оснований; SEQ ID NO: 60):