Способ терапии ремиттирующего рассеянного склероза - RU2523058C2

Чертежи

Показать все 13 чертежа(ей)

Описание

Изобретение относится к медицине, фармакологии, клеточной биотехнологии и может найти применение в лечении ремиттирующего рассеянного склероза и в научных целях.

Развитие аутоиммунных заболеваний связано с нарушением механизмов, контролирующих толерантность Т- и В-лимфоцитов к аутоантигенам [1]. Подобные нарушения индуцируют воспаление и повреждение собственных тканей организма активированными аутореактивными Т- и В-клетками. Сравнительно недавно были идентифицированы регуляторные Т-клетки, способные подавлять пролиферацию и эффекторные функции аутореактивных лимфоцитов. Большинство Т-клеток, обладающих регуляторной функцией, принадлежат к субпопуляции лимфоцитов CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺(Т_рег) [2, 3]. Характерным признаком Т_рег является экспрессия на их поверхности α цепи рецептора интерлейкина-2 (CD25⁺). У больных аутоиммунными заболеваниями выявлено значительное снижение количества Т_рег и нарушение их функции. Дефект Т_рег показан у больных системной красной волчанкой (СКВ), сахарным диабетом 1 типа, болезнью Крона, псориазом, ревматоидным артритом и др. [4-8].

В последнее время появились работы, посвященные изучению роли Т_рег в патогенезе рассеянного склероза [9-12].

Рассеянный склероз (PC) - хроническое прогрессирующее заболевание ЦНС, которое клинически проявляется мультисистемной неврологической симптоматикой, а патоморфологически характеризуется образованием множественных очагов демиелинизации в белом веществе головного и спинного мозга [13]. Патогенетическим механизмом заболевания является активация аутореактивных Т-клеток, специфичных против компонентов миелина, что приводит к повреждению миелиновой оболочки олигодендроцитов и аксонов и, как следствие этого, к формированию стойкого неврологического дефицита у больных [14].

В настоящее время препараты для лекарственной терапии PC можно условно подразделить на две группы: препараты для симптоматического лечения и препараты, изменяющие течение рассеянного склероза (ПИТРС) [15, 16].

В качестве лекарственных средств для симптоматического лечения PC применяются глюкокортикоиды (преднизолон, метипред, солумедрол и др.) и иммуносупрессивные препараты (циклофосфан, азатиоприн, митоксантрон и др.).

Механизмы действия глюкокортикоидов заключаются в уменьшении содержания активированных иммунокомпетентных клеток и уменьшении образования аутоантител [17].

Противовоспалительное действие связано прежде всего со снижением проницаемости сосудов и гематоэнцафилического барьера за счет торможения синтеза простогландинов. Вследствие снижения проницаемости эндотелия капилляров уменьшается миграция лейкоцитов и других клеток в очаг воспаления. АКТГ и его синтетические аналоги (Тетракозактид) обладают нейротрансмиттерным эффектом.

Среди недостатков данной группы препаратов следует отметить симптоматический характер лечения, кроме того, их длительное применение вызывает синдром гиперкортицизма (синдром Кушинга), психические расстройства, артериальную гипертензию, гипертрихоз [18].

При первично или вторично прогрессирующем рассеянном склерозе наряду с кортикостероидами (КС) применяют цитостатики, такие как азатиаприн, кладрибин, метотрексат, циклофосфамид, митоксантрон и др. Препараты имеют выраженные побочные действия, связанные с плохой переносимостью и угнетением костномозгового кроветворения [19].

Среди средств патогенетического лечения PC, достоверно изменяющих течение заболевания, в РФ зарегистрирован ряд препаратов, изменяющих течение PC (ПИТРС) [20]. К группе ПИТРС относят препараты интерферонов бета. Это интерферон-бета 1а и интерферон-бета 1б. Терапевтические эффекты ИФН-β связаны с влиянием на презентирование антигенов и угнетение пролиферации и активации воспалительных клеток; угнетение продукции провоспалительных цитокинов и изменение цитокинового профиля в сторону противовоспалительного фенотипа, а также уменьшение поступления лейкоцитов в центральную нервную систему через гематоэнцефалический барьер за счет влияния на молекулы адгезии, хемокины и матриксные металлопротеиназы [21-26].

К основным недостаткам применения ИФНβ относится длительность лечения (от 6 месяцев) и при наличии эффекта курс должен продолжаться пожизненно. Стоимость курса лечения и побочные эффекты - гриппоподобный синдром (повышение температуры тела, ломота в мышцах, суставах, слабость, разбитость), а также выработка нейтрализующих антител. У большинства пациентов данные антитела появляются между 6-м и 18-м месяцами после начала терапии. Доказано отрицательное влияние нейтрализующих антител как на клинические (частота обострений), так и нейровизуализационные показатели активности PC, а также на прогрессирование инвалидизации [27].

Для лечения рассеянного склероза также применяется синтетический полимер четырех аминокислот - глатирамера ацетат (Копаксон), механизм действия которого заключается в конкурентном связывании с молекулой II класса главного комплекса гистосовместимости, участвующей в презентировании антигенов с основным белком миелина, а также в активации Th2 CD4⁺ Т-клеток, пересекающих гематоэнцефалический барьер, что приводит к угнетению аутоиммунного ответа на множественные антигены миелина [28].

Прямые сравнительные исследования копаксона с высокими дозами бета-интерферонов (Ребиф, Бетаферон) не показали значимых отличий в способности препаратов снижать частоту обострений, а также уменьшать количество и объем поражений на МРТ [29].

Среди недостатков терапии данным препаратом следует выделить необходимость длительного применения (курс длится от 6 месяцев), высокую стоимость и наличие побочных реакций как в местах инъекций (гиперемия, жжение), так и в виде генерализованной постинъекционной реакции (одышка, тахикардия, гиперемия кожи, холодный пот, боли в грудной клетке, потемнение в глазах). Кроме того, при многолетнем приеме препарата возможно образование липоатрофических (локальная атрофия жировой ткани в местах инъекций) изменений [30].

Для терапии PC также применяется препарат моноклональных антител к молекулам интегринов - натализумаб (Тисабри). У больных PC препарат блокирует молекулярное взаимодействие между а4-интегрином, экспрессируемым на аутоагрессивных лимфоцитах, и васкулярной молекулой клеточной адгезии 1 (VCAM-1) сосудистого эндотелия гемато-энцефалического барьера (ГЭБ), что предотвращает миграцию лимфоцитов через эндотелий в очаги воспаления в ЦНС [31].

Среди недостатков препарата следует отметить высокую частоту (до 25% пациентов) побочных эффектов (головные боли, головокружение, кожный зуд, озноб, крапивница, астения). Отдаленные побочные эффекты связаны с иммуносупрессией, возникающей в результате действия препарата: инфекции мочевыводящих путей, вагинальные инфекции, пневмонии, тонзиллиты, герпетические инфекции. У 0,1% пациентов возможно повреждение печени, в связи с чем Европейским медицинским агентством по регистрации лекарственных средств (ЕМЕА) рекомендовано проводить регулярное обследование пациентов на предмет поражения печени при проведении лечения натализумабом [32].

Однако наиболее тяжелым побочным эффектом лечения Тисабри является прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия (ПМЛ) - демиелинизирующее заболевание, проявляющееся головными болями, парезами, нарушением координации, нарушением зрения, речи (афазия) и выраженными когнитивными расстройствами. Чаще всего заболевание заканчивается смертью пациента. ПМЛ связано с активизацией в условиях иммунодефицита вируса полиомы JCV в центральной нервной системе. Частота ПМЛ при лечении Тисабри составляет по последним данным 1.2/10000 пациентов [33]. Специфического лечения не существует.

Задача изобретения - повышение эффективности лечения ремиттирующего рассеянного склероза и снижение побочных эффектов.

Поставленная задача решается путем введения больному в стадии ремиссии выращенных ех vivo аутологичных регуляторных Т-клеток CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ из расчета 4,5-5,5 млн клеток на 1 кг веса пациента.

Авторами проведено исследования периферической крови 52 больных PC в стадии обострения и выявлено снижение Т_рег в 2-3 раза по сравнению с группой здоровых доноров. Далее, чтобы проверить, изменяется ли содержание Т_рег в зависимости от степени выраженности процесса, мы изучили иммунофенотип одной и той же группы больных и в стадии обострения, и в ремиссии.

Мы показали, что в стадии обострения количество Т_рег значительно снижено, тогда как в стадии ремиссии их содержание увеличивается и достигает уровня нормы. Далее, мы провели сопоставление между показателями тяжести заболевания и уровнем Т_рег в крови больных. Результаты продемонстрировали очевидную обратную зависимость между количеством Т_рег и степенью инвалидизации по шкале EDSS. Функциональная активность Т_рег, выделенных из периферической крови больных PC, также существенно снижена. Наши результаты подтверждают данные других авторов [34-37], это свидетельствует о том, что Т_рег клетки играют важную роль в поддержании иммунологической толерантности при PC. Исходя из этого одним из перспективных методов лечения PC является иммунокоррегирующая терапия.

1. Получение ex vivo (генерация и экспансия) клеток CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺

Проводилось по патенту РФ №2437933 2011 г.

Для оценки количества клеток CD4⁺CD25⁺, CD4⁺CD25⁺, CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ в мононуклеарной фракции, клеточную суспензию окрашивают соответствующими антителами и определяют процент указанных выше субпопуляций в исходной клеточной взвеси на приборе MACsQuant (Miltenyi Biotec).

На рисунке 1 представлен пример экспрессии характерных для Т_рег маркеров в МНК здорового донора. (А) 12,6% CD4⁺ Т-клеток коэкспрессируют CD25⁺. При этом у 5,9% таких CD4⁺CD25⁺ клеток наблюдается яркое свечение маркера CD25⁺, что расценивается как CD4⁺CO25^hi. Кроме того, 4,4% CD4⁺CD25⁺ Т-клеток коэкспрессирует также маркер Foxp3 (Б), а 5,1% - маркер CD 152 (В).

2. Сепарация CD4⁺ из МНК на колонках в магнитном поле

Сепарацию CD4⁺ Т-клеток из суспензии мононуклеарных клеток периферической крови человека на колонках, находящихся в магнитном поле, осуществляют в соответствии с инструкцией производителя (Myltenyi Biotec, Germany).

На рисунке 2 на примере периферической крови донора показана экспрессия характерных для Т_рег маркеров в популяции выделенных CD4⁺ Т-клеток. (А) 29,7% CD4⁺ Т-клеток коэкспрессирует маркер CD25⁺, причем 14,4% таких CD4⁺CD25⁺ клеток являются CD4⁺CD25^hi. Кроме того, 6,9% CD4⁺CD25⁺ Т-клеток коэкспрессирует также маркер Foxp3 (Б), а 7,2% - маркер CD152 (В).

Повышенные значения экспрессии каждого из маркеров по сравнению с таковыми, представленными на рисунке 1, объясняются тем, что на рисунке 1 процент экспрессии дан относительно всей популяции МНК, а на рисунке 2 - относительно популяции выделенных из них CD4⁺ клеток, которые, в среднем, составляют около 40% от МНК. Таким образом, если количество CD4⁺CD25⁺ клеток во фракции МНК составляет 12,6% (рисунок 1А), то количество тех же клеток относительно фракции CD4⁺ составляет 29,7% (рисунок 2А).

3. Фенотипические характеристики Т-регуляторных клеток после культивирования.

В Таблице 1 представлены результаты цитометрического анализа CD4⁺ Т-клеток до начала культивирования и через 7 дней после него.

Рисунок 3 показывает характерный пример экспрессии маркеров регуляторных Т-клеток после 7 дней культивирования. (А) После культивирования 99,9±0,2% CD4⁺ клеток коэкспрессирует CD25⁺, причем 99,7±1,7% из них являются CD4⁺CD25^hi. После культивирования Foxp3 коэкспрессируется на 89,6±3,2% (Б), а CTLA-4 - на 93,8±3,0% (В) CD4⁺CD25⁺ клеток. Таким образом, полученные после культивирования клетки имеют характерный для Т-регуляторов фенотип.

4. Экспансия Т-регуляторных клеток. Через 6-8 дней культивирования общее количество клеток увеличивается в среднем в 22,4±9,9 раза, а количество CD4+CD25+Foxp3+ регуляторных Т-клеток - в 948±432 раза.

Рисунок 4 показывает увеличение общего количества клеток (серые столбики диаграммы) и количества Т_рег (заштрихованные столбики диаграммы) в зависимости от срока культивирования. Так, если на 6 день культивирования общее количество клеток увеличивается в 14,0±4,9 раза, а количество Т_рег - в 641±197 раза, то на 8 день культивирования кратность увеличения составляет 27,2±7,3 и 1272±470 соответственно.

9. После экспансии супрессорная активность регуляторных Т-клеток сохраняется. Функциональную активность нативных и культивированных Т_рег сравнивают по их способности ингибировать пролиферацию клеток-мишеней в смешанной культуре лимфоцитов. Для этого аутологичные клетки-мишени (CD4⁺, CD4⁺CD25^-, выделенные методом магнитной сепарации), окрашенные витальным красителем Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE, Fluka, США), инкубируют в отсутствие или присутствии равного (1:1) количества нативных (свежевыделенных) или культивированных Т_рег. Стимуляцию пролиферации производят аллогенными антиген-презентирующими клетками (МНК с удаленными методом магнитной сепарации CD3⁺ Т-лимфоцитами, обработанные митомицином С) в присутствии 5 мкг/мл моноклональных антител к CD3 антигену. Через 5-7 дней инкубации пролиферацию клеток оценивают по редукции окраски CFSE, которая происходит в активно делящихся клетках.

Рисунок 5 показывает характерные примеры пролиферации клеток-мишеней (CD4⁺CD25^-) в отсутствие (А) и в присутствии (Б) регуляторных Т-клеток.

Вычисляют индекс пролиферации (И.П.) клеток-мишеней в каждом из типов лунок. Для этого учитывают количество клеток в каждом поколении (M1-М6 на рисунке 5), а вычисление И.П. производят делением суммы клеток во всех поколениях на сумму родительских клеток-предшественников. Количество родительских клеток-предшественников вычисляют делением количества клеток в данном поколении на 2^x, где x - номер поколения. Чем индекс пролиферации выше, тем сильнее пролиферируют клетки.

Рисунок 6 представляет результаты исследования супрессорной активности регуляторных Т-клеток до и после 7 дней культивирования. Видно, что пролиферация клеток-мишеней сильно подавлена при их культивировании в присутствии Т_рег, причем супрессорная активность нативных и культивированных Т_рег практически не отличалась: в случае использования в качестве клеток-мишеней CD4⁺(А) нативные Т_рег подавляли пролиферацию на 76,3%, а культивированные - на 82,4%; в случае использования CD4⁺CD25^- (Б) эти цифры составляли 87,9% и 86,7% соответственно.

Эффективность предлагаемой разработки

Наблюдение №1.

Клинические примеры 1-3 иллюстрируют состояние иммунного статуса при различных стадиях аутоиммунного процесса.

Пациент К., 29 лет, поступил в НЦН РАМН 12 ноября 2009 года с жалобами на слабость в правых руке и ноге, периодические онемения правой руки до области локтевого сустава, учащенное мочеиспускание.

Анамнез настоящего заболевания: В мае 2008 года стал впервые отмечать появление слабости в правой руке при физической нагрузке. Через 6 месяцев присоединилась слабость в правой ноге, участилось мочеиспускание. Обратился к неврологу по месту жительства, рекомендовано проведение МРТ головного мозга. 25 октября 2009 года проведена МРТ головного мозга по данным которой в белом веществе головного мозга преимущественно перивентрикулярно, в проекции мозолистого тела, конвекситально в теменных долях и правой гемисфере мозжечка определяются множественные очаги гиперинтенсивного MP-сигнала в режимах Т2 и Flair. Заключение: демиелинизирующий процесс.

Неврологический статус: В сознании. Контактен. Менингеальных знаков нет. Глазные щели D=S, зрачки OD=OS, движения глазных яблок в полном объеме. Лицо симметричное в покое и при проведении мимических проб. Глотание и фонация не нарушены. Язык при высовывании по средней линии. Легкое снижение мышечной силы в правых руке и ноге до 4-х баллов. Мышечный тонус не изменен. Сухожильные и периостальные рефлексы с рук оживлены, с ног живые, симметричные. Брюшные рефлексы отсутствуют. Патологических стопных знаков нет. Клоноид стоп. Гипестезия в правой руке до уровня локтевого сустава. Координаторные пробы выполняет с интенцией, больше справа. В пробе Ромберга - легкое пошатывание. Учащенное мочеиспускание.

Соматический статус, общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови - без патологических изменений. ЭКГ: Ритм синусовый, 66 в минуту, нормальное положение электрической оси сердца.

На основании данных анамнеза, неврологического статуса и данных МРТ головного мозга поставлен диагноз: рассеянный склероз, ремиттирующее течение, обострение.

13 ноября 2009 года у пациента взята кровь для определения иммунного статуса, в том числе количества регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+.

13-17 ноября пациенту проводилась пульс-терапия солумедролом 1000 мг в/в капельно 1 раз в сутки. 20 ноября 2009 года пациент был выписан из НЦН РАМН с улучшением: регрессировали чувствительные, двигательные и координаторные расстройства.

16 декабря пациент был приглашен в НЦН РАМН для проведения повторного анализа иммунного статуса. Состояние пациента с момента выписки из стационара оставалось стабильным. В неврологическом статусе не выявлено отрицательной динамики. Поставлен диагноз: рассеянный склероз, ремиттирующее течение, ремиссия.

Таким образом, после проведенной терапии метилпреднизолоном (солумедрол) и стабилизации состояния пациента получено значительное повышение содержания регуляторных Т-клеток CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ в периферической крови. Вероятно, это связано со снижением активности эффекторных Т-клеток, продуцирующих провоспалительные цитокины, под влиянием гормональной терапии, что ведет к образованию на периферии индуцированных Т_рег, способных секретировать ИЛ-10 и TGFβ, что еще в большей степени способствует снижению активности аутоиммунного процесса.

Наблюдение №2

Пациентка Ж., 46 лет, поступила в НЦН РАМН 26 февраля 2009 года с жалобами на пошатывание при ходьбе, онемение правой половины лица, общую слабость, быструю утомляемость.

Анамнез настоящего заболевания: С середины 2006 года стала отмечать появление пошатывания при ходьбе. С этого же времени появилось непостоянное чувство онемения в пальцах рук. В конце декабря 2008 года появились жалобы на онемение правой половины лица. Обратилась к неврологу по месту жительства, рекомендовано проведение МРТ головного мозга. При МРТ головного мозга от 15 января 2009 года: в конвекситальных отделах белого вещества головного мозга, в проекции мозолистого тела, субкортикально, в перивентрикулярной области визуализируются множественные мелкие очаги повышенной интенсивности сигнала в режимах Т2 и Flair. Очаги аналогичной интенсивности сигнала определяются в правой ножке мозга, в левом полушарии мозжечка. Кроме того, в спинном мозге на уровне тела С4 определяется очаг округлой формы, повышенной интенсивности сигнала в режиме Т2. После введения контрастного вещества отмечается его накопление мелким очагом в задней трети мозолистого тела. Заключение: множественное очаговое поражение вещества головного и спинного мозга, вероятнее всего, демиелинизирующего характера.

Неврологический статус: Сознание ясное, менингеальной симптоматики нет. Глазные щели, зрачки D=S. Объем движения глазных яблок полный. Легкая гипалгезия на лице справа. Лицо в покое и при выполнении мимических проб симметричное. Глотание и фонация сохранены. Язык при высовывании по средней линии. Парезов нет. Сухожильные рефлексы оживлены, расширены зоны вызывания, симметричные. Патологических стопных знаков нет. Клонусы стоп. Расстройств чувствительности не выявлено. ПНП, ПКП - интенция с двух сторон. В пробе Ромберга пошатывание.

Неврологическая симптоматика, данные анамнеза, результаты дополнительных методов исследования позволили выставить диагноз: рассеянный склероз, ремиттирующее течение, обострение.

Соматический статус, общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови - без патологических изменений. ЭКГ: Ритм синусовый, 78 в минуту, нормальное положение электрической оси сердца.

01 марта 2009 года у пациентки взята кровь для определения иммунного статуса, в том числе количества и функциональной активности регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+.

Функциональная (супрессорная) активность регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в стадии обострения PC составила 59,1%. Индекс пролиферации CD4+ Т-клеток в отсутствие Т_рег 1, 2, в присутствии (при инкубации CD4+ и CD4+CD25+Foxp3+ в соотношении 1:1) - 0,8.

С 02 по 06 марта 2009 года проводилась пульс-терапия метидпреднизолоном 1000 мг внутривенно капельно 1 раз в сутки. Через 30 дней неврологическая симптоматика регрессировала и у пациентки была диагностирована ремиссия PC.

11 мая 2009 года у пациентки повторно взят образец крови для определения количества и функциональной активности регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+.

Функциональная активность регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в стадии ремиссии PC составила 62,7%.

На рисунке 7 представлены процент супрессорной активности Т_рег и пролиферативный индекс CD4⁺ Т-клеток в присутствии и в отсутствие Т_рег больной Ж. и донора Л. (стадия обострения и ремиссии РС).

Таким образом, данный клинический пример демонстрирует, что у больной PC имеет место не только количественный, но и функциональный дефект Т_рег как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии заболевания. Т_рег больного PC неспособны в полной мере проявлять свою функцию, что определяется более высокой способностью к пролиферации CD4+ Т-клеток. Снижение супрессорной функции Т_рег может быть обусловлено их генетическим дефектом, изменением гомеостаза Т_рег в результате нарушения их созревания и миграции или нарушенного их образования на периферии в результате угнетающего действия на них эффекторных клеток и определенного цитокинового профиля.

Наблюдение №3

Пациентка Д., 31 год, поступила в НЦН РАМН 06 марта 2009 года с жалобами на легкое онемение стоп.

Анамнез заболевания: 9 февраля 2009 года резко возникла общая слабость, системное головокружение, сопровождавшееся тошнотой и неукротимой рвотой. Данная симптоматика наблюдалась на протяжении всего дня, при измерении артериального давления оно составило 150/90 мм рт.ст, после введения церукала и вазопрессоров состояние нормализовалось. Несколько дней сохранялась общая слабость. Через 6 дней от первого приступа развился второй эпизод системного головокружения с неукротимой рвотой, нарушением зрения, онемением, ощущением холода и покалывания в предплечьях и голенях, симптоматика регрессировала самостоятельно через 2-3 дня. Обратилась к неврологу по месту жительства, рекомендовано проведение МРТ головного мозга. МРТ головного мозга от 26 февраля 2009 года - в белом веществе большого мозга с обеих сторон определяются множественные очаги овальной и треугольной формы, повышенного MP-сигнала в режимах Т2 и Flair, располагающиеся на границе белого и серого вещества, перивентрикулярно, в мозолистом теле. После введения контрастного вещества отмечается его кольцевидное и однородное накопление некоторыми очагами (2-мя в семиовальных центрах в левом полушарии большого мозга, очагом в правой затылочной доле, небольшими очагами в лобных долях, в субкортикальных отделах белого вещества левой височной доли, лобных и теменных долях). Заключение: полученные MP-данные соответствуют демиелинизирующему процессу головного мозга. В марте 2013 года пациентка находилась на стационарном лечение, проведена пульс-терапия метилпреднизолоном в суммарной дозе 5000 мг (1000 мг в/в кап. 1 раз в сутки). На фоне лечения регрессировало онемение стоп. 24 апреля 2009 года пациентка осмотрена неврологом в НЦН РАМН.

Неврологический статус: Сознание ясное. Глазные щели, зрачки симметричны. Объем движения глазных яблок полный. Нарушений чувствительности на лице не выявлено. Мимические пробы выполняет удовлетворительно. Глотание и фонация не нарушены. Язык в полости рта и при выведении по средней линии. Мышечная сила достаточная, тонус мышц не изменен. Сухожильные рефлексы с рук оживлены, симметричные, с ног повышены: коленный S>D, ахиллов D>S, брюшные рефлексы снижены, патологических стопных знаков нет. Клоноид коленной чашечки слева. Нарушений поверхностной и глубокой чувствительности не выявлено. Координаторные пробы выполняет удовлетворительно. В пробе Ромберга - легкое пошатывание. Походка не изменена. Функции тазовых органов не нарушены.

Соматический статус, общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови - без патологических изменений. ЭКГ: ритм синусовый, 72 в минуту. Вертикальное положение электрической оси.

Неврологическая симптоматика, данные анамнеза, результаты дополнительных методов исследования позволили выставить диагноз: рассеянный склероз, ремиттирующее течение, ремиссия.

24 апреля 2009 года у пациентки взята кровь для определения иммунного статуса, в том числе количества регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+.

После определения иммунного статуса выявлено значительное снижение содержания регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+(Т_рег).

После определения числа Т_рег в крови больной проведена индукция ex vivo CD4+ Т-клеток больной с целью получения линий регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+.

Так, до культивирования количество CD4- T-клеток, экспрессирующих CD25+ и Foxp3+, составляло 0,8%, то после индукции CD4+ Т-клеток больной ex vivo число Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+ достигло 89,3% (рис.8).

Далее было проведено сравнение супрессорной активности культивированных и нативных Т_рег больной PC. В результате получено, что супрессорная активность нативных Т_рег составляет 55,6%, а культивированных - 54,9% (рис.9).

Таким образом, на данном клиническом примере продемонстрировано, что культивированные Т_рег идентичны нативным как по фенотипическим, так и функциональным характеристикам и количество Т_рег возрастает в десятки раз после их индукции ex vivo.

Нижеследующие примеры иллюстрируют терапию по предлагаемому способу.

Наблюдение №4.

Пациентка М., 26 лет, обратилась в поликлинику НЦН РАМН 14 августа 2008 года с жалобами на легкое онемение в правых руке и ноге, слабость в ногах, неустойчивость при ходьбе, задержки мочеиспускания.

Анамнез заболевания: В 2006 году впервые появились судороги в ногах, онемение кончиков пальцев левой кисти, которое затем распространилось на всю руку. Через 3 месяца возникло онемение левой ноги. Также с этого времени стала отмечать периодические головокружения, слабость в ногах, постепенное ухудшение походки. В июле 2008 года - ухудшение состояния в виде усиления головокружения, нарастания слабости и онемения в ногах, неустойчивости при ходьбе, появились задержки мочеиспускания. Проводилась сосудисто-метаболическая терапия в течение 10 дней с положительным эффектом в виде регресса головокружений, улучшения походки, уменьшения слабости и онемения в ногах. 14 августа 2008 года проведена МРТ головного мозга, при которой выявлены небольшие очаги (до 0,7 см) гиперинтенсивного МР-сигнала в режимах Т2 и Т2 d-f, некоторые слабо пониженного - в Т1 в глубоких и субкортикальных отделах белого вещества обоих полушарий большого мозга, лобных, теменных долях, левой височной доли, полушариях мозжечка, перивентрикулярно, продолговатом мозге. Заключение: МРТ-данные соответствуют демиелинизирующему процессу головного мозга. При регистрации зрительных вызванных потенциалов отмечались признаки демиелинизации. 14 августа 2008 года пациентка госпитализирована в нейроинфекционное отделение НЦН РАМН. Неврологический статус: Сознание ясное, менингеальной симптоматики нет. Глазные щели, зрачки D=S. Объем движения глазных яблок полный. Горизонтальный среднеамплитудный нистагм, больше вправо. Чувствительность на лице не изменена. Лицо в покое и при выполнении мимических проб симметричное. Глотание и фонация сохранены. Язык при высовывании по средней линии. Парезов в руках нет. Легкий нижний спастический парапарез. Мышечный тонус в ногах умеренно повышен по пирамидному типу. Сухожильные рефлексы с рук - оживлены, с ног - высокие, с расширением зон вызывания, симметричные. Патологических стопных знаков нет. Клонусы стоп. Легкая гемигипестезия справа. Пяточно-коленная проба - интенция с двух сторон. В пробе Ромберга пошатывается. Походка паретическая (ходит без опоры). Периодические задержки мочеиспускания.

Соматический статус, общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови - без патологических изменений. ЭКГ: ритм синусовый 73 в минуту. Вертикальное положение электрической оси сердца.

На основании данных анамнеза, неврологического статуса и результатов инструментальных методов исследования поставлен диагноз: рассеянный склероз, ремиттирующее течение, стадия стабилизации.

16 августа 2008 у пациентки взята кровь для определения иммунного статуса, в том числе количества регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+.

Учитывая, что было выявлено значительное снижение содержания регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ (Т_рег) в крови больной PC. Пациентке было предложено сдать образец крови для проведения культивирования и последующего введения Т_рег. Пациентка ознакомилась с информированным согласием и подписала документ 20 августа 2008 года.

Индукция регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ культивированием ex vivo осуществлялась в течение 7 дней. После чего количество CD4+ Т-клеток, экспрессирующих CD25+ и Foxp3+, возросло до 88,7% (рис.10).

Всего было выделено 355×10⁶ культивированных аутологичных Т_рег. 28 августа 2008 года пациентке проведено введение 305×10⁶ из расчета 4,5-5,5×10⁶ клеток на 1 кг веса пациента в растворе 2 мл реополиглюкина подкожно в область живота.

При наблюдении за пациенткой в течение 2 недель в стационаре у нее не наблюдалось никаких побочных эффектов от введения аутологичных регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+.

На 14 день после введения Т_рег проведен повторный забор крови для определения иммунного статуса.

При исследовании получено достоверное увеличение содержания Т_рег в периферической крови пациентки более чем в два раза, однако не достигло нижней границы нормы (2%).

Таким образом, можно предположить, что увеличение количества циркулирующих в крови Т_рег может снижать активность аутоиммунного процесса и использоваться с целью коррекции иммунных нарушений при PC. По всей видимости, введение аутологичных регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ надо проводить до тех пор, пока их количество не составит уровня нормальных величин, который необходим для подавления активности эффекторных клеток. Причем периодически должно оцениваться содержание Т_рег в крови больного PC, и при его снижении желательно проводить повторные инъекции Т_рег для поддержания их количества на нормальном уровне.

Пилотное исследование безопасности и иммунологической эффективности терапии аутологичными регуляторными Т-клетками CD4+CD25+Foxp3+.

В пилотное исследование были включены 5 пациентов с ремиттирующим рассеянным склерозом в стадии ремиссии. Неврологический дефицит оценивался по расширенной шкале инвалидизации EDSS. Пациентам не проводилась терапия метилпреднизолоном до включения в исследование как минимум в течение 3 месяцев. Пациенты не получали иммуномодулирующей терапии. Все пациенты дали согласие на участие в исследовании. Протокол клинического исследования одобрен локальным этическим комитетом НЦН РАМН. Клинические и эпидемиологические данные больных приведены в таблице 2.

После введения выращенных ex vivo аутологичных регуляторных Т-клеток CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ у всех больных РРС выявлено увеличение содержания этих клеток в периферической крови (табл.3) и (рис.11).

Табл. 3

При наблюдении за пациентами в течение года, только у одного больного через 9 месяцев после проведения трансплантации Т_рег выявлено обострение заболевания. Состояние остальных больных оставалось стабильным как клинически, так и по данным МРТ (табл.5). Анализируя количество обострений PC за год, предшествующий лечению (табл.1), мы видим, что у больных имело место как минимум 2 атаки заболевания и в среднем в группе больных составило 2,4, тогда как через 1 год после терапии Т_рег, это значение опустилось до 0,2 (рис.13).

Помимо сокращения количества обострений наблюдалось также уменьшение выраженности показателя инвалидизации. Если до введения регуляторных Т-клеток CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ средний балл по шкале EDSS составлял 2,9±0,25, то через 12 месяцев после проведенной трансплантации аутологичных Т_рег он снизился до 1,9±0,25 (рис.12).

За все время наблюдения у больных PC, участвующих в пилотном исследовании, не было зарегистрировано никаких нежелательных явлений.

Полученные результаты демонстрируют достижение задачи изобретения - повышение эффективности терапии ремиттирующего рассеянного склероза и снижение побочных эффектов.

Применение вакцины Т-регуляторных клеток в ремиссии

Клинический пример №1. Введение Вакцины Т_рег больной PC в стадии ремиссии Больная Ш., 23 лет.

Жалобы: на легкую слабость в ногах, пошатывание при ходьбе.

Анамнез: В 2006 году впервые появились ограничение движения левого глазного яблока кнаружи, двоение при взгляде влево, неустойчивость при ходьбе. Диагностирован парез отводящего нерва слева. МРТ головного мозга от 17.10.2006 г. в левой затылочной области паравентрикулярно по внутреннему контуру заднего рога левого желудочка определяется очаг размером до 7 мм гиперинтенсивный на Т2 ВИ и единичные мелкие очаги в белом веществе лобных областей. Заключение: Демиелинизирующий процесс головного мозга. На фоне сосудисто-метаболической терапии движение глазного яблока восстановилось, регрессировало двоение и неустойчивость при ходьбе. Однако периодически беспокоили головные боли, головокружение. С начала августа 2013 года появились жалобы на появление онемения и слабости в ногах и левой руке, боли за левым глазным яблоком при движении. МРТ головного мозга от 28.08.13: выявлена отрицательная динамика в виде увеличения количества очагов в обоих полушариях большого мозга, а также появления очага в правых отделах варолиева моста. После введения контрастного препарата отмечается накопление его одним очагом в субкортикальных отделах лобной доли правого полушария большого мозга и двумя очагами (в виде кольца) в шейном отделе спинного мозга. Пациентка госпитализирована в НЦН РАМН, где поставлен диагноз: рассеянный склероз, ремиттирующее течение, обострение.

Неврологический статус: Сознание ясное. Менингеальных знаков нет. Глазные щели, зрачки равные, движения глазных яблок в полном объеме. Чувствительность на лице сохранена. Мимические пробы выполняет удовлетворительно. Горизонтальный нистагм при взгляде влево. Слух (при ориентировочном исследовании) сохранен. Глотание и фонация не нарушены. Язык по средней линии. Умеренный нижний спастический парапарез. Мышечный тонус не изменен. Сухожильные и периостальные рефлексы живые, акцент справа. Расстройств чувствительности не выявлено. ПКП выполняет с дискоординацией. В пробе Ромберга - пошатывается. Тазовых расстройств нет. (EDSS -3.0 балла.) Проводилась пульс-терапия метилпреднизолоном в суммарной дозе 7 г., состояние улучшилось. В течение 1 месяца симптоматика частично регрессировала (EDSS-1.5 балла), таким образом, обострение рассеянного склероза купировалось.

Пациентке было предложено принять участие в клиническом научном исследовании «Оценка безопасности и клинико-иммунологической эффективности применения аутологичной клеточной вакцины регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ для иммунотерапии ремиттирующего рассеянного склероза». Пациентка соответствовала всем критериям включения/исключения согласно протоколу и дала согласие на участие в исследовании, подписав информационный листок пациента. 10 октября 2012 года проведено определение содержания Т_рег в периферической крови больной PC, которое составило 0,9% (Норма от 2-5%). Учитывая низкое содержание Т_рег, принято решение о возможности начала лечения Вакциной регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ (Вакцина Т_рег) для коррекции выявленных нарушений. 11 октября 2012 года взята кровь больной для культивирования Т_рег.

18 октября 2012 года в результате культивирования получено 386×10⁶ клеток. Проведено введение Вакцины Т_рег. Никаких местных и системных реакций в момент введение Вакцины Т_рег зарегистрировано не было.

01 ноября 2012 года проведен повторный забор крови у пациентки для определения содержания Т_рег, которое составило 2,1%. Далее в течение года каждые 2 месяца проводилось повторное определения количества Т_рег в крови больной PC. Данные представлены на графике 1.

График 1. Содержание Т_рег у Больной Ш., 23 лет.

Таким образом, после введения Вакцины Т_рег содержание собственных Т_рег в периферической крови больной PC увеличилось более чем в 2 раза и сохранялось на таком уровне в течение последующих 12 месяцев.

В течение 12 месяцев наблюдения нежелательных явлений и обострений PC не зарегистрировано.

Клинический пример №2. Применение вакцины Т_рег у больной PC в стадии ремиссии после прекращения лечения препаратами, изменяющими течение PC (ПИТРС), вследствие их неэффективности.

Пациентка Ж., 30 лет.

Жалобы: на слабость в ногах, императивные позывы на мочеиспускание.

Анамнез: В феврале 2006 года появилось онемение правой ноги. В мае 2006 года на ранних сроках беременности стали беспокоить императивные позывы на мочеиспускание с эпизодами неудержания мочи. На сроке беременности 37 недель - отслойка плаценты, операция кесарева сечения под эпидуральной анестезией, после чего появились слабость в ногах, пошатывание при ходьбе, эпизоды системных головокружений, ухудшились тазовые расстройства. Через 1-2 месяца регрессировали головокружения и улучшились функции тазовых органов. Летом 2007 года вновь появились императивные позывы на мочеиспускание. Весной 2008 года лечилась и обследовалась в МОНИКИ. Проведено МРТ головного мозга, при которой выявлен многоочаговый демиелинизирующий процесс. Поставлен диагноз: рассеянный склероз, обострение. Проведена пульс-терапия метилпреднизолоном, без существенного эффекта. Следующие обострения в 2009, 2010, 2011 гг., в результате которых отмечалось ухудшение состояния в виде нарастания слабости в ногах. Назначена иммуномодулирующая терапия (ПИТРС) Интерфероном-бета1б, на фоне которой наблюдался выраженный гриппоподобный синдром. В связи с плохой переносимостью препарат был заменен на Глатирамера ацетат. Несмотря на проводимое лечение, обострения заболевания сохранялись с регулярностью 2 раза в год. На МРТ головного мозга (17 августа 2011 года) отрицательная динамика в виде появления новых очагов демиелинизации. В феврале 2012 г. пациентка пришла на амбулаторный прием в ФГБУ «НЦН» РАМН. Неврологический статус: сознание ясное, менингеальной симптоматики нет. Глазные щели, зрачки D=S. Объем движения глазных яблок полный. Горизонтальный мелкоразмашистый нистагм при взгляде в стороны. Чувствительность на лице не изменена. Сглажена правая носогубная складка. Глотание и фонация сохранены. Язык при высовывании по средней линии. Умеренный нижний спастический парапарез. Сухожильные рефлексы с ног повышены, симметричные, с расширением рефлексогенных зон. Умеренное повышение мышечного тонуса в ногах. Клонусы стоп. Рефлексы Бабинского с двух сторон. Суставно-мышечное чувство расстроено в пальцах стоп. Координаторные пробы: ПКП - интенция и дискоординация с 2-х сторон. В пробе Ромберга неустойчива. Походка паретико-атактическая. Учащенное мочеиспускание, императивные позывы на мочеиспускание. EDSS=4 балла. Диагноз: рассеянный склероз, ремиттирующее течение, ремиссия. Учитывая неэффективность терапии ПИТРС, пациентке предложено принять участие в исследовании.

Пациентка дала свое согласие, подписав информационный листок пациента, после чего проведен забор крови для определения содержания Т_рег в крови больной PC. Исходное содержание Т_рег составило 1,2% (Норма 2-5%).

15 марта 2012 года у больной проведен забор крови для культивирования Т_рег и создания вакцины. В результате культивирования было получено 366 млн выраженных ex vivo Т_рег. После введения вакцины аутологичных Т_рег через 2 недели число Т_рег в крови пациентки увеличилось с 1,2% до 2,8%. Никаких местных и системных реакций в момент введение Вакцины Т_рег зарегистрировано не было.

При дальнейшем иммунофенотипическом мониторинге, который осуществлял каждые 2 месяца в течение 1 года (график 2) существенного колебания числа Т_рег в периферической крови больной выявлено не было. Неврологический осмотр больной PC продемонстрировал стабилизацию показателя EDSS на уровне 4 баллов.

График 2. Содержание Т_рег у Больной Ж., 30 лет.

В течение 12 месяцев наблюдения нежелательных явлений и обострений PC не зарегистрировано.

Клинический пример №3. Двукратное введение Вакцины Т_рег больному PC в стадии ремиссии.

Пациент Г., 19 лет.

Жалобы: онемение кончиков пальцев на руках и легкое пошатывание при ходьбе. Анамнез: С начала 2011 года впервые появилась легкая слабость в ногах, которая имела тенденцию к нарастанию. Через 6 месяцев появилась неустойчивость при ходьбе. С апреля 2012 года ухудшение состояния в виде нарастания слабости в ногах, пошатывания при ходьбе, появления онемения стоп, которое позже распространилось на переднюю поверхность голеней. МРТ головного мозга от 31.08.2012 г.: в белом веществе правой лобной, теменных и левой височной долях, левой ножке мозга выявлены супра- и инфратенториальные гиперинтенсивные по Т2 и flair очаги округлой и вытянутой формы размерами от 0,3 до 1,8 см. Очаги имеют четкие контуры, единичный - в левой ножке мозжечка с наличием перифокальной инфильтрации. В шейном и грудном отделах спинного мозга, интрамедулярно определяются множественные очаги гиперинтенсивные по Т2 ВИ и в режиме жироподавления с наличием перифокальной реакции, склонные к слиянию. Заключение: MP-картина может соответствовать демиелинизирующему процессу. Консультирован в ФГБУ «НЦР» РАМН, диагноз: рассеянный склероз, ремиттирующее течение, обострение. С 06.09.2012 по 24.09.2012 года находился в 6-м неврологическом отделении ФГБУ «НЦН» РАМН. Неврологический статус: Сознание ясное. Менингеальных знаков нет. Глазные щели, зрачки равные, движения глазных яблок в полном объеме. Чувствительность на лице сохранена. Мимические пробы выполняет удовлетворительно. Горизонтальный нистагм при взгляде в стороны. Слух (при ориентировочном исследовании) сохранен. Глотание и фонация не нарушены. Язык по средней линии. Нижний спастический парапарез. Снижение мышечной силы в правой ноге до 3,5 баллов, в левой до 4 баллов. Мышечный тонус не изменен. Сухожильные и периостальные рефлексы с рук: с двуглавой и треглавой мышцы - снижены с 2-х сторон, стилорадиальные рефлексы живые, симметричные; с ног: высокие, симметричные. Патологических стопных знаков не выявлено. Гипалгезия с уровня коленных суставов до внутренней поверхности стоп. ПНП - легкая интенция, больше слева, ПКП - дисметрия, больше справа. В пробе Ромберга - пошатывание. Тазовых расстройств нет. EDSS=3 баллам. Проведена пульс-терапия метилпреднизолоном в суммарной дозе 5 г. На фоне лечения была отмечена положительная динамика в виде регресса нижнего парапареза, чувствительных расстройств, уменьшения атаксии при ходьбе.

01 октября 2012 года пациент явился на амбулаторный прием. Диагноз: рассеянный склероз, ремиттирующее течение, ремиссия. Балл по шкале EDSS=2 балла. 01 октября 2012 года после подписания информационного листка пациента об участии в научном клиническом исследовании «Оценка безопасности и клинико-иммунологической эффективности применения аутологичной клеточной вакцины регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ для иммунотерапии ремиттирующего рассеянного склероза», у пациента был взят образец крови для культивирования аутологичных Т_рег. Исходное содержание Т_рег в крови больного PC составляло 0,9% от общего числа лимфоцитов.

07 октября 2012 года у больного проведен забор крови для культивирования Т_рег и создания вакцины. В результате культивирования было получено 350 млн выраженных ex vivo Т_рег. После введения вакцины Т_рег через 2 недели число Т_рег в крови пациента выросло с 0,9% до 1,8%. Не смотря на то, что содержание Т_рег в крови пациента увеличилось в 2 раза, но не достигло показателя нормы (2-5%). Таким образом, следующим этапом был повторный забор образца крови для культивирования Т_рег. Спустя необходимый временной промежуток удалось вырастить ex vivo 250 млн Т_рег, и после их введения и оценки содержания Т_рег через 1 месяц от начала терапии их количество составило 3,5%. Никаких местных и системных реакций в момент как первого, так и повторного введения Вакцины Т_рег зарегистрировано не было. При дальнейшем иммунофенотипическом мониторинге, который осуществлял каждые 2 месяца в течение 1 года (график 3), наблюдалась стабилизация числа Т_рег в периферической крови больного. Неврологический осмотр больного PC продемонстрировал стабилизацию показателя EDS на уровне 2.

График 3. Содержание Т_рег у Больного Г., 19 лет

В течение 12 месяцев наблюдения нежелательных явлений и обострений PC не зарегистрировано.

Таким образом, продемонстрирована иммунологическая и клиническая эффективность применения Вакцины Т_рег для поддержания иммунологической толерантности за счет увеличения в 2 и более раза и поддержания на уровне нормы регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в периферической крови больных рассеянным склерозом в стадии ремиссии. Предложенная нами коррекция иммунологических нарушений у больных PC позволит пролонгировать состояние ремиссии заболевания до 12 месяцев, предупреждая возможные обострения рассеянного склероза. При этом лечение Вакциной Т_рег не приводит к каким-либо местным или системным нежелательным реакциям у пациентов.

Источники информации

1. Davidson A., Diamond В. Autoimmune disease. New Engl. Med., 2001, 345, 340-350

2. Hall B.M., Pearce N.W., Gurley K.E., Dorsch S.E. Specific unresponsiveness in rats with prolonged cardiac allograft survival after treatment with cyclosporine. III. Further characterization of the CD4+ suppressor cell and its mechanisms of action. J. Exp. Med., 1990, 171, 141-157.

3. Sakaguchi S., Sakaguchi N., Asano M. et al. Immunologic self-tolerans maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alfa-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J. Immunol., 1995, 155(3), 1151-1164.

4. Lyssik E.Y., Torgashina A.V., Soloviev S.K. et al. Reduced number and function of CD4+CD25highFoxp3 regulatory T cells in patient with systemic lupus erythematosus. Adv Exper Med Biol 2007;601:113-9.

5. И.А. Корсунский, А.Г. Румянцев, C.H. Быковская. Роль регуляторных Т-клеток CD4+CD25+ и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в подавлении реакции трансплантат против хозяина. Онкогематология 2008; 3, 45-51.

6. Насонов Е.Л., Быковская С.Ю., Т-регуляторные клетки при аутоиммунных ревматических заболеваниях. Вестн РАМН 2006;(9-10):74-82.

7. Быковская С.Н., Насонов Е.Л. Роль дефектов иммуносупрессии в развитии аутоиммунных заболеваний. Научно-практическая ревматология 2005, 4, 81-84.

8. Dejaco С., Duftner С., Grubeck-Loebenstein В., Schirmer М. Imbalance of regulatory Т cells in human autoimmune diseases. Immunology 2006; 117(3). 289-300.

9. Viglietta V, Baercher-Allan C, Weiner HL, Haefer DA. Human CD4+CD25+ regulatory T cells J. Exp Med. 2004 Apr 5; 199 (7); 971-2.

10. Venken K, Hellings N, Thewissen M, Somers V, Hensen K, Rummens JL, Medaer R, Hupperts R, Stinissen P. Compromised CD4+CD25(high) regulatory T-cell function in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis is correlated with a reduced frequency of FOXP3-positive cells and reduced FOXP3 expression at the single-cell level. Immunology. 2008 Jan;123(l): 79-89.

11. Frisullo G, Nociti V, Iorio R et al. Regulatory T cells fail to suppress CD4T+-bet+ T cells in relapsing multiple sclerosis patient. Immunology 2009; 127(3): 418-28.

12. Haas J, Fritzsching В et al. Prevalence of Newly Generated Naive Regulatory T cells (Treg) Is Critical for T reg suppressive Function and Determines T reg Dysfunction in Multiple sclerosis. J. Immunol. 2007; 179; 1322-1330.

13. Noseworthy JH, Lucchinetti C, Rodriguez M, Weinshenker BG. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 2000 Sep 28; 343(13):938-52.

14. Завалишин И.А., Захарова M.H. Рассеянный склероз: современные аспекты этиологии и патогенеза // Журн. Неврол. и психиатр. им. С.С. Корсакова. - 2003. №103:2. - С.10.

15. Goodin D. S. et al.; Disease Modifying Therapies in Multiple Sclerosis Report of The Therapeutics and Technology Assessment Subcommittee of the American Academy of Neurology and The MS Council for Clinical Practice Guidelines Neurology 2002 Jan 22;58(2): 169-78.

16. Menge T. et al., Disease-modifying agents for multiple sclerosis: recent advances and future prospects. Drugs. 2008; 68(17): 2445-2468.

17. Tischner, D., and Reichardt, H.M. (2007). Glucocorticoids in the control of neuroinflammation.

Molecular and Cellular Endocrinology 275, 62-70.

18. Weinstock-Guttman B, Gallagher E, Baier M, Green L, Feichter J, Patrick K, Miller C, Wrest K, Ramanathan M Risk of bone loss in men with multiple sclerosis. Mult Scler. 2004 Apr; 10(2): 170-5.

19. Kieseier ВС, Jeffery DR. Chemotherapeutics in the treatment of multiple sclerosis. Ther Adv Neurol Disord. 2010 Sep; 3(5):277-91.

20. Hartung H.-P. High-dose, high-frequency recombinant interferon beta-la in the treatment of multiple sclerosis. Expert Opin. Pharmacother., 2009, 10 (2), 291-309.

21. Chofflon M. Mechansims of action for treatments in multiple sclerosis. Does a heterogeneouse disease demand a multi-targeted therapeutic approach? Biodrugs, 2005, 19 (5), 299-308.

22. Antonetti H., Finocchiaro O., Mascia M. et al. A comparison of the biologic activity of two recombinant IFN-beta preparations used in the treatment of relapsing-remitting multiple sclerosis. J. Interferon Cytokine Res., 2002, 22, 1181-1184.

23. Liu Z., Pelfrey C., Codeur A. et al. Immunomodulatory effects of interferon beta-la in multiple sclerosis. J. Neuroimmunol., 2001, 112, 153-162.

24. Schreiner В., Mitsdoerffer M., Kieseier B. et al. Interferon-beta enhances monocyte and dendritic cell expression of B7-H1 (PD-Ll), a strong inhibitor of autologous T-cell activation: reievance for the immune modulatory effect in multiple sclerosis. J. Neuroimmunol., 2004, 155,172-182.

25. Huynh H., Oger J., Dorovini-Zis K. Interferon-beta down regulates interferon-gamma-induced class II MHC molecule expression and morphological changes in primary cukures of human brain microvcssel endothelial cells. J. Neuroimmunol., 1995, 60, 63-73.

26. Leppert D., Waubant E., Burk M. et al. Interferon beta-lb inhibits gelatinase sectetion and in vitro migration of human T cells; a possible mechanism lor treatment efficacy in multiple sclerosis. Ann. Neurol., 1996, 40, 846-852.

27. Завалишин И.А. Переседова A.B. Современные аспекты терапии рассеянного склероза // Журн. Нервные болезни - 2006. №4. - С.2-5.

28. Neuhaus О., Farina С., Wekerle Н. et al. Mechanism of action of glatiramer acetate in multiple sclerosis. Neurology, 2001, 56, 702-708.

29. Mikol DD, Barkhof F, Chang P et al. The REGARD trial: a randomised assessor-blinded trial comparing interferon beta-la and glatiramer acetate in relapsing-remitting multiple sclerosis. Program and abstracts of the ECTRIMS 2007 23rd Congress of the European Committee for Treatment and Research in Multiple Sclerosis; October 11-14, 2007; Prague, Czech Republic. Poster 119.

30. McCormack PL, Scott LJ. Interferon-beta-1b: a review of its use in relapsing-remitting and secondary progressive multiple sclerosisCNS Drugs. 2004; 18(8):521-46.

31. Von Andrian U., Engelhardt B. Alpha4 integrins as therapeutic targets in autoimmune disease. N. Engl. J. Med., 2003, 348 (1), 68-72.

32. ″Questions and answers on Tysabri and liver injury″ European Medicines Agency. http:// www.emea.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Medicine_QA/2010/01 / WC 500070009.pdf

33. Weissert R. Progressive multifocal leukoencephalopathy. J Neuroimmunol. 2010 Oct 9 Saresella M, Marventano I, Longhi R, Lissoni F, Trabattoni D, Mendozzi L, Caputo D, Clerici M.FASEB J. 2008 Oct; 22(10):3500-8. Epub 2008 Jun 27.

35. Venken K, Helling N, Broekmans T et al. Natural CD4+CD25+CD127low Regulatory T cells (Treg) Development and Function are disturbed in multiple sclerosis patients: Recovery of Memory Treg Homeostasis during Disease Progression. J. Immunol. 2008; 180; 6411-6420. Borsellino G et al. (2007) Expression of ectonucleotidase CD39 by Foxp3+TREG cells: hydrolysis of extracellular ATP and immune suppression. Blood 110: 1225-1232 Huan J et al. (2005) Decreased FOXP3 levels in multiple sclerosis patients. J Neurosci Res 81: 45-52.

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для лечения ремиттирующего рассеянного склероза. Для этого больному в стадии ремиссии ремиттирующего рассеянного склероза вводят выращенные ex vivo аутологичные регуляторные Т-клетки CD4CD25Foxp3из расчета 4,5-5,5 млн клеток на 1 кг веса пациента. Использование данного способа приводит к повышению уровня CD4CD25Foxp3регуляторных Т-клеток в 2 и более раза и поддержанию на уровне нормы, что позволяет пролонгировать состояние ремиссии заболевания до 12 месяцев. 13 ил., 3 пр., 5 табл.

Формула