Способ фотодинамического воздействия на вирусы или клетки - RU2291700C2

Описание

Область техники

Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано для терапии вирусных и онкологических заболеваний путем фотодинамического воздействия на вирусы и раковые клетки.

Предшествующий уровень техники

Известные способы фотодинамического воздействия на вирусы и раковые клетки основаны на применении фотосенсибилизатора, который тем или иным образом вводят в достаточно близкий контакт с указанными вирусами или клетками в присутствии молекулярного кислорода и облучают при этом световым излучением. Фотосенсибилизатор при световом облучении возбуждается и генерирует синглетный кислород путем передачи энергии молекулярному кислороду, находящемуся в тканях или физиологических жидкостях, подвергаемых фотодинамическому воздействию. Генерируемый синглетный кислород обладает высоким поражающим действием в отношении вирусов и раковых клеток.

Для эффективного фотодинамического воздействия на раковые клетки и вирусы фотосенсибилизатор должен обладать такими свойствами как:

- способность эффективно генерировать синглетный кислород под действием светового облучения,

- совместимость с тканями и биологическими жидкостями,

- устойчивость к разрушению под действием светового облучения при длительном и многократном воздействии,

- способность к адресной доставке к патологическим тканям,

- дешевизна и доступность получения.

В настоящее время в качестве фотосенсибилизаторов широко используются всевозможные красители как природного, так и синтетического происхождения. Так, для лечения онкологических заболеваний используются синтезированные производные гематопорфирина (HpD), такие как Protofrin (Lipson et al. J.Natl. Cancer Inst., 26, (1961) р.1-11), а для очистки плазмы крови от вирусов применяют синтетический краситель метиленовый голубой (Н.Mohr. // Methods of Enzymology, 319, (2000), р.207-216). К фотосенсибилизаторам второго поколения относятся имеющие более высокую степень очистки производные порфиринов, фталоцианиды, хлорины (М.Kreimer-Birmbaum // Semin. Hematol. 26, (1989), р.157-173), и другие новые фотосенсибилизаторы (D. Braichotte, et al. // Photodynamic therapy and biomedical lasers, pp.461-465, ed. Elsevier, Amsterdam, 1992).

Существенным недостатком известных фотосенсибилизаторов на красителях как первого, так и второго поколения является сложность очистки организма или плазмы крови от использованного красителя, любой из которых относительно токсичен, а также от продуктов его разрушения, также, как правило, являющихся токсичными.

Например, эксперименты на пациентах показали, что краситель второго поколения Foskan на 75% разрушается прямо в опухоли в конце фотодинамической обработки при 10 Дж/см² (Photochem. Photobiol. 46 (1987), pp.925-938). Это относится и к метиленовому голубому, который используется для очистки плазмы крови от вирусов в промышленных масштабах. В результате возникает сложная проблема последующей очистки плазмы крови от использованного красителя и особенно от продуктов его разрушения.

Кроме того, фотосенсибилизаторы на красителях обладают недостаточно высоким индексом селективности (в терминах ткань-мишень / здоровая ткань) и низким коэффициентом экстинции, что требует введения относительно большого количества препарата для получения удовлетворительного фотодинамического терапевтического эффекта. Например, высокая аккумуляция красителей на коже при их внутривенном введении делает кожу чувствительной к свету еще 6-8 недель после фотодинамической обработки. В течение этого времени пациенты вынуждены оставаться в темном помещении до окончательного выведения красителя из организма.

Для решения вышеуказанных проблем, связанных с недостаточно высокой эффективностью и токсичностью фотосенсибилизаторов на красителях и трудностью их последующего удаления, было предложено использовать в качестве фотосенсибилизатора фуллерены, которые характеризуются высокой эффективностью генерирования синглетного кислорода при облучении светом и в то же время не токсичны и не распадаются на токсичные составляющие.

Так, в качестве фотосенсибилизаторов предлагалось использование химически модифицированных водорастворимых форм фуллерена (US 5994410, 30.10.1999). Например, был предложен способ получения фотосенсибилизатора для фотодинамического лечения путем химического модифицирования фуллерена с помощью водорастворимого полимера (JP 9235235, 19.09.1997). Полученный этим способом химически модифицированный фуллерен предназначен для фотодинамического воздействия на раковые ткани. Препарат вводится внутривенно и преимущественно накапливается в опухолевых тканях, поражая их при световом облучении. Однако известно, что химическое модифицирование фуллерена приводит к нарушению его π-электронной системы и, вследствие этого, к уменьшению эффективности генерирования им синглетного кислорода. К тому же известно, что полученный таким способом водорастворимый полимер сохраняет свои свойства растворимости в воде при содержании фуллерена не более 1% по весу к полимеру, что ограничивает дозировку фотосенсибилизатора в препарате. В результате использование водорастворимых форм фуллеренов не получило широкого распространения, как из-за сложности получения модифицированного водорастворимого фуллерена, так и по причине снижения фотосенсибилизирующих свойств фуллерена вследствие его модификации.

В патенте US 5566316, 02.02.1999, было предложено использовать в качестве фотосенсибилизатора немодифицированный фуллерен С₆₀, состоящий только из атомов углерода. Поскольку такие фуллерены практически не растворимы в воде, было предложено использовать их в виде водной суспензии, что облегчает последующее удаление фуллеренов, например, из подвергаемой фотодинамическому воздействию плазмы крови.

Однако суспензии фуллеренов в воде или физиологической жидкости весьма неустойчивы, так как фуллерены в таких суспензиях имеют тенденцию к быстрому осаждению и обычно требуют постоянного перемешивания во время осуществления фотодинамического воздействия. В такой суспензии трудно получить достаточно высокую концентрацию фуллерена, поскольку при повышении концентрации устойчивость суспензии резко ухудшается.

Кроме того, устойчивость фуллеренов к лучевому и термическому воздействию, а также их механическая устойчивость в ряде случаев также оказывается недостаточной. В частности, при интенсивном облучении светом фуллерены могут распадаться под воздействием генерируемого ими синглетного кислорода, что понижает эффективность фотодинамического воздействия. Недостаточная устойчивость фуллеренов обычно не позволяет многократно использовать их для фотодинамической обработки. При этом фуллерены имеют довольно высокую стоимость вследствие сложности процесса их получения.

Сущность изобретения

Задачей изобретения является создание способа фотодинамического воздействия на вирусы или клетки с помощью нетоксичного фотосенсибилизатора, состоящего только из атомов углерода, который обладает большей, по сравнению с фуллеренами, устойчивостью к лучевому и термическому воздействию, большей устойчивостью к осаждению при его использовании в виде суспензии и меньшей стоимостью.

Задача изобретения решается путем использования в качестве фотосенсибилизатора материала, состоящего только из атомов углерода и представляющего собой полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры, используемые в виде суспензии, например, в воде или физиологической жидкости. Такие наноструктуры полиэдральной формы имеют, в отличие от фуллеренов, многослойное строение и значительно больший размер частиц (который может составлять десятки или сотни нанометров, в то время как, например, размер частиц фуллерена С₆₀ равен 0,7 нм).

Из заявки на патент RU 2000124887, дата публикации 20.10.2002, известна одна из разновидностей таких полиэдральных многослойных углеродных наноструктур, которые обычно образуются как побочный продукт при получении фуллеренов. В RU 2000124887 эти структуры, названные авторами "астраленом", были впервые идентифицированы, и был предложен способ их выделения. Согласно этому способу, астрален получают путем термического распыления графитового анода в плазме дугового разряда, горящей в атмосфере инертного газа, осаждения продуктов распыления на катоде и переработки катодного осадка окислением, при котором корку катодного осадка измельчают и подвергают последовательным операциям окисления в газовой фазе и окисления в жидкой фазе в расплаве вещества, выбранного из группы, включающей гидроксиды, галогениды, нитраты щелочных металлов или их смеси, с последующим выделением целевого продукта. Полученные в результате этого процесса структуры обладают высокой химической стабильностью при существенной пористости, а также высокой термобароустойчивостью. Астрален имеет меньшую стоимость по сравнению с фуллеренами, при этом для его получения используют ту часть катодного осадка, которая ранее шла в отходы при производстве фуллеренов.

Частицы астралена характеризуются межслоевым расстоянием 0,34-0,36 нм, средним размером частиц 60-200 нм, насыпной плотностью 0,6-0,8 г/см³, пикнометрической плотностью 2,2±0,1 г/см³, показателем термобароустойчивости к графитизации при 3000°С не менее 50 Кбар, рентгенографическим показателем графитизации 0,01-0,02 и удельным электрическим сопротивлением при давлении 120 МПа не более 2,5×10⁴Ом·м. Предпочтительный средний размер частиц для их использования согласно настоящему изобретению составляет 100-120 нм.

Согласно RU 2000124887, астрален благодаря своей высокой дисперсности и термобароустойчивости может быть использован как противоизносная добавка к антифрикционным материалам, в частности эпоксидоуглепластикам, а также в качестве добавки в пластики для повышения электропроводности и снятия статического электричества. Какое-либо упоминание о возможности медицинского использования астралена в качестве фотосенсибилизатора в данной заявке отсутствует.

Однако авторы настоящего изобретения установили, что полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры, такие как астрален, обладают достаточно высокой эффективностью генерирования синглетного кислорода, сравнимой с эффективностью генерирования синглетного кислорода фуллеренами, что дает возможность использовать их для фотодинамического воздействия на биологические структуры, такие как вирусы, клетки и т.п. В то же время, благодаря своей морфологии, такие частицы обладают гораздо большей устойчивостью к внешним воздействиям по сравнению с фуллеренами. Благодаря повышенной устойчивости, полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры допускают многократное их использование при более высокой интенсивности светового облучения, чем допустимо для фуллеренов.

Поскольку полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры, подобно фуллеренам, нерастворимы в воде, они могут быть введены, например, в плазму крови или в цельную кровь в виде суспензии в воде или физиологическом растворе, легко удалены после осуществления фотодинамического воздействия и, благодаря высокой устойчивости, использованы повторно. При этом водные суспензии полиэдральных многослойных углеродных наноструктур являются весьма однородными и значительно более устойчивыми в отношении оседания частиц по сравнению с водными суспензиями фуллеренов, особенно при добавлении в такую суспензию поверхностно-активных веществ. Концентрация частиц в суспензии может находиться, например, в пределах 0,5-0,002% вес. и такая суспензия может вводиться в биообъект внутримышечно или внутривенно. Для повышения эффективности воздействия в суспензию может быть дополнительно введен молекулярный кислород или газовая смесь, содержащая молекулярный кислород.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения

При осуществлении предложенного способа фотодинамическое воздействие на вирусы или клетки осуществляется с использованием синглетного кислорода, генерируемого из молекулярного кислорода с помощью фотосенсибилизатора, вводимого в контакт с молекулярным кислородом и указанными вирусами или клетками и облучаемого оптическим излучением, причем в качестве фотосенсибилизатора используют астрален, представляющий собой нерастворимые в воде полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры, в виде суспензии в воде или физиологической жидкости.

В RU 2000124887 впервые описано выделение астралена как целевого продукта путем переработки части катодного осадка, а именно его наружной корки, преимущественно содержащей наночастицы астралена.

Согласно RU 2000124887 астрален получают термическим распылением графитового анода в плазме дугового разряда, горящей в атмосфере инертного газа, например аргона или гелия. Продукты распыления осаждаются на охлаждаемых стенках камеры и, в основном, на поверхности катода. Полученный катодный осадок (катодный депозит) представляет собой сложный агломерат, имеющий центральную рыхлую часть и более плотную кору, в которой, кроме спекшегося графита, содержатся разнообразные наноструктуры, ранее считавшиеся бесполезными примесями. Некоторое количество таких наноструктур есть и в центральной части катодного депозита.

Для получения астралена корку катодного осадка измельчают и подвергают последовательным операциям окисления в газовой фазе и окисления в жидкой фазе в расплаве гидроксидов, или галогенидов, или нитратов щелочных металлов, или их смесей с последующим выделением целевого продукта. Окисление измельченной корки в газовой фазе (на воздухе) осуществляют при температуре 500-700°С. Жидкофазное окисление проводят в расплаве неорганического соединения щелочного металла, такого как, например, натрий, калий или цезий. В качестве таких неорганических соединений могут быть использованы гидроксиды, галогениды (хлориды, бромиды), или нитраты щелочных металлов, или смеси указанных соединений. Окисление в жидкой фазе проводят при температуре 400-500°С, предпочтительно 430-500°С.

Перед операциями окисления обрабатываемая масса может быть смешана с окислителями, такими как нитраты или хлориды щелочных металлов или аммония. Окислитель добавляют в количестве 3-10% от массы обрабатываемого материала. Окислитель может быть смешан с обрабатываемым материалом в виде тонкодисперсного порошка или в виде насыщенного водного раствора. В последнем случае углеродный материал, смешанный с окислителем, должен быть высушен перед операцией жидкофазного окисления.

Например, согласно примеру изготовления астралена, описанному в RU 2000124887, катодный осадок может быть получен электродуговой эрозией анодного графитового стержня сечением 100 мм² с графитовым катодом того же сечения при плотности тока 200 А/см² и падении напряжения на дуге 24 В в гелиевой атмосфере (давление Не 70 Top). Осадок представляет собой трубчатую бахромчатую структуру длиной около 120 мм и диаметром около 35 мм неоднородной плотности с рыхлой сердцевиной и плотной оболочкой (коркой) с внутренним диаметром 9-10 мм и толщиной около 2 мм. Корку отделяют и измельчают до порошка со средней дисперсностью 200-800 нм. Порошок смешивают с 5% масс. диспергированного нитрата калия и помещают во вращающуюся трубчатую печь, в которой проводят газофазное окисление при температуре 550-600°С. После газофазного окисления порошок разделяют электрофлотацией, отбирая всплывающую фракцию с дисперсностью 100-300 нм. Отобранную фракцию высушивают, смешивают с 5% масс. сухого мелкодисперсного нитрата калия и помещают в расплав гидроксида калия, где подвергают жидкофазному окислению при температуре около 500°С. Расплав охлаждают, растворяют в воде, мелкодисперсный продукт отделяют электрофлотацией, отбирая всплывающую фракцию с дисперсностью 100-300 нм. Отобранную фракцию высушивают, смешивают с 5% масс. сухого мелкодисперсного нитрата калия и помещают в расплав гидроксида калия, где подвергают жидкофазному окислению при температуре около 500°С. Расплав охлаждают, растворяют в воде, мелкодисперсный продукт отделяют электрофлотацией, нейтрализуют кислотой, тщательно промывают на фильтре дистиллированной водой и переводят в дисперсию в органическом растворителе, например диметилформамиде. В других примерах изготовления астралена жидкофазное окисление проводят в расплаве смеси нитрата цезия и хлорида натрия в соотношении 1:3, или в расплаве хлорида лития, или в расплаве хлорида калия и гидроксида натрия в соотношении 1:4.

Для определения физико-химических параметров полученный продукт отделяют от растворителя и исследуют по следующим параметрам.

Определяют плотность полученного материала: насыпная плотность астралена равна 0,6-0,8 г/см³, пикнометрическая плотность равна 2,2±0,1 г/см³.

Рентгенографически определяют межслоевое расстояние в многослойных частицах, которое равно 0,34-0,36 нм.

Рентгенографически определяют количество аморфного графита, оставшегося в продукте (показатель графитизации), которое составляет 0,01-0,02.

Определяют сорбционные свойства продукта по отношению к четыреххлористому углероду; указанный показатель, равный 50 мг/г, свидетельствует о практическом отсутствии аморфного графита в продукте.

Под давлением из продукта формируют таблетку, на которой под давлением 120 МПа измеряют удельное сопротивление, которое не превышает 2,5×10^-4 Ом·м (в то время как удельное сопротивление графита составляет 0, 5×10^-2Ом·м).

Показатель термобароустойчивости определяют на установке для синтеза технических алмазов; при 3000°С материал выдерживает давление 50 Кбар (50000 атм) без изменения структурных характеристик.

Наконец, с помощью просвечивающего электронного микроскопа определяют форму полученных частиц и их размер. В RU 2000124887 приведены фотографии типичных частиц астралена. Характерные полиэдральные многослойные частицы астралена длиной около 150 мм имеют внутренний щелевидный капилляр. Другие полиэдральные частицы астралена имеют разветвленную форму без внутреннего капилляра.

Предпочтительный для осуществления настоящего изобретения размер (длина) частиц астралена находится в пределах 100-120 нм.

Авторы настоящего изобретения установили, что частицы астралена при воздействии света обладают явлением обратимой насыщенной адсорбции, условием проявления которого служит наличие возбужденных триплетных состояний π-сопряженной электронной оболочки на торцевых поверхностях частиц астралена. В частности, экспериментально установлено, что при облучении астралена наблюдается интенсивная фотолюминесценция синглетного кислорода, образующегося при оптическом возбуждении частиц астралена. Достаточно высокая эффективность генерирования синглетного кислорода (порядка 60% по сравнению с эффективностью фуллерена C₆₀) позволяет использовать астрален в качестве фотосенсибилизатора при осуществлении фотодинамического воздействия на вирусы и раковые клетки.

Фотодинамическое воздействие с использованием астралена может осуществляться аналогично известным способам такого воздействия, как in vivo, так и in vitro.

Поскольку астрален абсолютно не растворим в воде, он используется в виде суспензии в воде или физиологических жидкостях. Предпочтительный способ получения такой суспензии заключается в обработке частиц астралена в воде или физиологических жидкостях ультразвуком с добавлением или без добавления поверхностно-активных веществ. Суспензии астралена достаточно однородны и устойчивы в течение длительного времени в отношении оседания частиц. Концентрация частиц суспензии астралена может варьироваться в широких пределах, например от 0,5 вес.% до 0,002 вес.%, что позволяет контролировать дозировку лечебной композиции. Суспензию, в которую может дополнительно вводиться молекулярный кислород, добавляют к физиологической жидкости, такой как плазма крови или цельная кровь, для осуществления фотодинамического воздействия на содержащиеся в ней вирусы, такие как вирусы гепатита или вирусы иммунодефицита человека.

В качестве оптического излучения для активации астралена при осуществлении фотодинамического воздействия может быть использовано широкополосное ламповое излучение или лазерное излучение, например, с длиной волны порядка 0,5 мкм. Излучение может быть как непрерывным, так и импульсным.

Морфология наночастиц астралена обеспечивает их высокую термическую и лучевую прочность. Это позволяет многократно использовать полученную композицию для фотодинамической обработки.

Суспензия астралена может быть использована как для очистки плазмы крови и других биологических жидкостей от вирусов, так и для разрушения онкологических опухолей. Лечебная композиция может быть введена в биообъект внутримышечно или внутривенно.

Заявляемое изобретение далее поясняется примерами, но не ограничено ими.

Пример 1.

В качестве фотосенсибилизатора использовали полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры - астрален в виде суспензии. Для приготовления суспензии астрален предварительно высушивали в вакууме при 100°С в течение 6 часов в тонком слое. Затем 1 г астралена помещали в коническую колбу, в которую наливали 100 мл физиологического раствора. Колбу помещали в ультразвуковую ванну на 5 часов.

После процесса обработки ультразвуком содержимое колбы переливали в цилиндр и выдерживали в нем в течение 2 часов для осаждения крупных частиц. После отделения осадка получившуюся суспензию использовали для дальнейших экспериментов.

Эксперименты по фотодинамическому воздействию астраленов на вирусы проводили in vitro. В качестве вирусной культуры использовали вирус гриппа A/PR/8/34 (H1N1), культивированный в аллантоисной полости 10-12-дневных куриных эмбрионов. Затем аллантоисная жидкость, содержащая культуру вируса гриппа, помещалась в лунки 24 луночного планшета I для клеточных культур (Sarstedt, Германия). В лунки добавляли суспензию астралена, полученную, как описано выше, при различной концентрации. Готовили контрольный планшет II, лунки которого содержали аналогичные рабочему планшету составы. Контрольный планшет II помещали в темноту.

Планшет I освещали 500 W галогеновой лампой, сплошной спектр испускания которой близок к солнечному. Спектр действующего света (выбор светофильтров) и время облучения выбирались исходя из спектра поглощения фотосенсибилизатора и получения необходимой световой дозы. Температура планшета поддерживалась в пределах 20-24°С.

Разрушительное воздействие описанной процедуры на вирионы гриппа контролировалось с помощью электронной микроскопии (электронный микроскоп JEM - 100S фирмы JEOL, Япония). Изменение морфологии вирусных частиц проявлялось в появлении дефектов вирусной оболочки и разрушения поверхностных гликопротеидов. Это приводило к повышению в вирусной популяции дефектных вирионов, не способных к полноценной репликации. На электронно-микроскопических снимках оценивали соотношение вирусных частиц с интактной и нарушенной оболочкой.

В контрольном планшете II никакого изменения морфологии вирусных частиц не наблюдалось. В рабочем планшете I наблюдаемое изменение морфологии вирионов находилось в соответствии с мощностью и временем облучения (от 10 до 70% разрушенных вирионов).

Пример 2.

Воздействие осуществляли аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что в суспензию астралена в физиологическом растворе готовили при добавлении водорастворимого поверхностно-активного вещества.

Пример 3.

Воздействие осуществляли аналогично примерам 1 и 2, с той лишь разницей, что вместо астралена использовали полиэдральные многослойные углеродные нанотрубки.

Реферат

Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано для терапии вирусных и онкологических заболеваний. В способе фотодинамического воздействия на вирусы или клетки с использованием синглетного кислорода, генерируемого из молекулярного кислорода с помощью углеродного фотосенсибилизатора, вводимого в контакт с молекулярным кислородом и указанными вирусами или клетками и облучаемого оптическим излучением, в качестве фотосенсибилизатора используют суспензию полиэдральных многослойных углеродных наноструктур, характеризующихся межслойным расстоянием 0,34-0,36 нм, которые обладают высокой устойчивостью к лучевому и термическому воздействию, устойчивостью к осаждению и сравнительно низкой стоимостью. 9 з.п. ф-лы.

Формула