Комбинация в виде пищевой добавки или лекарства и способ лечения человека и животных с ее использованием (варианты) - RU2172630C2

Чертежи

Показать все 8 чертежа(ей)

Описание

Изобретение относится к новым и улучшенным композициям, предназначенным для лечения, и к способам лечения людей, а также животных с целью снижения повреждения ДНК, усиления репаративной способности ДНК и стимуляции иммунной функции клетки. В частности изобретение относится к введению людям (или другим животным) комбинации, состоящей из каротиноидного вещества, никотинамидного вещества и вещества, являющегося источником цинка (все понятия имеют значения, определенные ниже), например, в виде лекарства, предназначенного для лечения, или в виде суточной пищевой добавки, и к композициям, содержащим указанную комбинацию веществ.

Под понятием "каротиноидное вещество" в контексте настоящего описании понимают каротиноиды, например, вещество, выбранное из группы, включающей α -каротин, β -каротин, γ -каротин, ликопен и их смеси. Под понятием "никотинамидное вещество" в контексте настоящего описания понимают вещество, выбранное из группы, включающей никотинамид, ниацин, триптофан (аминокислота, которая является предшественником при синтезе ниацина) и их смеси. Под понятием "вещество, являющееся источником цинка", в контексте настоящего описания понимают соответствующий источник цинка, предназначенный для введения людям и/или другим животным, например, одну или более солей цинка, таких как сульфат цинка или другие цинковые соли, например, соли с аминокислотами, такими, как метионин или аспартат, дипептиды, глюконаты, галогениды, нитраты, оксиды или ацетаты.

Согласно изобретению предлагается новая комбинация встречающихся в природных условиях каротиноидного вещества, никотинамидного вещества и вещества, являющегося источником цинка, применяемая для комбинированного лечения пациентов, нуждающихся в таком лечении, направленного на противодействие повреждению ДНК клетки, такому как окислительное повреждение, на усиление репаративной способности ДНК клетки и на стимуляцию иммунной функции клетки. Изобретение относится далее к применению этой комбинации химических веществ в качестве пищевой добавки или лекарства, предназначенного для лечения, для предупреждения (или повышения сопротивляемости организма индивидуума) повреждения ДНК, для усиления репаративной способности ДНК и для стимуляции иммунной функции при заболеваниях, при которых эти процессы являются ключевыми для проявления болезненного состояния; например, при старении, раке, сердечнососудистых заболеваниях и аутоиммунных расстройствах, таких как диабет, ревматоидный артрит и неспецифический язвенный колит (Cross и др., Ann. Int. Med. 107: 526-545, 1987; Harris C.C., Cancer Res. 51 (Suppl.): 5023s-5044s, 1991; Olin K. L. и др., Proc. Soc. Expt. Biol. and Med., 203(4): 461-466, 1993).

Хорошо известно, что каротиноиды (Lupulescu A., Int. J. Vit. Nutri. Res. , 64(1): 3-14, 1993; Prabhala R.H. и др., Ann. N.Y. Acad. Sci., 691: 262-263, 1993; Chew B.P.J., Dairy Sci., 76(9): 2804-2811, 1993; Santamaria L. и др. , J. Nutri. Sci. Vit. Spec., No: 321-326, 1992; Machlin L.J., Crit. Rev. Food Sci. and Nutri., 35(1-2): 41-50, 1995; Murakoshi М. и др., Cancer Res., 52: 6583-6587, 1992; Okuzumi J. и др., Oncology, 49: 492-497, 1992), никотинамид/ниацин (Mandrup-Poulsen T. и др. Diabetes Metabolism Rev., 9(4): 295-309, 1993; Pero R.W. и др., Biochimie, 77: 385-393, 1995; Shockett P.J., Immunol. , 151(12): 6962-6976, 1993; Boulikas Т., AntiCancer Res., 12(3): 885-898, 1992; Brown R.R., Adv. Exp. Med. Biol., 294: 425-435, 1991; Henkin Y. и др. , Amer. J. Med., 91(3): 239-246, 1991; Jacobsen E.L., J. Am. Col. Nutri. , 12(4): 412-416, 1993) и цинк (Singh А. и др., J. Appl. Physiology, 76(6): 2298-2303, 1994; Walsh С.Т. и др., Environmental Health Perspectives, 102 (Suppl. 2): 5-46, 1994; Mocchegiani E. и др., Blood, 83(3): 749-757, 1994; Singh К. Р. и др., Immunopharmacol. Immunotoxicol., 14(4): 813-840, 1992; Mei W. и др., Biol. Trace Element Res., 28(1): 11-19, 1991; Chandra R. K. и др., Clin. Lab. Med., 13(2): 455-461, 1993) каждый по отдельности обладает способностью предупреждать заболевание и обладает иммунностимулирующими свойствами, однако ранее их никогда не объединяли друг с другом в качестве комбинированного лекарственного средства, которое могло бы предупреждать возникновение или замедлять развитие болезней у человека и стимулировать иммунную функцию (Compendium of Nonpresciption Products, Canadian Pharmaceutical Association, 1994; Canadian Drug Identification Code, June, 1995; The Extra Pharmacopeia, Martindale, 30-е издание; U.S. Pharmacopeia Dispensing Information, 15-е издание, 1995). Следовательно, анализ известных научных данных или доступных коммерческих продуктов позволяет с очевидностью утверждать, что, если объединить эти агенты, обладающие различными механизмами действия, контролирующими один и тот же тип заболеваний, в дозах, превышающих их нормальный уровень в пище, для каротиноидов, например для витамина A, 1467±1213 ккал, никотинамида 33,1±26,7 мг и цинка 6,8±8,4 мг (Payette Н., Am. J. Clin. Nutr. 52: 927-932, 1990), может быть получена композиция, обладающая ярко выраженными свойствами в отношении улучшения способности сопротивляться повреждению ДНК клетки, повышения репаративной способности ДНК клетки и стимуляции иммунной функции клетки у индивидуума.

Человек подвергался естественному отбору в течение сотен тысяч лет в отношении не одного химического соединения, а бесчисленного множества химических соединений, поступающих в организм человека из окружающей среды, в основном с пищей. Можно предположить, что физиология человека исключительно хорошо сбалансирована для поглощения и преобразования этих химических смесей с целью получения из них с максимально возможной эффективностью необходимых для жизни веществ, таких как получаемые из пищи источники энергии, и химических веществ, необходимых для поддержания клеточного гомеостаза и размножения. Это должно осуществляться без проявления каких-либо токсикологических последствий. Следовательно, существует большая вероятность того, что в том случае, когда люди имеют дело с природными лекарственными средствами в дозах, превышающих их нормальные уровни, характерные для пищевого рациона или окружающей среды, то существует выраженное взаимодействие между избыточными дозами природных лекарственных средств, в результате чего одна добавка ограничивает поглощение и метаболизм другой, что представляет собой естественную модель селекции, с помощью которой люди могут быть защищены от токсикологических последствий и передозировки. Например, из уровня техники известно, что каротиноиды и витамины E или C являются утилизаторами радикалов (электрофильных) и что эти природные продукты могут быть объединены в виде добавок для получения аддитивных биологических воздействий. Однако данные современной литературы не подтверждают эту практику, основанную на научном предположении, поскольку было установлено, что эти утилизаторы радикалов могут ингибировать поглощение друг друга и сводить на нет требуемую индукцию биологических воздействий (Inform. 6(7): 778-783, 1995; Zhang и др., J. Clin. Nutr. , 62: 1477S-1482S, 1995; Niki и др., Am. J. Clin. Nutr., 62: 1322S-1326S, 1995).

Известны поступающие в продажу коммерческие продукты, содержащие избыточные дозы (т.е. превышающие обычные уровни в пищевом рационе) каротиноидов, никотинамида и цинка в комбинации друг с другом, и, кроме того, они представляют собой композиции, включающие несколько других природных продуктов известного химического строения. Ниже приведены два примера.

Коммерческий продукт I
("Radical Fighters^® ", Twin Laboratories, Inc., Ronkonkoma, NY 11779, США)
β -каротин (экв. провитамин A) - 12500 МЕ
Витамин C - 750 мг
Аскорбилпальмитат - 125 мг
Витамин E (d - α -токоферол) - 250 МЕ
L-цистеин - 250 мг
L-глутатион (восстановленный) - 12,5 мг
Селен (селенит) - 100 мкг
Цинк (глюконат) - 10 мг
Витамин B₁ - 75 мг
Витамин B₂ - 50 мг
Никотинамид - 50 мг
Ниацин - 25 мг
Витамин B₅ - 250 мг
Витамин B₆ - 62,5 мг
Витамин B₁₂ - 150 мкг
Фолиевая кислота - 200 мкг
Биотин - 75 мкг
ПАБК (пара-аминобензойная кислота) - 150 мг
Инозит - 100 мг
Холин - 100 мг
Коммерческий продукт II
(Витамины для женщин, Bonne Forme, 4250 Hempstead Tpke, Suite 21, Bethpage, NY 11714, США)
Витамин A - 5000 МЕ
β - каротин - 3 мг
Витамин D₃ - 400 МЕ
Витамин E - 200 МЕ
Витамин K - 10 мкг
Витамин C - 500 мг
Витамин B₁ - 10 мг
Витамин B₂ - 10 мг
Витамин B₆ - 50 мг
Ниацин - 50 мг
Фолиевая кислота - 400 мкг
Витамин B₁₂ - 50 мкг
Биотин - 50 мкг
Пантотеновая кислота - 20 мг
Кальций - 1000 мг
Магний - 300 мг
Калий - 40 мг
Железо - 9 мг
Цинк - 15 мг
Медь - 1 мг
Марганец - 5 мг
Йод - 50 мкг
Хром - 80 мкг
Селен - 50 мкг
Молибден - 10 мкг
Однако для этих коммерческих продуктов не было установлено или не является очевидным, что определенная комбинация каротиноидов, никотинамида и цинка эффективна в отношении снижения индукции повреждения ДНК клетки или усиления репарации ДНК и иммунной функции. В противоположность этому, как описано ниже, согласно изобретению было установлено, что введение каротиноидов, никотинамида и цинка в комбинации с другими природными лекарственными средствами или питательными элементами, например, в виде указанного выше коммерческого продукта I, не снижает индукцию повреждения ДНК клетки или не усиливает репарацию ДНК и иммунную функцию, что предполагалось, но не было доказано в уровне техники. Этот факт также согласуется с уровнем техники (Inform 6(7): 778-783, 1995; Zhanf и др., Clin. Nutr., 62; 1477S-1482S, 1995; Nidi и др., Am. J. Clin. Nutr., 62: 1322S-1326S, 1995), подтверждающим, что природные продукты (например, лекарственные средства или питательные элементы), имеющие сходные механизмы биохимического действия, как установлено, обладают способностью блокировать поглощение и абсорбцию друг друга, что приводит к изменению биологических функций. Отсюда следует, хотя это не нашло практического воплощения в уровне техники, что a priori, т.е. без предварительной оценки отсутствия взаимного ингибирования природных продуктов, добавленных в комбинации, нельзя предположить, что добавка комбинации природных продуктов в количествах, превышающих их уровни в пищевом рационе, должна привести к аддитивным биологическим воздействиям каждого отдельно введенного продукта.

Точный механизм действия каротиноидов, таких как β- каротин, не полностью выяснен, но с научной точки зрения в целом признается, что одним из основных механизмов является утилизация кислорода, происходящего из свободных радикалов, образующихся либо в качестве побочных продуктов метаболизма, либо имеющих экзогенное происхождение (из окружающей среды) (Lieber D.C., Ann. N. Y. Acad. Sci. 691: 20-31, 1993; Bohm F. и др., J. Photochem. Photobiol. 21(2-3): 219-221, 1993; Regnault C. и др., Ann. Pharmacotherapy 27(11): 1349-1350, 1993). Можно ожидать, что, являясь утилизаторами свободных радикалов, каротиноиды могут снижать или защищать клетки от химического повреждения ДНК, РНК и протеинов клетки в результате токсических воздействий окружающей среды или от эндогенных метаболических отклонений в клетке, которые в конечном счете могут привести к болезненному состоянию. С другой стороны, никотинамид и соли цинка не обладают этим химическим свойством, которое приводит к улучшению биологической функции клетки.

Никотинамид и эквивалентная ему никотиновая кислота (ниацин, витамин B₃) или даже триптофан, являющийся предшественником синтеза ниацина, являются основными предшественниками для образования и поддержания клеточного пула НАД (никотинамид-аденин-динуклеотид) (Bernofsky, Mol. Cell. Biochem. 33: 135-143, 1980; Olsson A. и др., Biochem. Pharmacol. 45: 1191-1200, 1993). НАД важен для производства АТФ клетки и поддержания оксислительно-восстановительного потенциала клетки и он также является субстратом для фермента, репарирующего ДНК, поли-АДФ-рибозилтрансферазы (АДФРТ). Депривация ниацина существенно снижает пулы НАД как в клетках культур ткани (Jacobson Е. и др., в ADP-Ribosylation Reactions (Poirier G.G. и Moreau P., ред.), стр. 153-162, Springer Verlag, New York, N.Y. 1992), так и в живых системах, таких как животные (Zhang и др., J. Nutri. 123: 1349-1355, 1993) и человек (Fu и др., J. Nutri. 119: 1949-1955, 1989). Истощенные клетки обладают повышенной чувствительностью к повреждению ДНК, а уровни производства поли(АДФ-рибозы) в культивируемых клетках (Jacobson E.L., 1992, см. выше) или в печени крысы (Rawling и др., J. Nutri. 124: 1597-1603, 1994) оказались существенно пониженными при наличии небольшого дефицита никотинамида. С другой стороны, когда ниацин применяли в качестве добавки к обычному рациону (т.е. в дозах, превышающих известные уровни в пищевом рационе), пул НАД увеличивался, а клетки становились менее чувствительными к воздействию кислородных радикалов (Weitberg А.В., Mutational Res., 216: 197-201, 1989). Следовательно, из приведенного выше обзора известного уровня техники видно, что основной механизм действия никотинамида/ниацина отличается от такового, характерного для каратиноидов и цинка, тем, что клеточный потенциал в отношении энергетического метаболизма повышается путем увеличения запасов пулов НАД и АТФ (т.е. таких биохимических веществ, которые являются источниками энергии живых организмов), что в свою очередь полезно для клеток, тканей и органов с точки зрения снижения повреждения ДНК, усиления репарации ДНК (т.е. поли-АДФ-рибозилирование) и стимуляции иммунной функции, что указывает на его воздействие на болезненное состояние (Pero R.W. и др., Biochimie, 77: 385-393, 1995).

Цинк отличается от каротиноидов и никотинамида по своему механизму действия тем, что он оказывает влияние на развитие болезни и на иммунную функцию, являясь основным кофактором нескольких ферментных функций, участвующих в репликации, репарации ДНК и в антиокислительной защите клеток. Цинк необходим для репликации клеток и активности ДНК-полимеразы (Williams R.O. и др. , J. Cell Biol. , 58: 594-601, 1973). Имеются два цинковых "пальца" в ДНК-связывающем домене гена поли-аденозиндифосфатрибозилтрансферазы (АДФРТ) и в других протеинах, участвующих в репарации ДНК (Dawat P. и др., Microbiol. 141 (Pt 2): 411-417, 1995; Matsuda T. и др., J. Biol. Chem. 270(8): 4152-4157, 1995; Chiriccolo М. и др., Mutation Res., 295(3): 105-11, 1993), которые содержат остатки цистеина (т.е. аминокислоты), и если эти остатки цистеина окислены по своим тиольным составляющим, они могут предотвращать связывание ДНК и участие протеинов в репарации ДНК (Mazen и др., Nucleic Acid. Res. 17: 4689-4698,1989; de Murcia G. и др., BioEssays, 13(9): 455-462, 1989; Pero R.W. и др., Biochimie, 77: 385-393, 1995; Althaus F. и др., Mol. Cell. Biochem. , 138(1-2): 53-59, 1994). Кроме того, супероксиддисмутаза, представляющая собой антиокислительный фермент, защищающий клетки от вредного супероксидного аниона, поскольку этот радикал является субстратом для реакции с участием этого фермента, также нуждается в цинке в качестве кофактора (Brunori М. и Rotilio G. , Methods in Enzymology, 105: 22-35, 1984).

В целом хотя и было установлено, что каротиноиды, никотинамид/ниацин и цинк по отдельности обладают некоторыми полезными свойствами в клетках, и они в качестве отдельных агентов примененялись на моделях-животных для предупреждения определенных заболеваний и для стимулирования иммунной функции, однако отсутствуют соответствующие согласующиеся данные в отношении людей (Bodgen J.D. и др., Amer. J. Clin. Nutri., 48: 655-663, 1988; Walsh C. T. и др. , Environmental Health Perspectives, 102(Suppl. 2): 5-46, 1994). Кроме того, специалисту в данной области техники невозможно a priori предсказать, будут ли агенты с разными механизмами действия оказывать синергетическое, аддитивное или ингибирующее действие на биологическую реакцию, которую они будут вызывать при введении в комбинации друг с другом.

Краткое изложение сущности изобретения
Согласно настоящему изобретению предлагается композиция, предназначенная для введения людям или другим животным и состоящая в основном из комбинации каротиноидного вещества, никотинамидного вещества и вещества, являющегося источником цинка, и практически лишенная других активных ингредиентов. Под понятиями "состоящая в основном из" и "практически лишенная других активных ингредиентов" подразумевают, что композиция не содержит активных питательных элементов кроме вышеуказанного каротиноидного вещества, никотинамидного вещества и вещества, являющегося источником цинка. Понятие "активные питательные элементы" в контексте настоящего описания используют в качестве общего обозначения для витаминов, минеральных веществ и других соединений, служащих в качестве антиоксидантов, кофакторов антиоксидантов или иных веществ, участвующих в предупреждении болезни, в ингибировании повреждения ДНК, в усилении репаративной способности ДНК и/или усиливающих иммунную функцию, таких как ранее поступавшие в продажу в концентрированной, изолированной или комбинированной форме в качестве пищевых добавок и т.п. для потребления человеком и/или животным. В частности, понятие "активные питательные элементы" более конкретно включает вышеперечисленные ингредиенты двух продуктов, обозначенных выше как коммерческий продукт I и коммерческий продукт II.

Иными словами, согласно одному из вариантов в настоящем изобретении предлагаются композиции, содержащие каротиноидное вещество, никотинамидное вещество и вещество, являющееся источником цинка, и не содержащие других активных питательных элементов. Композиции по изобретению могут быть включены в препаративные формы для орального введения или в другом варианте в препаративные формы для парентерального введения.

В иллюстративном или предпочтительном варианте осуществления изобретения каротиноидное вещество может быть выбрано из группы, включающей α -каротин β -каротин, γ -каротин, ликопен и их смеси, никотинамидное вещество может быть выбрано из группы, включающей никотинамид, ниацин, триптофан и их смеси, а веществом, являющимся источником цинка, может быть одна или более солей цинка.

Для введения человеку каротиноидное вещество, никотинамидное вещество и вещество, являющееся источником цинка, могут присутствовать в комбинации и в пропорциях, обеспечивающих увеличение устойчивости ДНК к повреждению, усиление репаративной способности ДНК и стимуляцию иммунной функции у пациента-человека, которому вводят композицию в виде суточной дозы.

Изобретение также включает способ лечения человека или других животных, предусматривающий введение субъекту каротиноидного вещества, никотинамидного вещества и вещества, являющегося источником цинка, в виде определенной добавки к пищевому рациону субъекта (т.е. без добавления к пищевому рациону любых других активных питательных элементов) и в повторном их введении в основном с учетом суточной дозы.

Таким образом, согласно еще одному из вариантов изобретение относится к способу лечения человека, предусматривающему селективное введение субъекту комбинации каротиноидного вещества, никотинамидного вещества и вещества, являющегося источником цинка, в виде суточной дозы в количестве, обеспечивающем увеличение устойчивости ДНК к повреждению, усиление репаративной способности ДНК и стимуляцию иммунной функции. В частности, в одном из конкретных примером осуществления этого способа людям ежедневно вводят общепринятую предпочтительную дозу, составляющую приблизительно 100 мг каротиноидного вещества, приблизительно 100 мг никотинамидного вещества и приблизительно 10 мг вещества, являющегося источником цинка.

С теоретической точки зрения настоящее изобретение основано на принципе объединения химических продуктов, для которых известно, что они по отдельности обладают свойствами либо предупреждать заболевание раком, либо стимулировать иммунную систему, в виде одной препаративной формы, которая содержит только эти активные компоненты, причем известно, что по крайней мере один механизм действия каждого активного компонента отличается от известных механизмов действия других компонентов. Насколько известно из уровня техники, этот принцип ранее не использовался в данной области.

Изобретение основано на том факте, что природные продукты не могут быть объединены в виде природного лекарственного средства до тех пор, пока не изучено, оказывает ли каждый ингредиент аддитивное влияние на общее требуемое биологическое воздействие и что одним из способов достижения этой цели является тот принцип, что нельзя объединять природные продукты, которые обладают сходными механизмами действия и, следовательно, конкурентными путями абсорбции и экскреции без предварительного тестирования комбинации на аддитивность действий. Следует отметить, что настоящее изобретение позволяет избежать ингибирования при поглощении и абсорбции природных продуктов, позволяя тем самым достичь аддитивных биологических воздействий путем объединения только природных продуктов, имеющих четко выраженные различные и, следовательно, потенциально неконкурентные механизмы действия, которые наблюдаются, например, в случае эксклюзивной комбинации каротиноиды + никотинамид + цинк.

Таким образом было, в частности, обнаружено, что когда комбинацию каротиноиды + никотинамид + цинк по изобретению вводили людям, наблюдали статистически достоверное снижение окислительного повреждения ДНК клетки, усиление репаративной способности ДНК и стимуляцию иммунной функции. Полученные данные подтверждают, что при объединении этих агентов, которые имеют различные известные механизмы действия в отношении стимулирования иммунной функции, в концентрациях, превышающих таковые, характерные для нормального пищевого рациона, лечение с использованием этой комбинации приводит к более благоприятному характеру и к аддитивному воздействию на биологическую реакцию.

Согласно настоящему изобретению предусмотрено дополнительное введение людям или животным, например, с помощью орального, внутрибрюшинного, внутривенного, подкожного или внутримышечного методов введения, комбинации каротиноиды + никотинамид/ниацин + соответствующая цинковая соль, причем доза этой комбинации превышает характерную для добавки к нормальному пищевому рациону. Из уровня техники известно, что пищевая добавка, содержащая эту комбинацию вместе с одновременной добавкой других питательных веществ и/или природных продуктов, не может усилить иммунную функцию (Payette Н. и др., Am. J. Clin. Nutr. , 52: 927-932, 1990; Zhang и др., J. Clin. Nutr., 62: 1477S-1482S, 1995), однако, когда применяли только каротиноиды (в виде кароплекса, фирма C.E. Jamieson, Ltd., Онтарио, Канада), никотинамид и цинковую соль в отсутствии других природных добавок в дозах, превышающих обычные уровни в пищевом рационе, например, 100 мг, 100 мг и 10 мг соответственно, путем ежедневного орального введения в течение 7-ми недель, наблюдали устойчивость к окислительному повреждению ДНК клетки и усиление репарации ДНК и иммунной функции.

Оценка в клинических условиях состояла в сравнении каждой индивидуальной биологической реакции до и после введения добавки. Таким образом, каждый индивидуум являлся своим собственным контролем; например, у мужчин проводили базовые измерения устойчивости к окислительному повреждению ДНК клетки и усиления репарации ДНК и иммунной функции один раз в неделю в течение 4-х недель, затем им ежедневно вводили лекарство и те же самые измерения повторяли один раз в неделю в течение последних 5-ти недель 7-ми недельного периода вмешательства. Результаты первых измерений (т.е. n = 4) служили в качестве базовых параметров биологической реакции, которые сравнивали с результатами последующих измерений (т.е. n = 5). Одному индивидууму не вводили добавку, и он служил контролем для индивидуумов, которым вводили добавку. Данные этого экспериментального исследования показали, что и устойчивость к окислительному повреждению ДНК клетки, и усиление репарации ДНК, и стимуляция иммунной функции достоверно модулируются комбинацией каротиноиды + никотинамид + цинк при введении в виде эксклюзивной комбинации лекарства в дозах, превышающих обычные уровни в пищевом рационе, но не тогда, когда ее вводят совместно с другими дополнительными питательными веществами или добавками природного продукта.

Другие особенности и преимущества изобретения более подробно описаны ниже со ссылкой на прилагаемые чертежи.

Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена гистограмма, характеризующая однонитевые разрывы ДНК, которые обусловлены 100 мкМ перекисью водорода и которые оценивали в ЧОЛ (одноядерных лейкоцитах человека) с помощью щелочной элюции до и после добавления природных продуктов каротиноиды + никотинамид + цинк по настоящему изобретению. Данные приведены в виде среднего значения и стандартного отклонения (CO)•p<0,05 по сравнению с данными, полученными до введения добавки.

На фиг. 2 представлена гистограмма, характеризующая репарацию ДНК через 30 минут после индукции однонитевых разрывов ДНК 100 мкМ перекисью водорода в ЧОЛ, которые оценивали с помощью щелочной элюции до и после добавления природных продуктов каротиноиды + никотинамид + цинк по настоящему изобретению. Данные приведены в виде среднего значения и стандартного отклонения (CO)•p<0,05 по сравнению с данными, полученными до введения добавки.

На фиг. 3 представлена гистограмма, характеризующая репарацию ДНК через 60 минут после индукции однонитевых разрывов ДНК перекисью водорода в ЧОЛ, которые оценивали с помощью щелочной элюции до и после добавления природных продуктов каротиноиды + никотинамид + цинк по настоящему изобретению. Данные приведены в виде среднего значения и стандартного отклонения (CO)• p<0,05 по сравнению с данными, полученными до введения добавки.

На фиг. 4 представлена гистограмма, характеризующая активность поли-АДФРТ в ЧОЛ до и после добавления природных продуктов каротиноиды + никотинамид + цинк по настоящему изобретению. Данные приведены в виде среднего значения и стандартного отклонения (CO) •p<0,05 по сравнению с данными, полученными до введения добавки.

На фиг. 5 представлена гистограмма, характеризующая включение [³H] -тимидина после вызванной ФГА митогенной индукции в ЧОЛ до и после добавления природных продуктов каротиноиды + никотинамид + цинк по настоящему изобретению. Данные приведены в виде среднего значения и стандартного отклонения (CO)•p<0,05 по сравнению с данными, полученными до введения добавки.

На фиг. 6 представлена гистограмма, характеризующая концентрации НАД в эритроцитах человека до и после добавления природных продуктов каротиноиды + никотинамид + цинк по настоящему изобретению. Данные приведены в виде среднего значения и стандартного отклонения (CO) •p<0,05 по сравнению с данными, полученными до введения добавки.

На фиг. 7 представлена серия гистограмм, позволяющая сравнить in vivo воздействие добавления композиции каротиноиды + никотинамид + цинк по настоящему изобретению ("КНЦ") и добавки указанного выше как коммерческого продукта I ("КПI") на повреждение ДНК в одноядерных лейкоцитах человека. Повреждение ДНК вызывали 100 мкМ перекисью водорода и оценивали с помощью щелочной элюции. Данные приведены в виде столбца, представляющего собой среднее значение и интервала погрешности, характеризующего стандартное отклонение (CO) (n= 4-5). •обозначает, что различие достоверно (p<0,05, в соответствии с критерием Стьюдента) по сравнению с соответствующим базовым уровнем. Комментарий: пациент, обозначенный как вариант А, не получал коммерческий продукт I, так как у него произошел приступ острого аппендицита как раз перед началом курса вмешательства и у него не брали образцы крови в течение 3-х недель после этого.

На фиг. 8 представлена серия гистограмм, позволяющая сравнить in vivo воздействие добавления комбинации каротиноиды + никотинамид + цинк по настоящему изобретению ("КНЦ") и добавки указанного выше коммерческого продукта I ("КПI") на репарацию ДНК в одноядерных лейкоцитах человека. Репарацию ДНК оценивали с помощью щелочной элюции через 60 минут после повреждения ДНК, вызванного 100 мкМ перекисью водорода. Данные приведены в виде столбца, представляющего собой среднее значение и интервал погрешности, характеризующего стандартное отклонение (CO) (n=4-5 для каждого столбца). • обозначает, что различие достоверно (p<0,05, в соответствии с критерием Стьюдента) по сравнению с соответствующим базовым уровнем. Комментарий: вариант А не получал коммерческий продукт I, так как у него произошел приступ острого аппендицита как раз перед началом курса вмешательства и у него не брали образцы крови в течение 3-х недель после этого.

На фиг. 9 представлена серия гистограмм, позволяющая сравнить in vivo воздействие добавления композиции каротиноиды + никотинамид + цинк по настоящему изобретению ("КНЦ") и добавки указанного выше коммерческого продукта I ("КПI") на стимуляцию с помощью ФГА лимфоцитов человека. Результаты выражены в виде % от базового уровня (столбец представляет собой среднее значение, а линия погрешности характеризует стандартное отклонение (CO)). • обозначает, что различие достоверно (p<0,05) по сравнению с соответствующим базовым уровнем. Комментарий: вариант А не получал коммерческий продукт I, так как у него произошел приступ острого аппендицита как раз перед началом курса вмешательства и у него не брали образцы крови в течение 3-х недель после этого.

Подробное описание изобретения
В подробно описанном ниже варианте осуществления изобретения представлено применение комбинации, которая в основном состоит из каротиноидов + никотинамида + глюконата цинка (и не содержит других активных питательных элементов), в виде добавки для орального применения, причем уровни этих компонентов превышают нормальные характерные для пищевого рациона уровни или находятся в пределах этих уровней, которую вводят ежедневно с целью повышения у индивидуума устойчивости к повреждению ДНК клетки, усиления репарации ДНК и стимуляции иммунного ответа клетки in vivo. Основная идея исследования для подтверждения изобретения заключалась в объединении веществ, обладающих известными свойствами в отношении предотвращения рака и стимуляции иммунной функции, но с различными механизмами действия; например, каротиноиды являются электрофильными утилизаторами радикалов, продуцируемых эндогенно клетками или экзогенно в окружающей среде, никотинамид является мощным источником энергии благодаря повышению образования НАД или АТФ, а цинк является основным кофактором для антиоксидантов, ферментов, участвующих в репликации и репарации ДНК в клетках. Гипотеза состояла в том, что поскольку ни одно из этих веществ не вызывало выраженных воздействий на людей при введении этих агентов по отдельности, этот недостаток может быть преодолен при введении этих веществ в виде комбинации, поскольку они могут вызывать ярко выраженный аддитивный хемопревентивный (хемопрофилактический) биологический ответ вследствие неконкурентных механизмов действия, не ингибируя, например, действия друг друга.

В данном эксперименте с целью обоснования настоящего изобретения участвовало четверо здоровых мужчин-добровольцев в возрасте 30-40 лет, работающих в одинаковых условиях. Один раз в неделю в течение 4-х последовательных недель проводили базовую оценку реакций одноядерных лейкоцитов человека (ЧОЛ) до введения добавки in vivo в отношении каждого из следующих показателей: (I) устойчивость ДНК клетки к повреждению, определяемому с помощью щелочной элюции ДНК, (II) усиление репарации ДНК, определяемое по способности репарироваться после обработки стандартной дозой перекиси водорода, и (III) стимуляция иммунной функции, определяемая по митогенной стимуляции фитогемагглютинином (ФГА). Трем добровольцам, как описано ниже, орально вводили каротиноиды, никотинамид и глюконат цинка ежедневно в течение 7-ми последовательных недель, и характеристики биологической реакции определяли один раз в неделю в течение последних 5-ти недель. Один доброволец не получал добавки в течение 7-недельного периода вмешательства, но у него брали анализы и подвергали их биологическому исследованию в отношении исследуемых характеристик биологической реакции последовательно один раз в неделю в течение последних 5-ти недель, и этот доброволец служил в качестве "необработанного контроля". Затем результаты экспериментальных данных для каждого индивидуума "до" и "после" обработки объединяли и проводили групповой статистический анализ для выяснения воздействий при обработке и без обработки.

Использованные лекарства были приобретены у фирмы C.E. Jamieson, Ltd. (Онтарио, Канада): каротиноиды в виде кароплекса - по 100 мг в желатиновых капсулах с мягким покрытием, никотинамид - по 100 мг в виде таблеток и глюконат цинка - по 10 мг в виде таблеток, и предлагаемую согласно настоящему изобретению комбинацию этих трех веществ иногда в контексте настоящего описания обозначали как "КНЦ". Кароплекс представляет собой патентованный природный источник каротидоидов, получаемый из пальмового масла, содержащий 60% β -каротина, 34% α -каротина, 3% γ -каротина и 3% ликопена (lwasaki R. и Murakoski М., Inform, 2(2):210-217, 1990). Эти три лекарства применяли совместно путем орального введения в течение того же периода времени с понедельника по субботу (ежедневно) в течение 7-ми недель. Во всех случаях для каждого добровольца допускалось не более 3 дней без обработки в течение всего периода эксперимента.

С целью проверить гипотезу о том, что каротиноиды, никотинамид и цинк (КНЦ) при применении в комбинации в присутствии других добавок в виде питательных веществ или природных лекарственных средств не приведут к увеличению устойчивости индивидуума к повреждению ДНК клетки или к усилению репарации ДНК и иммунной функции, тем же добровольцам, которые получали добавки в виде КНЦ, предоставлялся 13-недельный период "без вмешательства", затем у них в течение 4-недельного периода повторно определяли базовые значения биологических показателей, используемых в КНЦ-эксперименте, после чего начинали оральное введение указанного выше коммерческого продукта I (иногда обозначаемого в настоящем описании как "КПI"), которое продолжали в течение 6-ти последовательных недель наряду с контролем "без вмешательства", и биологические показатели определяли один раз в неделю в течение 4-х последних недель. КПI содержал 20 ингредиентов, в том числе каротиноиды, никотинамид и цинк, и его вводили ежедневно с концентрациями каждого отдельного компонента, указанными выше в таблице под заголовком "Коммерческий продукт I". В этом эксперименте во всех случаях для каждого добровольца также допускалось не более 3 дней без обработки в течение всего периода обработки, за исключением варианта А, у которого произошел приступ острого аппендицита как раз перед началом КПI-вмешательства, и, таким образом, этот доброволец рассматривался как "контроль без вмешательства".

Каждую неделю отбирали приблизительно 20 мл венозной крови в 2 гепаринизированных вакуумных контейнера (143 U.S.P. единиц/10 мл пробирки), а также разделяли ЧОЛ, эритроциты и образцы плазмы в соответствии с методом, описанным у Pero и др. , (J. Int. Med., 233:63-67, 1993). ЧОЛ с плотностью 2•10⁶ клеток/мл суспендировали в 10%-ной свежей аутологичной плазме с добавлением среды RPMI 1640. Эту культуральную среду использовали во всех экспериментах. Непосредственно после взятия образца крови анализировали однонитевые разрывы ДНК с помощью щелочной элюции, активность поли-АДФРТ и индуцируемую фитогемагглютинином (ФГА) митогенную реакцию в ЧОЛ, а также определяли пул НАД с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД). Другие неиспользованные образцы хранили в замороженном состоянии при -70^oC для дальнейших анализов.

Окислительное повреждение ДНК и репарацию ДНК анализировали с помощью щелочной элюции путем обработки ЧОЛ на льду стандартной дозой 100 мкМ H₂О₂ в течение 60 минут (или оставляя ЧОЛ без обработки) и затем клетки инкубировали при 37^oC в течение 0, 30 или 60 минут для репарации ДНК. Повреждение ДНК и репарацию в различные моменты времени оценивали с помощью щелочной элюции, как описано у Kohn и др. (под ред. Friedberg E.C. и Hanawalt P., DNA Repair: A Laboratory Manual of Research Procedures, Marcel Dekker, New York, стр. 379-402, 1981) с модификациями для оценки немеченой ДНК с помощью микрофлуорометрии (Cesarone C.F. и др., Anal. Biochem., 100: 188-197,1979).

Фермент, участвующий в репарации ДНК, поли-АДФРТ исследовали с помощью метода изменения проницаемости клеток, разработанного Бергером, с ранее описанными модификациями (Pero и др., Carcinogensis, 10: 1657-1664, 1989). Активности поли-АДФРТ как в нормальном, так и в индуцированном физиологическом состоянии, измеряли на ЧОЛ при плотности 1• 10⁶ клеток/мл при обработке или без обработки стандартной дозой 100 мкМ H₂О₂ при 37^oC в течение 30 минут и затем клетки собирали центрифугированием, увеличивали их проницаемость и определяли активность поли-АДФРТ радиометрическим способом, как это подробно описано у Pero и др., Carcinogensis, 10: 1657-1664, 1989).

Для определения НАД методом ЖХВД замороженные эритроцитарные уплотненные дебрисы (500 мкл) подвергали оттаиванию в 600 мкл 1,8 М перхлорной кислоты (ПХК) на льду. После гомогенизации и добавления в качестве внутреннего стандарта 25 мкл 2,4 мМ тимидина (dThd) образцы центрифугировали при 14000 xg для удаления нерастворенного материала. Супернатант (0,5 мл) нейтрализовали добавлением 150 мкл 2М раствора K₂CO₃. После повторного центрифугирования при 14000 xg супернатант был готов для анализа с помощью ЖХВД. Химические вещества, применяемые для приготовления буферных растворов, были аналитически чистыми, а буфер для элюции представлял собой 150 мМ фосфат калия, pH 6, содержащий 0-4 об. % метанола (Jones D.P., J. Chromatogr., 225: 446-449, 1981). Перед использованием буфер для элюции фильтровали через стерильный полисульфоновый фильтр с размером пор 0,2 мкм (фирма VacuCap, Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). Анализ НАД проводили в колонке C₁₈ (3 мкм) (83х4,3 мм (внутренний диаметр), фирма Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT) с четырехнасосной системой типа Perkin Elmer (410 LC), снабженной УФ-детектором с переменной длиной волны (LC- 95) и интегратором (LCI-100). Базовое разделение получали менее, чем за 12 мин, когда анализировали водный раствор, содержащий АДФ-рибозу, АМФ, НАДФ, НАМ, НАД и dThd. Общие условия проведения анализа были следующими: скорость потока = 1,0 мл/мин; подвижная фаза - 1, 4%-ный метанол в течение 3,5 мин и 4%-ный в течение 10 мин; температура 20-25^oC; время повторного цикла между погонами - 10 мин; обнаружение при 254 нм. Стандартную кривую получили при использовании замороженных образцов эритроцитов, которые инкубировали в течение 1,5 ч при 37^oC перед экстракцией ПХК с последующим добавлением 0-40 мкМ НАД. Концентрацию НАД в образцах определяли как функцию высоты пика НАД по отношению к высоте пика внутреннего стандарта (dThd).

Индуцированную фитогемагглютинином (ФГА) митогенную реакцию анализировали с использованием 2•10⁵ ЧОЛ, которые инкубировали в многолуночных планшетах для микрокультуры, содержащих 200 мкл среды RPMI 1640 с добавлением 10%-ной аутологичной плазмы и 6 мкл ФГА/мл (фирма Gibco) при 37^oC и 5% CO₂ в течение 4 дней (Pero и др., Biochimie, 77: 385-393, 1995). После двух дополнительных дней инкубации в присутствии [³ H]-тимидина (конечная концентрация 6 Ки/мкМ, 1 мкКи/мл) клетки собирали и анализировали на содержание связанного с [³H] -тимидином радиоактивно меченного материала, присутствующего в 2•10⁵ ЧОЛ.

Ниже настоящее изобретение проиллюстрировано на примерах.

Пример 1
В данном примере показана эффективность обработки добровольцев каротиноидами (100 мг в виде кароплекса) + никотинамидом (100 мг) + глюконатом цинка (10 мг) (КНЦ) при оральном введении ежедневно в течение 7-ми последовательных недель и приведены результаты последующего анализа этого вмешательства в отношении защиты индивидуумов от вредных воздействий окислительного повреждения (например, 100 мкМ H₂О₂) ДНК в одноядерных лейкоцитах человека (ЧОЛ). Эти данные показывают, что у всех трех добровольцев, подвергнутых описанной выше обработке, обнаружено достоверное (p< 0,05) увеличение способности их ЧОЛ противостоять индуцируемому H₂О₂ повреждению ДНК, тогда как у добровольца, выступающего в роли контроля, которому в течение периода вмешательства эти вещества давали только в виде пищевой добавки, не было обнаружено воздействия на параметры этой биологической реакции (фиг. 1).

Пример 2
В данном примере показана эффективность обработки добровольцев каротиноидами (100 мг в виде кароплекса) + никотинамидом (100 мг) + глюконатом цинка (10 мг) (КНЦ) при оральном введении ежедневно в течение 7-ми последовательных недель с целью усиления репарации ДНК в ЧОЛ у индивидуума при окислительном повреждении ДНК in vitro (т.е. с помощью 100 мкМ H₂О₂). Результаты показывают, что у всех подвергнутых обработке добровольцев при прохождении процесса репарации ДНК в течение 30 минут и 60 минут обнаружено достоверное (p<0,05) увеличение репарации ДНК, вызванного повреждением (100 мкМ H₂О₂), тогда как у не подвергнутого обработке контрольного индивидуума, которому в течение периода вмешательства давали эти вещества только в дозах, соответствующих их уровням в пищевом рационе, не было обнаружено достоверного изменения в течение периода вмешательства (фиг. 2-3).

Пример 3
Данный пример подтверждает данные, уже представленные в примерах 1-2, и он касается оценки (количественной) фермента, участвующего в репарации ДНК, поли-АДФРТ, до и после орального введения добровольцам in vivo каротиноидов (100 мг в виде кароплекса), никотинамида (100 мг) и глюконата цинка (10 мг) (КНЦ) ежедневно в течение 7-ми последовательных недель. Данные показывают, что активность поли-АДФРТ увеличивалась в большей степени при вмешательстве по сравнению с контрольным индивидуумом, который не получал никаких добавок в течение периода вмешательства (фиг. 4).

Хотя эти данные оказались статистически недостоверными, они дополняют результаты, уже полученные в примерах 1-2, в которых показано, что это вмешательство с использованием лекарств привело к снижению окислительного повреждения ДНК клетки, и в то же время клетки могли существенно лучше восстанавливать ДНК после повреждения.

Пример 4
В данном примере показана эффективность обработки добровольцев никотинамидом, когда никотинамид (100 мг) вводили перорально ежедневно в течение 7-ми последовательных недель совместно с каротиноидами (100 мг в виде кароплекса) и глюконатом цинка (10 мг) (КНЦ), которую оценивали по воздействию на энергетические пулы НАД. Данные, представленные на фиг. 5, ясно показывают, что добавка никотинамида существенно увеличивает концентрацию НАД эритроцитов в клетке и, таким образом, сравнительный анализ подтверждает способность уменьшать повреждения ДНК и усиливать репарацию ДНК в ЧОЛ, что было показано и в примерах 1-3 этого же исследования. Также было установлено, что эритроциты являются хорошим общим индикатором статуса НАД в содержащих ядра клетках (Jacobson E. L. и др., в ADP-Ribosylation Reactions (Poirier G. G. и Moreau P., ред.), стр. 153-162, Springer-Verlag, New York, 1992). Этот пример также показывает, что присутствие в добавке каротиноидов и цинка не блокировало или не ингибировало биологическую реакцию увеличения пулов НАД, что, как известно из литературы, происходит при введении одного никотинамида.

Пример 5
В данном примере проведена оценка митогенного стимулирования ЧОЛ фитогемагглютинином (ФГА) в качестве теста на иммунную функцию до и после ежедневного перорального введения каротиноидов (100 мг в виде кароплекса), никотинамида (100 мг) и глюконата цинка (10 мг) (КНЦ) в течение 7-ми последовательных недель. Данные показывают, что у индивидуумов, подвергнутых лечебному вмешательству, обнаружена увеличенная индуцируемая ФГА митогенная реакция, что видно по увеличению включения [³H]-тимидина в ЧОЛ по сравнению с реакцией одного добровольца, у которого оценивали иммунную функцию в течение последних 5-ти недель периода вмешательства, но который не получал никакой добавки (контроль) (фиг. 6). Более того, если эти данные объединить с данными, представленными в примерах 1-4, они свидетельствуют о том, что когда иммунная функция повышается, это происходит параллельно и механически связано с улучшенной способностью ЧОЛ сопротивляться окислительному повреждению ДНК (примеры 1, 4) и с усилением репаративной способности ДНК (примеры 2, 3).

Пример 6 В данном примере показано воздействие in vivo на повреждение ДНК в ЧОЛ при оральном введении КНЦ (каротиноиды + никотинамид + цинк) в сравнении с воздействием коммерческого продукта I (КПI, содержащий каротиноиды + никотинамид + цинк + 17 других добавок) при изучении на одних и тех же добровольцах (фиг. 7). Представленные данные показывают, что хотя добавка КНЦ приводила к значительной устойчивости в отношении индукции повреждения ДНК в ЧОЛ, вызванного in vitro стандартной дозой перекиси водорода для вариантов Б и В по сравнению с контролем, добавка КПI не оказывала такого воздействия (т.е. при сравнении этого параметра с таковым у индивидуумов, обозначенных контролем и вариантом А). Этот эксперимент показывает, что присутствие в добавке других природных продуктов в дополнение к каротиноидам + никотинамиду + цинку ограничивает биологическую эффективность этих трех соединений, использованных в виде эксклюзивной комбинации, в отношении устойчивости ДНК клетки к повреждению.

Пример 7
В данном примере показано воздействие in vivo на репарацию ДНК в ЧОЛ после перорального введения КНЦ (каротиноиды + никотинамид + цинк) по сравнению с воздействием КПI (каротиноиды + никотинамид + цинк + 17 других добавок) при изучении на одних и тех же добровольцах (фиг. 8). Для варианта Б установлено, что в то время как добавка КНЦ значительно усиливала репарацию ДНК, не выявлено соответствующего действия в случае, когда этому же индивидууму вводили добавку с КПI или вообще не вводили добавок (т.е. при сравнении этого параметра с таковым у индивидуумов, обозначенных контролем и вариантом А). Этот эксперимент показывает, что присутствие в добавке других природных продуктов в дополнение к каротиноидам + никотинамиду + цинку ограничивает биологическую эффективность этих трех соединений, использованных в виде эксклюзивной комбинации, в отношении репарации ДНК.

Пример 8
В данном примере показано воздействие in vivo на иммунный ответ ЧОЛ при обработке in vitro митогеном фитогемагглютинином (ФГА) после орального введения КНЦ (каротиноиды + никотинамид + цинк) в сравнении с воздействием КПI (каротиноиды + никотинамид + цинк + 17 других добавок) при изучении на одних и тех же добровольцах (фиг. 9). Для варианта Б установлено, что добавка Nicoplex значительно усиливает стимуляцию ЧОЛ фитогемагглютинином. Однако, когда этому же индивидууму вводили добавку с КПI или вообще не вводили добавок (т. е. при сравнении этого параметра с таковым у индивидуумов, обозначенных контролем и вариантом А), соответствующего действия не было выявлено. Этот эксперимент показывает, что присутствие в добавке других природных продуктов в дополнение к каротиноидам + никотинамиду + цинку ограничивает биологическую эффективность этих трех соединений, использованных в виде эксклюзивной комбинации, в отношении иммунных реакций клеток.

Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничено конкретными приведенными выше характерными особенностями и примерами осуществления и оно может быть реализовано с использованием других способов без отклонения от его сущности.

Реферат

Изобретение может быть использовано для лечения людей и животных. Комбинация в виде пищевой добавки или лекарства содержит в качестве активных ингредиентов только каротиноидное вещество, никотинамидное вещество и источник цинка в виде их отдельных дозированных форм. Указанная комбинация селективно дополняет эти вещества, содержащиеся в обычном пищевом рационе, что обеспечивает увеличение устойчивости ДНК к повреждению, усиление репаративной способности ДНК и стимуляцию иммунной функции. Способы лечения человека или животного для получения указанного эффекта заключаются в ежедневном введении суточной дозы заявленной комбинации независимо от присутствия или отсутствия тех же активных веществ комбинации в обычном пищевом рационе. Второй вариант способа заключается в ежедневном селективном введении дозированных форм активных веществ композиции. Использование изобретения позволяет лечить проявление различных болезненных состояний, проявляющихся, например, при старении, раке, сердечно-сосудистых заболеваниях и аутоиммунных расстройствах, таких как диабет, ревматоидный артрит и неспецифический язвенный колит. 3 с. и 6 з.п.ф-лы, 9 ил.

Формула