Сулодексид для применения в лечении патологий, в которые вовлечены металлопротеиназы - RU2557996C2

Чертежи

Описание

В настоящем изобретении описан сулодексид или по меньшей мере один из его компонентов для применения в снижении уровня циркулирующей матриксной металлопротеиназы (ММР), в частности ММР-9.

Сулодексид и его композиция полезны для лечения патологий, в которые вовлечены ММР, таких как сердечно-сосудистое заболевание, сердечнососудистое заболевание, вызванное диабетом, варикозное расширение вен, хроническая венозная недостаточность (CVI), желудочно-кишечные язвы, легочное заболевание и неопластические патологии.

Предшествующий уровень техники

Недавние исследования продемонстрировали участие группы цинк-зависимых эндопептидаз, названных матриксными металлопротеиназами (ММР), принадлежащих к матриксиновому семейству, в сосудистых изменениях при сердечно-сосудистых патологических состояниях.

Венозная гипертензия является основой нескольких патологий, связанных с расстройствами макро- и микроциркуляции и вызывающих инфильтрацию лейкоцитов в эндотелий, разрушение сердечных клапанов и, наконец, обеспечивающих ремоделирование/перестройку венозной стенки, что может приводить к рефлюксу или образованию варикозного расширения вен и к патологиям дермы, как описано в Bergam J. et al. Ann. Vasc. Surg. 21 (2007), 260-266. Raffetto JD. и др. в Thromb. Res. 123 (2009) S66-S71 сообщают, что модификации, наблюдаемые во время развития хронической венозной патологии, могут быть связаны с изменением баланса между уровнем матриксных металлопротеиназ (ММР) и их тканевых ингибиторов (TIMP) в крови.

Как ММР, так и TIMP, участвуя в физиологическом ремоделировании внеклеточного матрикса, играют важную роль также и в клеточной коммуникации.

Высокие концентрации ММР были обнаружены при различных патологиях, как сообщают Mannello F. и др. в Curr. Cancer Drug Targets 5 (2005), 285-298. Среди ММР, ММР-9 (желатиназа В, КФ 3.4.24.35 с 92, 130 и 225 кДа) вовлечена в несколько патологий, в том числе неопластические патологии, откуда следует, что их присутствие в виде циркулирующего фермента и их увеличение связаны с развитием различных типов рака, таких как рак молочной железы, легких, яичников, предстательной железы и меланома, как сообщают Rahko E. и др. в Tumor Biol., 30 (5-6) (2009), 574-64.

Патогенная роль ММР четко показана при сосудистых патологических состояниях, вызванных также диабетом. Galis Z.S. и др. в Circ. Res. 90 (2002), 251-262, Kadoglou N.P. и др. в Angiology 56 (2005), 173-189, Derosa и др. в Diabetes Metab. 33 (2007), 129-134 и Tayebjee M.H. и др. в Diabetes Care 27 (2004), 2049-2051 описывают повышенный уровень циркулирующей ММР у пациентов с диабетом.

Raffetto JD. и др. в Biochem. Pharmacol. 75 (2008), 346-359, демонстрируют важность ММР в сосудистых заболеваниях, сообщая, что повышенная деградация внеклеточного матрикса (ЕСМ) в венозной стенке вовлечена в ранние стадии расслабления вен, образование варикозного расширения вен, дермальную модификацию и, наконец, приводит к образованию венозных язв.

Среди нескольких патологических механизмов, связанных с повышенной экспрессией ММР, важны и являются возможным объектом фармакологического лечения взаимодействия лейкоцитов с эндотелием. Mannello F. и др. сообщают в Arterioscler. Thromb, Vase. Biol. 28 (2008), 611-614, что лейкоциты и тромбоциты содержат более высокие количества ММР, которые могут высвобождаться во внеклеточную среду после активации/дегрануляция лейкоцитов или во время агрегации тромбоцитов. Более того, ММР-9 высвобождается из тромбоцитов и лейкоцитов после такого стимула, как реакции, индуцированные процессом коагуляции.

Известно, что плазмин, активированный во время фазы коагуляции, в свою очередь, является активатором ММР.

Среди протеолитических ферментов, присутствующих в человеческих стенках и потенциально ассоциированных с раковыми инвазиями, ММР, как было продемонстрировано, вовлечены в способность практически разрушать белки интерстициального матрикса и базальных мембран, позволяя клеткам диффундировать и проникать в соседние стенки.

Несколько соединений, таких как рецепторы ростовых факторов и молекулы клеточной адгезии, хемокины, цигокины, апоптозные лиганды и ангиогенные факторы, могут взаимодействовать с ММР, модифицируя и их экспрессию, и их активность.

Эти протеолитические ферменты действуют на многие биоактивные субстраты, вовлеченные в такие стадии неопластического развития, как рост первичной опухоли, ангиогенез, экстравазация и интравазация неопластических клеток, миграция и инвазия метастатических клеток во вторичный орган, начало и поддержание опухолевого роста.

Несколько клинических исследований было проведено как на животных, так и человеческих опухолевых моделях для оценки важности снижения уровня циркулирующей матриксной металлопротеиназы. Полученные результаты привели к разработке синтетических ингибиторов, как описано Ramnath N. и др. в Curr. Oncol. Rep.6 (2004), 96-102.

Основные исследованные ингибиторы содержат пептиды-миметики и пептиды-немиметики коллагена, тетрациклинов и бифосфонатных производных.

Клинические испытания, проведенные с имеющимися соединениями, показали, что длительные режимы лечения вызывают скелетно-мышечную боль и воспаление. Хотя показано, что эти события обратимы, и пациенты снова начинали лечение после короткого периода отмены, неожиданные нежелательные события ограничивали вводимые дозировки.

Более того, когда клинические испытания в отношении лечения неопластических заболеваний были расширены на большее число пациентов, кроме серийных токсикологических проблем вследствие цитостатических эффектов, никакой значительной терапевтической пользы не наблюдали, как сообщили Mannello F. и др. в Curr. Cancer Drug Targets 5 (2005), 285-298.

Некоторые ингибиторы ММР, исследованные в клинических испытаниях, представляют собой батимастат, маримастат, приномастат, BAY 12-9566, CGS27023A и производные тетрациклинов.

Батимастат, ВВ-94 (WO 90057191), представляет собой производное гидроксамовой кислоты, которое имитирует пептидную структуру природных субстратов. Батимастат является мощным ингибитором ММР и был первым ингибитором ММР, использованным в клинических испытаниях, но как было показано, он имеет низкую селективность, вызванную низкой растворимостью и абсорбцией. Более того, лечение батимастатом плохо переносится пациентами, поскольку его надо вводить посредством инъекций в плевральное и брюшное пространство. Клинические испытания Фазы III почти немедленно были остановлены из-за серьезных побочных эффектов, таких как сильные локальные воспалительные тканевые реакции, тошнота, боли в животе, как сообщают Tu G. и др. в Curr. Med. Chem. 15 (2008), 1388-1395.

Маримастат, ВВ-2516 (WO 9402447), представляет собой производное гидроксамовой кислоты с такой же структурой, что и батимастат, но с более высокой растворимостью и последующей более легкой абсорбцией при пероральном введении. Маримастат, как и батимастат, имеет низкую специфичность и был токсичным приблизительно у 30% всех леченых пациентов, вызывая скелетно-мышечные боли и ригидность, которые начинаются с мелких суставов пальцев рук и распространяются на предплечья и плечи, особенно около мест присоединения сухожилий, фиброз и некроз околосуставных стенок локтя и колена и желудочное расстройство, ассоциированные с потерей массы тела, как сообщают Vihinen и др. в Int. J. Cancer 99 (2002), 157-166.

Приномастат, AG3340 (WO 90720824) представляет собой производное гидроксамовой кислоты, селективное против некоторых ММР, вовлеченных в опухолевую инвазию и метастазы. Во время клинических испытаний побочные эффекты наблюдались в суставах плеч, коленей и рук, и лечение немедленно отменили, как сообщают Ramnath N. и др. в Curr. Oncol. Rep.6 (2004), 96-102.

BAY 12-9566 (US 4705798) представляет собой производное масляной кислоты, и в нескольких клинических испытаниях оно продемонстрировало токсичность, проявляющуюся в тромбоцитопении, анемии, увеличении уровней печеночных ферментов и билирубина, тошноте, утомляемости и головной боли, как сообщают Nelson А. и др. J. Clin. Oncol. 18 (2000), 1135-1149.

CGS27023A (US 5455258) имеет известные токсичные эффекты с обширным кожным раздражением, миалгией и артралгией.

Также производные тетрациклинов продемонстрировали во время клинических испытаний тяжелые нежелательные эффекты, такие как утомляемость, спутанность сознания, тошнота, рвота, кожная фототоксичность, увеличение уровней панкреатических ферментов, которые ограничивают вводимые дозы, как сообщают Hidalgo М. и др. в J. Natl. Cancer Inst. 93 (2001), 178-193.

Зимография и обратная зимография представляют собой методы, используемые в настоящее время для анализа ММР и TIMP в биологических образцах. Все типы субстратов для зимографии берут из способа желатиновой зимографии. Методы являются одинаковыми, за исключением того, что субстрат отличается, в зависимости от типа ММР или TIMP. В этих методах белки разделяются электрофорезом в денатурирующих, невосстанавливающих условиях в присутствии додецилсульфата натрия (SDS). Желатиновая зимография является методом, используемым в основном для определения ММР, представляющих собой желатиназу, и она чрезвычайно чувствительна для детекции ММР-2 и ММР-9 в концентрации несколько пикограмм. Следует учитывать, что другие ММР, такие как ММР-1, ММР-8 и ММР-13, также могут разлагать этот субстрат.

Этот метод основан на разделении электрофорезом в полиакриламидном геле со специфическим субстратом; SDS денатурирует ММР, которые становятся неактивными, и после миграции в электрофорезе SDS удаляют из геля в подходящем буфере, который восстанавливает структуру и функции ММР. После этого, если гель инкубируют, то активированные желатиназы переваривают желатин, который превращается в низкомолекулярные пептиды, которые удаляют промывкой, как описано Mannello F. и др. в Clin. Chem. 49 (2003), 339-34.

Гели помещают в проявочный раствор, например содержащий Кумасси, и затем обесцвечивают растворами, содержащими метиловый или этиловый спирт и уксусную кислоту. Окрашенные зоны геля являются результатом присутствия непереваренного желатина, тогда как неокрашенные зоны являются результатом ферментативной активности ММР. Ферментативная активность пропорциональна ширине прозрачных полос, таким образом, ее можно проанализировать и количественно определять с помощью денситометра, снабженного анализатором изображений.

Зимограммы дают специфичную и четкую информацию о ММР и, в частности о ММР-2 и ММР-9, поскольку эти два фермента могут быть разделены на основании различных электрофоретических подвижностей, которые зависят от их молекулярных масс. С этой целью подходящие стандарты молекулярной массы, соответствующие 72 кДа для про-ММР-2 и 92, 130 и 225 кДа для комплекса про-ММР-9 и ММР-9, наносят для сравнения на тот же гель.

Mannello F. и др. в Clin. Biochem. 41 (2008), 1466-73 исследовали эффект добавления высокомолекулярного гепарина (HMWH) лития на образцы периферической крови для оценки влияния HMWH на экспрессию ММР и TIMP в крови. Описанный эффект состоял в том, что HMWH оказывал как прямое, так и опосредованное влияние, изменяя количество циркулирующих ММР и TIMP и увеличивая высвобождение TIMP-2. Цель этой публикации состояла по существу в описании влияния высокомолекулярного гепарина (HMWH) на экспрессию ММР при манипуляциях с кровью для того, чтобы стандартизировать процедуры обращения с образцами крови в способе измерения ММР. В этой публикации нет ссылок и/или предложений, относящихся к фармакологическим применениям гепарина. Более того, не сообщаются концентрации гепарина лития, при которых наблюдается эффект. Вследствие этого, невозможно знать, может ли концентрация гепарина лития, которая обеспечивает наблюдаемый эффект, быть терапевтически полезной, поскольку хорошо известен высокий риск кровотечения, ассоциированный с HMWH. Тем не менее, поскольку известно, что гепарины обычно вводят посредством инъекции, следует предположить, что любое возможное применение гепарина с целью изменения концентраций ММР в плазме должно следовать тому же пути.

Эффект гепарина на экспрессию мРНК ММР-2 и TIMP-2 также описано у Caenazzo I. и др. в Nephrol. Dial. Transplant 2001, 16, 1769-75.

Поэтому все еще существует потребность в поиске активных ингредиентов для медицинских препаратов, полезных в снижении концентрации циркулирующих ММР в крови с целью лечения всех патологий, в которые вовлечены ММР, таких как патогенез воспаления, инфекционное, или неопластические, или сердечно-сосудистое заболевание. Среди этих патологий есть, например, патологии, вызванные диабетом, варикозное расширение вен, хроническая венозная недостаточность (CVI), атеросклероз, разрыв сердца после инфаркта миокарда, аневризма брюшной аорты, легочная патология, увеличение и развитие опухоли, врастание первичной опухоли, аномальный ангиогенез, экстравазации и интравазации неопластических клеток.

Сосудистые заболевания выбраны из группы варикозного расширения вен, атеросклероза у человека, разрыва сердца после инфаркта миокарда, аневризмы брюшной аорты.

Более того, существует потребность в получении лекарственных средств без каких-либо побочных или токсических эффектов при терапевтически эффективной дозировке, приемлемой для пациентов и вводимой пероральным путем, внутримышечной или внутривенной инъекцией для лечения всех патологий, в которые вовлечены ММР.

Неожиданно обнаружили, и это является предметом настоящего изобретения, что сулодексид или один из его компонентов, в частности дерматансульфат, полученный с помощью сулодексида (SDX-DS), или гепарин (SDX-HEP), полученный с помощью сулодексида, ингибирует и/или снижает уровень циркулирующих ММР.

Сулодексид представляет собой природную смесь природных гликозаминогликанов (GAG), экстрагированных из слизистой оболочки кишечника млекопитающих, как описано в US 3936351, которая содержит смесь быстродвижущегося гепарина (SDX-HEP) со средней молекулярной массой 7 кДа и дерматансульфата (SDX-DS) со средней молекулярной массой 25 кДа. Другие возможные компоненты, содержащиеся в сулодексиде, представляют собой хондроитинсульфат и гепарин. Сулодексид следует рассматривать в качестве уникального активного ингредиента, отличного от других гликозаминогликанов, содержащего примерно 80% по массе SDX-HEP и примерно 20% по массе SDX-DS. Эти компоненты до сих пор еще не выделены, и компоненты сулодексида определяют аналитическим способом, таким как гель-фильтрация и электрофорез.

Известно, что сулодексид демонстрирует высокую аффинность к антитромбину III (AT III) и кофактору II гепарина, ингибирует фактор Ха и тромбин, активирует тканевый плазминоген и снижает уровень фибриногена, как описано Ofosu F.A. в Semin. Thromb. Hemost. 24 (1998), 127-38 и Ceriello A. и др. в Diab, Nutr. Metab., 6 (1993), 1-4.

Поскольку известно, что активация плазмина из плазминогена представляет собой один из механизмов локальной активации ММР, известные свойства сулодексида приводят к выводу, что это соединение должно повышать концентрацию циркулирующих ММР.

В настоящем изобретении описан сулодексид или один из его компонентов, в частности SDX-DS или SDX-HEP, для ингибирования и/или снижения уровня циркулирующих ММР и, в частности ММР-9, известной также как желатиназа В, которые вовлечены во многие заболевания, в частности, инфекцию или неопластическое заболевание, сосудистое заболевание, характеризующееся высоким уровнем ММР, желудочно-кишечные язвы, увеличение и развитие опухоли, рост первичной опухоли, измененный ангиогенез, экстравазацию и интравазацию неопластических клеток и их комбинации. Что касается сосудистого заболевания, характеризующегося высоким уровнем ММР, то настоящее изобретение, в частности, относится к хронической венозной недостаточности (CVI), варикозному расширению вен, разрыву сердца после инфаркта миокарда, аневризме брюшной аорты, расслаблению вен, легочной патологии и неопластическим патологиям.

Другой неожиданный и важный аспект настоящего изобретения представляет собой дерматансульфат (SDX-DS) и низкомолекулярный гепарин (SDX-HEP), выделенный из сулодексида, способ их получения и их применение для ингибирования и/или снижения высвобождения ММР in vitro и in vivo, в отдельности или в их смеси.

Этот результат является действительно неожиданным, поскольку в литературе, например, в Cell Biol. Int. 2003, 27, 779-84, Isnard N. и др. сообщают, что дерматансульфат активирует экспрессию ММР-2 и ММР-9.

Неожиданные характеристики SDX-DS были продемонстрированы при сравнении с коммерческим дерматансульфатом, и результаты показаны в Примерах 2-9.

Эти результаты действительно делают сулодексид уникальным соединением, отличным от любых других гликозаминогликанов, которые могут быть получены с помощью низкомолекулярных гепаринов и дерматансульфатов, доступных на рынке, для лечения всех патологий, в которые вовлечены ММР.

Другой аспект настоящего изобретения относится к SDX-DS, выделенному из сулодексида.

Другой аспект настоящего изобретения относится к SDX-HEP, выделенному из сулодексида.

Другой конкретный аспект настоящего изобретения относится к дерматансульфату, полученному из сулодексида способом очистки, таким как аффинная хроматография с AT III-функционализированной средой.

Другой конкретный аспект настоящего изобретения относится к низкомолекулярному гепарину, полученному из сулодексида способом очистки, таким как аффинная хроматография с AT III-функционализированной средой.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим SDX-DS или SDX-HEP, и их применению в качестве лекарственного средства.

Описание изобретения

Предметом настоящего изобретения является сулодексид или один из его компонентов, в частности, SDX-DS или SDX-HEP, выделенный из сулодексида, и их применение в качестве лекарственного средства при всех патологиях, в которые вовлечены ММР. В частности, в изобретении описано применение сулодексида, или SDX-DS, или SDX-HEP для снижения уровня и/или ингибирования циркулирующих ММР, в частности, индуцибельной формы желатиназы ММР-9, с последующим уменьшением концентрации циркулирующих ММР в крови. Выделенные компоненты могут быть использованы для лекарственного средства либо по отдельности, либо в их смеси.

Сулодексид представлен в виде лекарственного средства, имеющегося в продаже под товарным знаком VESSEL 2F®, и его вводят пероральным путем, посредством внутримышечной или внутривенной инъекции для лечения сосудистых патологий с риском тромбоза, таких как расстройство периферических артерий, постфлебитный синдром, для лечения альбуминурии при нефропатии, как описано Harenberg J. в Med. Res. Rev. 18 (1998), 1-20 и Tamarin R. в Medical Praxis 8 (1997), 1.

Здесь также предусмотрено, что сулодексид и его производные, в частности SDX-DS и SDX-HEP, включают в себя их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, гидраты и клатраты.

Важным аспектом настоящего изобретения является специфичность сулодексида в ингибировании/снижении уровня ММР-9, называемой также желатиназой В, которая вовлечена в расслабление вен, варикозное расширение вен, хроническую венозную недостаточность (CVI) и язвы нижних конечностей.

Сулодексид, или SDX-DS, или SDX-HEP могут быть использованы в качестве активного ингредиента при всех патологиях, характеризующихся увеличением уровня индуцибельной ММР-9, без какого-либо влияния на конститутивную ММР-2. Преимуществом сулодексида или его компонентов является возможность введения пероральным или инъекционным путем, внутримышечным или внутривенным. Другим преимуществом сулодексида и его компонентов является возможность введения высокой дозировки без побочного эффекта, как описано в ЕР 1292315, которая хорошо переносится вплоть до 1000 мг/сутки и выше.

В настоящем изобретении описано новое применение сулодексида, или SDX-DS, или SDX-HEP для снижения и/или ингибирования концентрации ММР, в частности ММР-9 (желатиназа В, КФ 3.4.24.35 с мол. масс. 92, 130 и 225 кДа).

В настоящем изобретении описан сулодексид или один из его компонентов, в частности SDX-DS и SDX-HEP, для применения в ингибировании или снижении уровня ММР, в частности ММР-9, более чем на 20%.

В настоящем изобретении описаны количества сулодексида или SDX-DS или SDX-HEP, достаточные для достижения снижения и/или ингибирования высвобождения ММР-9 из клеток крови в циркулирующую плазму с последующим уменьшением активности циркулирующих ММР в венозном аппарате и последующим уменьшением ферментативной активности in situ в венозных стенках. Такой эффект имеет место при концентрации сулодексида in vitro и ex-vivo в диапазоне от 8 мкг/мл до 12 мкг/мл. Эти концентрации соответствуют терапевтически приемлемым дозировкам, которые могут достигаться в крови посредством введения сулодексида внутривенным, внутримышечным или пероральным путем при дозировках от 20 мг и вплоть до 1000 мг/сутки. Эффект сулодексида, SDX-DS, SDX-HEP на ММР в описанных концентрациях был продемонстрирован в экспериментах ex-vivo на биологических образцах.

Подробно, образцы крови брали от 50 здоровых добровольцев, мужчин и женщин. Образцы, которые обрабатывали для получения соответствующих образцов плазмы и сыворотки, анализировали с добавлением или без добавления варьирующей концентрации сулодексида SDX-DS и SDX-HEP.

В изобретении также описан SDX-DS, содержащийся в сулодексиде, в концентрации примерно 20% по массе, SDX-HEP в концентрации примерно 80%, способ их получения и применение в качестве лекарственного средства и для лечения всех патологий, в которые вовлечены ММР. SDX-DS и SDX-HEP могут быть получены способом очистки и экстракции.

В частности, в Примере 1 описан способ получения SDX-DS и SDX-HEP из сулодексида посредством очистки аффинной хроматографией, где гепариновую фракцию адсорбируют на стационарной фазе, функционализированной AT III, и дерматановую фракцию собирают в неадсорбированном элюате.

В Примере 2 описан эффект добавления в цельную кровь возрастающих количеств сулодексида до конечной концентрации от примерно 10 мкг/мл до примерно 50 мкг/мл и SDX-DS, экстрагированного из сулодексида, в конечной концентрации от примерно 0 мкг/мл до примерно 10 мкг/мл. После центрифугирования сыворотку из образцов цельной крови собирали и анализировали в желатиновой зимографии, как описано Mannello F. и др. в Clin. Chem. 2003, 49, 339-34. Для того чтобы нормализовать активности ММР в различных образцах, объем образцов доводили до одинаковых количеств общих белков. Денситометрические результаты желатиновой зимографии показаны в Таблице 2, где значение 100% приписано площади ММР из образцов сыворотки без добавления сулодексида или ингибитора ММР, и вычислено уменьшение площади ММР в присутствии сулодексида и SDX-DS. Было показано, что площадь полосы, соответствующей ММР-9, уменьшается по меньшей мере примерно на 20% при концентрации сулодексида, соответствующей примерно 10 мкг/мл, и до менее чем одна десятая при концентрации сулодексида, соответствующей примерно 50 мкг/мл.

Добавление сулодексида не влияет на концентрацию ММР-2.

Получается, что добавление сулодексида к образцам цельной крови до конечной концентрации в диапазоне от примерно 10 мкг/мл до примерно 50 мкг/мл снижает концентрацию циркулирующих ММР, в частности ММР-9, в соответствующих образцах сыворотки и пропорциональным образом, тогда как концентрация ММР-2 остается неизмененной.

В таблице 2 приведены также денситометрические результаты в образцах, обработанных SDX-DS, где площадь полосы, относящейся к ММР-9, уменьшается по меньшей мере примерно на 20% при концентрации, соответствующей примерно 2,5 мкг/мл, и по меньшей мере примерно на 60% при конечной концентрации примерно 10 мкг/мл.

Из этих результатов можно сделать вывод, что эффекту снижения/ингибирования ММР отдается предпочтение благодаря присутствию SDX-DS, содержащегося в сулодексиде, и эти результаты делают сулодексид уникальным активным ингредиентом среди гликозаминогликанов.

Эти данные также подтверждены количественным твердофазным иммуноферментным анализом, выполненным с использованием набора Biotrak® MMP Amersham, который распознает про-ММР желатиназы с пределом детекции (LOD, от англ. limit of detection), соответствующим 0,37-0,25 мкг/мл.

Таблица 3 подтверждает, что сулодексид при концентрации примерно 25 мкг/мл снижает по меньшей мере примерно на 20% площадь полосы, относящейся к ММР-9, и по меньшей мере примерно на 60% при концентрации примерно 50 мкг/мл. Добавление SDX-DS, полученного в Примере 1, снижает количества ММР по меньшей мере примерно на 20% при концентрации примерно 2,5 мкг/мл и по меньшей мере примерно на 60% при концентрации примерно 10 мкг/мл.

Демонстрация того, что сулодексид действует также на снижение высвобождения ММР тромбоцитами и лейкоцитами, очевидна в Примере 3, в котором сулодексид добавляют к образцам плазмы после удаления клеточного компонента цельной крови центрифугированием.

В Примере 3 описаны результаты, относящиеся к добавлению сулодексида к образцам крови, полученным от 50 здоровых добровольцев со средним возрастом 37 лет, ранее обработанным 0,13 М раствором цитрата натрия в количестве между 1% и 10% по объему и затем центрифугированным. К образцам супернатантов добавляли количества сулодексида до конечной концентрации от примерно 10 мкг/мл до 50 мкг/мл. Образцы анализировали с помощью желатиновой зимографии, как описано в Примере 2.

Значение, соответствующее 100%, приписывали полосе образца сыворотки без какого-либо добавления (контроль) и определяли пропорциональные уменьшения площади в зависимости от увеличивающихся количеств сулодексида в образцах сыворотки. Наблюдали, что прозрачные полосы переваривания желатина, относящиеся к протеолитической активности ММР-9, остаются неизменными после добавления сулодексида, как показано в Таблице 4 из Примера 3, и этот результат демонстрирует, что сулодексид не влияет на активность ММР, когда ферменты уже высвобождены в плазму.

Такой же результат получают, когда сулодексид добавляют к образцам сыворотки, как описано в Примере 4, в которые были добавлены возрастающие количества сулодексида. В частности, в Примере 4 описан эффект увеличивающихся количеств сулодексида от примерно 10 мкг/мл до примерно 50 мкг/мл, добавляемых к образцам сыворотки, полученной после центрифугирования образцов крови, взятых у 50 здоровых добровольцев со средним возрастом 37 лет. Полученные образцы сыворотки анализировали методом зимографии, как описано в Примере 2.

Относительные денситометрические значения желатинолитических площадей коррелировали с желати политически ми полосами ММР-2 и ММР-9, как показано в Таблице 5, где не наблюдалось никакого снижения относительно полос образца без добавления сулодексида.

В частности, полученные результаты из Примера 2 демонстрируют, что сулодексид и SDX-DS, содержащийся в сулодексиде, предотвращают увеличение и снижение уровня ММР в крови посредством механизма действия, который селективно действует на индуцибельную форму ММР-9, идентифицируя возможное терапевтического применение для лечения всех патологий, где присутствие ММР-9 прямо или опосредованно коррелирует с течением заболевания.

В Примере 5 описано сравнение между сулодексидом, парнапарином и SDX-DS, экстрагированным из сулодексида, по ММР, присутствующим в сыворотке. Образцы цельной крови, взятые от здоровых добровольцев, обрабатывали как в Примере 2, группу образцов обрабатывали сулодексидом до конечной концентрации примерно 25 мкг/мл, группу с дерматансульфатом - до конечной концентрации примерно 5 мкг/мл, и группу с низкомолекулярным гепарином (парнапарином) - до конечной концентрации примерно 20 мкг/мл. В Таблице 8 и Таблице 9 описаны результаты, полученные при зимографии и иммуноферментном анализе соответственно, где сулодексид демонстрирует снижение уровня ММР-9 в диапазоне от 50% до 70%, парнапарин в диапазоне от примерно 20% до 30%, и SDX-DS в диапазоне от примерно 50% до 70% относительно контрольного образца без какого-либо добавления.

Уникальное свойство сулодексида высвобождать ММР следует отнести к природной смеси GAG (гликозаминогликаны), которые представляют сулодексид.

Пример 6 подтверждает характеристики SDX-DS в снижении уровня ММР по сравнению с двумя различными дерматансульфатами, коммерчески доступными на рынке. В той же концентрации 5 мкг/мл SDX-DS индуцирует снижение уровня ММР-9 более чем на 50%, тогда как два коммерческих дерматансульфата (Sigma и Calbiochem) индуцируют снижение менее чем на 10%.

Обнаружили, что SDX-DS снижает уровень ММР, в частности ММР-9, по меньшей мере в три раза больше, чем коммерческие препараты DS.

Пример 7 демонстрирует, что SDX-HEP также имеет уникальные свойства, фактически, смесь низкомолекулярного гепарина и дерматансульфата, содержащаяся в сулодексиде, действуют иначе, чем синтетическая смесь, полученная путем добавления парнапарина к коммерческим дерматансульфату и SDX-DS.

Более подробно, сулодексид сравнивают со смесями низкомолекулярного гепарина и дерматансульфатов, смешанных примерно в таком же соотношении, какое имеет место в сулодексиде, примерно 80% парнапарина и примерно 20% дерматансульфата. Данные, представленные в Таблице 11, свидетельствуют о том, что сулодексид демонстрирует значительно более высокий процент ингибирования относительно смесей парнапарин/дерматансульфат и парнапарин/SDX-DS.

В частности, наблюдение, что сулодексид имеет превосходную активность относительно смеси гепарин/SDX-DS, позволяет продемонстрировать, что гепариновый компонент, содержащийся в сулодексиде, также имеет уникальные свойства, влияющие на уровень циркулирующих ММР.

Также была продемонстрирована способность сулодексида применительно к ММР на таком биологическом образце, как внутренняя стенка вен.

Внутренние стенки вен особенно важны, поскольку они являются местом действия ММР, вызывающих некоторые патологии, относящиеся к протеолитическому ремоделированию внеклеточного матрикса.

В Примере 8 показан сравнительный эффект сулодексида, SDX-DS и парнапарина на ММР на венозных стенках в иммуногистохимическом эксперименте. Этот эксперимент подтверждает эффект сулодексида и SDX-DS во всех патологиях, где вовлечены ММР, и, в частности, в снижении и/или ингибировании концентрации и экспрессии ММР. Добавляли сулодексид, SDX-DS и парнапарин в концентрации, соответственно, примерно 25 мкг/мл, 5 мкг/мл и 20 мкг/мл к сегментам подкожной вены ноги человека, хирургически полученным от 10 здоровых женщин (средний возраст 42 года), подвергнутым сафенэктомии в отношении варикозной вены.

После надлежащей обработки ткани, серийные срезы толщиной примерно 5 мкм инкубировали с моноклональным антителом против ММР-9, и после инкубации с биотинилированным вторичным антителом комплекс определяли с помощью пероксидазной реакции в соответствии со стандартными способами. Комплекс после инкубации детектировали с помощью авидин-пероксидазы в соответствии со стандартными способами.

Образцы ткани, обработанные сулодексидом, продемонстрировали уменьшенные площади окрашенной области, что демонстрирует более низкую локальную концентрацию ММР относительно контрольных и обработанных гепарином образцов.

Таблица 12 демонстрирует, что, если приписать значение, соответствующее 100, образцу без какой-либо добавки, то сулодексид в концентрации примерно 25 мкг/мл уменьшает интенсивность окрашенной области ММР-9 соответственно до примерно 60%; SDX-DS в концентрации примерно 5 мкг/мл уменьшает интенсивность до примерно 70%, и парнапарин в концентрации примерно 20 мкг/мл не уменьшает интенсивность ММР-9. Эти результаты in vitro в отношении сулодексида и SDX-DS можно перенести на применение in vivo и можно использовать для снижения уровня ММР при всех патологиях, в которые вовлечены ММР.

Пример 9 демонстрирует эффект сулодексида, SDX-DS и парнапарина на ММР в венозных стенках с помощью зимографии in situ (цитохимия).

Сулодексид, SDX-DS и парнапарин в концентрации, соответственно, примерно 25 мкг/мл, 5 мкг/мл и 20 мкг/мл добавляли к сегментам подкожной вены ноги человека, хирургически полученной от 10 здоровых женщин (средний возраст 42 года), подвергнутых сафенэктомии в отношении варикозной вены.

После обработки срезы вен инкубировали с субстратом, представляющим собой флуорогенный желатин, и протеолитическую активность наблюдали, сравнивая микроскопическое изображение участков вен при 530 нм.

В этих экспериментах уровень флуоресценции пропорционален активностям ММР в ткани, и результаты зимографии in situ представлены в Таблице 13.

Таблица 13 демонстрирует, что, если приписать значение, соответствующее 100, образцу без какой-либо добавки, то сулодексид в концентрации примерно 25 мкг/мл уменьшает интенсивность ММР-9 до примерно 50%; SDX-DS в концентрации примерно 5 мкг/мл уменьшает интенсивность ММР-9 до примерно 80%, и парнапарин в концентрации примерно 20 мкг/мл уменьшает интенсивность ММР-9 до примерно 40%.

Эффект сулодексида, SDX-DS и SDX-HEP на ткань вены в отношении снижения и/или ингибирования можно распространить на все ткани, где вовлечены ММР.

Например, сулодексид, SDX-DS и SDX-HEP также может быть использован в лечении кишечной язвы и другого поражения, относящегося к ММР, без ограничения.

С целью получения эффективных концентраций in vivo для снижения уровня ММР и, в частности, ММР-9, сулодексид можно вводить внутривенным путем, инъецируя из 1-4 флаконов раствора, содержащего примерно 60 мг/мл сулодексида с фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Альтернативно, сулодексид можно вводить в терапевтически эквивалентной дозировке внутримышечным или пероральным путем. В этом последнем случае можно вводить до 1000 мг/сутки и более высокие дозировки без каких-либо нежелательных явлений, как описано в ЕР 1292315.

Свойство сулодексида снижать уровень циркулирующих ММР и особенно селективное действие против ММР-9 представляет собой неизвестный и неожиданный эффект, в частности, полезный при всех патологиях, в которые вовлечены ММР, и, в частности, ММР-9, таких как сосудистое заболевание, хроническая венозная недостаточность (CVI), варикозное расширение вен, венозные язвы, легочные патологии, увеличение и развитие опухоли, врастание первичной опухоли, ангиогенез, экстравазации и интравазации неопластических клеток.

Описанные и неограничивающие эксперименты демонстрируют новое применение сулодексида, SDX-DS и гепариновой фракции сулодексида, для снижения/ингибирования высвобождения ММР, в частности ММР-9, высвобождаемой лейкоцитами и тромбоцитами, и ингибирования величин ММР во внутренних стенках вен. Результаты ex-vivo можно полностью перенести на применение сулодексида, SDX-DS и гепариновой фракции сулодексида in vivo с помощью фармацевтической композиции, содержащей сулодексид в количестве от примерно 20 до 1000 мг и выше; SDX-DS в количестве от примерно 4 мг до примерно 200 мг и выше; SDX-HEP в количестве от примерно 16 до примерно 700 и выше.

Более того, введение сулодексида, SDX-DS и SDX-HEP, можно осуществлять инъекционным путем, внутримышечным и/или внутривенным или пероральным путем, без ограничения.

Дозировка активного ингредиента: сулодексида, SDX-DS и SDX-HEP, может значительно варьироваться в зависимости от способа введения, возраста пациента, массы и общего состояния пациента, а также от тяжести заболевания, и может быть определена стандартными методами. В дополнение к этому, для идентификации возможных диапазонов дозировок можно использовать анализ in vitro и анализ на животных. Предпочтительно, фармацевтическая композиция находится в форме, приемлемой для перорального введения. Сулодексид, SDX-DS и гепариновая фракция сулодексида, по настоящему изобретению может содержаться в композиции в форме таблеток, капсул, гранулятов, суспензий, растворов или аэрозоля.

Пероральная фармацевтическая композиция может обеспечивать контролируемое высвобождение.

Пероральная фармацевтическая композиция может обеспечивать биоадгезивные свойства для увеличения мукоадгезивности.

Эксципиенты для перорального препарата выбраны из одного или более чем одного связующего агента, скользящего агента, разрыхлителя, разбавителя, природного агента.

Эксципиенты для перорального применения могут содержать разрыхлители, разбавители и их комбинации. Разрыхлители могут быть выбраны из кросповидона, натрия крахмала гликолата, кукурузного крахмала, производных целлюлозы и их комбинации. Разбавители могут быть выбраны из лактозы, маннита, ксилита, микрокристаллической целлюлозы, сахара, декстрина, гидрофильного углевода и их комбинации. Пероральная фармацевтическая форма может содержать биоадгезивные эксципиенты.

Таблетки могут дополнительно содержат оболочку, которая содержит гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, декстрин, мальтодекстрин, соединения на основе поливинилацетата, гидроксипропилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, фталат целлюлозы, их производное или их комбинацию.

Пероральная форма может также содержать ароматизаторы, красители или подсластители.

Фармацевтические композиции, содержащие сулодексид, или SDX-DS и SDX-HEP, в сравнении с известными и исследованными соединениями в отношении снижения/ингибирования контролируемого высвобождения ММР, обеспечивают многочисленные преимущества и решают многие проблемы, такие как специфическая селективность в отношении ММР-9, переносимость, безопасность и приемлемость.

Данное изобретение относится к новому терапевтическому применению, отличному от тех, для которых сулодексид имеется в продаже, в предупреждении сосудистых патологий с риском тромбоза.

В фармацевтической практике сулодексид, SDX-DS и SDX-HEP можно объединять с приемлемыми эксципиентами, используя общепринятые методы, известные специалисту.

Композицию можно вводить в отдельной или многократной дозировке, один или более чем один раз в сутки в композиции с контролируемым высвобождением.

В предшествующем уровне техники описано применение сулодексида при патологиях, относящихся к диабету, таких как диабетическая нефропатия, в то время как только теперь, после настоящего изобретения, можно иметь новое медицинское применение сулодексида.

Предметом настоящего изобретения также являются фармацевтические композиции, содержащие SDX-DS и SDX-HEP, полезные в лечении всех патологий, в которые вовлечены ММР, в частности ММР-9, без ограничения.

Конкретный аспект настоящего изобретения относится к указанному выше применению для лечения патологий, в которые вовлечено расслабление вен, например, образования варикозной вены, хронической венозной недостаточности; желудочно-кишечных язв, легочных патологий и неопластических патологий.

Другой конкретный и важный аспект настоящего изобретения относится к SDX-DS, выделенному из сулодексида, и его применению для ингибирования и/или снижения высвобождения ММР in vitro и in vivo.

Другой аспект этого изобретения относится к SDX-DS, полученному с помощью сулодексида, с использованием процесса очистки.

Другой конкретный аспект относится к получению SDX-DS посредством аффинной хроматографии с использованием AT III-функционализированной колонки.

Способ выделения SDX-DS включает следующие стадии:

а) приготовление аффинной хроматографической колонки с ATIII в концентрации от 5 до 10 мг/мл геля;

б) загрузка сулодексида в указанную колонку со стадии а) в концентрации от 0,1 до 5 мг/мл геля в буфере, содержащем 50 мМ TRIS и 50 мМ NaCl при рН 7,4;

в) объединение элюированных фракций дерматансульфата в неабсорбированной фракции и возможно лиофилизация указанного объединенного дерматансульфата;

г) возможно превращение указанного дерматансульфата в его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, клатрат.

Другой аспект этого изобретения относится к SDX-HEP, полученному с помощью сулодексида, с использованием процесса очистки.

Другой конкретный аспект относится к получению SDX-HEP посредством аффинной хроматографии с использованием AT III-функционализированной колонки.

Способ выделения SDX-HEP включает следующие стадии:

а) приготовление аффинной хроматографической колонки с ATIII в концентрации от 5 до 10 мг/мл геля;

б) загрузка сулодексида в концентрации от 0,1 до 5 мг/мл геля в буферном растворе, содержащем 50 мМ TRIS и 50 мМ NaCl при рН 7,4;

в) элюирование низкомолекулярного гепарина с указанной хроматографической колонки буферным раствором, содержащим 50 мМ TRIS и 3 М NaCl при рН 7,4;

г) объединение элюированной фракции низкомолекулярного гепарина и возможно лиофилизация указанного объединенного гепарина;

д) возможно превращение указанного низкомолекулярного гепарина в его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, клатрат.

Другой конкретный и важный аспект настоящего изобретения относится к SDX-HEP и его применению для ингибирования и/или снижения высвобождения ММР in vitro и in vivo.

Другой аспект относится к фармацевтическим композициям, содержащим сулодексид, в твердой форме, суспензии, грануле, аэрозоле для лечения патологий, в которые вовлечены ММР и уровень которых должен быть снижен.

Другой аспект относится к наборам, содержащим фармацевтическую композицию, содержащую сулодексид, SDX-DS и SDX-HEP.

Другой аспект относится к применению фармацевтических композиций, содержащих сулодексид или один из его компонентов, в частности SDX-DS или SDX-HEP, или их смесь, в дозировке, подходящей для введения по меньшей мере примерно 5 мг/сутки. Примеры суточных дозировок представляют собой от 5 до 1000 мг/сутки, от 15 до 800 мг/сутки, от 50 до 200 мг/сутки, от 20 до 1000 мг/сутки или более за одно или более введений, без ограничения.

Предпочтительная суточная дозировка для SDX-DS составляет от 1 мг до 300 мг или более, в частности, от 4 мг до 300 мг, за одно или более введений, без ограничения.

Предпочтительная суточная дозировка для SDX-HEP составляет от 16 мг до 900 мг или более, в частности от 19 мг до 800 мг, за одно или более введений, без ограничения.

Фармацевтическую композицию, содержащую сулодексид, SDX-DS и SDX-HEP, можно вводить пациентам, которые получают сопутствующие терапии, без какого-либо отрицательного эффекта.

Применение сулодексида, SDX-DS и SDX-HEP, описанное в настоящем изобретении, следует считать новым медицинским применением для лечения всех патологий, где вовлечены ММР, и требуется их снижение и/или ингибирование. Применение сулодексида, SDX-DS и гепариновой фракции сулодексида, в сравнении с соединениями, ранее исследованными в предшествующем уровне техники, преодолевает несколько важных проблем, таких как специфическая селективность в отношении ММР-9, соблюдение пациентом режима лечения и легкость введения.

Это изобретение подробно описано в следующих примерах, которые не следует рассматривать в качестве ограничивающих данное изобретение.

Графические материалы

Фиг.1: Гель-фильтрационный профиль сулодексида;

Фиг.2: Гель-фильтрационный профиль дерматансульфата, полученного с помощью сулодексида;

Фиг.3: Гель-фильтрационный профиль гепарина, полученного с помощью сулодексида.

Пример 1

Способ получения дерматансульфатной фракции из сулодексида

Количество сулодексида, экстрагированного из слизистой оболочки кишечника животного, соответствующее 8 мг, растворяли в буфере для связывания, содержащего 50 мМ TRIS и 50 мМ NaCl при рН 7,4, и наносили на аффинную колонку, полученную путем сочетания 7,5 мг ATIII/мл CNBr-активированного Сефарозного геля (GE).

Колонку промывали тем же буферным раствором, и абсорбированное вещество элюировали буферным раствором, состоящим из 50 мМ TRIS и 3 М NaCl при рН 7,4.

Фракцию дерматансульфата собирали в неабсорбированном веществе, присутствующем в элюате, тогда как гепариновую фракцию собирают в элюированных фракциях.

Фракцию дерматансульфата и гепарина можно хранить при -20° или можно лиофилизировать.

Объединенные фракции гепарина и объединенные фракции дерматансульфата анализировали в гель-фильтрационной хроматографии (GPC) и в агарозном геле.

Хроматографические профили получали в системе ВЭЖХ HP 1090, снабженной колонкой GPC с гелем TSK, G2000 SWXL (7,8×300 мм), элюируя с помощью 0,2 М Na₂SO₄, pH 5, при скорости потока, соответствующей 0,2 мл/мин, и определяя с помощью детектора показателя преломления (RI, Refraction Index).

На Фиг.1 показаны Хроматографические профили сулодексида, нанесенного на аффинную хроматографию, с широким хроматографическим профилем GPC с максимальным острым пиком при RT (время удерживания), соответствующим примерно 30 мин.

На Фиг.2 показана фракция дерматансульфата, присутствующая в элюате аффинной хроматографии, с более коротким пиком, имеющим максимум при RT примерно 27 мин.

На Фиг.3 показана фракция гепарина, элюированная посредством аффинной хроматографии, которая характеризуется широким пиком.

Анализ в агарозном геле осуществляли путем растворения агарозы в концентрации 0,6% (масс./об.) в барий-ацетатном буфере 0,04 М, pH 5,8. Теплый раствор помещали на стеклянную пластину с размерами примерно 7,5 см×4,5 см и сулодексид, SDX-DS и SDX-HEP в концентрации примерно 10 мг/мл, содержащий небольшое количество красителя крезола красного, наносили на агарозный гель. Электрофоретическое разделение осуществляли в две стадии: первую стадию в барий-ацетатном буфере 0,04 М pH 5,8 при 100 В в течение примерно 25 мин и вторую стадию в 1,3-диаминопропане 0,05 М, pH 9 при 110 В в течение примерно 30-40 минут. Затем пластину погружали в фиксирующий раствор, состоящий из 0,1%-ного (масс./об.) цетилпиридиния хлорида в воде на примерно 3 часа. После сушки пластины теплым воздухом пластину погружали в окрашивающий раствор, состоящий из 0,1%-ного (масс./об.) толуидина синего в смеси этанол/вода/уксусная кислота 50:50:1 (об./об./об.), обесцвечивали в том же растворе без красителя и сушили теплым воздухом.

Относительная подвижность (Rf) сулодексида, его выделенных компонентов SDX-DS и SDX-HEP и коммерческого дерматансульфата представлена в Таблице 1.

Пример 2

Эффект сулодексида на циркулирующие ММР в образцах крови

Образцы крови, взятые от 50 здоровых добровольцев, 25 женщин и 25 мужчин, в возрасте между 25 и 58 годами, средний возраст 37 лет, помещали в тест-пробирки и получали две совокупности образцов; в первую совокупность добавляли варьирующееся количество сулодексида до получения конечной концентрации, соответствующей 0, 12, 24 или 48 мкг/мл, во вторую совокупность добавляли варьирующиеся количества дерматана, полученного как в Примере 1, до конечной концентрации, соответствующей 0, 2,5, 5 или 10 мкг/мл. Образцы без добавления сулодексида и дерматана использовали в качестве контроля, и полосам ММР этих образцах приписывали произвольное значение интенсивности 100%. Интенсивность полос ММР обработанных образцов выражали в процентах относительно необработанных образцов.

Итоговые образцы центрифугировали при 1550 g в течение 10 минут при 4°C, количество супернатантов образцов сыворотки (S), соответствующее 150 мкг суммарного белка, определяемого по Брэдфорду, анализировали с помощью желатиновой зимографии. Образцы наносили на гель для зимографии, и разделение в электрофорезе сравнивали со стандартом ММР, полученным путем разведения капиллярной крови от здоровых добровольцев 15 объемами буфера Laemmli U.K (Nature, 227 (1970), 680-685) в невосстанавливающих условиях.

Зимограммы в желатине получали в 7,5%-ном (масс./об.) полиакриламиде, содержащем 0,2% (масс./об.) желатина, выделенного из свиной кожи (Тип А 90 Bloom, Sigma).

Электрофорез осуществляли при 35 мВ в течение 75 минут, гели промывали растворами Тритона Х-100 в концентрации 2,5% (об./об.) и инкубировали в течение 24 часов при 37°C в растворе, содержащем 50 мМ TRIS-HCl, рН 7,5, 5 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl, 1 мМ ZnCl₂, 0,3 мМ NaN₃, 0,02% (масс./об.) детергента Brij®-35 и 0,25% (об./об.) Тритона Х-100. Детектирование желатиназной активности in situ осуществляют путем окрашивания гелей Coomassie Brilliant blue R-250 в концентрации 0,2% (масс./об.) и затем обесцвечивания раствором метанол-уксусная кислота в объемном соотношении 80/20.

Сулодексид и SDX-DS, полученный как в Примере 1, действует только на полосу, относящуюся к ММР-9, тогда как интенсивность полосы ММР-2 остается неизменной относительно контроля, и ей приписывают значение 100%. Вычисление площадей осуществляли с помощью денситометра с анализатором изображений. В Таблице 1 представлены площади в процентах желатинолитического переваривания, связанного с ММР-9, в образцах сыворотки с сулодексидом или без него, с фракцией дерматана или без нее.

Концентрации ММР-9 в образцах определяют также в ELISA для измерений ферментативной активности металлопротеиназы, используя анализ MMP Biotrack (Amersham), который распознает формы про-ММР желатиназы с LOD (предел обнаружения, от англ. limit of detection) 0,37-0,25 мкг/л для ММР-9 и ММР-2. Полученные результаты представлены в Таблице 2. Эти результаты ELISA не показывают статистически значимых отличий от желатинолитической активности, обнаруженной при зимографии.

Пример 3

Эффект сулодексида на количества циркулирующих MMP в плазме

Образцы крови брали от 50 здоровых добровольцев, 25 женщин и 25 мужчин, в возрасте между 25 и 58 годами, средний возраст 37 лет, и 1 мл каждого образца добавляли к 38 мкл 0,13 М раствора цитрата натрия и центрифугировали при 1550 g в течение 10 минут при 4°С.

Увеличивающиеся количества сулодексида добавляют к образцам до получения конечной концентрации, соответствующей 0, 12, 24 и 48 мкг/мл.

Количество, соответствующее 150 мкг суммарного белка из супернатантов образцов плазмы (Р), полученной центрифугированием, измеренное по Брэдфорду, анализируют с помощью желатиновой зимографии. На гель наносят стандарт желатиназы, полученный путем разведения капиллярной крови здоровых добровольцев 15 объемами буфера Laemmli, в невосстанавливающих условиях.

Зимограммы в желатине получали и электрофорез осуществляли, как описано в Примере 2.

Площади полос на зимограммах определяли с помощью денситометра с анализатором изображений, вычисляя увеличение площади полос, относящихся к металлопротеиназе, по сравнению с полосами для плазмы без добавления сулодексида. Площади в процентах желатинолитического переваривания, относящегося к ММР-9, в образце крови с сулодексидом или без него представлены в Таблице 4.

Денситометрический анализ ММР-9 на зимограмме подтверждают количественным ELISA-анализом, данные которого, представленные в Таблице 4, не показывают значительных отличий в сравнении с денситометрическим анализом зимограммы.

Пример 4

Эффект сулодексида на количества циркулирующих ММР в сыворотке после образования сыворотки

Образцы крови, взятые от 50 здоровых добровольцев, 25 женщин и 25 мужчин, в возрасте между 25 и 58 годами, средний возраст 37 лет, помещают в тест-пробирку и центрифугируют при 1500 g в течение десяти минут при 4°С.

Возрастающие количества сулодексида добавляют к 150 мкг белка сыворотки, измеренного по Брэдфорду, для получения конечной концентрации сулодексида, соответствующей 0, 12, 24, 48 мкг/мл. Полученные образцы анализируют с помощью желатиновой зимографии в сравнении со стандартом желатиназы, полученным путем разведения капиллярной крови от здоровых добровольцев 15 объемами буфера Laemmli, в невосстанавливающих условиях.

Получение зимограмм, электрофорез и окрашивание/обесцвечивание осуществляют, как описано в Примере 2.

Площади полос на зимограммах определяют с помощью денситометра, с анализатором изображений, вычисляя уменьшение площади полос, относящихся к металлопротеиназе, по сравнению с таковыми для сыворотки без добавления сулодексида. Площади в процентах желатинолитического переваривания, относящегося к ММР, в образце сыворотки с сулодексидом или без него, представлены в Таблице 6.

Данные, полученные зимографией, не показывают значительных отличий в сравнении с данными, полученными с помощью ELISA, как представлено в Таблице 7.

Пример 5: Сравнительный пример

Оценка сулодексида, дерматансульфата, полученного как в Примере 1, и парнапарина

Образцы крови, полученные как описано в Примере 2, разделяли на три группы, где одну группу обрабатывали сулодексидом в конечной концентрации, соответствующей 24 мкг/мл, одну группу обрабатывали парнапарином в конечной концентрации, соответствующей 5 мкг/мл, и последнюю группу обрабатывали дерматановой фракцией, полученной как в Примере 1, в концентрации 5 мкг/мл, и сравнивали по зимографии и ELISA.

Результаты представлены в Таблице 8 и Таблице 9.

Эти Примеры подтверждают эффект сулодексида и дерматансульфатной фракции, присутствующей в сулодексиде, в снижении и/или ингибировании ММР, в частности ММР-9.

Пример 6: Сравнительный пример

Сравнение между коммерческим дерматансульфатом и дерматансульфатом, полученным как в Примере 1

Образцы крови, полученные, как описано в Примере 2, разделяли на три группы, где первую группу обрабатывали коммерческим дерматансульфатом от Sigma Aldrich (Италия); вторую группу обрабатывали дерматансульфатом от Calbiochem (Италия), и третью обрабатывали DS, экстрагированным из сулодексида, как в Примере 1, где все конечные концентрации соответствуют 5 мкг/мл. Образцы анализировали в ELISA, как в Примере 2, и конечные результаты представлены в Таблице 10.

Пример 7: Сравнительный пример

Сравнение между коммерческим дерматансульфатом и дерматансульфатом, полученным как в Примере 1

Образцы крови, полученные, как описано в Примере, 2 разделяли на пять групп:

Группа 1: образец крови с коммерческим парнапарином в концентрации 19 мкг/мл;

Группа 2: образец крови с сулодексидом в концентрации 24 мкг/мл;

Группа 3: образец крови с DS, полученным с помощью сулодексида, как в Примере 1, в концентрации 5 мкг/мл;

Группа 4: образец крови со смесью парнапарина в концентрации 19 мкг/мл и DS, полученного с помощью сулодексида, как в Примере 1, в концентрации 5 мк/мл;

Группа 5: образец крови со смесью парнапарина в концентрации 19 мкг/мл и коммерческого DS в концентрации 5 мкг/мл.

Образцы анализировали в ELISA, как описано в Примере 2, и результаты представлены в Таблице 11.

Снижение уровня ММР-9 вычисляли в отношении образцов без какой-либо добавки, которым приписывали величины площади, соответствующие 100%.

Коммерческие DS от Sigma и Calbiochem показали одинаковые результаты.

Пример 8

Оценка сулодексида, дерматансульфата (SDX-DS) и парнапарина ввенозных стенках ex-vivo при иммуногистохимии

Сегменты подкожных вен ноги человека, хирургически полученные от 10 здоровых женщин (средний возраст 42 года), подвергнутых сафенэктомии в отношении варикозных вен, поддерживали в стерильных условиях в CO₂-инкубаторе (5% CO₂ при 37°C в течение 24 часов) в 0,9% NaCl и разделяли на три части. Первую часть обрабатывали сулодексидом в концентрации 24 мкг/мл; вторую часть обрабатывали парнапарином в концентрации 19 мкг/мл и третью часть обрабатывали SDX-DS, полученным как в Примере 1, в концентрации 5 мкг/мл. Сегменты вены фиксировали в 10%-ном растворе формалина, обрабатывали и помещали в парафин. Готовые парафиновые блоки ориентировали перпендикулярно относительно первоначального направления кровотока, затем нарезали на поперечные срезы толщиной 5 мм и размещали на покровных стеклах, покрытых 3-аминопропилтриэтоксисиланом. Участок венозной стенки нарезали на серийные срезы толщиной 5 мкм. Серийные срезы исследовали путем окрашивания на эластин по Миллеру и гематоксилином и эозином по ван Гисону и Харрису. Срезы подвергали белковому блокированию нормальной козьей сывороткой и затем в течение ночи инкубировали при 4°C, с первичным моноклональным антителом против ММР-9 (Santa Cruz), разбавленным 1:50 забуференным фосфатами физиологическим раствором (PBS).

Затем срезы вен инкубировали с вторичным антителом (биотинилированное козье антитело против IgG мыши) в качестве стандартных методов и использовали комплекс авидин-биотин-пероксидаза.

После промывки в PBS срезы вены окрашивали раствором DAB (диаминобензидин) и H₂O₂ стандартным способом.

Затем срезы подвергали контрастирующему окрашиванию гематоксилином по Майеру, обезвоживали, осветляли и фиксировали. В каждую окрашиваемую партию всегда включали положительные и отрицательные контроли для обеспечения соответствия между последовательными сериями.

Изображения получали с помощью электронного микроскопа (40×) и результаты суммировали в Таблице 12. Интенсивность цвета измеряли с помощью оптического контроля, приписывая значение 100 ткани без какой-либо добавки (контроль), и оценивали визуальное ослабление черного цвета, определяемое под влиянием SDX-DS, SDX-HEP и парнапарина. Результаты представлены в Таблице 12.

Пример 9

Оценка ex vivo сулодексида, дерматансульфата и парнапарина в венозных стенках зимографией in situ (цитохимия)

Сегменты подкожных вен ноги человека, хирургически полученные от 10 здоровых женщин (средний возраст 42 года), подвергнутых сафенэктомии в отношении варикозных вены, поддерживали в стерильных условиях в CO₂-инкубаторе (5% CO₂ при 37°C в течение 24 часов) в 0,9% NaCl и разделяли на три части. Первую часть обрабатывали сулодексидом в концентрации 24 мкг/мл; вторую часть обрабатывали парнапарином в концентрации 19 мкг/мл и третью часть обрабатывали SDX-DS, полученным как в Примере 1, в концентрации 5 мкг/мл. Сегменты вены фиксировали в 10%-ном растворе формалина, обрабатывали и помещали в парафин. Готовые парафиновые блоки ориентировали перпендикулярно относительно первоначального направления кровотока, нарезали на поперечные срезы толщиной 5 мм и размещали на покровных стеклах, покрытых 3-аминопропилтриэтоксисиланом. Сегменты венозной стенки нарезали на серийные срезы толщиной 5 мкм.

Срезы сосудов инкубировали при 37°C в течение 5 часов с флуорогенным желатиновым субстратом (DQ Gelatin, Molecular probes) в концентрации 25 мкг/мл в буфере, содержащем 50 мМ TR1S-HCl, рН 7,5; 5 мМ CaCl₂; 100 мМ NaCl; 1 мМ ZnCl₂; 0,3 мМ NaN₃.

Протеолитическую активность наблюдали in situ, сравнивая венозные сегменты при 530 нм и идентифицируя их по зеленой флуоресценции. Данные денситометрического анализа с помощью зимографии in situ в ткани вены посредством цитохимического окрашивания ММР-9 флуорогенным желатином в присутствии SDX-DS, SDX-HEP и парнапармна относительно контроля представлены в Таблице 13. Значение 100 приписывали ткани без какой-либо добавки и измеряли снижение флуоресценции после добавления SDX-DS, SDS-HEP и парнапарина.

Реферат

Изобретение относится к применению дерматансульфата, выделенного из сулодексида для лечения заболеваний, в которые вовлечена металлопротеиназа ММР-9: варикозного расширения вен и сосудистых патологий с риском тромбоза. Технический результат: показано снижение и/или ингибирование ММР-9 в сыворотке крови и в сегментах подкожных вен ноги человека. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 13 табл.

Формула