Патенты

Иммуноконъюгаты, содержащие антитела против her2 и пирролбензодиазепины - RU2727663C2

Код документа: RU2727663C2

Чертежи

Показать все 13 чертежа(ей)

Описание

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке США № 62/051562, поданной 17 сентября 2014 года, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[002] Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла под названием ʺ2015-09-16_01146-0039-00PCT_Sequence_Listing_ST25.txtʺ созданного 15 сентября 2015 года, размером 76214 байт. Информация о перечне последовательностей в электронном формате в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[003] Настоящее изобретение относится к иммуноконъюгатам, содержащим антитела против HER2 и способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[004] Рак молочной железы является весьма существенной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Каждый год около 1,3 миллиона случаев рака молочной железы диагностируется в мире с более чем 450000 смертей, связанных с заболеванием (Jemal A, Bray F, Center M, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011; 61(2):69-90).

[005] Тирозинкиназа рецептора HER2 (ErbB2) является членом семейства трансмембранных рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR). Сверхэкспрессия HER2 наблюдается примерно в 20% случаев рака молочной железы человека и является причиной агрессивного роста и плохих клинических результатов, связанных с данными опухолями (Slamon et al (1987) Science 235:177-182). Сверхэкспрессия белка HER2 может быть определена с использованием иммуногистохимического метода оценки фиксированных блоков опухоли (Press MF, et al (1993) Cancer Res 53:4960-70).

[006] Трастузумаб (CAS 180288-69-1, HERCEPTIN®, huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Genentech) представляет собой рекомбинантное ДНК-производное, IgG1 каппа, моноклональное антитело, которое является гуманизированным вариантом мышиного антитела к HER2 (4D5), селективно связывающееся, с высокой аффинностью, в исследовании на клетках (Kd=5 нМ) с внеклеточным доменом HER2 (US 5677171, US 5821337, US 6054297, US 6165464, US 6339142, US 6407213, US 6639055, US 6719971, US 6800738, US 7074404; Coussens et al (1985) Science 230:1132-9; Slamon et al (1989) Science 244:707-12; Slamon et al (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792). Трастузумаб, как было показано, в обоих in vitro анализах и на животных, ингибирует пролиферацию опухолевых клеток человека, в которых присутствует ген HER2 (Hudziak et al (1989) Mol Cell Biol 9:1165-72; Lewis et al (1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga et al (1998) Cancer Res. 58:2825-2831). Трастузумаб является посредником антителозависимой клеточной цитотоксичности - АЗКЦ (Lewis et al (1993) Cancer Immunol Immunother 37(4):255-263; Hotaling et al (1996) [abstract]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram MD, et al (1997) [abstract]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602; Sliwkowski et al (1999) Seminars in Oncology 26(4), Suppl 12:60-70; Yarden Y. and Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., Vol. 2:127-137).

[007] HERCEPTIN® был утвержден в 1998 году для лечения пациентов с HER2-сверхэкспрессирующим метастатическим раком молочной железы (Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744), которые получали экстенсивную терапию предшествующую противораковой терапии, и с тех пор был применен к более чем 300000 пациентов (Slamon DJ, et al. N Engl J Med 2001;344:783-92; Vogel CL, et al. J Clin Oncol 2002;20:719-26; Marty M, et al. J Clin Oncol 2005;23:4265-74; Romond EH, et al. T N Engl J Med 2005;353:1673-84; Piccart-Gebhart MJ, et al. N Engl J Med 2005;353:1659-72; Slamon D, et al. [abstract]. Breast Cancer Res Treat 2006, 100 (Suppl 1): 52). В 2006 году FDA (Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов) одобрило HERCEPTIN® (трастузумаб, компании Genentech Inc.) в качестве части схемы лечения, включающей доксорубицин, циклофосфамид и паклитаксел для адъювантной терапии пациентов с HER2-позитивным раком молочной железы с поражением лимфоузлов.

[008] Трастузумаб-MCC-DM1 (T-DM1, трастузумаб эмтанзин, адо-трастузумаб эмтанзин, KADCYLA®) - новый конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) для лечения HER2-позитивного рака молочной железы, состоящий из цитотоксического агента DM1 (тиол-содержащего майтанзиноидного анти-микротрубочкового агента) конъюгированного с трастузумабом на боковой цепи лизина путем линкера MCC при среднем содержании лекарственного средства (отношение лекарственное средство:антитело) равным около 3,5. После связывания с HER2 экспрессируемым на опухолевых клетках, T-DM1 проходит рецептор-опосредованную интернализацию, вызывая внутриклеточное высвобождение цитотоксических катаболитов, содержащих DM1 и последующую гибель клетки.

[009] 22 февраля 2013 года Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов США одобрило адо-трастузумаб эмтанзин, продаваемый под торговой маркой KADCYLA®, для лечения пациентов с HER2-позитивным, метастатическим раком молочной железы, которые ранее получали лечение трастузумабом и таксаном.

[0010] Пертузумаб (также известный как рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело 2C4, rhuMAb 2C4, PERJETA®, Genentech, Inc, Южный Сан-Франциско) представляет собой первый в новом классе агентов известных как ингибиторы димеризации рецептора HER (HDI) и функционирует для ингибирования способности HER2 образовывать активные гетеродимеры или гомодимеры с другими рецепторами HER (такими как EGFR/HER1, HER2, HER3 и HER4). См., например, Harari and Yarden Oncogene 19:6102-14 (2000); Yarden and Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37 (2001); Sliwkowski Nat Struct Biol 10:158-9 (2003); Cho et al. Nature 421:756-60 (2003); и Malik et al. Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003).

[0011] Было показано, что пертузумабная блокада формирования гетеродимеров HER2-HER3 в опухолевых клетках ингибирует критический клеточный сигналинг, что приводит к снижению пролиферации и выживания опухоли (Agus et al. Cancer Cell 2:127-37 (2002).

[0012] Пертузумаб был оценен в исследованиях II фазы в комбинации с трастузумабом у пациентов с HER2-позитивным метастатическим раком молочной железы, которые ранее получали трастузумаб для метастатического заболевания. Одно исследование, проведенное Национальным Институтом рака (НИР), включало 11 пациентов с ранее леченным HER2-позитивным метастатическим раком молочной железы. У двух из 11 пациентов проявился частичный ответ (ЧО) (Baselga et al., J Clin Oncol 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings; 25:18 S (June 20 Supplement): 1004. Результаты II фазы неоадъювантного исследования по оценке влияния новой комбинацией препаратов пертузумаб и трастузумаб+химиотерапия (Доцетаксел) у женщин с ранними стадиями HER2-позитивного рака молочной железы, представленные на CTRC-AACR симпозиуме по раку молочной железы Сан-Антонио (SABCS), 8-12 декабря 2010 года, продемонстрировали, что два HER2 антитела вместе с Доцетакселом, применяемые в неоадъювантной терапии до операции, значительно улучшают скорость полного исчезновения опухоли (степень патологического полного ответа (pCR) на 45,8 процента) молочной железы более чем вдвое по сравнению с трастузумабом вместе с Доцетакселом (pCR, равный 29,0 процента), p=0,014.

[0013] Пертузумаб, который продается под торговой маркой PERJETA®, был утвержден в 2012 году для лечения пациентов с прогрессирующей или поздней стадией (метастатического) HER2-позитивного рака молочной железы. HER2-позитивный рак молочной железы характеризуется повышенным количеством белка HER2, который способствует росту и выживанию раковых клеток.

[0014] 30 сентября 2013 года Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов выдано ускоренное одобрение для PERJETA® (пертузумаб) в качестве части схемы лечения для пациентов с ранней стадией рака молочной железы (EBC) перед операцией (неоадъювантная терапия). PERJETA® представляет собой первое одобренное FDA лекарственное средство для неоадъювантного лечения рака молочной железы.

[0015] В данной области техники существует потребность в дополнительных безопасных и эффективных препаратах, нацеленных на HER2 для лечения HER2-ассоциированных состояний, таких как рак молочной железы, для применения в виде монотерапии и комбинированной терапии. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность и обеспечивает другие преимущества.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0016] В настоящем изобретении предложены иммуноконъюгаты, содержащие антитела против HER2 и способы их применения.

[0017] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается иммуноконъюгат, содержащий антитело и цитотоксический агент, причем цитотоксический агент представляет собой центр-сшитый пирролобензодиазепин. В некоторых вариантах реализации изобретения иммуноконъюгат имеет формулу Аb-(L-D)p, где:

а) Аb представляет собой антитело по любому из пп. 1-16;

b) L представляет собой линкер;

c) D представляет собой центр-сшитый пирролбенздиазепин ; и

d) p находится в диапазоне 1-8.

В некоторых вариантах реализации изобретения, L-D имеет Формулу A:

где:

R2 представлять собой

, где R36a и R36b независимо выбирают из H, F, C1-4 насыщенного алкила, C2-3 алкенила, причем алкильные и алкенильные группы необязательно замещены группой, выбранной из C1-4алкиламидо и C1-4 сложного алкилового эфира; или, где один из R36a и R36b представляет собой H, другой независимо выбирают из нитрила и C1-4 сложного алкилового эфира;

R6 и R9 независимо выбирают из H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn и галогена;

R7 независимо выбирают из H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn и галогена;

Y обладает формулой:

G представляет собой линкер, соединенный с антителом;

n равен целому числу, выбранному в диапазоне 0-48;

RA4 представляет собой C1-6алкиленовую группу;

или:

(a) R10 представляет собой H, и R11 представляет собой OH, ORA, где RA представляет собой C1-4 алкил; или

(b) R10 и R11 образуют азот-углеродную двойную связь между атомами азота и углерода, с которыми они связаны; или

(c) R10 представляет собой H и R11 представляет собой OSOzM, где z представляет собой 2 или 3 и M представляет собой одновалентный фармацевтически приемлемый катион;

R и R' каждый независимо выбирают из необязательно замещенных C1-12 алкильной, C3-20 гетероциклильной и C5-20 арильной групп, и необязательно по отношению к группе NRR', R и R' совместно с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенное 4-, 5-, 6- или 7-членное гетероциклическое кольцо;

R16, R17, R19, R20, R21и R22 соответствуют определению R6, R7, R9, R10R11и R2 соответственно;

Z представляет собой CH или N;

T и T'' независимо выбирают из одинарной связи или C1-9 алкилена, где цепь может быть прервана одним или несколькими гетероатомами, например, O, S, N(H), NMe, при условии, что число атомов в самой короткой цепи атомов между X и X ' составляет от 3 до 12 атомов; и

X и X' независимо выбирают из O, S и N(H); и

при этом антитело связывается с HER2 и содержит (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 11 и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой гуманизированное или химерное антитело. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой фрагмент антитела, который связывает HER2.

[0018] В некоторых вариантах реализации изобретения HER2 представляет собой HER2 человека, содержащий аминокислоты 23-1255 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело связывается с внеклеточным доменом I HER2. В некоторых вариантах реализации изобретения внеклеточный домен I HER2 имеет последовательность SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело связывается с петлей 163-189 и петлей 185-189 внеклеточного домена I (например, с первой петлей, определенной аминокислотами 163-189 и второй петлей, определенной аминокислотами 185-189 внеклеточного домена I). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело вступает в контакт с His171, Ser186, Ser187 и Glu188 внеклеточного домена I.

[0019] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой антитело IgG1, IgG2a или IgG2b. В любом из вариантов реализации изобретения, описанных в настоящем документе, антитело может содержать один или более модифицированных свободных аминокислотных остатков цистеина. В любом из вариантов реализации изобретения, описанных в настоящем документе один или более модифицированных свободных аминокислотных остатков цистеина могут располагаться в тяжелой цепи. В любом из вариантов реализации изобретения, описанных в настоящем документе один или более модифицированных свободных аминокислотных остатков цистеина могут располагаться в легкой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит по меньшей мере одну мутацию в константном участке тяжелой цепи, выбранную из A118C и S400C. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит по меньшей мере одну мутацию в константном участке легкой цепи, выбранную из K149C и V205C.

[0020] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит:

a) тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18; или

b) тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 23; или

c) тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 24 и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит константный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит константный участок легкой цепи SEQ ID NO: 25.

[0021] В некоторых вариантах реализации изобретения иммуноконъюгат содержит антитело, которое связывается с HER2, причем антитело содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах реализации изобретения предложено выделенное антитело, которое связывается с HER2, причем антитело содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 24 и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18.

[0022] В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгата R9 представляет собой H. В некоторых вариантах реализации изобретения R6 представляет собой H. В некоторых вариантах реализации изобретения R7 представляет собой OR7A, где R7A представляет собой необязательно замещенный C1-4 алкил. В некоторых вариантах реализации изобретения R7A представляет собой Me. В некоторых вариантах реализации изобретения X представляет собой O. В некоторых вариантах реализации изобретения T выбирают из одинарной связи, C1 и C2 алкиленовой группы. В некоторых вариантах реализации изобретения T представляет собой C1 алкиленовую группу. В некоторых вариантах реализации изобретения R36a и R36b оба представляют собой H. В некоторых вариантах реализации изобретения R36a и R36b оба представляют собой метил. В некоторых вариантах реализации изобретения один из R36a и R36b представляет собой H, а другой выбирают из C1-4 насыщенного алкила, C2-3 алкенила, где алкильные и алкенильные группы необязательно замещены. В некоторых вариантах реализации изобретения группу R36a и R36b, не являющуюся H, выбирают из метила и этила. В некоторых вариантах реализации изобретения R10 представляет собой H, а R11 представляет собой OH. В некоторых вариантах реализации изобретения R10 и R11 образуют азот-углеродную двойную связь между атомами азота и углерода, с которыми они связаны. В некоторых вариантах реализации изобретения R16, R17, R19, R20, R21, R22, X' и T' представляют собой те же, что R6, R7, R9, R10, R11, R2, X и T, соответственно.

[0023] В некоторых вариантах реализации изобретения иммуноконъюгат содержит структуру:

где Y определен выше. В некоторых вариантах реализации изобретения иммуноконъюгат содержит структуру:

где Ab представляет собой антитело, которое связывается с HER2, описанным в настоящем документе.

[0024] В любом из иммуноконъюгатов, описанных в настоящем документе p может находиться в диапазоне 1,3-2, 1,4-2, 1,5-2 или 2-5.

[0025] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен фармацевтический состав, содержащий иммуноконъюгат, описанный в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтический состав дополнительно содержит дополнительный терапевтический агент. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с HER2. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой (i) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с доменом II HER2, и/или (ii) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с доменом IV HER2. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой (i) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с эпитопом 2C4, и/или (ii) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с эпитопом 4D5. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный терапевтический агент выбирают из трастузумаба, трастузумаб-MCC-DM1 (T-DM1) и пертузумаба. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтический состав дополнительно содержит (1) трастузумаб или T-DM1 и (2) пертузумаб.

[0026] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы лечения индивидуума с HER2-позитивным раком. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный способ включает введение указанному индивиду эффективного количества иммуноконъюгата, описанного в настоящем документе, иммуноконъюгата, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак представляет собой рак молочной железы или рак желудка. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак представляет собой рак молочной железы на ранней стадии. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак представляет собой метастатический рак молочной железы. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак представляет собой рецидивирующий рак. В некоторых вариантах реализации изобретения рецидивирующий рак представляет собой местно-рецидивирующий рак. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак представляет собой распространенный рак. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак является неоперабельным. В некоторых вариантах реализации изобретения способ также включает введение указанному индивидууму дополнительного терапевтического агента.

[0027] В некоторых вариантах реализации изобретения способ лечения индивидуума, имеющего HER2-позитивный рак, включает введение индивидууму эффективного количества иммуноконъюгата, описанного в настоящем документе, и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента индивидууму. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с HER2. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой (i) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с доменом II HER2, и/или (ii) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с доменом IV HER2. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой (i) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с эпитопом 2C4, и/или (ii) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с эпитопом 4D5. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный терапевтический агент выбирают из трастузумаба, трастузумаб-MCC-DM1 (T-DM1) и пертузумаба. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительные терапевтические агенты представляют собой (1) трастузумаб или T-DM1 и (2) пертузумаб. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак представляет собой рак молочной железы или рак желудка. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак представляет собой рак молочной железы на ранней стадии. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак представляет собой метастатический рак молочной железы. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак представляет собой рецидивирующий рак. В некоторых вариантах реализации изобретения рецидивирующий рак представляет собой местно-рецидивирующий рак. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак представляет собой распространенный рак. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак является неоперабельным.

[0028] В некоторых вариантах реализации изобретения способ лечения индивидуума с HER2-позитивным раком включает:

a) подвергание индивидуума неоадъювантному лечению иммуноконъюгатом, описанным в настоящем документе или фармацевтическим составом, описанным в настоящем документе,

b) удаляют опухоль путем радикальной операции, и

c) подвергание индивидуума адъювантному лечению иммуноконъюгатом, описанным в настоящем документе или фармацевтическим составом, описанным в настоящем документе.

В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак представляет собой рак молочной железы или рак желудка.

[0029] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы ингибирования пролиферации HER2-позитивных клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает воздействие на клетку иммуноконъюгатом, описанным в настоящем документе в условиях допускающих связывание иммуноконъюгата с HER2 на поверхности клетки, тем самым ингибируя пролиферацию клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой клетку рака груди или клетку рака желудка.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0030] На Фиг. 1 представлено выравнивание консенсусной последовательности подгруппы I VH человека (VHI) и последовательности вариабельного участка тяжелой цепи мыши 7C2.B9 (ʺ7C2ʺ) и гуманизированной 7C2.v2.2.LA, как описано в Примере 1.

[0031] На Фиг. 2 представлено выравнивание консенсусной последовательности каппа IV VL человека (VLKIV) и последовательности вариабельного участка легкой цепи мыши 7C2.B9 (ʺ7C2ʺ) и гуманизированной 7C2.v2.2.LA, как описано в Примере 1.

[0032] На Фиг. 3 представлена структура внеклеточного доменов Her2, с обозначенными доменами I-IV, и доменами с которыми связываются антитела против Her2 трастузумаб, пертузумаб и 7C2.

[0033] На Фиг. 4 показано изменение объема опухоли (мм3) с течением времени с момента обработки hu7C2.v2.2.LA конъюгатами антитело-лекарственное средство (ADC), как описано в Примере 3.

[0034] На Фиг. 5 показано изменение объема опухоли (мм3) с течением времени с момента обработки hu7C2.v2.2.LA конъюгатами антитело-лекарственное средство (ADC), как описано в Примере 4.

[0035] На Фиг. 6 представлена структура некоторых конъюгатов антитело-лекарственное средство, используемых в примерах в настоящем документе.

[0036] На Фиг. 7A-B представлены аминокислотные последовательности легкой цепи (A) и тяжелой цепи (B) основного вида антитела пертузумаба.

[0037] На Фиг. 8A-B представлены иллюстративные аминокислотные последовательности легкой цепи (A) и тяжелой цепи (B) антитела вариантных видов пертузумаба.

[0038] На Фиг. 9A-B представлены аминокислотные последовательности легкой цепи (A) и тяжелой цепи (B) антитела трастузумаба.

[0039] На Фиг. 10 показана схема рецептора Her2 и последовательности доменов I-IV.

[0040] На Фиг. 11A-D представлена (A) кристаллическая структура комплекса между HER2 ECD (поверхность в тени домена и показанная как пространственная модель) и 7C2 Fab. 7C2 Fab связывается с доменом I HER2, который отличается от эпитопов связывания Fab трастузумаба (Tmab, PDB код: 1N8Z) и Fab пертузумаба (Pmab, PDB код: 1S78). (B) Суперпозиции структур HER2 ECD внутри комплекса трастузумаб/HER2, комплекса пертузумаб/HER2 и комплекса 7C2/HER2. (C) Поверхность комплекса 7C2/HER2. Боковые цепи остатков, вовлеченных во взаимодействие 7C2/HER2, показаны в виде палочек. Некоторые из потенциальных межмолекулярных водородных связей показаны в виде пунктирных линий. (D) Эпитоп связывания 7C2 частично совпадает с одноцепочечным Fv (scFv) chA21. Суперпозиция структуры комплекса chA21 scFv/HER2 (PDB код: 3H3B) с комплексом 7C2/HER2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0041] Далее будет приведено детальное описание некоторых вариантов реализации изобретения, примеры которых раскрыты с помощью сопутствующих структур и формул. Хотя изобретение будет описано в сочетании с перечисленными вариантами, необходимо понимать, что они не предназначены для ограничения изобретения такими вариантами реализации. Более того, изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в рамки представленного изобретения, как определено в формуле изобретения. Специалисту в данной области техники будут понятны многие способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, которые могут быть использованы в практике настоящего изобретения. Настоящее изобретение никоим образом не ограничивается описанными способами и материалами.

[0042] Все ссылки, приведенные в раскрытии в полном объеме, включены в настоящий документ посредством ссылок. В случае если одна или более позиций используемой литературы и подобных материалов отличается или противоречит настоящей заявке, включающей, но не ограничивающейся определенными условиями, сроком использования, описанными методиками и т.п., настоящая заявка имеет преимущество.

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0043] Слова ʺсодержатьʺ ʺсодержащийʺ, ʺвключатьʺ, ʺвключающийʺ и ʺвключаетʺ, когда используются в данном описании и формуле изобретения, предназначены для уточнения наличия заявленных характеристик, целых чисел, компонентов или шагов, но они не исключают наличия или добавления одной, или более других особенностей, целых чисел, компонентов действия или их групп.

[0044] ʺАкцепторный каркас человекаʺ для целей настоящего изобретения представляет собой каркас, содержащий аминокислотную последовательность каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящий от каркаса иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркаса человека, как указано ниже. Акцепторный каркас человека, "происходящий от" каркаса иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркаса человека, может содержать совпадающую с ними аминокислотную последовательность или может содержать изменения аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения количество аминокислотных изменений составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность VL-акцепторного каркаса человека идентична последовательности VL-каркаса иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркаса человека.

[0045] "Сродство" относится к силе суммы нековалентных взаимодействий между одиночным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, в настоящем документе "сродство связывания" относится к присущему молекуле сродству связывания, отражающему взаимодействие между членами пары связывающихся компонентов (например, антителом и антигеном) при их соотношении 1:1. Сродство молекулы X к ее партнеру Y в целом можно выразить константой диссоциации (Kd). Сродство можно измерить с помощью общепринятых в данной области техники способов, включая способы, описанные в настоящем документе. Конкретные иллюстративные и типичные варианты реализации измерения сродства связывания описаны далее.

[0046] Термин ʺантитело с созревшей аффинностьюʺ относится к антителу с одним или более изменениями в одной или более гипервариабельных областях (HVR) по сравнению с исходным антителом, которое не содержит таких изменений, причем такие изменения приводят к повышению аффинности антитела к антигену.

[0047] Термины "антитело к HER2" или "антитело, связывающееся с HER2", относятся к антителу, способному связывать HER2 с достаточной аффинностью, в результате чего указанное антитело можно использовать в качестве диагностического и/или терапевтического агента при целевом воздействии на HER2. В одном варианте реализации изобретения степень связывания антитела против HER2 с неспецифическим белком, не являющимся HER2, составляет менее около 10% связывания антитела с HER2 при измерении, например, с помощью радиоиммуннологического анализа (РИА). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело, связывающееся с HER2, характеризуется константой диссоциации (Kd), составляющей ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 5 нМ, ≤ 4 нМ, ≤ 3 нМ, ≤ 2 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ (например, 10-8М или менее, например, от 10-8М до 10-13М, например, от 10-9М до 10-13 М). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело к HER2 связывается с эпитопом HER2, который является консервативным среди HER2 различных видов.

[0048] Термин «антитело» в настоящем документе используется в самом широком смысле и включает различные структуры антител, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желательную антигенсвязывающую активность, но не ограничивается ими.

[0049] Термин "фрагмент антитела" относится к молекуле, не являющейся интактным антителом, но содержащей фрагмент интактного антитела и связывающей антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2-фрагменты; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.

[0050] «Антитело, связывающееся с тем же эпитопом», что и эталонное антитело, относится к антителу, блокирующему связывание эталонного антитела с его антигеном при конкурентном анализе на 50% или более, и наоборот, эталонное антитело блокирует связывание указанного антитела с его антигеном при конкурентном анализе на 50% или более. Типичный конкурентный анализ приведен в настоящем документе.

[0051] Термины ʺракʺ и ʺраковыйʺ относятся или описывают физиологическое состояние млекопитающих, обычно характеризующееся нерегулируемым ростом/пролиферацией клеток. Примеры рака включают карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации изобретения рак представляет собой рак молочной железы или рак желудка. В некоторых вариантах реализации изобретения рак представляет собой любой HER2-позитивный рак.

[0052] ʺHER2-позитивныйʺ рак содержит раковые клетки, которые имеют уровень HER2 выше нормального. Примеры HER2-позитивного рака включают HER2-позитивный рак молочной железы и HER2-позитивный рак желудка. Необязательно, HER2-позитивный рак имеет иммуногистохимический (IHC) балл равный 2+ или 3+ и/или коэффициент амплификации при in situ гибридизации (ISH) ≥2,0.

[0053] Термин ʺрак молочной железы на ранней стадии (EBC)ʺ или ʺранний рак молочной железыʺ используется в настоящем документе для обозначения рака молочной железы, который не распространился за пределы молочной железы или подмышечных лимфатических узлов. Это включает дуктальную карциному in situ и рак груди стадии I, стадии IIA, стадии IIB, и стадии IIIA.

[0054] Указание на опухоль или рак как на ʺСтадия 0,ʺ ʺСтадия I,ʺ ʺСтадия II,ʺ ʺСтадия III,ʺ или ʺСтадия IVʺ, и различные подстадии в рамках данной классификации, означает классификацию опухоли или рака с применением способов общей классификации стадий или классификацию стадий с использованием римских цифр, известных в данной области техники. Хотя фактическая стадии рака зависит от типа рака, в общем, рак на стадии 0 представляет собой in situ (локальное) поражение, рак на стадии I представляет собой локализованную опухоль небольшого размера, II и III стадии рака представляю собой локально распространенную опухоль, в которой принимают участие местные лимфатические узлы, а IV стадия рака представляет собой метастатический рак. Определенные стадии для каждого типа опухоли известны опытным врачам.

[0055] Термин ʺметастатический рак молочной железыʺ означает состояние рака молочной железы, когда раковые клетки передаются от изначального местоположения к одному или более местоположениям в других частях тела через кровеносные сосуды или лимфатические сосуды, для формирования одной или более вторичных опухолей в одном или более органах, кроме груди.

[0056] ʺРаспространенныйʺ рак представляет собой тот, который распространился за пределы местоположения или органа происхождения, путем локальной инвазии или метастазирование. Соответственно, термин ʺраспространенныйʺ рак включает как локально-распространенное, так и метастатические заболевание.

[0057] ʺРецидивирующийʺ рак представляет собой тот, который регенерировал или в начальном местоположении, или в отдаленной местоположении, в ответ на первоначальную терапию, такие как хирургическое вмешательство.

[0058] ʺЛокально распространеннымʺ рак представляет собой рак, который заново возникает после лечения на том же месте, что и ранее леченый рак.

[0059] ʺОперабельныйʺ или ʺрезектабельныйʺ представляет собой рак, который ограничивается первичным органом и пригоден для хирургического вмешательства (резекции).

[0060] ʺНеоперабельныйʺ или ʺнерезектабельныйʺ рак не может быть удален (резецирован) путем хирургического вмешательства.

[0061] Термин ʺхимерноеʺ антитело относится к антителу, в котором фрагмент тяжелой и/или легкой цепи происходит из конкретного источника или вида, в то время как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или вида.

[0062] ʺКлассʺ антитела относится к типу константного домена или константной области, содержащейся в его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

[0063] Используемый в настоящем документе термин ʺцитотоксический агентʺ относится к веществу, ингибирующему или предотвращающему функционирование клеток и/или приводящему к гибели или разрушению клеток. Цитостатические агенты включают радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические агенты или лекарственные вещества (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); ингибиторы роста; ферменты и их фрагменты, например, нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, например, низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты; и варианты и различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже, но не ограничиваются ими.

[0064] Термин ʺэффекторные функцииʺ относится к тем видам биологической активности, присущей Fc-области антитела, которые изменяются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); связывание с рецептором Fc; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; подавление рецепторов поверхности клетки (например, рецептора B-клеток); и активацию B-клеток.

[0065] «Эффективное количество» агента, например, фармацевтического состава, относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желательного терапевтического или профилактического результата. Эффективное количество лекарственного вещества может снизить количество раковых клеток; уменьшить размер опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлить и предпочтительно остановить) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлить и предпочтительно остановить) метастазирование опухоли; до определенной степени ингибировать рост опухоли; и/или до некоторой степени облегчить один или более симптомов, связанных с раком. В тех случаях, когда лекарственное средство может предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Эффективное количество может продлить выживаемость без прогрессирования (например, измеренное при помощи изменений в Критерии оценки ответа для солидных опухолей (RECIST) или CA-125), приводя к объективному ответу (включая частичный ответ (ЧО) или полный ответ (ПО)), увеличивает время общей выживаемости, и/или улучшая один или более симптомов рака (например, по оценке FOSI).

[0066] Термин «эпитоп» относится к конкретному сайту молекулы антигена, с которым связывается антитело.

[0067] ʺЭпитоп 4D5ʺ или ʺ4D5 эпитопʺ или ʺ4D5ʺ представляет собой участок внеклеточного домена HER2, к которому крепятся 4D5 (ATCC CRL 10463) трастузумаб. Данный эпитоп близок к трансмембранному домену HER2, и расположен в пределах домена IV HER2. Для скрининга антител, которые связываются с эпитопом 4D5, может быть использован обычный эпитоп перекрестный конкурентный анализ, такой как описанный в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Кроме того, картирование эпитопа может быть выполнено, для оценки того, связывается ли антитело с эпитопом 4D5 HER2 и (например, любой один или более остатков в участке от около 550 остатка до около 610 остатка HER2, включительно (SEQ ID NO: 39)).

[0068] ʺЭпитоп 2C4ʺ или ʺ2C4 эпитопʺ представляет собой участок внеклеточного домена HER2, к которому крепится антитело 2C4. Для скрининга антител, которые связываются с эпитопом 2C4, может быть использован обычный эпитоп перекрестный конкурентный анализ, такой, как описанный в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Кроме того, картирование эпитопа может быть выполнено, для оценки того, связывается ли антитело с эпитопом 2C4 HER2. Эпитоп 2C4 содержит остатки домена II во внеклеточном домене HER2. Антитело 2C4 и пертузумаб связываются с внеклеточным доменом HER2 на стыке доменов I, II и III (Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).

[0069] В в настоящем документе термин ʺFc-областьʺ используется для обозначения C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере фрагмент константной области. Данный термин охватывает нативную последовательность Fc-области и варианты Fc-области. В одном варианте реализации изобретения Fc-область тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 или от Pro230 до С-конца тяжелой цепи. Однако, Fc-область может содержать или не содержать C-концевой лизин (Lys447). Если не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации, принятой в ЕС, также называемой ЕС-индексом, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[0070] Термин ʺкаркасʺ или ʺFR (каркасный участок)ʺ относится к остаткам вариабельного домена, за исключением остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR в составе VH (или VL), как правило, определяются в следующей последовательности: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

[0071] В настоящем документе термины ʺполноразмерное антителоʺ, ʺинтактное антителоʺ и ʺцелое антителоʺ являются взаимозаменяемыми и относятся к антителу, структура которого практически аналогична структуре нативного антитела, или которое включает тяжелые цепи, содержащие Fc-область, описанную в настоящем документе.

[0072] Термин ʺгликозилированные формы HER2ʺ относится к природным формам HER2, которые посттрансляционно модифицированы путем добавления углеводных остатков.

[0073] Термины ʺклетка-хозяинʺ, ʺлиния клеток-хозяевʺ и ʺкультура клеток-хозяевʺ используются как взаимозаменяемые и относятся к клеткам, в которые введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают ʺтрансформантыʺ и ʺтрансформированные клеткиʺ, которые включают первично трансформированные клетки и полученное от них потомство, независимо от количества пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным исходной клетке по содержанию нуклеиновых кислот, и может содержать мутации. Настоящее описание включает мутантное потомство, обладающее той же функцией или биологической активностью, которую наблюдали во время скрининга или отбора из первоначально трансформированных клеток.

[0074] «Антитело человека» представляет собой антитело, обладающее аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности антитела, продуцированного в организме человека или клетке человека, или происходящее из нечеловеческого источника, использующего репертуар антител человека или другие последовательности, кодирующие антитело человека. Из этого определения антитела человека, в частности, исключено гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки нечеловеческого происхождения.

[0075] "Консенсусный каркас человека" является каркасом, представляющим наиболее распространенные аминокислотные остатки в отборе VL- или VH-каркасных последовательностей человеческого иммуноглобулина. Как правило, отбор VL- или VH-последовательностей человеческого иммуноглобулина осуществляют из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу по Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. В одном из вариантов реализации изобретения, для VL, подгруппа представляет собой подгруппу каппа I по Kabat et al., ранее. В одном из вариантов реализации изобретения, для VH, подгруппа представляет собой подгруппу III по Kabat et al., ранее.

[0076] «Гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из HVR нечеловеческого происхождения и аминокислотные остатки из FR человека. В некоторых вариантах реализации гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного, а обычно - двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют аналогичным участкам из антитела нечеловеческого происхождения, и все или практически все FR-области соответствуют последовательности антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере фрагмент константной области антитела, происходящий из антитела человека. «Гуманизированная форма» антитела, например, антитела нечеловеческого происхождения, относится к антителу, подвергшемуся гуманизации.

[0077] Термин «гипервариабельная область» или «HVR» в настоящем документе относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, обладающих гипервариабельными последовательностями и/или образующих структурно определенные петли («гипервариабельные петли»). Как правило, нативные четырехцепочечные антитела содержат шесть HVR: три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). HVR обычно содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или ʺобластей, определяющих комплементарностьʺ (CDR), причем последние характеризуются высочайшей изменчивостью последовательности и/или участвуют в распознавании антигена. Типичные гипервариабельные петли находятся в области аминокислотных остатков 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3). (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Типичные CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) находятся в области аминокислотных остатков 24-34 L1, 50-56 L2, 89-97 L3, 31-35B H1, 50-65 H2 и 95-102 H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) За исключением CDR1 в VH, CDR обычно содержат аминокислотные остатки, образующие гипервариабельные петли. CDR также содержат ʺостатки, определяющие специфичностьʺ или ʺSDRʺ, которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR содержатся в областях CDR, называемых укороченными CDR или a-CDR. Типичные a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) находятся в области аминокислотных остатков 31-34 L1, 50-55 L2, 89-96 L3, 31-35B H1, 50-58 H2 и 95-102 H3. (См. Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, FR-остатки) в настоящем документе нумеруют по Kabat et al., ранее.

[0078] ʺИммуноконъюгатʺ представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более гетерологичных молекул, включая цитотоксический агент, но не ограничиваясь им.

[0079] ʺПациентʺ или ʺиндивидʺ, или ʺсубъектʺ представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и приматов, не являющихся людьми, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, индивид или субъект является человеком. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент может представлять собой ʺпациента со злокачественным новообразованиемʺ, т.е. такого, который страдает или подвержен риску быть страдающим от одного или более симптомов рака, в частности, рака желудка или молочной железы.

[0080] ʺПопуляция пациентовʺ относится к группе пациентов со злокачественным новообразованием. Такие популяции могут быть использованы для демонстрации статистически значимой эффективности и/или безопасности лекарственного препарата.

[0081] ʺРецидивирующийʺ пациент представляет собой такого, который имеет признаки или симптомы рака после ремиссии. Необязательно, пациент имеет рецидив после адъювантной или неоадъювантной терапии.

[0082] Рак или биологический образец, который ʺпроявляет экспрессию, амплификацию или активацию HERʺ представляет собой тот, который, при диагностическом тесте экспрессирует (в том числе сверхэкспрессирует) рецептор HER, имеет амплифицированный ген HER и/или иным образом демонстрирует активацию или фосфорилирование рецептора HER.

[0083] ʺНеоадъювантная терапияʺ или ʺпредоперационная терапияʺ относятся к терапии до хирургического вмешательства. Цель неоадъювантной терапии заключается в оказании экстренной системного лечения, потенциально ликвидируя микрометастазы которые могут в дальнейшем размножаться, если будет проведена стандартная последовательность операций с последующей системной терапией. Неоадъювантная терапия может также помочь уменьшить размеры опухоли, что позволяет выполнить резекцию изначально нерезектабельных опухолей или сохранить части органа и его функции. Кроме того, неоадъювантная терапия позволяет провести in vivo оценку эффективности лекарственных препаратов, которые могут определить выбор последующего лечения.

[0084] ʺАдъювантная терапияʺ относятся к терапии, которую обеспечивают после радикальной хирургической операции, при которой не выявляются признаки остаточных явлений болезни, а также для снижения риска рецидива заболевания. Цель адъювантной терапии заключается в предотвращения рецидива рака, и, следовательно, уменьшении вероятности смерти, связанной с раком. Адъювантная терапия в настоящем документе, в частности, исключает неоадъювантную терапию.

[0085] ʺРадикальная хирургическая операцияʺ используется в том же значении, в котором данный термин используется в медицинском сообществе. Радикальная хирургическая операция включает, например, процедуры (хирургические или иные), которые приводят к удалению или резекции опухоли, включая те, что приводят к удалению или резекции всех макроскопически видимых опухолей. Радикальная хирургическая операция включает, например, полную или радикальную резекцию, или полную макроскопическую резекцию опухоли. Радикальная хирургическая операция включает процедуры, которые происходят в одном или нескольких этапах, и включает, например, многоэтапные хирургические процедуры, в которых проводится одна или более хирургические, или другие процедуры до резекции опухоли. Радикальная хирургическая операция включает процедуры удаления или резекции опухоли, в том числе вовлеченных органов, частей органов и тканей, а также прилегающих органов, таких как лимфатические узлы, части органов или ткани. Удаление может быть неполным, таким, что опухолевые клетки могут остаться даже незамеченными.

[0086] «Выживаемость» относится к пациенту, оставшемуся в живых, и включает выживаемость без признаков заболевания (DFS), выживаемость без прогрессирования (PFS) и общую выживаемость (ОВ). Выживаемость можно оценить по методике Каплана-Мейера, различия в выживаемости вычисляют с помощью стратифицированного лог-рангового критерия.

[0087] ʺВыживаемость без прогрессированияʺ (PFS) представляет собой время от первого дня лечения до документированного прогрессирования заболевания (включая изолированное прогрессирование в ЦНС) или смерти от любой причины в исследование, что наступит раньше.

[0088] ʺВыживаемость без признаков заболевания (DFS)ʺ относится к пациенту, остающемуся в живых в течение определенного времени, например, около 1 года, около 2 лет, около 3 лет, около 4 лет, около 5 лет, около 10 лет и т.д., от начала лечения или от постановки первоначального диагноза. В одном аспекте DFS анализируют по принципу, зависящему от назначенного лечения, т.е., пациентов оценивали на основании назначенной терапии. События, используемые в анализе DFS, могут включать локальный, местно-распространенный и удаленный рецидив рака, возникновение вторичного рака и смерть от любой причины у пациентов без предшествующего события (например, рецидива рака молочной железы или второй первичный рак).

[0089] «Общая выживаемость» относится к пациенту, остающемуся в живых в течение определенного времени, например, около 1 года, около 2 лет, около 3 лет, около 4 лет, около 5 лет, около 10 лет и т.д., от начала лечения или от постановки первоначального диагноза. В исследованиях, лежащие в основе настоящего изобретения, событие, используемое для анализа выживаемости, представляло собой смерть от любой причины.

[0090] Под ʺпродлением выживаемостиʺ понимается увеличение DFS и/или OS у леченного пациента по отношению к нелеченому пациенту, или по отношению к протоколу контроля лечения. Выживаемость отслеживают в течение по меньшей мере около шести месяцев или по меньшей мере около 1 года, или по меньшей мере около 2 лет, или по меньшей мере около 3 лет, или по меньшей мере около 4 лет, или по меньшей мере около 5 лет, или по меньшей мере около 10 лет, и т.д., после начала лечения или после постановки первоначального диагноза.

[0091] Под «монотерапией» понимают схему лечения, включающую только один терапевтический агент для лечения рака или опухоли в течение всего периода лечения.

[0092] Под ʺподдерживающей терапиейʺ понимают терапевтическую схему, которую назначают для снижения вероятности рецидива или прогрессирования заболевания. Поддерживающая терапия может быть обеспечена в течение любой продолжительности времени, включая увеличенные периоды времени вплоть до продолжительности жизни субъекта. Поддерживающая терапия может быть обеспечена после первоначальной терапии или вместе с первоначальной или дополнительными терапиями. Дозы, используемые для поддерживающей терапии, могут варьироваться и могут включать уменьшенные дозы по сравнению с дозами, используемыми для других видов терапии.

[0093] В настоящем документе термины ʺтрастузумабʺ, ʺHERCEPTIN®ʺ и ʺhuMAb4D5-8ʺ используются равнозначно. Такое антитело предпочтительно содержит аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепи, представленные в SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO. 29, соответственно.

[0094] В контексте настоящего документа, ʺпертузумабʺ, ʺPERJETA®ʺ и ʺrhuMAb 2C4ʺ используются равнозначно. Такое антитело содержит антитело основного вида, имеющее аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепи, представленные в SEQ ID NO: 32 и 31, соответственно (Фиг. 7A и B). В некоторых вариантах реализации изобретения пертузумаб содержит антитело вариантного вида с аминоконцевым лидерным удлинением, например, содержащим аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 34 и аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 33. Антитела необязательно продуцируются клетками яичника китайского хомячка (CHO).

[0095] Как определено в настоящем документе, ʺT-DM1,ʺ ʺтрастузумаб-MCC-DM1,ʺ ʺадо-трастузумаб эмтанзин,ʺ ʺтрастузумаб эмтанзинʺ и ʺKADCYLA®ʺ используются взаимозаменяемо и относятся к трастузумабу связанному путем линкерного фрагмента MCC к остатку препарат мантанзиноида DM1, включая все смеси различно загруженных и присоединенных конъюгатов антитело-лекарственный препарат, где 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, и 8 фрагментов лекарственного препарата ковалентно присоединены к антителу трастузумаб (US 7097840; US 8337856; US 2005/0276812; US 2005/0166993).

[0096] ʺВыделенное антителоʺ представляет собой антитело, отделенное от компонента своего природного окружения. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело является очищенным до более чем 95% или 99% чистоты, определяемой, например, посредством электрофореза (например, электрофореза в ДСН-ПААГ, изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), капиллярного электрофореза) или хроматографии (например, ионообменной или обращенно-фазной ВЭЖХ). Для обзора способов оценки чистоты антител, см., например, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

[0097] Термин ʺвыделенная нуклеиновая кислотаʺ относится к молекуле нуклеиновой кислоты, отделенной от компонента своего природного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержавшуюся в клетках, обычно содержащих указанную молекулу нуклеиновой кислоты, однако указанная молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в области хромосомы, отличающейся от ее естественного местоположения в хромосоме.

[0098] Выражение ʺвыделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело против HER2ʺ относится к одной или более молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая такую молекулу(ы) нуклеиновой кислоты в составе одного вектора или отдельных векторов и такую молекулу(ы) нуклеиновой кислоты, присутствующую в одном или более местоположениях в клетке-хозяине.

[0099] Термин «HER2» в настоящем документе относится к любому нативному зрелому HER2, полученному в результате процессинга белка-предшественника HER2 в клетке. Данный термин включает HER2 любого вида позвоночных, в том числе млекопитающих, например, приматов (например, людей и яванских макаков) и грызунов (например, мышей и крыс), если не указано иное. Данный термин также включает природные варианты HER2, например, сплайсинговые варианты или аллельные варианты. Аминокислотная последовательность типичного белка-предшественника HER2 человека с сигнальной последовательностью (сигнальная последовательность - аминокислоты 1-22) представлена в SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность типичного зрелого HER2 человека представляет собой аминокислоты 23-1255 SEQ ID NO: 1.

[00100] Термин «HER2-положительная клетка» относится к клетке, экспрессирующей HER2 на своей поверхности.

[00101] Термин «моноклональное антитело» в настоящем документе относится к антителу, полученному из популяции практически однородных антител, т.е., отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих естественные мутации или возникающих во время продукции моноклонального антитела, причем такие варианты присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат различные антитела против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты антигена. Таким образом, модификатор ʺмоноклональноеʺ указывает на то, что антитело получают по существу из однородной популяции антител; его не следует интерпретировать как требование относительно продуцирования антитела с помощью какого-либо конкретного способа. Например, моноклональные антитела для использования согласно настоящему изобретению можно получить с помощью различных способов, включая, но не ограничиваясь ими, гибридомный способ, методики рекомбинантных ДНК, методики фагового дисплея и способы с использованием трансгенных животных, полностью или частично содержащих локусы человеческого иммуноглобулина, причем такие способы и другие типичные способы получения моноклональных антител описаны в настоящем документе.

[00102] Термин «свободное антитело» относится к антителу, неконъюгированному с гетерологичной группой (например, цитотоксической группой) или радиоактивной меткой. Свободное антитело может присутствовать в фармацевтическом составе.

[00103] ʺНативные антителаʺ относятся к природным молекулам иммуноглобулина с различной структурой. Например, нативные антитела IgG обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой около 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь от N-конца к C-концу содержит вариабельную область (VH), также называемую вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, с последующими тремя константными доменами (CH1, CH2 и CH3). Аналогично, каждая легкая цепь от N-конца к C-концу содержит вариабельную область (VL), также называемую вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, с последующим константным легким доменом (CL). Легкую цепь антитела на основании аминокислотной последовательности ее константного домена можно отнести к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ).

[00104] ʺФлаконʺ представляет собой контейнер, пригодный для содержания жидкого или лиофилизированного препарата. В одном варианте реализации изобретения флакон представляет собой одноразовый флакон, например, 20-кубовый одноразовый флакон с пробкой.

[00105] Термин "вкладыш в упаковку" относится к инструкциям, в обычном порядке вкладываемым в упаковки терапевтических продуктов для продажи, содержащие информацию о показаниях, использовании, дозировке, приеме, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предостережениях, касающихся использования таких терапевтических продуктов.

[00106] "Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" по отношению к последовательностям эталонных полипептидов определяют как процентное содержание аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, идентичных аминокислотным остаткам в конкретной последовательности эталонного полипептида после выравнивания последовательностей и, при необходимости, внедрения разрывов для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, без учета консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процентной идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществить различными способами, известными специалистам в данной области техники, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, например, программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры выравнивания последовательностей, включая алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения значения % идентичности аминокислотных последовательностей генерируются с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Автором компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2 является компания Genentech, Inc., а исходный код программы был подан с информацией для пользователя в Бюро по охране авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где зарегистрирован под номером регистрации авторского права США TXU510087. Программа ALIGN-2 находится в свободном доступе в Genentech, Inc., Саут-Сан-Франциско, штат Калифорния, или может быть скомпилирована из исходного кода. Для использования в операционной системе UNIX, в том числе digital UNIX V4.0D, программу ALIGN-2 следует компилировать. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и остаются неизменными.

[00107] В случаях, когда ALIGN-2 используют для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности A по сравнению с или относительно данной аминокислотной последовательности B (что можно иначе сформулировать так, что данная аминокислотная последовательность A характеризуется или включает определенный % идентичности аминокислотной последовательности по сравнению с или относительно данной аминокислотной последовательности B) рассчитывают следующим образом:

100-кратное отношение X/Y

где X обозначает количество аминокислотных остатков, считающихся идентичными совпадениями при выравнивании А и В с помощью программы выравнивания последовательностей ALIGN-2, и где Y обозначает общее количество аминокислотных остатков в В. Следует принимать во внимание, что если длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, % идентичности аминокислотной последовательности A по отношению к B не равен % идентичности аминокислотной последовательности B по отношению к А. Если не указано иное, все используемые в настоящем документе процентные значения идентичности аминокислотных последовательностей получены, как описано непосредственно в предыдущем абзаце с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

[00108] Термин "фармацевтический состав" относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечить эффективную биологическую активность активного ингредиента, содержащегося в нем, и не содержит дополнительных компонентов, являющихся неприемлемо токсичными для субъекта, которому должна быть введена композиция.

[00109] ʺФармацевтически приемлемый носительʺ относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, отличающемуся от активного ингредиента и являющемуся нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.

[00110] В настоящем документе термин «лечение» (и его грамматические варианты, например, «лечить») относится к клиническому вмешательству при попытке изменить естественный ход развития личности, подвергаемой лечению, и может осуществляться для профилактики или в ходе клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают предотвращение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращая метастазирование, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или паллиативное лечение патологического состояния и ремиссию или улучшение прогноза, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации антитела согласно изобретению, используют для задержки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.

[00111] ʺСовместное введениеʺ означает внутривенное введение двух (или более) лекарственных препаратов во время одного и того же введения, а не последовательную инфузию из двух или более лекарственных препаратов. Как правило, это предполагает объединение двух (или более) лекарственных средств в один пакет для внутривенного вливания перед их совместным введением.

[00112] Лекарственный препарат, который применяют ʺодновременноʺ с одним или более другими лекарственными средствами применяется в течение того же цикла лечения, в тот же день лечения, что и одно или более другое лекарственное средство, и, при необходимости, в то же время что и одно или более другое лекарственное средство. Например, для противораковой терапии, применяемой каждые 3 недели, одновременно применяемые препараты назначают на каждые 1-е сутки 3-х недельного цикла.

[00113] ʺХимиотерапияʺ представляет собой применение химиотерапевтического агента, пригодного для лечения рака.

[00114] «Химиотерапевтический агент» представляет собой химическое соединение, пригодное для лечения рака, независимо от механизма действия. Классы химиотерапевтических агентов включают, но не ограничиваются ими: алкилирующие агенты, антиметаболиты, растительные алкалоиды, являющиеся веретенным ядом, цитотоксические/противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомеразы, антитела, фотосенсибилизаторы и ингибиторы киназ. Примеры химиотерапевтических агентов включают: антрациклины, такие как доксорубицин или эпирубицин (ADRIAMYCIN®), циклофосфамид (CYTOXAN®, NEOSAR®), антрациклин и циклофосфамид в комбинации (ʺАСʺ); таксан, например, доцетаксел (TAXOTERE®) или паклитаксел (TAXOL®), 5-FU (фторурацил, 5-фторурацил, номер в реестре CAS 51-21-8), лапатиниб (TYKERB®), капецитабин (XELODA®), гемцитабин (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (номер в реестре CAS 391210-10-9, Pfizer), цисплатин (цис-диамин,дихлорплатина(II), номер в реестре CAS 15663-27-1), карбоплатин (номер в реестре CAS 41575-94-4), темозоломид (4-метил-5-оксо- 2,3,4,6,8-пентазабицикло [4.3.0] нона-2,7,9-триен- 9-карбоксамид, номер в реестре CAS 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Шеринг Плау), тамоксифен ((Z)-2-[4-(1,2-дифенилбут-1-енил)фенокси]-N,N-диметил-этанамин, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®).

[00115] Дополнительные примеры химиотерапевтических агентов включают: оксалиплатин (ELOXATIN®, Sanofi), бортезомиб (VELCADE®, Millennium Pharm.), сутент (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), летрозол (FEMARA®, Novartis), иматиниба мезилат (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (ингибитор MEK, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (ингибитор Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (ингибитор PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (ингибитор PI3K, Novartis), XL-147 (ингибитор PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), фулвестрант (FASLODEX®, AstraZeneca), лейковорин (фолиновая кислота), рапамицин (сиролимус, RAPAMUNE®, Wyeth), лонафарниб (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), сорафениб (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), гефитиниб (IRESSA®, AstraZeneca), иринотекан (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), типифарниб (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (Cremophor-free), альбумин-сконструированные препараты наночастиц паклитаксела (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il), вандетаниб (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), хлорамбуцил, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), темсиролимус (TORISEL®, Wyeth), пазопаниб (GlaxoSmithKline), канфосфамид (TELCYTA®, Telik), тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®, NEOSAR®); алкилсульфонаты такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметиломеламин; ацетогенины (особенно булатацин и булатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его адозелезин, карцелезин и синтетические аналоги бизелезина); криптофицины (в частности криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин азотистые иприты такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, меклоретамин, меклоретаминоксид гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломусин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, калихеамицин гамма1I, калихеамицин омегаI1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); динемицин, динемицин A; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые энедииновые антибактериальные хромофоры), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идаруцибин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицина, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностат, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитаин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; алдофосфамида гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; мейтансиноиды, такие как маитанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраерин; пеностатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Юджин, Орегон); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2ʺ-трихлортриэтиламин; трихотецены (токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ara-C); циклофосфамид; тиотепа; 6-тиогуанин; меркаптомочевина; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксатрон; винкристин; винорелбин (NAVELBINE®); новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; CPT-11; ингибитор тропоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (ДФМО); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из указанного выше.

[00116] ʺФиксированнаяʺ или ʺпостояннаяʺ доза терапевтического агента в настоящем документе относятся к дозе, которую вводят пациенту-человека без учета массы (М) или площади поверхности тела (ПТ) пациента. Поэтому фиксированную или постоянную дозу не предоставляют в виде дозы мг/кг или дозы мг/м2, но предпочтительно в виде абсолютного количества терапевтического агента.

[00117] ʺНагрузочнаяʺ доза в настоящем документе, как правило, включает начальную дозу терапевтического агента, вводимую пациенту, с последующим введением одной или более такой же доз(ы). Как правило, в настоящем документе предусмотрено введение единичной нагрузочной дозы, но также предусмотрено нескольких нагрузочных доз. Как правило, величина вводимой нагрузочной доз(ы) превышает величину вводимой поддерживающей доз(ы) и/или нагрузочную дозу(ы) вводят чаще, чем поддерживающую дозу(ы), так чтобы достичь состояния желаемой равновесной концентрации терапевтического агента раньше, чем может быть достигнуто при помощи поддерживающей доз(ы).

[00118] ʺПоддерживающаяʺ доза в настоящем документе относятся к одной или более дозам терапевтического агента вводимым пациенту в течение срока лечения. Обычно поддерживающие дозы вводят в течение разделенных интервалов лечения, такие как, приблизительно каждую неделю, приблизительно каждые 2 недели, приблизительно каждые 3 недели или приблизительно каждые 4 недели, желательно каждые 3 недели.

[00119] ʺИнфузияʺ или ʺинфузионноеʺ относится к введению раствора, содержащего лекарственное средство, в организм через вену, в лечебных целях. Как правило, это достигается при помощи пакета для внутривенного вливания (в/в).

[00120] ʺПакет для внутривенного вливанияʺ или ʺпакет для в/в вливанияʺ представляет собой пакет, который может содержать раствор, который можно вводить через вену пациента. В одном варианте реализации изобретения раствор представляет собой солевой раствор (например, в концентрации около 0,9% или около 0,45% NaCl). Необязательно, пакет для внутривенного вливания изготавливают из полиолефина или поливинилхлорида.

[00121] Термин "вариабельная область" или ʺвариабельный доменʺ относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, участвующему в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно обладают аналогичной структурой, причем каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR). См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). Одиночного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения антигенсвязывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, можно выделить, используя VH- или VL-домен антитела, связывающийся с антигеном, для скрининга библиотеки последовательностей, комплементарных VL- или VH-доменам, соответственно. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

[00122] В настоящем документе термин ʺвекторʺ относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной обеспечивать репродукцию другой, связанной с ней нуклеиновой кислоты. Данный термин включает вектор как самореплицирующуюся нуклеотидную структуру, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он вводится. Некоторые векторы способны управлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем документе называют "экспрессирующими векторами".

[00123] ʺАлкилʺ представляет собой C1-C18 углеводород, содержащий нормальные, вторичные, третичные атомы углерода или атомы углерода цикла. Примерами являются метил (Me, -CH3), этил (Et, -CH2CH3), 1-пропил (n-Pr, n-пропил, -CH2CH2CH3), 2-пропил (i-Pr, i-пропил -CH(CH3)2), 1-бутил (n-Bu, n-бутил, -CH2CH2CH2CH3), 2-метил-1-пропил (i-Bu, i-бутил, -CH2CH(CH3)2), 2-бутил (s-Bu, s-бутил, -CH(CH3)CH2CH3), 2-метил-2-пропил (t-Bu, t-бутил, -C(CH3)3), 1-пентил (n-пентил, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-пентил (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-пентил (-CH(CH2CH3)2), 2-метил-2-бутил (-C(CH3)2CH2CH3), 3-метил-2-бутил (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-метил-1-бутил (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-метил-1-бутил (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-гексил (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-гексил (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-гексил (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-метил-2-пентил (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-метил-2-пентил (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-метил-2-пентил (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-метил-3-пентил (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-метил-3-пентил (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-диметил-2-бутил (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-диметил-2-бутил (-CH(CH3)C(CH3)3.

[00124] Термин ʺC1-C8 алкилʺ в настоящем документе относится к линейному или разветвленному, насыщенному или ненасыщенному углеводороду, содержащему от 1 до 8 атомов углерода. Типичные ʺC1-C8 алкильныеʺ группы включают метил, этил, n-пропил, n-бутил, n-пентил, n-гексил, n-гептил, n-октил, n-нонил и n-децил, но не ограничиваются ими; в то время как разветвленные C1-C8 алкилы включают, изопропил, -втор-бутил, -изобутил, -трет-бутил, -изопентил, 2-метилбутил, но не ограничиваются ими, ненасыщенные C1-C8 алкилы включают, винил, аллил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1-бутинил, но не ограничиваются ими. C1-C8 алкильная группа может быть незамещенной или замещенной одной или более группами, включая -C1-C8 алкильную, -O-(C1-C8 алкильную), -арильную, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN; где каждую R' независимо выбирают из H, -C1-C8 алкила и арила, но не ограничиваясь ими.

[00125] Термин ʺC1-C12 алкилʺ в настоящем документе относится к линейному или разветвленному, насыщенному или ненасыщенному углеводороду, содержащему от 1 до 12 атомов углерода. C1-C12 алкильная группа может быть незамещенной или замещенной одной или более группами, включая -C1-C8 алкильную, -O-(C1-C8 алкильную), -арильную, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN; где каждую R' независимо выбирают из H, -C1-C8 алкила и арила, но не ограничиваясь ими.

[00126] Термин ʺC1-C6 алкилʺ в настоящем документе относится к линейному или разветвленному, насыщенному или ненасыщенному углеводороду, содержащему от 1 до 6 атомов углерода. Типичные ʺC1-C6 алкильныеʺ группы включают метил, этил, n-пропил, n-бутил, n-пентил и n-гексил, но не ограничиваются ими; в то время как разветвленные C1-C6 алкилы включают, изопропил, -втор-бутил, -изобутил, -трет-бутил, -изопентил и 2-метилбутил, но не ограничиваются ими, ненасыщенные C1-C6 алкилы включают винил, аллил, 1-бутенил, 2-бутенил и изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил, 1-гексил, 2-гексил и 3-гексил, но не ограничиваются ими. C1-C6 алкильная группа может быть незамещенной или замещенной одной или более группами, описанными выше для C1-C8 алкильной группы.

[00127] Термин ʺC1-C4 алкилʺ в настоящем документе относится к линейному или разветвленному, насыщенному или ненасыщенному углеводороду, содержащему от 1 до 4 атомов углерода. Типичные ʺC1-C4 алкильныеʺ группы включают метил, этил, n-пропил, n-бутил, но не ограничиваются ими; в то время как разветвленные C1-C4 алкилы включают изопропил, -втор-бутил, -изобутил, -трет-бутил; но не ограничиваются ими, ненасыщенные C1-C4 алкилы включают винил, аллил, 1-бутенил, 2-бутенил и изобутиленил, но не ограничиваются ими. C1-C4 алкильная группа может быть незамещенной или замещенной одной или более группами, описанными выше для C1-C8 алкильной группы.

[00128] «Алкокси» представляет собой алкильную группу, связанную с атомом кислорода одинарной связью. Типичные алкоксигруппы включают метокси (-OCH3) и этоксигруппу (-OCH2CH3), но не ограничиваются ими. ʺC1-C5 представляет собой алкоксигруппу, содержащую от 1 до 5 атомов углерода. Алкоксигруппа может быть незамещенной или замещенной одной или более группами, описанными выше для алкильных групп.

[00129] ʺАлкенилʺ представляет собой C2-C18 углеводород, содержащий нормальные, вторичные, третичные атомы углерода или атомы углерода в составе цикла и по меньшей мере один участок ненасыщенности, т.е. углерод-углеродную, sp2двойную связь. Примеры включают: этилен или винил (-CH=CH2), аллил (-CH2CH=CH2), циклопентенил (-C5H7) и 5-гексенил (-CH2 CH2CH2CH2CH=CH2), но не ограничиваются ими. ʺ C2-C8 Алкенилʺ представляет собой углеводород, содержащий 2-8 нормальных, вторичных, третичных атомов углерода или атомы углерода в составе цикла и по меньшей мере один участок ненасыщенности, т.е. углерод-углеродную, sp2двойную связь.

[00130] ʺАлкинилʺ представляет собой C2-C18 углеводород, содержащий нормальные, вторичные, третичные атомы углерода или атомы углерода в составе цикла и по меньшей мере один участок ненасыщенности, т.е. углерод-углеродную, sp тройную связь. Примеры включают: ацетиленовую (-C≡CH) и пропаргиловую группу (-CH2C≡CH), но не ограничиваются ими. ʺC2-C8Алкинилʺ представляет собой углеводород, содержащий 2-8 нормальных, вторичных, третичных атомов углерода или атомы углерода в составе цикла и по меньшей мере один участок ненасыщенности, т.е. углерод-углеродную, sp тройную связь

[00131] ʺАлкиленʺ относится к насыщенному разветвленному или неразветвленному, или циклическому углеводородному радикалу, содержащему 1-18 атомов углерода и два одновалентных радикальных центра, образованных путем удаления двух атомов водорода от одного и того же или от двух различных атомов углерода в исходном алкане. Типичные алкиленовые радикалы включают, но не ограничиваются ими: метилен (-CH2-) 1,2-этил (-CH2CH2-), 1,3-пропил (-CH2CH2CH2-), 1,4-бутил (-CH2CH2CH2CH2-) и т.п.

[00132] ʺАлкениленʺ относится к ненасыщенному разветвленному или неразветвленному, или циклическому углеводородному радикалу, содержащему 2-18 атомов углерода и два одновалентных радикальных центра, образованных путем удаления двух атомов водорода от одного и того же или от двух различных атомов углерода в исходном алкене. Типичные алкениленовые радикалы включают: 1,2-этилен (-CH=CH-), но не ограничиваются им.

[00133] ʺАлкиниленʺ относится к ненасыщенному разветвленному или неразветвленному, или циклическому углеводородному радикалу, содержащему 2-18 атомов углерода и два одновалентных радикальных центра, образованных путем удаления двух атомов водорода от одного и того же или от двух различных атомов углерода в исходном алкине. Типичные алкиниленовые радикалы включают: ацетилен (-C≡C-), пропаргил (-CH2C≡C-) и 4-пентинил (-CH2CH2CH2C≡C-), но не ограничиваются ими..

[00134] "Арил" относится к карбоциклической ароматической группе. Примеры арильных групп включают фенил, нафтил и антраценил, но не ограничиваются ими. Карбоциклическая ароматическая группа или гетероциклическая ароматическая группа может быть незамещенной или замещенной одной или более группами, включая -C1-C8 алкил, -O-(C1-C8 алкил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN; где каждую R' независимо выбирают из H, -C1-C8 алкила и арила, но не ограничиваясь ими.

[00135] ʺC5-C20 арилʺ представляет собой арильную группу, содержащую от 5 до 20 атомов углерода в карбоциклических ароматических кольцах. Примеры C5-C20 арильных групп включают фенил, нафтил и антраценил, но не ограничиваются ими. C5-C20 арильная группа может быть замещенной или незамещенной, как описано выше для арильных групп. ʺC5-C14 арилʺ представляет собой арильную группу, содержащую от 5 до 14 атомов углерода в карбоциклических ароматических кольцах. Примеры C5-C14 арильных групп включают фенил, нафтил и антраценил, но не ограничиваются ими. C5-C14 арильная группа может быть замещенной или незамещенной, как описано выше для арильных групп.

[00136] "Арилен" представляет собой арильную группу, содержащую две ковалентные связи, и может находиться в орто-, мета- или пара-конфигурации, как показано на следующих структурах:

в которых фенильная группа может быть незамещенной или замещенной с участием до четырех групп, включая, но не ограничиваясь ими, -C1-C8 алкильную, -O-(C1-C8 алкильную), -арильную, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN; где каждую R' независимо выбирают из H, -C1-C8 алкила и арила.

[00137] ʺАрилалкилʺ относится к ациклическому алкильному радикалу, в котором один из атомов водорода, связанных с атомом углерода, обычно с концевым или sp3-атомом углерода, заменен на арильный радикал. Типичные арилалкильные группы, в числе прочего, включают бензил, 2-фенилэтан-1-ил, 2-фенилэтен-1-ил, нафтилметил, 2-нафтилэтан-1-ил, 2-нафтилэтен-1-ил, нафтобензил, 2 нафтофенилэтан-1-ил и т.п. Арилалкильная группа содержит от 6 до 20 атомов углерода, например, алкильный фрагмент арилалкильной группы, включающий алканильные, алкенильные или алкинильные группы, содержит от 1 до 6 атомов углерода, а арильный фрагмент содержит от 5 до 14 атомов углерода.

[00138] ʺГетероарилалкилʺ относится к ациклическому алкильному радикалу, в котором один из атомов водорода, связанных с атомом углерода, обычно с концевым или sp3 атомом углерода, заменен на гетероарильный радикал. Типичные гетероарилалкильные группы включают бензил 2-бензимидазолилметил, 2-фурилэтил и т.п., но не ограничиваются ими. Гетероарилалкильная группа содержит от 6 до 20 атомов углерода, например, алкильный фрагмент гетероарилалкильной группы, включающий алканильные, алкенильные или алкинильные группы, содержит от 1 до 6 атомов углерода, а гетероарильный фрагмент содержит от 5 до 14 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S. Гетероарильный фрагмент гетероарилалкильной группы может являться моноциклической структурой, содержащей от 3 до 7 членов кольца (от 2 до 6 атомов углерода, или бициклической структурой, содержащей от 7 до 10 членов кольца (от 4 до 9 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O, P, и S), например системой бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6].

[00139] "Замещенный алкил", "замещенный арил" и "замещенный арилалкил" означают алкил, арил и арилалкил, соответственно, в которых один или более атомов водорода независимо друг от друга замещены заместителем. Типичные заместители включают -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO-3, -PO3H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2, но не ограничиваются ими, где каждый X независимо представляет собой атом галогена: F, Cl, Br или I; а каждый R независимо представляет собой -H, C2-C18 алкил, C6-C20 арил, C3-C14 гетероцикл, защитную группу или группу пролекарства. Алкиленовые, алкениленовые и алкиниленовые группы также могут быть замещены аналогичным образом.

[00140] «Гетероарил» и «гетероцикл» относятся к кольцевой системе, в которой один или более кольцевых атомов представляют собой гетероатомы, например, азот, кислород и серу. Гетероциклический радикал содержит от 3 до 20 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S. Гетероцикл может являться моноциклической структурой, содержащей от 3 до 7 членов кольца (2-6 атомов углерода и 1-3 гетероатома, выбранных из N, O, P и S) или бициклической структурой, содержащей от 7 до 10 членов кольца (4-9 атомов углерода и 1-3 гетероатома, выбранных из N, O, P и S), например: системой бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6].

[00141] Типичные гетероциклы описаны, например, в Paquette, Leo A., ʺPrinciples of Modern Heterocyclic Chemistryʺ (W.A. Benjamin, New York, 1968), в частности, главах 1, 3, 4, 6, 7, и 9; ʺThe Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographsʺ (John Wiley & Sons, New York, с 1950 до настоящего времени), в частности, томах 13, 14, 16, 19 и 28; и J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.

[00142] Примеры гетероциклов включают (в качестве неограничивающего примера) пиридил, дигидропиридил, тетрагидропиридил (пиперидил), тиазолил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиофенил с окисленной серой, пиримидинил, фуранил, тиенил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тетразолил, бензофуранил, тианафталенил, индолил, индоленил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, пиперидинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, 2-пирролидонил, пирролинил, тетрагидрофуранил, бис-тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, бис-тетрагидропиранил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил, декагидрохинолинил, октагидроизохинолинил, азоцинил, триазинил, 6H-1,2,5-тиадиазинил, 2H,6H-1,5,2-дитиазинил, тиенил, тиантренил, пиранил, изобензофуранил, хроменил, ксантенил, феноксантинил, 2H-пирролил, изотиазолил, изоксазолил, пиразинил, пиридазинил, индолизинил, изоиндолил, 3H-индолил, 1H-индазолил, пуринил, 4H-хинолизинил, фталазинил, нафтиридинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, птеридинил, 4аH-карбазолил, карбазолил, β-карболинил, фенантридинил, акридинил, пиримидинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, фуразанил, феноксазинил, изохроманил, хроманил, имидазолидинил, имидазолинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиперазинил, индолинил, изоиндолинил, хинуклидинил, морфолинил, оксазолидинил, бензотриазолил, бензизоксазолил, оксиндолил, бензоксазолинил и изатиноил.

[00143] В качестве неограничивающего примера, гетероциклы, присоединенные через атом углерода, присоединены по положению 2, 3, 4, 5 или 6 пиридина, положению 3, 4, 5 или 6 пиридазина, положению 2, 4, 5 или 6 пиримидина, положению 2, 3, 5 или 6 пиразина, положению 2, 3, 4 или 5 фурана, тетрагидрофурана, тиофурана, тиофена, пиррола или тетрагидропиррола, положению 2, 4 или 5 оксазола, имидазола или тиазола, положению 3, 4 или 5 изоксазола, пиразола или изотиазола, положению 2 или 3 азиридина, положению 2, 3 или 4 азетидина, положению 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 хинолина или положению 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 изохинолина. В более типичном случае гетероциклы, присоединенные через атом углерода, включают 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 5-пиридил, 6-пиридил, 3-пиридазинил, 4-пиридазинил, 5-пиридазинил, 6-пиридазинил, 2-пиримидинил, 4-пиримидинил, 5-пиримидинил, 6-пиримидинил, 2-пиразинил, 3-пиразинил, 5-пиразинил, 6-пиразинил, 2-тиазолил, 4-тиазолил или 5-тиазолил.

[00144] В качестве неограничивающего примера, гетероциклы, присоединенные через атом азота, присоединены по положению 1 азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролина, 3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина, 1H-индазола, положению 2 изоиндола или изоиндолина, положению 4 морфолина и положению 9 карбазола или β-карболина. В основном гетероциклы, присоединенные через атом азота, включают1-азиридил, 1-азетедил, 1-пирролил, 1-имидазолил, 1-пиразолил и 1-пиперидинил.

[00145] ʺC3-C8 гетероциклʺ относится к ароматическому или неароматическому C3-C8 карбоциклу, в котором от одного до четырех атомов углерода в кольце независимо друг от друга замещены гетероатомом из группы, состоящей из O, S и N. Типичные примеры C3-C8 гетероцикла включают бензофуранил, бензотиофен, индолил, бензопиразолил, кумаринил, изохинолинил, пирролил, тиофенил, фуранил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, триазолил, хинолинил, пиримидинил, пиридинил, пиридонил, пиразинил, пиридазинил, изотиазолил, изоксазолил и тетразолил, но не ограничиваются ими. C3-C8 гетероцикл может быть незамещенным или замещенным с участием до семи групп, включая -C1-C8 алкильную, -O-(C1-C8 алкильную), -арильную, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN; где каждую R' независимо выбирают из H, -C1-C8 алкила и арила, но не ограничиваясь ими.

[00146] ʺC3-C8 гетероциклоʺ относится к C3-C8 гетероциклической группе, заданной выше, где один из атомов водорода гетероциклической группы замещен связью. C3-C8 гетероцикл может быть незамещенным или замещенным с участием до шести групп, включая -C1-C8 алкильную, -O-(C1-C8 алкильную), -арильную, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN; где каждую R' независимо выбирают из H, -C1-C8 алкила и арила, но не ограничиваясь ими.

[00147] ʺC3-C20 гетероциклʺ относится к ароматическому или неароматическому C3-C8 карбоциклу, в котором от одного до четырех атомов углерода в кольце независимо друг от друга замещены гетероатомом из группы, состоящей из O, S и N. C3-C20 гетероцикл может быть незамещенным или замещенным с участием до семи групп, включая -C1-C8 алкильную, -O-(C1-C8 алкильную), -арильную, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN; где каждую R' независимо выбирают из H, -C1-C8 алкила и арила, но не ограничиваясь ими.

[00148] ʺC3-C20 гетероциклоʺ относится к C3-C20 гетероциклической группе, заданной выше, где один из атомов водорода гетероциклической группы замещен связью.

[00149] "Карбоцикл" означает насыщенное или ненасыщенное кольцо, содержащее от 3 до 7 атомов углерода в случае моноциклической структуры или от 7 до 12 атомов углерода в случае бициклической группы. Моноциклические карбоциклы содержат 3-6 кольцевых атомов, в более типичном случае - 5 или 6 кольцевых атомов. Бициклические карбоциклы содержат 7-12 кольцевых атомов, например, образующих бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6] систему, либо 9 или 10 кольцевых атомов, образующих бицикло[5,6] или [6,6] систему. Примеры моноциклических карбоциклов включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-1-енил, 1-циклопент-2-енил, 1-циклопент-3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-1-енил, 1-циклогекс-2-енил, 1-циклогекс-3-енил, циклогептил и циклооктил.

[00150] "C3-C8 карбоцикл" представляет собой 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-членное насыщенное или ненасыщенное неароматическое карбоциклическое кольцо. Типичные C3-C8 карбоциклы включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентадиенил, циклогексил, циклогексенил, 1,3-циклогексадиенил, 1,4-циклогексадиенил, циклогептил, 1,3-циклогептадиенил, 1,3,5-циклогептатриенил, циклооктил и циклооктадиенил, но не ограничиваются ими. C3-C8 карбоциклическая группа может быть незамещенной или замещенной одной или более группами, включая -C1-C8 алкил, -O-(C1-C8 алкил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN; где каждую R' независимо выбирают из H, -C1-C8 алкила и арила, но не ограничиваясь ими.

[00151] ʺC3-C8 карбоциклоʺ относится к C3-C8 карбоциклической группе, описанной выше, где один из атомов водорода карбоциклической группы замещен связью.

[00152] "Линкер" относится к химической группе, содержащей ковалентную связь или цепь атомов, ковалентно присоединяющей антитело к группе лекарственного вещества. В различных вариантах реализации линкеры содержат двухвалентный радикал, например, алкилдиильные, арилдиильные, гетероарилдиильные группы, например: -(CR2)nO(CR2)n-, повторяющиеся единицы алкилоксигрупп (например, полиэтиленокси, ПЭГ, полиметиленокси) и алкиламиногрупп (например, полиэтиленамино, Jeffamine™); и сложные эфиры и амиды дикарбоновых кислот, в том числе сукцината, сукцинамида, дигликолята, малоната и капроамида. В различных вариантах реализации линкеры могут содержать один или несколько аминокислотных остатков, например, валина, фенилаланина, лизина и гомолизина.

[00153] Термин «хиральный» относится к молекулам, которые обладают свойством не совпадать при наложении со своим зеркальным отображением, в то время как термин «ахиральный» относится к молекулам, которые при наложении совпадают со своим зеркальным отображением.

[00154] Термин "стереоизомеры" относится к соединениям, которые имеют одинаковый химический состав, но различаются расположением атомов или групп в пространстве.

[00155] "Диастереомер" относится к стереоизомеру с двумя или более центрами хиральности, молекулы которых не являются зеркальными отображениями друг друга. Диастереоизомеры имеют различные физические свойства, например, температуры плавления, температуры кипения, спектральные свойства и реакционную способность. Смеси диастереоизомеров можно разделить с помощью аналитических методик с высокой степенью разделения, таких как электрофорез и хроматография.

[00156] Термин "энантиомеры" относится к двум стереоизомерам соединения, которые являются зеркальными отображениями друг друга, не совпадающими при наложении.

[00157] Стереохимические определения и условные обозначения, используемые в настоящем документе, в целом соответствуют S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, т.е. обладающих способностью вращать плоскость плоскополяризованного света. В описании оптически активного соединения приставки D и L или R и S, используют для обозначения абсолютной конфигурации молекулы относительно ее хирального центра(-ов). Префиксы d и l или (+) и (-) используют для обозначения знака поворота плоскополяризованного света соединением, при этом префиксы (-) или l означают, что соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или d является правовращающим. Для данной химической структуры эти стереоизомеры являются одинаковыми, за исключением того, что они представляют собой зеркальные отражения друг друга. Конкретный стереоизомер также можно рассматривать в качестве энантиомера, при этом смесь таких изомеров часто называют энантиомерной смесью. Смесь энантиомеров 50:50 называют рацемической смесью или рацематом; указанная смесь может образовываться в случае, если в химической реакции или процессе отсутствуют стереоселективность или стереоспецифичность. Термины "рацемическая смесь" и "рацемат" относятся к эквимолярной смеси двух типов энантиомеров, не обладающей оптической активностью.

[00158] "Уходящая группа" относится к функциональной группе, которая может быть замещена другой функциональной группой. Некоторые уходящие группы хорошо известны в данной области техники, и их примеры включают галогенид (например, хлорид, бромид, иодид), метансульфонил (мезил), п-толуолсульфонил (тозил), трифторметилсульфонил (трифлат) и трифторметилсульфонат, но не ограничиваются ими.

[00159] Термин "защитная группа" относится к заместителю, который обычно используют для блокирования или защиты конкретной функциональной группы при взаимодействии с другими функциональными группами соединения. Например, "аминозащитная группа" является заместителем, присоединенным к аминогруппе, который блокирует или защищает функциональную аминогруппу в соединении. Подходящие аминозащитные группы включают ацетил, трифторацетил, t-бутоксикарбонил (ВОС), бензилоксикарбонил (CBZ) и 9-флуоренилметиленоксикарбонил (Fmoc), но не ограничиваются ими. Общее описание защитных групп и их применение см. в T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991 или более позднем издании этой книги.

II. КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ

[00160] В одном из аспектов настоящее изобретение частично основано на антителах, связывающихся с HER2, и иммуноконъюгатах, содержащих такие антитела. Антитела и иммуноконъюгаты согласно изобретению, можно использовать, например, для диагностики или лечения HER2-позитивных видов рака.

A. Типичные антитела против HER2

[00161] В настоящем документе предложены выделенные антитела, связывающиеся с доменом I HER2. В некоторых вариантах реализации изобретения, антитела не препятствуют связыванию трастузумаба и/или пертузумаба с HER2. В некоторых вариантах реализации изобретения, антитела не препятствуют связыванию трастузумаба с HER2 и не препятствуют связыванию пертузумаба с HER2. В любом из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, антитела могут представлять собой моноклональные антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела могут представлять собой антитела человека, гуманизированные или химерные антитела.

[00162] Последовательность типичного природного белка-предшественника HER2 человека с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-22) приведена в SEQ ID NO: 1, а последовательность соответствующего зрелого белка HER2 соответствует аминокислотам 23-1255 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения домен I HER2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, домен II имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, домен III имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, а домен IV имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38 (см. Фиг. 10).

Антитело hu7C2 и другие варианты реализации изобретения

[00163] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предлагается антитело против HER2, содержащее по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (а) HVR-H1, содержащей последовательность аминокислот SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; (c) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (d) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (f) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. 14. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предлагается антитело против HER2, содержащее HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 и по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (c) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (d) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (e) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. 14.

[00164] В одном аспекте настоящего изобретения предложено антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности VH HVR, выбранные из (а) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17. 17. В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17. В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело содержит HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения антитело содержит (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17.

[00165] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности VL HVR, выбранные из (а) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (b) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (c) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело содержит (а) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (b) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (c) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

[00166] В другом аспекте настоящего изобретения антитело содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности VH HVR, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (ii) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и (iii) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 17, и (b) VL-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности VL HVR, выбранные из (i) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (c) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

[00167] В другом аспекте настоящего изобретения предлагается антитело, содержащее (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; (c) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (d) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (f) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

[00168] В любом из вышеуказанных вариантов реализации изобретения антитело против HER2 является гуманизированным. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения антитело против HER2 содержит HVR согласно любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения, и дополнительно содержит человеческий акцепторный каркас, например, каркас человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркас. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения акцепторный каркас человека представляет собой консенсусный VL каппа IV каркас человека (VLKIV) и/или VH-каркас1. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения акцепторный каркас человека представляет собой консенсусный VL каппа IV каркас человека (VLKIV) и/или VH-каркас1, содержащий любую из мутаций, описанных в настоящем документе.

[00169] В другом аспекте настоящего изобретения антитело против HER2 содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения VH-последовательность обладает по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело против HER2, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с HER2. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 5 аминокислот SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, замены, инсерции или делеции происходят в участках за пределами HVR (т. е., в FR). Необязательно антитело против HER2 содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 11, в том числе посттрансляционные модификации этой последовательности. В конкретном варианте реализации изобретения VH содержит одну, две или три HVR, выбранные из: (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и (c) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17.

[00170] В другом аспекте настоящего изобретения предложено антитело против HER2 содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах реализации VL-последовательность, обладающая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело против HER2, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с HER2. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 5 аминокислот SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, замены, инсерции или делеции происходят в участках за пределами HVR (т. е., в FR). Необязательно антитело против HER2 содержит VL-последовательность SEQ ID NO: 10, в том числе посттрансляционные модификации этой последовательности. В конкретном варианте реализации изобретения VL содержит одну, две или три HVR, выбранные из (а) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (b) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (c) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

[00171] В другом аспекте предложено антитело против HER2, содержащее VH согласно любому из вышеприведенных вариантов реализации изобретения и VL согласно любому из вышеприведенных вариантов реализации изобретения.

[00172] В одном варианте реализации изобретения антитело содержит VH- и VL-последовательности в SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 10, соответственно, включая посттрансляционные модификации этой последовательности.

[00173] В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложены антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и антитело против HER2, предложенное в настоящем документе. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения предлагается антитело, связывающееся с тем же эпитопом, что и антитело против HER2, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 11 и VL-последовательность SEQ ID NO: 10, соответственно.

[00174] В другом аспекте настоящего изобретения антитело против HER2 содержит последовательность тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения последовательность тяжелой цепи, обладающая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело против HER2, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с HER2. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 5 аминокислот SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, замены, инсерции или делеции происходят в участках за пределами HVR (т. е., в FR). Необязательно антитело против HER2 содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 19, в том числе посттрансляционные модификации этой последовательности. В конкретном варианте реализации изобретения тяжелая цепь содержит одну, две или три HVR, выбранные из: (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и (c) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17.

[00175] В другом аспекте настоящего изобретения предложено антитело против HER2 содержащее легкую цепь, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения последовательность легкой цепи, обладающая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, однако антитело против HER2, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с HER2. В некоторых вариантах реализации замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 10 аминокислот SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения замещены, вставлены и/или удалены в общей сложности от 1 до 5 аминокислот SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, замены, инсерции или делеции происходят в участках за пределами HVR (т. е., в FR). Необязательно антитело против HER2 содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 18, в том числе посттрансляционные модификации этой последовательности. В конкретном варианте реализации изобретения легкая цепь содержит одну, две или три HVR, выбранные из (а) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (b) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (c) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

[00176] В другом аспекте предложено антитело против HER2, содержащее тяжелую цепь согласно любому из вышеприведенных вариантов реализации изобретения и легкую цепь согласно любому из вышеприведенных вариантов реализации изобретения.

[00177] В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело содержит последовательности тяжелой цепи и легкой цепи в SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 18, соответственно, включая посттрансляционные модификации этой последовательности.

[00178] В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложены антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и антитело против HER2, предложенное в настоящем документе. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения предлагается антитело, связывающееся с тем же эпитопом, что и антитело против HER2, содержащее последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 19 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 18, соответственно.

[00179] В настоящем изобретении предложены антитела, содержащие вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и HVR3-LC согласно нумерации Kabat, как показано на Фиг. 1, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и HVR3-HC согласно нумерации Kabat, как показано на Фиг. 2. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC и последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC, как показано на Фиг. 1. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC и последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC, как показано на Фиг. 2.

[00180] В дополнительном аспекте антитело против HER2 согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения представляет собой моноклональное антитело, включая антитело человека. В одном варианте реализации изобретения антитело против HER2 представляет собой фрагмент антитела, например, Fv, Fab, Fab', scFv, диатело или F(ab')2 фрагмент. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения антитело является практически полноразмерным антителом, например, антителом IgG1, антителом IgG2a или антителом другого класса или изотипа, согласно определению, в настоящем документе.

[00181] В дополнительном аспекте антитело против HER2 согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения может включать любую из функций по отдельности или в комбинации, как описано ниже.

1. Сродство антитела

[00182] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антитело, предложенное в настоящем документе, характеризуется константой диссоциации (Kd), составляющей ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 50 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 5 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ, и необязательно составляет ≥ 10-13M. (например, 10-8М или менее, например, от 10-8М до 10-13М, например, от 10-9М до 10-13 М).

[00183] В одном варианте реализации настоящего изобретения Kd измеряют с помощью анализа связывания антигена, меченного радиоактивной меткой (РИА), выполняемого с использованием Fab-версии исследуемого антитела и его антигена, как описано в следующем анализе. Сродство связывания Fab с антигеном в растворе измеряют путем уравновешивания Fab с минимальной концентрацией (125I)-меченного антигена в присутствии серии разведений немеченного антигена, с последующим захватом связанного антигена с помощью планшета с иммобилизованным антителом против Fab (см., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Для определения условий анализа многолуночные планшеты MICROTITER® (Thermo Scientific) покрывали в течение ночи 5 мкг/мл антитела для захвата Fab (Cappel Labs) в 50 мМ растворе карбоната натрия (pH 9,6), а затем блокировали 2% (масс./об.) раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение двух-пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23 °C). В неадсорбирующем планшете (Nunc №269620) смешивали 100 пМ или 26 пМ [125I]-антигена с последовательно разбавленными растворами исследуемых Fab (например, в соответствии с оценкой антител Fab-12 против фактора роста эндотелия сосудов в работе Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Затем исследуемый Fab инкубировали в течение ночи; в то же время, инкубирование могло продолжаться в течение более длительного периода (например, около 65 часов) для гарантии достижения равновесия. Затем смесь переносили на планшет для захвата и инкубировали при комнатной температуре (например, в течение часа). Затем удаляли раствор и промывали планшет восемь раз 0,1% полисорбатом-20 (TWEEN-20®) в PBS. После высушивания планшетов добавляли 150 мкл сцинтиллятора (MICROSCINT-20TM; Packard) на лунку и производили подсчет планшетов на гамма-счетчике TOPCOUNTTM(Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, обеспечивавшие связывание, меньшее или равное 20% от максимального, отбирали для использования в конкурентном анализе связывания.

[00184] Согласно еще одному варианту реализации, Kd измеряют с помощью анализа на основе поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIACORE®-2000 или BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, штат Нью-Джерси) при 25°C с чипами CM5, иммобилизованными антигеном при ~ 10 единицах ответа (RU). Вкратце, чипы биосенсора с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIACORE, Inc.) активировали N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидгидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разбавляли 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) и вводили при скорости потока 5 мкл/мин, достигая приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После введения антигена вводили 1 М раствор этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Для измерений кинетики двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) вводят в PBS с 0,05% поверхностно-активным веществом полисорбатом-20 (TWEEN-20TM) (PBST) при 25 °С при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и диссоциации (koff) рассчитывали с помощью простейшей модели связывания Ленгмюра при соотношении один к одному (программное обеспечение BIACORE® Evaluation Software версии 3.2) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) рассчитывали как отношение koff/kon. См., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Если скорость ассоциации согласно вышеописанному анализу поверхностного плазмонного резонанса превышает 106 M-1 с-1, то ее можно определить с помощью методики гашения флуоресценции, измеряющей увеличение или снижение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение=295 нм; испускание=340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C для 20 нМ раствора антител против антигена (в форме Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, измеренных на спектрометре, например, на спектрофотометре с устройством остановки потока (Aviv Instruments) или спектрофотометре SLM-AMINCOTM 8000 серии (ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой.

2. Фрагменты антител

[00185] В некоторых вариантах реализации антитело, предложенное в настоящем документе, представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антител включают, но не ограничиваются ими, фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv и scFv, и другие фрагменты, описанные ниже. Обзор некоторых фрагментов антител см. в Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Обзор некоторых фрагментов антител, см., например, Pluckthün, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); см. также WO 93/16185; и патенты США № 5571894 и 5587458. Обсуждение Fab и F(ab')2 фрагментов, содержащих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации и обладающих увеличенным периодом полужизни in vivo, см. в патенте США № 5869046.

[00186] Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими. См., например, EP 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Триатела и тетратела также описаны в публикации Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

[00187] Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, полностью или частично содержащие вариабельный домен тяжелой цепи или полностью, или частично содержащие вариабельный домен легкой цепи антитела. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело человека (Domantis, Inc., Уолтем, штат Массачусетс, США; см., например, патент США № 6248516 B1).

[00188] Фрагменты антител можно получить различными способами, включая протеолитический гидролиз интактного антитела, а также продукцию рекомбинантными клетками-хозяевами (например, E. coli или фагом), как описано в настоящем документе, но не ограничиваясь ими.

3. Химерные и гуманизированные антитела

[00189] В некоторых вариантах реализации антитело, предложенное в настоящем документе, представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте США № 4816567; и в Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). В одном примере химерное антитело содержит вариабельную область нечеловеческого происхождения (например, вариабельную область, происходящую от антитела мыши, крысы, хомяка, кролика или примата, не являющегося человеком, например, обезьяны) и константную область человека. В еще одном примере химерное антитело представляет собой антитело с ʺпереключенным классомʺ, в котором изменен класс или подкласс по сравнению с родительским антителом. Термин ʺхимерные антителаʺ включает антигенсвязывающие фрагменты таких антител.

[00190] В некоторых вариантах реализации химерное антитело является гуманизированным антителом. Как правило, антитело нечеловеческого происхождения гуманизируют с целью снижения иммуногенности для человека, сохраняя при этом специфичность и сродство исходного антитела нечеловеческого происхождения. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их фрагменты) происходят от антитела нечеловеческого происхождения, а FR (или их фрагменты) происходят от последовательностей антитела человека. Гуманизированное антитело также необязательно содержит по меньшей мере фрагмент константного участка антитела человека. В некоторых вариантах реализации некоторые FR-остатки в гуманизированном антителе заменяют соответствующими остатками антитела нечеловеческого происхождения (например, антитела, из которого получены остатки HVR), например, с целью восстановления или улучшения специфичности, или сродства антитела.

[00191] Гуманизированные антитела и способы их изготовления рассмотрены, например, в публикациях Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), и дополнительно описаны, например, в статьях, например, в Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); патентах США № 5821337, 7527791, 6982321, и 7087409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (где описана пересадка SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (где описано ʺизменение поверхностиʺ); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (где описана ʺперетасовка FRʺ); и Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005), и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (где описан подход ʺуправляемого выбораʺ перетасовки FR).

[00192] Каркасные области человека, которые можно использовать для гуманизации, включают: каркасные области, выбранные с использованием метода ʺнаилучшего соответствияʺ (см., например, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); каркасные области, происходящие от консенсусной последовательности антител человека конкретной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепи (см., например, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); и Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); зрелые (содержащие соматические мутации) каркасные области человека или эмбриональные каркасные области человека (см., например, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); и каркасные области, полученные при скрининге библиотек FR (см., например, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

4. Антитела человека

[00193] В некоторых вариантах реализации антитело, предложенное в настоящем документе, представляет собой антитело человека. Человеческие антитела можно получить, используя различные методики, известные в данной области техники. Антитела человека в общих чертах описаны в статьях van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

[00194] Антитела человека можно получить путем введения иммуногена трансгенному животному, модифицированному с целью продукции интактных антител человека или интактных антител с вариабельными областями человека в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные, как правило, целиком или частично содержат локусы иммуноглобулинов человека, замещающие эндогенные локусы иммуноглобулинов или локализованные вне хромосом или случайным образом интегрированные в хромосомы животного. Как правило, у таких трансгенных мышей инактивированы эндогенные локусы иммуноглобулинов. Обзор способов получения антител человека из трансгенных животных см. в Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). См. также, например, патенты США № 6075181 и 6150584, в которых описана технология XENOMOUSETM; патент США № 5770429 в котором описана технология HuMab®; патент № 7041870, в котором описана технология K-M MOUSE®, и публикацию заявки на патент США № US 2007/0061900, в которой описана технология VelociMouse®). Вариабельные области человека из интактных антител, генерируемых такими животными, можно дополнительно модифицировать, например, путем объединения с другой константной областью человека.

[00195] Человеческие антитела можно получить с помощью способов на основе гибридом. Описаны линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для продукции моноклональных антител человека. См., например, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Антитела человека, полученные посредством технологии на основе B-клеточной гибридомы человека, также описаны в Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Дополнительные способы включают способы, описанные, например, в патенте США № 7189826 (где описана продуцирование моноклональных IgM-антител человека гибридомной линией) и статье Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (где описаны гибридомы человека-человека). Технология на основе гибридомы человека (Trioma technology) также описана в статьях Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

[00196] Антитела человека также можно получить путем выделения Fv-клона последовательностей вариабельного домена, выбранных из библиотек фагового дисплея человеческого происхождения. Такие последовательности вариабельного домена затем можно объединять с желательными константными доменами человека. Методики отбора антител человека из библиотек антител описаны ниже.

5. Антитела, полученные из библиотек

[00197] Антитела согласно изобретению, можно выделить путем скрининга комбинаторных библиотек на предмет антител с желательной активностью или активностями. Например, в данной области техники известны различные способы получения библиотек фагового дисплея и скрининг таких библиотек на предмет антител, обладающих желательными характеристиками связывания. Такие методы рассмотрены, например, в публикации Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) и дополнительно описаны, например, в статьях McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

[00198] В некоторых способах на основе фагового дисплея репертуары VH- и VL-генов по отдельности клонировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и случайным образом рекомбинировали в фаговых библиотеках, которые затем можно подвергать скринингу на предмет антигенсвязывающего фага, как описано в статье Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Фаг обычно осуществляет дисплей фрагментов антитела в виде одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv) или Fab-фрагментов. Библиотеки из иммунизированных источников позволяют получить антитела с высоким сродством к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. В качестве альтернативы, можно клонировать наивный репертуар (например, человека) для получения единого источника антител к широкому спектру чужеродных антигенов и аутоантигенов без иммунизации, как описано в статье Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Наконец, наивные библиотеки можно также получить путем синтеза, клонируя сегменты V-генов стволовых клеток, не подвергавшиеся реаранжировке, и используя ПЦР-праймеры, содержащие случайные последовательности, для кодирования гипервариабельной области CDR3 и осуществления реаранжировки in vitro как описано в статье Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, в которых описаны фаговые библиотеки человеческих антител, включают, например, патент США № 5750373 и патентные публикации США № 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.

[00199] Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек антител человека, в настоящем документе считаются антителами человека или фрагментами антител человека.

6. Полиспецифические антитела

[00200] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело, предложенное в настоящем документе, представляет собой полиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Полиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, специфически связывающиеся с по меньшей мере двумя различными сайтами. В некоторых вариантах реализации изобретения одна из специфичностей связывания относится к HER2, а другая - к любому другому антигену. В некоторых вариантах реализации изобретения одна из специфичностей связывания относится к HER2, а другая - к CD3. См., например, патент США № 5821337. В некоторых вариантах реализации изобретения биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами HER2. Кроме того, для локализации цитотоксических агентов в области клеток, экспрессирующих HER2, можно использовать биспецифические антитела. Биспецифические антитела можно получить в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

[00201] Способы изготовления полиспецифических антител включают рекомбинантную совместную экспрессию двух пар тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина с различной специфичностью (см. Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, и Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), и инженерию согласно стратегии «выступ-во-впадину» (см., например, патент США № 5731168). Термин «выступ-во-впадину» или технология ʺKnHʺ, используемые в настоящем документе, относятся к технологии, направляющей спаривание двух полипептидов вместе in vitro или in vivo путем введения выступа (выпячивания) в один полипептид и полости (впадины) в другой полипептид на поверхности взаимодействия, с помощью которой они взаимодействуют. Например, KnH были встроены в поверхности связывания Fc:Fc, поверхности связывания CL:CH1 или поверхности связывания VH/VL антител (см., например, US 2011/0287009, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431, Zhu et al., 1997, Protein Science 6:781-788 и WO2012/106587). В некоторых вариантах реализации изобретения, KnH управляет спариванием двух разных тяжелых цепей вместе при образовании мультиспецифических антител. Например, мультиспецифические антитела, имеющие KnH в своих участках Fc могут дополнительно содержать единичные вариабельные домены, связанные с каждым участком FC, или дополнительно содержать различные вариабельные домены тяжелой цепи, спаренные с одинаковыми или разными вариабельными доменами легкой цепи. Технология KnH может также использоваться, для спаривания вместе двух разных внеклеточных доменов рецептора или любых других полипептидных последовательностей, которые содержат различные целевые последовательности распознавания (например, включая аффитела, пептитела (пептид-ассоциированные антитела) и другие слияния Fc).

[00202] Термин ʺмутация выступаʺ, используемый в настоящем документе, относится к мутации, которая вводит выступ (выступ) в полипептид на поверхность взаимодействия, при помощи которой полипептид взаимодействует с другим полипептидом. В некоторых вариантах реализации изобретения другой полипептид имеет ʺмутацию впадиныʺ

[00203] Термин ʺмутация впадиныʺ, используемый в настоящем документе, относится к мутации, которая вводит полость (впадину) в полипептид на поверхность взаимодействия, при помощи которой полипептид взаимодействует с другим полипептидом. В некоторых вариантах реализации изобретения другой полипептид имеет ʺмутацию выступаʺ.

[00204] Краткое, неограничивающее обсуждение приводится ниже.

[00205] ʺВыступʺ относится к по меньшей мере одной аминокислотной боковой цепи, которая выступает из поверхности взаимодействия первого полипептида и, следовательно, позиционируемая с компенсационной полостью на прилегающей поверхности взаимодействия (например, поверхности взаимодействия второго полипептида), с тем чтобы стабилизировать гетеромультимер, и тем самым сдвинуть равновесие в пользу образования гетеромультимеров вместо образования гомомультимеров, например. Выступ может существовать в природной поверхности взаимодействия или может быть введен искусственно (например, путем изменения нуклеиновых кислот, кодирующих поверхность взаимодействия). В некоторых вариантах реализации изобретения, нуклеиновую кислоту, кодирующую поверхность взаимодействия первого полипептида изменяют для кодирования выступа. Чтобы добиться этого, нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один ʺоригинальныйʺ аминокислотный остаток в поверхности взаимодействия первого полипептида заменяется нуклеиновой кислотой, кодирующей, по меньшей мере один ʺвведенныйʺ аминокислотный остаток, который имеет больший объем боковой цепи, чем оригинальный аминокислотный остаток. Понятно, что в этом случае может быть более одного оригинального и соответствующего введенного остатка. Размеры боковой цепи различных аминокислотных остатков приведены в Таблице 1 US2011/0287009. Мутация, необходимая для введения ʺвыступаʺ может быть названа ʺмутацией выступаʺ.

[00206] В некоторых вариантах реализации изобретения введенные остатки для формирования выступа представляют собой природные аминокислотные остатки, выбранные из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y) и триптофана (W). В некоторых вариантах реализации изобретения введенный остаток представляет собой триптофан или тирозин. В некоторых вариантах реализации изобретения оригинальный остаток для формирования выступа имеет небольшой объем боковой цепи, такой как аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глицин, серин, треонин или валин.

[00207] ʺПолостьʺ относится к по меньшей мере одной аминокислотной боковой цепи, которая утоплена в поверхность взаимодействия второго полипептида и, следовательно, вмещает соответствующий выступ на прилегающей поверхности взаимодействия первого полипептида. Полость может существовать в природной поверхности взаимодействия или может быть введена искусственно (например, путем изменения нуклеиновых кислот, кодирующих поверхность взаимодействия). В некоторых вариантах реализации изобретения, нуклеиновую кислоту, кодирующую поверхность взаимодействия второго полипептида изменяют для кодирования полости. Чтобы добиться этого, нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один ʺоригинальныйʺ аминокислотный остаток в поверхности взаимодействия второго полипептида заменяется нуклеиновой кислотой, кодирующей, по меньшей мере один ʺвведенныйʺ аминокислотный остаток, который имеет меньший объем боковой цепи, чем оригинальный аминокислотный остаток. Понятно, что в этом случае может быть более одного оригинального и соответствующего введенного остатка. В некоторых вариантах реализации изобретения, введенные остатки для формирования полости представляют собой природные аминокислотные остатки, выбранные из аланина (A), серина (S), треонина (T) и валина (V). В некоторых вариантах реализации изобретения введенный остаток представляет собой серин, аланин или треонин. В некоторых вариантах реализации изобретения оригинальный остаток для формирования полости имеет большой объем боковой цепи, такой как тирозин, аргинин, фенилаланин или триптофан. Мутация, необходимая для введения ʺполостиʺ может быть названа ʺмутацией впадиныʺ.

[00208] Выступ является ʺпозиционируемымʺ в полости, это означает, что пространственное расположение выступа и полости на поверхности взаимодействия первого полипептида и второго полипептида, соответственно, и размеры выступа и полости являются такими, что выступ может быть расположен в полости, существенно не нарушая нормальную ассоциацию первого и второго полипептидов на поверхности взаимодействия. Поскольку выступы, такие как Tyr, Phe и Trp обычно не выступают перпендикулярно от оси поверхности взаимодействия и обладают предпочтительной конформацией, выравнивание выступа с соответствующей полостью может, в некоторых случаях зависеть от моделирования пары выступ/полость на основе трехмерной структуры, например, полученные в результате рентгеноструктурного анализа или ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Это может быть достигнуто с использованием различные методик, известных в данной области техники.

[00209] В некоторых вариантах реализации изобретения мутация выступа в константной области IgG1 представляет собой T366W (нумерация EU). В некоторых вариантах реализации изобретения мутация впадины в константной области IgG1 включает одну или более мутаций, выбранных из T366S, L368A и Y407V (нумерация EU). В некоторых вариантах реализации изобретения мутация впадины в константной области IgG1 включает T366S, L368A и Y407V (нумерация EU).

[00210] В некоторых вариантах реализации изобретения мутация выступа в константной области IgG4 представляет собой T366W (нумерация EU). В некоторых вариантах реализации изобретения мутация впадины в константной области IgG4 включает одну или более мутаций, выбранных из T366S, L368A и Y407V (нумерация EU). В некоторых вариантах реализации изобретения мутация впадины в константной области IgG4 включает T366S, L368A и Y407V (нумерация EU).

[00211] Полиспецифические антитела также можно получить за счет конструирования электростатических направляющих эффектов для создания гетеродимерных молекул на основе Fc антител (WO 2009/089004A1); перекрестного сшивания двух или более антител или фрагментов (см., например, патент США № 4676980, и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); использования лейциновых «молний» для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); использования технологии ʺдиателʺ для изготовления биспецифических фрагментов антител (см., например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); и использования одноцепочечных Fv (sFv)-димеров (см., например, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); и получение триспецифических антител, описанное, например, в Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

[00212] Сюда входит также конструирование антител с тремя или более функциональными антигенсвязывающими сайтами, в том числе «антител-осьминогов» (см., например, US 2006/0025576A1).

[00213] В настоящем документе антитело или фрагмент также включает ʺFAb двойного действияʺ или ʺDAFʺ, содержащее антигенсвязывающий сайт, связывающийся с HER2, а также еще одним, отличающимся от него, антигеном (см., например, US 2008/0069820).

7. Варианты антител

[00214] В некоторых вариантах реализации изобретения рассматриваются варианты аминокислотных последовательностей антител, предложенных в настоящем документе. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотных последовательностей антитела можно получить путем внесения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечного конструкта можно внести любую комбинацию делеций, инсерций и замен при условии, что конечный конструкт обладает желательными характеристиками, например, связыванием с антигеном.

a) Варианты замен, вставок и делеций

[00215] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются варианты антител, содержащие одну или более аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для заместительного мутагенеза, включают HVR и FR. Консервативные замены приведены в Таблице 1 под заголовком "предпочтительные замены". Более существенные изменения приведены в Таблице 1 под заголовком "типичные замены" и подробно описаны ниже по отношению к классам боковой цепи аминокислот. В исследуемое антитело можно внедрить аминокислотные замены и исследовать продукты посредством скрининга на предмет желательной активности, например, сохранения/улучшения связывания антигена, снижения иммуногенности или улучшения ADCC или CDC.

ТАБЛИЦА 1

Первоначальный
остатокТипичные
заменыПредпочтительные
заменыAla (A)Val; Leu; IleValArg (R)Lys; Gln; AsnLysAsn (N)Gln; His; Asp, Lys; ArgGlnAsp (D)Glu; AsnGluCys (C)Ser; AlaSerGln (Q)Asn; GluAsnGlu (E)Asp; GlnAspGly (G)AlaAlaHis (H)Asn; Gln; Lys; ArgArgIle (I)Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцинLeuLeu (L) норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; PheIleLys (K)Arg; Gln; AsnArgMet (M)Leu; Phe; IleLeuPhe (F)Trp; Leu; Val; Ile; Ala; TyrTyrPro (P)AlaAlaSer (S)ThrThrThr (T)Val; SerSerTrp (W)Tyr; PheTyrTyr (Y)Trp; Phe; Thr; SerPheVal (V)Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцинLeu

Аминокислоты можно сгруппировать по общим свойствам боковой цепи:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

[00216] Неконсервативные замены приводят к замене представителя одного из этих классов на представителя другого класса.

[00217] Один тип вариантов, полученных путем замены, включает замену одного или более остатков гипервариабельной области исходного антитела (например, гуманизированного антитела или антитела человека). Как правило, полученный(е) вариант(ы), отобранные для дальнейшего исследования, характеризуются модификациями (например, улучшением) определенных биологических свойств (например, повышенным сродством, сниженной иммуногенностью) по сравнению с исходным антителом и/или в значительной степени сохраняют определенные биологические свойства исходного антитела. Типичный вариант, получаемый путем замены, представляет собой антитело с созревшим сродством, которое легко получить, например, с использованием методик созревания сродства на основе фагового дисплея, например, описанных в настоящем документе. Вкратце, один или несколько остатков HVR мутируют и вариантные антитела подвергают фаговому дисплею и скринингу на предмет конкретной биологической активности (например, сродства связывания).

[00218] Модификации (например, замены) можно внести в HVR, например, для улучшения сродства антитела. Такие модификации можно внести в «горячие точки» HVR, т.е. остатки, кодируемые кодонами, с высокой частотой подвергающимися мутациям во время соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. Biol. 207:179-196 (2008)) и/или SDR (a-CDR), с тестированием полученного варианта VH или VL на аффинность связывания. Созревание сродства путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек описано, например, в Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) В некоторых вариантах реализации созревания сродства вносят разнообразие в вариабельные гены, выбранные для созревания, любым из различных способов (например, ПЦР пониженной точности, перетасовки цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). Затем создают вторичную библиотеку. Затем библиотеку подвергают скринингу с целью идентификации любых вариантов антител, обладающих желательной аффинностью. Еще один способ внесения разнообразия включает HVR-направленные подходы, в которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков одновременно). Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, можно специфически определить, например, с помощью мутагенеза с аланиновым сканированием или моделирования. При этом мишенями часто являются CDR-H3 и CDR-L3.

[00219] В некоторых вариантах реализации изобретения замены, вставки или делеции могут возникать в одном или более HVR при условии, что такие модификации по существу не снижают способность антитела к связыванию антигена. Например, в HVR можно ввести консервативные модификации (например, консервативные замены, как предложено в настоящем документе), которые не снижают сродство в значительной степени. Такие модификации могут располагаться за пределами ʺгорячих точекʺ HVR или SDR. В некоторых вариантах реализации вариантов VH- и VL-последовательностей, предложенных выше, каждая HVR является немодифицированной или содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.

[00220] Пригодный способ выявления остатков или областей антитела, которые могут являться мишенями для мутагенеза, называется ʺмутагенезом с аланиновым сканированиемʺ, как описано Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. В данном способе выявляют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженных остатковтаких как arg, asp, his, lys и glu) и замещают их нейтральными или отрицательно заряженными аминокислотами (например, аланином или полиаланином) с целью определить, влияет ли это на взаимодействие антитела с антигеном. В аминокислотные положения, демонстрирующие функциональную чувствительность к первоначальной замене, можно ввести дополнительные замены. В альтернативном или дополнительном варианте для выявления точек контакта между антителом и антигеном используют кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело. Такие контактные остатки и соседние остатки можно использовать в качестве мишеней или удалять из кандидатов для замены. Варианты можно подвергать скринингу с целью определения наличия у них желательных свойств.

[00221] Вставки аминокислотных последовательностей включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния с диапазоном длины от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности одного или множества аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают присоединение к N- или C-концу антитела фермента (например, для ADEPT) или полипептида, что увеличивает период полужизни антитела в сыворотке.

b) Варианты гликозилирования

[00222] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело, предложенное в настоящем документе, модифицируют с целью увеличения или уменьшения степени гликозилирования антитела. Добавление или делецию сайтов гликозилирования в антителе легко осуществить путем модификации аминокислотной последовательности, приводящей к созданию или удалению одного, или более сайтов гликозилирования.

[00223] Если антитело содержит Fc-область, то можно модифицировать углевод, присоединенный к ней. Нативные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, обычно содержат разветвленный двуантенарный олигосахарид, обычно присоединенный с помощью N-связи к Asn297 в СН2-домене Fc-области. См., например, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Указанный олигосахарид может содержать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стебле» двухантенарной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах реализации изобретения можно выполнить модификации олигосахарида в антителе согласно настоящему изобретению с целью создания вариантов антител с определенными улучшенными свойствами.

[00224] В одном варианте реализации изобретения предлагаются варианты антител, содержащие углеводную структуру с недостаточным количеством фукозы, присоединенной (непосредственно или косвенно) к Fc-области. Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяют путем расчета среднего количества фукозы в углеводной цепи при Asn297 по отношению к сумме всех углеводных структур, присоединенных к Asn 297 (например, сложных гибридных структур с высоким содержанием маннозы), измеренной с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии, как описано, например, в WO 2008/077546. Asn297 относится к остатку аспарагина, расположенному приблизительно в положении 297 в Fc-области (ЕС-нумерация остатков Fc-области); однако Asn297 также может располагаться на расстоянии приблизительно ± 3 аминокислоты выше или ниже положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, из-за незначительной изменчивости последовательности антител. Такие варианты фукозилирования могут обладать улучшенной ADCC-функцией. См., например, патентные публикации США № US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примеры публикаций, связанных с ʺдефукозилированнымиʺ или ʺфукозодефицитнымиʺ вариантами антитела включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Примеры линий клеток, способных продуцировать дефукозилированные антитела, включают клетки Lec13 CHO, дефектные по фукозилированию белка (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); патентная заявка США № US 2003/0157108 A1, Presta, L; and WO 2004/056312 A1, Adams et al., особенно Пример 11), и линии клеток с нокаутом, например, клетки CHO с нокаутом гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы FUT8, (см., например, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006) и WO2003/085107).

[00225] Кроме того, предложены варианты антител с олигосахаридами, разделенными пополам, например, в которых двухантенарный олигосахарид, присоединенный к Fc-области антитела, разделен по GlcNAc. Такие варианты антител могут характеризоваться сниженным фукозилированием и/или улучшенной ADCC-функцией. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); патенте США № 6602684 (Umana et al.); и US 2005/0123546 (Umana et al.). Кроме того, предложены варианты антител, содержащие по меньшей мере один остаток галактозы в составе олигосахарида, присоединенного к Fc-области. Такие варианты антител могут обладать улучшенной CDC-функцией. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); и WO 1999/22764 (Raju, S.).

c) Варианты Fc-области

[00226] В некоторых вариантах реализации в Fc-область антитела, предложенного в настоящем документе, можно ввести одну или более аминокислотную модификацию, тем самым получая вариант Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательность Fc-области человека (например, Fc-области IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или более аминокислотных положениях.

[00227] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения рассмотрен вариант антитела, обладающий некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его желательным кандидатом для вариантов применения, при которых важен период полужизни антитела in vivo, а некоторые эффекторные функции (например, комплемент и ADCC) не нужны или вредны. Для подтверждения снижения/ослабления CDC- и/или ADCC-активности можно выполнить анализ цитотоксичности in vitro и/или in vivo. Например, чтобы убедиться в отсутствии связывания антитела с FcγR (и, следовательно, отсутствии ADCC-активности) при сохранении способности связывания с FcRn, можно выполнить анализ связывания Fc-рецептора (FcR). Основные клетки, опосредующие ADCC, NK-клетки, экспрессируют только Fc(RIII, в то время как моноциты экспрессируют Fc(RI, Fc(RII и Fc(RIII. Сводная информация об экспрессии FcR на гемопоэтических клетках приведена в Таблице 3 на странице 464 статьи Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Неограничивающие примеры анализа in vitro для оценки ADCC-активности исследуемой молекулы описаны в патенте США № 5500362 (см, например, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) и Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (see Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). В качестве альтернативы можно использовать виды анализа, не связанные с использованием радиоактивных веществ (см., например, анализ цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии без использования радиоактивных веществ (CellTechnology, Inc., Маунтин-Вью, штат Калифорния, США; и анализ цитотоксичности CytoTox 96® без использования радиоактивных веществ (Promega, Мэдисон, штат Висконсин, США). Эффекторные клетки, пригодные для такого анализа, включают мононуклеары периферической крови (МПК) и естественные киллеры (NK). В качестве альтернативы или дополнения, ADCC-активность молекулы, представляющей интерес, можно оценить in vivo, например, на животной модели, например, согласно описанию в публикации Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Кроме того, можно выполнить анализ связывания C1q с целью подтверждения неспособности антитела связывать C1q и, следовательно, отсутствия CDC-активности. См., например, твердофазный ИФА связывания C1q и C3c в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно выполнить анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); и Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Кроме того, можно определить связывание и выведение/период полужизни FcRn in vivo с использованием способов, известных в данной области техники (см., например, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

[00228] В некоторых вариантах реализации изобретения в Fc-область антитела, предложенного в настоящем документе, можно ввести одну или более аминокислотную модификацию, для повышения связывания IgG с неонатальным Fc-рецептором. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит следующие три мутации в соответствии с нумерацией EU: M252Y, S254T и T256E (ʺмутация YTEʺ) (патент США № 8697650; см., также Dall'Acqua et al., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006). В некоторых вариантах реализации изобретения мутация YTE не влияет на способность антитела связываться его родственным антигеном. В некоторых вариантах реализации изобретения мутация YTE увеличивает период полужизни антитела в сыворотке по сравнению с нативным (т.е. без мутации YTE) антителом. В некоторых вариантах реализации изобретения мутация YTE увеличивает увеличивает период полужизни антитела в сыворотке в 3 раза по сравнению с нативным (т.е. без мутации YTE) антителом. В некоторых вариантах реализации изобретения мутация YTE увеличивает увеличивает период полужизни антитела в сыворотке в 2 раза по сравнению с нативным (т.е. без мутации YTE) антителом. В некоторых вариантах реализации изобретения мутация YTE увеличивает увеличивает период полужизни антитела в сыворотке в 4 раза по сравнению с нативным (т.е. без мутации YTE) антителом. В некоторых вариантах реализации изобретения мутация YTE увеличивает увеличивает период полужизни антитела в сыворотке в 5 раз по сравнению с нативным (т.е. без мутации YTE) антителом. В некоторых вариантах реализации изобретения мутация YTE увеличивает увеличивает период полужизни антитела в сыворотке в 10 раз по сравнению с нативным (т.е. без мутации YTE) антителом. См., например, патент США № 8697650; см., также Dall'Acqua et al., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006).

[00229] В некоторых вариантах реализации изобретения мутация YTE обеспечивает средство для модуляции антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической (АЗКЦ) активности антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения мутация YTEO обеспечивает средство для модуляции АЗКЦ активности гуманизированного антитела IgG, направленного против антигена человека. См., например, патент США № 8697650; см., также Dall'Acqua et al., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006).

[00230] В некоторых вариантах реализации изобретения мутация YTE обеспечивает одновременную модуляцию полужизни в сыворотке, распределения в тканях и активности антитела (например, АЗКЦ активности антитела IgG). См., например, патент США № 8697650; см., также Dall'Acqua et al., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006).

[00231] Антитела с пониженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или более остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 Fc-области (патент США № 6737056). Такие Fc-мутанты включают Fc-мутантов с заменами в двух или более аминокислотных положениях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемые Fc-мутанты ʺDANAʺ с заменой остатков 265 и 297 на аланин (патент США № 7332581).

[00232] В некоторых вариантах реализации изобретения пролин в позиции 329 (нумерация EU) (P329) в Fс-участке дикого типа человека заменяется на глицин или аргинин, или аминокислотный остаток достаточно большой, чтобы уничтожить пролиновый сэндвич в поверхности взаимодействия Fc/Fcγ рецептора, который образовался между P329 Fc и остатками триптофана W87 и W110 FcgRIII (Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 July 2000)). В дополнительном варианте реализации изобретения по меньшей мере одна дополнительная аминокислотная замена в варианте Fc представляет собой S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D и P331S, а в еще одном дополнительном варианте реализации изобретения указанная по меньшей мере одна дополнительная аминокислотная замена представляет собой L234A и L235A Fc-участка человеческого IgG1 или S228P и L235E Fc-участка человеческого IgG4, все согласно нумерации EU (патент США № 8969526 который в полном объеме включен в настоящий документ посредством ссылки).

[00233] В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид содержит вариант Fc Fc-участка человеческого IgG дикого типа, в котором полипептид имеет P329 в Fс участке человеческого IgG замененный на глицин, причем вариант Fc содержит по меньшей мере две аминокислотные замены в L234A и L235A в Fс участке человеческого IgG1 или S228P и L235E в Fс-участке человеческого IgG4, при этом остатки пронумерованы в соответствии с нумерацией EU (патент США № 8969526, который в полном объеме включен в настоящий документ посредством ссылки). В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид, содержащий замены P329G, L234A и L235A (нумерация EU) проявляет сниженную аффинность к человеческому FcγRIIIA и FcγRIIA, для снижения АЗКЦ до по меньшей мере 20% от АЗКЦ, вызванной полипептидом, содержащим Fc-участок человеческого IgG дикого типа и/или для модуляции АЗКФ (антителозависимого клеточного фагоцитоза) (патент США № 8969526 который в полном объеме включен в настоящий документ посредством ссылки).

[00234] В конкретном варианте реализации изобретения полипептид, содержащий вариант Fс человеческого Fc-полипептида дикого типа содержит тройную мутацию: мутация аминокислотной замены в положении Pro329, а L234A и L235A в соответствии с нумерацией EU (P329/LALA) (патент США № 8969526 который в полном объеме включен в настоящий документ посредством ссылки). В конкретных вариантах реализации изобретения полипептид содержит следующие аминокислотные замены: P329G, L234A и L235A согласно нумерации EU.

[00235] Описаны некоторые варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcR. (См., например, патент США № 6737056; WO 2004/056312 и Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)

[00236] В некоторых вариантах реализации вариант антитела содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, улучшающими АЗКЦ, например, заменами в положениях 298, 333 и 334 Fc-области (нумерация остатков EU).

[00237] В некоторых вариантах реализации вносят изменения в Fc-область, что приводит к изменению (т.е. улучшению или снижению) связывания C1q и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в патенте США № 6194551, WO 99/51642 и Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

[00238] Антитела с увеличенным периодом полужизни и улучшенным связыванием с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который отвечает за передачу материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Указанные антитела содержат Fc-область с одной или более заменами, которые улучшают связывание Fc-области с FcRn. Такие варианты Fc включают варианты с заменами одного или более остатков Fc-области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, заменой остатка 434 Fc-области (патент США № 7371826).

[00239] См. также Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); патент США № 5648260; патент США № 5624821; и WO 94/29351 в отношении других примеров вариантов FC-области.

d) Варианты антител, сконструированные с использованием остатков цистеина

[00240] В некоторых вариантах реализации изобретения может быть желательно создать антитела, сконструированные с использованием остатков цистеина, например, «THIOMAB™», в которых один или несколько остатков замещены остатками цистеина. В конкретных вариантах реализации изобретения замещенные остатки расположены в сайтах антитела, которые способны к конъюгации. За счет замены этих остатков на цистеин в доступных сайтах антитела располагают реакционноспособные тиоловые группы, которые можно использовать для конъюгирования антитела с другими группами, например, молекулами лекарственного вещества или молекулами линкер-лекарственное средство с целью создания иммуноконъюгата, как описано далее в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения можно заменить на цистеин один или более из следующих остатков: K149 (нумерация Kabat) легкой цепи; V205 (нумерация Kabat) легкой цепи; A118 (нумерация EU) тяжелой цепи; A140 (нумерация EU) тяжелой цепи; L174 (нумерация EU) тяжелой цепи; Y373 (нумерация EU) тяжелой цепи; и S400 (нумерация EU) Fc-области тяжелой цепи. В конкретном варианте реализации изобретения, антитела, описанные в настоящем документе, содержат цистеиновую замену HC-A14°C (нумерация EU). В конкретном варианте реализации изобретения, антитела, описанные в настоящем документе, содержат цистеиновую замену LC-K149C (нумерация Kabat). В конкретном варианте реализации изобретения, антитела, описанные в настоящем документе, содержат цистеиновую замену HC-A118C (нумерация EU). Антитела, сконструированные с использованием остатков цистеина, можно получить, как описано, например, в патенте США № 7521541.

[00241] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит одну из следующих цистеиновых замен тяжелой цепи:

Цепь (HC/LC)ОстатокСайт мутации, нумерация EU №Сайт мутации, нумерация Kabat №HCT114110HCA140136HCL174170HCL179175HCT187183HCT209205HCV262258HCG371367HCY373369HCE382378HCS424420HCN434430HCQ438434

[00242] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит одну из следующих цистеиновых замен легкой цепи:

Цепь (HC/LC)ОстатокСайт мутации, нумерация EU №Сайт мутации, нумерация Kabat №LCI106106LC R108108LCR142142LCK149149LC V205205

[00243] Неограничивающий пример hu7C2.v2.2.LA легкой цепи (LC) K149C THIOMAB™ обладает аминокислотными последовательностями тяжелой цепи и легкой цепи из SEQ ID NO: 19 и 23, соответственно. Неограничивающий пример hu7C2.v2.2.LA тяжелой цепи (НC) A118C THIOMAB™ обладает аминокислотными последовательностями тяжелой цепи и легкой цепи из SEQ ID NO: 24 и 18, соответственно.

[00244] Иллюстративная константная область тяжелой цепи с искусственно внедренным остатком цистеина S40°C представлена в SEQ ID NO: 28. Константная область тяжелой цепи с искусственно внедренным остатком цистеина S40°C может быть слита с C-концевым участком тяжелой цепи hu7C2.v2.2.LA, представленным в SEQ ID NO: 11. Итоговая тяжелая цепь hu7C2.v2.2.LA HC S40°C может быть спарена с легкой цепью каппа hu7C2.v2.2.LA, такой как легкая цепь, представленная в SEQ ID NO: 18.

[00245] Иллюстративная константная область легкой цепи с искусственно внедренным остатком цистеина V205C представлена в SEQ ID NO: 25. Константная область легкой цепи с искусственно внедренным остатком цистеина V205C может быть слита с C-концевым участком легкой цепи hu7C2.v2.2.LA, представленным в SEQ ID NO: 10. Итоговая легкая цепь hu7C2.v2.2.LA LC V205C может быть спарена с тяжелой цепью IgG hu7C2.v2.2.LA, такой как тяжелая цепь, представленная в SEQ ID NO: 19.

e) Производные антител

[00246] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело, предлагаемое в настоящем документе, можно дополнительно модифицировать путем введения дополнительных небелковых фрагментов, известных в данной области техники и легкодоступных. Фрагменты, пригодные для получения производных антитела, включают водорастворимые полимеры, но не ограничиваются ими. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или случайные сополимеры) и декстран или поли(n-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси, но не ограничиваются ими. Пропионовый альдегид полиэтиленгликоля может обладать преимуществами при производстве из-за его стабильности в воде. Указанный полимер может обладать любой молекулярной массой и быть разветвленным или неразветвленным. Количество молекул полимера, присоединенных к антителу, может меняться, и при присоединении более чем одного полимера они могут представлять собой одинаковые или разные молекулы. В целом, количество и/или тип полимеров, используемых для получения производных, можно определить с учетом факторов, включающих, но не ограничиваясь ими, конкретные свойства или функции антитела, подлежащие улучшению, независимо от того, будет ли производное антитела использоваться в терапии при определенных условиях, и др.

[00247] В еще одном варианте реализации изобретения предлагаются конъюгаты антитела и небелкового фрагмента, которые можно селективно нагревать посредством облучения. В одном варианте реализации изобретения небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Облучение может быть любой длины волны, включая, но не ограничиваясь ими, длины волн, которые не приносят вреда обычным клеткам, но нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой клетки, находящиеся по соседству с небелковым фрагментом, погибают.

B. Рекомбинантные методики и композиции

[00248] Антитела можно получить с использованием рекомбинантного методик и композиций, например, как описано в патенте США № 4816567. В одном варианте реализации изобретения предлагается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело против HER2, описанное в настоящем документе. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). В дополнительном варианте реализации изобретения предложены один или более векторов (например, экспрессирующих векторов), содержащих такую нуклеиновую кислоту. В дополнительном варианте реализации изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном из таких вариантов реализации изобретения, клетка-хозяин содержит (например, трансформирована): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В одном варианте реализации клетка-хозяин является эукариотической, например, клеткой яичника китайского хомяка (CHO) или лимфоидной клеткой (например, клеткой Y0, NS0, Sp20). В одном варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ получения антитела против HER2, причем указанный способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, как описано выше, в условиях, пригодных для экспрессии антитела, и, в некоторых случаях, извлечение антитела из клетки-хозяина (или среды, в которой культивируют клетку-хозяина).

[00249] Для рекомбинантной продукции антитела против HER2 нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, например, как описано выше, является выделенной и вставлена в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такую нуклеиновую кислоту легко выделить и секвенировать с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела).

[00250] Пригодные клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают прокариотические или эукариотические клетки, описанные в настоящем документе. Например, антитела можно продуцировать в бактериях, в частности, если гликозилирование и Fc-эффекторные функции не являются необходимыми. Экспрессию фрагментов антитела и полипептидов в бактериях см., например, патенты США № 5648237, 5789199 и 5840523. (См. также Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, где описана экспрессия фрагментов антитела в E. coli.) После экспрессии антитела можно выделить из бактериальной биомассы в растворимую фракцию и подвергать дальнейшей очистке.

[00251] В дополнение к прокариотам, пригодными хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, являются эукариотические микроорганизмы, например, мицелиальные грибы или дрожжи, в том числе штаммы грибов и дрожжей с ʺгуманизированнымиʺ путями гликозилирования, что приводит к продукции антитела с профилем гликозилирования, частично или полностью характерным для человека. См., Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

[00252] Пригодные для экспрессии гликозилированного антитела клетки-хозяева также происходят от многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Выявлены многочисленные штаммы бакуловирусов, которые можно использовать в комбинации с клетками насекомых, особенно для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

[00253] Кроме того, в качестве хозяев можно использовать культуры клеток растений. См., например, патенты США № 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (где описана технология PLANTIBODIESTM, применяемая для продуцирования антител в трансгенных растениях).

[00254] Кроме того, в качестве хозяев можно использовать клетки позвоночных. Например, можно использовать линии клеток млекопитающих, адаптированные к росту в суспензии. Другие примеры подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих представляют собой линию клеток почки обезьяны CV1, трансформированных SV40 (COS-7); эмбриональную линию клеток почки человека (клетки 293 или 293, как описано, например, в статье Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки детеныша хомяка (BHK); клетки Сертоли мыши (клетки TM4, как описано,, например, в Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK; клетки печени крысы линии buffalo (BRL 3A); клетки легких человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562); клетки TRI, как описано, например, в статье Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); клетки MRC 5; и клетки FS4. Другие подходящие линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (CHO), в том числе DHFR клетки CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); и линии миеломных клеток, например, Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, пригодных для продукции антител, см., например, в Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).

C. Анализы

[00255] Антитела против HER2, предложенные в настоящем документе, могут быть идентифицированы, подвергнуты скринингу, или исследованы относительно их физических/химических свойств и/или биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области техники.

[00256] В одном аспекте исследуют антигенсвязывающую активность антитела согласно изобретению, например, с помощью таких известных методов, как твердофазный ИФА, BIACore®, FACS или вестерн-блоттинг.

[00257] В еще одном аспекте для выявления антитела, конкурирующего с любым из антител, описанных в настоящем документе за связывание с HER2, могут быть использованы конкурентные анализы. В некоторых вариантах реализации изобретения такое конкурирующее антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), что и антитело, описанное в настоящем документе. Подробные примеры способов картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлены в Morris (1996) ʺEpitope Mapping Protocols,ʺ in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

[00258] В типичном конкурентном анализе иммобилизованный HER2 инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антителе, связывающееся с HER2 (например, любое из антител, описанных в настоящем документе), и второе немеченое антитело, тестируемое на предмет способности конкурировать с первым антителом за связывание с HER2. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный HER2 инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не содержащем второе немеченое антитело. После инкубирования в условиях, допускающих связывание первого антитела с HER2, удаляют избыток несвязанного антитела и измеряют количество метки, связанной с иммобилизованным HER2. Если количество метки, связанной с иммобилизованным HER2, существенно снижается в анализируемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с HER2. См. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

D. Иммуноконъюгаты

[00259] В настоящем документе также предложены иммуноконъюгаты, содержащие антитело против HER2 согласно изобретению, конъюгированное с одним или более цитотоксическими агентами, например, химиотерапевтическими средствами или лекарственными веществами, ингибиторами роста, токсинами (например, белковыми токсинами, токсинами бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, обладающими ферментативной активностью, или их фрагментами) или радиоактивными изотопами, т.е. радиоконъюгат).

[00260] Иммуноконъюгаты обеспечивают адресную доставку молекулы лекарственного вещества в опухоль, а в некоторых вариантах реализации - внутриклеточное накопление в опухоли, причем системное введение неконъюгированных лекарственных веществ может привести к неприемлемым для нормальных клеток уровням токсичности (Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387).

[00261] Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) являются химиотерапевтическими молекулами адресного действия, которые сочетают в себе свойства антител и цитотоксических лекарственных веществ за счет адресной доставки сильнодействующих цитотоксических лекарственных веществ к антиген-экспрессирующим опухолевым клеткам (Teicher, B.A. (2009) Current Cancer Drug Targets 9:982-1004), тем самым повышая терапевтический индекс за счет максимального увеличения эффективности и минимизации неспецифической токсичности (Carter, P.J. and Senter P.D. (2008) The Cancer Jour 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41:98-107.

[00262] ADC-соединения согласно настоящему изобретению включают соединения, обладающие противоопухолевой активностью. В некоторых вариантах реализации изобретения ADC-соединения содержат антитело, конъюгированное, т.е. ковалентно присоединенное к молекуле лекарственного вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело ковалентно присоединено к молекуле лекарственного вещества посредством линкера. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) согласно изобретению, селективно доставляют эффективную дозу лекарственного средства в опухолевую ткань, за счет чего можно достичь более высокой селективности, т.е. сниженной эффективной дозы при увеличении терапевтического индекса ("терапевтическое окно").

[00263] Молекула лекарственного вещества (D) в составе конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC) может содержать любое соединение, фрагмент или группу, обладающие цитотоксическим или цитостатическим действием. Молекулы лекарственного вещества могут придавать конъюгату свои цитотоксические и цитостатические свойства посредством механизмов, включающих связывание тубулина, связывание или интеркалирование ДНК и ингибирование РНК-полимеразы, синтеза белка и/или топоизомеразы, но не ограничивающихся ими. Типичные молекулы лекарственного вещества включают пирролбенздиазепин (PBD) и его стереоизомеры, изостеры, аналоги и производные, обладающие цитотоксической активностью, но не ограничиваются ими. Неограничивающие примеры таких иммуноконъюгатов подробно описаны ниже.

1. Типичные конъюгаты антитело-лекарственное средство

[00264] Типичный вариант реализации конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC) содержит антитело (Ат), мишенью которого является опухолевая клетка, молекулу лекарственного вещества (D) и линкер (L), присоединяющий Ат к D. В некоторых вариантах реализации антитело присоединяют к линкеру (L) через один или более аминокислотных остатков, например, лизина и/или цистеина.

[00265] Типичный ADC соответствует Формуле I:

где р составляет от 1 до около 20. В некоторых вариантах реализации изобретения количество молекул лекарственного вещества, которые можно конъюгировать с антителом, ограничено количеством свободных остатков цистеина. В некоторых вариантах реализации изобретения свободные остатки цистеина вводят в аминокислотную последовательность антитела способами, описанными в настоящем документе. Типовые ADC Формулы I включают, но не ограничиваются ими, антитела, которые имеют 1, 2, 3 или 4 сконструированные цистеиновые аминокислоты (Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). В некоторых вариантах реализации изобретения один или несколько свободных остатков цистеина уже присутствуют в антителе без использования инженерии, и в этом случае существующие свободные остатки цистеина можно использовать для конъюгирования антитела с лекарственным веществом. В некоторых вариантах реализации антитело подвергают воздействию восстановительных условий до конъюгирования антитела с целью получения одного или более свободных остатков цистеина.

a) Типичные линкеры

[00266] "Линкер" (L) представляет собой бифункциональный или многофункциональный фрагмент, который можно использовать для связывания одной или более молекул лекарственного вещества (D) с антителом (Ат) с образованием конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC) Формулы I. В некоторых вариантах реализации конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) можно получить с использованием линкера, содержащего реакционноспособные функциональные группы для ковалентного присоединения к лекарственному веществу и антителу. Например, в некоторых вариантах реализации тиол цистеина антитела (Ат) может образовывать связь с реакционноспособной функциональной группой линкера или промежуточного соединения лекарственное средство-линкер с образованием ADC.

[00267] В одном из аспектов линкер содержит функциональную группу, способную вступать в реакцию со свободным цистеином, присутствующим на антителе, с образованием ковалентной связи. Неограничивающие примеры таких реакционно-способных функциональных групп включают малеимид, галогенацетамиды, α-галогенацетил, активированные сложные эфиры, такие как 4-нитрофенильные сложные эфиры, пентафторфенильные сложные эфиры, тетрафторфенильные сложные эфиры, ангидриды, хлориды кислот, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты. См., например, способ конъюгации на странице 766 Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773 и Примеры в данном документе.

[00268] В некоторых вариантах реализации изобретения линкер содержит функциональную группу, способную вступать в реакцию с электрофильной группой, присутствующей на антителе. Такие типичные электрофильные группы включают альдегидные и кетоновые карбонильные группы, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации изобретения гетероатом реакционноспособной функциональной группы линкера может взаимодействовать с электрофильной группой антитела и образовывать ковалентную связь с блоком антитела. Неограничивающие примеры таких реакционноспособных функциональных групп включают гидразид, оксим, аминогруппу, гидразин, тиосемикарбазон, гидразинкарбоксилат и арилгидразид, но не ограничиваются ими.

[00269] Линкер может содержать один или более компонентов линкера. Типовые линкерные компоненты включают 6-малеимидокапроил («MC»), малеимидопропаноил («MP»), валин-цитруллин («val-cit» или «vc»), аланин-фенилаланин («ala-phe»), п-аминобензоилоксикарбонил («PAB»), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио) пентаноат («SPP») и 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 карбоксилат («MCC»). Различные линкерные компоненты известны в данной области техники, некоторые из которых описаны ниже.

[00270] Линкер может представлять собой «отщепляемый линкер», облегчающий высвобождение лекарственного вещества. Неограничивающие типичные расщепляемые линкеры включают кислотолабильные линкеры (например, содержащие гидразон), протеазочувствительные (например, пептидазочувствительные) линкеры, фотолабильные линкеры или дисульфид-содержащие линкеры (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); US 5208020).

[00271] В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет следующую Формулу II:

где A представляет собой ʺрастягивающую единицуʺ, и a представляет собой целое число от 0 до 1; W представляет собой ʺаминокислотную единицуʺ, и w представляет собой целое число от 0 до 12; Y представляет собой ʺспейсерную единицуʺ, и y равен 0, 1 или 2; и Ab, D, и p определены выше как для Формулы I. Типовые варианты реализации таких линкеров описаны в патенте США № 7498298, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00272] В некоторых вариантах реализации изобретения компонент линкера содержит "растягивающую единицу", которая связывает антитело с другим компонентом линкера или с молекулой лекарственного вещества. Неограничивающие типичные растягивающие единицы представлены ниже (где волнистая линия указывает на сайты ковалентного присоединения к антителу, лекарственному веществу или дополнительным компонентам линкера):

[00273] В некоторых вариантах реализации изобретения линкерный компонент содержит «аминокислотную единицу». В некоторых таких вариантах реализации изобретения аминокислотная единица обеспечивает расщепление линкера протеазой, тем самым облегчая высвобождение лекарственного вещества из иммуноконъюгата при воздействии внутриклеточных протеаз, таких как лизосомальные ферменты (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). Типовые аминокислотные единицы включают, но не ограничиваются ими, дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и пентапептиды. Типовые дипептиды включают, но не ограничиваются ими, валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe); фенилаланин-лизин (fk или phe-lys); фенилаланин-гомолизин (phe-homolys) и N-метил-валин-цитруллин (Me-val-cit). Типовые трипептиды включают, но не ограничиваются ими, глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Аминокислотная единица может содержать аминокислотные остатки, которые встречаются в природе и/или минорные аминокислоты и/или не встречающиеся в природе аминокислотные аналоги, такие как цитруллин. Аминокислотные единицы могут быть разработаны и оптимизированы для ферментативного расщепления конкретным ферментом, например, опухоле-ассоциированной протеазой, катепсином B, C и D или протеазой плазмином.

[00274] В некоторых вариантах реализации изобретения линкерный компонент содержит «спейсерную» единицу, которая связывает антитело с фрагментом лекарственного вещества либо непосредственно, либо через растягивающую единицу и/или аминокислотную единицу. Спейсерная единица может быть ʺсаморасщепляющейсяʺ или ʺне саморасщепляющейся.ʺ «Не саморасщепляющаяся" спейсерная единица, представляет собой спейсерную единицу, полностью или частично остающуюся связанной с молекулой лекарственного вещества при расщеплении ADC. Примеры не саморасщепляющихся спейсерных единиц включают глициновую спейсерную единицу и глицин-глициновую спейсерную единицу, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации изобретения ферментативное расщепление ADC, содержащего глицин-глициновую спейсерную единицу, ассоциированной с опухолевой клеткой протеазой приводит к высвобождению фрагмента глицин-глицин-лекарственное средство из остального ADC. В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент глицин-глицин-лекарственное средство подвергают стадии гидролиза в опухолевой клетке, таким образом отщепляя глицин-глициновую спейсерную единицу от фрагмента лекарственного вещества.

[00275] «Саморасщепляющаяся» спейсерная единица обеспечивает высвобождение фрагмента лекарственного вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения спейсерная единица линкера содержит п-аминобензильную единицу. В некоторых таких вариантах реализации изобретения п-аминобензиловый спирт присоединяют к аминокислотной единице посредством амидной связи, и между бензиловым спиртом и лекарственным веществом создается карбамат, метилкарбамат или карбонат (Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). В некоторых вариантах реализации изобретения спейсерная единица представляет собой п-аминобензилоксикарбонил (PAB). В некоторых вариантах реализации изобретения ADC, содержащий саморасщепляющийся линкер, обладает следующей структурой:

где Q представляет собой -C1-C8 алкил, -O-(C1-C8 алкил), -галоген, -нитрогруппу или -цианогруппу; m представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 4; и p находится в диапазоне от 1 до около 20. В некоторых вариантах реализации изобретения, p находится в диапазоне 1-10, 1-7, 1-5 или 1-4.

[00276] Other examples of self-immolative spacers include, but are not limited to, aromatic compounds that are electronically similar to the PAB group, such as 2-aminoimidazol-5-methanol derivatives (U.S. Patent No. 7,375,078; Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) и орто- или пара-аминобензилацетальдегиды, но не ограничиваются ими В некоторых вариантах реализации изобретения спейсеры могут применяться таким образом, чтобы претерпевать циклизацию при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223), соответственно, замещенные бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] кольцевые системы (Storm et al (1972) J. Amer. Amer. Chem. Soc. 94:5815) и амиды 2-аминофенилпропионовых кислот (Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867). Присоединение лекарственного вещества к α-углероду глицинового остатка представляет собой другой пример саморасщепляющегося спейсера, который может использоваться в ADC (Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1447).

[00277] В некоторых вариантах реализации изобретения линкер L может быть линкером дендритного типа для ковалентного присоединения более чем одного фрагмента лекарственного вещества к антителу посредством разветвленного мультифункционального линкерного фрагмента (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Дендритные линкеры могут увеличивать молярное соотношение лекарственного вещества к антителу, т.е. нагрузку, которая соотносится с активностью ADC. Таким образом, если антитело несет только одну реакционноспособную цистеиновую тиоловую группу, через дендритный линкер можно присоединить множество молекул лекарственного вещества.

[00278] Неограничивающие типовые линкеры представлены ниже в контексте ADC Формулы I: val-cit

[00279] Дополнительные неограничивающие примеры ADC включают структуры:

где X представляет собой:

иликаждый R представляет собой независимо H или C1-C6 алкил; и n равен 1-12.

[00280] Как правило, линкеры пептидного типа могут получать путем образования пептидной связи между двумя или более фрагментами аминокислот и/или пептидов. Такие пептидные связи могут быть получены, например, в соответствии с жидкофазным методом синтеза (например, E. Schröder and K. Lübke (1965) ʺThe Peptidesʺ, volume 1, pp 76-136, Academic Press).

[00281] В некоторых вариантах реализации изобретения линкер замещен группами, регулирующими растворимость и/или реакционную способность. В качестве неограничивающего примера, заряженный заместитель, например, сульфонат (-SO3-) или аммонийная группа, может повысить растворимость линкерного реагента в воде и облегчить реакцию присоединения линкерного реагента к антителу и/или молекуле лекарственного вещества, или облегчить реакцию присоединения Ат-L (промежуточного продукта антитело-линкер) к D или DL (промежуточному продукту лекарственное средство-линкер) к Ат, в зависимости от способа синтеза, используемого для получения ADC. В некоторых вариантах реализации изобретения часть линкера связывается с антителом, а часть линкера связывается с лекарственным веществом, и затем Ab-(линкерная часть)a связывается с лекарственным веществом-(линкерная часть)b с образованием ADC Формулы I.

[00282] В некоторых таких вариантах реализации антитело содержит более одного заместителя (фрагмент линкера)а, так что к антителу в составе ADC Формулы I можно присоединить более одного лекарственного вещества. Соединения согласно настоящему изобретению явным образом предусматривают ADC, полученный с использованием следующих линкерных реагентов: бис-малеимидтриоксиэтиленгликоля (BMPEO), N-(β-малеимидпропилокси)-N-гидроксисукцинимидного сложного эфира (BMPS), N-(ε-малеимидкапроилокси)сукцинимидного сложного эфира (EMCS), N-[γ-малеимидбутирилокси]сукцинимидного сложного эфира (GMBS), 1,6-гексан-бис-винилсульфона (HBVS), сукцинимидил-4-(N-малеимидметил)циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроата) (LC-SMCC), m-малеимидбензоил-N-гидроксисукцинимидного сложного эфира (MBS), гидразида 4-(4-N-малеимидфенил)масляной кислоты (MPBH), сукцинимидил-3-(бромацетамид)пропионата (SBAP), сукцинимидилиодацетата (SIA), сукцинимидил-(4-иодацетил)аминобензоата (SIAB), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионата (SPDP), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноата (SPP), сукцинимидил 4-(N-малеимидметил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC), сукцинимидил-4-(p-малеимидфенил)бутирата (SMPB), сукцинимидил-6-[(бета-малеимидпропионамид)гексаноата] (SMPH), иминтиолана (IT), сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, и сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоата (SVSB), а также бис-малеимидных реагентов: дитиобисмалеимидэтана (DTME), 1,4-бисмалеимидбутана (BMB), 1,4-бисмалеимидил-2,3-дигидроксибутана (BMDB), бисмалеимидгексана (BMH), бисмалеимидэтана (BMOE), BM(ПЭГ)2 (показан ниже) и BM(ПЭГ)3 (показан ниже); бифункциональных производных имидоэфиров (например, диметиладипимидат-HCl), активных сложных эфиров (например, дисукцинимидилсуберата), альдегидов (например, глутаральдегида), бис-азидосоединений (например, бис-(p-азидбензоил)гександиамина), производных бис-диазония (например, бис-(p-диазонийбензоил)-этилендиамина), диизоцианатов (например, толуол-2,6-диизоцианата), и бис-производных активного фтора (например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензола), но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации изобретения бис-малеимидные реактивы обеспечивают присоединение тиоловой группы цистеина в антителе с тиол-содержащим фрагментом лекарственного вещества, линкером или интермедиатом линкера-лекарственного вещества. Другие функциональные группы, которые реагируют с тиоловыми группами, включают иодацетамид, бромацетамид, винилпиридин, дисульфид, пиридилдисульфид, изоцианат и изотиоцианат, но не ограничиваются ими.

[00283] Некоторые подходящие линкерные реагенты можно получить из различных коммерческих источников, например, Pierce Biotechnology, Inc. (Рокфорд, штат Иллинойс, США), Molecular Biosciences Inc. (Боулдер, штат Колорадо, США), или синтезировать в соответствии с методиками, описанными в данной области техники; например, в Toki, et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; и WO 04/032828.

[00284] 1-Изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA), меченая углеродом-14, представляет собой типичный хелатирующий агент для конъюгирования радионуклеотида с антителом. См., например, WO94/11026.

b) Типичные молекулы лекарственных веществ

[00285] В некоторых вариантах реализации изобретения ADC содержит пирролбенздиазепин (PBD). В некоторых вариантах реализации изобретения димеры PBD распознают специфические последовательности ДНК и связываются с ними. Сообщение о естественном PBD-продукте, антрамицине, впервые было опубликовано в 1965 г. (Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5793-5795; Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5791-5793). С тех пор сообщалось о ряде как естественных PBD, так и их аналогов (Thurston, et al., (1994) Chem. Rev. 1994, 433-465, в том числе о димерах трициклического каркаса PBD (US 6884799; US 7049311; US 7067511; US 7265105; US 7511032; US 7528126; US 7557099). Безотносительно к конкретным теоретическим представлениям считается, что димерная структура придает соединению соответствующую трехмерную форму, изоспиральную малой бороздке B-формы ДНК, что приводит к плотной посадке в сайте связывания (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, (1986) Acc. Chem. Res., 19:230-237). Показано, что димерные PBD-соединения, несущие C2-арильные заместители, можно использовать в качестве цитотоксических агентов (Hartley et al (2010) Cancer Res. 70(17):6849-6858; Antonow (2010) J. Med. Chem. 53(7):2927-2941; Howard et al (2009) Bioorganic and Med. Chem. Letters 19(22):6463-6466).

[00286] В некоторых вариантах реализации изобретения PBD-соединения можно использовать в качестве пролекарств, защищая их по положению N10 азотсодержащими защитными группами, удаляемыми in vivo (WO 00/12507; WO 2005/023814).

[00287] PBD-димеры конъюгировали с антителами, и показано, что полученный ADC обладал противораковыми свойствами (US 2010/0203007). Неограничивающие типичные сайты связывания в составе PBD-димера включают пятичленное пиррольное кольцо, связь между PBD-блоками и иминогруппу N10-C11 (WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598).

[00288] Неограничивающие типичные PBD-димерные компоненты ADC соответствуют формуле А:

где:

R2 представлять собой

, где R36a и R36b независимо выбирают из H, F, C1-4 насыщенного алкила, C2-3 алкенила, причем алкильные и алкенильные группы необязательно замещены группой, выбранной из C1-4 алкиламидо и C1-4 сложного алкилового эфира; или, где один из R36a и R36b представляет собой H, другой независимо выбирают из нитрила и C1-4 сложного алкилового эфира;

R6 и R9 независимо выбирают из H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn и галогена;

R7 независимо выбирают из H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn и галогена;

Y обладает формулой:

G содержит реакционноспособную группу для соединения с антителом, или G представляет собой линкер, соединенный с антителом;

n равен целому числу, выбранному в диапазоне 0-48;

RA4 представляет собой C1-6алкиленовую группу;

или

(a) R10 представляет собой H, и R11 представляет собой OH, ORA, где RA представляет собой C1-4 алкил; или

(b) R10 и R11 образуют азот-углеродную двойную связь между атомами азота и углерода, с которыми они связаны; или

(c) R10 представляет собой H и R11 представляет собой OSOzM, где z представляет собой 2 или 3 и M представляет собой одновалентный фармацевтически приемлемый катион;

R и R' каждый независимо выбирают из необязательно замещенных C1-12 алкильной, C3-20 гетероциклильной и C5-20 арильной групп, и необязательно по отношению к группе NRR', R и R' совместно с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенное 4-, 5-, 6- или 7-членное гетероциклическое кольцо;

где R16, R17, R19, R20, R21и R22 соответствуют определению R6, R7, R9, R10R11и R2 соответственно;

где Z представляет собой CH или N;

где T и T'' независимо выбирают из одинарной связи или C1-9 алкилена, где цепь может быть прервана одним или несколькими гетероатомами, например, O, S, N(H), NMe, при условии, что число атомов в самой короткой цепи атомов между X и X' составляет от 3 до 12 атомов; и

X и X' независимо выбирают из O, S и N(H).

[00289] В некоторых вариантах реализации изобретения R9 и R19 представляют собой H.

[00290] В некоторых вариантах реализации изобретения R6 и R16 представляют собой H.

[00291] В некоторых вариантах реализации изобретения R7 и R17 оба представляют собой OR7A, где R7A представляет собой необязательно замещенный C1-4 алкил. В некоторых вариантах реализации изобретения R7A представляет собой Me. В некоторых вариантах реализации изобретения R7A представляет собой Ch2Ph, где Ph представляет собой фенильную группу.

[00292] В некоторых вариантах реализации изобретения X представляет собой O.

[00293] В некоторых вариантах реализации изобретения T выбирают из одинарной связи, C1 и C2 алкиленовой группы. В некоторых вариантах реализации изобретения T представляет собой C1 алкиленовую группу.

[00294] В некоторых вариантах реализации изобретения R36a и R36b оба представляют собой H. В некоторых вариантах реализации изобретения R36a и R36b оба представляют собой метил. В некоторых вариантах реализации изобретения один из R36a и R36b представляет собой H, а другой выбирают из C1-4 насыщенного алкила, C2-3 алкенила, где алкильные и алкенильные группы необязательно замещены. В некоторых вариантах реализации изобретения группу R36a и R36b, не являющуюся H, выбирают из метила и этила.

[00295] В некоторых вариантах реализации изобретения R10 представляет собой H, а R11 представляет собой OH. В некоторых вариантах реализации изобретения R10 и R11 образуют азот-углеродную двойную связь между атомами азота и углерода, с которыми они связаны.

[00296] В любом из вариантов реализации изобретения, описанных в настоящем документе R16, R17, R19, R20, R21, R22, X' и T' могут представлять собой те же, что R6, R7, R9, R10, R11, R2, X и T, соответственно.

[00297] В некоторых вариантах реализации изобретения G включает группу, выбранную из (i) малеимидных групп (ii) активированных дисульфидов, (iii) активных сложных эфиров, таких как сложные эфиры NHS (N-гидроксисукцинимида), сложные эфиры HOBt (N-гидроксибензотриазола), галогенформиаты и галогенангидриды; (iv) алкил и бензилгалогенидов, таких как галогенацетамиды; и (v) альдегидов, кетонов, карбоксильных групп, включая малеимидную группу, активированный дисульфид или электрофильную функциональную группу. В некоторых вариантах реализации изобретения G представляет собой линкер связанный с антителом, где линкер содержит молекулу, выбранную из электрофильной функциональной группы, выбранной из (i) малеимидных групп (ii) активированных дисульфидов, (iii) активных сложных эфиров, таких как сложные эфиры NHS (N-гидроксисукцинимида), сложные эфиры HOBt (N-гидроксибензотриазола), галогенформиаты и галогенангидриды; (iv) алкил и бензилгалогенидов, таких как галогенацетамиды; и (v) альдегидов, кетонов, карбоксила. В некоторых вариантах реализации изобретения G представляет собой:

, где волнистая линия указывает на присоединение к остатку (A1).

В некоторых вариантах реализации изобретения G представляет собой:

, где волнистая линия указывает на присоединение к остатку (A1), а Ab представляет собой антитело.

[00298] В некоторых вариантах реализации изобретения ADC содержит присоединенный по центру PBD, содержащий структуру:

где Y определен выше.

[00299] Неограничивающий примерный ADC, содержащего присоединенный по центру димер PBD, может быть получен путем конъюгирования интермедиата линкера лекарственного вещества, содержащего присоединенный по центру димер PBD (представленный ниже) с антителом:

с целью получения присоединенного по центру конъюгата антитело-лекарственное средство на основе PBD:

[00300] Другой интермедиат линкера лекарственного вещества, содержащий присоединенный по центру димер PBD представляет собой:

который конъюгирован с антителом с образованием ADC:

[00301] Димеры PBD и ADC, содержащие PBD димеры могут быть получены в соответствии со способами, известными в данной области техники. См., например, WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598; WO 2013/055987; WO 2014/159981; WO 2014/140862.

c) Лекарственная нагрузка

[00302] Лекарственную нагрузку обозначают буквой p; она представляет собой среднее количество молекул лекарственного вещества на антитело в молекуле Формулы I. Лекарственная нагрузка может составлять от 1 до 20 молекул лекарственного вещества (D) на антитело. ADC Формулы I включают коллекции антител, конъюгированных с рядом молекул лекарственного вещества в количестве от 1 до 20. Среднее количество молекул лекарственного вещества на антитело в препаратах ADC в результате реакций конъюгирования можно охарактеризовать обычными средствами, например, масс-спектроскопией, твердофазным ИФА и ВЭЖХ. Кроме того, можно определить количественное распределение ADC по отношению к p. В некоторых случаях путем таких средств, как обращенно-фазная ВЭЖХ или электрофорез, можно достичь отделения, очистки и оценки характеристик однородного ADC, в котором p представляет собой определенное значение, от ADC с другими значениями лекарственной нагрузки.

[00303] Для некоторых конъюгатов антитело-лекарственное средство p может быть ограничена количеством сайтов присоединения на антителе. Например, если присоединяемая группа представляет собой тиоловую группу цистеина, как в некоторых типичных вышеприведенных вариантах реализации, антитело может содержать только одну или несколько тиоловых групп цистеина, или может содержать только одну или несколько достаточно реакционноспособных тиоловых групп, к которым можно присоединить линкер. В некоторых вариантах реализации изобретения высокая лекарственная нагрузка, например, p > 5, может привести к агрегации, нерастворимости, токсичности или потере способности некоторых конъюгатов антитело-лекарственное средство проникать в клетку. В некоторых вариантах реализации изобретения средняя лекарственная нагрузка ADC колеблется от 1 до около 8; от около 2 до около 6; или от около 3 до около 5. Показано, что для некоторых ADC фактическое оптимальное соотношение молекул лекарственного вещества на антитело может быть менее чем 8 и может составлять от около 2 до около 5 (US 7498298).

[00304] В некоторых вариантах реализации изобретения количество молекул лекарственного вещества, конъюгированных с антителом в ходе реакции конъюгирования, составляет меньше теоретического максимального значения. Антитело может содержать, например, остатки лизина, которые не реагируют с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер или линкерным реагентом, как обсуждается ниже. Как правило, антитела не содержат большого количества свободных и реакционноспособных тиоловых групп цистеина, которые могут связываться с молекулой лекарственного вещества; фактически, большинство тиоловых остатков цистеина в составе антител существуют в виде дисульфидных мостиков. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело можно восстановить с помощью восстанавливающего агента, например, дитиотрейтола (ДТТ) или трикарбонилэтилфосфина (TCEP) при частично или полностью восстановительных условиях с целью получения реакционноспособных тиоловых групп цистеина. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело подвергают воздействию денатурирующих условий с целью выявления реакционноспособных нуклеофильных групп, например, лизина или цистеина.

[00305] Нагрузку (соотношение лекарственное средство/антитело) ADC можно контролировать различными способами, например: (i) ограничивая молярный избыток промежуточного соединения лекарственное средство-линкер или линкерного реагента по отношению к антителу, (ii) ограничивая время или температуру реакции конъюгирования и (iii) посредством частичных или лимитирующих восстановительных условий для модификации тиоловых групп цистеина.

[00306] Следует понимать, что при реакции более чем одной нуклеофильной группы с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер или линкерным реагентом полученный продукт представляет собой смесь ADC-соединений с распределением одной или нескольких молекул лекарственного вещества, присоединенных к антителу. Среднее количество лекарственного вещества на антитело в смеси можно рассчитать с помощью двойного твердофазного ИФА антитела, специфичного по отношению к антителу и лекарственному веществу. Отдельные молекулы ADC в смеси можно выявить с помощью масс-спектроскопии и разделить с помощью ВЭЖХ, например, гидрофобной хроматографии (см., например, McDonagh et al (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. ʺEffect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,ʺ Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. ʺControlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,ʺ Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004). В некоторых вариантах реализации изобретения из конъюгационной смеси посредством электрофореза или хроматографии можно выделить однородный ADC с одинаковым значением нагрузки.

d) Некоторые способы получения иммуноконъюгатов

[00307] ADC Формулы I можно получить различными способами, используя реакции органической химии, условия и реагенты, известные специалистам в данной области, включая: (1) реакцию нуклеофильной группы антитела с бивалентным линкерным реагентом для образования Ат-L через ковалентную связь, с последующей реакцией с молекулой лекарственного агента D; и (2) реакцию нуклеофильной группы молекулы лекарственного агента с двухвалентным линкерным реагентом для образования D-L через ковалентную связь с последующей реакцией с нуклеофильной группой антитела. Типичные способы получения ADC формулы I при помощи недавних методов, описаны в патенте США 7498298, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00308] Примеры нуклеофильных групп антител включают: (i) N-концевые аминогруппы, (ii) аминогруппы боковых цепей, например, лизина, (iii) тиоловые группы боковых цепей, например, цистеина, и (iv) гидроксильные или аминогруппы углевода, если антитело является гликозилированным, но не ограничиваются ими. Аминные, тиоловые и гидроксильные группы являются нуклеофильными и могут реагировать с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на молекулах линкера и линкерных реагентов, включая: (i) активные эфиры, например, NHS-эфиры, HOBt-эфиры, галоформиаты и галогенангидриды; (ii) алкил- и бензилгалиды, например, галоацетамиды; и (iii) альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы. Некоторые антитела содержат восстанавливаемые межцепочечные дисульфидные связи, т.е. цистеиновые мостики. Антителам можно придать способность к реакции конъюгирования с линкерными реагентами путем обработки восстановителем, например, DTT (дитиотрейтолом) или трикарбонилэтилфосфином (TCEP), получая полностью или частично восстановленное антитело. Каждый цистеиновый мостик, таким образом, теоретически образует две реакционноспособные тиоловые нуклеофильные группы. В антитела можно внедрить дополнительные нуклеофильные группы путем модификации остатков лизина, например, посредством реакции остатков лизина с 2-иминтиоланом (реагентом Трота), приводящей к конверсии аминов в тиолы. Реакционноспособные тиоловые группы также можно внедрить в антитело путем внедрения одного, двух, трех, четырех или более остатков цистеина (например, получения вариантов антител, включающих один или более аминокислотных остатков цистеина неприродного происхождения.

[00309] Кроме того, конъюгаты антитело-лекарственное средство согласно изобретению, можно получить путем реакции между электрофильной группой антитела, например, альдегидной или кетоновой карбонильной группой, с нуклеофильной группой линкерного реагента или лекарственного вещества. Пригодные для этого нуклеофильные группы линкерного реагента включают гидразид, оксим, аминогруппу, гидразин, тиосемикарбазон, гидразинкарбоксилат и арилгидразид, но не ограничиваются ими. В одном варианте реализации антитело модифицируют с целью внедрения электрофильных групп, которые способны реагировать с нуклеофильными заместителями в составе линкерного реагента или лекарственного вещества. В еще одном варианте реализации изобретения можно окислить углеводы гликозилированных антител, например, периодатными окислителями, образуя альдегидные или кетоновые группы, которые могут реагировать с аминной группой линкерного реагента или молекулы лекарства. Полученные группы иминового основания Шиффа могут образовывать стабильную связь или восстанавливаться, например, боргидридными реагентами, образуя стабильные аминные связи. В одном варианте реализации изобретения реакция углеводного фрагмента гликозилированного антитела с галактозооксидазой или мета-периодатом натрия могла приводить к образованию карбонильных (альдегидных и кетоновых) групп в составе антитела, которые могли реагировать с соответствующими группами лекарственного агента (Hermanson, Bioconjugate Techniques). В еще одном варианте реализации изобретения антитела, содержащие N-концевые остатки серина или треонина, могли реагировать с мета-периодатом натрия, что приводило к образованию альдегида вместо первой аминокислоты (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Такой альдегид может реагировать с нуклеофильной группой молекулы лекарственного вещества или линкера.

[00310] Типичные нуклеофильные группы в составе молекулы лекарственного вещества включают, не ограничиваясь ими: аминные, тиоловые, гидроксильные, гидразидные, оксимные, гидразиновые, тиосемикарбазоновые, гидразинкарбоксилатные и арилгидразидные группы, способные реагировать с образованием ковалентных связей с электрофильными группами в составе молекул линкера и линкерных реагентов, включающими: (i) активные эфиры, например, NHS-эфиры, HOBt-эфиры, галоформиаты и галогенангидриды; (ii) алкил- и бензилгалиды, например, галоацетамиды; и (iii) альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы.

[00311] Неорганичивающие типичные перекрестно сшивающие реагенты, которые можно применять для получения ADC, описаны в разделе настоящего документа «Типичные линкеры». В данной области техники известны способы применения таких перекрестно сшивающих реагентов для связывания двух молекул, в том числе белковой молекулы и химической группы. В некоторых вариантах реализации изобретения можно изготовить гибридный белок, содержащий антитело и цитотоксический агент, например, с помощью рекомбинантных методик или синтеза пептидов. Рекомбинантная молекула ДНК может содержать области, кодирующие антитело и цитотоксические фрагменты конъюгата, находящиеся рядом друг с другом или разделенные областью, кодирующей линкерный пептид, который не ухудшает желательные свойства конъюгата.

[00312] В еще одном варианте реализации антитело можно конъюгировать с "рецептором" (например, стрептавидином) для предварительного адресного воздействия на опухоль при введении конъюгата антитело-рецептор пациенту с последующим удалением несвязавшегося конъюгата из циркуляторного русла с помощью очищающего агента и введением "лиганда" (например, авидина), конъюгированного с цитотоксическим агентом (например, лекарственным веществом или радионуклеотидом).

E. Трастузумаб-MCC-DM1 и пертузумаб

Трастузумаб-MCC-DM1 (T-DM1)

[00313] Настоящее изобретение включает терапевтическое лечение с применением конъюгата антитело-лекарственное средство трастузумаб-MCC-DM1 (T-DM1, также известный как трастузумаб эмтанзин) (CAS Reg. № 139504-50-0), который имеет структуру:

где Tr представляет собой трастузумаб присоединенный при помощи линкерного остатка MCC к молекуле майтансиноидного лекарственного вещества DM1 (US 5208020; US 6441163). Соотношение лекарственное средство к антителу или лекарственную нагрузку обозначают буквой p в вышеупомянутой структуре трастузумаб-MCC-DM1, и варьирует в целых величинах от 1 до около 8. Трастузумаб-MCC-DM1 включает все смеси различно загруженных и присоединенных конъюгатов антитело-лекарственное средство, где 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, и 8 фрагментов лекарственного средства ковалентно присоединены к антителу трастузумаб (US 7097840; US 8337856; US 2005/0276812; US 2005/0166993).

[00314] Трастузумаб может быть продуцирован суспензионной культурой клеток млекопитающих (клетки яичника китайского хомячка, CHO). HER2 и (или c-еrbB2) протоонкоген кодирует трансмембранный рецептор белка 185кДа, который структурно связан с рецептором эпидермального фактора роста. Трастузумаб представляет собой антитело, которое имеет антигенсвязывающий остаток, или образуется из мышиного антитела 4D5 (ATCC CRL 10463, на хранении в американской коллекции типовых культур, 12301 Parklawn Drive, Роквилл, штат Мэриленд. 20852 under the Budapest Treaty on May 24, 1990). Типичные гуманизированные антитела 4D5 включают huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 и huMAb4D5-8 (трастузумаб, HERCEPTIN®) как в US 5821337. В некоторых вариантах реализации изобретения антительная часть T-DM1 содержит аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей, представленные в SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO. 29, соответственно.

[00315] Трастузумаб-MCC-DM1 может быть получен, например, согласно Примеру 1 публикации заявки США № 20110165155.

[00316] В качестве общего предложения, начальное фармацевтически эффективное количество трастузумаб-МСС-DM1, вводимое в составе дозы будет находиться в диапазоне от около 0,3 до 15 мг/кг/сутки от массы тела пациента.

[00317] Коммерческий препарат T-DM1 (KADCYLA®, адо-трастузумаб эмтанзин) представляет собой стерильный, лиофилизированнный, несодержащий консервантов порошок белого, желтовато-белого цвета, в одноразовых флаконах. Каждый флакон содержит 100 мг или 160 мг адо-трастузумаб эмтанзина. После разведения, каждый одноразовый флакон содержал адо-трастузумаб эмтанзина (20 мг/мл), полисорбата 20 [0,02% (масс./об.)], сукцината натрия (10 мМ) и сахарозы [6% (масс./об.)] с pH равным 5,0 и плотностью равной 1,026 г/мл. Полученный раствор, содержащий 20 мг/мл адо-трастузумаб эмтанзина вводили путем внутривенной инфузии после разбавления. В некоторых вариантах реализации изобретения адо-трастузумаб эмтанзин вводят в дозе 3,6 мг/кг каждые три недели. В некоторых вариантах реализации изобретения адо-трастузумаб эмтанзин вводят в дозе 2,4 мг/кг каждую неделю.

Композиции пертузумаба

[00318] Композиция пертузумаба содержит смесь основного вида антитела пертузумаб, как определено выше, и один или более его вариант. В предпочтительном варианте реализации в настоящем документе основной вид антитела пертузумаб представляет собой тот, что содержит аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 32 и аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 31 (включая деамидированные и/или окисленные варианты данных последовательностей). В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая смесь основного вида антитела пертузумаб и вариант его аминокислотной последовательности, содержащие аминоконцевое лидерное удлинение, например, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 34 и аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 33. 33. Предпочтительно, аминоконцевое лидерное удлинение располагается на легкой цепи вариантного антитела (например, на одной или двух легких цепях вариантного антитела). Антитело против HER2 основного вида или его вариантное антитело может представлять собой полноразмерное антитело или фрагмент антитела (например, фрагменты Fab или F(ab')2), однако, предпочтительно оба являются полноразмерными антителами. Вариантное антитело согласно настоящему документу может содержать аминоконцевое лидерное удлинение на одной или более тяжелой или легкой цепях данного антитела. Предпочтительно, аминоконцевое лидерное удлинение располагается на одной или двух легких цепях антитела. Аминоконцевое лидерное удлинение предпочтительно содержит или состоит из VHS--. Наличие аминоконцевого лидерного удлинения в композиции может быть обнаружено с помощью различных аналитических методов, включая, но не ограничиваясь ими, анализ N-концевой последовательности, анализ заряда гетерогенности (например, катионообменная хроматография или капиллярный зонный электрофорез), масс-спектрометрии и т.д. Количество вариантного антитела в композиции в целом варьирует в зависимости от суммы, составляющей предел обнаружения любого теста (предпочтительно N-концевого анализа последовательностей), используемого для распознавания варианта в количестве, меньшем, чем количество основного вида антитела. Как правило, около 20% или менее (например, от около 1% до около 15%, например, от 5% до около 15%) молекул антитела в композиции, содержащей аминоконцевое лидерное удлинение. Такой количественный процент предпочтительно определяют с помощью количественного N-концевого анализа последовательностей или катионообменного анализа (предпочтительно с использованием слабой катионообменной колонки высокого разрешения, такой как катионообменная колонка PROPAC WCX-10™). Помимо вариантов с аминоконцевым лидерным удлинением, предусмотрены также изменения аминокислотной последовательности основного вида антител и/или вариантных антител, включающие, но не ограничивающиеся ими, антитела, содержащие C-концевой остаток лизина на одной или обеих тяжелых цепях, деамидированные вариантные антитела и т.д.

[00319] Кроме того, основные виды антител или вариантные антитела могут дополнительно включать гликозилированные варианты, неограничивающие примеры включающие, антитело, содержащее G1 или G2 олигосахаридные структуры, прикрепленные к его Fc-участку, антитело, содержащее углеводный фрагмент, прикрепленный к его легкой цепи (например, один или два углеводных фрагмента, таких как глюкоза или галактоза, прикрепленные к одной или двум легким цепям антитела, например, прикрепленные к одному или более остаткам лизина), антитело, содержащее одну или две негликозилированные тяжелые цепи или антитело, содержащее сиалированный олигосахарид, прикрепленный к одной или двух его тяжелым цепям и т.д.

[00320] Композиция может быть получена из генетически модифицированной клеточной линии, например, клеточной линии яичника китайского хомяка (CHO), экспрессирующей антитело против HER2, или может быть приготовлена путем пептидного синтеза.

[00321] Для более подробной информации о типичных композициях пертузумаба см. патент США № 7560111 и 7879325, а также US 2009/0202546A1.

[00322] Коммерческий препарат пертузумаба (PERJETA®) содержит пертузумаб 420мг/14мл (30мг/мл) в форме раствора для внутривенной (в/в) инфузии, не содержащего консерванты. В некоторых вариантах реализации изобретения лечение пертузумабом включает введение первичной загрузочной дозы, равной 840 мг, с последующим введением фиксированной поддерживающей дозы, равной 420 мг, каждые три недели.

F. Способы и композиции для диагностики и обнаружения

[00323] В некоторых вариантах реализации изобретения любое из антител против HER2, предложенных в настоящем документе, можно применять для обнаружения наличия HER2 в биологическом образце. В данном контексте термин "обнаружение" охватывает количественное или качественное обнаружение. «Биологический образец» содержит, например, клетку или ткань (например, биопсийный материал, включая раковую или потенциально раковую ткань молочной железы.

[00324] В одном варианте реализации изобретения предлагается антитело против HER2 для применения в способе диагностики или обнаружения. В другом аспекте предлагается способ обнаружения наличия человеческого HER2 в биологическом образце. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный способ включает приведение в контакт биологического образца с антителом против HER2, описанным в настоящем документе, в условиях, допускающих связывание антитела против HER2 с человеческим HER2, и определение образования комплекса между антителом против HER2 и HER2 в биологическом образце. Такой способ можно осуществлять in vitro или in vivo. В одном варианте реализации изобретения антитело против HER2 применяют для выбора субъектов, подходящих для лечения с помощью антитела против HER2, например, когда HER2 является биомаркером для отбора пациентов. В дополнительном варианте реализации биологический образец представляет собой клетку или ткань.

[00325] В дополнительном варианте реализации изобретения антитело против HER2 применяют in vivo для обнаружения, например, посредством визуализации in vivo, HER2-положительного рака у субъекта, например, для целей диагностики, прогноза или определения стадии рака, определения соответствующего курса лечения или мониторинга реакции рака на лечение. Один известный в данной области техники способ обнаружения in vivo, представляет собой иммунологическую позитронно-эмиссионную томографию (иммуно-ПЭТ), описанную, например, в статье van Dongen et al., The Oncologist 12:1379-1389 (2007) and Verel et al., J. Nucl. Med. 44:1271-1281 (2003). В таких вариантах реализации изобретения предложен способ обнаружения HER2-положительного рака у субъекта, включающий введение меченого антитела против HER2 субъекту с HER2-положительным раком или подозрением на него, и обнаружение меченого антитела против HER2 у субъекта, причем обнаружение меченого антитела против HER2 указывает на HER2-положительный рак у субъекта. В некоторых таких вариантах реализации изобретения меченое антитело против HER2 включает антитело против HER2, конъюгированное с излучателем позитронов, таким как,68Ga,18F,64Cu,86Y,76Br,89Zr и124I. В конкретном варианте реализации изобретения излучатель позитронов представляет собой89Zr.

[00326] В дополнительных вариантах реализации изобретения способ диагностики или обнаружения включает контакт первого антитела против HER2, иммобилизованного на подложке, с биологическим образцом, проверяемым на наличие HER2, воздействие второго антитела против HER2 на подложку и обнаружение связывания второго антитела против HER2 с комплексом первого антитела против HER2 и HER2 в биологическом образце. Подложка может представлять собой любой благоприятный носитель, например, стекло, металл, керамику, полимерные гранулы, предметные стекла, чипы и другие подложки. В некоторых вариантах реализации биологический образец содержит клетку или ткань. В некоторых вариантах реализации изобретения первое или второе антитело против HER2 представляет собой любое из антител, описанных в настоящем документе.

[00327] Типичные расстройства, которые можно диагностировать или обнаруживать в соответствии с любым из вышеприведенных вариантов реализации изобретения, включают HER2-положительные виды рака, такие как, HER2-положительный рак молочной железы и HER2-положительную рак желудка. В некоторых вариантах реализации изобретения HER2-позитивный рак имеет иммуногистохимический (IHC) балл равный 2+ или 3+ и/или коэффициент амплификации при in situ гибридизации (ISH) ≥2,0.

[00328] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются меченые антитела против HER2. Метки включают, но не ограничиваются ими, метки или фрагменты, обнаруживаемые прямым способом (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также фрагменты, такие как ферменты или лиганды, обнаруживаемые непрямым способом, например, с помощью ферментативной реакции или молекулярных взаимодействий. Типичные метки включают радиоизотопы32P,14C,125I,3H и131I, флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных элементов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы например, люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу (патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (ПХ), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, оксидазы углеводов, например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, оксидазы гетероциклических соединений, такие как уриказа и ксантиноксидаза, в сочетании с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника красителя, например, ПХ, лактопероксидазу или микропероксидазу, биотин/авидин, спиновые метки, метки-бактериофаги, стабильные свободные радикалы и т.п., но не ограничиваются ими. В еще одном варианте реализации изобретения метка представляет собой излучатель позитронов. Излучатели позитронов включают68Ga,18F,64Cu,86Y,76Br,89Zr и124I, но не ограничиваются ими. В конкретном варианте реализации изобретения излучатель позитронов представляет собой89Zr.

G. Фармацевтические составы

[00329] Фармацевтические составы антитела или иммуноконъюгата против HER2, как описано в настоящем документе, получают путем смешивания такого антитела или иммуноконъюгата с желательной степенью чистоты с одним или более необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в виде лиофилизированных составов или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители обычно являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, и включают: буферные вещества, например, фосфат, цитрат и другие органические соли; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (например, хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензэтония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, например, метил- или пропилпарабен; катехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и m-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; белки, например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, например, поливинилпирролидон; аминокислоты, например, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, например, ЭДТА; углеводы, например, сахарозу, маннит, трегалозу или сорбит; солеобразующие противоионы, например, натрия; металлсодержащие комплексы (например, комплексы Zn-белок) и/или неионогенные ПАВ, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), но не ограничиваются ими. Типичные фармацевтически приемлемые носители в настоящем документе дополнительно включают агенты для диспергирования лекарственных средств в межклеточном пространстве, например, растворимые нейтрально-активные гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины PH-20 гиалуронидазы человека, например, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Некоторые типичные sHASEGP и способы их применения, в том числе rHuPH20, описаны в патентных публикациях США № 2005/0260186 и 2006/0104968. В одном из аспектов sHASEGP объединяют с одним или более дополнительными гликозаминогликаназами, например, хондроитиназами.

[00330] Типичные лиофилизированные составы антитела или иммуноконъюгата описаны в патенте США № 6267958. Водные составы антитела или иммуноконъюгата включают составы, описанные в патенте США № 6171586 и WO2006/044908, причем последние составы содержат гистидин-ацетатный буфер.

[00331] Состав, описанный в настоящем документе, также может содержать более одного активного соединения, если это необходимо для лечения по конкретным показаниям, предпочтительно, соединения с взаимодополняющими активностями, не оказывающие нежелательного действия друг на друга.

[00332] Активные ингредиенты можно включить в микрокапсулы, полученные, например, с помощью методик коацервации или межфазной полимеризации, например, микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатина и полиметилметакрилата, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны в Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed.

[00333] (1980). Можно получить препараты замедленного высвобождения. Подходящие препараты с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, причем матрицы находятся в форме профилированных изделий, например, пленок или микрокапсул.

[00334] Композиции, предназначенные для применения in vivo, обычно являются стерильными. Стерильности легко достичь, например, путем фильтрации через мембраны для стерильной фильтрации.

H. Терапевтические способы и композиции

[00335] Любое из антител или иммуноконъюгатов против HER2, предложенных в настоящем документе, можно применять в способах, например, терапевтических способах.

[00336] В одном из аспектов антитело против HER2 или иммуноконъюгат, предложенные в настоящем документе, применяют в способе ингибирования пролиферации HER2-положительных клеток, при этом указанный способ включает воздействие антитела против HER2 или иммуноконъюгата на клетку в условиях, благоприятствующих связыванию антитела против HER2 или иммуноконъюгата с HER2 на поверхности клетки, тем самым ингибируя пролиферацию клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный способ можно осуществлять in vitro или in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой клетку рака груди или клетку рака желудка.

[00337] Ингибирование пролиферации клеток in vitro можно анализировать с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-GloTM, доступного для приобретения в Promega (Мэдисон, штат Висконсин, США). Указанный анализ определяет количество жизнеспособных клеток в культуре на основе количественного анализа присутствующего АТФ, который является индикатором метаболически активных клеток. См. Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, патент США № 6602677. Этот анализ можно выполнять в 96- или 384-луночном формате, что делает его доступным для автоматизированного высокопроизводительного скрининга (HTS). См. Cree et al. См., Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. Процедура анализа включает добавление одного реагента (реагента CellTiter-Glo®) непосредственно к культивируемым клеткам. Это приводит к лизису клеток и генерации люминесцентного сигнала, продуцируемого посредством люциферазной реакции. Люминесцентный сигнал пропорционален количеству присутствующего АТФ, которое прямо пропорционально количеству жизнеспособных клеток, присутствующих в культуре. Данные можно регистрировать с помощью фотометра или устройства визуализации на основе ПЗС-камеры. Выход люминесценции выражают в виде относительных световых единиц (ОСЕ).

[00338] В еще одном аспекте предлагается антитело против HER2 или иммуноконъюгат для применения в качестве лекарственного средства. В дополнительных аспектах предложено антитело или иммуноконъюгат против HER2 для применения в способе лечения. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается антитело против HER2 или иммуноконъюгат для применения при лечении HER2-положительного рака. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены антитело или иммуноконъюгат против HER2 для применения в способе лечения индивида с HER2-положительным раком, причем указанный способ включает введение индивиду эффективного количества антитела или иммуноконъюгата против HER2. В одном из таких вариантов реализации изобретения способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, как описано ниже.

[00339] В дополнительном аспекте настоящего изобретения предлагается применение антитела против HER2 или иммуноконъюгата при производстве или изготовлении лекарственного средства. В одном варианте реализации изобретения лекарственное средство предназначено для лечения HER2-положительного рака. В дополнительном варианте реализации изобретения лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения HER2-положительного рака, причем указанный способ включает введение индивидууму с HER2-положительным раком эффективного количества лекарственного средства. В одном из таких вариантов реализации изобретения способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, как описано ниже.

[00340] В дополнительном аспекте настоящего изобретения предлагается способ лечения HER2-положительного рака. В одном варианте реализации изобретения указанный способ включает введение субъекту с таким HER2-положительным раком эффективного количества антитела против HER2 или иммуноконъюгата. В одном из таких вариантов реализации изобретения способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, как описано ниже.

[00341] HER2-положительный рак согласно любому из вышеприведенных вариантов реализации может представлять собой, например, HER2-позитивный рак молочной железы или HER2-позитивный рак желудка. В некоторых вариантах реализации изобретения, HER2-позитивный рак имеет иммуногистохимический (IHC) балл равный 2+ или 3+ и/или коэффициент амплификации при in situ гибридизации (ISH) ≥2,0.

[00342] "Индивидуум", "пациент" или "субъект" согласно любому из вышеописанных вариантов реализации может являться человеком.

[00343] В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложены фармацевтические составы, содержащие любое из антител или иммуноконъюгатов против HER2, предложенных в настоящем документе, например, для применения в любом из вышеуказанных терапевтических способов. В одном варианте реализации изобретения фармацевтический состав содержит любое из антител против HER2 или иммуноконъюгатов, предложенных в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В еще одном варианте реализации фармацевтический состав содержит любое из антител или иммуноконъюгатов против HER2, предложенных в настоящем документе, и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, как описано ниже.

[00344] Антитела или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут использоваться в терапии либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами. Например, антитело или иммуноконъюгат по настоящему изобретению (например, конъюгат антитело-лекарственное средство hu7C2.v.2.2.LA (hu7C2 ADC)) могут быть введены совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой также антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с HER2. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой (i) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с доменом II HER2, и/или (ii) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с доменом IV HER2. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой (i) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с эпитопом 2C4, и/или (ii) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с эпитопом 4D5.

[00345] В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство hu7C2.v.2.2.LA (hu7C2 ADC) вводят совместно с одним или более терапевтическими агентами, выбранными из трастузумаба (Herceptin®), T-DM1 (Kadcyla®) и пертузумаба (Perjeta®). В некоторых вариантах реализации изобретения hu7C2 ADC вводят совместно с трастузумабом. В некоторых вариантах реализации изобретения hu7C2 ADC вводят совместно с T-DM1. В некоторых вариантах реализации изобретения hu7C2 ADC вводят совместно с пертузумабом. В некоторых вариантах реализации изобретения a hu7C2 ADC вводят совместно с трастузумабом и пертузумабом. В некоторых вариантах реализации изобретения a hu7C2 ADC вводят совместно с T-DM1 и пертузумабом.

[00346] Такие комбинированные виды терапии, отмеченные выше, охватывают комбинированное введение (когда два или более терапевтических агентов включены в те же или отдельные препараты), а также раздельное введение; в последнем случае введение антитела или иммуноконъюгата по настоящему изобретению может осуществляться до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта. Антитела или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению также могут быть использованы в комбинации с лучевой терапией.

[00347] Антитело или иммуноконъюгат согласно изобретению (и любое дополнительное терапевтическое средство) можно вводить любыми подходящими способами, включая парентеральный, внутрилегочный и назальный, и, если это желательно для местного лечения, посредством внутриочагового введения. Парентеральные вливания включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Введение дозы можно осуществлять любым подходящим способом, например, с помощью инъекций, например, внутривенных или подкожных инъекций, частично в зависимости от того, является ли введение кратким или хроническим. В настоящем документе рассмотрены различные схемы применения, включая одно или несколько введений в различные моменты времени, болюсное введение и импульсное вливание, но не ограничиваясь ими.

[00348] Антитела или иммуноконъюгаты согласно изобретению следует составлять, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы, которые следует учитывать в данном контексте, включают конкретное расстройство, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, область доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные врачам-практикам. Необязательно, но в некоторых случаях антитело или иммуноконъюгат могут комбинировать с одним или более агентами, используемыми в настоящее время для предотвращения или лечения рассматриваемого нарушения. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела или иммуноконъюгата, присутствующего в составе, вида нарушения или лечения и других факторов, описанных выше. Их, как правило, применяют в тех же дозах и посредством того же пути введения, как описано в настоящем документе, или в дозировке около от 1 до 99% от дозировок, описанных в настоящем документе, или в любой дозировке и посредством любого пути введения, эмпирически/клинически считающихся подходящими.

[00349] Дозировка антитела или иммуноконъюгата согласно изобретению, соответствующая профилактике или лечению заболевания (при применении по отдельности или в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими агентами), зависит от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела или иммуноконъюгата, тяжести и течения заболевания, введения антитела или иммуноконъюгата в профилактических или терапевтических целях, предыдущей терапии, истории болезни пациента и его реакции на антитело или иммуноконъюгат, и решения лечащего врача. Антитело или иммуноконъюгат соответствующим образом вводят пациенту однократно или в ходе курса лечения. В зависимости от вида и тяжести заболевания, первоначальная предполагаемая дозировка дополнительного агента для введения пациенту, например, посредством одного или более раздельных введений или непрерывного вливания, составляет от около 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1 мг/кг - 10 мг/кг). Типичная ежедневная доза может находиться в диапазоне от около 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. При повторном введении в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение обычно следует продолжать до желательного подавления симптомов заболевания. Одна типичная доза антитела или иммуноконъюгата находится в диапазоне от около 0,05 мг/кг до около 10 мг/кг. Так, пациенту можно вводить одну или более из доз, составляющих около 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любые их комбинации). Такие дозы можно вводить с перерывами, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, что пациент получает от около двух до около двадцати, или, например, около шести доз антитела). Можно вводить начальную повышенную нагрузочную дозу, за которой следует одна или более пониженные дозы. В то же время можно применять другие схемы приема. Ход лечения можно контролировать с помощью обычных методик и анализов.

[00350] Следует понимать, что любой из указанных выше составов или терапевтических способов можно осуществить с использованием как иммуноконъюгата согласно изобретению, так и антитела против HER2.

I. Изделия

[00351] Приведены изделия или ʺнаборыʺ, содержащие конъюгат антитело-лекарственное средство hu7C2.v.2.2.LA (hu7C2 ADC) и трастузумаб-MCC-DM1 и/или пертузумаб, пригодные для способов лечения согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения набор содержит контейнер, содержащий hu7C2 ADC. В некоторых вариантах реализации изобретения набор дополнительно содержит контейнер, содержащий трастузумаб-MCC-DM1. В некоторых вариантах реализации изобретения набор дополнительно содержит контейнер, содержащий пертузумаб. В некоторых вариантах реализации изобретения набор дополнительно содержит контейнер, содержащий трастузумаб-MCC-DM1 и контейнер, содержащий пертузумаб. В некоторых вариантах реализации изобретения набор содержит два или более из hu7C2 ADC, трастузумаб-MCC-DM1 и пертузумаб в одном контейнере. Набор может дополнительно содержать этикетку или листок-вкладыш внутри, или связанные с контейнером. Термин "листок-вкладыш" относится к инструкциям, в обычном порядке вкладываемым в упаковки терапевтических продуктов для продажи, содержащие информацию о показаниях, использовании, дозировке, приеме, противопоказаниях и/или предостережениях, касающихся использования таких терапевтических продуктов. Подходящие контейнеры включают, к примеру, бутыли, флаконы, шприцы, блистерные упаковки и т.п. Контейнеры можно изготовить из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер может содержать hu7C2 ADC и, необязательно, трастузумаб-MCC-DM1 и/или пертузумаб, или их препарат, являющиеся эффективными при применении в способе лечения в настоящем документе, и может иметь стерильный порт для доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). На этикетке или листке-вкладыше в упаковке, указано, что композицию используют в способе лечения, описанного и заявленного в настоящем документе. Промышленный препарат может дополнительно содержать дополнительный контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (БВДИ), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он также может содержать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

[00352] Набор может дополнительно содержать инструкции для применения hu7C2 ADC и, необязательно, трастузумаб-МСС-DM1 и/или пертузумаб. Например, если набор содержит первую композицию, содержащую hu7C2 ADC и второй фармацевтический препарат, набор может дополнительно содержать инструкции для одновременного, последовательного или раздельного введения первой и второй фармацевтических композиций пациенту, который нуждается в этом.

[00353] В другом варианте реализации изобретения наборы подходят для доставки твердых пероральных форм hu7C2 ADC и, необязательно, трастузумаб-МСС-DM1 и/или пертузумаба, такие как таблетки или капсулы. Такой набор предпочтительно содержит ряд единичных доз. Такие наборы могут содержать карты с дозами, упорядоченные в порядке их предполагаемого использования. Примером такого комплекта является ʺблистерная упаковкаʺ. Блистерные упаковки хорошо известны в упаковочной промышленности и широко применяются для упаковки фармацевтических единичных лекарственных форм. При желании, может быть предоставлена памятка, например, в виде цифр, букв или других отметок, или с вложенным календарем, обозначающим дни в графике лечения, в которые можно применять дозы.

[00354] Согласно одному варианту реализации изобретения набор может содержать (a) первый контейнер с hu7C2 ADC и, необязательно, (b) второй контейнер с трастузумаб-MCC-DM1, содержащимся в нем, и/или с пертузумабом, содержащимся в нем. В некоторых вариантах реализации изобретения набор может содержать (a) первый контейнер с hu7C2 ADC, (b) второй контейнер с трастузумаб-MCC-DM1 содержащимся в нем, и (c) третий контейнер с пертузумабом, содержащимся в нем. В некоторых вариантах реализации изобретения набор может дополнительно содержать контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (БВДИ), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он также может содержать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

[00355] Если набор содержит композицию hu7C2 ADC и трастузумаб-MCC-DM1 и/или пертузумаба, набор может содержать контейнер, содержащий две отдельных композиции, такой как бутыль с перегородкой или упаковка из фольги с перегородкой, однако, отдельные композиции могут также содержаться внутри одного, неразделенного контейнера. Обычно, набор содержит указания по применению отдельных компонентов. Форма набора является особенно предпочтительной в случаях, когда отдельные компоненты предпочтительно вводить в различных лекарственных формах (например, пероральной и парентеральной), вводить с различными промежутками, или в случаях, когда лечащий врач считает желательным титрование дозы отдельных компонентов комбинации.

[00356] Один из вариантов реализации изделия в настоящем документе содержит пакет для внутривенного (в/в) вливания, содержащий стабильную смесь hu7C2 ADC и пертузумаба и/или T-DM1 пригодную для введения пациенту, страдающему от рака. Необязательно, смесь создана на основе солевого раствора; например, содержащего около 0,9% NaCl или около 0,45% NaCl. Типичный пакет для внутривенного вливания представляет собой пакет для внутривенного вливания из полиолефина или поливинилхлорида, например, пакет для внутривенного вливания объемом 250 мл. Согласно некоторых вариантам реализации изобретения смесь содержит около 420 мг или около 840 мг пертузумаба и от около 100 мг до около 160 мг T-DM1.

[00357] Необязательно, смесь в пакете для внутривенного вливания остается стабильной в течение 24 часов при 5°C или 30 °C. Стабильность смеси может быть оценена при помощи одного или более анализов, выбранных из группы, состоящей из: цвета, внешнего вида и четкости (CAC), анализа концентрации и мутности, ситового анализа, эксклюзионной хроматографии (SEC), ионообменной хроматографии (IEC), капиллярного зонального электрофореза (CZE), капиллярного изоэлектрического фокусирования (iCIEF) и количественное определение активного вещества.

III. ПРИМЕРЫ

[00358] Ниже приведены примеры способов и композиций согласно настоящему изобретению. Следует понимать, что учитывая общее описание, представленное выше, можно осуществить различные другие варианты реализации настоящего изобретения.

Пример 1: Гуманизация мышиного антитела 7С2

[00359] Мышиное антитело против HER2 7C2 связывается с эпитопом домена I HER2. См, например, публикацию PCT № WO 98/17797. Данный эпитоп отличается от эпитопа, связывающего трастузумаб, который связывается с доменом IV HER2, и эпитопа, связывающего пертузумаб, который связывается с доменом II HER2. См. Фиг. 3, 16 и 18. Связывая домен IV, трастузумаб нарушает лиганд-независимые комплексов HER2-HER3, тем самым ингибируя дальнейший сигналинг (например, PI3K/AKT). В отличие от этого, пертузумаб, связываясь с доменом II предотвращает лиганд-управляемое взаимодействие HER2 с другими представителями семейства HER (например, HER3, HER1 или HER4), таким образом также предотвращая нисходящую трансдукцию сигнала. Связывание MAb 7С2 с доменом I не препятствует связыванию трастузумаба и пертузумаба с доменами IV и II, соответственно, тем самым предоставляя возможность объединения MAb 7С2 ADC с трастузумабом, трастузумаб эмтанзином (T-DM-1) и/или пертузумабом.

[00360] Мышиное антитело 7C2 (7C2.B9, см. публикацию PCT № WO 98/17797) было гуманизировано следующим образом.

A. Материалы и способы

[00361] Остатки пронумерованы по Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

[00362] Прямой гипервариабельный участок трансплантируют на акцепторный консенсусный человеческий каркас. Варианты, сконструированные во время гуманизации 7C2 были оценены в форме IgG. Домены VL и VH мышиного 7C2 были выравнены с человеческими VL каппа IV (VLKIV) и человеческими VH субгруппы I (VHI) консенсусными последовательностями. Гипервариабельные участки (HVR) мышиного 7C2 (7C2.B9) антитела были встроены в VLKIV и VHI акцепторные каркасы для создания CDR-трансплантированых вариантов. Позиции 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) были трансплантированы из домена VL mu7C2 в VLKI. Позиции 26-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) были трансплантированы из домена VH mu7C2 в VHI (Фиг. 1 и 2). Значения HVR определены по их гипервариабельности последовательности (Wu, T. T. & Kabat, E. A. (1970)), их структурному положению (Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987)) и их вовлечению в контакты антиген-антитело (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)). Для оценки верньерных позиций каркаса, которые могут быть важны, некоторые верньерные позиции были возвращены в мышиные последовательности. Верньерные позиции включают позиции 4 и 49 в VL, а также позиции 37, 67, 69, 71 и 73 в VH. Были синтезированы три различные версии последовательностей VL и последовательностей VH (Blue Heron, Bothell, WA) и впоследствии субклонированы в экспрессионные векторы млекопитающих. Путем комбинирования различных версий LC с HC, было создано в общей сложности 9 различных вариантов трансплантированых hu7C2 (v1.1, v1.2, v1.3, v2.1, v2.2, v2.3, v3.1, v3.2 и v3.3).

[00363] Библиотека аффинности созревания. Был использован моновалентный Fab-g3 дисплейный фагмидный вектор с 2 открытыми рамками считывания под управлением единичного промотора phoA. Первая открытая рамка считывания состоит из сигнальной последовательности stII слитой с доменами VL и CL акцепторной легкой цепи, а вторая состоит из сигнальной последовательности stII слитой с доменами VH и CH1 акцепторной тяжелой цепи с минорным фаговым белком оболочки Р3. Трансплантированый вариант HVR (7C2.v2.1) был создан при помощи мутагенеза по Кункелю с использованием отдельных олигонуклеотидов для каждого гипервариабельного участка и расположен на фаге в качестве Fab.

[00364] Для улучшения аффинности были созданы фаговые библиотеки, содержащие изменения в каждом гипервариабельном участке. Изменения последовательностей были вставлены отдельно в каждую позицию гипервариабельных участков 7C2.v2.1 при помощи мутагенеза по Кункелю. Каждая позиции в гипервариабельном участке 7C2.v2.1 была полностью рандомизирована по одной за раз для всех возможных 20 аминокислот с применением олигонуклеотидов, кодирующих NNS. В общей сложности 68 библиотек, каждая из которых состоит из 20 членов, были созданы с одним положением, расположенным в одном из полностью рандомизированных гипервариабельных участков 7С2. Библиотеки с позициями в одинаковых гипервариабельных участках были объединены, для создания в общей сложности шести библиотек.

[00365] Создание фаговых библиотек. Олигонуклеотиды, сконструированные для внесения различий в каждый гипервариабельный участок, как описано выше, были фосфорилированы отдельно в 20 мкл реакционных смесях, содержащих 660 нг олигонуклеотида, 50 мМ Tris pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 1 мМ АТФ, 20 мМ DTT и 5 единиц полинуклеотидкиназы в течение 1 ч при 37 °C.

[00366] [00468] Для создания библиотеки аффинности созревания были проведены 68 индивидуальных реакций мутагенеза по Кункелю в 96-луночном планшете для ПЦР. Фосфорилированные олигонуклеотиды, полученные в ходе реакции (приведенной выше), 2 мкл добавляли к 500 нг шаблонов по Кункелю в 50 мМ Tris pH 7,5, 10 мМ MgCl2 в конечном объеме, равном 25 мкл. Смесь отжигали при 90 °C в течение 1 мин, 50 °C в течение 3 мин, а затем охлаждали на льду. Отожженные шаблоны были затем заполнены путем добавления 0,5 мкл 10 мМ АТФ, 0,5 мкл 10 мМ дНТФ (10 мМ каждого из дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ), 1 мкл 100 мМ DTT, 1 мкл 10X буфера TM (0,5 М Tris pH 7,5, 0,1 M MgCl2), 80 единиц лигазы T4 и 4 единицы полимеразы T7 в конечном объеме, равном 30 мкл в течение 2 ч при комнатной температуре. Эти заполненные и лигированные продукты каждый отдельно, затем был трансформирован в XL1-синие клетки. Библиотеки, содержащие позиции в одинаковых участках CDR были объединены и восстановлены в 10 мл среды SOC, в течение 1 часа при 37 °C. Были добавлены карбенациллин (50 мкг/мл) и хелперный фаг M13/KO7 (MOI (множественность заражения) 10). Культуру инкубировали в течение еще 30 мин при 37 °C и переносили в 500 мл 2YT, содержащие 50 мкг/мл карбенациллина и 50 мкг/мл канамицина и культивировали 20 ч при 37 °C.

[00367] Отбор фагов. Внеклеточный домен Her2 (Her2 ECD) был биотинилирован через свободные амины с применением NHS-PEG4-Biotin (Pierce). Для реакции биотинилирования был использован 4-х кратный молярный избыток биотинового реагента в PBS. Реакции проводились путем диализа в PBS.

[00368] Фаг был отобран из супернатанта клеточной культуры и суспендирован в PBS, содержащем 1% БСА. Фаговые библиотеки инкубировали с биотинилированым Her2 ECD при комнатной температуре и фаг, связанный с биотин-Her2 был затем захвачен за 5 минут на нейтравидине (10 мкг/мл), который был иммобилизирован в PBS на микротитровальных планшетах MaxiSorp (Nunc) в течение ночи, при 4 °C. Микротитровальные лунки были тщательно промыты PBS, содержащим 0,05% Tween 20 (PBST), и связанный фаг был элюирован путем инкубирования лунок 20 мМ HCl, 500 мМ KCl в течение 30 мин. Элюированный фаг нейтрализовали 1 М Tris, pH 7,5 и амплифицировали с использованием XL1-синих клеток и M13/KO7 хелперного фага и культивировали в течение ночи при 37 °C в 2YT, 50 мкг/мл карбенациллина и 50 мкг/мл канамицина. Титры фага, элюированные из целевого планшета сравнивали с титрами фага, восстановленными из нецелевого планшета для оценки обогащения. Строгость отбора была увеличена как путем уменьшения концентрации биотинилированного Her2 ECD (с 5 нМ до 0,2 нМ) во время связывания и путем увеличения времени конкуренции (с 0 до 60 мин при комнатной температуре) с 1 мкМ немеченного Her2 ECD в растворе.

[00369] Оценка вариантов при помощи поверхностного плазмонного резонанса. Варианты 7C2 были экспрессированы в качестве IgG путем 293 транзиентной трансфекции. IgG был очищен при помощи А-аффинной хроматографии. Аффинность каждого варианта 7C2 IgG для Her2 определяли путем поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcoreT100. Сенсорные чипы Biacore Series S CM5 были иммобилизованы моноклональным мышиным анти-человеческим IgG (Fc) антителом (Human antibody capture kit, GE Healthcare). Серийные 3-х разовые разведения каждого варианта 7C2 вводили со скоростью потока равной 30 мкл/мин. Каждый образец анализировали с 3-минутной ассоциацией и 10-минутной диссоциацией. После каждой инъекции чип восстанавливали с помощью 3 М MgCl2. Ответ связывания корректировали путем вычитания RU проточной ячейки захватывающей нерелевантные IgG при подобной плотности. Для анализа кинетики была использована модель 1:1 Languir одновременного выравнивания kon и koff.

B. Результаты и обсуждение

[00370] Гуманизация 7C2. Человеческие акцепторные каркасы, использованные для гуманизации 7C2 основаны на консенсусной человеческой VL каппа IV (VLKIV) и консенсусной человеческой VHI. Домены VL и VH мышиного 7C2 были выравнены с человеческими VLKIV и VHI доменами; гипервариабельные участки были определены и трансплантированы в акцепторный каркас человека для создания 7C2.v1.1. Моновалентная аффинность 7C2.v1.1 снижается в 2,5 раза по сравнению с mu7C2.B9, как определено путем ППР (поверхностного плазмонного резонанса) (см. Таблицу 2).

Таблица 2: Аффинность трансплантированных антител 7C2 CDR

VLKD (нМ)K4K4.K49K4.L4.K49VHVH1v1.1
(20 нМ)v2.1
(16 нМ)v3.1
(15 нМ)VH1.V71v1.2
(13 нМ)v2.2
(11 нМ)v3.2
(10 нМ)VH1.L37.A67.L69.V71.K73v1.3
(11 нМ)v2.3
(10 нМ)v3.3
(9 нМ)

[00371] Для повышения аффинности связывания 7C2.v1.1, позиции 4 и 49 в легкой цепи и позиции 37, 67, 69, 71 и 73 в тяжелой цепи были заменены на остатки, обнаруженные в этих позициях в mu7C2.B9. Комбинации этих измененных легких и тяжелых цепей с цепями от 7C2.v1.1 были трансфицированы в 293 клетки, экспрессированы в качестве IgG и очищены, и оценены на связывание Her2 ECD при помощи ППР (см. Таблицу 2). Вариант 7C2.v3.3, содержащий 2 измененные позиции в легкой цепи и 5 измененных позиций в тяжелой цепи, имеет моновалентную аффинность, сравнимую с mu7C2.B9 (см. Таблицу 4).

[00372] Библиотеки созревания сродства были изучены в попытке получить дальнейшие улучшения, используя каркас 7C2.v2.1, содержащий минимальные измененные верньерные позиции (Y49K) в легкой цепи. Для каждого гипервариабельного участка, все 20 аминокислот были встроены отдельно в индивидуальные позиции, с применением мутагенеза по Кункелю (всего 68 библиотек, каждая из которых содержит 20 членов, объединенных в шесть библиотек созревания сродства). Шесть библиотек аффинности созревания были промыты 4 раунда в растворе с биотинилированным Her2 ECD. Строгость отбора постепенно увеличивали путем уменьшения концентрации биотин-Her2 ECD (от 5 до 0,2 нМ) и увеличения времени конкуренции (от 0 до 1 часа при комнатной температуре) с насыщенным количеством немеченного Her2 ECD. Для библиотеки H2 наблюдалось двухтысячекратное фаговое обогащение.

[00373] В общей сложности 588 клонов с последнего раунда были отобраны для анализа последовательностей ДНК. Отдельные изменения последовательностей были определены в каждом HVR (см. Таблицу 3). Самые многочисленные клоны имели изменения в VH в позиции S53 на Met или Leu. Варианты S53M и S53L были экспрессированы в качестве IgG, и анализ ППР продемонстрировал, что S53M и S53L имеют сопоставимую аффинность к Her2. Вариант S53L был выбран потому, что метионин склонен к окислению в процессе производства. Потенциальный сайт образования изоаспарагиновой кислоты в HVR-H2 был устранен при помощи мутации S55A (см. Таблицу 4).

Таблица 3: Кинетика вариантов с улучшенной аффинностью

ВариантHVR-H1HVR-H2HVR-H3ka (1/мс)kd (1/с)KD (нМ)v2.1GYWMN
(SEQ ID NO: 15)MIHPSDSEIRANQKFRD
(SEQ ID NO: 8)GTYDGGFEY
(SEQ ID NO:17)2,6E+
054,1E-0315,5v2.1.S53MMIHPMDSEIRANQKFRD
(SEQ ID NO:20)2,7E+
056,7E-042,4v2.1.S53LMIHPLDSEIRANQKFRD
(SEQ ID NO:21)2,5E+
058,5E-043,4v2.1.E101KGTYDGGFKY
(SEQ ID NO:22)2.2E+
051,5E-036,8

Таблица 4: Обобщенные результаты аффинностей вариантов hu7C2

вариант hu7C2KD (нМ)mu7C2.B98hu7C2.v2.211hu7C2.v2.2.LA (S53L, S55A);
HVR-H2 SEQ ID NO: 163

[00374] Выравнивание человеческих доменов VLKIV и VHI и вариабельных участков тяжелой и легкой цепи mu7C2.B9 (ʺ7C2ʺ) и hu7C2.v2.2.LA (упоминается в следующих примерах как ʺhu7C2ʺ) представлено на Фиг. 1 и 2.

Пример 2: Продуцирование конъюгатов антитело-лекарственное средство hu7C2

[00375] Для крупномасштабного производства антител их продуцировали в клетках CHO. Векторы, кодирующие легкие цепи и тяжелые цепи, трансфицировали в клетки CHO; IgG очищали от культуральной среды с помощью аффинной хроматографии с белком А.

A. Синтез интермедиата линкера лекарственного вещества, содержащего присоединенный по центру димер PBD

[00376] Интермедиат линкера лекарственного вещества, содержащий присоединенный по центру димер PBD (N-(3-(3,5-бис((((S)-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11a-тетрагидро-1H-пиррол[2,1-c][1,4] бенздиазепин-8-ил)окси)метил)фенил)проп-2-ин-1-ил)-1-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамид)-3,6,9,12-тетраоксапентандекан-15-амид; ʺ10ʺ), имеющий следующую формулу:

был синтезирован следующим образом.

1. (11S,11aS,11'S,11a'S)-ди-трет-бутил8,8'-(((5-йод-1,3-фенилен)бис(метилен))бис(окси))бис(7-метокси-2-метилен-5-оксо-11-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)-2,3,11,11a-тетрагидро-1H-пиррол[2,1-c][1,4]бензодиазепин-10(5H)-карбоксилат) (2a).

[00377] 1,3-бис(бромметил)-5-йодбензен (2,00 г, 5,20 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору Boc/THP-защищенной PBD укрывающей единицы 1 (4,75 г, 10,3 ммоль), TBAI (190 мг, 0,52 ммоль) и K2CO3 (1,42 г, 10,3 ммоль) в сухом ДМФА (60 мл). Реакционную смесь нагревали до 60 °С и перемешивали в атмосфере аргона в течение 3 ч, после чего анализ методом ЖХ/МС выявлял значительное образование продукта при времени удерживания, равным 4,15 мин (ES+) m/z 1171 ([M+ Na]+., ~10% относительной интенсивности). Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, а ДМФА удаляли путем выпаривания in vacuo. Полученный остаток распределяли между водой (50 мл) и EtOAc (50 мл) и водную фазу экстрагировали с помощью EtOAc (3×20 мл). Объединенные органические слои промывают водой (2×20 мл), рассолом (50 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и упаривали in vacuo для получения неочищенного продукта. Очистка флэш-хроматографией (градиентное элюирование: 50:50 об./об. EtOAc/гексан - 80:20 об./об. EtOAc/гексан) с получением бис-эфира 2a в виде белого пенистого вещества (5,42 г, 91% выход).

1. (11S,11aS,11'S,11a'S)-диt-трет-бутил8,8'-(((5-бром-1,3-фенилен)бис(метилен)бис(окси))бис(7-метокси-2-метилен-5-оксо-11-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)-2,3,11,11a-тетрагидро-1H-пиррол[2,1-c][1,4]бензодиазепин-10(5H)-карбоксилат) (2b)

[00378] 1-бромо-3,5-бис(бромметил)бензен (1,54 г, 4,53 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору Boc/THP-защищенной PBD укрывающей единицы 1 (4,20 г, 9,06 ммоль), TBAI (167 мг, 0,45 ммоль) и K2CO3 (1,25 г, 9,06 ммоль) в сухом ДМФА (52 мл). Реакционную смесь нагревали до 60 °С и перемешивали в атмосфере аргона в течение 5 ч, после чего анализ методом ЖХ/МС выявлял значительное образование продукта при времени удерживания, равным 4,10 мин (ES+) m/z 1101 ([M+ H]+., ~70% относительной интенсивности). Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, а ДМФА удаляли путем выпаривания in vacuo. Полученный остаток распределяли между водой (60 мл) и EtOAc (60 мл) и водную фазу экстрагировали с помощью EtOAc (3×25 мл). Объединенные органические слои промывают водой (30 мл), рассолом (50 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и упаривали in vacuo для получения неочищенного продукта. Очистка флэш-хроматографией (градиентное элюирование: 50:50 об./об. EtOAc/гексан - 100% EtOAc) с получением бис-эфира 2b в виде белого пенистого вещества (3,37 г, 68% выход).

2. (11S,11aS,11'S,11a'S)-ди-трет-бутил8,8'-(((5-хлор-1,3-фенилен)бис(метилен))бис(окси))бис(7-метокси-2-метилен-5-оксо-11-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)-2,3,11,11a-тетрагидро-1H-пиррол[2,1-c][1,4]бензодиазепин-10(5H)-карбоксилат) (2c).

[00379] 1,3-бис(бромметил)-5-хлорбензен (1,42 г, 4,80 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору Boc/THP-защищенной PBD укрывающей единицы 1 (4,42 г, 9,60 ммоль), TBAI (177 мг, 0,48 ммоль) и K2CO3 (1,33 г, 9,60 ммоль) в сухом ДМФА (55 мл). Реакционную смесь нагревали до 60 °С и перемешивали в атмосфере аргона в течение 1,5 ч, после чего анализ методом ЖХ/МС выявлял значительное образование продукта при времени удерживания, равным 4,08 мин (ES+) m/z 1057 ([M+ H]+., ~30% относительной интенсивности). Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, а ДМФА удаляли путем выпаривания in vacuo. Полученный остаток распределяли между водой (60 мл) и EtOAc (60 мл) и водную фазу экстрагировали с помощью EtOAc (3×20 мл). Объединенные органические слои промывают водой (20 мл), рассолом (40 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и упаривали in vacuo для получения неочищенного продукта. Очистка флэш-хроматографией (градиентное элюирование: 50:50 об./об. EtOAc/гексан - 80:20 об./об. EtOAc/гексан) с получением бис-эфира 2c в виде белого пенистого вещества (5,10 г, 99% выход).

[00380] Каталитическое количество Pd(PPh3)4 (5,0 мг, 4,2 мкмоль) добавляли к смеси бис-эфира 2a (242 мг, 0,21 ммоль), пропаргиламина (41 мкл, 35 мг, 0,63 ммоль), CuI (1,6 мг, 8,4 мкмоль), диэтиламина (0,42 мл, 309 мг, 4,22 ммоль) и высушенные в печи 4Å гранулы молекулярного сита в сухом ДМФА (1,8 мл) в высушенном в печи герметичном сосуде. Смесь дегазировали и продували аргоном 3 раза, затем нагревали в микроволновой печи при 100 °С в течение 3 минут, после чего анализ методом ЖХ/МС выявлял полное потребление исходного материала и существенное образование продукта при времени удерживания, равным 3,18 мин (ES+) m/z 1076 ([M+ H]+., ~60% относительной интенсивности). Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, и затем фильтровали через шлак для удаления сит (промывали ДМФА). Фильтрат выпаривали in vacuo чтобы получить нестабильный неочищенный продукт 8, который немедленно использовали на следующей стадии без очистки или анализа.

[00381] MAL-dPEG®4-кислоту (88 мг, 0,21 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору EDCI (41 мг, 0,21 ммоль), и сырому первичному амину 8 в сухом DCM (4 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение 3 ч, после чего анализ методом ЖХ/МС выявлял значительное количество желаемого продукта при времени удерживания, равном 3,58 мин (ES+) m/z 1475 ([M+H]+., ~ 10% относительной интенсивности), 1498 ([M+Na]+., ~ 5% относительной интенсивности), сопровождаемого побочным продуктом при времени удерживания 3,85 мин. Реакционную смесь разбавляли DCM (30 мл) и промывали H2O (3 × 10 мл), рассолом (20 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали in vacuo, для получения неочищенного продукта. Очистка флеш-хроматографией (градиентное элюирование: 100% DCM - 96:4 об./об. DCM/MeOH) с получением малеимида 9 в виде пенистого вещества (67 мг, 22% выход на 2 стадии).

[00382] Раствор 95:5 об./об. ТФА/H2O (1 мл) добавляли к образцу Boc/THP-защищенного соединения 9 (67 мг, 45,5 мкмоль) при 0°C (лед/ацетон). После перемешивания при 0 °С в течение 1,5 часов реакция считалась завершенной, как определено ЖХ/МС, желаемый пик продукта при времени удерживания 2,67 мин (ES+) m/z 1070 ([M+H]+., ~ 5% относительной интенсивности ). Реакционную смесь охлаждали и добавляли по каплям в охлажденный насыщенный водный раствор NaHCO3 (50 мл). Смесь экстрагировали ДХМ (3 × 15 мл) и объединенные органические слои промывали солевым раствором (40 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали in vacuo, с получением сырого продукта. Очистка флеш-хроматографией (градиентное элюирование: 100% CHCl3-96:4 об./об. CHCl3/MeOH) с получением 10 в виде оранжевого пенистого вещества (12 мг, 24% выход).

B. Альтернативный синтез интермедиата линкера лекарственного вещества, содержащего присоединенный по центру димер PBD

[00383] Интермедиат линкера лекарственного вещества, содержащий присоединенный по центру димер PBD (N-(3-(3,5-бис((((S)-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11a-тетрагидро-1H-пиррол[2,1-c][1,4] бенздиазепин-8-ил)окси)метил)фенил)проп-2-ин-1-ил)-1-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамид)-3,6,9,12-тетраоксапентандекан-15-амид; ʺ10ʺ), имеющий следующую формулу:

может быть синтезирован следующим образом.

[00384] EDCI (263 мг, 1,37 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору трет-бок-N-амидо-dPEG®₄-кислоты (26) (500 мг, 1,37 ммоль, Stratech Scientific Limited) и пропаргиламина (88 мкл, 76 мг, 1,37 ммоль) в сухом DCM (10 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение 16 часов, после чего анализ методом ЖХ/МС показал значительное количество желаемого продукта при времени удерживания 1,26 минуты (ЭР +) m/z 403 ([M+H]+., ~ 50% относительной интенсивности), 425 ([M+Na]+., ~ 100% относительной интенсивности), обратите внимание, что как исходный материал, так и продукт имели слабое УФ-поглощение (214 и 254 нм) и лучше всего были обнаружены с ES+ TIC. Реакционную смесь разбавляли ДХМ (100 мл) и промывали H2O (30 мл), рассолом (40 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и упаривали in vacuo с получением неочищенного продукта. Очистка флеш-хроматографией (градиентное элюирование с шагом 1%: 100% ДХМ - 98:2 об./об. ДХМ/MeOH) с получением амида 27 в виде масла (392 мг, выход 71%).

[00385] Каталитическое количество Pd(PPh3)4 (23,0 мг, 19,5 мкмоль) добавляли к смеси йодоарила 2a (1,02 мг, 0,89 ммоль), Вос-ацетилена 27 (393 мкл, 0,98 ммоль), CuI (7,4 мг, 39,1 мкмоль), диэтиламина (2,02 мл, 1,43 мг, 19,5 ммоль) и высушенные в печи 4Å гранулы молекулярного сита в сухом ДМФА (9 мл) в высушенном в печи герметичном сосуде. Смесь дегазировали и продували аргоном 3 раза, затем нагревали в микроволновой печи при 100 °С в течение 26 минут, после чего анализ методом ЖХ/МС выявлял существенное образование продукта при времени удерживания, равным 1,89 мин (ES+) m/z 1446 ([M+ Na]+., ~100% относительной интенсивности), 1424 ([M+ H]+., ~15% относительной интенсивности). Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, и затем фильтровали через шлак для удаления сит (промывали ДМФА). Фильтрат упаривали in vacuo, а полученный остаток растворяли в ДХМ (100 мл) и промывали H2O (20 мл), рассолом (30 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и упаривали in vacuo с получением неочищенного продукта. Очистка флеш-хроматографией (градиентное элюирование с шагом 1%: 100% ДХМ - 97:3 об./об. ДХМ/MeOH) с получением алкилена 28 в виде желтого пенистого вещества (882 мг, выход 70%).

[00386] TBDMSOTf (1,42 мл, 1,64 ммоль, 6,2 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору три-Boc-защищенного соединения 28 (882 мг, 0,62 ммоль) и 2,6-лутидина (0,96 мл, 883 мг, 8,25 ммоль) в сухом ДХМ (15 мл) при к.т. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение 16 часов, в течение которых анализ времени с помощью ЖХ/МС выявил образование карбамата TBS при времени удерживания, равном 2,09 мин (ES+) m/z 1504 ([M+ Na]+.~ 100% относительной интенсивности). Реакционную смесь разбавляли DCM (60 мл) и промывали насыщенным NH4Cl (2 × 20 мл), H2O (20 мл), рассолом (30 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали in vacuo, получая сырой TBS карбамат. Продукт повторно растворяли в ТГФ (15 мл) и обрабатывали раствором TBAF (744 мкл 1,0 М раствор в ТГФ, 0,744 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего анализ с помощью ЖХ/МС выявил значительное образование продукта при времени удерживания, равном 1,45 минут (ES+) m/z 1324 ([M+ H]+., ~ 60% относительной интенсивности), вместе с продуктом, соответствующим 1 N10Boc/1 THP, отщепленному при времени удерживания, равном 1,29 минут (ES+) m/z 1121 ([M+ H]+., ~ 10% относительной интенсивности), 1138 ([M+H2O]+., ~ 20% относительной интенсивности) и продукт, соответствующий 2 N10 Boc/2 THP, отщепленный при времени удерживания 1,12 минуты (ES+) m/z 919 ([M+ H]+., ~ 2,5% относительной интенсивности), 937 ([M+H2O]+., ~ 3% относительной интенсивности), 955 ([M+2H2O]+., ~ 5% относительной интенсивности). ТГФ удаляли выпариванием in vacuo, а полученный остаток повторно растворяли в ДХМ (60 мл) и промывали насыщенным NH4Cl (2 × 20 мл), Н2О (20 мл), рассолом (30 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и упаривали in vacuo с получением ключевого амина 29 в виде розоватой пены.

[00387] К перемешиваемому раствору N-малеил-β-аланина (53 мг, 0,32 ммоль) и амина 29 (~ 418 мг, 0,32 ммоль) в сухом ДХМ (6 мл) при комнатной температуре добавляли EDCI (61 мг, 0,32 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение 3 часов, после чего анализ методом ЖХ/МС показал значительное количество желаемого продукта при времени удерживания 1,80 мин (ES+) m/z 1474 ([M+ H]+., ~ 15% относительной интенсивности), 1497 ([M+ Na]+., ~ 100% относительной интенсивности) вместе с продуктом, соответствующим 1 N10Boc/1 ТНР, отщепленным при времени удерживания, равном 1,56 минуты 1272 ([M+ H]+., ~ 80% относительной интенсивности), 1295 ([M+ Na]+., ~ 45% относительной интенсивности), а продукт, соответствующий 2 N10 Boc/2 THP, отщепленный при времени удерживания 1,31 минуты (ES+ M+ не наблюдался). Реакционную смесь разбавляли ДХМ (30 мл) и промывали H2O (15 мл), рассолом (20 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и упаривали in vacuo с получением неочищенного продукта 9 в качестве пены.

[00388] Раствор 95:5 об./об. ТФА/H2O (5 мл) добавляли к образцу Boc/THP-защищенного соединения 9 (~466 мг, 0,32 ммоль) при 0°C (лед/ацетон). После перемешивания при 0 °С в течение 1 часа реакция считалась завершенной, как определено ЖХ/МС, желаемый пик продукта при времени удерживания, равном 1,32 мин (ES+) m/z 1070 ([M+H]+., ~100% относительной интенсивности ). Реакционную смесь охлаждали и добавляли по каплям в охлажденный насыщенный водный раствор NaHCO3 (120 мл). Смесь экстрагировали ДХМ (3 × 40 мл) и объединенные органические слои промывали солевым раствором (50 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали in vacuo, с получением сырого продукта. Очистка флэш-хроматографией (градиентное элюирование: 100% CHCl3-96:4 об./об. CHCl3/MeOH) с получением 10 в виде оранжевой пены (202 мг, выход 60%): [α]21D=+351° (c=0,47, CHCl3); ЖХ/МС (15-минутный пробег), Время удерживания 4,88 мин (ES+) m/z 1070 ([M+ H]+., ~100% относительной интенсивности);1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 7,66 (д, 2H, J=4,4 Гц), 7,52 (с, 2H), 7,45-7,40 (м, 3H), 6,98-6,94 (м, 1H), 6,80 (с, 2H), 6,66 (с, 2H), 6,55-6,50 (м, 1H), 5,22-5,07 (м, 8H), 4,30-4,22 (м, 6H), 3,96 (с, 6H), 3,91-3,85 (м, 2H), 3,82 (т, 2H, J=7,2 Гц), 3,76 (т, 2H, J=5,8 Гц), 3,65-3,43 (м, 16H), 3,16-3,08 (м, 2H), 2,94 (д, 2H, J=15,7 Гц), 2,54-2,44 (м, 4H).

C. Конъюгирование молекул линкер-лекарственное средство с антителами

[00389] Конъюгаты антитело-лекарственное средство Hu7C2 (ADC) получают путем конъюгирования hu7C2.v.2.2.LA с мутацией тяжелой цепи A118C (тио-hu7C2-HC A118C) или мутацией легкой цепи K149C (тио-hu7C2-LC-K149C) с выбранной молекулой лекарственное средство-линкер (например, интермедиат линкера лекарственного вещества, содержащий присоединенный по центру димер PBD). При первоначальном выделении искусственно внедренные остатки цистеина в антителах присутствовали в виде смешанных дисульфидов с клеточными тиолами (например, глутатионом) и, таким образом, были недоступны для конъюгирования. Частичное восстановление этих антител (например, с помощью ДТТ), очистка и повторное окисление дегидроаскорбиновой кислотой (DHAA) позволило получить антитела со свободными сульфгидрильными группами цистеина, доступными для конъюгирования, как описано ранее, например, в статье Junutula et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:925-932 и US 2011/0301334. Вкратце, антитела объединяли с молекулой лекарственное средство-линкер для конъюгирования молекулы лекарственное средство-линкер со свободными остатками цистеина в антителе. Через несколько часов выполняли очистку ADC. Определяли лекарственную нагрузку (среднее количество молекул лекарственного вещества на антитело) для каждого ADC, которая составила 1,8-1,9. Полученные структуры ADC и термины, используемые для них представлены ниже на Фиг. 6.

[00390] Пример способа конъюгирования молекул линкер-лекарственное средство с антителами является следующим:

[00391] Полноразмерные моноклональные антитела с модифицированным цистеином (THIOMABSTM - Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26 (8): 925-932; Dornan et al., (2009) Blood 114 (13): 2721-2729, US 7521541; US 7723485, WO2009/052249, Shen et al (2012) Nature Biotech., 30(2): 184-191; Junutula et al., (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52), экспрессированные в клетках СНО, восстанавливали с около 20-40-кратным избытком TCEP (трис (2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлоридом) или DTT (дитиотреитолом) в 50 мМ Tris pH 7,5 с 2 мМ ЭДТА в течение 3 часов при 37 °С или в течение ночи при комнатной температуре. (Getz et al (1999) Anal. Biochem. 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA). Восстановленный THIOMAB™ разбавляли и загружали в колонку HiTrap S в 10 мМ ацетате натрия, pH 5, и элюировали PBS, содержащим 0,3 М хлорид натрия. Альтернативно, антитело подкисляли добавлением 1/20 объема 10% уксусной кислоты, разбавленной 10 мМ сукцинатом рН 5, загружали в колонку, а затем промывали 10 колоночными объемами сукцинатного буфера. Колонку элюировали 50 мМ Tris pH 7,5, 2 мМ ЭДТА.

[00392] Элюированный восстановленный THIOMAB™ обрабатывали 15-кратным молярным избытком DHAA (дегидроаскорбиновой кислоты) или 200 нМ водного сульфата меди (CuSO4). Окисление межцепочечных дисульфидных связей завершалось примерно через три часа или более. Окисление на воздухе также эффективно. Повторно окисленное антитело диализовали в 20 мМ натрийсукцинате pH 5, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА и хранили замороженным при -20 °C.

[00393] Деблокированные, повторно окисленные тио-антитела (THIOMABS™) подвергали взаимодействию с 6-8-кратным молярным избытком выбранного фрагмента линкер-лекарственное средство (например, присоединенный по центру предшественник PBD линкер-лекарственное средство) (из стокового раствора в ДМСО в концентрации 20 мМ) в 50 мМ Трис, рН 8, до тех пор, пока реакция не была завершена (16-24 часа), как определено ЖХ-МС анализом реакционной смеси.

[00394] Сырые конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) затем наносили на катионообменную колонку после разбавления 20 мМ сукцинатом натрия, рН 5. Колонку промывали по меньшей мере 10 колоночными объемами 20 мМ сукцината натрия, рН 5, а антитело элюировали PBS. Конъюгаты антитело-лекарственное средство доводили в 20 мМ His/ацетат, рН 5, с 240 мМ сахарозы, используя гель-фильтрационные колонки. Конъюгаты антитело-лекарственное средство оценивали при помощи УФ-спектроскопии для определения концентрации белка, аналитической SEC (эксклюзионной хроматографией) для агрегационного анализа и ЖХ-МС до и после лечения лизин C эндопептидазой.

[00395] Эксклюзионную хроматографию проводили, используя колонку Shodex KW802,5 в 0,2 М фосфате калия с pH 6,2 с 0,25 мМ хлорида калия и 15% IPA со скоростью потока 0,75 мл/мин. Агрегированное состояние конъюгата определяют путем интегрирования поглощения элюированной пиковой области при 280 нм.

[00396] Анализ ЖХ-МС проводили с использованием прибора Agilent QTOF 6520 ESI. Например, конъюгат антитело-лекарственное средство, полученный с использованием данной реакции, обрабатывали 1:500 масс./масс. Lys C эндопротеиназы (Promega) в трис, рН 7,5, в течение 30 мин при 37 °С. Полученные в результате фрагменты отщепления загружали в 1000А, 8 мкм колонку PLRP-S, нагретую до 80 °С, и элюировали с градиентом от 30% В до 40% В в течение 5 мин. Подвижная фаза A представляет собой H2O с 0,05% ТФА, а подвижная фаза B представляет собой ацетонитрил с 0,04% ТФА. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин. Элюцию белка контролировали с помощью УФ-поглощения при 280 нм перед электрораспылительной ионизацией и МС-анализом. Обычно достигается хроматографическое разрешение неконъюгированного Fc-фрагмента, остаточного неконъюгированного Fab и лекарственного Fab. Полученные m/z спектры деконволировали с использованием программного обеспечения Mass Hunter™ (Agilent Technologies) для вычисления массы фрагментов антитела.

Пример 3: Эффективность конъюгатов антитело-лекарственное средство hu7C2 в моделях ксенотрансплантата с использованием трансгенной опухоли молочной железы MMTV-Her2 Fo5

[00397] Мышам CRL nu/nu (иммунодефицитные) (Charles River Laboratory) имплантировали фрагменты ~2×2 мм трансгенной опухоли молочной железы MMTV-Her2 Fo5. Когда опухоли достигали среднего объема опухоли 100-300 мм3, животных делили на 7 групп по 8 мышей в каждой. Мыши получали единичное введение на первые сутки одного из следующих препаратов, путем внутривенной инъекции в хвостовую вену: (1) плацебо (20 мМ L-гистидин, 240 мМ сахароза, 0,02% Tween-20, pH 5,5), (2) тио-hu7C2-HC-A118C-присоединенный по центру-PBD, 0,3 мг/кг; (3) тио-hu7C2-HC-A118C-присоединенный по центру-PBD, 1 мг/кг; (4) тио-hu7C2-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD, 0,3 мг/кг; (5) тио-hu7C2-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD, 1 мг/кг; (6) тио-контрольноеAb-HC-A118C-присоединенный по центру-PBD, 1 мг/кг или (7) тио-контрольноеAb-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD, 1 мг/кг. DAR (коэффициент адсорбции) для тио-hu7C2-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD, тио-hu7C2-HC-A118C-присоединенный по центру-PBD и тио-контрольноеAb-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD составлял 1,8. DAR для тио-контрольноеAb-HC-A118C-присоединенный по центру-PBD составлял 1,9.

[00398] Замеры массы опухоли и тела проводились по меньшей мере один раз в неделю в течение периода исследования. Мышей умерщвляли, когда опухоли достигали размера 1000-2000 мм3, или если мышь теряла 20% или более массы своего тела. Объем опухоли измеряли в двух измерениях (длина и ширина) с помощью штангенциркуля и объем опухоли рассчитывали с использованием формулы: Размер опухоли (мм3)=(значение длины x значение ширины2) x 0,5.

[00399] Результаты эксперимента приведены в Таблице 5 и на Фиг. 4. В каждой группе было 8 мышей в начале исследования. AUC/сутки % ИРО (ингибирование роста опухоли) вычисляли по следующей формуле: %ИРО=100 x (1 - AUCлечение/сутки ÷ AUCплацебо/сутки). ЧО=частичный ответ, который определяется как более чем 50%, но менее 100% уменьшение объема опухоли, по сравнению с исходным объемом опухоли, в любые сутки во время исследования. ПО=полный ответ, который определяется как 100% уменьшение объема опухоли (нет измеримых опухолей), в любые сутки во время исследования.

Таблица 5: Эффективность hu7C2 ADC в модели ксенотрансплантата с использованием трансгенной опухоли молочной железы MMTV-Her2 Fo5

Группаобъем опухоли, последние суткиПоследние сутки (N)AUC/
сутки % ИРО (нижний, верхний)ЧОПО% изме
нение МТ (массы тела), послед
ние сутки(1) плацебо164014 (7)0 (0,0)005,71(2) тио-hu7C2-HC-A118C-присоединенный по центру-PBD, 0,3 мг/кг26035 (6)93 (77, 103)102,18(3) тио-hu7C2-HC-A118C-присоединенный по центру-PBD, 1 мг/кг11543 (6)106 (95, 118)225,83(4) тио-hu7C2-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD, 0,3 мг/кг19443 (6)97 (82, 107)205,15(5) тио-hu7C2-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD, 1 мг/кг6743 (8)111 (101, 123)533,53(6) тио-контрольноеAb-HC-A118C-присоединенный по центру-PBD, 1 мг/кг79422 (8)54 (10, 79)007,66(7) тио-контрольноеAb-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD, 1 мг/кг51226 (6)72 (39, 89)004,62

[00400] Как показано в Таблице 5, тио-hu7C2-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD продемонстрировал 5 частичных ответов и 3 полных ответа при 1 мг/кг, и 2 частичных ответа при 0,3 мг/кг. Тио-hu7C2-HC-A118C-дисульфид-PBD продемонстрировал 2 частичных ответа и 2 полных ответа при 1 мг/кг и 1 частичный ответ при 0,3 мг/кг.

Пример 4: Эффективность конъюгатов антитело-лекарственное средство hu7C2 в моделях ксенотрансплантата с использованием трансгенной опухоли молочной железы человека KPL-4

[00401] Каждую самку ТКИД-бежевых мышей C.B-17 (Charles River Laboratory) инокулировали в область жировой подушки молочной железы 3 миллионами клеток KPL-4, растворенными в HBSS/матригеле (соотношение 1:1). Когда опухоли-ксенотрансплантаты достигли среднего объема 100-300 мм3 (день 0), животных рандомизировали в 5 групп по 8 мышей на группу. Мыши получали единичное введение на первые сутки одного из следующих препаратов, путем внутривенной инъекции в хвостовую вену: (1) плацебо (20 мМ L-гистидин, 240 мМ сахароза, 0,02% Tween-20, pH 5,5), (2) тио-hu7C2-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD, 0,3 мг/кг; (3) тио-LC-K149C-A118C-присоединенный по центру-PBD, 1 мг/кг; (4) тио-hu7C2-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD, 3 мг/кг; (5) тио-контрольноеAb-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD, 3 мг/кг. DAR для тио-hu7C2-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD составлял 1,7, а DAR в контроле составлял 1,8.

[00402] Опухоли и массу тела мышей измеряли 1-2 раза в неделю в течение всего исследования. Мышей безотлагательно умерщвляли по достижении потери массы тела > 20% исходной массы. Объем опухоли измеряли в двух измерениях (длина и ширина) с помощью штангенциркуля и объем опухоли рассчитывали с использованием формулы: Размер опухоли (мм3)=(значение длины x значение ширины2) x 0,5.

[00403] Результаты эксперимента приведены в Таблице 6 и на Фиг. 5. В каждой группе было 8 мышей в начале исследования. AUC/сутки % ИРО (ингибирование роста опухоли) вычисляли по следующей формуле: %ИРО=100 x (1 - AUCлечение/сутки ÷ AUCплацебо/сутки). ЧО=частичный ответ, который определяется как более чем 50%, но менее 100% уменьшение объема опухоли, по сравнению с исходным объемом опухоли, в любые сутки во время исследования. ПО=полный ответ, который определяется как 100% уменьшение объема опухоли (нет измеримых опухолей), в любые сутки во время исследования.

Таблица 6: Эффективность hu7C2 ADC в модели ксенотрансплантата с использованием трансгенной опухоли молочной железы человека KPL-4

Группаобъем опухоли, последние суткиПослед
ние сутки
(N)AUC/
сутки % ИРО (нижний, верхний)ЧОПО% изменение МТ (массы тела), последние сутки(1) плацебо109522 (8)0 (0,0)00-5,89(2) тио-hu7C2-HC-A149C-присоединенный по центру-PBD, 0,3 мг/кг55025 (8)58 (-14, 87)00-2,45(3) тио-hu7C2-HC-A149C-присоединенный по центру-PBD, 1 мг/кг64125 (7)55 (-28, 90)00-5,7(4) тио-hu7C2-HC-A149C-присоединенный по центру-PBD, 3 мг/кг 7925 (8)120 (108, 147)51-5,94(5) тио-контрольноеAb-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD, 3 мг/кг24725 (6)107 (87, 128)10-14,99

[00404] Как показано в Таблице 6, тио-hu7C2-LC-K149C-присоединенный по центру-PBD продемонстрировал 5 частичных ответов и 1 полный ответ при 1 мг/кг.

[00405] В данном исследовани ADC против Her2 продемонстрировал дозозависимое ингибирование роста опухоли, с регрессией опухоли, наблюдаемой при дозе 3 мг/кг.

Пример 3: Кристаллическая структура Fab 7C2, связанного с HER2

Способы

[00406] Экспрессия, очистка и кристаллизации комплекса 7C2/HER2. -Fab 7C2 экспрессировали в E. coli и очищали при помощи аффинной смолы белок G сефарозы (GE), SP катионообменной хроматографии на сефарозе и эксклюзионной хроматографии (SEC). Внеклеточный домен HER2 (ECD) экспрессировали в клетках CHO и очищали при помощи аффинной хроматографии с использованием антитела трастузумаб, связанного с шариками стекла с контролируемым размером пор, а затем путем (DEAE) диэтиламиноэтил анионообменной и эксклюзионной хроматографии.

[00407] Комплекс между Fab 7C2 и HER2 ECD очищали при помощи SEC. Комплекс гликозилировали с использованием комбинации ферментов (эндо- F1, F2, F3, эндо-H и ПНГазы), с последующей очисткой при помощи SEC в 0,1 М NaCl, 20 мМ ГЭПЭС pH 7,2 и 2% глицероле. Комплекс кристаллизовали, в результате чего получили толстые пластины после недели в "висячей капле" с притенением равных частей белка 10 мг/мл и "резервуарной жидкости" (30% об./об. ПЭГ 550 монометилэфир, 0,1M трехосновной дигидрат цитрата натрия pH 5,0) и кратковременно обрабатывали резервуарной жидкостью до погружения в жидкий азот.

[00408] Дифракционные данные для комплекса до разрешения 2,7 Å собирали на ~110 K на оси пучка SSRL 11-1. Дифракционные изображения интегрировали и масштабировали с использованием программы HKL2000 и элементов пакета программ CCP4. См. Winn et al., 2011, Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr. 67: 235-42.

[00409] Структура была определена путем молекулярного замещения (MR) с использованием программы Phaser. См. McCoy et al., 2005, Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr. 61: 458-64. Модель поиска MR включала домен HER2 ECD, полученный от кристаллической структуры комплекса Fab HER2/Герцептин (код PDB: 1N8Z), константного домена Fab (код PDB: 1N8Z) и предсказанной модели вариабельного домена, созданной при помощи программы Modeller. См. Fiser et al., 2003, Methods Enzymol., 374: 461-91. Структура была уточнена при помощи программ REFMAC5 (Marshudov et al., 2011, Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr. 67: 355-67) и PHENIX.refine (Adams et al., 2010, Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr. 66 (pt. 2): 213-21) с использованием максимального правдоподобия целевой функции, анизотропных индивидуальных B-фактором и TLS уточнения. Данные и статистика уточнения приведены в Таблице 7.

Таблица 7: Статистические данные рентгеновской дифракции и уточнения структуры (в скобках приведены значения для последнего разрешения оболочки)

Сбор данных SSRL 11-1

Пространственная группа C2221

Параметры ячеек (Å) a=136,8, b=171,9, с=162,5

Разрешение (Å) 50-2,75 (2,85-2,75)

Rсим 0,112 (0,689)

Количество наблюдений 319169

Уникальные отражения 49078

Избыток 6,5 (5,5)

Полнота (%) 98,8 (92,2)

/<σI> 20 (2,2)

Vm(A3/Da) 4,2

Уточнение

Разрешение (Å) 48,33-2,75

Количество отражений 49053

R, Rсвобод 0,23, 0,25

Количество остатков 1047

Количество молекул воды 109

Количество атомов 8039

RMSD связей (среднеквадратическое отклонение) (Å) 0,007

RMSD углов (°) 1,2

Среднее связанных ΔB (Å2) 5,5

Анализ Рамачандрана (%) 93/6/1

Количество групп TLS 3

e (Å2) 7C2/HER2 88

Результаты

[00410] Кристаллическая структура комплекса 7C2 Fab/HER2 была определена для разрешения 2,75 Å. Каждая асимметричная ячейка содержит один комплекс Fab/HER2. Структура демонстрирует, что 7C2 Fab связывается с доменом I HER2 ECD (Фиг. 11A). Эпитоп связывания отличается от таковых, у ранее описанных комплексов HER2 ECD с фрагментами Fab терапевтического антитела трастузумаб (Tmab) или пертузумаб (Pmab), которые располагаются на доменах IV и II, соответственно. См., например, Cho et al., 2003, Nature, 421: 756-60; Eigenbrot et al., 2010, PNAS, 107: 15039-44; и Franklin et al., 2004, Caner Cell, 5: 17-28. Действительно, перекрывание структуры комплекса 7C2 Fab/HER2 ECD со структурами комплекса Tmab/HER2 ECD и комплекса Pmab/HER2 ECD демонстрирует, что три фрагмента Fab имеют независимые, неперекрывающиеся эпитопы и пространственно не мешают друг другу в связывании HER2 (Фиг. 11A). Суперпозиция структур HER2 ECD внутри комплекса Tmab/HER2 ECD, комплекса Pmab/HER2 ECD и комплекса 7C2 Fab/HER2 ECD демонстрирует минимальные структурные различия (Фиг. 11B). Данное наблюдение предполагает, что HER2 ECD является относительно жестким, что согласуется с предыдущими данными литературы. См., например, Cho et al., 2003, Nature, 421: 756-60; Eigenbrot et al., 2010, PNAS, 107: 15039-44; и Franklin et al., 2004, Caner Cell, 5: 17-28.

[00411] 7C2 Fab связывается с петлей 163-175 и петлей 185-189 внутри домена I HER2 (т.е., аминокислотами 163-175 и 185-189 зрелого HER2, например, SEQ ID NO: 39; домен I представлен в SEQ ID NO: 35). Связь занимает ~1160Å2 площади поверхности доступной для растворителя на каждой поверхности связывания. Имеется разветвленная сеть гидрофобных, водородных связей и ионных взаимодействий. Некоторые остатки, которые участвуют в связывании помечены на Фиг. 11C. Боковая цепь His171 вступает в контакт с остатками тяжелой цепи His52 и Asp55. Остатки HER2 Ser186, Ser187 и Glu188 образуют водородные связи с D102 тяжелой цепи и двумя остатками Tyr (Tyr36 и Tyr54) легкой цепи.

[00412] Эпитоп связывания 7C2 частично перекрывается с тем, который ранее сообщался для антитела против HER2 - chA21 (Фиг. 11D). См. Zhou et al., 2011, JBC, 286: 31676-83. Оба эпитопа содержат цепь в домене I (остатки 163-187). Интересно, что остаток His171 принимает участие во взаимодействии с обоими антителами. Однако эпитоп связывания chA21 занимает ~1820Å2 площади поверхности доступной для растворителя, что на ~660Å2 больше, чем эпитоп 7C2 и содержит две дополнительные N-концевые петли, остатки 100-105 и остатки 135-144.

[00413] Хотя для ясности понимания некоторые детали настоящего исследования описаны посредством иллюстраций и примеров, не следует считать, что описание и примеры ограничивают рамки настоящего изобретения. Описания всех патентов и научной литературы, приведенные в настоящем документе, явным образом полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

Таблица последовательностей

НАЗВАНИЕПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬSEQ ID NOПредшественник Her2 человека
(UniProtKB/ Swiss-Prot: P04626.1); ак 1-22 сигнальной последовательности; ак 23-1255 зрелого Her2MELAALCRWG LLLALLPPGA ASTQVCTGTD MKLRLPASPE THLDMLRHLY QGCQVVQGNL ELTYLPTNAS LSFLQDIQEV QGYVLIAHNQ VRQVPLQRLR IVRGTQLFED NYALAVLDNG DPLNNTTPVT GASPGGLREL QLRSLTEILK GGVLIQRNPQ LCYQDTILWK DIFHKNNQLA LTLIDTNRSR ACHPCSPMCK GSRCWGESSE DCQSLTRTVC AGGCARCKGP LPTDCCHEQC AAGCTGPKHS DCLACLHFNH SGICELHCPA LVTYNTDTFE SMPNPEGRYT FGASCVTACP YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR CEKCSKPCAR VCYGLGMEHL REVRAVTSAN IQEFAGCKKI FGSLAFLPES FDGDPASNTA PLQPEQLQVF ETLEEITGYL YISAWPDSLP DLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGI SWLGLRSLRE LGSGLALIHH NTHLCFVHTV PWDQLFRNPH QALLHTANRP EDECVGEGLA CHQLCARGHC WGPGPTQCVN CSQFLRGQEC VEECRVLQGL PREYVNARHC LPCHPECQPQ NGSVTCFGPE ADQCVACAHY KDPPFCVARC PSGVKPDLSY MPIWKFPDEE GACQPCPINC THSCVDLDDK GCPAEQRASP LTSIISAVVG ILLVVVLGVV FGILIKRRQQ KIRKYTMRRL LQETELVEPL TPSGAMPNQA QMRILKETEL RKVKVLGSGA FGTVYKGIWI PDGENVKIPV AIKVLRENTS PKANKEILDE AYVMAGVGSP YVSRLLGICL TSTVQLVTQL MPYGCLLDHV RENRGRLGSQ DLLNWCMQIA KGMSYLEDVR LVHRDLAARN VLVKSPNHVK ITDFGLARLL DIDETEYHAD GGKVPIKWMA LESILRRRFT HQSDVWSYGV TVWELMTFGA KPYDGIPARE IPDLLEKGER LPQPPICTID VYMIMVKCWM IDSECRPRFR ELVSEFSRMA RDPQRFVVIQ NEDLGPASPL DSTFYRSLLE DDDMGDLVDA EEYLVPQQGF FCPDPAPGAG GMVHHRHRSS STRSGGGDLT LGLEPSEEEA PRSPLAPSEG AGSDVFDGDL GMGAAKGLQS LPTHDPSPLQ RYSEDPTVPL PSETDGYVAP LTCSPQPEYV NQPDVRPQPP SPREGPLPAA RPAGATLERP KTLSPGKNGV VKDVFAFGGA VENPEYLTPQ GGAAPQPHPP PAFSPAFDNL YYWDQDPPER GAPPSTFKGT PTAENPEYLG LDVPV1зрелый HER2 человекаTQVCTGTD MKLRLPASPE THLDMLRHLY QGCQVVQGNL ELTYLPTNAS LSFLQDIQEV QGYVLIAHNQ VRQVPLQRLR IVRGTQLFED NYALAVLDNG DPLNNTTPVT GASPGGLREL QLRSLTEILK GGVLIQRNPQ LCYQDTILWK DIFHKNNQLA LTLIDTNRSR ACHPCSPMCK GSRCWGESSE DCQSLTRTVC AGGCARCKGP LPTDCCHEQC AAGCTGPKHS DCLACLHFNH SGICELHCPA LVTYNTDTFE SMPNPEGRYT FGASCVTACP YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR CEKCSKPCAR VCYGLGMEHL REVRAVTSAN IQEFAGCKKI FGSLAFLPES FDGDPASNTA PLQPEQLQVF ETLEEITGYL YISAWPDSLP DLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGI SWLGLRSLRE LGSGLALIHH NTHLCFVHTV PWDQLFRNPH QALLHTANRP EDECVGEGLA CHQLCARGHC WGPGPTQCVN CSQFLRGQEC VEECRVLQGL PREYVNARHC LPCHPECQPQ NGSVTCFGPE ADQCVACAHY KDPPFCVARC PSGVKPDLSY MPIWKFPDEE GACQPCPINC THSCVDLDDK GCPAEQRASP LTSIISAVVG ILLVVVLGVV FGILIKRRQQ KIRKYTMRRL LQETELVEPL TPSGAMPNQA QMRILKETEL RKVKVLGSGA FGTVYKGIWI PDGENVKIPV AIKVLRENTS PKANKEILDE AYVMAGVGSP YVSRLLGICL TSTVQLVTQL MPYGCLLDHV RENRGRLGSQ DLLNWCMQIA KGMSYLEDVR LVHRDLAARN VLVKSPNHVK ITDFGLARLL DIDETEYHAD GGKVPIKWMA LESILRRRFT HQSDVWSYGV TVWELMTFGA KPYDGIPARE IPDLLEKGER LPQPPICTID VYMIMVKCWM IDSECRPRFR ELVSEFSRMA RDPQRFVVIQ NEDLGPASPL DSTFYRSLLE DDDMGDLVDA EEYLVPQQGF FCPDPAPGAG GMVHHRHRSS STRSGGGDLT LGLEPSEEEA PRSPLAPSEG AGSDVFDGDL GMGAAKGLQS LPTHDPSPLQ RYSEDPTVPL PSETDGYVAP LTCSPQPEYV NQPDVRPQPP SPREGPLPAA RPAGATLERP KTLSPGKNGV VKDVFAFGGA VENPEYLTPQ GGAAPQPHPP PAFSPAFDNL YYWDQDPPER GAPPSTFKGT PTAENPEYLG LDVPV39Вариабельный участок легкой цепи мыши 7C2.B9 (mu7C2)DIVLTQSPAS LVVSLGQRAT ISCRASQSVS GSRFTYMHWY QQKPGQPPKL LIKYASILES GVPARFSGGG SGTDFTLNIH PVEEDDTATY YCQHSWEIPP WTFGGGTKLE IK2Вариабельный участок тяжелой цепи Mu7C2QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYSFT GYWMNWLKQR PGQGLEWIGM IHPSDSEIRA NQKFRDKATL TVDKSSTTAY MQLSSPTSED SAVYYCARGT YDGGFEYWGQ GTTLTVSS3Mu7C2 HVR-L1RASQSVSGSRFTYMH4Mu7C2 HVR-L2YASILES5Mu7C2 HVR-L3QHSWEIPPWT6Mu7C2 HVR-H1GYWMN7Mu7C2 HVR-H2MIHPSDSEIRANQKFRD8Mu7C2 HVR-H3GTYDGGFEY9Гуманизированный вариабельный участок легкой цепи 7C2.v2.2.LA (ʺhu7C2ʺ)DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASQSVS GSRFTYMHWY QQKPGQPPKL LIKYASILES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQHSWEIPP WTFGQGTKVE IK10Вариабельный участок тяжелой цепи Hu7C2EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT GYWMNWVRQA PGQGLEWIGM IHPLDAEIRA NQKFRDRVTI TVDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARGT YDGGFEYWGQ GTLVTVSS11Hu7C2 HVR-L1RASQSVSGSRFTYMH12Hu7C2 HVR-L2YASILES13Hu7C2 HVR-L3QHSWEIPPWT14Hu7C2 HVR-H1GYWMN15Hu7C2 HVR-H2 (Hu7C2. v2.1.S53L, S55A HVR-H2)MIHPLDAEIRANQKFRD16Hu7C2 HVR-H3GTYDGGFEY17Гуманизированная каппа легкая цепь 7C2.v2.2.LA (hu7C2) DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASQSVS GSRFTYMHWY QQKPGQPPKL LIKYASILES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQHSWEIPP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC18Тяжелая цепь Hu7C2IgG1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT GYWMNWVRQA PGQGLEWIGM IHPLDAEIRA NQKFRDRVTI TVDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARGT YDGGFEYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK19Hu7C2. v2.1.S53M HVR-H2MIHPMDSEIRANQKFRD20Hu7C2. v2.1.S53L HVR-H2MIHPLDSEIRANQKFRD21Hu7C2. v2.1.E101K HVR-H3GTYDGGFKY22Гуманизированная каппа легкая цепь 7C2.v2.2.LA (hu7C2) K149CDIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASQSVS GSRFTYMHWY QQKPGQPPKL LIKYASILES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQHSWEIPP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWCVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC23Тяжелая цепь Hu7C2 A118C IgG1EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT GYWMNWVRQA PGQGLEWIGM IHPLDAEIRA NQKFRDRVTI TVDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARGT YDGGFEYWGQ GTLVTVSSCS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK24Константный участок легкой цепи (Igκ) с искусственно внедренным остатком цистеина V205CTVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPCTKS FNRGEC25Константный участок тяжелой цепи (IgG1) с искусственно внедренным остатком цистеина A118CCSTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK26Константный участок легкой цепи (Igκ) с искусственно внедренным остатком цистеина K149CTVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW CVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC27Константный участок тяжелой цепи (IgG1) с искусственно внедренным остатком цистеина S400CASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDCDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK28

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> GENENTECH, INC.

<120> ИММУНОКОНЪЮГАТЫ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ HER2 И ПИРРОЛБЕНЗОДИАЗЕПИНЫ

<130> 01146-0039-00PCT

<150> US 62/051562

<151> 2014-09-17

<160> 43

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 1255

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His

35 40 45

Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

50 55 60

Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val

65 70 75 80

Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu

85 90 95

Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

100 105 110

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro

115 120 125

Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser

130 135 140

Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln

145 150 155 160

Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn

165 170 175

Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys

180 185 190

His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser

195 200 205

Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

210 215 220

Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys

225 230 235 240

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu

245 250 255

His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val

260 265 270

Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg

275 280 285

Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu

290 295 300

Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln

305 310 315 320

Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

325 330 335

Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

340 345 350

Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys

355 360 365

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp

370 375 380

Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe

385 390 395 400

Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

405 410 415

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg

420 425 430

Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu

435 440 445

Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly

450 455 460

Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val

465 470 475 480

Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr

485 490 495

Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His

500 505 510

Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys

515 520 525

Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys

530 535 540

Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys

545 550 555 560

Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys

565 570 575

Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp

580 585 590

Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu

595 600 605

Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln

610 615 620

Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys

625 630 635 640

Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser

645 650 655

Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly

660 665 670

Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg

675 680 685

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

690 695 700

Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu

705 710 715 720

Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys

725 730 735

Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile

740 745 750

Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu

755 760 765

Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg

770 775 780

Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu

785 790 795 800

Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg

805 810 815

Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly

820 825 830

Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala

835 840 845

Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe

850 855 860

Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp

865 870 875 880

Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg

885 890 895

Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val

900 905 910

Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala

915 920 925

Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro

930 935 940

Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met

945 950 955 960

Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe

965 970 975

Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu

980 985 990

Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu

995 1000 1005

Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr

1010 1015 1020

Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly

1025 1030 1035

Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg

1040 1045 1050

Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu

1055 1060 1065

Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser

1070 1075 1080

Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu

1085 1090 1095

Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser

1100 1105 1110

Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val

1115 1120 1125

Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro

1130 1135 1140

Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro

1145 1150 1155

Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu

1160 1165 1170

Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly

1175 1180 1185

Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala

1190 1195 1200

Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp

1205 1210 1215

Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro

1220 1225 1230

Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr

1235 1240 1245

Leu Gly Leu Asp Val Pro Val

1250 1255

<210> 2

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Val Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser

20 25 30

Arg Phe Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Asp Gly Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser Arg Phe Thr Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 5

Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 6

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Pro Trp Thr

1 5 10

<210> 7

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 7

Gly Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 8

Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe Arg

1 5 10 15

Asp

<210> 9

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 9

Gly Thr Tyr Asp Gly Gly Phe Glu Tyr

1 5

<210> 10

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser

20 25 30

Arg Phe Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Leu Asp Ala Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Asp Gly Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 12

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser Arg Phe Thr Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 13

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 13

Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser

1 5

<210> 14

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 14

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Pro Trp Thr

1 5 10

<210> 15

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 15

Gly Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 16

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 16

Met Ile His Pro Leu Asp Ala Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe Arg

1 5 10 15

Asp

<210> 17

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 17

Gly Thr Tyr Asp Gly Gly Phe Glu Tyr

1 5

<210> 18

<211> 219

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 18

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser

20 25 30

Arg Phe Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 19

<211> 448

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Leu Asp Ala Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Asp Gly Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 20

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 20

Met Ile His Pro Met Asp Ser Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe Arg

1 5 10 15

Asp

<210> 21

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 21

Met Ile His Pro Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe Arg

1 5 10 15

Asp

<210> 22

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 22

Gly Thr Tyr Asp Gly Gly Phe Lys Tyr

1 5

<210> 23

<211> 219

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser

20 25 30

Arg Phe Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 24

<211> 448

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Leu Asp Ala Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Asp Gly Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 25

<211> 106

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 25

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Cys Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 26

<211> 330

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 26

Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 27

<211> 106

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 27

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 28

<211> 330

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 28

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Cys Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 29

<211> 449

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 29

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 30

<211> 214

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 31

<211> 448

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 31

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 32

<211> 214

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 33

<211> 449

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 34

<211> 217

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 34

Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

1 5 10 15

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val

20 25 30

Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

65 70 75 80

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile

85 90 95

Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 35

<211> 195

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 35

Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser

1 5 10 15

Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln

20 25 30

Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser

35 40 45

Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile

50 55 60

Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val

65 70 75 80

Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp

85 90 95

Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro

100 105 110

Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys

115 120 125

Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr

130 135 140

Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr

145 150 155 160

Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met

165 170 175

Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser

180 185 190

Leu Thr Arg

195

<210> 36

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 36

Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr

1 5 10 15

Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His

20 25 30

Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu

35 40 45

Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser

50 55 60

Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr

65 70 75 80

Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu

85 90 95

Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln

100 105 110

Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val

115 120

<210> 37

<211> 169

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 37

Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr

1 5 10 15

Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser

20 25 30

Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr

35 40 45

Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu

50 55 60

Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp

65 70 75 80

Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His

85 90 95

Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu

100 105 110

Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His

115 120 125

His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu

130 135 140

Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu

145 150 155 160

Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala

165

<210> 38

<211> 142

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 38

Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr

1 5 10 15

Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu

20 25 30

Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg

35 40 45

His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val

50 55 60

Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr

65 70 75 80

Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro

85 90 95

Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala

100 105 110

Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp

115 120 125

Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr

130 135 140

<210> 39

<211> 1233

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 39

Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser

1 5 10 15

Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln

20 25 30

Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser

35 40 45

Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile

50 55 60

Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val

65 70 75 80

Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp

85 90 95

Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro

100 105 110

Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys

115 120 125

Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr

130 135 140

Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr

145 150 155 160

Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met

165 170 175

Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser

180 185 190

Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro

195 200 205

Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly

210 215 220

Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly

225 230 235 240

Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr

245 250 255

Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser

260 265 270

Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser

275 280 285

Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp

290 295 300

Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys

305 310 315 320

Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser

325 330 335

Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu

340 345 350

Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala

355 360 365

Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile

370 375 380

Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu

385 390 395 400

Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn

405 410 415

Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly

420 425 430

Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His

435 440 445

Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe

450 455 460

Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp

465 470 475 480

Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly

485 490 495

His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe

500 505 510

Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu

515 520 525

Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu

530 535 540

Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp

545 550 555 560

Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala

565 570 575

Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp

580 585 590

Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys

595 600 605

Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln

610 615 620

Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu

625 630 635 640

Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu Ile Lys Arg Arg

645 650 655

Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu Leu Gln Glu Thr

660 665 670

Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala Met Pro Asn Gln Ala

675 680 685

Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Val Lys Val Leu

690 695 700

Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Ile Pro Asp

705 710 715 720

Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn

725 730 735

Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met

740 745 750

Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu

755 760 765

Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro Tyr Gly Cys Leu

770 775 780

Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu Gly Ser Gln Asp Leu

785 790 795 800

Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu Glu Asp

805 810 815

Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys

820 825 830

Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Leu

835 840 845

Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp Gly Gly Lys Val Pro Ile

850 855 860

Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg Arg Phe Thr His Gln

865 870 875 880

Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe

885 890 895

Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Arg Glu Ile Pro Asp Leu

900 905 910

Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp

915 920 925

Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ser Glu Cys Arg

930 935 940

Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser Arg Met Ala Arg Asp

945 950 955 960

Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ala Ser

965 970 975

Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu Leu Glu Asp Asp Asp Met

980 985 990

Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe

995 1000 1005

Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly Gly Met Val His His

1010 1015 1020

Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr

1025 1030 1035

Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu

1040 1045 1050

Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu

1055 1060 1065

Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp

1070 1075 1080

Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu

1085 1090 1095

Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro

1100 1105 1110

Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro

1115 1120 1125

Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala

1130 1135 1140

Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val

1145 1150 1155

Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu

1160 1165 1170

Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro

1175 1180 1185

Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln

1190 1195 1200

Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr

1205 1210 1215

Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Gly Leu Asp Val Pro Val

1220 1225 1230

<210> 40

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 40

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 41

<211> 114

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 41

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg

<210> 42

<211> 113

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 42

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Val Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser

20 25 30

Arg Phe Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 43

<211> 113

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 43

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser

20 25 30

Arg Phe Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<---

Реферат

Группа изобретений относится к иммуноконъюгатам, содержащим антитела против HER2, и их применению в виде монотерапии или комбинированной терапии HER2-ассоциированных состояний. Иммуноконъюгат имеет формулу Ab-(L-D), где Ab представляет собой антитело, которое связывается с HER2, L представляет собой линкер, D представляет собой цитотоксический агент, а именно пирролобензодиазепин, p находится в диапазоне 1-8. Также предложены фармацевтический состав и способы для лечения HER2-связанного состояния, в частности HER2-позитивного рака, с использованием указанного иммуноконъюгата. 6 н. и 58 з.п. ф-лы, 11 ил., 7 табл., 3 пр.

Формула

1. Иммуноконъюгат, который нацеливается на HER2, содержащий антитело и цитотоксический агент, где иммуноконъюгат имеет формулу Аb-(L-D)p, где:
а) Аb представляет собой антитело;
(b) L представляет собой линкер;
(c) D представляет собой цитотоксический агент и
(d) p равен 1-8;
и где D представляет собой пирролобензодиазепин, и L-D имеет формулу А:
где R2 представляет собой
, где R36a и R36b независимо выбраны из H, F, C1-4 насыщенного алкила, C2-3 алкенила, где группы алкила и алкенила необязательно замещены группой, выбранной из С1-4 алкиламидо и эфира C1-4 алкила; или где один из R36a и R36b представляет собой H, другой независимо выбран из нитрила и эфира C1-4 алкила;
R6 и R9 независимо выбраны из H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn или галогена;
R7 независимо выбраны из H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn или галогена;
Y имеет формулу:
где G представляет собой линкер, соединенный с антителом; и
n равно целому числу, выбранному из 0-48;
(a) R10 представляет собой H, и R11 представляет собой OH, ORA, где RA представляет собой C1-4 алкил; или
(b) R10 и R11 образуют азот-углеродную двойную связь между атомами азота и углерода, с которыми они связаны; или
(c) R10 представляет собой H, и R11 представляет собой OSOzM, где z равно 2 или 3, и M представляет собой одновалентный фармацевтически приемлемый катион;
каждый R и R' независимо выбран из необязательно замещенных групп C1-12 алкила, C3-20 гетероциклила и C5-20 арила, и необязательно по отношению к группе NRR', R и R' совместно с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенное 4-, 5-, 6- или 7-членное гетероциклическое кольцо;
R16, R17, R19, R20, R21и R22 соответствуют определению R6, R7, R9, R10,R11и R2 соответственно;
Z представляет собой CH или N;
T и T' независимо выбраны из одинарной связи или C1-9 алкилена, где цепь может быть прервана одним или несколькими гетероатомами, например O, S, N(H), NMe, при условии, что число атомов в самой короткой цепи атомов между X и X' составляет 3-12 атомов; и
X и X' независимо выбраны из O, S и N(H);
и где антитело представляет собой антитело, которое связывается с HER2, содержащее:
(а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15;
(b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16;
(c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17;
(d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12;
(e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13; и
(f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14.
2. Иммуноконъюгат по п.1, где антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:11, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:10.
3. Иммуноконъюгат по п.1, где антитело представляет собой моноклональное антитело.
4. Иммуноконъюгат по п.3, где антитело является гуманизированным или химерным антителом.
5. Иммуноконъюгат по п.1, где антитело представляет собой фрагмент антитела, который связывается с HER2.
6. Иммуноконъюгат по п.1, где HER2 представляет собой HER2 человека, содержащий аминокислоты 23-1255 последовательности SEQ ID NO:1.
7. Иммуноконъюгат по п.1, где антитело связывается с внеклеточным доменом I HER2.
8. Иммуноконъюгат по п.7, где внеклеточный домен I HER2 имеет последовательность SEQ ID NO:35.
9. Иммуноконъюгат по п.1, где антитело представляет собой антитело IgG1, IgG2a или IgG2b.
10. Иммуноконъюгат по п.1, где антитело содержит один или более сконструированных свободных аминокислотных остатков цистеина в константном участке тяжелой цепи и в константном участке легкой цепи.
11. Иммуноконъюгат по п.10, где один или более сконструированных свободных аминокислотных остатков цистеина расположены в константном участке тяжелой цепи.
12. Иммуноконъюгат по п.10, где один или более сконструированных свободных аминокислотных остатков цистеина расположены в константном участке легкой цепи.
13. Иммуноконъюгат по п.11, где антитело содержит по меньшей мере одну мутацию в константном участке тяжелой цепи, выбранную из A118C и S400C.
14. Иммуноконъюгат по п.12, где антитело содержит по меньшей мере одну мутацию в константном участке легкой цепи, выбранную из K149C и V205C.
15. Иммуноконъюгат по любому из пп.1-9, где антитело содержит:
a) тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:19, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:18; или
b) тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:19, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:23; или
c) тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:24, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:18.
16. Иммуноконъюгат по любому из пп.1-9, где антитело содержит константный участок тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:28.
17. Иммуноконъюгат по любому из пп.1-9, где антитело содержит константный участок легкой цепи SEQ ID NO:25.
18. Иммуноконъюгат по п.1, где R9 представляет собой H.
19. Иммуноконъюгат по п.1, где R6 представляет собой H.
20. Иммуноконъюгат по п.1, где R7 представляет собой OR, где R представляет собой необязательно замещенный C1-4 алкил.
21. Иммуноконъюгат по п.20, где R представляет собой Me.
22. Иммуноконъюгат по п.1, где X представляет собой O.
23. Иммуноконъюгат по п.1, где T выбран из одинарной связи, группы C1алкилена и C2алкилена.
24. Иммуноконъюгат по п.23, где T представляет собой группу C1алкилена.
25. Иммуноконъюгат по п.1, где оба R36a и R36b представляют собой H.
26. Иммуноконъюгат по п.1, где оба R36a и R36b представляют собой метил.
27. Иммуноконъюгат по п.1, где один из R36a и R36b представляет собой H, а другой выбраны из C1-4 насыщенного алкила, C2-3 алкенила, где группы алкила и алкенила необязательно замещены.
28. Иммуноконъюгат по п.27, где группы R36a и R36b, которые не представляют собой H, выбраны из метила и этила.
29. Иммуноконъюгат по п.1, где R10 представляет собой H, и R11 представляет собой OH.
30. Иммуноконъюгат по п.1, где R10 и R11 образуют азот-углеродную двойную связь между атомами азота и углерода, с которыми они связаны.
31. Иммуноконъюгат по п.1, где R16, R17, R19, R20, R21, R22, X' и T' соответствуют определениям R6, R7, R9, R10, R11, R2, X и T соответственно.
32. Иммуноконъюгат по п.1, содержащий структуру:
33. Иммуноконъюгат по п.32, содержащий структуру:
34. Иммуноконъюгат по п.1 или 33, где p равно 1,3-2 или 2-5.
35. Фармацевтический состав для лечения HER2-связанного состояния, содержащий иммуноконъюгат по любому из предшествующих пунктов и фармацевтически приемлемый носитель.
36. Фармацевтический состав по п.35, дополнительно содержащий дополнительный терапевтический агент.
37. Фармацевтический состав по п.36, где дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с HER2.
38. Фармацевтический состав по п.37, где дополнительный терапевтический агент представляет собой (i) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с доменом II HER2, и/или (ii) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с доменом IV HER2.
39. Фармацевтический состав по п.38, где дополнительный терапевтический агент представляет собой (i) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с эпитопом 2C4, и/или (ii) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с эпитопом 4D5.
40. Фармацевтический состав по п.36, где дополнительный терапевтический агент представляет собой трастузумаб, трастузумаб-MCC-DM1 (T-DM1) и/или пертузумаб.
41. Фармацевтический состав по п.36, дополнительно содержащий
(1) трастузумаб или T-DM1 и
(2) пертузумаб.
42. Способ лечения индивидуума с HER2-позитивным раком, включающий введение индивидууму эффективного количества иммуноконъюгата по любому из пп.1-34 или фармацевтического состава по любому из пп.35-41.
43. Способ по п.42, где HER2-позитивный рак представляет собой рак молочной железы или рак желудка.
44. Способ по п.43, где HER2-позитивный рак молочной железы представляет собой рак молочной железы на ранней стадии.
45. Способ по п.43, где HER2-позитивный рак молочной железы представляет собой метастатический рак молочной железы.
46. Способ по любому из пп.42-45, дополнительно включающий введение индивидууму дополнительного терапевтического агента.
47. Способ лечения индивидуума с HER2-позитивным раком, включающий введение индивидууму эффективного количества иммуноконъюгата по любому из пп.1-34 и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента.
48. Способ по п.47, где дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с HER2.
49. Способ по п.48, где дополнительный терапевтический агент представляет собой
(i) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с доменом II HER2, и/или
(ii) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с доменом IV HER2.
50. Способ по п.49, где дополнительный терапевтический агент представляет собой
(i) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с эпитопом 2C4, и/или
(ii) антитело или иммуноконъюгат, которые связываются с эпитопом 4D5.
51. Способ по п.47, где дополнительный терапевтический агент выбран из трастузумаба, трастузумаб-MCC-DM1 (T-DM1) и пертузумаба.
52. Способ по п.47, отличающийся тем, что дополнительные терапевтические агенты представляют собой (1) трастузумаб или T-DM1 и (2) пертузумаб.
53. Способ по любому из пп.47-52, где HER2-позитивный рак представляет собой рак молочной железы или рак желудка.
54. Способ по п.53, где HER2-позитивный рак молочной железы представляет собой метастатический рак молочной железы.
55. Способ по п.53, где HER2-позитивный рак молочной железы представляет собой рак молочной железы на ранней стадии.
56. Способ по любому из пп.42-55, где HER2-позитивный рак представляет собой рецидивирующий рак.
57. Способ по п.56, где рецидивирующий рак представляет собой местно-рецидивирующий рак.
58. Способ по любому из пп.42-54, где HER2-позитивный рак представляет собой рак на последних стадиях.
59. Способ по любому из пп.42-58, где HER2-позитивный рак является неоперабельным.
60. Способ лечения индивидуума с HER2-позитивным раком, включающий:
a) проведение у индивидуума неоадъювантной терапии эффективным количеством иммуноконъюгата по любому из пп.1-34 или фармацевтическим составом по любому из пп.35-41,
b) хирургическое удаление опухоли и
c) проведение у индивидуума адъювантной терапии эффективным количеством иммуноконъюгата по любому из пп.1-34 или фармацевтическим составом по любому из пп.35-41.
61. Способ по п.60, где HER2-позитивный рак представляет собой рак молочной железы или рак желудка.
62. Способ по п.61, где HER2-позитивный рак представляет собой рак молочной железы.
63. Способ ингибирования пролиферации HER2-позитивной клетки, включающий воздействие на клетку иммуноконъюгатом по любому из пп.1-34 в условиях, допускающих связывание иммуноконъюгата с HER2 на поверхности клетки, тем самым ингибируя пролиферацию клетки.
64. Способ по п.63, где клетка представляет собой клетку рака груди или клетку рака желудка.

Патенты аналоги

Авторы

ЧЭНЬ Сяочэн (US)
ДЕННИС Марк (US)
ДЖУНУТУЛА Джагат Редди (US)
ФИЛЛИПС Гейл Льюис (US)
ПИЛЛОУ Томас Харден (US)
СЛИВКОВСКИ Марк Кс. (US)
CHEN XIAOCHENG
DENNIS MARK
JUNUTULA JAGATH REDDY
PHILLIPS GAIL LEWIS
PILLOW THOMAS HARDEN
SLIWKOWSKI MARK X
CHEN, Xiaocheng
DENNIS, Mark
JUNUTULA, Jagath Reddy
PHILLIPS, Gail Lewis
PILLOW, Thomas Harden
SLIWKOWSKI, Mark X.

Патентообладатели

GENENTECH INC
GENENTECH, INC.

Заявители

GENENTECH INC
GENENTECH, INC.

СПК: A61K31/5517 A61K39/39558 A61K47/6803 A61K47/6855 A61K47/6869 A61P35/00 A61P35/04 A61P43/00 C07K16/005 C07K16/32 C07K2317/24 C07K2317/92

МПК: A61K31/5517 A61K39/395 A61K47/68 A61P35/00

Публикация: 2020-07-22

Дата подачи заявки: 2015-09-16

0
0
0
0
Невозможно загрузить содержимое всплывающей подсказки.
Поиск по товарам
Добавить свой товар
Сообщества
Товары
Участники
Патенты
Запросов

Поставщикам
О сервисе
Блогерам
Помощь
Представьтесь