Ингибитор входа вируса гепатита и фармацевтическая композиция для лечения гепатита - RU2662161C1

Описание

Изобретение относится к новым ингибиторам входа вируса гепатита дельта (ВГД), новой фармацевтической композиции и способу лечения инфекции ВГД и ко-инфекции ВГД и вируса гепатита В (ВГВ).

Вирус гепатита дельта уникален среди патогенов человека и животных тем, что имеет ряд общих свойств как с вироидами растений, так и с вироидоподобными сателлитными РНК растений. Этот небольшой содержащий РНК инфекционный агент является вирусом-сателлитом, поскольку для его размножения в клетках и развития инфекции необходимо, чтобы клетки были заражены ВГВ (он использует оболочечные белки ВГВ (S-антигены) для упаковки своего генома). Существует предположение, что ВГД развился из примитивной вироидоподобной РНК, захватившей клеточный транскрипт. Этот патоген, переносимый кровью, размножается в печени и часто вызывает острый гепатит у млекопитающих.

ВГД передается через кровь и ее производные. Существуют две основные модели развития инфекции ВГД. Коинфекция имеет место в том случае, когда организм заражается одновременно и ВГВ, и ВГД. О суперинфекции говорят тогда, когда организм сначала имел ВГВ, а потом заразился ВГД. Такие суперинфекции могут достигать наиболее сильной выраженности и имеют наибольшую вероятность перехода в хроническую форму. Пациенты, зараженные и ВГВ и ВГД, имеют намного большую вероятность развития терминальной стадии печеночной недостаточности, быстрого развития цирроза печени, а в случае хронических инфекций - увеличенную вероятность гепатоцеллюлярной карциномы.

Хотя ВГД обнаруживается исключительно в присутствии ВГВ, при заражении ВГВ далеко не всегда обнаруживается ВГД. В некоторых популяциях частота совместного развития ВГВ с ВГД особенно высока. В разных популяциях доля пациентов с ВГВ, страдающих также от ВГД, варьирует от менее чем 1% до более 10%. Наиболее высок процент таких пациентов в бассейне Амазонки, на территории юга бывшего СССР, в Средиземноморье и Африке южнее Сахары. В целом в развитых странах ВГД редок. Процент инфицированных двумя вирусами одновременно (ко-инфицированными) может быть особенно высок среди определенных групп населения в пределах одной популяции, так, среди наркоманов, использующих нестерильные иглы, он может достигать более чем 70%. Также в группу риска входят люди, принимающие концентраты факторов свертывания крови. По всему миру ВГД заражены около 20 млн. человек.

В настоящий момент не существует направленной терапии конкретно против ВГД. Было показано, что в 20% случаев применение высоких доз интерферона-α давало положительный результат, однако при прекращении приема интерферона инфекция снова развивалась, следовательно, интерферон не приводит к излечению [https://ru.wikipedia.org/].

Против ВГД были опробованы методы противовирусной терапии, основанные на ингибиторах обратной транскриптазы ВГВ. Можно было бы предположить, что это приведет к опосредованному подавлению размножения ВГД, однако в действительности такого не произошло [https://ru.wikipedia.org/wiki].

В настоящее время известен по-видимому только один ингибитор входа ВГД Мирклудекс В (Myrcludex В), представляющий собой синтетический липопептид, идентичный аминокислотной последовательности домена preS1 поверхностного антигена ВГВ (HBsAg-L). Это линейный, 47-аминокислотный, химически синтезированный полипептид, несущий N-концевую миристоильную часть и С-концевой карбоксамид. Мирклудекс В ингибирует распространение ВГД и ВГВ in vitro, на животных моделях и в клинических испытаниях [http://myr-pharma.com/about/research-and-development/technology-and-mode-of-action]. Мирклудекс В является ингибитором входа ВГД и ВГВ, блокирующим полипептид, осуществляющий сопряженный транспорт таурохолата натрия (NTCP, клеточный рецептор этих вирусов), таким образом ингибируя новое инфицирование клеток печени. (Sodium/Taurocholate Co-transporting Polypeptide - NTCP) [Schulze A, et al. J. Virol. 2010, 84(4), 1989-200. Slijepcevic D et al. Hepatology 2015, 62(1), 207-219].

Мирклудекс В имеет наномолярную активность (ЕС₅₀ ~ 47 нМ) ингибирования входа ВГВ in vitro за счет блокирования NTCP [file:///C:/Users/av/Downloads/viruses-09-00172-v3%20(1).pdf].

В октябре 2015 г начались клинические испытания Мирклудекса В [F.A. Lempp, S. Urban. Viruses 2017, 9, 172, 1-19; http://www.studfiles.ru/preview/6159594/page:32/], результаты которых до настоящего времени не опубликованы.

В настоящий момент не существует направленной терапии конкретно против инфекции ВГД и отсуствуют ингибиторы ВГД, представляющие собой малые молекулы. В этой связи поиск новых препаратов для лечения инфекции ВГД и ко-инфекции ВГД и ВГВ является актуальной задачей.

Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании этого изобретения.

Термин «алкил», используемый здесь, относится к насыщенным с линейной или разветвленной цепью углеводородным радикалам, содержащим от одного до шести атомов углерода. Примеры алкильных радикалов C₁-С₆, включают, но не ограничиваются ими, метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил и трет-бутил.

«Арил» означает ароматическую моноциклическую или полициклическую систему, включающую от 6 до 14 атомов углерода, преимущественно от 6 до 10 атомов углерода. Арил может содержать один или более «заместителей циклической системы», которые могут быть одинаковыми или разными.

«Галоген» означает фтор, хлор, бром и йод. Предпочтительными являются фтор, хлор и бром.

«Гидрат» означает стехиометрическую или нестехиометрическую композицию соединения или его соли с водой.

«Карбокси группа» означает группу -СО₂Н.

«Ко-инфекция» означает в вирусологии сочетанное заражение одной. клетки различными видами вирусов.

«Лекарственное начало» (лекарственная субстанция лекарственное вещество, drug-substance) означает физиологически активное вещество синтетического или иного (биотехнологического, растительного, животного, микробного и прочего) происхождения, обладающее фармакологической активностью и являющееся активным началом фармацевтической композиции, используемой для производства и изготовления лекарственного препарата (средства).

«Лекарственное средство (препарат)» - вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции), в виде таблеток капсул инъекций, мазей и др. готовых форм предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего.

«Метокси группа» обозначает группу -О-СН₃.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя соединение формулы 1 и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как, парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, алгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения, в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения.

«Фармацевтически приемлемая соль» означает относительно нетоксичные органические и неорганические соли кислот и оснований, заявленных в настоящем изобретении. Эти соли могут быть получены in situ в процессе синтеза, выделения или очистки соединений или приготовлены специально. В частности, соли оснований могут быть получены специально, исходя из очищенного свободного основания заявленного соединения и подходящей органической или неорганической кислоты. Примерами полученных таким образом солей являются гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валериаты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, тозилаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, мезилаты, малонаты, салицилаты, пропионаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, сульфаматы и им подобные (Подробное описание свойств таких солей дано в Berge S.M. et al., "Pharmaceutical Salts" J. Pharm. Sci. 1977, 66: 1-19). Соли заявленных кислот также могут быть специально получены реакцией очищенной кислоты с подходящим основанием, при этом могут быть синтезированы соли металлов и аминов. К металлическим относятся соли натрия, калия, кальция, бария, цинка, магния, лития и алюминия, наиболее желательными из которых являются соли натрия и калия. Подходящими неорганическими основаниями, из которых могут быть получены соли металлов, являются гидроксид, карбонат, бикарбонат и гидрид натрия, гидроксид и бикарбонат калия, поташ, гидроксид лития, гидроксид кальция, гидроксид магния, гидроксид цинка. В качестве органических оснований, из которых могут быть получены соли заявленных кислот, выбраны амины и аминокислоты, обладающие достаточной основностью, чтобы образовать устойчивую соль, и пригодные для использования в медицинских целях (в частности, они должны обладать низкой токсичностью). К таким аминам относятся аммиак, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, бензиламин, дибензиламин, дициклогексиламин, пиперазин, этилпиперидин, трис(гидроксиметил)аминометан и подобные им. Кроме того, для солеобразования могут быть использованы гидроокиси тетраалкиламмония, например, такие как, холин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний и им подобные. В качестве аминокислот могут быть использованы основные аминокислоты - лизин, орнитин и аргинин.

Предметом данного изобретения является новый ингибитор входа вируса гепатита дельта, представляющий собой 1,1-диоксо-1,4-дигидро-2Н-бензо[1,2,4]тиадиазин-3-оны общей формулы 1, его гидрат и/или сольват,

где Ar¹ и Ar² представляют собой необязательно одинаковые арилы, в том числе фенил, необязательно замещенный одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из C₁-С₄алкила, метоксила, галогена, карбоксила необязательно замещенного карбамоила и карбонитрила.

Соединения общей формулы 1, как неожиданно установили авторы, являются эффективными ингибиторами входа ВГД. Соединения общей формулы 1 блокируют NTCP рецептор гепатоцита, важный для развития инфекционного вируса гепатита дельта, таким образом, ингибируя новое инфицирование клеток печени.

Согласно данному изобретению предпочтительным ингибитором входа ВГД общей формулы 1 является 1,1-диоксо-1,4-дигидро-2Н-бензо[1,2,4]тиадиазин-3-он, выбранный из ряда соединений 1.1-1.16 и их гидратов и/или сольватов.

Соединения общей формулы 1 являются коммерчески доступными соединениями [база данных SciFinder® от Chemical Abstracts Service]. Соединения 1.1-1.6 и 1.8-1.16 известны также, как ингибиторы репликации ВГВ [Патент RU 2574387 (2016)].

Соединения общей формулы 1, их гидраты и/или сольваты являются активными ингибиторами входа ВГД, блокирующими NTCP рецептор гепатоцита. Ингибирующую активность соединений общей формулы 1 (ингибирование секреции антигена HDag в культуре клеток HepG2/NTCP, зараженных ВГД) определяли методом ELISA по протоколу, описанному ниже в Примере 1, а их цито токсичность определяли по протоколу, описанному ниже в Примере 2. В сопоставимых условиях методом ELISA определяли ингибирование входа ВГВ соединениями общей формулы 1 (ингибирование секреции антигена HBcAg) в культуре клеток HepG2/NTCP, зараженных ВГВ). Например, активность ингибирования секреции антигена HDAg соединением формулы 1.7 соответствует значению ЕС₅₀=64 нМ, а соединением формулы 1.14 - ЕС₅₀=38 нМ. Авторы установили, что соединения формул 1.7 и 1.14 также являются и активными ингибиторами входа ВГВ и имеют активность ингибирования секреции антигена HBeAg соединением формулы 1.7 соответствует значению ЕС₅₀=61 нМ, а соединением формулы 1.14 - ЕС₅₀=37 нМ.

Согласно данному изобретению новый ингибитор входа ВГД общей формулы 1, его гидрат и/или сольват представляет собой лекарственное начало для приготовления фармацевтической композиции и готовой лекарственной формы для профилактики и лечения инфекции ВГД и ко-инфекции ВГД и ВГВ и необязательно гепатита С (ВГС) и вируса имунодефицита человека (ВИЧ) у теплокровных животных и людей.

Предметом данного изобретения является фармацевтическая композиция в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, для лечения инфекции ВГД или ко-инфекции ВГД и ВГВ и ВГС и ВИЧ у людей и теплокровных животных, включающая в свой состав ингибитор входа ВГД общей формулы 1, его гидрат и/или сольват в терапевтически эффективном количестве и необязательно фармацевтически приемлемые эксципиенты. Под фармацевтически приемлемыми эксципиентами подразумеваются применяемые в сфере фармацевтики разбавители, вспомогательные агенты и/или носители. Фармацевтическая композиция наряду с ингибитором общей формулы 1 или его гидратом и/или сольватом по настоящему изобретению может включать и другие активные субстанции, при условии, что они не вызывают нежелательных эффектов.

При необходимости использования фармацевтической композиции по настоящему изобретению в клинической практике она может смешиваться с традиционными фармацевтическими носителями.

Носители, используемые в фармацевтических композиций по настоящему изобретению, представляют собой носители, которые применяются в сфере фармацевтики для получения распространенных форм, в том числе: в пероральных формах используются связующие вещества, смазывающие агенты, дезинтеграторы, растворители, разбавители, стабилизаторы, суспендирующие агенты, бесцветные агенты, корригенты вкуса; в формах для инъекций используются антисептические агенты, солюбилизаторы, стабилизаторы; в местных формах используются основы, разбавители, смазывающие агенты, антисептические агенты.

Предметом данного изобретения является способ получения фармацевтической композиции смешением с инертным наполнителем и/или растворителем, по крайней мере, одного ингибитора входа ВГД общей формулы 1 или его гидрата и/или сольвата в терапевтически эффективном количестве.

Предметом данного изобретения являются также терапевтические коктейли для лечения инфекции ВГД и ко-инфекции ВГД и ВГВ и необязательно ВГС и ВИЧ, включающие в качестве одного из компонентов новое лекарственное средство общей формулы 1, его гидрат и/или сольват или новую фармацевтическую композицию, содержащих в качестве активного компонента по крайней мере один ингибитор входа ВГД общей формулы 1 или его гидрат и/или сольват.

Терапевтический коктейль для лечения инфекции ВГД или ко-инфекции ВГД и ВГВ и необязательно ВГС и ВИЧ, наряду с фармацевтической композицией по данному изобретению, может включать другие известные препараты, предназначенные для лечения ВГВ, ВГС, ВИЧ или препараты, усиливающие иммунную систему пациента.

В соответствии с данным изобретением способ профилактики и лечения инфекции ВГД или ко-инфекции ВГД и ВГВ и необязательно ВГС и ВИЧ у животных и людей заключается во введении пациенту новой фармацевтической композиции по данному изобретению или нового терапевтического коктейля по данному изобретению.

Лекарственные средства могут вводиться через ингалятор, перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или местно). Клиническая дозировка средства общей формулы 1 или его гидрата и/или сольвата у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективности и биодоступности активных ингредиентов в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента, при этом суточная доза у взрослых обычно составляет 10~500 мг. Поэтому во время приготовления из фармацевтической композиции ингибитора по настоящему изобретению в виде единиц дозировки необходимо учитывать вышеназванную эффективную дозировку, при этом каждая единица дозировки препарата должна содержать 10~500 мг ингибитора общей формулы 1 или его гидрат и/или сольват. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени.

Предметом данного изобретения является также способ ингибирования активности ВГД в естественных условиях, включающий стадию контактирования ингибитора общей формулы 1, его фармацевтически приемлемой соли, гидрата и/или сольвата и NTCP рецептора гепатоцита.

Авторы обнаружили также, что соединение 1.7 его гидрат и/или сольват является ингибитором входа вируса гепатита В. Это также является предметом данного изобретения.

Данное изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Определение противовирусной активности фармацевтической композиции, содержащей в качестве активной субстанции один из ингибиторов входа ВГВ общей формулы 1, в отношении ВГД в культуре клеток человеческой гепатомы (HepG2/NTCP), зараженной ВГД in vitro.

Для определения активности ингибиторов использовался иммунный in vitro тест ELISA на антиген ВГД (HDAg). С помощью этого теста измерялась эффективность ингибирования тестируемыми соединениями продукции антигена (и, следовательно, входа ВГД) в клетках, инфицированных ВГД. Использованная в данном эксперименте культура клеток HepG2/NTCP способна быть эффективно инфицирована ВГД и, следовательно, пригодна для изучения ингибиторов входа ВГД.

Клетки HepG2/NTCP были высеяны в 96-луночные платы (3,0×10³ клеток на лунку) в среде DMEM (50 мкл на каждую лунку). Для каждого тестируемого соединения приготовили 6 растворов в среде DMEM в диапазоне концентраций 0,2-60 мкМ. Спустя 4 ч после высеивания клеток, исходный раствор был удален при помощи аспирации, после чего к каждой лунке добавили 50 мкл раствора тестируемого соединения, а также 50 мкл препарата ВГД. Таким образом, финальные концентрации тестируемых соединений были в диапазоне 0,1-30 мкМ. После инкубации в течение 24 ч, вирусная среда была удалена при помощи аспирации, и к культурам были добавлены тестируемые соединения в исходных концентрациях до конечного объема 200 мкл. Клетки и тестируемые соединения инкубировали дополнительно в течение 7 дней при 37°С в увлажненной атмосфере воздуха, содержащей 5% углекислого газа (CO₂). Культуральные супернатанты исследовали на содержание HDAg при помощи коммерческого диагностического набора HDV-Ag Microwell ELISA (Diagnostic Automation Inc.), в соответствии с рекомендациями производителя. Кратко, от 10 до 50 мкл супернатантов вносили в 96-луночные планшеты с адсорбированными антителами к HDAg, добавляли второе анти- HDAg антитело, меченное пероксидазой хрена, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Промывали каждую лунку троекратно раствором PBS, затем обрабатывали 100 мкл/лун раствора OPD (приготовлен растворением 1 таблетки OPD в 12 мл цитрат-фосфатного буфера с добавлением 5 мкл 30% Н₂О₂) в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением к каждой лунке 100 мкл 2N H₂SO₄, после чего измеряли поглощение при длине волны 490 нм. Величину ЕС₅₀, представляющую собой концентрацию тестируемого соединения, при котором репликация вируса понижается вдвое, определяли для каждого тестируемого соединения при помощи программы Xlfit.

Например, активность ингибирования секреции антигена HDAg соединением формулы 1.7 соответствует значению ЕС₅₀=64 нМ, а соединением формулы 1.14 - ЕС₅₀=38 нМ.

Полученные результаты свидетельствуют о наномолярной противовирусной активности ингибиторов входа ВГД соединений (1.1-1.16) общей формулы 1 в отношении ВГД in vitro.

Пример 2. Определение цитотоксичности ингибиторов общей формулы 1.

Для определения цитотоксичности субстанций клетки HepG2/NTCP высевались в черной микроплате с прозрачным дном (96 ячеек, 3,0×10³ клеток на лунку). Для каждого ингибитора использовали три независимых повтора. Тестируемые ингибиторы добавляли через 18 ч, после чего клетки инкубировали с веществами в течение 7 дней. Промывали дважды каждую лунку фосфатно-солевым буфером PBS (0,2 мл/лун) и затем лизировали клетки добавлением клеточного буфера (50 мкл/лун) (все указанные реактивы входят в комплект набора ATPLite, Perkin-Elmer, USA). Микроплату инкубировали в течение 5 минут на вращающейся платформе при 600 об/мин, после чего добавляли в каждую лунку 50 мкл раствора субстрата (часть набора ATPLite). Инкубировали еще 5 минут на вращающейся платформе при 600 об/мин, выдерживали 10 минут в темноте, и затем измеряли люминесценцию на приборе TopCount NXT (Packard, Perkin Elmer). Величину CC₅₀, представляющую из себя концентрацию тестируемого соединения, при котором жизнеспособность клеток понижается вдвое, определяли для каждого тестируемого ингибитора общей формулы 1 при помощи программы Xlfit. Полученные результаты свидетельствуют о низкой цитотоксичности ингибиторов (СС₅₀>30 μМ) общей формулы 1.

Пример 3. Получение лекарственного средства в форме таблеток. Смешивают 1600 мг крахмала, 1600 мг измельченной лактозы, 400 мг талька и 1000 мг ингибитора формулы 1.7 или формулы 1.13 и спрессовывают в брусок. Полученный брусок измельчают в гранулы и просеивают через сита, собирая гранулы размером 14-16 меш. Полученные гранулы таблетируют в подходящую форму таблетки весом 560 мг каждая.

Пример 4. Получение лекарственного средства в форме капсул. Тщательно смешивают ингибитор формулы 1.7 или формулы 1.13 с порошком лактозы в соотношении 2:1. Полученную порошкообразную смесь упаковывают по 600 мг в желатиновые капсулы подходящего размера.

Пример 5. Получение лекарственного средства в форме инъекционных композиций для внутримышечных, внутрибрюшинных или подкожных инъекций. Смешивают 500 мг ингибитора формулы 1.7 или формулы 1.13 с 300 мг хлорбутанола, 2 мл пропиленгликоля и 100 мл инъекционной воды. Полученный раствор фильтруют и помещают по 1 мл в ампулы, которые запаивают.

Реферат

Данное изобретение относится к применению 1,1-диоксо-1,4-дигидро-2Н-бензо[1,2,4]тиадиазин-3-она общей формулы 1 в качестве ингибиторов входа вируса гепатита дельта (ВГД). Ингибиторы блокируют NTCP рецептор гепатоцита, активность которого способствует развитию гепатита дельта. В общей формуле 1Аrи Аrпредставляют собой необязательно одинаковые фенилы, необязательно замещенные одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из С-Салкила, метоксила, галогена и карбонитрила. Изобретение также относится к новому соединению 1.7, выбранному из группы соединений общей формулы 1, которое дополнительно обладает свойствами ингибитора вируса гепатита В (ВГВ). 7 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 пр.

Формула