Ингибитор вируса гепатита в (вгв) - RU2726456C1

Описание

Настоящее изобретение относится к новым ингибиторам вируса гепатита В (ВГВ, HBV) в качестве химиотерапевтических средств для лечения ВГВ.

Гепатит В - это инфекционное воспалительное заболевание печени, возникающее вследствие внедрения в организм вируса из семейства гепаднавирусов (ДНК-содержащие вирусы, репликация которых очуществляется через стадию РНК). Вирус гепатита В (ВГВ) обладает устойчивостью к физическим и химическим влияниям, (например, не погибает в замороженном состоянии около 20 лет, в холодильнике - 6 лет, а при комнатной температуре - около 3 месяцев). Он уничтожается при кипячении длительностью 30 минут, а при автоклавировании - через 5 минут [http://medbe.ru].

ВГВ вызывает как острые, так и хронические заболевания и подвергает людей высокому риску смерти от цирроза и рака печени. Острый гепатит В характеризуется неблагоприятным клиническим течением - в условиях стандартной терапии 1% случаев заканчивается летально, в 10% случаев заболевание переходит в хроническую форму. Развившийся хронический гепатит приводит, в свою очередь, к циррозу и первичному раку печени.

Россия относится к странам со средней степенью распространенности ВГВ. В 2016 году смертность от вирусных гепатитов составила около 1,4 млн человек [http://www.vector.nsc.ru/virusnyie-gepatity/]. Следует отметить, что 98% смертей обусловлены развитием конечных стадий хронических гепатитов В (ХГВ) и С (ХГС). Лечение острого и хронического гепатита В является одной из основных проблем здравоохранения.

Против вирусного гепатита В была разработана и с 1982 года стала доступна вакцина. Она представляет собой вирусную частицу и безопасна для организма. При ее введении в организме образуются специфичные антитела к вирусу гепатита В.

Вакцина эффективно предотвращает инфекцию и ее хронические последствия на 95%. Однако предотвращение инфекции не снимает вопрос необходимости лечения как минимум 3 млн. больных хроническим гепатитом В в России и еще порядка 240-350 млн. в мире. Таким образом, хронический гепатит В продолжает оставаться глобальной проблемой.

В настоящее время существует только 2 варианта лечения ХГВ: иммуномодуляторами (препараты интерферона интерферон альфа-2а, пэгилированный интерферон альфа-2а) или аналогами нуклеотидов или нуклеозидов (АН). Оба метода имеют свои преимущества и недостатки. К преимуществам терапии интерфероном можно отнести отсутствие генотипической резистентности вируса, а к недостаткам широкий спектр противопоказаний (например, декомпенсированный цирроз печени), широкий спектр побочных эффектов, включая слабость, гриппоподобные симптомы, депрессию, подавление функций костного мозга, обострение аутоиммунных заболеваний, а также неудобство использования (часто препарат вводится подкожно) [https://ru.wikipedia.org/]. У большинства людей терапия интерфероном не излечивает инфекцию ВГВ, а только подавляет репликацию вируса. Поэтому лечение ВГВ должно продолжаться в течение всей жизни [http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/].

Терапия аналогами нуклеотидов или нуклеозидов демонстрирует выраженное противовирусное действие, имеет удобный режим дозирования (перорально), сравнительно редкие побочные реакции. В настоящее время одобрено 5 препаратов-аналогов нуклеотидов или нуклеозидов для лечения ХГВ: ламивудин (аналог цитидина), энтекавир (нуклеозидный аналог гуанозина), телбивудин (нуклеозидный аналог тимидина), тенофовир (нуклеотидный аналог аденина), адефовир (нуклеозидный аналог аденина) [http://infectious.ru/docs/rekomendacii_gepatit_b.pdf]. Механизм действия указанных препаратов связан с ингибированием реакций обратной транскрипции РНК вируса гепатита В в одноцепочечную ДНК. Аналоги нуклеотидов или нуклеозидов хорошо переносятся пациентами, не вызывая значительных побочных эффектов. Однако, в некоторых случаях наблюдается лактатный ацидоз и нефротоксичность. Нуклеозиды ламивудин, телбивудин и нуклеотид адефовир морально устарели и не рекомендуются ввиду низкого порога резистентности и возможности формирования перекрестной резистентности вируса к энтекавиру и препаратам тенофовира соответственно. Прием энтекавира противопоказан при беременности; а тенофовир обладает нефротоксичностью [http://kna-s31.edu.27.ru/files/documents/898_gepatit_v.docx].

Основной проблемой терапии ХГВ с помощью АН является возникающая устойчивость ВГВ к препаратам. В гене обратной транскриптазы вируса происходят мутации, которые предотвращают связывание препаратов с ферментом в активном сайте. При отмене терапии наблюдается быстрый рецидив заболевания, что не позволяет спрогнозировать сроки лечения.

Для решения проблемы мировой эпидемии ХГВ необходим постоянный поиск новых препаратов для лечения гепатита В, способных воздействовать на жизненный цикл вируса в организме, которые могут быть использованы в комбинации с иммуномодулирующими агентами, что, в конечном итоге, должно привести к полной элиминации вируса из организма, недостижимой в настоящий момент.

Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании этого изобретения.

Термин «алкил», используемый здесь, относится к насыщенным с линейной или разветвленной цепью углеводородным радикалам, содержащим от одного до шести атомов углерода. Примеры алкильных радикалов C₁-С₆, включают, но не ограничиваются ими, метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил и трет-бутил.

«Арил» означает ароматическую моноциклическую или полициклическую систему, включающую от 6 до 14 атомов углерода, преимущественно от 6 до 10 атомов углерода. Арил может содержать один или более «заместителей циклической системы», которые могут быть одинаковыми или разными.

«Галоген» означает фтор, хлор, бром и йод. Предпочтительными являются фтор, хлор и бром.

«Алкокси группа» означает группу -O-R, например, -О-СН₃.

«Карбоксил» означает группу -СО₂Н или -CO₂R.

«Карбамоил» означает rpynny-CONR.

«N-карбоксамид» означает группу -NCOR.

«N-сульфамид» означает группу -NSO₂R.

«Оксикарбонил» означает группу -OCOR.

Термин «необязательно замещенный» означает, что упомянутая группа может быть замещена в одном или более положениях любым одним или любой комбинацией радикалов.

Термин «кристаллическая форма» означает структуру вещества, характеризующуюся упаковкой образующих ее молекул в один из видов кристаллической решетки.

Термин «поликристаллическая форма» означает структуру вещества, имеющую поликристаллическое строение, т.е. состоящую из множества мелких монокристаллов, т.е. кристаллитов определенной кристаллической формы.

Термин «активный компонент» (лекарственное вещество) относится к физиологически активному веществу синтетического или иного (биотехнологического, растительного, животного, бактериального и так далее) происхождения, обладающему фармакологической активностью, которое является активным ингредиентом фармацевтической композиции.

«Лекарственное начало» (лекарственная субстанция лекарственное вещество, drug-substance) означает физиологически активное вещество синтетического или иного (биотехнологического, растительного, животного, микробного и прочего) происхождения, обладающее фармакологической активностью и являющееся активным началом фармацевтической композиции, используемой для производства и изготовления лекарственного препарата (средства).

«Лекарственное средство (препарат)» означает вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции), в виде таблеток капсул инъекций, мазей и др. готовых форм предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего.

«Фармацевтическая композиция» означает композицию, включающую в себя соединение формулы 1 и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как, парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, алгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения, в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения.

«Фармацевтически приемлемая соль» означает относительно нетоксичные органические и неорганические соли кислот и оснований, заявленных в настоящем изобретении. Эти соли могут быть получены in situ в процессе синтеза, выделения или очистки соединений или приготовлены специально. В частности, соли оснований могут быть получены специально, исходя из очищенного свободного основания заявленного соединения и подходящей органической или неорганической кислоты. Примерами полученных таким образом солей являются гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валериаты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, тозилаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, мезилаты, малонаты, салицилаты, пропионаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, сульфаматы и им подобные [Berge S.M. et al., "Pharmaceutical Salts" J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19). Соли заявленных кислот также могут быть специально получены реакцией очищенной кислоты с подходящим основанием, соли натрия, калия, кальция, бария, цинка, магния, лития и алюминия, наиболее желательными из которых являются соли натрия и калия. Подходящими неорганическими основаниями, из которых могут быть получены соли металлов, являются гидроксид, карбонат, бикарбонат и гидрид натрия, гидроксид и бикарбонат калия, поташ, гидроксид лития, гидроксид кальция, гидроксид магния, гидроксид цинка. В качестве органических оснований, из которых могут быть получены соли заявленных кислот, выбраны амины и аминокислоты, обладающие достаточной основностью, чтобы образовать устойчивую соль, и пригодные для использования в медицинских целях. К таким аминам относятся аммиак, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, бензиламин, дибензиламин, дициклогексиламин, пиперазин, этилпиперидин, трис(гидроксиметил)-аминометан и подобные им. Кроме того, для солеобразования могут быть использованы гидроокиси тетраалкиламмония, например, такие как, холин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний и им подобные. В качестве аминокислот могут быть использованы основные аминокислоты - лизин, орнитин и аргинин.

«Фармацевтически приемлемые эксципиенты» означает применяемые в сфере фармацевтики разбавители, вспомогательные агенты и/или фармацевтические носители. «Фармацевтические носители» означает носители, которые применяются в сфере фармацевтики для получения распространенных форм, в том числе: в пероральных формах используются связующие вещества, смазывающие агенты, дезинтеграторы, растворители, разбавители, стабилизаторы, суспендирующие агенты, бесцветные агенты, корригенты вкуса; в формах для инъекций используются антисептические агенты, солюбилизаторы, стабилизаторы; в местных формах используются основы, разбавители, смазывающие агенты, антисептические агенты.

Предметом данного изобретения являются новые ингибиторы вируса гепатита В (ВГВ, HBV) в качестве химиотерапевтических средств для лечения ВГВ, представляющие собой производные 4H-3,1-бензоксазин-4-она общей формулы 1

где R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉ представляют собой необязательно одинаковые: водород, алкил, арил, галоген, гидроксил, алкокси, оксикарбонил, амин или замещенный амин, N-карбоксамид, N-сульфамид, карбоксил или карбамоил.

Согласно данному изобретению предпочтительными ингибиторами ВГВ общей формулы 1 являются соединения формул 1.1-1.13:

6-бром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4Н-3,1-бензоксазин-4-она 1.1;

6-бром-2-(2-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.2;

6-бром-2-(4-метоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.3;

6-бром-2-(4-пропоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.4;

2-(4-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.5;

2-(3-пропоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.6;

4-(4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил пропионата 1.7;

2-(3-бромфенил)-6,7-диметокси-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.8;

6,7-диметокси-2-(4-этоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.9;

4-(6-ацетокси-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил ацетата 1.10;

3-(6-ацетокси-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил ацетата 1.11;

2-(2-метилфенил)-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-6-ил ацетата 1.12;

8-метил-2-(2-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.13.

Более предпочтительным ингибитором ВГВ общей формулы 1 является 6-бром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4H-3,1-бензоксазин-4-он 1.1, выбранный из ряда соединений 1.1-1.13 и их гидратов и/или сольватов:

Патентуемые ингибиторы представляют собой соединения, не являющиеся новыми, поскольку их структурные формулы известны из коммерчески доступных баз данных и литературы [Hadfield, J.A. et al. Anti-Cancer Drugs, 1994, 5, 533-8; Fenton, G. et al. J. Med. Chem., 1989, 32, 265-272]. Также 4H-3,1-бензоксазин-4-оны 1 хорошо известны в качестве ингибиторов сериновых протеаз [US 4665070, Syntex Inc. (СА), 12.05.1987], ингибиторов тканевого фактора VII [US 6180625, Novo Nordisk A/S (DK), 30.06.2001], гиперлипидемических средств [JP 1994009670, Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. (JP), 18.01.1994], антифиброзных агентов [US 9062076, Fibrotech Therapeuticus PTY LTD (AU), 23.06.2015 & WO 2011047432, 28.04.2011]; антипаркинсонических и противоинфекционных препаратов [JP 2007153860, Shipro Kasei Kaisha Ltd. (JP), 21.06.2007]; противовирусных агентов [JP 1999322611, Daiichi Sankyo Co., Ltd. (JP), 24.11.1999; Hsieh, P.-W. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14(18), 4751-754]. Однако в научной и патентной литературе отсутствуют данные об их биологической активности в отношении ВГВ инфекции. Отсутствуют источники, в которых соединения общей формулы 1 были бы описаны в качестве лекарственного средства для лечения вирусного гепатита. Авторы выявили и патентуют их новое свойство, а именно, способность ингибировать развитие вируса гепатита В (ВГВ, HBV), что является техническим решением в качестве предмета «применение продукта или способа по определенному (новому) назначению», а именно, в качестве лекарственного средства для лечения вирусного гепатита В, и таким образом 4H-3,1-бензоксазин-4-оны общей формулы 1 обладают новизной и изобретательским уровнем.

Способ получения 4H-3,1-бензоксазин-4-онов 1.1-1.13 представлен на схеме 1. Он заключается в обработке замещенной бензойной кислоты 2 SOCl₂, что дает хлорангидрид замещенной бензойной кислоты 3. Последующая реакция хлорангидридов бензойной кислоты 3 с 2-аминобензойными кислотами 4 приводит к 4H-3,1-бензоксазин-4-онам 1 [Fenton, G. et al. J. Med. Chem., 1989, 32, 265-272].

Схема 1. Получение 4H-3,1-бензоксазин-4-онов 1

Согласно данному изобретению новый ингибитор ВГВ общей формулы 1, его гидрат и/или сольват представляет собой лекарственное начало для приготовления фармацевтической композиции и готовой лекарственной формы для профилактики и лечения инфекции ВГВ у теплокровных животных и людей.

Предметом данного изобретения является активный компонент, обладающий свойством ингибитора ВГВ, представляющий собой производные 4H-3,1-бензоксазин-4-она общей формулы 1.

Предпочтительно активный компонент представляет собой, 6-бром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4H-3,1-бензоксазин-4-он формулы 1.1.

Предметом данного изобретения является также фармацевтическая композиция в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, для лечения инфекции ВГВ у людей и теплокровных животных, включающая в свой состав ингибитор ВГВ общей формулы 1, его гидрат и/или сольват в терапевтически эффективном количестве и необязательно, фармацевтически приемлемые эксципиенты. Фармацевтическая композиция наряду с ингибитором общей формулы 1 или его гидратом и/или сольватом по настоящему изобретению может включать и другие активные субстанции, при условии, что они не вызывают нежелательных эффектов. При необходимости использования фармацевтической композиции по настоящему изобретению в клинической практике она может смешиваться с традиционными фармацевтическими носителями.

Предпочтительно предметом данного изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая 6-бром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4H-3,1-бензоксазин-4-он формулы 1.1 в терапевтически эффективном количестве.

Предпочтительно предметом данного изобретения является фармацевтическая композиция, которой соединение общей формулы 1 содержится в количестве от 1 до 1000 мг.

Более предпочтительным предметом данного изобретения является фармацевтическая композиция, которой соединение 6-бром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4H-3,1-бензоксазин-4-он формулы 1.1 содержится в количестве от 1 до 1000 мг.

Предметом данного изобретения является способ получения фармацевтической композиции смешением с инертным наполнителем и/или растворителем, по крайней мере, одного ингибитора ВГВ общей формулы 1 или его гидрата и/или сольвата в терапевтически эффективном количестве.

Предметом данного изобретения являются также терапевтические коктейли для лечения инфекции ВГВ, включающие в качестве одного из компонентов новое лекарственное средство общей формулы 1, его гидрат и/или сольват или новую фармацевтическую композицию, содержащие в качестве активного компонента по крайней мере один ингибитор ВГВ общей формулы 1 или его гидрат и/или сольват. Терапевтический коктейль для лечения инфекции ВГВ, наряду с фармацевтической композицией по данному изобретению, может включать другие известные препараты, предназначенные для лечения ВГВ, ВГС, ВИЧ или препараты, усиливающие иммунную систему пациента.

В соответствии с данным изобретением способ профилактики и лечения инфекции ВГВ у животных и людей заключается во введении пациенту новой фармацевтической композиции по данному изобретению или нового терапевтического коктейля по данному изобретению.

Лекарственные средства могут вводиться через ингалятор, перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или местно).

Клиническая дозировка средства общей формулы 1 или его гидрата и/или сольвата у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективности и биодоступности активных ингредиентов в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента, при этом суточная доза у взрослых обычно составляет 10~800 мг. Поэтому во время приготовления из фармацевтической композиции ингибитора по настоящему изобретению в виде единиц дозировки необходимо учитывать вышеназванную эффективную дозировку, при этом каждая единица дозировки препарата должна содержать 10~800 мг ингибитора общей формулы 1 или его гидрат и/или сольват. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени.

Настоящее изобретение далее будет описано в связи с определенными вариантами осуществления, которые не предназначены для ограничения его объема. Напротив, настоящее изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем формулы изобретения. Таким образом, следующие примеры, которые включают в себя конкретные варианты, иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение.

Пример 1. Синтез 4-трет-бутилбензоил хлорида 3.1.

К суспензии 4-трет-бутилбензойной кислоты 2.1 (0,178 г, 1 ммоль) в сухом толуоле (5 мл) добавляли SOCl₂ (0,14 мл, 2 ммоль). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником 16 ч, после чего растворитель отгоняли в вакууме. К остатку добавляли еще сухой толуол (5 мл), затем упаривали на роторном испарителе досуха. Получали 0,196 г (100%) 4-трет-бутилбензоил хлорида 3.1.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,07 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,50 (д, J=8,0 Гц, 2Н).

Пример 2. Синтез 6-бром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.1.

Раствор 4-трет-бутилбензоил хлорида 3.1 (0,196 г, 1 ммоль) в сухом пиридине (5 мл) добавляли к раствору 2-амино-5-бромбензойной кислоты 4.1 (0,216 г, 1 ммоль) в сухом пиридине (5 мл) при 10°С при интенсивном перемешивании. Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем разбавляли водой (30 мл). Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали водой (5 мл), сушили и перекристаллизовывали из EtOH (5 мл). Получали 0,180 г (50%) 6-6ром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.1.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,23 (с, 1Н), 8,13 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 8,07 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,65 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,60 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 1,36 (с, 9Н).

Пример 3. Синтез 2-хлорбензоил хлорида 3.2.

Аналогично примеру 1 из 2-хлорбензойной кислоты 2.2 (0,157 г, 1 ммоль) получали 0,175 г (100%) 2-хлорбензоил хлорида 3.2.

Пример 4. Синтез 6-бром-2-(2-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.2.

Аналогично примеру 2 из 2-хлорбензоил хлорида 3.2 (0,175 г, 1 ммоль) и 2-амино-5-бромбензойной кислоты 4.1 (0,216 г, 1 ммоль) получали 0,172 г (51%) 6-бром-2-(2-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.2.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,28 (с, 1Н), 7,99 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,94 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,62 (д, J-8,0 Гц, 1Н), 7,55-7,50 (м, 2Н), 7,44 (т, J=8,0 Гц, 1Н).

Пример 5. Синтез 4-метоксибензоил хлорида 3.3.

Аналогично примеру 1 из 4-метоксибензойной кислоты 2.3 (0,152 г, 1 ммоль) получали 0,171 г (100%) 4-метоксибензоил хлорида 3.3.

Пример 6. Синтез 6-бром-2-(4-метоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.3.

Аналогично примеру 2 из 4-метоксибензоил хлорида 3.3 (0,171 г, 1 ммоль) и 2-амино-5-бромбензойной кислоты 4.1 (0,216 г, 1 ммоль) получали 0,172 г (51%) 6-бром-2-(4-метоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.3.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,23 (с, 1H), 8,18 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,92 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,54 (д, J-8,0 Гц, 1Н), 7,02 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 3,88 (с, 3Н).

Пример 7. Синтез 4-пропоксибензоил хлорида 3.4.

Аналогично примеру 1 из 4-пропоксибензойной кислоты 2.4 (0,180 г, 1 ммоль) получали 0,199 г (100%) 4-пропоксибензоил хлорида 3.4.

Пример 8. Синтез 6-бром-2-(4-пропоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.4.

Аналогично примеру 2 из 4-пропоксибензоил хлорида 3.4 (0,199 г, 1 ммоль) и 2-амино-5-бромбензойной кислоты 4.1 (0,216 г, 1 ммоль) получали 0,177 г (49%) 6-бром-2-(4-пропоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.3.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,22 (с, 1H), 8,18 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,92 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,53 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,00 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 3,99 (т, J=7,2 Гц, 2Н), 1,82 (ск, J=7,2 Гц, 2Н), 1,06 (т, J=7,2 Гц, 3Н).

Пример 9. Синтез 4-хлорбензоил хлорида 3.5.

Аналогично примеру 1 из 4-хлорбензойной кислоты 2.5 (0,157 г, 1 ммоль) получали 0,175 г (100%) 4-хлорбензоил хлорида 3.5.

Пример 10. Синтез 2-(4-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.5.

Аналогично примеру 2 из 4-хлорбензоил хлорида 3.5 (0,175 г, 1 ммоль) и 2-аминобензойной кислоты 4.2 (0,137 г, 1 ммоль) получали 0,131 г (51%) 2-(4-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.5.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,27 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 8,16 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,96 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,72 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,63 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,45 (д, J=8,0 Гц, 2Н).

Пример 11. Синтез 3-пропоксибензоил хлорида 3.6.

Аналогично примеру 1 из 3-пропоксибензойной кислоты 2.6 (0,180 г, 1 ммоль) получали 0,197 г (99%) 3-пропоксибензоил хлорида 3.6.

Пример 12. Синтез 2-(3-пропоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.6.

Аналогично примеру 2 из 3-пропоксибензоил хлорида 3.6 (0,197 г, 1 ммоль) и 2-аминобензойной кислоты 4.2 (0,137 г, 1 ммоль) получали 0,124 г (44%) 2-(3-пропоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.6.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,16 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,95 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,79 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,72 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,68 (с, 1Н), 7,63 (т, J=8,0 Гц, 1H), 7,48 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,20 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 4,04 (т, J=7,2 Гц, 2Н), 1,82 (ск, J=7,2 Гц, 2Н), 1,06 (т, J=7,2 Гц, 3Н).

Пример 13. Синтез 4-пропионилоксибензоил хлорида 3.7.

Аналогично примеру 1 из 4-пропионилоксибензойной кислоты 2.7 (0,194 г, 1 ммоль) получали 0,206 г (97%) 4-пропионилоксибензоил хлорида 3.7.

Пример 14. Синтез 4-(4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил пропионата 1.7.

Аналогично примеру 2 из 4-пропионилоксибензоил хлорида 3.7 (0,206 г, 1 ммоль) и 2-аминобензойной кислоты 4.2 (0,137 г, 1 ммоль) получали 0,097 г (33%) 4-(4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил пропионата 1.7.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,24 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 8,16 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,96 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,72 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,63 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,37 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 2,66 (кв, J=7,2 Гц, 2Н), 1,16 (т, J=7,2 Гц, 3Н).

Пример 15. Синтез 3-бромбензоил хлорида 3.8.

Аналогично примеру 1 из 3-бромбензойной кислоты 2.8 (0,201 г, 1 ммоль) получали 0,220 г (100%) 3-бромбензоил хлорида 3.8.

Пример 16. Синтез 2-(3-бромфенил)-6,7-диметокси-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.8.

Аналогично примеру 2 из 3-бромбензоил хлорида 3.8 (0,220 г, 1 ммоль) и 2-амино-4,5-диметоксибензойной кислоты 4.3 (0,197 г, 1 ммоль) получали 0,188 г (52%) 2-(3-бромфенил)-6,7-диметокси-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.8.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,31 (с, 1Н), 8,14 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,75 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,52 (т, J=8,0 Гц, 1H), 7,43 (с, 1Н), 7,16 (с, 1Н), 3,98 (с, 3Н), 3,92 (с, 3Н).

Пример 17. Синтез 4-этоксибензоил хлорида 3.9.

Аналогично примеру 1 из 4-этоксибензойной кислоты 2.9 (0,166 г, 1 ммоль) получали 0,185 г (100%) 4-этоксибензоил хлорида 3.9.

Пример 18. Синтез 6,7-диметокси-2-(4-этоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.9. Аналогично примеру 2 из 4-этоксибензоил хлорида 3.9 (0,185 г, 1 ммоль) и 2-амино-4,5-диметоксибензойной кислоты 4.3 (0,197 г, 1 ммоль) получали 0,157 г (48%) 6,7-диметокси-2-(4-этоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.9.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,15 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,39 (с, 1H), 7,02 (с, 1H), 6,95 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 4,10 (кв, J=7,2 Гц, 2Н), 3,98 (с, 3Н), 3,92 (с, 3Н), 1,44 (т, J=7,2 Гц, 3Н).

Пример 19. Синтез 4-ацетоксибензоил хлорида 3.10.

Аналогично примеру 1 из 4-ацетоксибензойной кислоты 2.10 (0,180 г, 1 ммоль) получали 0,195 г (98%) 4-ацетоксибензоил хлорида 3.10.

Пример 20. Синтез 4-(6-ацетокси-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил ацетата 1.10.

Аналогично примеру 2 из 4-ацетоксибензоил хлорида 3.10 (0,195 г, 1 ммоль) и 2-амино-5-ацетоксибензойной кислоты 4.4 (0,195 г, 1 ммоль) получали 0,136 г (40%) 4-(6-ацетокси-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил ацетата 1.10.¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,25 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,91 (с, 1Н), 7,76 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,70 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,36 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 2.37 (с, 3Н), 2.32 (с, 3Н).

Пример 21. Синтез 3-ацетоксибензоил хлорида 3.11.

Аналогично примеру 1 из 3-ацетоксибензойной кислоты 2.11 (0,180 г, 1 ммоль) получали 0,194 г (98%) 3-ацетоксибензоил хлорида 3.11.

Пример 22. Синтез 3-(6-ацетокси-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил ацетата 1.11.

Аналогично примеру 2 из 3-ацетоксибензоил хлорида 3.11 (0,194 г, 1 ммоль) и 2-амино-5-ацетоксибензойной кислоты 4.4 (0,195 г, 1 ммоль) получали 0,119 г (35%) 3-(6-ацетокси-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил ацетата 1.11.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,10 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,94 (с, 1Н), 7,91 (с, 1Н), 7,76 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,70 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,62 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,40 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 2.37 (с, 3Н), 2.32 (с, 3Н).

Пример 23. Синтез 2-метилбензоил хлорида 3.12.

Аналогично примеру 1 из 2-метилбензойной кислоты 2.12 (0,136 г, 1 ммоль) получали 0,153 г (99%) 2-метилбензоил хлорида 3.12.

Пример 24. Синтез 2-(2-метилфенил)-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-6-ил ацетата 1.12.

Аналогично примеру 2 из 2-метилбензоил хлорида 3.12 (0,153 г, 1 ммоль) и 2-амино-5-ацетоксибензойной кислоты 4.4 (0,195 г, 1 ммоль) получали 0,115 г (39%) 2-(2-метилфенил)-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-6-ил ацетата 1.12.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 7,97 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,87 (с, 1H), 7,68 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,59 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,41 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,34-7,28 (м, 2Н), 2.70 (с, 3Н), 2.30 (с, 3Н).

Пример 25. Синтез 8-метил-2-(2-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.13.

Аналогично примеру 2 из 2-хлорбензоил хлорида 3.2 (0,175 г, 1 ммоль) и 2-амино-3-метилбензойной кислоты 4.5 (0,151 г, 1 ммоль) получали 0,117 г (43%) 8-метил-2-(2-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.13.¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,02-7,95 (м, 2Н), 7,78 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,55-7,50 (м, 3Н), 7,44 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 2.65 (с, 3Н).

Пример 26. Исследование подавления развития ВГВ в культуре гепатомы человека HepG2 и цитотоксического эффекта ингибиторов ВГВ общей формулы 1.

В экспериментальной in vitro модели инфекции вируса гепатита В использовалась линия гепатомы человека HepG2, которая для способности к инфицированию ВГВ и поддержанию полного цикла его репликации in vitro стабильно трансфицировала геном NTCP.

В качестве источника инфекционных вирусных частиц для инфицирования клеточной линии HepG2/NTCP была выбрана клеточная линия гепатомы человека HepAD38, несущая стабильно интегрированный геном вируса ВГВ под контролем тетрациклин-регулируемого промотора, и секретирующая вирусные частицы в культуральную среду в отсутствие терациклина.

Препарат ВГВ получали с использованием линии HepAD38 по следующему протоколу: Клетки HepAD38 пассировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, пенициллин/стрептомицин и заменимые аминокислоты. Культуральную среду отбирали раз в 2 дня, осветляли центрифугированием (200 g, 15 мин) и хранили при 4°С не дольше 7 дней. Далее к культуральным средам добавляли сухой ПЭГ 8000 до конечной концентрации 7,5%, и инкубировали при 4°С на ротационной платформе в течение ночи. Вирусный преципитат отделяли центрифугированием (2000 g, 30 мин) и осадок суспендировали в 1/100 первоначального объема в среде OPTI-MEM. Полученный таким образом вирусный препарат аликвотировали и хранили при -80°С

Инфицирование проводили следующим образом: Клеточную суспензию HepG2-NTCP распределяли по 96-луночным планшетам по 2000 клеток на каждую лунку. После прикрепления клеток (в тот же или на следующий день) исходный раствор удаляли аспирацией и к каждой лунке добавляли по 50 мкл раствора тестируемых соединений, растворенных в среде OPTI-MEM (с финальной концентрацией ДМСО 2%), или OPTI-MEM с 2% ДМСО (в лунки положительного и отрицательного контролей инфекции) и по 50 мкл мкл препарата ВГВ, разведенного в среде OPTI-MEM с 2% ДМСО (кроме отрицательного контроля инфекции). После инкубации в течение 24 часов в увлажненной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа СО₂, среду с ВГВ удаляли аспирацией и к культурам добавляли 200 мкл культуральной среды ДМЕМ, содержащей соответствующие тестируемые соединения в интересующей концентрации. Клетки инкубировали дополнительно в течение 6 дней при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа СО₂. Далее, клеточные супернатанты (50 мкл) исследовали на содержание вирусного антигена ИФА анализом при помощи коммерческого набора HBeAg ELISA 4.0 (Creative Diagnostics, каталожный номер DEIA003) по протоколу производителя набора и измеряли оптическую плотность каждой анализируемой лунки при длине волны 450 нм, используя планшетный денситометр.

Реферат

Изобретение относится к области органической химии, а именно к применению производного 4Н-3,1-бензоксазин-4-она общей формулы 1где R, R, R, R, R, R, R, R, Rнеобязательно одинаковые и представляют собой водород, С-Салкил, галоген, C-Салкокси, оксикарбонил формулы -OC(O)R, где R означает C-Салкил, в качестве ингибитора вируса гепатита В для получения лекарственного средства для лечения гепатита В. Также предложена фармацевтическая композиция, включающая соединение общей формулы 1. Технический результат: предложено применение производного 4Н-3,1-бензоксазин-4-она в качестве ингибитора вируса гепатита В. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 табл., 26 пр.

Формула