Молекулы нуклеиновых кислот для уменьшения уровня мрнк papd5 или papd7 для лечения инфекционного гепатита в - RU2768699C2

Чертежи

Показать все 10 чертежа(ей)

Описание

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, которое предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию вирусом гепатита В (HBV), где соединение, которое уменьшает экспрессию и/или активность РАР-ассоциированного доменсодержащего 5 (PAPD5) или РАР-ассоциированного доменсодержащего 7 (PAPD7), идентифицируется как соединение, которое предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV. Согласно данному изобретению также предложены ингибиторы PAPD5 или PAPD7 для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV. В частности, согласно настоящему изобретению идентифицированы молекулы нуклеиновых кислот, такие как антисмысловые олигонуклеотиды или агенты на основе РНКи (молекула РНК-интерференции), в качестве ингибиторов PAPD5 или PAPD7, а также их комбинированный препарат, содержащий ингибитор PAPD5 и ингибитор PAPD7, для одновременного или последовательного применения в лечении или предупреждении инфекции HBV. Также настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV, и способ отслеживания терапевтического успеха во время лечения инфекции HBV.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Вирус гепатита В (HBV) представляет собой оболочечный, частично двухцепочечный ДНК-вирус. Компактный геном HBV из 3,2 т.п.н. состоит из четырех перекрывающихся открытых рамок считывания (ORF), которые кодируют коровые, полимеразные (Pol), оболочечные и Х-белки. ORF Pol является самой длинной, a ORF оболочки располагается внутри нее, тогда как ORF X и кора перекрываются с ORF Pol. Жизненный цикл HBV имеет два главных события: 1) образование замкнутой кольцевой ДНК (зкДНК) из релаксированной кольцевой (РК ДНК) и 2) обратная транскрипция предгеномной РНК (пгРНК) с образованием РК ДНК. До инфекции клеток-хозяев геном HBV существует в пределах вириона в виде РК ДНК. Определили то, что вирионы HBV способны получать доступ в клетки-хозяева посредством неспецифичного связывания с отрицательно заряженными протеогликанами, присутствущими на поверхности человеческих гепатоцитов (Schulze, Hepatology, 46, (2007), 1759-68), и посредством специфичного связывания антигенов поверхности HBV (HBsAg) с гепатоцитарным рецептором на основе натрий-таурохолатного котранспортирующего полипептида (NTCP) (Yan, J Virol, 87, (2013), 7977-91). Для контроля вирусной инфекции необходимо точное наблюдение за врожденной иммунной системой хозяина, которая могла бы отвечать в пределах минут-часов после инфекции для влияния на исходный рост вируса и ограничения хронической и стойкой инфекции. Несмотря на доступные в настоящее время лечения на основе IFN (интерферон) и нуклеоз(т)идных аналогов, инфекция HBV остается важной проблемой для здоровья во всем мире, которая оценочно касается 350 миллионов хронических носителей, которые имеют высокий риск цирроза печени и печеночно-клеточной карциномы.

Секреция противовирусных цитокинов в ответ на инфекцию HBV гепатоцитами и/или внутрипеченочными иммунными клетками играет центральную роль в клиренсе вируса инфицированной печенью. Однако хронически инфицированные пациенты демонстрируют только слабый иммунный ответ из-за разных стратегий избегания, принятых вирусом для противодействия системам распознавания клетки-хозяина и последующим противовирусным ответам.

Многие наблюдения показали то, что несколько вирусных белков HBV могли противодействовать исходному клеточному ответу хозяина, препятствуя системе сигнализации распознавания вируса и затем противовирусной активности интерферона (IFN). Полагают то, что среди них избыточная секреция пустых субвирусных частиц HBV (SVP, HBsAg) участвует в поддержании иммунотолерантного состояния, наблюдаемого у хронически инфицированных пациентов (СНВ). Стойкое воздействие HBsAg и других вирусных антигенов может приводить к HBV-специфичному устранению Т-клеток или к прогрессирующему функциональному ухудшению (Kondo, Journal of Immunology (1993), 150, 4659-4671; Kondo, Journal of Medical Virology (2004), 74, 425-433; Fisicaro, Gastroenterology, (2010), 138, 682-93). Кроме того, сообщали о том, что HBsAg подавляет функцию иммунных клеток, таких как моноциты, дендритные клетки (DC) и клетки-природные киллеры (NK) посредством прямого взаимодействия (Op den Brouw, Immunology, (2009b), 126, 280-9; Woltman, PLoS One, (2011), 6, e15324; Shi, J Viral Hepat. (2012), 19, e26-33; Kondo, ISRN Gasteroenterology, (2013), Article ID 935295).

Количественное измерение HBsAg является значимым биомаркером для прогнозирования и ответа на лечение при хроническом гепатите В. Однако достижение потери HBsAg и сероковерсии редко наблюдается у хронически инфицированных пациентов, но является одной из конечных целей терапии. Современной терапией, такой как нуклеоз(т)идные аналоги, являются молекулы, которые ингибируют синтез ДНК HBV, но не направлены на уменьшение уровня HBsAg. Нуклеоз(т)идные аналоги, даже при длительной терапии, демонстрируют лишь слабый клиренс HBsAg, сравнимый с клиренсом, наблюдаемым в природе (от 1% до 2%) (Janssen, Lancet, (2005), 365, 123-9; Marcellin, N. Engl. J. Med., (2004), 351, 1206-17; Buster, Hepatology, (2007), 46, 388-94).

е-Антиген вируса гепатита В (также именуемый антиген оболочки HBV или HBeAg) представляет собой вирусный белок, который секретируется клетками, инфицированными гепатитом В. HBeAg ассоциирован с хроническими инфекциями гепатитом В и используется в качестве маркера активного вирусного заболевания и степени зараженности пациента.

Функция пред кора вируса гепатита В или HBeAg не полностью известна. Однако хорошо известно то, что HBeAg играет ключевую роль в стойкости вируса. Полагают то, что HBeAg стимулирует хроничность HBV посредством функционирования в качестве иммунорегулирующего белка. В частности, HBeAg представляет собой секретируемый вспомогательный белок, который, по-видимому, ослабляет иммунный ответ хозяина на внутриклеточный белок нуклеокапсида (Walsh, Virology, 2011, 411 (1): 132-141). HBeAg действует в качестве иммунотолеогена, способствующего стойкости HBV, и возможно функционирует во время внутриутробного развития, принимая во внимание то, что растворимый HBeAg проходит через плаценту (Walsh, Virology, 2011, 411 (1): 132-141). Кроме того, HBeAg осуществляет понижающую регуляцию: i) клеточных генов, контролирующих внутриклеточную сигнализацию; и ii) Toll-подобного рецептора 2 (TLR-2) для глушения врожденного иммунного ответа на вирусную инфекцию (Walsh, Virology, 2011, 411 (1): 132-141). В отсутствие HBeAg репликация HBV ассоциирована с повышающей регуляцией пути TLR2 (Walsh, Virology, 2011, 411(1): 132-141). Соответственно, HBeAg имеет значительную роль в модулировании взаимодействий вирус/хозяин для влияния на иммунный ответ хозяина (Walsh, Virology, 2011, 411 (1): 132-141). Таким образом, уменьшение HBeAg в HBeAg-позитивной популяции пациентов может приводить к обращению HBV-специфичной иммунодисфункции (Milich, 1997, J. Viral. Hep. 4: 48-59; Milich, 1998, J. Immunol. 160: 2013-2021). Кроме того, секретируемый HBeAg является значительно более эффективным, чем внутриклеточный коровый антиген гепатита (HBeAg) в вызове толерантности Т-клеток, и разделение толерантности Т-клеток между HBeAg и HBcAg, и клональная гетерогенность НВс/HBeAg-специфичной толерантности Т-клеток могут иметь значительные последствия для природной инфекции HBV и особенно для предкор-негативного хронического гепатита (Chen, 2005, Journal of Virology, 79: 3016-3027).

Соответственно, уменьшение секреции HBeAg, помимо секреции HBsAg, приводило бы к улучшенному ингибированию развития хронической инфекции HBV по сравнению с ингибированием секреции одного HBsAg. Кроме того, наивысшие показатели перехода острой инфекции в хроническую (больше 80%) были описаны в случаях передачи от матери к плоду и неонатальной передачи HBV от HBeAg-позитивных матерей (Liaw, Lancet, 2009, 373: 582-592; Liaw, Dig. Dis. Sci., 2010, 55: 2727-2734 и Hadziyannis, 2011, Journal of hepatology, 55: 183-191). Следовательно, уменьшение уровня HBeAg у будущей матери может не только уменьшать степень зараженности пациента, но также может ингибировать развитие хронической инфекции HBV ее ребенка.

Следовательно, при терапии HBV имеется неудовлетворенная медицинская потребность в ингибировании вирусной экспрессии, в частности, в ингибировании секреции HBsAg и HBeAg (Wieland, S.F. & F.V. Chisari. J Virol, (2005), 79, 9369-80; Kumar et al. J Virol, (2011), 85, 987-95; Woltman et al. PLoS One, (2011), 6, e15324; Op den Brouw et al. Immunology, (2009b), 126, 280-9).

В WO 03/022987, например, в Таблице 7A, раскрыты 1298 генов, которые подвергаются повышающей регуляции в ткани, позитивной в отношении гепатита С. Одним из упомянутых генов является белок 4 с функцией, связанной с топоизомеразой (TRF4, AF089897). AF089897 также называется TRF4-2, который является весьма сходным с положениями 880-2340 SEQ ID NO: 4, приведенными в настоящей заявке. Наблюдение того, что фрагмент PAPD5 подвергается легкой повышающей регуляции в клетках, позитивных в отношении гепатита С, не дает какого-либо указания на то, что ингибирование PAPD5 представляет эффективную терапию. В WO 03/022987 А2 не раскрыт какой-либо намек на то, что фрагменты PAPD5 вообще играют какую-либо критическую роль во время инфекции гепатитом С. Кроме того, HCV и HBV представляют собой два совершенно разных вируса, приводящих к двум совершенно разным заболеваниям с разными этиологиями, разным прогрессированием и разными применяемыми лекарственными средствами. Это согласуется с наблюдением авторов настоящего изобретения о том, что ингибиторы PAPD5 и PAPD7 - DHQ и ТНР - не являются активными против вируса гепатита С (HCV) или других вирусов, помимо HBV (данные не показаны).

В WO 2010/040571 PAPD5 был предложен в длинном списке других генов, как имеющий потенциальную роль в пролиферации клеток при метаболическом и опухолевом заболевании без предоставления какого-либо действительного доказательства.

В WO 2013/166264 PAPD5 был предложен в длинном списке других генов, как имеющий потенциальную роль в увеличении репликации вирусов без предоставления какого-либо действительного доказательства.

В WO 2017/066712 была описана понижающая регуляция PAPD5 в связи с лечением и диагностикой заболеваний теломеров. С этой целью были описаны пять структур кшРНК (короткая шпилечная РНК).

Насколько известно авторам изобретения, PAPD5 или PAPD7 никогда не были ассоциированы с инфекцией HBV, и модифицированные одноцепочечные антисмысловые олигонуклеотиды никогда не делали против данных мишеней.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, технической проблемой, лежащей в основе настоящего изобретения, является идентификация и предоставление улучшенных средств и способов лечения и/или предупреждения инфекции HBV.

Данная техническая проблема решается посредством предоставления воплощений, описанных в данном документе и охарактеризованных в формуле изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Данные графические материалы показывают:

Фиг. 1: иллюстрации из эксперимента 1-1 с химическими зондами НВХ129653/НВХ129654 и 3 фрагментами «добычи».

Фиг. 2: иллюстрации из эксперимента 1-1 с химическими зондами НВХ129653/НВХ129654 и полноразмерными белками PAPD5/7.

Фиг. 3: иллюстрации из конкурентного анализа с использованием НВХ129653 (DHQ) и MOL653/654 для конкуренции.

Фиг. 4: иллюстрации из конкурентного анализа с использованием НВХ129654 (ТНР) и MOL653/654 для конкуренции.

Фиг.5: иллюстрации из конкурентного анализа с использованием НВХ129653 (DHQ) и INACT653/INACT654 для конкуренции. MOL653 был включен в качестве позитивного контроля.

Фиг. 6: иллюстрации из конкурентного анализа с использованием НВХ129654 (ТНР) и INACT653/INACT654 для конкуренции. MOL653 был включен в качестве позитивного контроля.

Фиг. 7: (А) Нокдаун (KD) посредством миРНК (малая интерферирующая РНК) PAPD5 и PAPD7 в инфицированных HBV dHepaRG приводит к уменьшению экспрессии HBV. Дифференцированные клетки HepaRG инфицировали HBV и обрабатывали миРНК против одного из PAPD5, PAPD7 или обоих (25 нМ каждая) за одни сутки до инфекции HBV и в сутки 4 после инфекции. Супернатант отбирали в сутки 11, уровни HBsAg и HBeAg, секретированных в супернатант, измеряли посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) и нормировали к необработанному контролю. Затем измеряли клеточную токсичность и ингибирование экспрессии генов и также нормировали к необработанному контролю. (Б) Проводили такой же эксперимент, как и описанный в (А), за исключением того, что измеряли только уровень HBsAg, секретированного в супернатант.

Фиг. 8: представление способности олигонуклеотидов, протестированных в Примере 4, уменьшать экспрессию PAPD5 в культурах клеток HeLa. Каждый олигонуклеотид представлен точкой, указывающей его место на мРНК PAPD5 по положению на хромосоме. Концентрации олигонуклеотидов составляли 5 и 25 микроМ, как указано на правой стороне каждого графика.

Фиг. 9: представление способности олигонуклеотидов, протестированных в Примере 5, уменьшать экспрессию PAPD7 в культурах клеток HeLa. Каждый олигонуклеотид представлен точкой, указывающей его место на мРНК PAPD7 по положению на хромосоме. Концентрации олигонуклеотидов составляли 5 и 25 микроМ, как указано на правой стороне каждого графика.

Фиг. 10: представление ингибирования HBsAg в инфицированных HBV клетках HepaRG с использованием комбинаций олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 и PAPD7 (20 мкМ каждого), по сравнению с ингибированием, полученным с использованием одного олигонуклеотида (20 мкМ), присутствующего в комбинации. Данный анализ проводили с использованием гимнозиса (gymnosis).

Фиг. 11: представление ингибирования HBsAg в инфицированных HBV клетках HepaRG с использованием комбинаций олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 и PAPD7 (500 нМ каждого), по сравнению с ингибированием, полученным с использованием одного олигонуклеотида (500 нМ) из комбинации. Данный анализ проводили с использованием трансфекции.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, для применения в лечении и/или предупреждении инфекции вирусом гепатита В, где указанная молекула нуклеиновой кислоты ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5. В частности, композиция, содержащая комбинированный препарат молекулы нуклеиновой кислоты, ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5, а другая молекула нуклеиновой кислоты ингибирует экспрессию и/или активность PAPD7, для применения в лечении и/или предупреждении инфекции вирусом гепатита В.

Другой аспект настоящего изобретения относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые ингибируют экспрессию и/или активность PAPD7, в частности, к одноцепочечным антисмысловым молекулам миРНК и кшРНК.

Другой аспект настоящего изобретения относится к одноцепочечным антисмысловым олигонуклеотидам, которые ингибируют экспрессию и/или активность PAPD5, в частности, к модифицированным антисмысловым олигонуклеотидам, содержащим олигонуклеотид, модифицированный 2'-сахаром, и фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

Другими аспектами данного изобретения являются конъюгаты молекул нуклеиновых кислот по изобретению, комбинированные препараты молекул нуклеиновых кислот, способные к ингибированию экспрессии и/или активности и PAPD5, и PAPD7, и фармацевтические композиции, содержащие молекулы по изобретению.

Другим аспектом изобретения является способ идентификации соединения или композиции, которая предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию вирусом гепатита В (HBV), включающий:

а. приведение в контакт тестируемого соединения или композиции с клеткой, экспрессирующей PAPD5 и/или PAPD7;

б. измерение экспрессии и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в присутствии и в отсутствие указанного тестируемого соединения или композиции; и

в. идентификацию соединения или композиции, которая уменьшает экспрессию и/или активность PAPD5 и/или PAPD7, в качестве соединения, которое предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

PAPD5 и PAPD7 представляют собой неканонические поли(А)-полимеразы, которые принадлежат к надсемейству нуклеотидилтрансфераз, подобных полимеразе β. В контексте настоящего изобретения неожиданно было показано то, что соединение, которое является полезным для терапевтического вмешательства в течение инфекции HBV, можно успешно идентифицировать посредством проведения анализа того, ингибирует ли тестируемое соединение PAPD5 или PAPD7. Или, другими словами, ингибирование PAPD5 или PAPD7, или ингибирование и того, и другого было идентифицировано в приложенных примерах как являющееся индикатором эффективности соединения по ингибированию инфекции HBV. В приложенных примерах продемонстрировано то, что дигидрохинолизиноновое соединение, имеющее формулу (III), показанное в разделе Материалы и Методы, именуемое в данном документе DHQ, и тетрагидропиридопиримидиновое соединение, имеющее формулу (IV), как показано в разделе Материалы и Методы, именуемое в данном документе ТНР, связываются с полипептидами PAPD5 или PAPD7 (SEQ ID NO: 1 и 2 соответственно). Данные соединения имеют способность ингибировать продукцию антигена поверхности HBV (HBsAg) и экспрессию РНК HBV во время инфекции HBV (WO 2015/113990 А1 и WO 2016/177655). Кроме того, в приложенных примерах показано то, что ингибирование PAPD5 или PAPD7, или и того, и другого, посредством применения пулов миРНК приводит к ингибированию вирусной экспрессии, особенно секреции HBsAg и HBeAg, а также продукции внутриклеточной мРНК HBV. Данные результаты прямо показывают то, что посредством уменьшения количества и/или активности (например, количества) PAPD5 и/или PAPD7 можно предупреждать или лечить (т.е. уменьшать интенсивность и/или ингибировать) инфекцию HBV (например, хроническую инфекцию HBV).

Способы скрининга по изобретению

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу скрининга, в котором идентифицируется соединение, которое уменьшает экспрессию и/или активность (например, экспрессию) PAPD5 или PAPD7 (или комбинации соединений, которые уменьшают уровень PAPD5 и PAPD7), в качестве соединения, которое предупреждает и/или лечит (т.е. уменьшает интенсивность и/или ингибирует) инфекцию HBV. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения данное соединение представляет собой молекулу РНКи (интерферирующая РНК), в частности, молекулу нуклеиновой кислоты, такую как миРНК, кшРНК или антисмысловой олигонуклеотид. С использованием способа скрининга по изобретению 240 антисмысловых олигонуклеотидов, модифицированных LNA (запертая нуклеиновая кислота), нацеленных на мРНК либо PAPD5, либо PAPD7, было подвергнуто скринингу на их способность уменьшать экспрессию PAPD5 или PAPD7, или и того, и другого, используя комбинации соединений. Некоторые из них были дополнительно протестированы для подтверждения их способности уменьшать интенивность и/или ингибировать инфекцию HBV либо одни, либо в комбинации.

Одним аспектом данного изобретения является способ идентификации соединения или композиции, которая предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию вирусом гепатита В (HBV), включающий:

а) приведение в контакт тестируемого соединения с клеткой, экспрессирующей РАР-ассоциированный доменсодержащий 5 (PAPD5), и/или РАР-ассоциированный доменсодержащий 7 (PAPD7);

б) измерение экспрессии и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в присутствии и в отсутствие указанного тестируемого соединения или композиции; и

в) идентификация соединения, которое уменьшает экспрессию и/или активность PAPD5 и PAPD7, в качестве соединения или композиции, которая предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV; возможно

г) проведение анализа комбинаций соединений для уменьшения экспрессии и/или активности PAPD5 и PAPD7.

В контексте настоящего изобретения было обнаружено то, что соединение (или композиция), которая уменьшает уровень PAPD5 или PAPD7, или комбинации соединений, которые уменьшают PAPD5 и PAPD7 в комбинации, приводит к ингибированию экспрессии и репликации генов HBV; и, таким образом, предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV. Такое соединение может приводить к уменьшению экспрессии и/или активности PAPD5 или PAPD7 на 10-100%, предпочтительно 20-100%, более предпочтительно 30-100%, даже более предпочтительно 40-100%, даже более предпочтительно 50-100%, даже более предпочтительно 60-100%, даже более предпочтительно 70-100%, даже более предпочтительно 80-100% и наиболее предпочтительно на 90-100%.

В предложенном в данном документе способе скрининга рассматривается то, что измеряется экспрессия PAPD5 и/или PAPD7 (т.е. анализируется/определяется) посредством применения на стадии (а) клетки, экспрессирующей PAPD5 и/или PAPD7, такой как линия клеток HeLa или HepaRG. Экспрессию и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 можно измерять (т.е. анализировать/определять) либо (i) определяя полипептид PAPD5 и/или PAPD7; либо (ii) определяя уровни транскрипта в клетке, экспрессирующей PAPD5 и/или PAPD7.

В одном аспекте изобретения соединение, которое уменьшает экспрессию PAPD5 или PAPD7 (например, PAPD5 или предпочтительно комбинации соединений, которые снижают уровень и PAPD5, и PAPD7), идентифицируется как соединение(ния), которое(рые) предупреждает(ют), уменьшает(ют) интенсивность и/или ингибирует(ют) (например, лечит(чат)) инфекцию HBV. В другом аспекте изобретения соединение, которое уменьшает активность полипептида PAPD5 или PAPD7 (например, PAPD5 или, предпочтительно, комбинации соединений, которые снижают уровень и PAPD5, и PAPD7), идентифицируется как соединение(ния), которое(рые) предупреждает(ют), уменьшает(ют) интенсивность и/или ингибирует(ют) (например, лечит(чат)) инфекцию HBV. Приоритетным является то, что соединение, которое уменьшает экспрессию и/или активность PAPD5 или комбинации соединений, которые уменьшают уровень обеих молекул - PAPD5 и PAPD7 - идентифицируется как соединения, которые предупреждют, уменьшают интенсивность и/или ингибируют инфекцию HBV. Наиболее предпочтительно комбинация соединений, которая уменьшает экспрессию и/или активность обеих молекул - PAPD5 и PAPD7 - идентифицируется как композиция, которая предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV.

Вышеописанный способ скрининга приводит к идентификации соединения или комбинации соединений, которая предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV. Приоритетным является то, что указанные соединения уменьшают интенсивность и/или ингибируют (т.е. лечат) инфекцию HBV. Таким образом, предложенный в данном документе способ скрининга является полезным в идентификации соединения, которое лечит инфекцию HBV.

В контексте настоящего изобретения PAPD5 может представлять собой полипептид PAPD5 или мРНК PAPD5. Приоритетным является то, что в контексте способов скрининга, предложенных в данном документе, PAPD5 представляет собой мРНК PAPD5.

Один аспект настоящего изобретения относится к предложенному в данном документе способу скрининга, в котором клетки, экспрессирующие PAPD5, содержат нуклеиновую кислоту-мишень PAPD5, содержащую или состоящую из:

(i) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2;

(ii) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, 5 или 10, или ее природных вариантов;

(iii) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1 или 2, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы;

(iv) нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью (ii), где полипептид, экспрессируемый от нуклеотидной последовательности, имеет функцию поли-А полимеразы;

(v) нуклеотидной последовательности, кодирующей ферментативно активный фрагмент SEQ ID NO: 1 или 2, такой как нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO: 7 или 8;

(vi) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью ферментативно активного фрагмента SEQ ID NO: 1 или 2, такой как SEQ ID NO: 7 или 8, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы; или

(vii) нуклеотидной последовательности, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 или 10.

В предпочтительных воплощениях нуклеиновая кислота-мишень PAPD5 представляет собой мРНК, такую как пре-мРНК или зрелую мРНК. В других воплощениях нуклеиновая кислота-мишень PAPD5 представляет собой полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, 5 или 10, или ее природных вариантов. Однако мРНК PAPD5 также может представлять собой полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с SEQ ID NO: 4, 5 или 10, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы.

В контексте настоящего изобретения PAPD7 может представлять собой полипептид PAPD7 или мРНК PAPD7. Приоритетным в контексте способов скрининга, предложенных в данном документе, является то, что PAPD7 представляет собой мРНК PAPD7.

Один аспект настоящего изобретения относится к предложенным в данном документе способам скрининга, в которых клетки, экспрессирующие PAPD7, содержат нуклеиновую кислоту-мишень PAPD7, содержащую или состоящую из:

(i) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;

(ii) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6 или 11, или ее природных вариантов;

(iii) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с SEQ ID NO: 3, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы;

(iv) нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью (ii), где полипептид, экспрессируемый от последовательности нуклеиновой кислоты, имеет функцию поли-А полимеразы;

(v) нуклеотидной последовательности, кодирующей ферментативно активный фрагмент SEQ ID NO: 3, такой как нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO: 9; или

(vi) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью ферментативно активного фрагмента SEQ ID NO: 3, такой как SEQ ID NO: 9, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы; или

(vii) нуклеотидной последовательности, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 6 или 11.

В предпочтительных воплощениях нуклеиновая кислота-мишень PAPD7 представляет собой мРНК, такую как пре-мРНК или зрелая мРНК. В других воплощениях нуклеиновая кислота-мишень PAPD7 представляет собой полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6 или 11, или ее природных вариантов. Однако мРНК PAPD7 также может представлять собой полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную и даже более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность с SEQ ID NO: 6 или 11, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы.

В контексте настоящего изобретения клетка, используемая для скрининга, может представлять собой эукариотическую клетку. Например, указанная клетка может представлять собой дрожжевую клетку или клетку позвоночного. Клетки позвоночных включают клетки рыб, птиц, рептилий, амфибий, сумчатых и млекопитающих. Предпочтительно клетка представляет собой клетку млекопитающего, наиболее предпочтительно - человеческую клетку. Клетки млекопитающих также включают клетки кошек, собак, крупного рогатого скота, лошадей, коз, овец, свиней, мышиных, таких как мышь и крыса, и кроликов. В способах скрининга, предложенных в данном документе, «клетка» может эндогенно экспрессировать PAPD5 и/или PAPD7, или сверхэкспрессировать PAPD5 и/или PAPD7. Для сверхэкспрессии PAPD5 и/или PAPD7 клетка может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид PAPD5 и/или полипептид PAPD7 в пределах экспрессионного вектора. В предпочтительных воплощениях клетка содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид PAPD5, и нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид PAPD7. Клетка по предложенным в данном документе способам скрининга может содержаться в животном, не являющемся человеком, например, в мыши, крысе, кролике или хорьке. Клетки, предложенные для способа скрининга, описанного в данном документе, также могут называться клетками-мишенями.

В предложенном в данном документе способе скрининга, где измеряется активность полипептида PAPD5 и/или полипептида PAPD7, указанная активность PAPD5 и PAPD7 предпочтительно представляет собой функцию поли-А полимеразы (т.е. активность поли-А полимеразы). Функцию/активность полипептида поли-А полимеразы (например, PAPD5 или PAPD7) можно измерять, например, отслеживанием полиаденилирования мРНК in vitro, например, как описано в Rammelt, RNA, 2011, 17:1737-1746. Данный способ также можно использовать для измерения функции поли-А полимеразы PAPD5 и/или PAPD7 в присутствии и в отсутствие тестируемого соединения. Вкратце, рибоолигонуклеотид А₁₅ можно инкубировать с рекомбинантным белком PAPD5, экспрессируемым в Escherichia coli в присутствии АТР(А), СТР (С), GTP(G), UTP(U) или смеси всех четырех dNTP соответственно.

Экспрессию PAPD5 и/или PAPD7 в клетке в присутствии и в отсутствие тестируемого соединения можно измерять, например, с использованием (к)ПЦР, вестерн-блоттинга или масс-спектрометрии.

Соединение, которое ингибирует размножение HBV, может представлять собой соединение, которое уменьшает экспрессию вирусной РНК, которое уменьшает продукцию вирусной ДНК (ДНК HBV), происходящей от вирусной РНК (РНК HBV), которое уменьшает продукцию новых вирусных частиц (частиц HBV), и/или которое уменьшает продукцию и/или секрецию HBsAg и/или HBeAg. Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к предложенным в данном документе способам скрининга, в которых соединение, которое ингибирует размножение HBV, ингибирует секрецию HBsAg, ингибирует секрецию HBeAg и/или ингибирует продукцию внутриклеточной мРНК HBV или ДНК HBV. Предпочтительно соединение, которое ингибирует размножение HBV, представляет собой соединение, которое ингибирует секрецию HBsAg, секрецию HBeAg и продукцию внутриклеточной мРНК HBV или ДНК HBV.

Например, соединение, которое ингибирует размножение HBV, может уменьшать экспрессию вирусной РНК (РНК HBV), продукцию вирусной ДНК (ДНК HBV), происходящей от вирусной РНК, продукцию новых вирусных частиц (частиц HBV), продукцию и/или секрецию HBsAg и/или HBeAg на 10-100%, предпочтительно на 20-100%, более предпочтительно на 30-100%, даже более предпочтительно на 40-100%, даже более предпочтительно на 50-100%, даже более предпочтительно на 60-100%, даже более предпочтительно на 70-100%, даже более предпочтительно на 80-100% и наиболее предпочтительно на 90-100% по сравнению с необработанными клетками или животными, или клетками или животными, обработанными подходящим контролем.

Ингибирование размножения HBV можно измерять, например, измерением того, имеет ли тестируемое соединение активность по ингибированию секреции HBsAg и/или HBeAg, или по ингибированию продукции мРНК HBV или ДНК HBV. Ингибирование секреции HBsAg и/или HBeAg можно измерять ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), например, посредством применения набора CLIA ELISA (Autobio Diagnostic) согласно инструкциям изготовителей. Ингибирование продукции внутриклеточной мРНК HBV можно измерять ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени, например, как описано в приложенных примерах. Дополнительными способами для оценки того, ингибирует ли тестируемое соединение размножение HBV, являются измерение секреции ДНК HBV посредством кПЦР-ОТ (количественная полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией), например, как описано в WO 2015/173208, или как описано в приложенных примерах; норзерн-блоттинг; гибридизация in situ или иммунофлуоресценция.

Предложенные в данном документе способы скрининга могут дополнительно включать стадию сравнения тестируемого соединения с контролем. Указанным контролем может быть неактивное тестируемое соединение, где указанное неактивное тестируемое соединение представляет собой соединение, которое не уменьшает экспрессию и/или активность PAPD5 и PAPD7.

Это неактивное тестируемое соединение не имеет активности против HBV, например, оно не приводит к ингибированию секреции HBsAg и HBeAg, и к ингибированию продукции внутриклеточной мРНК HBV. Например, неактивное тестируемое соединение может иметь значение IC₅₀ (полумаксимальная ингибирующая концентрация) при ингибировании HBsAg более чем 6 мкМ. В предложенном в данном документе способе скрининга неактивное тестируемое соединение может представлять собой ненацеленный антисмысловой олигонуклеотид, миРНК или кшРНК. В способе скрининга, в котором измеряется экспрессия и/или активность PAPD5 и/или PAPD7, может использоваться тестируемое соединение, как определено выше в (i). Неактивное соединение может быть разработано из активного соединения, например, посредством химической модификации и/или функционального нарушения.

Для проведения предложенных в данном документе способов скрининга можно использовать общедоступные или коммерчески доступные библиотеки молекул. Таким образом, в контексте данного изобретения указанное тестируемое соединение может представлять собой подвергаемую скринингу библиотеку молекул нуклеиновых кислот, выбранных из:

(i) одноцепочечных антисмысловых олигонуклеотидов, предпочтительно содержащих по меньшей мере один 2'-модифицированный нуклеозид; или

(ii) молекул миРНК; или

(iii) молекул кшРНК.

В приложенных примерах продемонстрировано то, что посредством ингибирования полипептида или мРНК PAPD5 и/или PAPD7, может эффективно ингибироваться секреция HBsAg и HBeAg, а также продукция внутриклеточной мРНК HBV. Эти данные демонстрируют то, что ингибитор PAPD5 и/или PAPD7 может использоваться для предупреждения и/или лечения инфекции HBV.

В данной области было описано несколько низкомолекулярных соединений, которые имеют определенную эффективность в лечении инфекции HBV (см., например, WO 2015/113990 А1 и WO 2016/177655). В приложенных примерах впервые продемонстрирована явная корреляция между активностью низкомолекулярного соединения против инфекции HBV и аффинностью связывания по отношению к PAPDP5 и PAPD7. Данное осознание открыло возможности для конструирования молекул нуклеиновых кислот, нацеленных на мРНК PAPD5 или PAPD7, приводя к особенно высокой эффективности против HBV. Данные молекулы нуклеиновых кислот могут быть нацелены непосредственно в печень с использованием конъюгатов, способных к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr). По сравнению с вводимыми системно маленькими молекулами данные молекулы нуклеиновых кислот будут иметь отличный профиль РК (фармакокинетика) / PD (фармакодинамика) и профиль токсичности. Кроме того, согласно настоящему изобретению впервые показано то, что соединение(ния), которое(рые) ингибирует(ют) PAPD5 или PAPD7, или, в частности, PAPD5 и PAPD7, имеет(ют) экстраординарно высокую активность в показателях ингибирования секреции HBsAg и HBeAg, а также продукции внутриклеточной мРНК HBV. Уменьшение секреции HBsAg и HBeAg ингибирует развитие хронической инфекции HBV более эффективно по сравнению с уменьшением секреции одного HBsAg. Кроме того, ингибирование секреции HBsAg и HBeAg уменьшает зараженность человека, инфицированного HBV. Кроме того, уменьшение уровня HBeAg у будущей матери также может ингибировать развитие хронической инфекции HBV ее ребенка. Таким образом, настоящее изобретение неожиданно демонстрирует то, что селективное применение соединений, которые ингибируют нуклеиновые кислоты-мишени PAPD5 или PAPD7, или комбинаций соединений, которые ингибируют нуклеиновые кислоты-мишени и PAPD5, и PAPD7, приводит к улучшенному терапевтическому успеху при лечении инфекции HBV в показателях значительно более эффективного уменьшения уровня HBsAg и HBeAg.

Соответственно, одним аспектом настоящего изобретения является применение одного или более чем одного ингибитора, способного уменьшать уровни нуклеиновых кислот-мишеней PAPD5 или PAPD7, или комбинаций соединений, которые ингибируют экспрессию нуклеиновых кислот-мишеней и PAPD5, и PAPD7, в лечении инфекции HBV, в частности, хронической инфекции HBV. В другом воплощении данное изобретение относится к применению по меньшей мере двух ингибиторов, способных уменьшать уровни нуклеиновых кислот-мишеней PAPD5 и/или PAPD7 при уменьшении уровней вирусных антигенов HBsAg и HBeAg.

Таким образом, настоящее изобретение относится к ингибитору или комбинации ингибиторов PAPD5 и/или PAPD7 для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV, где указанный(ные) ингибитор(ры) независимо выбран(ны) из группы, состоящей из:

(а) одной или более чем одной молекулы интерферирующей РНК (РНКи) против PAPD5 или PAPD7;

(б) аппарата редактирования генома, включающего:

(i) сайт-специфичную ДНК-нуклеазу или полинуклеотид, кодирующий сайт-специфичную ДНК-нуклеазу; и

(ii) РНК-проводник или полинуклеотид, кодирующий РНК-проводник.

Молекулы РНКи могут быть независимо выбраны из группы состоящей из:

а) одноцепочечного антисмыслового олигонуклеотида;

б) молекулы миРНК; и

в) молекулы кшРНК.

Ингибитор по настоящему изобретению также может представлять собой молекулу запертой нуклеиновой кислоты (LNA), специфичную в отношении PAPD5 или PAPD7.

Рассматривается то, что ингибитор по изобретению используется для лечения (например, уменьшения интенсивности) инфекции HBV.

Данный ингибитор может представлять собой молекулу, которая специфично ингибирует PAPD7. Предпочтительно ингибитор представляет собой молекулу, которая специфично ингибирует PAPD5. Более предпочтительно ингибиторы объединяются таким образом, что они ингибируют и PAPD5, и PAPD7. Таким образом, приоритетным является то, что ингибиторы по настоящему изобретению либо ингибируют PAPD5, либо объединяются таким образом, что они ингибируют и PAPD5, и PAPD7. Наиболее предпочтительно ингибиторы по настоящему изобретению объединяются таким образом, что они ингибируют PAPD5 и PAPD7. В одном аспекте данного изобретения ингибиторы по настоящему изобретению объединяются таким образом, что они ингибируют и PAPD5, и PAPD7, и приводят к уменьшению секреции HBsAg и/или HBeAg по меньшей мере на 50% по сравнению с контролем без лекарственного средства (т.е. по сравнению с клетками или субъектами, которым не вводилось лекарственное средство).

Ингибитор по настоящему изобретению может иметь значение IC₅₀ в ингибировании HBsAg и HBeAg меньше 6 мкМ, предпочтительно меньше 5 мкМ, предпочтительно меньше 4 мкМ, предпочтительно меньше 3 мкМ, предпочтительно меньше 2 мкМ, более предпочтительно меньше 1 мкМ, более предпочтительно меньше 0,5 мкМ и наиболее предпочтительно меньше 0,1 мкМ.

Редактирование генома посредством применения сайт-специфичной ДНК-нуклеазы (такой как Cas9 или Cpf1) и РНК-проводника обычно известно в данной области и описывается, например, в "CRISPR-Cas: A Laboratory Manual", 2016, под редакцией Jennifer Doudna, ISBN 978-1-621821-31-1.

Например, если указанная сайт-специфичная ДНК-нуклеаза представляет собой нуклеазу Cas9, тогда аппарат редактирования генома предпочтительно дополнительно содержит:

(i) по меньшей мере одну РНК-проводник, состоящую из по меньшей мере одной специфичной в отношении последовательности-мишени молекулы РНК CRISPR (крРНК) и по меньшей мере одной транс-активирующей молекулы крРНК (тракрРНК);

(ii) полинуклеотид, кодирующий молекулы РНК (i);

(iii) по меньшей мере одну РНК-проводник, которая представляет собой молекулу химерной РНК, содержащую по меньшей мере одну специфичную в отношении последовательности-мишени крРНК и по меньшей мере одну тракрРНК; или

(iv) полинуклеотид, кодирующий химерную РНК (iii).

В альтернативном примере сайт-специфичная ДНК-нуклеаза представляет собой нуклеазу Cpf1, и аппарат редактирования генома предпочтительно дополнительно содержит:

(i) по меньшей мере одну РНК-проводник, содержащую специфичную в отношении последовательности-мишени молекулу PHKCRISPR (крРНК); или

(ii) полинуклеотид, кодирующий молекулы РНК (i).

Предложенные в данном документе ингибиторы PAPD5 или PAPD7 также могут представлять собой аппарат редактирования генома, который содержит по меньшей мере один предварительно собранный рибонуклеопротеиновый комплекс белок Cas9-РНК-проводник (RNP).

В данном документе РНК-проводник конструируют для нацеливания на геномную ДНК PAPD5 или PAPD7. В качестве альтернативы, используются несколько РНК-проводников таким образом, что может осуществляться нацеливание на геномную ДНК PAPD5 и PAPD7. Ингибирование PAPD5 и/или PAPD7 может достигаться посредством введения нокаутирующих мутаций со сдвигом рамки считывания в геномную ДНК PAPD5 и/или PAPD7 посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) или посредством модифицирования геномной ДНК PAPD5 и/или PAPD7 через направляемую гомологией репарацию (HDR). Как можно индуцировать данные механизмы является общеизвестным в данной области, и это описывается, например, в Heidenreich, 2016, Nat Rev Neurosci 17 36-44.

Ингибитор по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой молекулу, не встречающуюся в природе. Ингибитор по изобретению может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из агентов на основе РНКи, включающих миРНК, кшРНК, криспер РНК и одноцепочечные антисмысловые олигонуклеотиды. Предпочтительно молекулы РНКи содержат по меньшей мере один не встречающийся в природе нуклеотид, такой как олигонуклеотидтрифосфат, замещенный рибоолигонуклеотид, нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, нуклеозид LNA, нуклеозид PNA (пептидилнуклеиновая кислота), молекула GNA (гликольнуклеиновая кислота), молекула TNA (треозонуклеиновая кислота), морфолинонуклеотид или нуклеиновая кислота с модифицированным остовом, таким как полисилоксан, 2'-O-(2-метокси)-этил-фосфоротиоат, или нуклеиновая кислота с заместителем, таким как метил-, тио-, сульфат, бензоил-, фенил-, амино-, пропил-, хлор- и метанокарбануклеозид, или репортерную молекулу для облегчения ее выявления. Ингибитор по изобретению также может быть встречающейся в природе или невстречающейся в природе маленькой молекулой или аппаратом редактирования генома.

В контексте настоящего изобретения предложенный в данном документе ингибитор ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5 или PAPD7.

Например, ингибитор по настоящему изобретению может связываться с нуклеиновой кислотой-мишенью PAPD5 и ингибировать активность полипептида PAPD5. В другом примере ингибитор по настоящему изобретению связывается нуклеиновой кислотой-мишенью PAPD7 и ингибирует активность полипептида PAPD7. В данном документе приоритетным является то, что ингибиторы объединяются для нацеливания на мРНК и PAPD5, и PAPD7 и ингибируют активность обоих: полипептида PAPD5 и PAPD7. Ингибитор по настоящему изобретению может ингибировать экспрессию PAPD5 или PAPD7; или комбинация ингибиторов может ингибировать экспрессию и PAPD5, и PAPD7.

Соединения по изобретению

Как описано выше, ингибитор по настоящему изобретению может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты.

В одном аспекте изобретения ингибитор по настоящему изобретению представляет собой молекулу РНКи против PAPD5 или PAPD7. Указанная молекула РНКи может представлять собой миРНК или кшРНК.

Например, ингибитор по настоящему изобретению может представлять собой миРНК, которая направлена против PAPD5, где указанная миРНК представляет собой любую из комбинации следующих миРНК:

Пул миРНК к PAPD5 (L-010011-00-0010; ON-TARGETplus человеческий PAPD5):

миРНК - 1 - J-010011-05 - последовательность-мишень:

миРНК - 2 - J-010011-06 - последовательность-мишень:

миРНК - 3 - J-010011-07 - последовательность-мишень:

миРНК - 4 - J-010011-08 - последовательность-мишень:

Ингибитор по настоящему изобретению также может представлять собой миРНК, которая направлена против PAPD7, где указанная миРНК представляет собой любую из комбинации следующих миРНК:

Пул миРНК к PAPD7 (L-009807-00-0005; ON-TARGETplus человеческий PAPD7):

миРНК - 1 - J-009807-05 - последовательность-мишень:

миРНК - 2 - J-009807-06 - последовательность-мишень:

миРНК - 3 - J-009807-07 - последовательность-мишень:

миРНК - 4 - J-009807-08 - последовательность-мишень:

Выше показаны последовательности-мишени подходящих миРНК. Последовательности соответствующих миРНК являются непосредственно комплементарными данным последовательностям-мишеням.

В контексте настоящего изобретения рассматривается то, что объединенный препарат может содержать: (а) миРНК, направленную(ные) против PAPD5, объединенную(ные) с (б) миРНК, направленной(ными) против PAPD7, для того, чтобы ингибировать экспрессию и PAPD5, и PAPD7.

В контексте настоящего изобретения также рассматривается то, что объединенный препарат может содержать: (а) кшРНК, направленную против PAPD5, объединенную с (б) кшРНК, направленной против PAPD7, для того, чтобы ингибировать экспрессию и PAPD5, и PAPD7. В данном контексте молекула кшРНК в (а) может быть одной или более чем одной из следующих молекул кшРНК:

В другом аспекте изобретения молекула РНКи представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, способный ингибировать экспрессию PAPD5 или PAPD7. Данная модуляция достигается посредством гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, кодирующей PAPD5 или PAPD7. Нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой PAPD5 млекопитающего, такую как последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 и 10, или ее природные варианты.

Нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой PAPD7 млекопитающего, такой как последовательность, выбранная из SEQ ID NO: 6 или 11, или ее природные варианты.

Олигонуклеотид по изобретению представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, который нацелен на PAPD5 или PAPD7.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен модулировать экспрессию мишени посредством ее ингибирования или понижающей регуляции. Предпочтительно такая модуляция дает ингибирование экспрессии по меньшей мере на 20% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии мишени, более предпочтительно, по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% ингибирования по сравнению с нормальным уровнем экспрессии мишени. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению могут быть способны ингибировать уровни экспрессии мРНК PAPD5 или PAPD7 по меньшей мере на 60% или 70% in vitro с использованием клеток HeLa или HepaRG. В некоторых воплощениях соединения по изобретению могут быть способны ингибировать уровни экспрессии белка PAPD5 или PAPD7 по меньшей мере на 50% in vitro с использованием клеток HeLa или HepaRG. Подходящим образом анализы, которые можно использовать для измерения ингибирования РНК или белка PAPD5 или PAPD7, описываются выше в разделе способов скрининга. Модулирование мишени запускается гибридизацией между непрерывной нуклеотидной последовательностью олигонуклеотида и нуклеиновой кислотой-мишенью.

Один аспект настоящего изобретения относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 90% комплементарной PAPD5. Данные антисмысловые олигонуклеотиды способны уменьшать экспрессию PAPD5. Предпочтительно антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром.

Другой аспект настоящего изобретения относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 90% комплементарной PAPD7. Данный антисмысловой олигонуклеотид способен уменьшать экспрессию PAPD7. Предпочтительно антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит непрерывную последовательность, которая является по меньшей мере на 90% комплементарной, как, например, по меньшей мере на 91%, как, например, по меньшей мере на 92%, как, например, по меньшей мере на 93%, как, например, по меньшей мере на 94%, как, например, по меньшей мере на 95%, как, например, по меньшей мере на 96%, как, например, по меньшей мере на 97%, как, например, по меньшей мере на 98% или на 100% комплементарной области нуклеиновой кислоты-мишени или последовательности-мишени.

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид по изобретению или его непрерывная нуклеотидная последовательность является полностью комплементарной (на 100% комплементарной) области нуклеиновой кислоты-мишени, или в некоторых воплощениях может содержать одно или два несоответствия между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью.

В некоторых воплощениях данный олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, полной (или 100%-ной) комплементарностью к области нуклеиновой кислоты-мишени, такой как последовательность-мишень, присутствующая в SEQ ID NO: 4, 5 или 10. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 10. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 4, 5 или 10.

В некоторых воплощениях данный олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, полной (или 100%-ной) комплементарностью к области нуклеиновой кислоты-мишени, такой как последовательность-мишень, присутствующая в SEQ ID NO: 6 или 11. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 6 или 11.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит или состоит из 10-35 нуклеотидов в длину, как, например, от 10 до 30, как, например, от 11 до 22, как, например, от 12 до 20, как, например, от 14 до 20, как, например, от 14 до 18, как, например, от 14 до 16, как, например, от 16 до 20 смежных нуклеотидов в длину.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или его непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 22 или меньшего числа нуклеотидов, как, например, из 20 или меньшего числа нуклеотидов. Следует понимать то, что любой интервал, приведенный в данном документе, включает конечные точки данного интервала. Соответственно, при указании того, что олигонуклеотид включает от 10 до 30 нуклеотидов, включаются и 10, и 30 нуклеотидов.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, перечисленных в Таблице 3 в разделе Материалы и метод.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-131 (см. мотивы последовательностей, перечисленные в Таблице 3).

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 18, 23, 25, 26, 30, 32, 39, 54, 56, 58, 65, 80, 88, 92, 93, 111, 115, 116 и 118 (см. мотивы последовательностей, перечисленные в Таблице 3).

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 26, 54, 56, 80, 93 и 115.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, перечисленных в Таблице 4 в разделе Материалы и метод.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 132-251 (см. мотивы последовательностей, перечисленные в Таблице 4).

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 и 244 (см. мотивы последовательностей, перечисленные в Таблице 4).

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 172, 188, 190, 229 и 239.

В другом аспекте данное изобретение относится к комбинированному препарату, содержащему: а) молекулу нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5; и б) молекулу нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD7. В конкретных воплощениях молекулы нуклеиновых кислот независимо выбраны из миРНК, кшРНК и антисмысловых олигонуклеотидов, описанных в данном документе.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) одну или более чем одну молекулу миРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD5, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 252, 253, 254 и 255; и б) одну или более чем одну молекулу миРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD7, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 256, 257, 258 и 259.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) одну или более чем одну молекулу кшРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD5, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 252, 253, 254 и 255; и б) один или более чем один антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на последовательность-мишень PAPD7, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 и 244.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) одну или более чем одну молекулу антисмыслового олигонуклеотида, нацеленную на последовательность-мишень PAPD5, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 18, 23, 25, 26, 30, 32, 39, 54, 56, 58, 65, 80, 88, 92, 93, 111, 115, 116 и 118; и б) одну или более чем одну молекулу миРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD7, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 256, 257, 258 и 259.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) одну или более чем одну молекулу кшРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD5, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 260, 261, 262, 263 и 264; и б) одну или более чем одну молекулу миРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD7, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 256, 257, 258 и 259.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) одну или более чем одну молекулу кшРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD5, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 260, 261, 262, 263 и 264; и б) один или более чем один антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на последовательность-мишень PAPD7, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 и 244.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 18, 23, 25, 26, 30, 32, 39, 54, 56, 58, 65, 80, 88, 92, 93, 111, 115, 116 и 118, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 и 244.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, 23, 25, 26, 32, 39, 54, 80, 92, 93, 116 и 118, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 153, 155, 172, 174, 183, 188, 190, 195, 197, 221, 224, 229, 232 и 244.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 18 и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 221.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 23 и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 172 или 188.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 25 и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 174 или 183.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 26, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 183.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 39, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 229.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 54, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 190 или 232.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 56, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 153 или 244.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 80, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 153 или 244.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 92, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 190 или 232.

В некоторых воплощениях данный комбинированный препарат, содержит: а) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 116, и б) антисмысловой олигонуклеотид или непрерывную нуклеотидную последовательность, которая содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно 100%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID NO: 155 или 195.

Конструкция олигонукпеотида

Термин «конструкция олигонуклеотида» относится к картине модификаций сахара нуклеозидов в последовательности олигонуклеотида. Олигонуклеотиды по изобретению содержат нуклеозиды с модифицированным сахаром и также могут содержать нуклеозиды ДНК или РНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит нуклеозиды с модифицированным сахаром и нуклеозиды ДНК. Включение модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотид по изобретению может увеличивать аффинность олигонуклеотида в отношении нуклеиновой кислоты-мишени. В данном случае модифицированные нуклеозиды можно называть модифицированными нуклеотидами, увеличивающими аффинность. Модифицированные нуклеозиды также можно называть звеньями.

В одном воплощении олигонуклеотид содержит по меньшей мере 1 модифицированный нуклеозид, как, например, от 1 до 8 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 2 до 8 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 3 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 4 до 6 модифицированных нуклеозидов.

В одном воплощении олигонуклеотид содержит один или более чем один нуклеозид с модифицированным сахаром, как, например, нуклеозиды, модифицированные 2'-сахаром. Предпочтительно олигонуклеотид по изобретению содержит один или более чем один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-O-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и нуклеозидов LNA. Даже более предпочтительно один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой запертую нуклеиновую кислоту (LNA).

В другом воплощении олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В предпочтительном воплощении все межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные или боранофосфатные межнуклеозидные связи. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи в непрерывной последовательности олигонуклеотида представляют собой фосфоротиоатные связи.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA, как, например, от 1 до 8 нуклеозидов LNA, как, например, от 2 до 8 нуклеозидов LNA, как, например, от 3 до 7 нуклеозидов LNA, как, например, от 4 до 6 нуклеозидов LNA.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид по изобретению способен рекрутировать РНКазу Н.

Конструкция гэпмера

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид по изобретению имеет конструкцию или структуру гэпмера, также именуемую в данном документе просто «гэпмер». В структуре гэпмера олигонуклеотид содержит по меньшей мере три отличные структурные области: 5'-фланг, гэп и 3'-фланг, F-G-F' в ориентации '5->3'. В данной конструкции фланкирующие области F и F' (также именуемые области крыльев) содержат непрерывный отрезок модифицированных нуклеозидов, которые являются комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени PAPD5 или PAPD7, тогда как область гэпа - G - содержит непрерывный отрезок нуклеотидов, который способен рекрутировать нуклеазу, предпочтительно эндонуклеазу, такую как РНКаза, например, РНКаза Н, когда олигонуклеотид находится в дуплексе с нуклеиновой кислотой-мишенью. В предпочтительных воплощениях область гэпа состоит из нуклеозидов ДНК. Области F и F', фланкирующие 5'- и 3'-концы области G, предпочительно содержат нуклеозиды, не рекрутирующие нуклеазу (нуклеозиды с 3'-эндоструктурой), более предпочтительно один или более чем один модифицированный нуклеозид, увеличивающий аффинность. В некоторых воплощениях 3'-фланг содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA, предпочтительно по меньшей мере 2 нуклеозида LNA. В некоторых воплощениях 5'-фланг содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA. В некоторых воплощениях обе 5'- и 3'-фланкирующие области содержат нуклеозид LNA. В некоторых воплощениях все нуклеозиды в данных фланкирующих областях представляют собой нуклеозиды LNA. В других воплощениях фланкирующие области могут содержать и нуклеозиды LNA, и другие нуклеозиды (смешанные фланги), такие как нуклеозиды ДНК и/или модифицированные нуклеозиды, не являющиеся нуклеозидами LNA, такие как 2'-замещенные нуклеозиды. В данном случае гэп определяется как непрерывная последовательность из по меньшей мере 5 нуклеозидов, рекрутирующих РНКазу Н (нуклеозиды с 2'-эндоструктурой, предпочтительно ДНК), фланкированная на 5'- и 3'-конце модифицированным нуклеозидом, увеличивающим аффинность, предпочтительно LNA, таким как бета-D-окси-LNA. Следовательно, нуклеозиды 5'-фланкирующей области и 3'-фланкирующей области, которые являются смежными с областью гэпа, представляют собой модифицированные нуклеозиды, предпочтительно нуклеозиды, не рекрутирующие нуклеазу или нуклеозиды с высокой аффинностью.

Область F

Область F (5'-фланг или 5'-крыло) присоединяется к '5-концу области G и включает, содержит или состоит из по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида, как, например, из по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении область F содержит или состоит из от 1 до 4 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-4 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1-3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозидов. Область F определяется наличием по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце данной области.

В некоторых воплощениях модифицированные нуклеозиды в области F имеют З'-эндоструктуру.

В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид. В одном воплощении все нуклеозиды в области F представляют собой 2'-модифицированные нуклеозиды.

В другом воплощении область F содержит нуклеозиды ДНК и/или РНК, помимо 2'-модифицированных нуклеозидов. Фланги, содержащие ДНК и/или РНК, характеризуются наличием 2'-модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце (рядом с областью G) области F. Нуклеозиды ДНК во флангах предпочтительно не должны быть способны рекрутировать РНКазу Н. Длина 5'-фланга (области F) в олигонуклеотидах с нуклеотидами ДНК и/или РНК во флангах может быть больше, поддерживая число 2'-модифицированных нуклеозидов от 1 до 4, как описано выше. В другом воплощении один или более чем один 2'-модифицированный нуклеозид в области F выбран из звеньев 2'-O-алкил-РНК, 2'-О-метил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, звеньев МОЕ, звеньев LNA, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ANA) и звеньев 2'-фтор-ANA.

В некоторых воплощениях область F содержит и нуклеозид LNA, и 2'-замещенный модифицированный нуклеозид. Они часто называются олигонуклеотидами со смешанными крыльями или со смешанными флангами.

В одном воплощении изобретения все модифицированные нуклеозиды в области F представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении все нуклеозиды в области F представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении нуклеозиды LNA в области F независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA, амино-LNA, сЕТ и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В предпочтительном воплощении область F содержит по меньшей мере 1 звено бета-D-окси LNA на 5'-конце непрерывной последовательности. В другом предпочтительном воплощении область F состоит из бета-D-окси нуклеозидов LNA.

Область G

Область G (область гэпа) предпочтительно включает, содержит или состоит из 4-18 или из 5-17, или из 6-16, или из 8-12 последовательных нуклеозидных звеньев, способных рекрутировать РНКазу Н.

Нуклеозидные звенья в области G, которые способны рекрутировать нуклеазу, в одном воплощении выбраны из группы, состоящей из ДНК, альфа-L-LNA, С4'-алкилированой ДНК (как описано в РСТ/ЕР2009/050349 и Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300, которые обе включены в данный документ посредством ссылки), нуклеозидов, происходящих из арабинозы, подобных ANA и 2'F-ANA (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (незапертая нуклеиновая кислота) (как описано в Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, включенной в данный документе посредством ссылки). UNA представляет собой незапертую нуклеиновую кислоту, типично где связь между С2 и С3 рибозы была удалена, образуя незапертый «сахарный» остаток.

В некоторых воплощениях область G состоит из 100% звеньев ДНК.

В других воплощениях область G может состоять из смеси ДНК и других нуклеозидов, способных опосредовать расщепление РНКазой Н.

В некоторых воплощениях нуклеозиды в области G имеют 2'-эндоструктуру.

Область F'

Область F' (3'-фланг или 3'-крыло) присоединяется к 3'-концу области G и включает, содержит или состоит из по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида, как, например, из по меньшей мере 2, по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении область F' содержит или состоит из от 1 до 3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1-3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозидов. Область F' определяется наличием по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида на 5'-конце и на 3'-конце данной области.

В некоторых воплощениях модифицированные нуклеозиды в области F' имеют 3'-эндоструктуру.

В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F' представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид. В одном воплощении все нуклеозиды в области F' представляют собой 2'-модифицированные нуклеозиды.

В другом воплощении область F' содержит нуклеозиды ДНК и/или РНК, помимо 2'-модифицированных нуклеозидов. Фланги, содержащие ДНК и/или РНК, характеризуются наличием 2'-модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце (смежном с областью G) области F'. Данные нуклеозиды ДНК во флангах предпочтительно не должны быть способны рекрутировать РНКазу Н. Длина 3'-фланга (области F') в олигонуклеотидах с нуклеотидами ДНК и/или РНК во флангах может быть больше, поддерживая число 2'-модифицированных нуклеотидов от 1 до 4, как описано выше. В другом воплощении один или более чем один 2'-модифицированный нуклеозид в области F' выбран из звеньев 2'-O-алкил-РНК, 2'-О-метил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, звеньев МОЕ, звеньев LNA, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ANA) и звеньев 2'-фтор-ANA.

В некоторых воплощениях область F' содержит и LNA и 2'-замещенный модифицированный нуклеозид. Они часто называются олигонуклеотидами со смешанными крыльями или со смешанными флангами.

В одном воплощении изобретения все модифицированные нуклеозиды в области F' представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении все нуклеозиды в области F' представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении нуклеозиды LNA в области F' независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA, амино-LNA, сЕТ и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В предпочтительном воплощении область F' содержит по меньшей мере два звена бета-D-окси LNA на 3'-конце непрерывной последовательности. В другом предпочтительном воплощении область F' состоит из бета-D-окси LNA нуклеозидов.

Область D' и D''

Область D' и D'' может быть присоединена к 5'-концу области F или к 3'-концу области F' соответственно.

Область D' и D'' может независимо содержать 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов, которые могут быть комплементарными или некомплементарными нуклеиновой кислоте-мишени. В данном отношении олигонуклеотид по изобретению может в некоторых воплощениях содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, способную модулировать мишень, которая фланкирована на 5'- и/или 3'-конце дополнительными нуклеотидами. Такие дополнительные нуклеотиды могут служить в качестве нуклеазочувствительного биорасщепляемого линкера (см. определение линкеров). В некоторых воплощениях дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеотиды связаны фосфодиэфирными связями и могут представлять собой ДНК или РНК. В другом воплощении дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеотиды представляют собой модифицированные нуклеотиды, которые могут быть включены, например, для увеличения нуклеазоустойчивости или для легкости синтеза. В одном воплощении олигонуклеотид по изобретению содержит область D' и/или D'', помимо непрерывной нуклеотидной последовательности.

Гэпмерный олигонуклеотид по настоящему изобретению может быть представлен следующими формулами:

F-G-F'; в частности, F_1-7-G_4-12-F'_1-7

D'-F-G-F', в частности, D'_1-3-F_1-7-G_4-12-F'_1-7

F-G-F'-D'', в частности, F_1-7-G_4-12-F'_1-7-D''_1-3

D'-F-G-F'-D'', в частности, D'_1-3-F_1-7-G_4-12-F'_1-7-D''_1-3

Предпочтительное число и типы нуклеозидов в областях F, G и F', D' и D'' были описаны выше.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид представляет собой гэпмер, состоящий из 14-20 нуклеотидов в длину, где каждая из областей F и F' независимо состоит из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозных звеньев, и область G состоит из 6-17 нуклеозидных звеньев, способных рекрутировать нуклеазу при нахождении в дуплексе с нуклеиновой кислотой-мишенью PAPD5 или PAPD7, и где данный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени PAPD5 или PAPD7.

Во всех случаях конструкция F-G-F' может дополнительно включать область D' и/или D'', которая может иметь 1, 2 или 3 нуклеозидных звена, таких как звенья ДНК. Предпочтительно нуклеозиды в области F и F' представляют собой модифицированные нуклеозиды, тогда как нуклеотиды в области G представляют собой немодифицированные нуклеозиды.

При каждой конструкции предпочтительным модифицированным нуклеозидом является LNA.

В другом воплощении все межнуклеозидные связи в гэпе в гэпмере представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. В другом воплощении все межнуклеозидные связи во флангах (области F и F') в гэпмере представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. В другом предпочтительном воплощении все межнуклеозидные связи в области D' и D'' в гэпмере представляют собой фосфодиэфирные связи.

Для специфических гэпмеров, как раскрыто в данном документе, когда остатки цитозина (С) аннотируются как 5-метил-цитозин, в разных воплощениях один или более чем один С, присутствующий в олигонуклеотиде, может представлять собой немодифицированные остатки С.

Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO: от 12_1 до 131_1 (см. олигонуклеотиды, перечисленные в Таблице 3).

Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO: 15_1, 18_1, 23_1, 25_1, 26_1, 30_, 32_1, 39_1, 54_1, 56_1, 58_1, 65_1, 80_1, 88_1, 92_1, 93_1, 111_1, 115_1, 116_1 и 118_1 (см. олигонуклеотиды, перечисленные в Таблице 3).

Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO: 23_1, 26_1, 54_1, 56_1, 80_1, 93_1 и 115_1.

Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO: от 132_ до 251_1 (см. олигонуклеотиды, перечисленные в Таблице 4).

Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO: 153_1, 155_1, 168_1, 171_1, 172_1, 174_1, 183_1, 184_1, 188_1, 190_1, 191_1, 194_1, 195_1, 197_1, 221_1, 224_1, 229_1, 232_1, 239_1 и 244_1 (см. олигонуклеотиды, перечисленные в Таблице 4).

Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO: 172_1, 188_1, 190_1, 229_1 и 237_1.

Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотид, выбранный из группы олигонуклеотидных соединений с CMP ID NO: 18_1, 25_1, 26_1, 32_1, 39_1, 54_1, 56_1, 80_1, 92_1, 93_1, 116_1 и 118_1, и б) олигонуклеотид, выбранный из группы олигонуклеотидных соединений с CMP ID NO: 153_1, 155_1, 168_1, 171_1, 172_1, 174_1, 183_1, 184_1, 188_1, 190_1, 191_1, 194_1, 195_1, 197_1, 221_1, 224_1, 229_1, 232_1, 23_19 и 244_1.

Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 18_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 221_1.

Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 23_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 172_1 или 188_1.

Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 25_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 174_1 или 183_1.

Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 26_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 183_1.

Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 39_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 229_1.

Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 54_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 190_1 или 232_1.

Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 56_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 153_1 или 244_1.

Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 80_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 153_1 или 244_1.

Одним воплощением изобретения является комбинированный препарат, содержащий: а) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 116_1 и б) олигонуклеотидное соединение с CMP ID NO: 155_1 или 195_1.

Применения

В контексте настоящего изобретения неожиданно было показано то, что комбинированное ингибирование PAPD5 и PAPD7 приводит к синергическому эффекту при ингибировании размножения HBV. В приложенных примерах показано то, что уменьшение экспрессии одного PAPD5 приводит к уменьшению секреции HBsAg и HBeAg примерно на 50%, подобным образом, уровень внутриклеточной мРНК HBV был снижен при использовании ингибитора PAPD5. Уменьшение экспрессии одного PAPD7 приводит к уменьшению секреции HBsAg и HBeAg не более чем на 15%. Одновременный нокдаун PAPD5 и PAPD7 приводит к синергическому эффекту при уменьшении секреции HBsAg и HBeAg, который находится выше суммы эффектов одиночных нокдаунов. Не будучи связанными теорией, данный синергический эффект может быть обусловлен компенсаторным эффектом PAPD5 и PAPD7, так как оба белка имеют высокую гомологию последовательности и одинаковые ферментативные функции. Из-за уменьшения секреции HBsAg ингибитор по настоящему изобретению ингибирует развитие хронической инфекции HBV. В частности, из-за ингибирования секреции HBeAg ингибитор по настоящему изобретению более эффективно ингибирует развитие хронической инфекции HBV по сравнению с соединением, которое только уменьшает секрецию HBsAg. Кроме того, уменьшение уровня HBeAg у будущей матери также может ингибировать развитие хронической инфекции HBV ее ребанка. Таким образом, из-за уменьшения секреции HBeAg ингибитор по настоящему изобретению ингибирует развитие хронической инфекции HBV (как, например, развитие хронической инфекции HBV у потомства матери, инфицированной HBV) и уменьшает зараженность человека, инфицированного HBV. Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к предложенному в данном документе ингибитору, где данный ингибитор уменьшает секрецию HBsAg и HBeAg. В соответствии с этим, другой аспект данного изобретения относится к предложенному в данном документе ингибитору, в частности, к молекуле нуклеиновой кислоты или к комбинации молекул нуклеиновых кислот, где данный ингибитор ингибирует развитие хронической инфекции HBV и уменьшает зараженность человека, инфицированного HBV. В конкретном аспекте изобретения предложенный в данном документе ингибитор ингибирует развитие хронической инфекции HBV у потомства матери, инфицированной HBV. Данная мать предпочтительно является HBeAg-позитивной.

Субъектом, подлежащим лечению ингибитором по изобретению (или который получает ингибитор по настоящему изобретению профилактически), предпочтительно является человек, более предпочтительно человеческий пациент, который является HBsAg-позитивным и/или HBeAg-позитивным, даже более предпочтительно человеческий пациент, который является HBsAg-позитивным и HBeAg-позитивным. Указанным человеческим пациентом может быть будущая мать, например, будущая мать, которая является HBeAg-позитивной и/или HBsAg-позитивной, более предпочтительно будущая мать, которая является HBeAg-позитивной и HBsAg-позитивной.

Одно воплощение настоящего изобретения относится к ингибитору PAPD5, в частности, к молекуле нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5, для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV, в частности, хронической инфекции HBV. Другое воплощение настоящего изобретения относится к комбинированному препарату, содержащему ингибитор PAPD5 и ингибитор PAPD7, для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV, в частности, хронической инфекции HBV. В предпочтительном воплощении комбинированная композиция для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV содержит а) молекулу нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5; и б) молекулу нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD7. Таким образом, настоящее изобретение относится к комбинированному препарату, содержащему ингибитор PAPD5 и ингибитор PAPD7, для одновременного или последовательного применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV.

Настоящее изобретение также относится к комбинированному препарату, содержащему а) молекулу нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5; и б) молекулу нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD7. В контексте данного изобретения рассматривается то, что указанный комбинированный препарат используется для лечения (например, уменьшения интенсивности) инфекции HBV. Определения, раскрытые в данном документе в связи с ингибитором по настоящему изобретению, применимы, с учетом необходимых изменений, к комбинированному препарату по настоящему изобретению. Данный комбинированный препарат может содержать молекулу, которая является ингибитором PAPD5, и отдельную молекулу, которая является ингибитором PAPD7 (например, две отдельные молекулы РНКи, такие как молекулы миРНК, кшРНК и антисмысловые олигонуклеотиды или две отдельные маленькие молекулы). Эти два отдельных ингибитора могут быть приготовлены в одной единице, например, в одной пилюле или флаконе. В качестве альтернативы, данные два отдельных ингибитора могут быть приготовлены отдельно, в отдельных единицах, например, отдельных пилюлях или флаконах. Два отдельных ингибитора могут вводиться совместно (т.е. одновременно) или раздельно (т.е. последовательно), при условии, что достигается синергический эффект двух ингибиторов. В одном аспекте изобретения данный комбинированный препарат приводит к уменьшению секреции HBsAg и HBeAg по меньшей мере на 50% по сравнению с контролем без лекарственного средства (т.е. по сравнению с клетками или субъектами, которым не вводится лекарственное средство).

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для применения в лечении и/или предупреждении инфекции, где данная фармацевтическая композиция содержит:

(i) ингибитор по изобретению или комбинированный препарат по изобретению; и

(ii) возможно фармацевтически приемлемый носитель.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или предупреждения инфекции HBV, где данный способ включает введение эффективного количества ингибитора по изобретению, в частности, молекулы нуклеиновой кислоты, конъюгата ингибитора, фармацевтической композиции по изобретению или комбинированного препарата по изобретению субъекту, нуждающемуся в таком лечении.

Согласно данному изобретению также предложено применение ингибитора по изобретению, в частности, молекулы нуклеиновой кислоты, конъюгата ингибитора, фармацевтической композиции по изобретению или комбинированного препарата по изобретению для изготовления лекарственного средства. В предпочтительных воплощениях данное лекарственное средство изготовлено в лекарственной форме для подкожного введения, и для комбинированного препарата соотношение ингибитора PAPD5 и ингибитора PAPD7 составляет 1:1 по массе.

Согласно данному изобретению также предложено применение ингибитора по изобретению, в частности, молекулы нуклеиновой кислоты, конъюгата ингибитора, фармацевтической композиции по изобретению или комбинированного препарата по изобретению, как описано для изготовления лекарственного средства, где данное лекарственное средство находится в лекарственной форме для внутривенного введения, и для комбинированного препарата соотношение ингибитора PAPD5 и ингибитора PAPD7 составляет 1:1 по массе.

Ингибитор по изобретению, комбинированный препарат по изобретению или фармацевтическая композиция по изобретению могут использоваться в комбинированной терапии. Например, ингибитор по изобретению, комбинированный препарат по изобретению или фармацевтическую композицию по изобретению можно объединять с другими агентами против HBV, такими как интерферон-альфа-2b, интерферон-альфа-2а и интерферон-альфакон-1 (пегилированный и непегилированный), рибавирин, ламивудин (ЗТС), энтекавир, тенофовир, телбивудин (LdT), адефовир или другие появляющиеся агенты против HBV, такие как ингибитор репликации РНК HBV, ингибитор секреции HBsAg, ингибитор капсида HBV, антисмысловой олигомер (например, как описано в WO 2012/145697 и WO 2014/179629), миРНК (например, описанная WO 2005/014806, WO 2012/024170, WO 2012/2055362, WO 2013/003520, WO 2013/159109, WO 2017/027350 и WO 2017/015175), терапевтическая вакцина против HBV, профилактическая вакцина против HBV, терапия антителами против HBV (моноклональными или поликлональными) или агонистами TLR 2, 3, 7, 8 или 9 для лечения и/или профилактики HBV.

Приложенные примеры демонстрируют то, что понижающая регуляция PAPD5 и/или PAPD7 идет параллельно с уменьшением продукции HBsAg и HBeAg, а также внутриклеточной мРНК HBV в клетках, инфицированных HBV. Данные результаты показывают то, что количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 можно использовать для отслеживания терапевтического успеха во время лечения инфекции HBV, например, если лечение ингибитором PAPD5 и/или PAPD7 продолжается или было проведено. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу отслеживания терапевтического успеха во время лечения инфекции HBV, где данный способ включает:

(а) проведение анализа количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце, полученном от опытного субъекта,

(б) сравнение указанного количества и/или активности с контрольными данными, соответствующими количеству и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 по меньшей мере одного контрольного субъекта; и

(в) прогнозирование терапевтического успеха на основе стадии сравнения (б).

В способе отслеживания по изобретению опытный субъект может представлять собой человека, который получает лекарственное средство против инфекции HBV или получал лекарственное средство против инфекции HBV. Данное лекарственное средство может содержать агенты против HBV, как описано выше. Данное лекарственное средство также может содержать ингибитор PAPD5 и/или PAPD7.

В способе отслеживания по изобретению контрольные данные могут соответствовать количеству и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта. Указанный образец может представлять собой кровь или биопсию печени.

Один аспект данного изобретения относится к способу отслеживания по изобретению, в котором по меньшей мере один контрольный субъект имеет инфекцию HBV, но не получал лекарственное средство против инфекции HBV; и в котором на стадии (в) пониженное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 опытного субъекта по сравнению с контрольными данными показывает терапевтический успех в лечении инфекции HBV. Например, указанное пониженное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 могут означать то, что количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 в образце опытного субъекта составляют от 0 до 90% количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта. Например, указанное пониженное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 могут составлять от 0 до 80%, предпочтительно от 0 до 70%, более предпочтительно от 0 до 60%, даже более предпочтительно от 0 до 50%, даже более предпочтительно от 0 до 40%, даже более предпочтительно от 0 до 30%, даже более предпочтительно от 0 до 20% и наиболее предпочтительно от 0 до 10% количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта.

Другой аспект данного изобретения относится к способу отслеживания по изобретению, в котором по меньшей мере один контрольный субъект имеет инфекцию HBV и получал лекарственное средство против инфекции HBV; и в котором на стадии (в) идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 опытного субъекта по сравнению с контрольными данными показывает терапевтический успех в лечении инфекции HBV. Другой аспект данного изобретения относится к способу отслеживания по изобретению, в котором по меньшей мере один контрольный субъект не имеет инфекции HBV; и в котором на стадии (в) идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 опытного субъекта по сравнению с контрольными данными показывает терапевтический успех в лечении инфекции HBV. Идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 может означать то, что количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 в образце опытного субъекта составляет 90-110% количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта. Например, указанное идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 может составлять 95-105% количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта.

Также настоящим изобретением охватывается клетка или животное, не являющееся человеком (например, мышь, крыса, хорек или кролик), с повышенной, пониженной или отсутствующей экспрессией PAPD5 и/или PAPD7, которых можно использовать для идентификации и/или характеристики соединения, которое предупреждает и/или лечит (например, уменьшает интенсивность) инфекции HBV. Например, указанная клетка или животное, не являющееся человеком, может содержать экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую PAPD5 и/или PAPD7, например, клонированную в экспрессионный вектор и связанную функциональным образом с экзогенным промотором. Указанная клетка или животное, не являющееся человеком, может сверхэкспрессировать PAPD5 и/или PAPD7, предпочтительно PAPD5 и PAPD7. В качестве альтернативы, указанная клетка или животное, не являющееся человеком, могут иметь нокдаун PAPD5 и/или PAPD7, предпочтительно PAPD5 и PAPD7.

Воплощения изобретения

Таким образом, настоящее изобретение относится к следующим пунктам:

1. Способ идентификации соединения, которое предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию вирусом гепатита В (HBV), включающий:

а. приведение в контакт тестируемого соединения с клеткой, экспрессирующей PAPD5 и/или PAPD7;

б. измерение экспрессии и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в присутствии и в отсутствие указанного тестируемого соединения; и

в. идентификацию соединения, которое уменьшает экспрессию и/или активность PAPD5 или PAPD7, в качестве соединения, которое предупреждает, уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию тестирования способности комбинаций соединений, идентифицированных в в), уменьшать экспрессию и/или активность PAPD5 и PAPD7.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором PAPD5 представляет собой нуклеиновую кислоту-мишень PAPD5.

4. Способ по п. 3, в котором нуклеиновая кислота-мишень PAPD5 содержит или состоит из:

а. нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 или 5, или 10, или ее природного варианта;

б. нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью а.), где полипептид, экспрессируемый от данной последовательности нуклеиновой кислоты, имеет функцию поли-А полимеразы;

в. нуклеотидной последовательности, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 или 10;

г. нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2;

д. нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1 или 2, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы;

е. нуклеотидной последовательности, кодирующей ферментативно активный фрагмент SEQ ID NO: 1 или 2, такой как SEQ ID NO: 7 или 8; или

ж. нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью ферментативно активного фрагмента SEQ ID NO: 1 или 2, такой как SEQ ID NO: 7 или 8, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы.

5. Способ по п. 1 или 2, в котором PAPD7 представляет собой нуклеиновую кислоту-мишень PAPD7.

6. Способ по п. 5, в котором нуклеиновая кислота-мишень PAPD7 содержит или состоит из:

а. нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6 или 11, или ее природного варианта;

б. нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью а.), где полипептид, экспрессируемый от данной последовательности нуклеиновой кислоты, имеет функцию поли-А полимеразы;

в. нуклеотидной последовательности, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 6 или 11;

г. нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;

д. нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID NO: 3, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы;

е. нуклеотидной последовательности, кодирующей ферментативно активный фрагмент SEQ ID NO: 3, такой как SEQ ID NO: 9; или

ж. нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью ферментативно активного фрагмента SEQ ID NO: 3, такой как SEQ ID NO: 9, где данный полинуклеотид кодирует полипептид, который имеет функцию поли-А полимеразы.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором указанная клетка представляет собой эукариотическую клетку.

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором соединение, которое ингибирует размножение HBV, ингибирует секрецию антигена поверхности HBV (HBsAg), ингибирует секрецию антигена оболочки HBV (HBeAg) и/или ингибирует продукцию внутриклеточной мРНК HBV или ДНК HBV.

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором тестируемое соединение представляет собой предназначенную для скрининга библиотеку молекул нуклеиновых кислот, выбранных из:

а. одноцепочечных антисмысловых олигонуклеотидов или

б. молекул миРНК; и

в. молекул кшРНК.

10. Способ по любому из пп. 1-9, в котором соединение, идентифицированное на стадии в. п. 1, уменьшает экспрессию мРНК PAPD5 или PAPD7 по меньшей мере на 50%.

11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором тестируемое соединение представляет собой комбинированный препарат молекулы нуклеиновой кислоты, способной уменьшать уровень PAPD5, и молекулы нуклеиновой кислоты, способной уменьшать уровень PAPD7.

12. Способ по п. 11, в котором комбинированный препарат уменьшает уровень антигена поверхности HBV (HBsAg), антигена оболочки HBV (HBeAg) и/или внутриклеточной мРНК HBV или ДНК HBV по меньшей мере на 70%.

13. Способ по любому из пп. 1-12, который дополнительно включает стадию сравнения опытного соединения с контролем.

14. Способ по п. 13, в котором указанный контроль представляет собой неактивное тестируемое соединение, которое не уменьшает экспрессию и/или активность PAPD5 или PAPD7.

15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором активностью PAPD5 и PAPD7 является функция поли-А полимеразы.

16. Ингибитор PAPD5 или PAPD7 для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV, где указанный ингибитор представляет собой:

а. молекулу РНК-интерференции (РНКи) против PAPD5 или PAPD7; или

б. аппарат редактирования генома, содержащий:

i. сайт-специфичную ДНК-нуклеазу или полинуклеотид, кодирующий сайт-специфичную ДНК-нуклеазу; и

ii. РНК-проводник или полинуклеотид, кодирующий РНК-проводник.

17. Ингибитор для применения по п. 16, где данный ингибитор представляет собой молекулу РНКи, выбранную из группы, состоящей из:

а. одноцепочечного антисмыслового олигонуклеотида;

б. молекулы миРНК; и

в. молекулы кшРНК.

18. Ингибитор для применения по п. 16 или 17, где данный ингибитор представляет собой комбинированный препарат, содержащий:

а. молекулу РНКи, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5; и

б. молекулу РНКи, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD7.

19. Ингибитор для применения по любому из пп. 16-18, где данный ингибитор снижает секрецию HBsAg и HBeAg.

20. Ингибитор для применения по любому из пп. 16-18, где данный ингибитор уменьшает продукцию внутриклеточной мРНК HBV или ДНК HBV.

21. Ингибитор для применения по любому из пп. 16-20, где данный ингибитор ингибирует развитие хронической инфекции HBV и/или уменьшает зараженность человека, инфицированного HBV.

22. Антисмысловой олигонуклеотид или молекула миРНК, которая содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности из 10-30 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 80% комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени PAPD5, и данный антисмысловой олигонуклеотид способен понижать экспрессию PAPD5.

23. Молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности из 10-30 нуклеотидов в длину, где данная непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 80% комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени PAPD7, и антисмысловой олигонуклеотид способен понижать экспрессию PAPD7.

24. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 23, где данная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид.

25. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 22, где данный олигонуклеотид способен к гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 и 10, с ΔG° меньше -41,87 кДж.

26. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 23 или 24, где данный олигонуклеотид способен к гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, выбранной из SEQ ID NO: 6 или 11, с ΔG° меньше -41,87 кДж.

27. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-26, где нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК.

28. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 27, где РНК представляет собой мРНК.

29. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 28, где мРНК представляет собой пре-мРНК или зрелую мРНК.

30. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-29, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 12-22 нуклеотидов.

31. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 30, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 14-20 нуклеотидов.

32. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-31, где данный антисмысловой олигонуклеотид содержит или состоит из 12-25 нуклеотидов в длину.

33. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-32, где данный олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность является одноцепочечной.

34. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-32, где данный олигонуклеотид не является ни миРНК, ни комплементарным самому себе.

35. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22 или 25, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 12-131.

36. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 35, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 15, 18, 23, 25, 26, 30, 32, 39, 54, 56, 58, 65, 80, 88, 92, 93, 111, 115, 116 и 118.

37. Молекула нуклеиновой кислоты или антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 23, 24 или 26, где непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 132-151.

38. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 37, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 153, 155, 168, 171, 172, 174, 183, 184, 188, 190, 191, 194, 195, 197, 221, 224, 229, 232, 239 и 244.

39. Молекула антисмыслового олигонуклеотида по любому из пп. 22-38, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность имеет от нуля до трех несоответствий по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью, которой она комплементарна.

40. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 39, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет одно несоответствие по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью.

41. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 39, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность является полностью комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.

42. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-41, содержащий один или более чем один модифицированный нуклеозид.

43. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 42, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой высокоаффинный модифицированный нуклеозид.

44. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-43, где данный антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.

45. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 44, в котором модифицированная межнуклеозидная связь является нуклеазоустойчивой.

46. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 44 или 45, в котором по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями или боранофосфатными межнуклеозидными связями.

47. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 44 или 45, в котором все межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями.

48. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22-47, где данный олигонуклеотид способен рекрутировать РНКазу Н.

49. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 48, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер.

50. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 48 или 49, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер формулы 5'-F-G-F'-3', в котором область F и F' независимо содержит или состоит из 1-4 модифицированных нуклеозидов, и G представляет собой область из 6-17 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазуН.

51. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 42-44 или 50, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид, модифицированный 2' сахаром, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и нуклеозидов LNA.

52. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 50 или 51, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F и F' представляет собой нуклеозид LNA.

53. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 52, в котором все модифицированные нуклеозиды в области F и F' представляет собой нуклеозиды LNA.

54. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 53, в котором область F и F' состоит из нуклеозидов LNA.

55. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 51-54, в котором нуклеозид LNA выбран из бета-D-окси-LNA, альфа-L-окси-LNA, бета-D-амино-LNA, альфа-L-амино-LNA, бета-D-тио-LNA, альфа-L-тио-LNA, (S)cET, (R)cET, бета-D-ENA и альфа-L-ENA.

56. Олигонуклеотид по любому из пп. 51-54, в котором нуклеозид LNA представляет собой окси-LNA.

57. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 51-56, в котором нуклеозид LNA представляет собой бета-D-окси-LNA.

58. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 51-54, в котором нуклеозид LNA представляет собой тио-LNA.

59. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 51-54, в котором нуклеозид LNA представляет собой амино-LNA.

60. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 51-54, в котором нуклеозид LNA представляет собой сЕТ.

61. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 51-54, в котором нуклеозид LNA представляет собой ENA.

62. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 52, в котором по меньшей мере одна из областей F или F' дополнительно содержит по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК и 2'-фтор-ДНК.

63. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 52-62, в котором нуклеозиды, рекрутирующие РНКазу Н в области G, независимо выбраны из ДНК, альфа-L-LNA, С4'-алкилированной ДНК, ANA, 2' F-ANA и UNA.

64. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 50 или 63, в котором нуклеозиды в области G представляют собой нуклеозиды ДНК.

65. Антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп. 22 или 25, где данный антисмысловой олиг онуклеотид выбран из CMP ID NO: от 12_1 до 131_1.

66. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 65, где антисмысловое соединение выбрано из CMP ID NO: 15_1, 18_1, 23_1, 25_1, 26_1, 30_, 32_1, 39_1, 54_1, 56_1, 58_1, 65_1, 80_1, 88_1, 92_1, 93_1, 111_1, 115_1, 116_1 и 118_1.

67. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 24, где данный антисмысловой олигонуклеотид выбран из CMP ID NO: от 132_ до 151_1.

68. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 67, где антисмысловое соединение выбрано из CMP ID NO: 153_1, 155_1, 168_1, 171_1, 172_1, 174_1, 183_1, 184_1, 188_1, 190_1, 191_1, 194_1, 195_1, 197_1, 221_1, 224_1, 229_1, 232_1, 239_1 и 244_1.

69. Молекула миРНК по п. 22, где молекула миРНК нацелена на последовательность-мишень PAPD5, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 252, 253, 254 и 255.

70. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 23, где данная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу миРНК, нацеленную на последовательность-мишень PAPD7, выбранную из одной или более чем одной из SEQ ID NO: 256, 257, 258 и 259.

71. Конъюгат, содержащий антисмысловой олигонуклеотид или миРНК по любому из пп. 22-70 и по меньшей мере одну конъюгатную группировку, ковалентно присоединенную к указанному олигонуклеотиду.

72. Конъюгат по п. 71, в котором конъюгатная группировка выбрана из углеводов, лигандов рецепторов поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов, витаминов, вирусных белков или их комбинаций.

73. Конъюгат по п. 71 или 72, в котором конъюгатная группировка способна связываться с рецептором асиалогликопротеина.

74. Конъюгат по любому из пп. 71-73, содержащий линкер, который расположен между антисмысловым олигонуклеотидом и конъюгатной группировкой.

75. Конъюгат по п. 74, в котором линкер представляет собой физиологически лабильный линкер.

76. Конъюгат по п. 75, в котором физиологически лабильный линкер представляет собой нуклеазочувствительный линкер.

77. Конъюгат по п. 75 или 76, в котором олигонуклеотид имеет формулу D'-F-G-F' или F-G-F'-D'', где F, F' и G являются такими, как определено в любом из пп. Ошибка! Источник ссылки не найден.52-Ошибка! Источник ссылки не найден.65, и D' или D'' содержит 1, 2 или 3 нуклеозида ДНК с фосфоротиоатными межнуклеозидными связями.

78. Комбинированный препарат, содержащий:

а. молекулу РНКи, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD5; и

б. молекулу РНКи, которая ингибирует экспрессию и/или активность PAPD7.

79. Комбинированный препарат по п. 78, в котором молекулы РНКи выбраны из пп. 22-70 или конъюгата по любому из пп. 71-77.

80. Комбинированный препарат по п. 78, в котором молекула РНКи в а) представляет собой антисмысловые соединения по п. 36 или 66, и где молекула РНКи в б) представляет собой антисмысловые соединения по п. 38 или 68.

81. Фармацевтическая композиция, содержащая антисмысловой олигонуклеотид или молекулу миРНК по любому из пп. 22-70, или конъюгат по любому из пп. 71-77, или комбинированный препарат по пп. 78-80 и возможно фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль и/или адъювант.

82. Способ in vivo или in vitro модулирования экспрессии PAPD5 и/или PAPD7 в клетке-мишени, которая экспрессирует PAPD5 и/или PAPD7, причем указанный способ включает введение антисмыслового олигонуклеотида или молекулы миРНК по пп. 22-70 или конъюгата по пп. 71-77, или комбинированного препарата по п. 78 или 79, или фармацевтической композиции по п. 81 в эффективном количестве в указанную клетку.

83. Способ лечения или предупреждения заболевания, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества антисмыслового олигонуклеотида или молекулы миРНК по пп. 22-70, или конъюгата по пп. 71-77, или комбинированного препарата по пп. 78-80, или фармацевтической композиции по п. 81 субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию.

84. Антисмысловой олигонуклеотид или молекула миРНК по пп. 22-70, или конъюгат по пп. 71-77, или комбинированный препарат по пп. 78-80, или фармацевтическая композиция по п. 81 для применения в качестве лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания у субъекта.

85. Применение олигонуклеотида или молекулы миРНК по пп. 22-70, или конъюгата по пп. 71-77, или комбинированного препарата по пп. 78-80 для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания у субъекта.

86. Способ, антисмысловой олигонуклеотид или применение по любому из пп. 83-85, где уровень PAPD5 и/или PAPD7 уменьшается по меньшей мере на 30% или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% по сравнению с экспрессией без антисмыслового олигонуклеотида или молекулы миРНК по пп. 22-70 или конъюгата по пп. 71-77, или комбинированного препарата по пп. 78-80.

87. Способ, антисмысловой олигонуклеотид или применение по пп. 83-85, где заболевание выбрано из инфекции HBV, в частности, хронической инфекции HBV.

88. Способ отслеживания терапевтического успеха во время лечения инфекции HBV, где данный способ включает:

а. проведение анализа в образце, полученном от опытного субъекта, количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7;

б. сравнение указанного количества и/или активности с контрольными данными, соответствующими количеству и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 по меньшей мере одного контрольного субъекта; и

в. прогнозирование терапевтического успеха на основе стадии сравнения (б).

89. Способ отслеживания по п. 88, в котором опытный субъект представляет собой человека, который получает лекарственное средство против инфекции HBV или получал лекарственное средство против инфекции HBV.

90. Способ отслеживания по п. 88 или 89, в котором контрольные данные соответствуют количеству и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта.

91. Способ отслеживания по любому из пп. 88-90, в котором по меньшей мере один контрольный субъект имеет инфекцию HBV, но не получал лекарственное средство против инфекции HBV; и в котором на стадии (в) пониженное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 опытного субъекта по сравнению с контрольными данными показывает терапевтический успех в лечении инфекции HBV.

92. Способ отслеживания по п. 91, в котором указанное пониженное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 означает то, что количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 в образце опытного субъекта составляет от 0 до 90% количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта.

93. Способ отслеживания по любому из пп. 88-90, в котором по меньшей мере один контрольный субъект имеет инфекцию HBV и получал лекарственное средство против инфекции HBV; и в котором на стадии (в) идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 опытного субъекта по сравнению с контрольными данными показывает терапевтический успех в лечении инфекции HBV.

94. Способ отслеживания по любому из пп. 88-90, в котором по меньшей мере один контрольный субъект не имеет инфекцию HBV; и в котором на стадии (в) идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 опытного субъекта по сравнению с контрольными данными показывает терапевтический успех в лечении инфекции HBV.

95. Способ отслеживания по п. 93 или 94, в котором указанное идентичное или аналогичное количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 означает то, что количество и/или активность PAPD5 и/или PAPD7 в образце опытного субъекта составляет от 90-110% количества и/или активности PAPD5 и/или PAPD7 в образце по меньшей мере одного контрольного субъекта.

Фармацевтические композиции

Как описано выше, данное изобретение относится к композиции, содержащей ингибитор PAPD5, один или в комбинации с ингибитором PAPD7, для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV. Данный ингибитор предпочтительно представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, как определено в данном документе. В частности, рассматривается комбинированный препарат, содержащей ингибитор PAPD5 и ингибитор PAPD7, для применения в лечении и/или предупреждении инфекции HBV; и фармацевтическая композиция, содержащая указанную композицию ингибитора или указанный комбинированный препарат. Указанная фармацевтическая композиция (т.е. лекарственное средство) возможно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Указанная фармацевтическая композиция может дополнительно содержать терапевтически приемлемый разбавитель, соль, эксципиент и/или адъювант.

Типичную фармацевтическую композицию готовят смешиванием ингибитора PAPD5, одного или с ингибитором PAPD7, и носителя или эксципиента. Подходящие носители и эксципиенты являются хорошо известными специалистам в данной области и подробно описываются, например, в Ansel,

Подходящие препараты для молекул нуклеиновых кислот находятся в

Соединения согласно настоящему изобретению могут существовать в виде их фармацевтически приемлемых солей. Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к традиционным солям присоединения кислоты или солям присоединения основания, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединений по настоящему изобретению и образуются из подходящих нетоксичных органических или неорганических кислот, или органических или неорганических оснований. Соли присоединения кислоты включают, например, соли, происходящие из неорганических кислот, таких как соляная кислота, бромисто-водородная кислота, йодисто-водородная кислота, серная кислота, сульфаминовая кислота, фосфорная кислота и азотная кислота, и соли, происходящие из органических кислот, таких как п-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота и тому подобное. Соли присоединения основания включают соли, полученные из аммония, калия, натрия и гидроксидов четвертичного аммония, таких как, например, гидроксид тетраметиламмония. Химическая модификация фармацевтического соединения до соли представляет собой методику, хорошо известную химикам-фармацевтам, для того, чтобы получать улучшенную физическую и химическую стабильность, гигроскопичность, текучесть и растворимость соединений. Она, например, описывается в Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435 или в Ansel, в: Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed. (1995), pp. 196 и 1456-1457. Например, фармацевтически приемлемая соль соединений, предложенных в данном документе, может представлять собой натриевую соль.

Фармацевтическую композицию по изобретению готовят, дозируют и вводят способом, совместимым с надлежащей медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в данном контексте включают конкретное животное, которое лечат, клиническое состояние индивидуального пациента, место доставки агента, способ введения, схему введения, возраст и пол пациентов, и другие факторы, известные практикующим врачам. В данном документе термин «эффективное количество» (также известное как «(терапевтически) эффективная доза») означает количество соединения, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ субъекта, которого пытается добиться врач или другой медицинский работник. «Эффективное количество» ингибитора по изобретению, комбинированного препарата по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению будет управляться такими соображениями, и оно представляет собой минимальное количество, необходимое для ингибирования HBsAg и/или HBeAg. Например, такое количество может быть меньше количества, которое является токсичным для клеток реципиента или млекопитающего в целом.

Например, если ингибитор PAPD5 или ингибитор PAPD7 представляет(ют) собой антисмысловой олигонуклеотид, тогда введенное фармацевтически эффективное количество составляет дозу 0,1-15 мг/кг, как, например, 0,2-10 мг/кг, как, например, 0,25-5 мг/кг. Введение может осуществляться один раз в неделю, каждую 2-ую неделю, каждую третью неделю или даже один раз в месяц.

Молекулы нуклеиновых кислот или фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут вводиться местно (как, например, на кожу, ингаляцией, глазным или ушным путем) или энтерально (как, например, перорально или через желудочно-кишечный тракт), или парентерально (как, например, внутривенно, подкожно, внутримышечно, интрацеребрально, интрацеребровентрикулярно или интратекально).

В предпочтительном воплощении молекула нуклеиновой кислоты или фармацевтические композиции по настоящему изобретению вводятся парентеральным путем, включающим внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию, подоболочечное или внутричерепное, например, интрацеребральное или интравентрикулярное, интравитральное введение. В одном воплощении активный олигонуклеотид или олигонуклеотидный конъюгат вводится внутривенно. В другом воплощении молекула активной нуклеиновой кислоты или конъюгат молекулы нуклеиновой кислоты вводится подкожно.

Ингибитор по изобретению, комбинированный препарат по изобретению или фармацевтическая композиция по изобретению является полезной в предупреждении и/или лечении HBV по изобретению. Они предпочтительно ингибируют секрецию HBsAg и/или HBeAg, наиболее предпочтительно - HBsAg и HBeAg.

Определения

Нуклеотидная последовательность

Термин «нуклеотидная последовательность» или «полинуклеотид» является общеизвестным в данной области и включает молекулы, содержащие или состоящие из встречающихся в природе молекул, таких как ДНК и РНК, а также аналогов нуклеиновых кислот, таких как, например, трифосфаты олигонуклеотидов, замещенные рибоолигонуклеотиды, молекулы LNA, молекулы PNA, молекулы GNA (гликольнуклеиновая кислота), молекулы TNA (треозонуклеиновая кислота), морфолинополинуклеотиды или нуклеиновые кислоты с модифицированными остовами, такими как полисилоксан и 2'-O-(2-метокси)этил-фосфоротиоат, или нуклеиновая кислота с заместителями, такими как метил-, тио-, сульфат, бензоил-, фенил-, амино-, пропил-, хлор- и метанокарбануклеозиды, или репортерные молекулы для облегчения ее выявления. Кроме того, термин «нуклеотидная последовательность» в контексте настоящего изобретения следует истолковывать эквивалентно термину «молекула нуклеиновой кислоты», и, среди прочих, он может относиться к ДНК, РНК, PNA или LNA, или их гибридам, или их любой модификации, которая известна в данной области (см., например, US 5525711, US 4711955, US 5792608 или ЕР 302175 для примеров модификаций). Остатки нуклеиновой кислоты, содержащиеся в описанной последовательности нуклеиновой кислоты и предложенные в данном документе, могут представлять собой встречающиеся в природе остатки нуклеиновых кислот или остатки нуклеиновых кислот, полученные искусственно. Примерами остатков нуклеиновых кислот являются аденин (А), гуанин (G), цитозин (С), тимин (Т), урацил (U), ксантин (X) и гипоксантин (НХ). Как понятно специалисту в данной области, тимин (Т) и урацил (U) можно использовать взаимозаменяемо, в зависимости от соответствующего типа полинуклеотида. Например, как известно специалисту, тимин (Т) как часть ДНК соответствует урацилу (U) как части соответствующей транскрибированной мРНК. Полинуклеотиды, описанные и предложенные в данном документе, могут быть одно- или двухцепочечными, линейными или кольцевыми, природными или синтетическими.

Нуклеотидные последовательности, предложенные в данном документе, могут быть клонированы в вектор. Термин «вектор» в том виде, в котором он используется в данном документе, включает плазмиды, космиды, вирусы, бактериофаги и другие векторы, обычно используемые в генной инженерии. В предпочтительном воплощении данные векторы подходят для трансформации клеток, подобных клеткам млекопитающих или клеткам дрожжей. В данном документе вектор может представлять собой экспрессионный вектор. В общем, экспрессионные векторы были широко описаны в литературе. Они могут содержать селектируемый маркерный ген и репликатор, обеспечивающий репликацию у хозяина, промотор и сигнал терминации для транскрипции. Между промотором и сигналом терминации может быть по меньшей мере один сайт рестрикции или полилинкер, который делает возможной вставку последовательности нуклеиновой кислоты, желательной для экспрессии. Неограничивающие примеры вектора, в который можно клонировать предложенную в данном документе нуклеотидную последовательность, представляют собой аденовирусные, на основе аденосателлитного вируса (AAV), лентивирусные, лентивирусные на основе ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), невирусные миникольцевые векторы или другие векторы для бактериальных и эукариотических систем экспрессии.

Молекула нуклеиновой кислоты

Термин «молекула нуклеиновой кислоты» или «терапевтическая молекула нуклеиновой кислоты» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется, как его обычно понимает специалист: как молекула, содержащая два или более чем два ковалентно связанных нуклеозида (т.е. нуклеотидная последовательность). Молекула(лы) нуклеиновой кислоты, на которые дается ссылка в способе по изобретению, обычно представляют собой терапевтические олигонуклеотиды меньше 50 нуклеотидов в длину. Молекулы нуклеиновой кислоты могут представлять собой или содержат антисмысловой олигонуклеотид или могут представлять собой другую олигомерную молекулу нуклеиновой кислоты, такую как РНК CRISPR, миРНК, кшРНК, аптамер или рибозим. Молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой композиции, которые обычно получают в лаборатории посредством твердофазного химического синтеза, с последующей очисткой. При ссылке на последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, делается ссылка на последовательность или порядок группировок нуклеиновых оснований или их модификаций ковалентно связанных нуклеотидов или нуклеозидов. Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению является искусственной, синтезируется химически и типично очищается или выделяется. Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать один или более чем один модифицированный нуклеозид или нуклеотид.

В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит или состоит из 8-40 нуклеотидов в длину, как, например, из 9-35, как, например, из 10-30, как, например, из 11-22, как, например, из 12-20, как, например, из 13-18 или 14-16 непрерывных нуклеотидов в длину.

В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты или ее непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 22 или менее нуклеотидов, как, например, 20 или менее нуклеотидов, как, например, 18 или менее нуклеотидов, как, например, 14, 15, 16 или 17 нуклеотидов. Следует понимать то, что любой интервал, приведенный в данном документе, включает конечные точки интервала. Соответственно, если указано то, что молекула нуклеиновой кислоты включает от 10 до 30 нуклеотидов, включаются и 10, и 30 нуклеотидов.

В некоторых воплощениях непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 непрерывных нуклеотидов в длину.

Молекула(лы) нуклеиновой кислоты типично служит(жат) для модулирования экспрессии нуклеиновых кислот-мишеней у млекопитающего. В некоторых воплощениях молекулы нуклеиновых кислот, такие как миРНК, кшРНК и антисмысловые олигонуклеотиды, типично служат для ингибирования экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени. Молекулы нуклеиновой кислоты, при объединении, могут, следовательно, быть эффетивными в модулировании экспрессии одной или более чем одной нуклеиновой кислоты-мишени у млекопитающего.

В одном воплощении изобретения молекула нуклеиновой кислоты выбрана из реактива на основе РНКи, такой как миРНК, кшРНК или антисмысловой олигонуклеотид. В предпочтительных воплощениях молекула нуклеиновой кислоты представляет собой высокоаффинный модифицированный антисмысловой олигонуклеотид.

В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу фосфоротиоатной нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты содержит фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

В некоторых воплощениях молекула(лы) нуклеиновой кислоты может(гут) быть конъюгированы с ненуклеозидными группировками (конъюгатными группировками).

Библиотеку молекул нуклеиновой кислоты следует понимать как набор вариантов молекул нуклеиновой кислоты. Цель библиотеки молекул нуклеиновой кислоты может варьировать. В некоторых воплощениях библиотека молекул нуклеиновой кислоты состоит из олигонуклеотидов с разными последовательностями нуклеиновых оснований, например, она может представлять собой библиотеку молекул нуклеиновой кислоты, которая сконструирована по всей длине нуклеиновой кислоты-мишени (например, последовательности РНК), например, может быть получена библиотека антисмысловых олигонуклеотидов или молекул миРНК посредством «прогулки по гену» мРНК с целью идентификации областей на нуклеиновой кислоте-мишени, где молекулы нуклеиновой кислоты эффективно модулируют нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых воплощениях библиотека молекул нуклеиновой кислоты состоит из олигонуклеотидов с перекрывающейся последовательностью нуклеиновых оснований, нацеленной на конкретную область на нуклеиновой кислоте-мишени, с целью идентификации наиболее эффективной последовательности в библиотеке молекул нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях библиотека молекул нуклеиновой кислоты представляет собой библиотеку сконструированных вариантов молекулы нуклеиновой кислоты («потомство» молекул нуклеиновой кислоты) родительской или предковой молекулы нуклеиновой кислоты, где сконструированные варианты молекулы нуклеиновой кислоты сохраняют коровую последовательность нуклеиновых оснований родительской молекулы нуклеиновой кислоты.

Олигонуклеотид

Термин «олигонуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется таким образом, как обычно понятно специалисту, как молекула, содержащая два или более чем два ковалентно связанных нуклеозида. Такие ковалентно связанные нуклеозиды также могут называться молекулами нуклеиновой кислоты или олигомерами. Олигонуклеотиды обычно получают в лаборатории посредством твердофазного химического синтеза с последующей очисткой. При ссылке на последовательность олигонуклеотида, делается ссылка на последовательность или порядок группировок нуклеиновых оснований или их модификаций ковалентно связанных нуклеотидов или нуклеозидов. Олигонуклеотид по изобретению является искусственным, синтезируется химически и типично очищается или выделяется. Олигонуклеотид по изобретению может содержать один или более чем один модифицированный нуклеозид или нуклеотид. Антисмысловой олигонуклеотид представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид с минимальным образованием или отсутствием образования внутреннего дуплекса. Молекула миРНК обычно состоит из 2 комплементарных олигонуклеотидных нитей (смысловой нити и антисмысловой нити), которые образуют двухцепочечную молекулу. Молекула кшРНК представляет собой олигонуклеотид, который обычно длиннее, чем антисмысловой олигонуклеотид, и который образует структуру внутреннего дуплекса (шпильки) в пределах молекулы.

Антисмысловые олигонуклеотиды

Термин «антисмысловой олигонуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется как олигонуклеотид, способный модулировать экспрессию гена-мишени посредством гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, в частности с непрерывной последовательностью на нуклеиновой кислоте-мишени. Антисмысловые олигонуклеотиды по существу не являются двухцепочечными и, следовательно, не являются миРНК или кшРНК. Предпочтительно антисмысловые олигонуклеотиды по настоящему изобретению являются одноцепочечными.

РНКи

В данном документе термин «молекула РНК-интерференции (РНКи)» относится к любой молекуле, ингибирующей экспрессию или трансляцию РНК, включая молекулы нуклеиновых кислот, определенные в данном документе. Малая интерферирующая РНК (миРНК) представляет собой двухцепочечную молекулу РНК, которая посредством комплементарного связывания с мРНК после транскрипции, приводит к их деградации и потере трансляции. Малая шпилечная РНК (мшРНК) представляет собой искусственную молекулу РНК со структурой шпильки, которая способна при экспрессии уменьшать уровень мРНК посредством дайсер (Dicer) и комплекса сайленсинга, уменьшающего уровень мРНК (RISC). Молекулы РНКи могут быть сконструированы на основе последовательности РНК интересующего гена. Соответствующие РНКи могут быть затем синтезированы химически или посредством транскрипции in vitro, или экспрессированы от вектора или ПЦР-продукта.

Молекулы миРНК и кшРНК обычно имеют от 20 до 50 нуклеотидов в длину, как, например, от 25 до 35 нуклеотидов в длину, и они взаимодействуют с эндонуклеазой, известной как дайсер (Dicer), которая, как считается, подвергает процессингу дцРНК до малых интерферирующих РНК из 19-23 пар оснований с характерными 3' липкими концами из двух оснований, которые затем включаются в комплекс РНК-индуцированного сайленсинга (RISC). Эффективные удлиненные формы субстратов дайсер были описаны в US 8349809 и US 8513207, тем самым включенных посредством ссылки. При связывании с подходящей мРНК-мишенью одна или более чем одна эндонуклеаза в пределах RISC расщепляет мишень с индукцией сайленсинга. Агенты РНКи могут быть химически модифицированными с использованием модифицированных межнуклеозидных связей и высокоаффинных нуклеозидов, таких как нуклеозиды, модифицированные 2'-4' бициклической рибозой, включающие LNA и сЕТ.

Непрерывная нуклеотидная последовательность

Термин «непрерывная нуклеотидная последовательность» относится к области олигонуклеотида, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени. Данный термин используется в данном документе взаимозаменяемо с термином «непрерывная последовательность нуклеиновых оснований» и термином «последовательность олигонуклеотидного мотива». В некоторых воплощениях все нуклеотиды данного олигонуклеотида составляют непрерывную нуклеотидную последовательность. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность и, возможно, может содержать дополнительный(ные) нуклеотид(ды), например, область нуклеотидного линкера, которая может использоваться для присоединения функциональной группы к непрерывной нуклеотидной последовательности. Область нуклеотидного линкера может быть или может не быть комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.

Нуклеотиды

Нуклеотиды представляют собой структурные элементы олигонуклеотидов и полинуклеотидов и для целей настоящего изобретения включают и встречающиеся в природе, и не встречающиеся в природе нуклеотиды. В природе нуклеотиды, такие как нуклеотиды ДНК и РНК, содержат группировку сахара рибозы, группировку нуклеинового основания и одну или более чем одну фосфатную группу (которая отсутствует в нуклеозидах). Нуклеозиды и нуклеотиды также могут взаимозаменяемо называться «звеньями» или «мономерами».

Модифицированный нуклеозид

Термин «модифицированный нуклеозид» или «модификация нуклеозида» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к нуклеозидам, модифицированным по сравнению с эквивалентным нуклеозидом ДНК или РНК посредством введения одной или более чем одной модификации сахарной группировки или группировки (нуклеинового) основания. В предпочтительном воплощении модифицированный нуклеозид содержит модифицированную сахарную группировку. Термин «модифицированный нуклеозид» также может использоваться в данном документе взаимозаменяемо с термином «аналог нуклеозида» или модифицированные «звенья», или модифицированные «мономеры». Нуклеозиды с немодифицированной сахарной группировкой ДНК или РНК называются в данном документе нуклеозидами ДНК или РНК. Нуклеозиды с модификациями в области основания нуклеозида ДНК или РНК все еще, в общем, называются ДНК или РНК, если они обеспечивают образование пар оснований по Уотсону-Крику.

Модифицированная межнуклеозидная связь

Термин «модифицированная межнуклеозидная связь» определяется так, как обычно понятно специалисту: как связи, отличные от фосфодиэфирных (РО) связей, которые ковалентно связывают вместе два нуклеозида. Нуклеотиды с модифицированными межнуклеозидными связями также называются «модифицированными нуклеотидами». В некоторых воплощениях модифицированная межнуклеозидная связь увеличивает устойчивость молекул нуклеиновых кислот по изобретению к нуклеазе по сравнению с фосфодиэфирной связью. Для олигонуклеотидов, встречающихся в природе, межнуклеозидная связь включает фосфатные группы, создающие фосфодиэфирную связь между соседними нуклеозидами. Модифицированные межнуклеозидные связи являются особенно полезными в стабилизации олигонуклеотидов, а также миРНК для применения in vivo, и они могут служить для защиты против нуклеазного расщепления в областях нуклеозидов ДНК или РНК в олигонуклеотиде или миРНК по изобретению, например, в пределах области гэпа гэпмерного олигонуклеотида, а также в областях модифицированных нуклеозидов.

В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, например, антисмысловой олигонуклеотид, кшРНК или миРНК, содержит одну или более чем одну межнуклеозидную связь, модифицированную от природного фосфодиэфира до связи, которая, например, является более устойчивой к нуклеазной атаке. Устойчивость к нуклеазе можно определять посредством инкубирования олигонуклеотида в сыворотке крови или посредством применения анализа устойчивости к нуклеазе (например, фосфодиэстеразе яда змеи (SVPD)), которые оба хорошо известны в данной области. Межнуклеозидные связи, которые способны усиливать устойчивость олигонуклеотида к нуклеазе, называются нуклеазоустойчивыми межнуклеозидными связями. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в антисмысловом олигонуклеотиде или в его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или в его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными. Будет понятно то, что в некоторых воплощениях нуклеозиды, которые связывают олигонуклеотид по изобретению с ненуклеотидной функциональной группой, такой как конъюгат, могут содержать фосфодиэфир. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности являются нуклеазоустойчивыми межнуклеозидными связями.

Модифицированные межнуклеозидные связи могут быть выбраны из группы, содержащей фосфоротиоат, дифосфоротиоат и боранофосфат. В некоторых воплощениях модифицированные межнуклеозидные связи, например, фосфоротиоатная, дифосфоротиоатная или боранофосфатная, являются совместимыми с рекрутированием олигосахаридом по изобретению РНКазы Н.

В некоторых воплощениях межнуклеозидная связь, такая как фосфоротиоатная межнуклеозидная связь, содержит серу (S).

Фосфоротиоатная межнуклеозидная связь является особенно полезной из-за устойчивости к нуклеазе, полезной фармакокинетики и легкости получения. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат, как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит одну или более чем одну нейтральную межнуклеозидную связь, в частности, межнуклеозидную связь, выбранную из фосфотриэфира, метилфосфоната, MMI, амида-3, формацеталя или тиоформацеталя.

Дополнительные межнуклеозидные связи раскрываются в WO 2009/124238 (включенной в данный документ посредством ссылки). В одном воплощении межнуклеозидная связь выбрана из линкеров, раскрытых в WO 2007/031091 (включенной в данный документ посредством ссылки). В частности, межнуклеозидная связь может быть выбрана из -O-Р(O)₂-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)₂-O-, -S-P(O)₂-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)₂-O-, -O-P(O)₂-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)₂-S-, -O-PO(R^H)-O-, 0-PO(OCH₃)-0-, -O-PO(NR^H)-O-, -O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-, -O-PO(BH₃)-O-, -O-PO(NHR^H)-O-, -O-P(O)₂-NR^H-, -NR^H-P(O)₂-O-, -NR^H-CO-O-, -NR^H-CO-NR^H-, и/или межнуклеозидный линкер может быть выбран из группы, состоящей: -O-СО-O-, -О-CO-NR^H-, -NR^H-CO-CH₂-, -O-CH₂-CO-NR^H-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -CO-NR^H-CH₂-, -CH₂-NR^HCO-, -O-CH₂-CH₂-S-, -S-CH₂-CH₂-O-, -S-CH₂-CH₂-S-, -CH₂-SO₂-CH₂-, -CH₂-CO-NR^H-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-CO-, -CH₂-NCH₃-O-CH₂-, где R^H выбран из водорода и С1-4-алкила.

Нуклеазоустойчивые связи, такие как фосфотиоатные связи, являются особенно полезными в областях антисмысловых олигонуклеотидов, способных рекрутировать нуклеазу, при формировании дуплекса с нуклеиновой кислотой-мишенью, таких как область G для гэпмеров или область немодифицированных нуклеозидов хэдмеров (headmer) и тэйлмеров (tailmer). Однако, фосфоротиоатные связи также могут быть полезными в областях, не рекрутирующих нуклеазу, и/или в областях, усиливающих аффинность, таких как области F и F' для гэпмеров, или в области модифицированных нуклеозидов хэдмеров и тэйлмеров.

Каждая из сконструированных областей может, однако, содержать межнуклеозидные связи, отличные от фосфоротиоатных, такие как фосфодиэфирные связи, в частности, в областях, где модифицированные нуклеозиды, такие как LNA, защищают связь от нуклеазной деградации. Включение фосфодиэфирных связей, как, например, одной или двух связей, в частности между или рядом с модифицированными нуклеозидными звеньями (типично в областях, не рекрутирующих нуклеазу), может модифицировать биодоступность и/или биораспределение олигонуклеотида - см. WO 2008/113832, включенную в данный документ посредством ссылки.

В одном воплощении все межнуклеозидные связи в антисмысловом олигонуклеотиде представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. Предпочтительно все межнуклеозидные связи в олигонуклеотиде представляют собой фосфоротиоатные связи.

Нуклеиновое основание

Термин «нуклеиновое основание» включает пуриновую (например, аденин и гуанин) и пиримидиновую (например, урацил, тимин и цитозин) группировку, присутствующую в нуклеозидах и нуклеотидах, которые образуют водородные связи при гибридизации нуклеиновых кислот. В контексте настоящего изобретения термин нуклеиновое основание также охватывает модифицированные нуклеиновые основания, которые могут отличаться от встречающихся в природе нуклеиновых оснований, но являются функциональными во время гибридизации нуклеиновых кислот. В данном контексте термин «нуклеиновое основание» относится и к встречающимся в природе нуклеиновым основаниям, таким как аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин, также как и к не встречающимся в природе вариантам. Такие варианты, например, описываются в Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1.

В некоторых воплощениях группировка нуклеинового основания модифицируется заменой пурина или пиримидина на модифицированный пурин или пиримидин, такой как замещенный пурин или замещенный пиримидин, как, например, нуклеиновое основание, выбранное из изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-метилцитозина, 5-тиозолоцитозина, 5-пропинилцитозина, 5-пропинилурацила, 5-бромурацил-5-тиазолоурацила, 2-тиоурацила, 2'-тиотимидина, инозина, диаминопурина, 6-аминопурина, 2-аминопурина, 2,6-диаминопурина и 2-хлор-6-аминопурина.

Группировки нуклеиновых оснований могут быть указаны буквенным кодом для каждого соответствующего нуклеинового основания, например, А, Т, G, С или U, где каждая буква возможно может включать модифицированные нуклеиновые основания с эквивалентной функцией. Например, в проиллюстрированных в качестве примеров олигонуклеотидах группировки нуклеиновых оснований выбраны из А, Т, G, С и 5-метилцитозина. Возможно для гэпмеров LNA можно использовать 5-метилцитозин нуклеозидов LNA.

Модифицированный олигонуклеотид

Термин «модифицированный олигонуклеотид» или «модифицированная молекула нуклеиновой кислоты» описывает олигонуклеотид или молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую один или более чем один нуклеозид с модифицированным сахаром и/или модифицированными межнуклеозидными связями. Термин «химерный» представляет собой термин, который использовали в литературе для описания олигонуклеотидов или молекул нуклеиновых кислот с модифицированными нуклеозидами, в частности, олигонуклеотидами гэпмера.

Комплементарность

Термин «комплементарность» описывает способность

нуклеозидов/нуклеотидов к образованию пар оснований по Уотсону-Крику. Парами оснований по Уотсону-Крику являются гуанин (С)-цитозин (С) и аденин (А)-тимин (Т)/урацил (U). Будет понятно то, что олигонуклеотиды могут содержать нуклеозиды с модифицированными нуклеиновыми основаниями, например, 5-метилцитозин часто используется вместо цитозина, и термин «комплементарность», как таковой, охватывает образование пар оснований по Уотсону-Крику между немодифицированными и модифицированными нуклеиновыми основаниями (см., например, Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1).

Термин «% комплементарности» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к числу нуклеотидов непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты (например, в олигонуклеотиде) в процентах, которые, в данном положении, являются комплементарными (т.е. образуют пары оснований по Уотсону-Крику) в данном положении непрерывной нуклеотидной последовательности отдельной молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеиновой кислоты-мишени). Данная процентная доля рассчитывается подсчетом числа выровненных оснований, которые образуют пары между двумя последовательностями (при выравнивании с использованием последовательности-мишени 5'-3' и последовательности олигонуклеотида от 3' к 5'), деля на общее число нуклеотидов в олигонуклеотиде и умножая на 100. При таком сравнении нуклеиновое основание/нуклеотид, который не выравнивается (не образует пару оснований), называется несоответствием. Предпочтительно при расчете % комплементарности непрерывной нуклеотидной последовательности не допускаются вставки и делеции.

Термин «полностью комплементарный» относится к 100%-ной комплементарности.

Следующее представляет собой пример олигонуклеотида (SEQ ID NO: 12), который является полностью комплементарным области нуклеиновой кислоты-мишени (SEQ ID NO: 10).

Идентичность

В контексте настоящего изобретения термин «идентичность» или «процент идентичности» означает то, что аминокислотные или нуклеотидные последовательности имеют идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, даже более предпочтительно по меньшей мере 98% и даже более предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности последовательностям, показанным в данном документе, например, последовательностям SEQ ID NO: 1, 2 или 3, где более высокие значения идентичности являются предпочтительными по отношению к более низким значениям. Согласно настоящему изобретению термин «идентичность/идентичности» или «процент идентичности/идентичностей» в контексте двух или более чем двух последовательностей нуклеиновой кислоты или аминокислотных последовательностей относится к двум или более чем двум последовательностям, которые являются одинаковыми, или которые имеют определенную процентную долю аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с аминокислотными последовательностями, например, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 7, 8 или 9, или с нуклеотидными последовательностями, например, SEQ ID NO: 4, 5, 6, 10 или 11) при сравнении и выравнивании на максимальное соответствие в окне сравнения или по обозначенной области, при измерении с использованием алгоритма сравнения последовательности, как известно в данной области, или посредством выравнивания вручную и визуальной проверки.

Для аминокислотных последовательностей предпочтительно существует описанная идентичность в области, которая состоит из по меньшей мере примерно 50 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 100 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 400 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 500 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 600 аминокислот и наиболее предпочтительно для всех аминокислот по длине.

В случае нуклеотидных последовательностей описанная идентичность наиболее предпочтительно существует в области, которая состоит из по меньшей мере 100 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 1000 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 2000 нуклеотидов и наиболее предпочтительно всех нуклеотидов по длине. Однако для молекул нуклеиновых кислот, которые обычно меньше 50 нуклеотидов, идентичность может оцениваться по значительно более короткой области. Обычно процентная доля идентичности молекул нуклеиновых кислот рассчитывается путем подсчета числа выровненных оснований, которые являются идентичными между двумя последовательностями, деля на общее число нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты и умножая на 100. Процентная доля идентичности = (совпадения × 100) / длина выровненной области. Предпочтительно при расчете % идентичности непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты не допускаются вставки и делеции.

Специалистам в данной области будет известно как определять процент идентичности между/среди последовательностей, используя, например, такие алгоритмы, как алгоритмы, основанные на компьютерной программе CLUSTALW (Thompson, 1994, Nucl Acids Res, 2: 4673-4680) или FASTDB (Brutlag, 1990, Comp App Biosci, 6: 237-245), как известно в данной области. Специалистам в данной области также доступны алгоритмы BLAST и BLAST 2.0 (Altschul, 1997, Nucl Acids Res 25: 3389-3402; Altschul, 1993, J Mol Evol, 36: 290-300; Altschul, 1990, J Mol Biol 215: 403-410). Например, BLAST 2.0, которая обозначает инструмент поиска основного местного выравнивания BLAST (Altschul, 1997, местн. цит.; Altschul, 1993, местн. цит.; Altschul, 1990, местн. цит.), можно использовать для поиска местных выравниваний последовательностей. BLAST, как обсуждалось выше, дает выравнивания и нуклеотидной, и аминокислотной последовательностей для определения сходства последовательностей. Из-за местной природы выравниваний BLAST является особенно полезным в определении точных совпадений или в идентификации аналогичных последовательностей. Аналогичные компьютерные методики с использованием BLAST (Altschul, 1997, местн. цит.; Altschul, 1993, местн. цит.; Altschul, 1990, местн. цит.) используются для поиска идентичных или родственных молекул в базах данных нуклеотидов, таких как GenBank или EMBL.

Гибридизация

Термин «осуществление гибридизации» или «гибридизуется» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как две нити нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотид и нуклеиновая кислота-мишень), образующие водородные связи между парами оснований на противоположных нитях, формируя, посредством этого, дуплекс. Аффинность связывания между двумя нитями нуклеиновой кислоты представляет собой силу гибридизации. Она часто описывается в показателях температуры плавления (T_m), определенной как температура, при которой половина олигонуклеотидов образует дуплекс с нуклеиновой кислотой-мишенью. При физиологических условиях T_m не является строго пропорциональной аффинности (Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537). Свободная энергия Гиббса в стандартном состоянии - ΔG° - является более точным представлением аффинности связывания и связана с константой диссоциации (K_d) реакции согласно уравнению ΔG°=-RTIn(K_d), где R представляет собой газовую постоянную, и Т представляет собой абсолютную температуру. Следовательно, очень низкая ΔG° реакции между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью отражает сильную гибридизацию между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью. ΔG° представляет собой энергию, связанную с реакцией, где концентрации в воде составляют 1 М, рН составляет 7, и температура составляет 37°С. Гибридизация олигонуклеотидов с нуклеиновой кислотой-мишенью представляет собой спонтанную реакцию, и для спонтанных реакций ΔG° меньше, чем ноль. ΔG° можно измерять экспериментально, например, посредством применения способа изотермической титрационной калориметрии (ITC), как описано в Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38 и Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. Специалисту будет известно то, что доступно имеющееся в продаже оборудование для измерений ΔG°. ΔG° также можно оценивать численно посредством применения модели ближайшего соседа, как описывается SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465, с использованием подходящим образом выведенных термодинамических параметров, описанных Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 и McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405. Для того чтобы иметь возможность модулирования их намеченной нуклеиновой кислоты-мишени посредством гибридизации, олигонуклеотиды по настоящему изобретению гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочными значениями ΔG° меньше -41,8 кДж для олигонуклеотидов, которые имеют 10-30 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях степень или сила гибридизации измеряется посредством свободной энергии Гиббса в стандартном состоянии - ΔG°. Олигонуклеотиды могут гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочными значениями ΔG° меньше интервала -41,8 кДж, как, например, меньше -62,8 кДж, как, например, меньше -83,7 кДж и как, например, меньше -104,6 кДж для олигонуклеотидов, которые имеют 8-30 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочным значением ΔG° от -41,8 до -251 кДж, как, например, от -50,2 до -167,4 кДж, как, например, от -62,8 до -125,5 кДж или от -66,9 до 113 кДж, как, например, от -75,3 до -104,6 кДж.

Нуклеиновая кислота-мишень

Согласно настоящему изобретению нуклеиновая кислота-мишень представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует PAPD5 или PAPD7 млекопитающего и может представлять собой, например, ген, РНК, мРНК и пре-мРНК, зрелую мРНК или последовательность кДНК. Следовательно, данная мишень может называться нуклеиновая кислота-мишень PAPD5 или PAPD7. Олигонуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты по изобретению, например, может быть нацелена на области экзонов PAPD5 или PAPD7 млекопитающего, или, например, может быть нацелена на область интрона пре-мРНК PAPD5 или PAPD7. Подходящим образом, нуклеиновая кислота-мишень кодирует белок PAPD5 или PAPD7, в частности PAPD5 или PAPD7 млекопитающего, такой как PAPD5 или PAPD7 человека (см., например, Таблицы 1А и Б, и Таблицу 2А и Б), в которых приводятся последовательности мРНК и пре-мРНК для человеческого, обезьяньего, крысиного и свиного PAPD5 или PAPD7).

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 и 10 или их встречающихся в природе вариантов (например, последовательностей, кодирующих PAPD5 млекопитающего).

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 или 11, или их встречающихся в природе вариантов (например, последовательностей, кодирующих PAPD7 млекопитающего).

При использовании олигонуклеотида по изобретению в исследовании или диагностике нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой кДНК или синтетическую нуклеиновую кислоту, происходящую из ДНК или РНК.

Для применения in vivo или in vitro олигонуклеотид по изобретению типично способен ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени PAPD5 или PAPD7 в клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту-мишень PAPD5 или PAPD7. Непрерывная последовательность нуклеиновых оснований олигонуклеотида по изобретению типично комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени PAPD5 или PAPD7 при измерении по длине олигонуклеотида, возможно, за исключением одного или двух несоответствий, и, возможно, исключая линкерные области на основе нуклеотидов, которые могут связывать олигонуклеотид с возможной функциональной группой, такой как конъюгат или другие некомплементарные концевые нуклеотиды (например, область D' или D''). Нуклеиновая кислота-мишень в некоторых воплощениях может представлять собой РНК или ДНК, такую как матричная РНК, как, например, зрелая мРНК или пре-мРНК. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК или ДНК, которая кодирует белок PAPD5 или PAPD7 млекопитающего, такой как человеческий PAPD5 или PAPD7, например, последовательность мРНК человеческого PAPD5, такую как последовательность, раскрытая как SEQ ID NO 4, 5 или 10, или последовательность мРНК человеческого PAPD7, такую как последовательность, раскрытая как SEQ ID NO 6 или 11. Дополнительная информация по типичым нуклеиновым кислотам-мишеням приводится в Таблицах 1А и Б, и Таблице 2А и Б.

Прям. - прямая нить. Обр. - обратная нить. Геномные координаты дают последовательность пре-мРНК (геномная последовательность).

Последовательность-мишень

Термин «последовательность-мишень» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к последовательности нуклеотидов, присутствующей в нуклеиновой кислоте-мишени, которая содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая является комплементарной олигонуклеотиду или молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность-мишень состоит из области на нуклеиновой кислоте-мишени, которая является комплементарной непрерывной нуклеотидной последовательности олигонуклеотида по изобретению (т.е. подпоследовательности).

Олигонуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной или гибридизуется с областью на нуклеиновой кислоте-мишени, такой как подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени, такой как последовательность-мишень, описанная в данном документе.

Последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, которой является комплементарным или с которой гибридизуется олигонуклеотид, обычно содержит отрезок непрерывных нуклеиновых оснований из по меньшей мере 10 нуклеотидов. Непрерывная нуклеотидная последовательность содержит от 10 до 50 нуклеотидов, как, например, 12-30, как, например, 13-25, как, например, 14-20, как, например, 15-18 смежных нуклеотидов.

Вариант, встречающийся в природе

Термин «вариант, встречающийся в природе» относится к вариантам PAPD5 или PAPD7, или транскриптам, которые происходят из тех же самых генетических локусов, что и нуклеиновая кислота-мишень, но могут отличаться, например, за счет вырожденности генетического кода, вызывающей множественность кодонов, кодирующих ту же самую аминокислоту, или благодаря альтернативному сплайсингу пре-мРНК, или присутствию полиморфизмов, таких как однонуклеотидные полиморфизмы и аллельные варианты. На основе присутствия достаточно комплементарной последовательности к олигонуклеотиду, олигонуклеотид по изобретению, следовательно, может быть нацелен на нуклеиновую кислоту-мишень и ее встречающиеся в природе варианты.

В некоторых воплощениях встречающиеся в природе варианты имеют по меньшей мере 95%, как, например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии с нуклеиновой кислотой-мишенью PAPD5 млекопитающего, такой как нуклеиновая кислота-мишень, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO 4, 5 или 10.

В некоторых воплощениях встречающиеся в природе варианты имеют по меньшей мере 95%, как, например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии с нуклеиновой кислотой-мишенью PAPD5 млекопитающего, такой как нуклеиновая кислота-мишень, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 или 11.

В гене PAPD5 или PAPD7 известны многочисленные однонуклеотидные полиморфизмы, например, однонуклеотидные полиморфизмы, раскрытые в Таблице 2А (исходной/эталонной последовательностью человеческой пре-мРНК является SEQ ID NO: 10) и Таблице 2Б (исходной/эталонной последовательностью человеческой пре-мРНК является SEQ ID NO: 11).

Модуляция экспрессии

Термин «модуляция экспрессии» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как общий термин для способности молекул нуклеиновых кислот изменять количество PAPD5 или PAPD7 по сравнению с количеством PAPD5 или PAPD7 до введения молекулы нуклеиновой кислоты. В качестве альтернативы, модуляцию экспрессии можно определять посредством ссылки на контрольный эксперимент. Обычно понятно то, что контроль представляет собой индивида или клетку-мишень, обработанную композицией физиологического раствора, или индивида или клетку-мишень, обработанную ненацеленой молекулой нуклеиновой кислоты (имитация). Однако он также может представлять собой индивида, которого лечили стандартом лечения.

Одним типом модуляции является способность молекул нуклеиновых кислот ингибировать, осуществлять понижающую регуляцию, уменьшать, подавлять, удалять, останавливать, блокировать, предотвращать, ослаблять, снижать, устранять или прекращать экспрессию PAPD5 или PAPD7, например, посредством деградации мРНК или блокировки транскрипции.

Высокоаффинные модифицированные нуклеозиды

Высокоаффинный модифицированный нуклеозид представляет собой модифицированный нуклеотид, который, при включении в олигонуклеотид, увеличивает аффинность олигонуклеотида в отношении его комплементарной мишени, например, при измерении по температуре плавления (T_m). Высокоаффинный модифицированный нуклеозид по настоящему изобретению предпочтительно приводит к увеличению температуры плавления от +0,5 до +12°С, более предпочтительно - от +1,5 до +10°С, и наиболее предпочтительно - от +3 до +8°С на модифицированный нуклеозид. В данной области известны многочисленные высокоаффинные модифицированные нуклеозиды, и они включают, например, многие 2'-замещенные нуклеозиды, а также запертые нуклеиновые кислоты (LNA) (см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 и Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213).

Модификации сахара

Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать один или более чем один нуклеозид, который имеет модифицированную сахарную группировку, т.е. модификацию сахарной группировки по сравнению с рибозной сахарной группировкой, находящейся в ДНК и РНК.

Были получены многочисленные нуклеозиды с модификацией рибозной сахарной группировки, главным образом, с целью улучшения определенных свойств молекул нуклеиновых кислот, таких как аффинность и/или нуклеазоустойчивость.

Такие модификации включают модификации, где модифицируется структура рибозного кольца, например, посредством замены на гексозное кольцо (HNA) или бициклическое кольцо, которое типично имеет бирадикальный мостик между углеродами С2 и С4 на рибозном кольце (LNA), или на несвязанное рибозное кольцо, у которого типично отсутствует связь между углеродами С2 и С3 (например, UNA). Другие нуклеозиды с модифицированным сахаром включают, например, бициклогексозные нуклеиновые кислоты (WO 2011/017521) или трициклические нуклеиновые кислоты (WO 2013/154798). Модифицированные нуклеозиды также включают нуклеозиды, где сахарная группировка заменяется на несахарную группировку, например, в случае пептидных нуклеиновых кислот (PNA) или морфолинонуклеиновых кислот.

Модификации Сахаров также включают модификации, сделанные посредством изменения замещающих групп на рибозном кольце на группы, отличные от водорода, или группы 2'-ОН, находящихся в природе в нуклеозидах ДНК и РНК. Заместители, например, можно вводить в 2'-, 3'-, 4'- или 5'-положения. Нуклеозиды с модифицированными сахарными группировками также включают 2'-модифицированные нуклеозиды, такие как 2'-замещенные нуклеозиды. В самом деле, значительное внимание было потрачено на разработку 2'-замещенных нуклеозидов, и было обнаружено то, что многочисленные 2'-замещенные нуклеозиды имеют полезные свойства при включении в олигонуклеотиды, такие как повышенная устойчивость нуклеозидов и повышенная аффинность.

2'-Модифицированные нуклеозиды

Нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, представляет собой нуклеозид, который имеет в положении 2' заместитель, отличный от Н или -ОН (2'-замещенный нуклеозид) или содержит 2'-связанный бирадикал и включает 2'-замещенные нуклеозиды и нуклеозиды LNA (связанные 2'-4' бирадикальным мостиком). Например, 2'-модифицированный сахар может обеспечивать повышенную аффинность связывания и/или повышенную нуклеазоустойчивость олигонуклеотида. Примерами 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов являются 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-F-ANA (F-ANA) нуклеозид. Относительно дополнительных примеров, пожалуйста, см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 и Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Ниже приводятся иллюстрации некоторых 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов.

Нуклеозиды запертых нуклеиновых кислот (LNA)

Нуклеозиды LNA представляют собой модифицированные нуклеозиды, которые содержат линкерную группу (именуемую бирадикал или мостик) между С2' и С4' рибозного сахарного кольца нуклеотида. Данные нуклеозиды также называются в литературе мостиковой нуклеиновой кислотой или бициклической нуклеиновой кислотой (BNA).

В некоторых воплощениях модифицированный нуклеозид или нуклеозиды LNA олигомера по изобретению имеют общую структуру формулы I или II:

где W выбран из -O-, -S-, -N(R^a)-, -C(R^aR^b)-, таким образом, что в некоторых воплощениях -О-; В обозначает нуклеиновое основание или модифицированную группировку нуклеинового основания;

Z обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 5'-концевую группу;

Z* обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 3'-концевую группу;

X обозначает группу, выбранную из списка, состоящего из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -О-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях X выбран из группы, состоящей из: -О-, -S-, NH-, NR^aR^b, -СН₂-, CR^aR^b, -С(=СН₂)- и -C(=CR^aR^b)-.

В некоторых воплощениях X представляет собой -О-.

Y обозначает группу, выбранную из группы, состоящей из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -О-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -СН₂-, -C(R^aR^b)-, -СН₂СН₂-, -C(R^aR^b)-C(R^aR^b)-, -СН₂СН₂СН₂-, -C(R^aR^b)C(R^aR^b)C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)- и -C(R^a)=N-.

В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -СН₂-, -CHR₃-, -СНСН₃-, CR^aR^b-.

или -X-Y- совместно обозначают двухвалентную линкерную группу (также именуемую радикал), состоящую из 1, 2, 3 или 4 групп/атомов, выбранных из группы, состоящей из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -О-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях -X-Y- обозначает бирадикал, выбранный из групп, состоящих из: -Х-СН₂-, -X-CR^aR^b-, -X-CHR^a-, -Х-С(НСН₃)^-, -O-Y-, -O-CH₂-, -S-СН₂-, -NH-CH₂-, -О-СНСН₃-, -СН₂-O-СН₂, -О-СН(СН₃СН₃)-, -O-СН₂-СН₂-, ОСН₂-СН₂-СН₂-, -O-СН₂ОСН₂-, -O-NCH₂-, -С(=СН₂)-СН₂-, -NR^a-CH₂-, N-O-CH₂, -S-CR^aR^b- и -S-CHR^a-.

В некоторых воплощениях -X-Y- обозначает -O-СН₂- или -O-СН(СН₃)-, где Z выбран из -О-, -S- и -N(R^a)-,

и R^a, и, при наличии R^b, каждый независимо выбран из водорода, возможно замещенного C_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного С_2-6-алкинила, гидрокси, возможно замещенного C_1-6-алкокси, С_2-6-алкоксиалкила, С_2-6-алкенилокси, карбокси, C_1-6-алкоксикарбонила, C_1-6-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)-амино-карбонила, амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, C_1-6-алкил-карбониламино, карбамидо, C_1-6-алканоилокси, сульфоно, C_1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, C_1-6-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя R^a и R^b могут вместе обозначать возможно замещенный метилен (=СН₂), где для всех хиральных центров асимметрические группы могут находиться либо в R, либо в S ориентации.

где R¹, R², R³, R⁵ и R^5* независимо выбраны из группы, состоящей из: водорода, возможно замещенного C_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного С_2-6-алкинила, гидрокси, C_1-6-алкокси, С_2-6-алкоксиалкила, С_2-6-алкенилокси, карбокси, C_1-6-алкоксикарбонила, C_1-6-алкилкарбонила, формила, арила, арилокси-карбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилокси-карбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)-амино-карбонила, амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, C_1-6-алкил-карбониламино, карбамидо, C_1-6-алканоилокси, сульфоно, C_1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, C_1-6-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя могут вместе обозначать оксо, тиоксо, имино или возможно замещенный метилен.

В некоторых воплощениях R¹, R², R³, R⁵ и R^5* независимо выбраны из C_1-6-алкила, такого как метил, и водорода.

В некоторых воплощениях все R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода.

В некоторых воплощениях все R¹, R², R³ представляют собой атомы водорода, и либо R⁵, либо R^5* также представляет собой атом водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, представляет собой C_1-6-алкил, такой как метил.

В некоторых воплощениях R^a представляет собой либо атом водорода, либо метил. В некоторых воплощениях R^b, при наличии, представляет собой либо атом водорода, либо метил.

В некоторых воплощениях один или оба из R^a и R^b представляют собой атом водорода.

В некоторых воплощениях один из R^a и R^b представляет собой атом водорода, а другой отличается от атома водорода.

В некоторых воплощениях один из R^a и R^b представляет собой метил, а другой представляет собой атом водорода.

В некоторых воплощениях оба из R^a и R^b представляют собой метил.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CH₂-, W представляет собой О, и все R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 и WO 2004/046160, которые все включены тем самым посредством ссылки, и они включают то, что обычно известно как нуклеозиды бета-О-окси LNA и альфа-L-окси LNA.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160, которые включены тем самым посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -NH-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды амино LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160, которые тем самым включены посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-СН₂-СН₂- или -O-CH₂-CH₂-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 00/047599 и Morita et al, Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12 73-76, которые тем самым включены посредством ссылки, и включают то, что обычно известно как нуклеиновые кислоты, связанные 2'-O-4'С-этиленовым мостиком (ENA).

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³ и один из R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, C_1-6алкил, такой как метил. Такие 5'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2007/134181, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CR^aR^b, где один или оба из R^a и R^b отличаются от атома водорода, как, например, метил, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³ и один из R⁵ и R^5* представляют собой атом водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, C_1-6алкил, такой как метил. Такие бис-модифицированные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2010/077578, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-СН(СН₂ОСН₃)- (2' О-метоксиэтилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -О-СН(СН₂СН₃) - (2' O-этилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CHR^a, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 10036698 и WO 07090071, которые обе тем самым включены посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН(СН₂ОСН₃)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA также известны в данной области как циклические МОЕ (сМОЕ) и раскрыты в WO 07090071.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-СН(СН₃)- либо в R-, либо в S-конфигурации. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH₂-O-CH₂- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CH(CH₃)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-метилнуклеозиды LNA также известны в данной области как сЕТ нуклеозиды и могут представлять собой либо (S)cET, либо (R)cET стереоизомеры, как раскрыто в WO 07090071 (бета-D) и WO 2010/036698 (альфа-L), которые оба тем самым включены посредством ссылки).

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -O-CR^aR^b-, в котором ни один из R^a или R^b не является атомом водорода, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях и R^a, и R^b представляют собой метил. Такие 6'-двухзамещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2009006478, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-CHR^a-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 11156202, которая тем самым включена посредством ссылки. В некоторых воплощениях 6'-замещенных тио LNA R^a представляет собой метил.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -С(=СН2)-C(R^aR^b)-, как, например, -С(=СН₂)-СН₂- или -С(=СН₂)-СН(СН₃)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды винилкарбо LNA раскрыты в WO 08154401 и WO 09067647, которые обе тем самым включены посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(-OR^a)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой С_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как N-замещенные LNA и раскрываются в WO 2008/150729, которая тем самым включена посредством ссылки. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-NR^a-CH₃- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(R^a)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой С_1-6алкил, такой как метил.

В некоторых воплощениях один или оба из R⁵ и R^5* представляют собой атом водорода, и, при замещении, другой из R⁵ и R^5* представляет собой С_1-6алкил, такой как метил. В таком воплощении все из R¹, R², R³ могут представлять собой атомы водорода, и бирадикал -X-Y- может быть выбран из -O-СН₂- или -О-C(HCR^a)-, такого как -О-С(НСН3)-.

В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -CR^aR^b-O-CR^aR^b-, такой как CH₂-O-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как конформационно ограниченные нуклеотиды (CRN) и раскрываются в WO 2013036868, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -O-CR^aR^b-O-CR^aR^b-, такой как O-CH₂-O-CH₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой С_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как нуклеотиды СОС и раскрываются в Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238, которая тем самым включена посредством ссылки.

Будет понятно то, что, если не определено, нуклеозиды LNA могут находиться в бета-D или альфа-L стереоизоформе.

Некоторые примеры нуклеозидов LNA представлены на Схеме 1.

Схема 1

Как проиллюстрировано в Примерах, в некоторых воплощениях изобретения нуклеозиды LNA в олигонуклеотидах представляют собой нуклеозиды бета-D-окси-LNA.

Деградация, опосредованная нуклеазой

Термин «деградация, опосредованная нуклеазой» относится к олигонуклеотиду, способному опосредовать деградацию комплементарной нуклеотидной последовательности при образовании дуплекса с такой последовательностью.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид может функционировать посредством деградации нуклеиновой кислоты-мишени, опосредованной нуклеазой, где олигонуклеотиды по изобретению способны рекрутировать нуклеазу, в частности, эндонуклеазу, предпочтительно эндорибонуклеазу (РНКазу), такую как РНКаза Н. Примерами конструкций олигонуклеотидов, которые работают посредством механизмов, опосредованных нуклеазой, являются олигонуклеотиды, которые типично содержат область из по меньшей мере 5 или 6 нуклеозидов ДНК и фланкированы на одной стороне или на обеих сторонах нуклеозидами, увеличивающими аффинность, например, гэпмеры, хэдмеры и тэйлмеры.

Активность и рекрутирование РНКазы Н

Термин «активность РНКазы Н антисмыслового олигонуклеотида» относится к его способности при нахождении в дуплексе с комплементарной молекулой РНК рекрутировать РНКазу Н. В WO 01/23613 предложены способы in vitro для определения активности РНКазы Н, которые можно использовать для определения способности рекрутировать РНКазу Н. Типично олигонуклеотид считается способным рекрутировать РНКазу Н, если он, при предоставлении с комплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, имеет исходную скорость, измеренную в пмоль/л/мин, по меньшей мере 5%, как, например, по меньшей мере 10% или больше, чем 20% от исходной скорости, определенной при использовании олигонуклеотида, имеющего такую же последовательность оснований, что и тестируемый модифицированный олигонуклеотид, но содержащего только мономеры ДНК с фосфоротиоатными связями между всеми мономерами в олигонуклеотиде, и с использованием методологии, предложенной в Примерах 91-95 WO 01/23613 (включенной тем самым посредством ссылки).

Гэпмер

Термин «гэпмер» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит область олигонуклеотидов (гэп), рекрутирующую РНКазу Н, которая фланкирована 5' и 3' областями (фланги или крылья), которые содержат один или более чем один модифицированный нуклеозид, усиливающий аффинность. В данном документе описываются разные конструкции гэпмеров. Хэдмеры и тэйлмеры представляют собой олигонуклеотиды, способные рекрутировать РНКазу Н, где отсутствует один из флангов, т.е. только один из концов олигонуклеотида содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность. Для хэдмеров отсутствует 3'-фланг (т.е. 5'-фланг содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность), и для тэйлмеров отсутствует 5'-фланг (т.е. 3'-фланг содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность).

Гэпмер LNA

Термин «гэпмер LNA» относится к гэпмерному олигонуклеотиду, в котором по меньшей мере один из модифицированных нуклеозидов, усиливающих аффинность, представляет собой нуклеозид LNA.

Гэпмер со смешанными крыльями

Термин «гэпмер со смешанными крыльями» или «гэпмер со смешанными флангами» относится к гэпмеру LNA, в котором по меньшей мере одна фланговая область содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, не являющийся LNA, такой как по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, такой как, например, нуклеозид(ды) 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-F-ANA. В некоторых воплощениях гэпмер со смешанными крыльями имеет один фланг, который содержит только нуклеозиды LNA (например, 5' или 3'), и другой фланг (3' или 5' соответственно) содержит 2'-замещенный(ные) модифицированный(ные) нуклеозид(ды) и возможно нуклеозиды LNA.

Конъюгат

Термин «конъюгат» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к олигонуклеотиду, который ковалентно связан с ненуклеотидной группировкой (конъюгатная группировка или область С, или третья область).

Конъюгирование олигонуклеотида по изобретению с одной или более чем одной ненуклеотидной группировкой может улучшать фармакологию данного олигонуклеотида, например, посредством влияния на активность, клеточное распределение, клеточное поглощение или стабильность олигонуклеотида. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка модифицирует или улучшает фармакокинетические свойства олигонуклеотида посредством улучшения распределения в клетке, биодоступности, метаболизма, выведения, проницаемости и/или поглощения олигонуклеотида клеткой. В частности, конъюгат может нацеливать олигонуклеотид в конкретный орган, ткань или тип клеток и, посредством этого, улучшать эффективность данного олигонуклеотида в этом органе, ткани или типе клеток. В то же самое время конъюгат может служить для уменьшения активности олигонуклеотида в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями, например, активность вне мишени или активность в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями. В WO 93/07883 и WO 2013/033230 предложены подходящие конъюгатные группировки, которые тем самым являются включенными посредством ссылки. Дополнительными подходящими конъюгатными группировками являются группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr). В частности, подходящими для связывания с ASGPr являются трехвалентные N-ацетилгалактозаминные конъюгатные группировки, см., например, WO 2014/076196, WO 2014/207232 и WO 2014/179620 (включенные тем самым посредством ссылки).

Конъюгаты олигонуклеотидов и их синтез также были описаны во всеохватывающих обзорах Manoharan в Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, ST. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 и Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.

В одном воплощении ненуклеотидная группировка (конъюгатная группировка) выбрана из группы, состоящей из углеводов, лигандов рецептора поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов (например, бактериальных токсинов), витаминов, вирусных белков (например, капсидов) или их комбинаций.

Линкеры конъюгатов

Связка или линкер представляет собой соединение между двумя атомами, которое связывает одну химическую группу или интересующий сегмент с другой химической группой или интересующим сегментом посредством одной или более чем одной ковалентной связи. Конъюгатные группировки могут присоединяться к олигонуклеотиду непосредственно или через связывающую группировку (например, линкер или связку). Линкеры служат для ковалентного присоединения третьей области, например, конъюгатной группировки к олигонуклеотиду (например, концам области А или С).

В некоторых воплощениях изобретения конъюгат или конъюгат олигонуклеотида по изобретению возможно может содержать линкерную область, которая располагается между олигонуклеотидом и конъюгатной группировкой. В некоторых воплощениях линкер между конъюгатом и олигонуклеотидом является биорасщепляемым.

Биорасщепляемые линкеры содержат или состоят из физиологически лабильной связи, которая является расщепляемой при условиях, которые обычно встречаются или являются аналогичными условиям, которые встречаются в организме млекопитающего. Условия, при которых физиологически лабильные линкеры подвергаются химическому превращению (например, расщеплению), включают такие химические условия, как рН, температура, окислительные или восстановительные условия или агенты и концентрация соли, обнаруженные или аналогичные условиям, встречающимся в клетках млекопитающих. Внутриклеточные условия у млекопитающих также включают присутствие ферментативной активности, обычно присутствующей в клетке млекопитающего, как, например, от протеолитических ферментов или гидролитических ферментов, или нуклеаз. В одном воплощении биорасщепляемый линкер чувствителен к расщеплению нуклеазой S1. В предпочтительном воплощении нуклеазочувствительный линкер содержит от 1 до 10 нуклеозидов, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов, более предпочтительно - от 2 до 6 нуклеозидов, и наиболее предпочтительно - от 2 до 4 связанных нуклеозидов, содержащих по меньшей мере две последовательные фосфодиэфирные связи, как, например, по меньшей мере 3 или 4, или 5 последовательных фосфодиэфирных связей. Предпочтительно нуклеозидами являются нуклеозиды ДНК или РНК. Биорасщепляемые линкеры, содержащие фосфодиэфир, более подробно описываются в WO 2014/076195 (включенной тем самым посредством ссылки).

Конъюгаты также могут быть связаны с олигонуклеотидом через небиорасщепляемые линкеры, или в некоторых воплощениях конъюгат может содержать нерасщепляемый линкер, который ковалентно присоединяется к биорасщепляемому линкеру. Линкеры не обязательно являются биорасщепляемыми, но, главным образом, служат для ковалентного присоединения конъюгатной группировки к олигонуклеотиду или биорасщепляемому линкеру. Такие линкеры могут содержать структуру цепи или олигомер из повторяющихся звеньев, такой как этиленгликоль, аминокислотные звенья или аминоалкильные группы. В некоторых воплощениях линкер (область Y) представляет собой аминоалкил, как, например, С₂-С₃₆ аминоалкильную группу, включающую, например, C₆-C₁₂ аминоалкильные группы. В некоторых воплощениях линкер (область Y) представляет собой С₆ аминоалкильную группу. Конъюгатные группы линкера могут традиционно присоединяться к олигонуклеотду посредством применения аминомодифицированного олигонуклеотида и активированной сложноэфирной группы на конъюгатной группе.

Лечение

Термины «лечение», «осуществление лечения», «лечит» или тому подобные используются в данном документе для общего обозначения получения желательного фармакологического и/или физиологического эффекта. Данный эффект является терапевтическим в показателях частичного или полного излечения заболевания и/или вредного эффекта, приписываемого заболеванию. Термин «лечение» в том виде, в котором он используется в данном документе, охватывает любое лечение заболевания у субъекта и включает: (а) ингибирование заболевания, т.е. задержку его развития, подобную ингибированию увеличения уровня HBsAg и/или HBeAg; или (б) уменьшение интенсивности (т.е. облегчение) заболевания, т.е. вызов регрессии заболевания, подобно подавлению продукции HBsAg и/или HBeAg. Таким образом, соединение, которое уменьшает интенсивность и/или ингибирует инфекцию HBV, представляет собой соединение, которое лечит инфекцию HBV. Предпочтительно термин «лечение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к медицинскому вмешательству в уже проявившееся расстройство, подобно лечению уже определенной и проявившейся инфекции HBV.

Предупреждение

В данном документе термин «осуществление предупреждения», «предупреждение» или «предупреждает» относится к профилактическому лечению, например, к мерам или процедуре, целью которой является предупреждение, а не излечение заболевания. Предупреждение означает то, что получается желательный фармакологический и/или физиологический эффект, который является профилактическим в показателях полного или частичного предупреждения заболевания или его симптома. Соответственно, фраза «предупреждение инфекции HBV» в данном документе включает предупреждение у субъекта появления инфекции HBV и предупреждение появления симптомов инфекции HBV. В настоящем изобретении, в частности, рассматривается предупреждение инфекции HBV у детей от матерей, инфицированных HBV.

Пациент

Для целей настоящего изобретения «субъект» (или «пациент») может представлять собой позвоночное. В контексте настоящего изобретения термин «субъект» включает и людей, и других животных, особенно млекопитающих, и другие организмы. Таким образом, предложенные в данном документе средства и способы являются применимыми и к терапии человека, и к ветеринарным применениям. Соответственно, описанный в данном документе субъект может быть животным, таким как мышь, крыса, хомяк, кролик, морская свинка, хорек, кошка, собака, курица, овца, виды крупного рогатого скота, лошадь, верблюд или примат. Предпочтительно субъект представляет собой млекопитающее. Более предпочтительно субъект представляет собой человека.

Инфекция HBV

Термин «инфекция вирусом гепатита В» или «инфекция HBV» является общеизвестным в данной области и относится к инфекционному заболеванию, которое вызвано вирусом гепатита В (HBV) и поражает печень. Инфекция HBV может быть острой или хронической инфекцией. Некоторые инфицированные люди не имеют симптомов во время исходной инфекции, и у некоторых развивается быстрое начало заболевания со рвотой, желтоватой кожей, утомляемостью, темной мочой и болью в области живота ("Hepatitis В Fact sheet №204". who.int. Июль 2014 г. Скачанный 4 ноября 2014 г.). Данные симптомы часто длятся несколько недель и могут приводить к смерти. До начала симптомов может проходить от 30 до 180 суток. У 90% тех, кто инфицировался около момента рождения, развивается хроническая инфекция гепатитом В, тогда как она развивается у 10% инфицированных в возрасте старше пяти лет ("Hepatitis В FAQs for the Public - Transmission", U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC), скачано 29.11.2011). У большинства с хроническим заболеванием нет симптомов; однако, в конечном счете, могут развиваться цирроз и рак печени (Chang, 2007, Semin Fetal Neonatal Med, 12: 160-167). Данные осложнения приводят к смерти 15-25% имеющих хроническое заболевание ("Hepatitis В Fact sheet №204". who.int. July 2014, скачанный 4 ноября 2014 г.). В данном документе термин «инфекция HBV» включает острую и хроническую инфекцию гепатитом В. Термин «инфекция HBV» также включает бессимптомную стадию исходной инфекции, симптоматические стадии, а также бессимптомную хроническую стадию инфекции HBV.

Ферментативно активные фрагменты

В данном документе ферментативно активный фрагмент SEQ ID NO: 1 или 2 (т.е. PAPD5) относится к тем полипептидам, которые содержат отрезок смежных аминокислотных остатков SEQ ID NO: 1 или 2 (т.е. PAPD5), и которые сохраняют биологическую активность (т.е. функциональность) PAPD5, в частности, функцию поли-А полимеразы. В соответствии с этим в данном документе ферментативно активный фрагмент SEQ ID NO: 3 (т.е. PAPD7) относится к тем полипептидам, которые содержат отрезок смежных аминокислотных остатков SEQ ID NO: 3 (т.е. PAPD7), и которые сохраняют биологическую активность (т.е. функциональность) PAPD7, в частности, функцию поли-А полимеразы. Примерами ферментативно активных фрагментов PAPD5 и PAPD7 являются нуклеотидилтрансферазный домен и поли-А полимераза Cid1.

Полипептид

В данном документе термин «полипептид» включает все молекулы, которые содержат или состоят из аминокислотных мономеров, связанных пептидными (амидными) связями. Таким образом, термин «полипептид» включает все аминокислотные последовательности, такие как пептиды, олигопептиды, полипептиды и белки. «Полипептид», описанный в данном документе, может представлять собой встречающийся в природе полипептид или полипептид, не встречающийся в природе. Полипептид, не встречающийся в природе, может содержать по меньшей мере одну мутацию (например, замену аминокислоты, делецию аминокислоты или присоединение аминокислоты) по сравнению с аналогом, встречающимся в природе. Полипептид, не встречающийся в природе, также может быть клонирован в вектор и/или связан функциональным образом с промотором, который не является природным промотором указанного полипептида. Указанный промотор может быть конститутивно активным промотором. Термин «аминокислота» или «остаток» в том виде, в котором он используется в данном документе, включает и L-, и D-изомеры встречающихся в природе аминокислот, а также других аминокислот (например, аминокислот, не встречающихся в природе, аминокислот, которые не кодируются последовательностями нуклеиновых кислот, синтетических аминокислот и т.д.). Примерами встречающихся в природе аминокислот являются аланин (Ala; А), аргинин (Arg; R), аспарагин (Asn; N), аспарагиновая кислота (Asp; D), цистеин (Cys; С), глутамин (Gln; Q), глутаминовая кислота (Glu; Е), глицин (Gly; G), гистидин (His; Н), изолейцин (lie; I), лейцин (Leu; L), лизин (Lys; K), метионин (Met; М), фенилаланин (Phe; F), пролин (Pro; P), серии (Ser; S), треонин (Thr; T), триптофан (Trp; W), тирозин (Tyr; Y), валин (Val; V). Посттрансляционно модифицированными встречающимися в природе аминокислотами являются дегидробутирин (Dhb) и лабионин (Lab). Примеры аминокислот, не встречающихся в природе, описаны выше. Полипептид, не встречающийся в природе, может содержать один или более чем один неаминокислотный заместитель или гетерологичные аминокислотные заместители, по сравнению с аминокислотной последовательностью, встречающейся в природе формы полипептида, например, молекулу-репортер или другой лиганд, ковалентно или нековалентно связанный с аминокислотной последовательностью.

Соединение

В данном документе термин «соединение» означает любую молекулу нуклеиновой кислоты, такую как молекулы РНКи согласно изобретению или любой конъюгат, содержащий такую молекулу нуклеиновой кислоты. Например, описанное в данном документе соединение может представлять собой молекулу РНКи против PAPD5 или PAPD7, в частности, антисмысловой олигонуклеотид, миРНК или кшРНК.

Композиция

Для описания соединения - молекулы нуклеиновой кислоты - также можно использовать термин «композиция». Композиция молекулы нуклеиновой кислоты содержит меньше, чем 20% примесей, предпочтительно меньше, чем 15% примесей или 10% примесей, более предпочтительно меньше, чем 9, 8, 7 или 6% примесей, наиболее предпочтительно меньше, чем 5% примесей. Данные примеси типично представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, которые на один или два нуклеотида короче (n-1 или n-2), чем компонент в виде молекулы главной нуклеиновой кислоты.

Ингибитор

Термин «ингибитор» известен в данной области и относится к соединению/веществу или композиции, способным полностью или частично предотвращать или уменьшать физиологическую функцию (т.е. антивность) (а) специфического(ких) белка(ков) (например, PAPD5 и/или PAPD7). В контексте настоящего изобретения «ингибитор» PAPD5 и PAPD7 способен предупреждать или уменьшать активность/функцию PAPD5 или PAPD7, соответственно, посредством предотвращения или уменьшения экспрессии генных продуктов PAPD5 или PAPD7. Таким образом, ингибитор PAPD5 или PAPD7 может приводить к пониженному уровню экспрессии PAPD5 или PAPD7 (например, пониженному уровню мРНК PAPD5 или PAPD7, или белка PAPD5 или PAPD7), что отражается в пониженной функциональности (т.е. активности) PAPD5 или PAPD7, где указанная функция включает функцию поли-А полимеразы. Ингибитор PAPD5 или PAPD7 в контексте настоящего изобретения, соответственно, также может охватывать транскрипционные репрессоры экспрессии PAPD5 или PAPD7, которые способны уменьшать уровень PAPD5 или PAPD7. Предпочтительные ингибиторы представляют собой молекулы нуклеиновых кислот по изобретению.

Измерение

В данном документе термин «измерение» также означает «проведение анализа» или «определение» (т.е. выявление и/или проведение количественного анализа). Например, термин «измерение экспрессии и/или активности PAPD5 и/или PAPD7» означает определение количества экспрессии и/или активности PAPD5 и/или PAPD7, например, определение количества полипептида PAPD5 и/или PAPD7 (т.е. белка). Способы измерения (т.е. определения) количества и/или активности белка PAPD5 и/или PAPD7 известны в данной области и описываются выше в данном документе. В соответствии с этим, фраза «измерение того, ингибирует ли тестируемое соединение размножение HBV» означает проведение анализа или определение (т.е. выявление и/или количественное измерение) того, ингибирует ли тестируемое соединение или композиция размножение HBV.

Настоящее изобретение дополнительно описывается со ссылкой на неограничивающие графические материалы и примеры.

ПРИМЕРЫ

Примеры иллюстрируют данное изобретение.

Материал и методы

Последовательности олигонуклеотидных мотивов и олигонуклеотидные соединения

Последовательности мотива представляют непрерывную последовательность, представленную в олигонуклеотиде.

Конструкции относятся к конструкции гэпмера - F-G-F'- где каждое число представляет число последовательных модифицированных нуклозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (первое число - 5'-фланг), с последующим числом нуклеозидов ДНК (второе число - область гэпа), с последующим числом модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (третье число - 3'-фланг), которым возможно предшествуют или после которых следуют дополнительные повторяющиеся области ДНК и LNA, которые не обязательно являются частью непрерывной последовательности, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.

Последовательности мотива представляют непрерывную последовательность нуклеиновых оснований, представленную в олигонуклеотиде.

Конструкции относятся к конструкции гэпмера - F-G-F'- где каждое число представляет число последовательных модифицированных нуклозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (первое число - 5'-фланг), с последующим числом нуклеозидов ДНК (второе число - область гэпа), с последующим числом модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (третье число - 3'-фланг), которым возможно предшествуют или после которых следуют дополнительные повторяющиеся области ДНК и LNA, которые не обязательно являются частью непрерывной последовательности, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.

Химия соединений

Каждое соединение из двух химических серий DHQ и ТНР синтезировали так, чтобы оно подходило для скрининга Y3H, проводимого HYBRIGENICS SERVICES SAS. Оба соединения включали линкер PEG5 и были мечены лигандом на основе триметопримового (ТМР) якоря (Таблица 5).

Скрининг Y3H ULTImate YChemH™

Два данных соединения были предоставлены Roche для HYBRIGENICS SERVICES SAS и протестированы на проницаемость и токсичность. Соединения были затем подвергнуты скринингу против библиотеки кДНК человеческой плаценты (PLA) HYBRIGENICS. Скрининги проводили согласно оптимизированному потоколу спаривания клетка-клетка, разработанному для Hybrigenics ULTImate Y2H™, используемому при разных концентрациях соединений (Таблица 6).

Анализ зависимости Y3H ULTImate YChemH™

Клоны, полученные из скрининга, собирали в 96-луночный формат, и позитивные клоны в отношении роста при селективных условиях (HIS+) оценивали в анализе зависимости с использованием анализов пятен. Только клоны, которые могли расти на селективной среде в присутствии меченого соединения, собирали, обрабатывали (лизис клеток, ПЦР, секвенирование генов) и картировали для выравнивания белка с использованием анализа Blast.

Эксперимент по подтверждению 1 к 1 Y3H ULTImate YChemH™ - фрагменты добычи

На данной стадии подтверждения каждый идентифицированный фрагмент добычи и один химический зонд (НВХ129653, НВХ129654) тестируется в эксперименте 1 к 1. Плазмиды из 3 отобранных добыч из библиотеки скрининга экстрагировали из дрожжевых клеток, амплифицировали в E. coli и повторно трансформировали в дрожжевые клетки YHGX13. Для каждого взаимодействия DO1, 1/10, 1/100 и 1/1000 культуры диплоидных дрожжей, экспрессирующих и конструкцию приманки, и добычи, наносили в виде пятен на селективную среду без триптофана, лейцина и гистидина, и дополняли химическим зондом и FK506. Взаимодействия тестировали в двойной повторности. Одну чашку использовали на химическое соединение и концентрацию (DMSO (диметилсульфоксид), 5, 10 и 20 мкМ НВХ129653, 5, 10 и 20 мкМ НВХ129654, 5 мкМ НВХ24786 Триметоприм (ТМР) и 5 мкМ НВХ129634 (TMP-PEG5-OH)). Чашки инкубировали при 30°С в течение 3 суток.

Эксперимент по подтверждению 1 к 1 Y3H ULTImate YChemH™ - полноразмерные белки

Кодирующую последовательность полноразмерного PAPD5var1 (NM_001040284.2) и PAPD7varX1 (XM_005248234.2) восстанавливали из N-концевого фрагмента гена с оптимизированными кодонами (для удаления высокого содержания GC) и имеющихся в продаже клонов С-концевых областей белков, и клонировали в рамке считывания с доменом активации Gal4 (AD) в плазмиду рР7 (AD-добыча), полученную из исходной pGADGH (Bartel et al., 1993 in Cellular interactions in development: A practical approach, ed. Hartley, D.A., Oxford University Press, Oxford, pp. 153-179). Данные конструкции проверяли секвенированием полных вставок. Для каждой добычи проводили миниспаривание между дрожжевыми клетками YHGX13 (Y187 ade2-101::loxP-kanMX-loxP, matα), трансформированными плазмидами добычи, и YPT6AT (mata), трансформированными DHFR (дигидрофолатредуктаза) приманки, с получением культуры диплоидных дрожжей. Для каждого взаимодействия DO1, 1/10, 1/100 и 1/1000 культуры диплоидных дрожжей, экспрессирующих и конструкцию приманки, и добычи, наносили в виде пятен на селективную среду без триптофана, лейцина и гистидина, и дополняли химическим зондом и FK506. Взаимодействия тестировали в двойной повторности. Одну чашку использовали на химическое соединение и концентрацию (DMSO, 5, 10 и 20 мкМ НВХ129653, 5, 10 и 20 мкМ НВХ129654, 5 мкМ НВХ24786 Триметоприм (ТМР) и 5 мкМ НВХ129634 (TMP-PEG5-OH)). Чашки инкубировали при 30°С в течение 3 суток.

Y3H ULTImate YChemH™ - конкуренция со свободным соединением

Конкурентный анализ основывается на описанном ранее подтверждении 1 к 1 с постоянной концентрацией химического зонда (НВХ129653, НВХ129654) и возрастающими концентрациями родительского соединения химического зонда (MOL653, MOL654) или его неактивного энантиомера (INACT653, INACT654) (Таблица 7). Конкурентные анализы проводили на селективной среде при 8 концентрациях свободного соединения (0; 0,25; 0,5; 1; 2; 5; 10 и 20 мкМ) и согласующейся концентрации меченого У3Н-соединения (1 мкМ).

Культура клеток HepaRG

Клетки HepaRG (Biopredics International, Rennes, Франция, Кат. № HPR101) культивировали при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% CO₂ в полной ростовой среде HepaRG, состоящей из среды Уильяма Е (GIBCO), добавки в ростовую среду (Biopredics, Кат. № ADD710), 1% (об./об.) GlutaMAX-I (Gibco #32551) и 1× пенициллина/стрептомицина (Gibco, #15140), в течение 2 недель. Для инициации дифференциации в ростовую среду на конфлюентные клетки добавляли 0,9% (об./об.) DMSO (Sigma-Aldrich, D2650). Через одну неделю среду заменяли полной средой для дифференциации (ростовая среда HepaRG, дополненная 1,8% (об./об.) DMSO), в которой клетки поддерживали в течение приблизительно 4 недель с обновлением среды для дифференциации каждые 7 суток. Дифференцированные клетки HepaRG (dHepaRG) демонстрировали гепатоцитоподобные островки клеток, окруженные монослоем билиарно-подобных клеток. До инфицирования HBV и обработки соединением клетки dHepaRG высевали в 96-луночные планшеты, покрытые коллагеном I (Gibco, кат. № А11428-03), в количестве 60000 клеток на лунку в 100 мкл полной среды для дифференциации. Клеткам давали восстанавливать их дифференцированный фенотип в 96-луночных планшетах в течение приблизительно 1 недели после посева на чашки до инфицирования HBV.

Инфицирование HBV клеток dHepaRG

Клетки dHepaRG инфицировали частицами HBV при MOI (множественность заражения) 30. Частицы HBV продуцировались из клеток HepG2.2.15, продуцирующих HBV (Sells et al 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 1005-1009). Условия культивирования, дифференциация и инфицирование HBV dHepaRG были описаны ранее (Hantz, 2009, J. Gen. Virol., 2009, 90: 127-135). Вкратце, добавляли полную среду для дифференциации (120 мкл/лунку) (ростовая среда HepaRG, состоящая из среды Уильяма (GIBCO), добавки в ростовую среду (Biopredics, Кат. № ADD710) и 1% (об./об.) GlutaMAX-I (Gibco #32551) и 1× пенициллина/стрептомицина (Gibco, #15140), дополненную 1,8% (об./об.) DMSO), содержащую 4% PEG-8000 (полиэтиленгликоль-8000) и маточный раствор вируса (от 20 до 30 GE/клетку). Через одни сутки после инфицирования клетки три раза промывали фосфатно-солевым буферным раствором, и заменяли среду (полная среда для дифференциации) каждые двое суток на протяжении эксперимента.

Обработка HepaRG, инфицированных HBV, миРНК

Пул из четырех разных миРНК приобретали у GE Dharmacon (ON TARGETplus) (Таблица 8).

За одни сутки до инфицирования клеток HBV и через 4 суток после инфицирования клетки обрабатывали пулом миРНК либо против PAPD5, против PAPD7, против обоих, либо ненацеленной миРНК в качестве контроля. миРНК (25 нМ каждой) трансфицировали с использованием DharmaFect 4 (GE Dharmacon; Кат. № T-2004-01) и OPTI-MEM (Thermo Scientific; Кат. №51985034) согласно протоколу изготовителя. Данный эксперимент шел в течение 11 суток.

Измерения антигена HBV

Для оценки влияния на экспрессию и секрецию антигена HBV супернатанты отбирали в сутки 11. Уровни HBsAg и HBeAg HBV измеряли с использованием наборов для CLIA ELISA (Autobio Diagnostic #CL0310-2, #CL0312-2), согласно протоколу изготовителя. Вкратце, 25 мкл супернатанта на лунку переносили в соответствующий планшет для микротитрования, покрытый антителом, и добавляли 25 мкл реактива на основе конъюгата фермента. Планшет инкубировали в течение 60 мин на шейкере при комнатной температуре перед промывкой лунок пять раз промывочным буфером с использованием автоматического промывателя. В каждую лунку добавляли 25 мкл субстрата А и Б. Планшеты инкубировали на шейкере в течение 10 мин при комнатной температуре перед измерением люминисценции с использованием ридера люминисценции Envision (Perkin Elmer).

Жизнеспособность клеток

После удаления от клеток dHepaRG, инфицированных HBV, сред супернатанта клетки инкубировали с раствором CellTiterGlo One (Promega) для измерения жизнеспособности клеток.

После обработок клеток dHepaRG, инфицированных HBV, олигонуклеотидами LNA измеряли жизнеспособность клеток с использованием набора для подсчета клеток-8 (Sigma-Aldrich, #96992) согласно протоколу изготовителя. Вкратце, среду удаляли от клеток и заменяли 110 мкл среды, содержащей 9% набора для подсчета клеток-8. Клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Супернатант переносили в новый 96-луночный планшет, и измеряли поглощение при 450 нм с использованием ридера люминисценции Envision (Perkin Elmer).

ПЦР в реальном времени внутриклеточной мРНК

Для выделения внутриклеточной мРНК dHepaRG один раз промывали PBS (Gibco) и лизировали с использованием MagNA Pure "96 Cellular RNA Large Volume Kit" (Roche #05467535001). Лизаты можно хранить при -80°С. Для реакции кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция) в реальном времени использовали систему выявления последовательности АВ7900 НТ (Applied Biosystems), мастер-микс для экспрессии генов TaqMan® (ThermoFisher Scientific). Для выявления мРНК HBV использовали праймер, специфичный в отношении кора HBV (Integrated DNA Technologies) (Таблица 9), а для измерения уменьшения уровня PAPD5 и PAPD7 в присутствии миРНК использовали геноспецифичные зонды для анализа экспрессии TaqMan® (ThermoFisher Scientific; PAPD5 Кат. №4331182; PAPD7 Кат. №4331182). Образцы нормировали с использованием зонда анализа экспрессии TaqMan® против β-актина (ThermoFisher Scientific; PAPD5 Кат. №4331182).

Экстракция и количественное измерение ДНК HBV из препарата вируса

Экстракция ДНК HBV проводится с использованием набора для вирусов QIAamp UltraSens (Qiagen, #53704) согласно протоколу изготовителя со следующими оптимизациями. 30 мкл и 3 мкл образца вируса разводят в 1 мл PBS перед добавлением буфера АС. Первая стадия центрифугирования осуществляется в течение 45 мин при полной скорости и 4°С. ДНК HBV количественно измеряется в двойной повторности посредством кПЦР с использованием QuantStudio 12K Flex (Applied Biosystems), мастер-микса для экспрессии генов TaqMan (Applied Biosystems, #4369016) и премикса 1:1:0,5 праймеров, показанных в Таблице 9 выше, и зонда разведенного до концентрации 100 мкМ. кПЦР проводится с использованием следующих установок: инкубация UDG (2 мин, 50°С), активация фермента (10 мин, 95°С) и кПЦР (40 циклов по 15 с, 95°С для денатурации и 1 мин, 60°С для отжига и удлинения). Расчет геномных эквивалентов основывается на стандартной кривой, полученной от разведении плазмиды генотипа D HBV с известными концентрациями.

Синтез олигонуклеотидов

Синтез олигонуклеотидов, в общем, известен в данной области. Ниже приводится протокол, который можно применять. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению возможно были получены слегка отличающимися способами в показателях использованных прибора, подложки и концентраций.

Олигонуклеотиды синтезируются на уридиновых универсальных подложках с использованием фосфорамидитного подхода на Oligomaker 48 в 1 мкмольном масштабе. В конце синтеза Олигонуклеотиды отщепляются от твердой подложки с использованием водного аммония в течение 5-16 часов при 60°С. Олигонуклеотиды очищают посредством ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) с обращенной фазой (ВЭЖХ-ОФ) или посредством экстракций твердой фазы и характеризуют последством СВЭЖХ (сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография), а молекулярная масса дополнительно подтверждается посредством МС-ЭРИ (масс-спектрометрия с электрораспылительной ионизацией).

Удлинение олигонуклеотида:

Связывание β-цианоэтилфосфорамидитов (ДНК-А(Bz), ДНК-G(ibu), ДНК-C(Bz), ДНК-Т, LNA-5-метил-С(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf) или LNA-T) проводится с использованием раствора 0,1 М амидита, защищенного 5'-O-DMT, в ацетонитриле и DCI (4,5-дицианоимидазол) в ацетонитриле (0,25 М) в качестве активатора. Для конечного цикла можно использовать фосфорамидит с желательными модификациями, например, С6 линкер для присоединения конъюгатной группы или конъюгатную группу, как таковую. Тиолирование для введения фосфоротиоатных связей проводится с использованием ксантангидрида (0,01 М в ацетонитриле/пиридине 9:1). Фосфодиэфирные связи могут вводиться с использованием 0,02 М йода в THF (тетрагидрофуран)/пиридине/воде 7:2:1. Остальными реактивами являются реактивы, типично используемые для синтеза олигонуклеотидов.

Для конъюгирования после твердофазного синтеза в последнем цикле твердофазного синтеза можно использовать имеющийся в продаже С6 аминолинкер-фосфорамидит, и после снятия защиты и отщепления от твердой подложки выделяется аминосвязанный олигонуклеотид со снятой защитой. Конъюгаты вводятся посредством активации функциональной группы с использованием стандартных способов синтеза.

Очистка посредством ВЭЖХ-ОФ:

Неочищенные соединения очищают посредством препаративной ВЭЖХ-ОФ на колонке Phenomenex Jupiter C18 10 мкм 150×10 мм. В качестве буферов используют 0,1 М ацетат аммония, рН 8, при скорости тока 5 мл/мин. Отобранные фракции лиофилизируют с получением очищенного соединения, типично в виде белого твердого вещества.

Сокращения:

DCI: 4,5-дицианоимидазол

DCM: дихлорметан

DMF: диметилформамид

DMT: 4,4'-диметокситритил

THF: тетрагидрофуран

Bz: бензоил

Ibu: изобутирил

ВЭЖХ-ОФ: высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой.

Анализ T_m:

Дуплексы олигонуклеотида и РНК-мишени (связанной фосфатом - РО) разводят до 3 мМ в 500 мл воды, не содержащей РНКазы, и смешивают с 500 мл 2× T_m-буфера (200 мМ NaCl, 0,2 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 20 мМ фосфат Na, pH 7,0). Данный раствор нагревают до 95°С в течение 3 мин и затем дают осуществляться отжигу при комнатной температуре в течение 30 мин. Температуры плавления дуплекса (T_m) измеряют на спектрофотометре Lambda 40, работающем в ультрафиолетовой/видимой области, оснащенном программатором температуры Пелетье РТР6, используя программу РЕ Templab (Perkin Elmer). Температура повышается от 20°С до 95°С и затем снижается до 25°С, с записью поглощения при 260 нм. Для оценки T_m дуплекса используются первая производная и локальные максимумы как плавления, так и отжига.

Пример 1: DHQ и ТНР связывается с PAPD5 и PAPD7

PAPD5/7 идентифицировали в скрининге Y3H Ultimate YChemH как общего партнера взаимодействия с DHQ и ТНР

Оба белка PAPD5 (вариант 1: NP_001035374; вариант 2: NP_001035375) и PAPD7 (ХР_005248291) идентифицировали по большому числу фрагментов в скрининге Y3H для обоих соединений (DHQ и ТНР), как описано в разделе Материалы и Метод. Идентифицированные белки были ранжированы HYBRIGENICS с баллом достоверности А (шкала от А до D) (Таблица 10).

Взаимодействие PAPD5/7 с DHQ и ТНР могло быть подтверждено с использованием подтверждения 1 к 1 Y3H Ultimate YChemH идентифицированных фрагментов добычи и дополнительно с полноразмерными белками

На первом этапе подтверждения три фрагмента, идентифицированных в первом скрининге, были отобраны для анализа подтверждения 1 к 1 (как описано в разделе Материалы и Метод) и протестированы в трех разных концентрациях (5, 10 и 20 мкМ) (Таблица 11).

Все три фрагмента могли быть подтверждены в качестве специфичных партнеров связывания для DHQ и ТНР уже при наименьшей протестированной концентрации (Фиг. 1).

На второй стадии подтверждения были синтезированы полноразмерные белки PAPD5 и PAPD7, и использованы для подтверждения 1 к 1 (как описано в разделе Материалы и Метод) с DHQ и ТНР (Таблица 12).

Взаимодействия между данными полноразмерными белками и соединениями DHQ и ТНР были подтверждены при наименьшей протестированной концентрации, и было показано то, что они являются специфичными в отношении химических зондов (Фиг. 2).

Конкуренцию взаимодействию PAPD5/7 с DHQ и ТНР в Y3H могут составлять оба свободных активных соединения, но не неактивный энантиомер

После подтверждения связывания DHQ и ТНР с фрагментами белков и полноразмерными PAPD5 и PAPD7, связывание было подтверждено в конкурентном эксперименте Y3H ULTImate YChenH (как описано в разделе Материалы и Метод) с использованием либо неактивного, либо активного свободного соединения (Таблица 13). Уменьшение потери роста дрожжей в присутствии родительского активного соединения, но не в присутствии неактивного энантиомера означает то, что родительское соединение конкурирует с химическим зондом и взаимодействует с белком-мишенью.

Для всех тестируемых соединений анализировали токсичность на неселективной среде при наивысшей концентрации (20 мкМ) с использованием люминисцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega) согласно протоколу изготовителя. При данной концентрации для любого соединения не наблюдали токсичности, так как рост дрожжей не подвергался влиянию (данные не показаны). Для обоих свободных активных родительских соединений (DHQ и ТНР, MOL653 и MOL654 соответственно) могла наблюдаться конкуренция, причем для конкуренции за связывание с полноразмерным белком нужна меньшая концентрация, чем взаимодействий с фрагментом (Фиг. 3 и 4). Успешная перекрестная конкуренция свидетельствует об общем сайте связывания DHQ и ТНР с PAPD5/7 и/или по меньшей мере связывании в тесной близости друг с другом.

Пример 2: ингибирование PAPD5 и/или PAPD7 с использованием миРНК приводит к эффективному лечению инфекции HBV

Для нахождения корреляции между связыванием DHQ и ТНР с PAPD5/7 и влиянием двух данных белков на экспрессию генов HBV авторы изобретения использовали технологию РНКи для уменьшения уровня данных белков в dHepaRG, инфицированных HBV в природе, и для отслеживания влияния этого уменьшения на параметры вируса. Для этого авторы изобретения использовали пулы миРНК против PAPD5 и PAPD7 (см. Таблицу 8) в клетках dHepaRG, инфицированных HBV, как описано в разделе Материалы и метод.

Уменьшение уровня PAPD5 приводило к ингибированию экспрессии вируса, измеренной по секретируемым HBsAg и HBeAg, а также по внутриклеточной мРНК HBV (измеренной с использованием CLIA ELISA и ПЦР в реальном времени, как описано в разделе Материалы и Методы). В то время как уменьшение уровня мРНК PAPD5 кардинально уменьшало экспрессию генов HBV, ингибирование PAPD7 имело умеренный эффект на экспрессию HBV (Фиг. 7). Однако при объединении миРНК против PAPD7 и против PAPD5 наблюдали усиленную синергическую активность против HBV (Фиг. 7), свидетельствующую о компенсаторной роли PAPD7 в отсутствие PAPD5.

Пример 3: DHQ и ТНР эффективно уменьшает уровень HBsAg и HBeAg

Эффективность DHQ и ТНР и их вариантов против инфекции HBV измеряли в клетках HepG2.2.15 с использованием HBsAg и HBeAg в качестве показателя.

Клетки HepG2.2.15 (Sells et al 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 1005-1009) культивировали в 96-луночных планшетах (15000 клеток/лунку в 100 мкл) в DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) плюс GluTaMax-1 (GiBCO, Кат. №10569), 1% пенициллине/стрептомицине (Gibco, Кат. №15140), 10% FBS (фетальная телячья сыворотка) (Clontech, Кат. №631106), генетицине, 0,25 мкг/мл (Invitrogen, 10131035). Соединения тестировали с использованием трехкратных серийных разведении в DMSO с максимальной концентрацией 100 мкМ и 9 серийными разведениями. Каждое соединение тестировали в четырех повторностях. Клетки инкубировали в течение 3 суток, отбирали супернатанты, и измеряли в HBsAg и HBeAg, как описано в разделе Материалы и Методы.

Значения IC₅₀ тестируемых соединений при уменьшении секреции HBsAg и HBeAg показаны далее:

НВХ129653 (DHQ - TMP): IC₅₀ HBsAg 1,181 мкМ

НВХ129654 (ТНР - ТМР): IC₅₀ HBsAg 0,299 мкМ

MOL653 (DHQ - свободное - активное): IC₅₀ HBsAg 0,003 мкМ; IC₅₀ HBeAg 0,007 мкМ

MOL654 (ТНР - свободное - активное): IC₅₀ HBsAg 0,003 мкМ

INACT653 (DHQ - свободное - неактивное): IC₅₀ HBsAg 3,15 мкМ

INACT654 (ТНР - свободное - неактивное): IC₅₀ HBsAg больше 25 мкМ

Пример 4: скрининг эффективности in vitro антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5

Скрининг олигонуклеотидов осуществляли по длине мРНК PAPD5 с использованием 16-20 мерных гэпмеров. Анализ эффективности осуществляли в эксперименте in vitro в клетках HeLa.

Линии клеток

Линию клеток HeLa приобретали в Европейской коллекции аутентичных клеточных культур (ЕСАСС, #93021013) и поддерживали, как рекомендовано поставщиком, в увлажненном инкубаторе при 37°C с 5% CO₂. Для анализов 2500 клеток/лунку высевали в 96-многолуночный планшет в минимальную питательную среду Игла (Sigma, M2279) с 10% фетальной телячей сыворотки (FBS), 2 мМ глутамином AQ, 1% NEAA, 25 мкг/мл гентамицина.

Эффективность олигонуклеотидов

Клетки инкубировали в течение 24 часов до добавления олигонуклеотидов, растворенных в PBS. Конечная концентрация олигонуклеотидов составляла 5 и 25 мкМ, конечный объем культуры составлял 100 мкл/лунку. Клетки отбирали через 3 суток после добавления олигонуклеотидных соединений, и РНК экстрагировали с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. После денатурации дуплекса PHК/LNA (90°С, 40 с) проводили кПЦР с одноэтапным протоколом (qScript™ XLT одноэтапная кПЦР-ОТ ToughMix®, Low ROX™ от Quanta Bioscience, #95134-500) в дуплексной системе с анализами с праймерами TaqMan для интересующего гена - PAPD5 (Hs00223727_m1, FAM-MGB, Life Technologies) и гена домашнего хозяйства - GUSB (Hu_4326320E, VIC-MGB, Life Technologies), следуя рекомендациям поставщика. Относительный уровень экспрессии мРНК PAPD5 показан в Таблице 14 в виде % относительно среднего контрольных образцов (клетки, обработанные PBS). На Фиг. 8 представлен нокдаун мишени, достигаемый с индивидуальными олигонуклеотидными соединениями по всей кодирующей последовательности PAPD5.

Пример 5: скрининг на эффективность in vitro антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD7

Скрининг олигонуклеотидов по длине мРНК PAPD7 проводили по существу, как описано в Примере 4, с заменой на анализ на основе праймеров TaqMan для интересующего гена PAPD7 (Hs00173159_m1, FAM-MGB, Life Technologies).

Относительный уровень экспрессии мРНК PAPD7 показан в Таблице 15 в виде % относительно среднего контрольных образцов (клетки, обработанные PBS). На Фиг. 9 представлен нокдаун мишени, достигаемый с индивидуальными олигонуклеотидными соединениями по всей кодирующей последовательности PAPD7.

Пример 6: влияние на клетки dHepaRG, инфицированные HBV, с использованием отобранных антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 или PAPD7, доставленных в клетки посредством гимнозиса

Выбирали набор самых эффективных олигонуклеотидов из Примера 4 и 5 для анализа их влияния на параметры размножения HBV в клетках dHepaRG, инфицированных HBV.

Клетки dHepaRG, инфицированные HBV (описанные в разделе Материалы и Методы, инфицирование HBV клеток dHepaRG), культивировали в 96-луночных планшетах. Через одни сутки после инфекции HBV 20 мкМ олигонуклеотида доставляли в клетки с использованием самостоятельного поглощения (гимнозиса). Всего анализировали 40 олигонуклеотидов: 20, нацеленных на PAPD5, и 20, нацеленных на PAPD7. Данные эксперименты проводили в тройной повторности с контролями в виде PBS. Обработку олигонуклеотидами, включающую замену среды, повторяли в сутки 4 и 7 (это отличается от замены каждые 2 суток, описанной в разделе Материалы и Методы).

В сутки 11 после инфекции супернатанты отбирали, и уровни HBsAg и HBeAg оценивали с использованием анализа CLIA ELISA (см. Материалы и Методы, измерения антигена HBV). Жизнеспособность клеток измеряли, как описано в разделе Материалы и Метод, Жизнеспособность клеток. мРНК экстрагировали из клеток с использованием робота MagNA Pure и набора для клеточной РНК большого объема MagNA Pure 96 (Roche, #05467535001) согласно протоколу изготовителя. мРНК HBV и мРНК PAPD5 или PAPD7 количественно измеряли в двойной технической повторности посредством кПЦР с использованием QuantStudio 12K Flex (Applied Biosystems), 1-этапного набора TaqMan RNA-to-CT (Applied Biosystems, #4392938), эндогенного контроля в виде человеческого АСТВ (Applied Biosystems, #4310881Е). Реактивы Taqman использовали вместе со следующими имеющимися в продаже праймерами ThermoFisher Sceintific (HBV Pa03453406_s1; PAPD5 Hs00900790_m1 и PAPD7 Hs00173159_m1). Экспрессию мРНК анализировали с использованием способа 2-ΔΔCt сравнительного порогового цикла с нормированием к контрольному гену АСТВ (ThermoFisher Sceintific 4310881Е) и к клеткам, обработанным PBS.

Влияния обработки олигонуклеотидами на мРНК PAPD5 или PAPD7, а также влияние на параметр размножения HBV - HBsAg - показаны в Таблице 16 и Таблице 17.

Из этих данных можно видеть то, что ингибирование мРНК PAPD5 (Таблица 16) и мРНК PAPD7 (Таблица 17) было очень эффективным для большинства олигонуклеотидных соединений.

Наблюдаемое влияние уменьшения уровня мРНК PAPD5 и PAPD7 на уровни HBsAg является, однако, менее отчетливым даже в клетках, обработанных в течение 11 суток после самостоятельной доставки олигонуклеотида. Здесь только нацеленные на PAPD5 СМР ID NO: 23_1, 26_1 и 115_1 демонстрировали явное ингибирование HBsAg, а из соединений, нацеленных на PAPD7, только СМР ID NO: 229_1 демонстрировало явное ингибирование HBsAg. Не будучи связанными теорией, это могло быть обусловлено медленным началом влияния, вызванного нокдауном мишени, на ингибирование HBsAg в настоящем анализе и, таким образом, для некоторых соединений ингибирование HBsAg не было бы заментным, если оно не анализируется в более поздний момент времени.

Пример 7: влияние на клетки dHepaRG, инфицированные HBV, с использованием комбинированного препарата антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 и PAPD7, доставленных в клетки посредством гимнозиса

В Примере 2 наблюдали то, что смешивание пула миРНК, нацеленных на PAPD7, с пулом миРНК, нацеленных на PAPD5, приводило к синергической активности против HBV. Целью настоящего примера является иследование того, могла ли аналогичная синергия наблюдаться при объединении двух индивидуальных одноцепочечных олигонуклеотидов, где один нацелен на PAPD5, и один нацелен на PAPD7.

Данный эксперимент проводили, как описано в Примере 6, с тем изменением, что, вместо добавления индивидуальных олигонуклеотидов, добавляли к клеткам комбинацию двух олигонуклеотидов, таким образом, что 20 мкМ одного олигонуклеотида, нацеленного на PAPD5, было добавлено вместе с 20 мкМ второго олигонуклеотида, нацеленного на PAPD7. Для данных комбинаций измеряли только HBsAg. Комбинацию олигонуклеотидов можно видеть в Таблице 18, включая результаты по параметрам размножения HBV, ингибированию HBsAg.

Данные результаты также обобщаются на Фиг. 10. Из 40 комбинаций, протестированных выше, 18 приводили к очевидному синергическому влиянию на ингибирование HBsAg. 7 из данных синергических комбинаций образованы с олигонуклеотидами, которые индивидуально не дают какого-либо влияния на ингибирование HBsAg в текущем анализе. Из данного эксперимента можно заключить то, что комбинация олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 и PAPD7, имеет высокую вероятность продуцирования синергического влияния на ингибирование HBsAg.

Пример 8: повтор отобранных комбинаций из Примера 7

Эксперимент в Примере 7 повторяли с комбинациями олигонуклеотидов, указанными в Таблице 19.

Из этих данных можно видеть то, что синергический эффект, наблюдаемый в Примере 7, является воспроизводимым.

Пример 9: влияние на клетки dHepaRG, инфицированные HBV, с использованием отобранных антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 и PAPD7, доставленных в клетки посредством трансфекции

В следующем эксперименте исследовали, могли ли быть достигнуты аналогичные синергические результаты с использованием трансфекции олигонуклеотидов в клетки dHepaRG, инфицированные HBV, вместо самостоятельной доставки.

Двенадцать олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5 (Таблица 20), и тринадцать олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD7 (Таблица 21), индивидуально тестировали с использованием трансфекционного анализа, описанного в данном документе.

Олигонуклеотиды трансфицировали в формате 96-луночного планшета в конечной концентрации 500 нМ на лунку в дифференцированные клетки HepaRG через одни сутки после инфекции HBV (описано в разделе Материалы и Методы, инфекция HBV клеток dHepaRG). До трансфекции среду заменяли 100 мкл полной среды для дифференциации, не содержащей пенициллин/стрептомицин. Для обработки одним олигонуклеотидом олигонуклеотид разводили в среде Opti-MEM+Glutamax-I с пониженным содержанием сыворотки (Gibco, #51985) и инкубировали при соотношении 1:1 с липофектамином RNAiMax (Invitrogen, #56532) в течение 5 минут при комнатной температуре согласно инструкциям изготовителя. Из данной смеси LNA-трансфекционный реактив 20 мкл затем добавляли на поверхность клеток. Через 3 суток среду заменяли полной средой для дифференциации. В сутки 5 после трансфекции измеряли HBsAg, как описано в разделе Материалы и Метод, уровень мРНК PAPD5 и PAPD7 измеряли, как описано в Примере 6.

Кроме того, некоторые из олигонуклеотидов против PAPD5 и PAPD7 тестировали в комбинации (Таблица 22). Данные олигонуклеотды сотрансфицировали в клетки HepaRG, инфицированные HBV, с использованием того же самого протокола, что и одна обработка 500 нМ каждого олигонуклеотида в конечной концентрации.

Из этих данных можно видеть то, что при использовании трансфекционного анализа 6 из 12 олигонуклеотидов, нацеленных на PAPD5, имеют явное влияние на ингибирование HBsAg, которое значительно больше, чем наблюдаемое с использованием гимнотического анализа в Примере 6. Также число соединений, нацеленных на PAPD7, которые имеют влияние на ингибирование HBsAg, было увеличено при применении трансфекционного анализа таким образом, что 4 из 12 соединений имеют явное влияние на ингибирование HBsAg. Данные от комбинаций обобщаются в Таблице 22 и на Фиг. 11. Из этих данных можно видеть то, что 9 из 12 протестированных комбинаций дают очевидное синергическое влияние на ингибирование HBsAg.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> F. Hoffmann la Roche

<120> МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ УРОВНЯ мРНК PAPD5 И/ИЛИ

PAPD7 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА В

<130> P33547-WO

<160> 267

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 698

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Arg Pro Arg Pro Arg Ser Ala Pro Gly Lys Pro Arg Arg Arg Ser

1 5 10 15

Arg Ala Arg Leu Arg Ser Ser Arg Thr Pro Ser Gly Gly Ala Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ala Thr Gly Gly Ser Gly

35 40 45

Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Gly Ala Ala Ser Ala Pro Ala Pro Ala

50 55 60

Pro Ala Gly Met Tyr Arg Ser Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ser His Ala

65 70 75 80

Leu Pro Ala Glu Gln Arg Asp Phe Leu Pro Leu Glu Thr Thr Asn Asn

85 90 95

Asn Asn Asn His His Gln Pro Gly Ala Trp Ala Arg Arg Ala Gly Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Ser Pro Pro Ser Ala Ser Ser Ser Pro His Pro Ser Ala

115 120 125

Ala Val Pro Ala Ala Asp Pro Ala Asp Ser Ala Ser Gly Ser Ser Asn

130 135 140

Lys Arg Lys Arg Asp Asn Lys Ala Ser Thr Tyr Gly Leu Asn Tyr Ser

145 150 155 160

Leu Leu Gln Pro Ser Gly Gly Arg Ala Ala Gly Gly Gly Arg Ala Asp

165 170 175

Gly Gly Gly Val Val Tyr Ser Gly Thr Pro Trp Lys Arg Arg Asn Tyr

180 185 190

Asn Gln Gly Val Val Gly Leu His Glu Glu Ile Ser Asp Phe Tyr Glu

195 200 205

Tyr Met Ser Pro Arg Pro Glu Glu Glu Lys Met Arg Met Glu Val Val

210 215 220

Asn Arg Ile Glu Ser Val Ile Lys Glu Leu Trp Pro Ser Ala Asp Val

225 230 235 240

Gln Ile Phe Gly Ser Phe Lys Thr Gly Leu Tyr Leu Pro Thr Ser Asp

245 250 255

Ile Asp Leu Val Val Phe Gly Lys Trp Glu Asn Leu Pro Leu Trp Thr

260 265 270

Leu Glu Glu Ala Leu Arg Lys His Lys Val Ala Asp Glu Asp Ser Val

275 280 285

Lys Val Leu Asp Lys Ala Thr Val Pro Ile Ile Lys Leu Thr Asp Ser

290 295 300

Phe Thr Glu Val Lys Val Asp Ile Ser Phe Asn Val Gln Asn Gly Val

305 310 315 320

Arg Ala Ala Asp Leu Ile Lys Asp Phe Thr Lys Lys Tyr Pro Val Leu

325 330 335

Pro Tyr Leu Val Leu Val Leu Lys Gln Phe Leu Leu Gln Arg Asp Leu

340 345 350

Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Ser Tyr Ser Leu Phe Leu Met

355 360 365

Ala Val Ser Phe Leu Gln Leu His Pro Arg Glu Asp Ala Cys Ile Pro

370 375 380

Asn Thr Asn Tyr Gly Val Leu Leu Ile Glu Phe Phe Glu Leu Tyr Gly

385 390 395 400

Arg His Phe Asn Tyr Leu Lys Thr Gly Ile Arg Ile Lys Asp Gly Gly

405 410 415

Ser Tyr Val Ala Lys Asp Glu Val Gln Lys Asn Met Leu Asp Gly Tyr

420 425 430

Arg Pro Ser Met Leu Tyr Ile Glu Asp Pro Leu Gln Pro Gly Asn Asp

435 440 445

Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Gln Val Lys Gln Ala Phe Asp

450 455 460

Tyr Ala Tyr Val Val Leu Ser His Ala Val Ser Pro Ile Ala Lys Tyr

465 470 475 480

Tyr Pro Asn Asn Glu Thr Glu Ser Ile Leu Gly Arg Ile Ile Arg Val

485 490 495

Thr Asp Glu Val Ala Thr Tyr Arg Asp Trp Ile Ser Lys Gln Trp Gly

500 505 510

Leu Lys Asn Arg Pro Glu Pro Ser Cys Asn Gly Asn Gly Val Thr Leu

515 520 525

Ile Val Asp Thr Gln Gln Leu Asp Lys Cys Asn Asn Asn Leu Ser Glu

530 535 540

Glu Asn Glu Ala Leu Gly Lys Cys Arg Ser Lys Thr Ser Glu Ser Leu

545 550 555 560

Ser Lys His Ser Ser Asn Ser Ser Ser Gly Pro Val Ser Ser Ser Ser

565 570 575

Ala Thr Gln Ser Ser Ser Ser Asp Val Asp Ser Asp Ala Thr Pro Cys

580 585 590

Lys Thr Pro Lys Gln Leu Leu Cys Arg Pro Ser Thr Gly Asn Arg Val

595 600 605

Gly Ser Gln Asp Val Ser Leu Glu Ser Ser Gln Ala Val Gly Lys Met

610 615 620

Gln Ser Thr Gln Thr Thr Asn Thr Ser Asn Ser Thr Asn Lys Ser Gln

625 630 635 640

His Gly Ser Ala Arg Leu Phe Arg Ser Ser Ser Lys Gly Phe Gln Gly

645 650 655

Thr Thr Gln Thr Ser His Gly Ser Leu Met Thr Asn Lys Gln His Gln

660 665 670

Gly Lys Ser Asn Asn Gln Tyr Tyr His Gly Lys Lys Arg Lys His Lys

675 680 685

Arg Asp Ala Pro Leu Ser Asp Leu Cys Arg

690 695

<210> 2

<211> 698

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Arg Pro Arg Pro Arg Ser Ala Pro Gly Lys Pro Arg Arg Arg Ser

1 5 10 15

Arg Ala Arg Leu Arg Ser Ser Arg Thr Pro Ser Gly Gly Ala Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ala Thr Gly Gly Ser Gly

35 40 45

Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Gly Ala Ala Ser Ala Pro Ala Pro Ala

50 55 60

Pro Ala Gly Met Tyr Arg Ser Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ser His Ala

65 70 75 80

Leu Pro Ala Glu Gln Arg Asp Phe Leu Pro Leu Glu Thr Thr Asn Asn

85 90 95

Asn Asn Asn His His Gln Pro Gly Ala Trp Ala Arg Arg Ala Gly Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Ser Pro Pro Ser Ala Ser Ser Ser Pro His Pro Ser Ala

115 120 125

Ala Val Pro Ala Ala Asp Pro Ala Asp Ser Ala Ser Gly Ser Ser Asn

130 135 140

Lys Arg Lys Arg Asp Asn Lys Ala Ser Thr Tyr Gly Leu Asn Tyr Ser

145 150 155 160

Leu Leu Gln Pro Ser Gly Gly Arg Ala Ala Gly Gly Gly Arg Ala Asp

165 170 175

Gly Gly Gly Val Val Tyr Ser Gly Thr Pro Trp Lys Arg Arg Asn Tyr

180 185 190

Asn Gln Gly Val Val Gly Leu His Glu Glu Ile Ser Asp Phe Tyr Glu

195 200 205

Tyr Met Ser Pro Arg Pro Glu Glu Glu Lys Met Arg Met Glu Val Val

210 215 220

Asn Arg Ile Glu Ser Val Ile Lys Glu Leu Trp Pro Ser Ala Asp Val

225 230 235 240

Gln Ile Phe Gly Ser Phe Lys Thr Gly Leu Tyr Leu Pro Thr Ser Asp

245 250 255

Ile Asp Leu Val Val Phe Gly Lys Trp Glu Asn Leu Pro Leu Trp Thr

260 265 270

Leu Glu Glu Ala Leu Arg Lys His Lys Val Ala Asp Glu Asp Ser Val

275 280 285

Lys Val Leu Asp Lys Ala Thr Val Pro Ile Ile Lys Leu Thr Asp Ser

290 295 300

Phe Thr Glu Val Lys Val Asp Ile Ser Phe Asn Val Gln Asn Gly Val

305 310 315 320

Arg Ala Ala Asp Leu Ile Lys Asp Phe Thr Lys Lys Tyr Pro Val Leu

325 330 335

Pro Tyr Leu Val Leu Val Leu Lys Gln Phe Leu Leu Gln Arg Asp Leu

340 345 350

Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Ser Tyr Ser Leu Phe Leu Met

355 360 365

Ala Val Ser Phe Leu Gln Leu His Pro Arg Glu Asp Ala Cys Ile Pro

370 375 380

Asn Thr Asn Tyr Gly Val Leu Leu Ile Glu Phe Phe Glu Leu Tyr Gly

385 390 395 400

Arg His Phe Asn Tyr Leu Lys Thr Gly Ile Arg Ile Lys Asp Gly Gly

405 410 415

Ser Tyr Val Ala Lys Asp Glu Val Gln Lys Asn Met Leu Asp Gly Tyr

420 425 430

Arg Pro Ser Met Leu Tyr Ile Glu Asp Pro Leu Gln Pro Gly Asn Asp

435 440 445

Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Gln Val Lys Gln Ala Phe Asp

450 455 460

Tyr Ala Tyr Val Val Leu Ser His Ala Val Ser Pro Ile Ala Lys Tyr

465 470 475 480

Tyr Pro Asn Asn Glu Thr Glu Ser Ile Leu Gly Arg Ile Ile Arg Val

485 490 495

Thr Asp Glu Val Ala Thr Tyr Arg Asp Trp Ile Ser Lys Gln Trp Gly

500 505 510

Leu Lys Asn Arg Pro Glu Pro Ser Cys Asn Gly Asn Gly Val Thr Leu

515 520 525

Ile Val Asp Thr Gln Gln Leu Asp Lys Cys Asn Asn Asn Leu Ser Glu

530 535 540

Glu Asn Glu Ala Leu Gly Lys Cys Arg Ser Lys Thr Ser Glu Ser Leu

545 550 555 560

Ser Lys His Ser Ser Asn Ser Ser Ser Gly Pro Val Ser Ser Ser Ser

565 570 575

Ala Thr Gln Ser Ser Ser Ser Asp Val Asp Ser Asp Ala Thr Pro Cys

580 585 590

Lys Thr Pro Lys Gln Leu Leu Cys Arg Pro Ser Thr Gly Asn Arg Val

595 600 605

Gly Ser Gln Asp Val Ser Leu Glu Ser Ser Gln Ala Val Gly Lys Met

610 615 620

Gln Ser Thr Gln Thr Thr Asn Thr Ser Asn Ser Thr Asn Lys Ser Gln

625 630 635 640

His Gly Ser Ala Arg Leu Phe Arg Ser Ser Ser Lys Gly Phe Gln Gly

645 650 655

Thr Thr Gln Thr Ser His Gly Ser Leu Met Thr Asn Lys Gln His Gln

660 665 670

Gly Lys Ser Asn Asn Gln Tyr Tyr His Gly Lys Lys Arg Lys His Lys

675 680 685

Arg Asp Ala Pro Leu Ser Asp Leu Cys Arg

690 695

<210> 3

<211> 792

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Asp Pro Arg Val Ala Trp Ile Gln Pro Glu Gln Lys Gly Pro Ala

1 5 10 15

Asn Ala Leu Trp Met Gln Ile Trp Glu Thr Ser Gln Gly Val Gly Arg

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Leu Asn Ser Pro Ala Leu

35 40 45

Asp Thr Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Arg Gly Ser Gly Gly Leu

50 55 60

Gly Pro Ala Leu Pro Ala Ala Ser Pro Pro Pro Pro Gly Pro Thr Ala

65 70 75 80

Pro Ala Ala Leu Pro Pro Ala Leu Leu Thr Ala Leu Gly Pro Ala Ala

85 90 95

Glu Gly Ala Arg Arg Leu His Lys Ser Pro Ser Leu Ser Ser Ser Ser

100 105 110

Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ala Glu Ser Gly Thr Glu Ser Pro Gly Cys

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Leu Gly Arg Pro Gly Gly Gly

130 135 140

Arg Gly Gly Ala Phe Phe Asn Phe Ala Asp Gly Ala Pro Ser Ala Pro

145 150 155 160

Gly Thr Ala Asn Gly His Pro Gly Pro Arg Gly Pro Ala Pro Ala Gly

165 170 175

Ser Pro Ser Gln His Gln Phe His Pro Gly Arg Arg Lys Arg Glu Asn

180 185 190

Lys Ala Ser Thr Tyr Gly Leu Asn Tyr Leu Leu Ser Gly Ser Arg Ala

195 200 205

Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gln Ala Pro Arg Pro

210 215 220

Gly Thr Pro Trp Lys Ser Arg Ala Tyr Ser Pro Gly Ile Gln Gly Leu

225 230 235 240

His Glu Glu Ile Ile Asp Phe Tyr Asn Phe Met Ser Pro Cys Pro Glu

245 250 255

Glu Ala Ala Met Arg Arg Glu Val Val Lys Arg Ile Glu Thr Val Val

260 265 270

Lys Asp Leu Trp Pro Thr Ala Asp Val Gln Ile Phe Gly Ser Phe Ser

275 280 285

Thr Gly Leu Tyr Leu Pro Thr Ser Asp Ile Asp Leu Val Val Phe Gly

290 295 300

Lys Trp Glu Arg Pro Pro Leu Gln Leu Leu Glu Gln Ala Leu Arg Lys

305 310 315 320

His Asn Val Ala Glu Pro Cys Ser Ile Lys Val Leu Asp Lys Ala Thr

325 330 335

Val Pro Ile Ile Lys Leu Thr Asp Gln Glu Thr Glu Val Lys Val Asp

340 345 350

Ile Ser Phe Asn Met Glu Thr Gly Val Arg Ala Ala Glu Phe Ile Lys

355 360 365

Asn Tyr Met Lys Lys Tyr Ser Leu Leu Pro Tyr Leu Ile Leu Val Leu

370 375 380

Lys Gln Phe Leu Leu Gln Arg Asp Leu Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly

385 390 395 400

Ile Ser Ser Tyr Ser Leu Ile Leu Met Ala Ile Ser Phe Leu Gln Leu

405 410 415

His Pro Arg Ile Asp Ala Arg Arg Ala Asp Glu Asn Leu Gly Met Leu

420 425 430

Leu Val Glu Phe Phe Glu Leu Tyr Gly Arg Asn Phe Asn Tyr Leu Lys

435 440 445

Thr Gly Ile Arg Ile Lys Glu Gly Gly Ala Tyr Ile Ala Lys Glu Glu

450 455 460

Ile Met Lys Ala Met Thr Ser Gly Tyr Arg Pro Ser Met Leu Cys Ile

465 470 475 480

Glu Asp Pro Leu Leu Pro Gly Asn Asp Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly

485 490 495

Ala Met Gln Val Lys Gln Val Phe Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Leu Ser

500 505 510

His Ala Val Ser Pro Leu Ala Arg Ser Tyr Pro Asn Arg Asp Ala Glu

515 520 525

Ser Thr Leu Gly Arg Ile Ile Lys Val Thr Gln Glu Val Ile Asp Tyr

530 535 540

Arg Arg Trp Ile Lys Glu Lys Trp Gly Ser Lys Ala His Pro Ser Pro

545 550 555 560

Gly Met Asp Ser Arg Ile Lys Ile Lys Glu Arg Ile Ala Thr Cys Asn

565 570 575

Gly Glu Gln Thr Gln Asn Arg Glu Pro Glu Ser Pro Tyr Gly Gln Arg

580 585 590

Leu Thr Leu Ser Leu Ser Ser Pro Gln Leu Leu Ser Ser Gly Ser Ser

595 600 605

Ala Ser Ser Val Ser Ser Leu Ser Gly Ser Asp Val Asp Ser Asp Thr

610 615 620

Pro Pro Cys Thr Thr Pro Ser Val Tyr Gln Phe Ser Leu Gln Ala Pro

625 630 635 640

Ala Pro Leu Met Ala Gly Leu Pro Thr Ala Leu Pro Met Pro Ser Gly

645 650 655

Lys Pro Gln Pro Thr Thr Ser Arg Thr Leu Ile Met Thr Thr Asn Asn

660 665 670

Gln Thr Arg Phe Thr Ile Pro Pro Pro Thr Leu Gly Val Ala Pro Val

675 680 685

Pro Cys Arg Gln Ala Gly Val Glu Gly Thr Ala Ser Leu Lys Ala Val

690 695 700

His His Met Ser Ser Pro Ala Ile Pro Ser Ala Ser Pro Asn Pro Leu

705 710 715 720

Ser Ser Pro His Leu Tyr His Lys Gln His Asn Gly Met Lys Leu Ser

725 730 735

Met Lys Gly Ser His Gly His Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Val

740 745 750

Gly Ser Gly Gly Val Arg Pro Pro Val Gly Asn Arg Gly His His Gln

755 760 765

Tyr Asn Arg Thr Gly Trp Arg Arg Lys Lys His Thr His Thr Arg Asp

770 775 780

Ser Leu Pro Val Ser Leu Ser Arg

785 790

<210> 4

<211> 8114

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 4

acaacgcgct ccctgcgggg cgggcggcaa cctccatgcg gcctcgtcca cgctcagcac 60

cggggaagcc gaggcggaga agccgcgcgc gcctcagaag ctcccggacg cccagcggcg 120

gcgcgagcgg cggcggcggc agcagcagca gcagcagcac ggccaccggc gggagcggca 180

gcagcaccgg cagccccggc ggcgcggcct cggccccggc cccggccccg gccggcatgt 240

atcgctccgg ggagcgcctg ctgggcagcc acgcgctgcc cgcggagcag cgggacttcc 300

tgcccctaga gacgaccaac aacaacaaca accaccacca gcccggggcc tgggcccgcc 360

gggcgggctc ctcggcgtcc tcgcctccct cggcgtcctc gtccccgcac ccttcggccg 420

ccgtccccgc cgccgatcca gccgattcgg cctcgggcag cagcaacaag aggaagcgcg 480

acaacaaggc cagcacgtat ggactcaact acagcctgct gcagcccagc ggagggcggg 540

ccgcgggggg cggccgagca gacggcggcg gggtcgtgta cagcgggacc ccgtggaaac 600

ggaggaacta caaccaggga gtcgtgggtc tgcatgaaga aatcagtgat ttttatgaat 660

acatgtctcc aagacctgag gaggagaaga tgcggatgga ggtggtgaac aggatcgaga 720

gtgtaattaa ggagctctgg cccagcgctg acgtccagat atttggaagt tttaaaactg 780

gactttattt acctactagt gacatcgacc tagtggtgtt tgggaagtgg gagaacctac 840

ccctctggac tctggaagaa gctcttcgga aacacaaagt cgcagatgag gattcggtga 900

aagttttaga caaagcaact gtacctatta ttaaattaac agattctttt actgaagtga 960

aagttgatat cagctttaat gtacagaatg gcgtgagagc agctgacctc atcaaagatt 1020

ttaccaagaa atatcctgta ttgccatact tggttttagt attgaaacaa ttcctattgc 1080

agagggacct taatgaagta tttacaggtg gaattggttc ttatagtctc tttttaatgg 1140

cagtcagttt ccttcagtta catcccaggg aagatgcttg catccccaat acaaactatg 1200

gtgttctctt aatagaattt tttgaattat atggacgaca cttcaattat ttaaagactg 1260

gcatccggat aaaggatggt ggttcatatg tggccaaaga tgaagtacag aaaaatatgc 1320

tagatggcta caggccatca atgctttata tcgaagatcc tttacaacca ggtaacgatg 1380

ttggaaggag ttcatatggg gccatgcaag tgaagcaggc ctttgattat gcctacgttg 1440

ttttgagtca tgctgtatca ccaatagcaa agtactatcc caacaatgaa acagaaagca 1500

tactaggtag aataattaga gtaacagatg aagttgccac atatagagat tggatatcaa 1560

agcagtgggg cttgaagaat agacctgagc cttcatgcaa tggaaatggt gttaccttga 1620

tagtagatac tcagcagtta gataaatgta ataataatct atctgaagaa aatgaagccc 1680

ttggaaaatg tagaagtaaa acctcggaat ctcttagtaa acactcttca aactcttcat 1740

caggtccagt gtcgtcctct tctgccacac agtccagctc tagtgatgta gattccgatg 1800

caacaccatg caaaaccccg aaacagctgc tttgccgtcc gtccactggg aaccgagtag 1860

ggtcgcaaga tgtatccttg gagtcctctc aggcagttgg gaaaatgcaa agcacccaaa 1920

ccactaacac atccaacagc accaacaaat ctcagcatgg atcagcaagg ctctttcgtt 1980

cttccagcaa aggcttccaa ggtacaactc aaacaagcca tggttccttg atgacaaaca 2040

aacaacatca aggcaaatcc aataatcagt attaccatgg caaaaagagg aaacacaaga 2100

gggacgcgcc cctctcagac ctctgtagat agtcagcgct gcgcggtgga ctgtcttctc 2160

tgtgcaatga tctcatgctc aggacagttg cgcagggact cctgggagat attcaggagc 2220

ctcacactgt tcagacgttg acttagcaac tgcgtttttt cccagctcgc cacagaatgg 2280

atcatgaaga ctgacaactg caaaaaaaac aaaacaaaac aaaaaaaaaa gcaagcaaaa 2340

aagagggaaa aaaaaggctg cttatttgat aagtcatatg ctacaacagg gtcattttaa 2400

gatttaaagc ttgaatgtaa aataaatata tttctcattg gctttatgca gagttatagg 2460

gaatagtatt cagtgttggt agggtgatag aaacaaaaaa cagtatcaga ggatgaggtg 2520

gggaaggaaa acaaaggtat ctgataggaa gtccagattc caaaggggaa agtgatctgt 2580

gcatgttttt tttttaaata tttttgcata tatttaccat tttattgtgt gtatatatag 2640

aagaccatat aggagattga tatttgtaat agtggatttg ttaataatac tttttacata 2700

acattactgt ttaaattgta aacagatttt ttctcaggat tagtttgaaa aataatctaa 2760

attgtcatct taacatccat atatagggaa gtgattagtt ctattactca atttgttttt 2820

ctcagcattg aaatgactta atagaaccct tgtgtcctgc tgcaaaaatt tttcctctct 2880

aaagaaaagg tttatggtgg caaatgatgt ttattttatt ttgtaaaaaa aaaaaaatgt 2940

actatgtact tttgtgtaaa cactgaaaaa tctctggtca tctccgagaa ttaacttgca 3000

actgttttct atagtgctgt cgtcttgggc aatgggcaat tacatgactt tgtgtttgct 3060

tcctttgcag tctttttttt ttccccccat ttcttcctaa taggaaaaaa aaaaaaaaaa 3120

aggtcaccca tgtctggtct cattcctgtt gcagtgaaac ttcgagttcc acagactttg 3180

catgctggct tctctaaccc tgtgtgctgc gtgtgcctgt ttctcatctc ttattctttt 3240

taaaattcat gcttaactac tgtgggagaa taactgtaaa cagctttaat taaatcatac 3300

ttataaaaaa ctattttctt atattccact ctatgctttt ggtattgttg atctttacaa 3360

attaaatggt ctttgataat ggatctattt tgtattgcct tattaagacc aaatacttct 3420

tgtcatccca ttctttatcc tcttctttca tggaattgtt atcgttaatt aaaacttttt 3480

taaacattgg cttgtttcaa tcatactgta aattttggtt gtagtcagct ttgagtgcaa 3540

tgagatgtat aattctgtta tcattacctg ttgagtttga aactcagttg ggaatattta 3600

atataataga atgtaagtga catttctgaa aatgctttct ttcagggtga aagctcttat 3660

gtttagcatc aatgtgtatg gctctgttaa atgcagccat ttctgagacg agattctttt 3720

atatatatat acatataaag tactattggc ttttaggagt ttcttttata tacatttatg 3780

aaatactgaa gaccaatcag accattaatg gacacttagt gtaacttttt ataaagaaaa 3840

taatgctaaa gtaagaccaa aactgatgtc atcactgaaa ttaacaattt tcaatatgtt 3900

catattttaa ttcacaatgg aaaaatgtgt tccaaaactg gaaactcata gtactcgtgt 3960

aaactgtgga agatttcaaa tgtgatgtta ttttgacaat gttttaaatt ttagagtcac 4020

attttattct gatcagaatt tttattgaga tgttgagctt ttgtttttga aactagtttg 4080

tcataacatt gtgcataatc acagtattta ttttctagga caattgtgaa tgtgtagact 4140

tatgtttact gctaagggaa caattattta taaaataata ttaaatccag tattagctgc 4200

ctatttcaga cacttaatac ttgcagagat ctatgttaca tttaccacac tgaagttttt 4260

tttgttgttt tttgtttgtt tttaaagaat caccctcatt gttgaaagta aatgtactct 4320

tagggtgcga atattagtgt tccaataagc atgtgattat attaaggtgg tggtagcggg 4380

aagataattc tgattccatt gggaatctta ggttttcgta aatttattgg gaaaatagtt 4440

tttcctgtac tgctgaagtt tctttttggt aaacagtatc tttctaaaag aaaaaagcat 4500

gaaggagaaa ttgaggtgtg tatacatttc ctcaaatgac cagcattgta ttcgtgaata 4560

ctgtgtatct tgcagtgaac agtgtggaag ctgttcattt ttcaatctga agtaaaatac 4620

tttcaagaac ttttagtttg cctgctcatt tgttttatac atttcatcta tttgactcct 4680

atcttatttc ttttttgagt tttaatactt cctatatttt gtgaatatat cagaaatgtg 4740

tcatttatat attagagtcc attcatatcc atgaatcata accttccttt gctaatactt 4800

gttgaatggg attttacaaa ttctccctca ctctggtgac atttctcagg cagtcatgta 4860

tgtgtacctg gccattagaa atattaatat ttaaagactg ttttttagag gagctgatgg 4920

gttggtgagg tgtcagcaca aaatcttact ggttatgttt tgatgataaa agtatatcca 4980

ttttttccct ccagctttaa ggtgactgtg aaggtgcctg gttttgaatg tctttgtttg 5040

gtttggagat gtcgcactca gttttcaaat ctagcttgga tctgtaggac ctatgttttt 5100

tacaagtaat tgccctccag tcttcaacag ttgattctgt tttattttta tcctgttttg 5160

agtgtacttt acctttactt gcattttgag cctcattaat atttaggtta tttgatttgg 5220

ctccagatat tcctagatct gcacagggca aaacatgggc tatagggtga gcatttttaa 5280

ttgtcttttt ctgctggaac cttatatctc tccatgtgtt ttctgctcct tccctccccc 5340

atgaaatggt aagtgtgact tgtgtttgcc tgaacctgtg gactagtgtt tggggtttct 5400

ggaaacacta gagggtcaga aaagagtaat gaccaccgtg acgtgcagga ttctcttgct 5460

gtgacatgtt cattgcaaag ccctctccag tgactaggag gtgtagttat taaggttgat 5520

ctgttagaaa tcaccattat taggtattag tggtagatgt tgctgatact tttattggtc 5580

atgactacat ctcagtttta ctttaatatt gatctatagt ttgatcagtt ccttgaattc 5640

taatatgttg atttctcagt gtttctgtca ctaaccaaga atgtttctag gcagttggtt 5700

gcttcacagt caaaactaaa tggtaaacta tcaaaaatac attcccaatt ttgctgtgat 5760

aaatattgaa atgttaaaat taatgaacag aagaatttat tcttacccat ctattcttgt 5820

tctcctagtt cattaaactt tcagttattg gaaaggcaca ttctcaaagt attttatgag 5880

caaaatattc tataaatgcg tctaacaaac ctaattgaat ataaaagtta tatttagtag 5940

ttactgttga tagtaatttt catcagggtc atagttcatc tagtaaaata tttagagaat 6000

gatgttaaca ttccagcatt aaagtgggaa caaagattta tatatgaaat tccttaaaag 6060

agttcatctt gccttggttt ctgaccctca agactctagc tacctgccat cttgtcaaaa 6120

catttgtggg tagaataagt gttaaagatc aaattttaat atgcttctcg atatttaaca 6180

tagctaagaa gccagatttt actgtagaag ttatttacat gatttgaaaa cttgacctaa 6240

ctggaagcct ttttctcagt catcttgttc taagccatct tgacttcaca cccttagcga 6300

cttttctttt ttttttggtc aaagataatg agctaaatat atatagacgt tgaatgttga 6360

caaaattatt aaccagaaaa attgcttata aaggctgctg atctatttga tacctagaat 6420

taaatatttg aggacagttt ttagttaata aactgctaat gtttatttta ctgtctctca 6480

ggtttttggt ttttttaaaa aaaatgtgtt tggcctttac attttctact taagtgtgta 6540

ctttattgag tttaaccttg tctgtagcct agtagcctga aagaaaagga gacagaacca 6600

gagagatgga tgtagtgcat tccctttggt tattacacat ttgtggtagc tcctggattt 6660

actgagagat attttagcta tgtcaataag aacagctaat gatgtggaaa tcaggtgttc 6720

tcttgtgtat ttcagtgaac atttttatta gtagttgcat atcatctcta gttccacatt 6780

ttaacttaac gtctttgtgg cttcaccact gagctacctt tcactacacc agcttctgtg 6840

tggcctggta acatggaagg tctctcctaa ggacagtctg gacgtatttt gggggaatgt 6900

tatttatctt aaagatgcct agaaacaaaa cgcatatagt accagtgaga aactatgaag 6960

taaacaagtt gctcaggccg ggcatggtgg ctcacgcctg taatcccagc actttgggag 7020

gccgaagcgg gaggatggct tgaggctggg agtttgagac cttcatctct taaaaaaaca 7080

aacaaaaacc tgaatggtga ggtgtggtgg aattgggtag gggagggaaa ggaggacttg 7140

gaaaagcatt ctccaaagcc agcaacttgg tgaagttcag tacttgcctc ttagaggtta 7200

ggccatgcct ttcaaagaga gtgaaatgat gggttatcag ccacattctt ggagttaata 7260

tttttcttca tctttcagtt tgggttctgt gctattcata gttcttccct aagaccattt 7320

cattattacc ttttatattt agttgcaatt tattataata tgttgttttg tccctgaact 7380

taatctccta attttaagat cctctctgat ttttgcatat tgaaacttac agaagtcact 7440

ttaaaaaagt cttttgaaag tcctacaatc ctaaaataaa tcacaagctt gtttgttaga 7500

cgtgtcaaga gtctccagtc tttactacta aaaagcagca ctgccttaac acacattgtt 7560

atgggtgaaa agtgagggac gaccagtgta gtttctggat ataaagtgtg aaggactgtt 7620

gagttaaaca tttttagtgg aatatacata gataacgtgt atttagaaac tttggtgaag 7680

ccagtatttg tttttagtaa cctttttatg tatttccttc tttgattagc attgtcttca 7740

gtgttaagaa atgtggactc ctgtgaggtg ctggaggttt gaatcatctt gaaaactttc 7800

caatcttgtc tagttaccac tgcagagaca ctaaggaatt taccagaaaa agatatttga 7860

tacaagtgat ttaagaaatc tcaacatttc ctgaggccgt atcactgggc aaccagtgat 7920

gaaaactatg aatgaattgc acacctggaa gattttttaa gctaatgaca gtttcttcaa 7980

agatgtcaat tatttgcctt ggaaatttta taaattgcat ttctatgcac atcggcctct 8040

agtgcttacc actcggttta ttattcataa tctgcaattc aataaaggct ttgtgttttc 8100

atttatcttc aaaa 8114

<210> 5

<211> 7973

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 5

acaacgcgct ccctgcgggg cgggcggcaa cctccatgcg gcctcgtcca cgctcagcac 60

cggggaagcc gaggcggaga agccgcgcgc gcctcagaag ctcccggacg cccagcggcg 120

gcgcgagcgg cggcggcggc agcagcagca gcagcagcac ggccaccggc gggagcggca 180

gcagcaccgg cagccccggc ggcgcggcct cggccccggc cccggccccg gccggcatgt 240

atcgctccgg ggagcgcctg ctgggcagcc acgcgctgcc cgcggagcag cgggacttcc 300

tgcccctaga gacgaccaac aacaacaaca accaccacca gcccggggcc tgggcccgcc 360

gggcgggctc ctcggcgtcc tcgcctccct cggcgtcctc gtccccgcac ccttcggccg 420

ccgtccccgc cgccgatcca gccgattcgg cctcgggcag cagcaacaag aggaagcgcg 480

acaacaaggc cagcacgtat ggactcaact acagcctgct gcagcccagc ggagggcggg 540

ccgcgggggg cggccgagca gacggcggcg gggtcgtgta cagcgggacc ccgtggaaac 600

ggaggaacta caaccaggga gtcgtgggtc tgcatgaaga aatcagtgat ttttatgaat 660

acatgtctcc aagacctgag gaggagaaga tgcggatgga ggtggtgaac aggatcgaga 720

gtgtaattaa ggagctctgg cccagcgctg acgtccagat atttggaagt tttaaaactg 780

gactttattt acctactagt gacatcgacc tagtggtgtt tgggaagtgg gagaacctac 840

ccctctggac tctggaagaa gctcttcgga aacacaaagt cgcagatgag gattcggtga 900

aagttttaga caaagcaact gtacctatta ttaaattaac agattctttt actgaagtga 960

aagttgatat cagctttaat gtacagaatg gcgtgagagc agctgacctc atcaaagatt 1020

ttaccaagaa atatcctgta ttgccatact tggttttagt attgaaacaa ttcctattgc 1080

agagggacct taatgaagta tttacaggtg gaattggttc ttatagtctc tttttaatgg 1140

cagtcagttt ccttcagtta catcccaggg aagatgcttg catccccaat acaaactatg 1200

gtgttctctt aatagaattt tttgaattat atggacgaca cttcaattat ttaaagactg 1260

gcatccggat aaaggatggt ggttcatatg tggccaaaga tgaagtacag aaaaatatgc 1320

tagatggcta caggccatca atgctttata tcgaagatcc tttacaacca ggtaacgatg 1380

ttggaaggag ttcatatggg gccatgcaag tgaagcaggc ctttgattat gcctacgttg 1440

ttttgagtca tgctgtatca ccaatagcaa agtactatcc caacaatgaa acagaaagca 1500

tactaggtag aataattaga gtaacagatg aagttgccac atatagagat tggatatcaa 1560

agcagtgggg cttgaagaat agacctgagc cttcatgcaa tggtccagtg tcgtcctctt 1620

ctgccacaca gtccagctct agtgatgtag attccgatgc aacaccatgc aaaaccccga 1680

aacagctgct ttgccgtccg tccactggga accgagtagg gtcgcaagat gtatccttgg 1740

agtcctctca ggcagttggg aaaatgcaaa gcacccaaac cactaacaca tccaacagca 1800

ccaacaaatc tcagcatgga tcagcaaggc tctttcgttc ttccagcaaa ggcttccaag 1860

gtacaactca aacaagccat ggttccttga tgacaaacaa acaacatcaa ggcaaatcca 1920

ataatcagta ttaccatggc aaaaagagga aacacaagag ggacgcgccc ctctcagacc 1980

tctgtagata gtcagcgctg cgcggtggac tgtcttctct gtgcaatgat ctcatgctca 2040

ggacagttgc gcagggactc ctgggagata ttcaggagcc tcacactgtt cagacgttga 2100

cttagcaact gcgttttttc ccagctcgcc acagaatgga tcatgaagac tgacaactgc 2160

aaaaaaaaca aaacaaaaca aaaaaaaaag caagcaaaaa agagggaaaa aaaaggctgc 2220

ttatttgata agtcatatgc tacaacaggg tcattttaag atttaaagct tgaatgtaaa 2280

ataaatatat ttctcattgg ctttatgcag agttataggg aatagtattc agtgttggta 2340

gggtgataga aacaaaaaac agtatcagag gatgaggtgg ggaaggaaaa caaaggtatc 2400

tgataggaag tccagattcc aaaggggaaa gtgatctgtg catgtttttt ttttaaatat 2460

ttttgcatat atttaccatt ttattgtgtg tatatataga agaccatata ggagattgat 2520

atttgtaata gtggatttgt taataatact ttttacataa cattactgtt taaattgtaa 2580

acagattttt tctcaggatt agtttgaaaa ataatctaaa ttgtcatctt aacatccata 2640

tatagggaag tgattagttc tattactcaa tttgtttttc tcagcattga aatgacttaa 2700

tagaaccctt gtgtcctgct gcaaaaattt ttcctctcta aagaaaaggt ttatggtggc 2760

aaatgatgtt tattttattt tgtaaaaaaa aaaaaatgta ctatgtactt ttgtgtaaac 2820

actgaaaaat ctctggtcat ctccgagaat taacttgcaa ctgttttcta tagtgctgtc 2880

gtcttgggca atgggcaatt acatgacttt gtgtttgctt cctttgcagt cttttttttt 2940

tccccccatt tcttcctaat aggaaaaaaa aaaaaaaaaa ggtcacccat gtctggtctc 3000

attcctgttg cagtgaaact tcgagttcca cagactttgc atgctggctt ctctaaccct 3060

gtgtgctgcg tgtgcctgtt tctcatctct tattcttttt aaaattcatg cttaactact 3120

gtgggagaat aactgtaaac agctttaatt aaatcatact tataaaaaac tattttctta 3180

tattccactc tatgcttttg gtattgttga tctttacaaa ttaaatggtc tttgataatg 3240

gatctatttt gtattgcctt attaagacca aatacttctt gtcatcccat tctttatcct 3300

cttctttcat ggaattgtta tcgttaatta aaactttttt aaacattggc ttgtttcaat 3360

catactgtaa attttggttg tagtcagctt tgagtgcaat gagatgtata attctgttat 3420

cattacctgt tgagtttgaa actcagttgg gaatatttaa tataatagaa tgtaagtgac 3480

atttctgaaa atgctttctt tcagggtgaa agctcttatg tttagcatca atgtgtatgg 3540

ctctgttaaa tgcagccatt tctgagacga gattctttta tatatatata catataaagt 3600

actattggct tttaggagtt tcttttatat acatttatga aatactgaag accaatcaga 3660

ccattaatgg acacttagtg taacttttta taaagaaaat aatgctaaag taagaccaaa 3720

actgatgtca tcactgaaat taacaatttt caatatgttc atattttaat tcacaatgga 3780

aaaatgtgtt ccaaaactgg aaactcatag tactcgtgta aactgtggaa gatttcaaat 3840

gtgatgttat tttgacaatg ttttaaattt tagagtcaca ttttattctg atcagaattt 3900

ttattgagat gttgagcttt tgtttttgaa actagtttgt cataacattg tgcataatca 3960

cagtatttat tttctaggac aattgtgaat gtgtagactt atgtttactg ctaagggaac 4020

aattatttat aaaataatat taaatccagt attagctgcc tatttcagac acttaatact 4080

tgcagagatc tatgttacat ttaccacact gaagtttttt ttgttgtttt ttgtttgttt 4140

ttaaagaatc accctcattg ttgaaagtaa atgtactctt agggtgcgaa tattagtgtt 4200

ccaataagca tgtgattata ttaaggtggt ggtagcggga agataattct gattccattg 4260

ggaatcttag gttttcgtaa atttattggg aaaatagttt ttcctgtact gctgaagttt 4320

ctttttggta aacagtatct ttctaaaaga aaaaagcatg aaggagaaat tgaggtgtgt 4380

atacatttcc tcaaatgacc agcattgtat tcgtgaatac tgtgtatctt gcagtgaaca 4440

gtgtggaagc tgttcatttt tcaatctgaa gtaaaatact ttcaagaact tttagtttgc 4500

ctgctcattt gttttataca tttcatctat ttgactccta tcttatttct tttttgagtt 4560

ttaatacttc ctatattttg tgaatatatc agaaatgtgt catttatata ttagagtcca 4620

ttcatatcca tgaatcataa ccttcctttg ctaatacttg ttgaatggga ttttacaaat 4680

tctccctcac tctggtgaca tttctcaggc agtcatgtat gtgtacctgg ccattagaaa 4740

tattaatatt taaagactgt tttttagagg agctgatggg ttggtgaggt gtcagcacaa 4800

aatcttactg gttatgtttt gatgataaaa gtatatccat tttttccctc cagctttaag 4860

gtgactgtga aggtgcctgg ttttgaatgt ctttgtttgg tttggagatg tcgcactcag 4920

ttttcaaatc tagcttggat ctgtaggacc tatgtttttt acaagtaatt gccctccagt 4980

cttcaacagt tgattctgtt ttatttttat cctgttttga gtgtacttta cctttacttg 5040

cattttgagc ctcattaata tttaggttat ttgatttggc tccagatatt cctagatctg 5100

cacagggcaa aacatgggct atagggtgag catttttaat tgtctttttc tgctggaacc 5160

ttatatctct ccatgtgttt tctgctcctt ccctccccca tgaaatggta agtgtgactt 5220

gtgtttgcct gaacctgtgg actagtgttt ggggtttctg gaaacactag agggtcagaa 5280

aagagtaatg accaccgtga cgtgcaggat tctcttgctg tgacatgttc attgcaaagc 5340

cctctccagt gactaggagg tgtagttatt aaggttgatc tgttagaaat caccattatt 5400

aggtattagt ggtagatgtt gctgatactt ttattggtca tgactacatc tcagttttac 5460

tttaatattg atctatagtt tgatcagttc cttgaattct aatatgttga tttctcagtg 5520

tttctgtcac taaccaagaa tgtttctagg cagttggttg cttcacagtc aaaactaaat 5580

ggtaaactat caaaaataca ttcccaattt tgctgtgata aatattgaaa tgttaaaatt 5640

aatgaacaga agaatttatt cttacccatc tattcttgtt ctcctagttc attaaacttt 5700

cagttattgg aaaggcacat tctcaaagta ttttatgagc aaaatattct ataaatgcgt 5760

ctaacaaacc taattgaata taaaagttat atttagtagt tactgttgat agtaattttc 5820

atcagggtca tagttcatct agtaaaatat ttagagaatg atgttaacat tccagcatta 5880

aagtgggaac aaagatttat atatgaaatt ccttaaaaga gttcatcttg ccttggtttc 5940

tgaccctcaa gactctagct acctgccatc ttgtcaaaac atttgtgggt agaataagtg 6000

ttaaagatca aattttaata tgcttctcga tatttaacat agctaagaag ccagatttta 6060

ctgtagaagt tatttacatg atttgaaaac ttgacctaac tggaagcctt tttctcagtc 6120

atcttgttct aagccatctt gacttcacac ccttagcgac ttttcttttt tttttggtca 6180

aagataatga gctaaatata tatagacgtt gaatgttgac aaaattatta accagaaaaa 6240

ttgcttataa aggctgctga tctatttgat acctagaatt aaatatttga ggacagtttt 6300

tagttaataa actgctaatg tttattttac tgtctctcag gtttttggtt tttttaaaaa 6360

aaatgtgttt ggcctttaca ttttctactt aagtgtgtac tttattgagt ttaaccttgt 6420

ctgtagccta gtagcctgaa agaaaaggag acagaaccag agagatggat gtagtgcatt 6480

ccctttggtt attacacatt tgtggtagct cctggattta ctgagagata ttttagctat 6540

gtcaataaga acagctaatg atgtggaaat caggtgttct cttgtgtatt tcagtgaaca 6600

tttttattag tagttgcata tcatctctag ttccacattt taacttaacg tctttgtggc 6660

ttcaccactg agctaccttt cactacacca gcttctgtgt ggcctggtaa catggaaggt 6720

ctctcctaag gacagtctgg acgtattttg ggggaatgtt atttatctta aagatgccta 6780

gaaacaaaac gcatatagta ccagtgagaa actatgaagt aaacaagttg ctcaggccgg 6840

gcatggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg ccgaagcggg aggatggctt 6900

gaggctggga gtttgagacc ttcatctctt aaaaaaacaa acaaaaacct gaatggtgag 6960

gtgtggtgga attgggtagg ggagggaaag gaggacttgg aaaagcattc tccaaagcca 7020

gcaacttggt gaagttcagt acttgcctct tagaggttag gccatgcctt tcaaagagag 7080

tgaaatgatg ggttatcagc cacattcttg gagttaatat ttttcttcat ctttcagttt 7140

gggttctgtg ctattcatag ttcttcccta agaccatttc attattacct tttatattta 7200

gttgcaattt attataatat gttgttttgt ccctgaactt aatctcctaa ttttaagatc 7260

ctctctgatt tttgcatatt gaaacttaca gaagtcactt taaaaaagtc ttttgaaagt 7320

cctacaatcc taaaataaat cacaagcttg tttgttagac gtgtcaagag tctccagtct 7380

ttactactaa aaagcagcac tgccttaaca cacattgtta tgggtgaaaa gtgagggacg 7440

accagtgtag tttctggata taaagtgtga aggactgttg agttaaacat ttttagtgga 7500

atatacatag ataacgtgta tttagaaact ttggtgaagc cagtatttgt ttttagtaac 7560

ctttttatgt atttccttct ttgattagca ttgtcttcag tgttaagaaa tgtggactcc 7620

tgtgaggtgc tggaggtttg aatcatcttg aaaactttcc aatcttgtct agttaccact 7680

gcagagacac taaggaattt accagaaaaa gatatttgat acaagtgatt taagaaatct 7740

caacatttcc tgaggccgta tcactgggca accagtgatg aaaactatga atgaattgca 7800

cacctggaag attttttaag ctaatgacag tttcttcaaa gatgtcaatt atttgccttg 7860

gaaattttat aaattgcatt tctatgcaca tcggcctcta gtgcttacca ctcggtttat 7920

tattcataat ctgcaattca ataaaggctt tgtgttttca tttatcttca aaa 7973

<210> 6

<211> 4511

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 6

gggcgcgcgg gccccgcggg ggcggcgcgt ggatggatcc gcgcgtggcc tggatccagc 60

ccgagcagaa ggggccggcc aatgccctgt ggatgcagat ctgggagacc tcgcagggcg 120

tgggccgcgg cggctcgggc ttcgcgtcct atttctgcct caactcgccg gcgctggaca 180

cggcggccgc ggcgggggcg gccgggcggg gcagtggcgg cctgggcccc gcgctgcccg 240

ccgcgtcgcc cccgccgccc ggccccaccg cgcccgccgc gctgcccccc gcgctgctga 300

cggcgctggg gcccgcggcc gagggcgcgc ggcgcttgca caagtcgccg tcgctgtcgt 360

cctcgtcgtc gtcctcctcg tccaacgcgg agtcgggcac cgagagcccc ggctgctcgt 420

cgtcgtcctc cagcagcgcc tcgctgggcc ggccgggcgg cggccgcggc ggcgccttct 480

tcaacttcgc cgacggcgcg cccagcgccc ctggcacagc caacgggcac cccgggccgc 540

gcggccccgc gcccgccggc tccccgtcgc agcaccagtt ccacccgggt cgccggaaac 600

gcgagaacaa ggccagcacc tacggcctca actacctgct gtccggcagc cgcgcggccg 660

ctctcagcgg agggggcggc cccggggccc aggcgccgcg gcccggcacc ccgtggaaga 720

gccgcgcgta cagcccgggc atccagggac tacatgagga aataattgac ttttataact 780

tcatgtcccc ttgtcctgaa gaagcagcta tgagaagaga ggtggtgaaa cggatcgaaa 840

ctgtggtgaa agacctttgg ccgacggctg atgtacagat atttggcagc tttagtacag 900

gtctttatct tccaactagc gacatagacc tggtggtctt cgggaaatgg gagcgtcctc 960

ctttacagct gctggagcaa gccctgcgga agcacaacgt ggctgagccg tgttccatca 1020

aagtccttga caaggctacg gtaccaataa taaagctcac agatcaggag actgaagtga 1080

aagttgacat cagctttaac atggagacgg gcgtccgggc agcggagttc atcaagaatt 1140

acatgaagaa atattcattg ctgccttact tgattttagt attgaaacag ttccttctgc 1200

agagggacct gaatgaagtt tttacaggtg gaattagctc atacagccta attttaatgg 1260

ccattagctt tctacagttg catccaagaa ttgatgcccg gagagctgat gaaaaccttg 1320

gaatgcttct tgtagaattt tttgaactct atgggagaaa ttttaattac ttgaaaaccg 1380

gtattagaat caaagaagga ggtgcctata tcgccaaaga ggagatcatg aaagccatga 1440

ccagcgggta cagaccgtcg atgctgtgca ttgaggaccc cctgctgcca gggaatgacg 1500

ttggccggag ctcctatggc gccatgcagg tgaagcaggt cttcgattat gcctacatag 1560

tgctcagcca tgctgtgtca ccgctggcca ggtcctatcc aaacagagac gccgaaagta 1620

ctttaggaag aatcatcaaa gtaactcagg aggtgattga ctaccggagg tggatcaaag 1680

agaagtgggg cagcaaagcc cacccgtcgc caggcatgga cagcaggatc aagatcaaag 1740

agcgaatagc cacatgcaat ggggagcaga cgcagaaccg agagcccgag tctccctatg 1800

gccagcgctt gactttgtcg ctgtccagcc cccagctcct gtcttcaggc tcctcggcct 1860

cttctgtgtc ttcactttct gggagtgacg ttgattcaga cacaccgccc tgcacaacgc 1920

ccagtgttta ccagttcagt ctgcaagcgc cagctcctct catggccggc ttacccaccg 1980

ccttgccaat gcccagtggc aaacctcagc ccaccacttc cagaacactg atcatgacaa 2040

ccaacaatca gaccaggttt actatacctc caccgaccct aggggttgct cctgttcctt 2100

gcagacaagc tggtgtagaa ggaactgcgt ctttgaaagc cgtccaccac atgtcttccc 2160

cggccattcc ctcagcgtcc cccaacccgc tctcgagccc tcatctgtat cataagcagc 2220

acaacggcat gaaactgtcc atgaagggct ctcacggcca cacccaaggc ggcggctaca 2280

gctctgtggg tagcggaggt gtgcggcccc ctgtgggcaa caggggacac caccagtata 2340

accgcaccgg ctggaggagg aaaaaacaca cacacacacg ggacagtctg cccgtgagcc 2400

tcagcagata atggctcctg gctgcgtcag cctcccccac ccctctgcag actgccccgc 2460

ggcctcggcc accggcaggg gaaccgagac cagcaccccg cacgtcagcc gggctcgcgg 2520

cacgcccgcc gctgatcact ctgcatgttt cttcgtgtgg tggtcgcgtc catcttcaag 2580

aacagctcgt tgtgctcatc tgtgaagcct tattaaacgt ggacgttgtt ttctgccttc 2640

ccaggattct tccttcagtg ctgaggcagg tcgggctcag gaactgcagg gacgtgaaca 2700

tgcgcttgcg gtttgaggta gccgtgtctg ttccttcgcg gtttgctatt ttcatttcct 2760

gttcgtcaaa gcagcagagg agatcaaacc ccgttcgtgt gtctttcctc cacggataag 2820

cttgggaggt cattgtttta ctgccctcac attttgtttg aaatttcaga actgtttttc 2880

tatgtaaata ttgaaaactt atgatttgtg caataactca gatatttttt atttaatttc 2940

ctattttcac ataagttata tttaagggag gagggaattt tttttaaaca agcttaggtc 3000

ctttcccgag ctgcattttc taagttgggt catcgtgtcg gctggttgtc tgacgagcat 3060

cgttacaaac accatgatga ggggtttggg gttttatttt gatgtctttt cttttggtcg 3120

gaagtgagtg aaggagccag gtcgccctga aggttttcca aagggcttgg ctccagagcc 3180

acctggcaga ctgcccgtgg ccctgctgtc gggccccagg ccgttgtcct gctctgacca 3240

cagagtttta atgttttggt tttcacttct tttaaactgg acaacaaatc cagcatttca 3300

agtgccagaa gtataacttt ctaaggagag aagggttgtc acattataaa atctttagga 3360

aaatgtgaac tggaaaacgc ttcggtcagt tttagtgaca tagcctgtga tgatgggtct 3420

ggtgactatt attgcggacc gtggtaccca gttttaggaa tgtggagaaa ggaattctgt 3480

tgattccgtt gaggaatctg tagcgtatgc attcgttctg ttaagagcaa atctaggaga 3540

agtgcttcag ctgcccagtg cgccgtgggg agtgttttaa cggatcgtgt cgcaggagag 3600

cacagcccag cgttggggcc gggaccgctg gcgcccgacg tcggaagcat acaggtatac 3660

tatgcaagtg tattctgcca caacaaccac tgtctttgtt accttttttt gaacaagaat 3720

atatccatcc tgcctaaccc tgagtttttg gagcaccaca gttgtcctgg gagttggttg 3780

catcttgtag gccatctgac ttcctgtttt taaaacgggg gtctggtctt gctaaacact 3840

acaggtaggt tggtctttga agtccactag tggagaatgt caagacaaga tacttattac 3900

catgacatct gatgcatgtg cagcagtggg gagttctaga ttgatctctg aatgtgatcg 3960

acgcccagca aggacaagct ttaaaatgtc tgcggtctgc ccttttgaag caggactggc 4020

tcactctgtc attgggagct gtcagctgcg actgcaggtt ctctaggagg cattccagaa 4080

tagagtagca cactgtgtct gcagttctcg atgaccgaaa gttatcaaaa atatttaaaa 4140

tatttaaatt gtgaacctat tgataaagaa tatttataaa aactgatctg taggcctgta 4200

ctaatctcta cgcattagca atattgactg taaacccaca ttaaggaaac cactacgggt 4260

ctggcagtgc gtgtcccgtg gggtgtgcat tttaaaactc gattcataga cacaggtacc 4320

atgttccatt tccgtcatgg tgaagcaaat gaattggcct ggctaccact gtggtcgcgt 4380

gctacaggtt tgacaaaaag atatcatgtt tcgatttttt tgtgtgtgga caacaatatg 4440

gaagctaaaa ttgacatatt tttatgtaaa gtttttctat tctttgattt ttaataaact 4500

ttggaaacca g 4511

<210> 7

<211> 474

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 7

Thr Tyr Gly Leu Asn Tyr Ser Leu Leu Gln Pro Ser Gly Gly Arg Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Gly Arg Ala Asp Gly Gly Gly Val Val Tyr Ser Gly Thr

20 25 30

Pro Trp Lys Arg Arg Asn Tyr Asn Gln Gly Val Val Gly Leu His Glu

35 40 45

Glu Ile Ser Asp Phe Tyr Glu Tyr Met Ser Pro Arg Pro Glu Glu Glu

50 55 60

Lys Met Arg Met Glu Val Val Asn Arg Ile Glu Ser Val Ile Lys Glu

65 70 75 80

Leu Trp Pro Ser Ala Asp Val Gln Ile Phe Gly Ser Phe Lys Thr Gly

85 90 95

Leu Tyr Leu Pro Thr Ser Asp Ile Asp Leu Val Val Phe Gly Lys Trp

100 105 110

Glu Asn Leu Pro Leu Trp Thr Leu Glu Glu Ala Leu Arg Lys His Lys

115 120 125

Val Ala Asp Glu Asp Ser Val Lys Val Leu Asp Lys Ala Thr Val Pro

130 135 140

Ile Ile Lys Leu Thr Asp Ser Phe Thr Glu Val Lys Val Asp Ile Ser

145 150 155 160

Phe Asn Val Gln Asn Gly Val Arg Ala Ala Asp Leu Ile Lys Asp Phe

165 170 175

Thr Lys Lys Tyr Pro Val Leu Pro Tyr Leu Val Leu Val Leu Lys Gln

180 185 190

Phe Leu Leu Gln Arg Asp Leu Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly

195 200 205

Ser Tyr Ser Leu Phe Leu Met Ala Val Ser Phe Leu Gln Leu His Pro

210 215 220

Arg Glu Asp Ala Cys Ile Pro Asn Thr Asn Tyr Gly Val Leu Leu Ile

225 230 235 240

Glu Phe Phe Glu Leu Tyr Gly Arg His Phe Asn Tyr Leu Lys Thr Gly

245 250 255

Ile Arg Ile Lys Asp Gly Gly Ser Tyr Val Ala Lys Asp Glu Val Gln

260 265 270

Lys Asn Met Leu Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Met Leu Tyr Ile Glu Asp

275 280 285

Pro Leu Gln Pro Gly Asn Asp Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met

290 295 300

Gln Val Lys Gln Ala Phe Asp Tyr Ala Tyr Val Val Leu Ser His Ala

305 310 315 320

Val Ser Pro Ile Ala Lys Tyr Tyr Pro Asn Asn Glu Thr Glu Ser Ile

325 330 335

Leu Gly Arg Ile Ile Arg Val Thr Asp Glu Val Ala Thr Tyr Arg Asp

340 345 350

Trp Ile Ser Lys Gln Trp Gly Leu Lys Asn Arg Pro Glu Pro Ser Cys

355 360 365

Asn Gly Asn Gly Val Thr Leu Ile Val Asp Thr Gln Gln Leu Asp Lys

370 375 380

Cys Asn Asn Asn Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ala Leu Gly Lys Cys Arg

385 390 395 400

Ser Lys Thr Ser Glu Ser Leu Ser Lys His Ser Ser Asn Ser Ser Ser

405 410 415

Gly Pro Val Ser Ser Ser Ser Ala Thr Gln Ser Ser Ser Ser Asp Val

420 425 430

Asp Ser Asp Ala Thr Pro Cys Lys Thr Pro Lys Gln Leu Leu Cys Arg

435 440 445

Pro Ser Thr Gly Asn Arg Val Gly Ser Gln Asp Val Ser Leu Glu Ser

450 455 460

Ser Gln Ala Val Gly Lys Met Gln Ser Thr

465 470

<210> 8

<211> 419

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 8

Leu Leu Gln Pro Ser Gly Gly Arg Ala Ala Gly Gly Gly Arg Ala Asp

1 5 10 15

Gly Gly Gly Val Val Tyr Ser Gly Thr Pro Trp Lys Arg Arg Asn Tyr

20 25 30

Asn Gln Gly Val Val Gly Leu His Glu Glu Ile Ser Asp Phe Tyr Glu

35 40 45

Tyr Met Ser Pro Arg Pro Glu Glu Glu Lys Met Arg Met Glu Val Val

50 55 60

Asn Arg Ile Glu Ser Val Ile Lys Glu Leu Trp Pro Ser Ala Asp Val

65 70 75 80

Gln Ile Phe Gly Ser Phe Lys Thr Gly Leu Tyr Leu Pro Thr Ser Asp

85 90 95

Ile Asp Leu Val Val Phe Gly Lys Trp Glu Asn Leu Pro Leu Trp Thr

100 105 110

Leu Glu Glu Ala Leu Arg Lys His Lys Val Ala Asp Glu Asp Ser Val

115 120 125

Lys Val Leu Asp Lys Ala Thr Val Pro Ile Ile Lys Leu Thr Asp Ser

130 135 140

Phe Thr Glu Val Lys Val Asp Ile Ser Phe Asn Val Gln Asn Gly Val

145 150 155 160

Arg Ala Ala Asp Leu Ile Lys Asp Phe Thr Lys Lys Tyr Pro Val Leu

165 170 175

Pro Tyr Leu Val Leu Val Leu Lys Gln Phe Leu Leu Gln Arg Asp Leu

180 185 190

Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Ser Tyr Ser Leu Phe Leu Met

195 200 205

Ala Val Ser Phe Leu Gln Leu His Pro Arg Glu Asp Ala Cys Ile Pro

210 215 220

Asn Thr Asn Tyr Gly Val Leu Leu Ile Glu Phe Phe Glu Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Arg His Phe Asn Tyr Leu Lys Thr Gly Ile Arg Ile Lys Asp Gly Gly

245 250 255

Ser Tyr Val Ala Lys Asp Glu Val Gln Lys Asn Met Leu Asp Gly Tyr

260 265 270

Arg Pro Ser Met Leu Tyr Ile Glu Asp Pro Leu Gln Pro Gly Asn Asp

275 280 285

Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Gln Val Lys Gln Ala Phe Asp

290 295 300

Tyr Ala Tyr Val Val Leu Ser His Ala Val Ser Pro Ile Ala Lys Tyr

305 310 315 320

Tyr Pro Asn Asn Glu Thr Glu Ser Ile Leu Gly Arg Ile Ile Arg Val

325 330 335

Thr Asp Glu Val Ala Thr Tyr Arg Asp Trp Ile Ser Lys Gln Trp Gly

340 345 350

Leu Lys Asn Arg Pro Glu Pro Ser Cys Asn Gly Pro Val Ser Ser Ser

355 360 365

Ser Ala Thr Gln Ser Ser Ser Ser Asp Val Asp Ser Asp Ala Thr Pro

370 375 380

Cys Lys Thr Pro Lys Gln Leu Leu Cys Arg Pro Ser Thr Gly Asn Arg

385 390 395 400

Val Gly Ser Gln Asp Val Ser Leu Glu Ser Ser Gln Ala Val Gly Lys

405 410 415

Met Gln Ser

<210> 9

<211> 320

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 9

Tyr Ser Pro Gly Ile Gln Gly Leu His Glu Glu Ile Ile Asp Phe Tyr

1 5 10 15

Asn Phe Met Ser Pro Cys Pro Glu Glu Ala Ala Met Arg Arg Glu Val

20 25 30

Val Lys Arg Ile Glu Thr Val Val Lys Asp Leu Trp Pro Thr Ala Asp

35 40 45

Val Gln Ile Phe Gly Ser Phe Ser Thr Gly Leu Tyr Leu Pro Thr Ser

50 55 60

Asp Ile Asp Leu Val Val Phe Gly Lys Trp Glu Arg Pro Pro Leu Gln

65 70 75 80

Leu Leu Glu Gln Ala Leu Arg Lys His Asn Val Ala Glu Pro Cys Ser

85 90 95

Ile Lys Val Leu Asp Lys Ala Thr Val Pro Ile Ile Lys Leu Thr Asp

100 105 110

Gln Glu Thr Glu Val Lys Val Asp Ile Ser Phe Asn Met Glu Thr Gly

115 120 125

Val Arg Ala Ala Glu Phe Ile Lys Asn Tyr Met Lys Lys Tyr Ser Leu

130 135 140

Leu Pro Tyr Leu Ile Leu Val Leu Lys Gln Phe Leu Leu Gln Arg Asp

145 150 155 160

Leu Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly Ile Ser Ser Tyr Ser Leu Ile Leu

165 170 175

Met Ala Ile Ser Phe Leu Gln Leu His Pro Arg Ile Asp Ala Arg Arg

180 185 190

Ala Asp Glu Asn Leu Gly Met Leu Leu Val Glu Phe Phe Glu Leu Tyr

195 200 205

Gly Arg Asn Phe Asn Tyr Leu Lys Thr Gly Ile Arg Ile Lys Glu Gly

210 215 220

Gly Ala Tyr Ile Ala Lys Glu Glu Ile Met Lys Ala Met Thr Ser Gly

225 230 235 240

Tyr Arg Pro Ser Met Leu Cys Ile Glu Asp Pro Leu Leu Pro Gly Asn

245 250 255

Asp Val Gly Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Gln Val Lys Gln Val Phe

260 265 270

Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Leu Ser His Ala Val Ser Pro Leu Ala Arg

275 280 285

Ser Tyr Pro Asn Arg Asp Ala Glu Ser Thr Leu Gly Arg Ile Ile Lys

290 295 300

Val Thr Gln Glu Val Ile Asp Tyr Arg Arg Trp Ile Lys Glu Lys Trp

305 310 315 320

<210> 10

<211> 82393

<212> ДНК

<213> homo sapiens

<400> 10

acaacgcgct ccctgcgggg cgggcggcaa cctccatgcg gcctcgtcca cgctcagcac 60

cggggaagcc gaggcggaga agccgcgcgc gcctcagaag ctcccggacg cccaggtacg 120

tgggagcact ccacagatgg cgcaagtacg gttgggccag gcggttgcgg ccccgtcgcg 180

ccgcggcctc tgtgacgcac ggcgaggcct cccgggctgc tgcgcggcgc agcgggggcg 240

gggcgagcgc gtgagggcgg ggcggtgggg ggggggggcg gagcgagagg ggcggagccg 300

gcagaggccc cgccccgggg ccggaggagc gaggacgcta cggagcaggc gcgtctcgct 360

gccgccgctg ccgccgccgc cgctcgctct tctgtggagc cgccgccgcc gccgccgcca 420

tttgcacggg gaccccagtg acaggggctc ggcggagggg cggaggggcg gagggagggg 480

gggagggccc gcggagcccc cgagggcggg agcgacgccg ccggcgccgg ccgggctccc 540

tgcgcgaccg cgccgcccgc ggcgggcccc gagcagcagc agcagcagca gcggcagcag 600

cggcagcagc agcagcagcc gaggccgggc gtgcgcctga ggcggcggcg gcggcggccc 660

tgcgggcggc cgggaggggc gggggcagcg gccgccgccg tttgatggat ccgaggatcg 720

cctggtttca gccagagcag ctcggaccgt ccaacagtct gtggatgcag atctgggaga 780

cgacccaggg gctgaggaac ctctacttca accaccactg tcacagcagc ggcggcgcga 840

gcggcggcgg cggcagcagc agcagcagca gcacggccac cggcgggagc ggcagcagca 900

ccggcagccc cggcggcgcg gcctcggccc cggccccggc cccggccggc atgtatcgct 960

ccggggagcg cctgctgggc agccacgcgc tgcccgcgga gcagcgggac ttcctgcccc 1020

tagagacgac caacaacaac aacaaccacc accagcccgg ggcctgggcc cgccgggcgg 1080

gctcctcggc gtcctcgcct ccctcggcgt cctcgtcccc gcacccttcg gccgccgtcc 1140

ccgccgccga tccagccgat tcggcctcgg gcagcagcaa caagaggaag cgcgacaaca 1200

aggccagcac gtatggactc aactacagcc tgctgcagcc cagcggaggg cgggccgcgg 1260

ggggcggccg agcagacggc ggcggggtcg tgtacagcgg gaccccgtgg aaacggagga 1320

actacaacca gggagtcgtg gggtgagtgc tggctctgcg gcccgatggc ctggccggtg 1380

cgaatgcgca gccgggcaca cgcccacaga ggggggttgt gagggtctag gagcggccac 1440

ccccacggcc tgccttcgct gctgttgcac gggggtgctg ctggccatcc ccaacccccc 1500

agtcgttcac acctttcccc aagcctcctt agccgtccac accctccgtc tcctgtcctc 1560

ccttagtcgt ccacaccttc ctcccctccc tcttaaccgt ccacaccttc cccaggcccc 1620

cccctttatc cattcactct cctcccatcc cccttagtta aacacatcta cccttgacca 1680

ccaccccgcc tccagccctc cacacctttt tccccatcat cacaactcaa gatgagaccg 1740

cttagcacgg gcctatcatt cattccctga gaacattggt gtgtgagtgt tttttgatgg 1800

tgcaggaccc ggaggtgctt tccttgccaa gaatagaaac atccagaatg ctcctcccca 1860

tcccccaatc ccagacagca attatgtcag ccctgtaagg cattgcctgc tcttgaccct 1920

ttggcccatc tttttatttt taaaaaattc ccatgtcaca gatgccctgt ctatgcagag 1980

ggtggcgtgg gatgggtgac cactaagttt aggctggtga aggtggtgag cccttctgag 2040

gccctgatag aactttccag gagttcatgg tccgcggctc cagcttctca ctgtaaagtt 2100

gtcatcctgg cagaggcagc caatgctttt cattctaggg ggtagagatt tatgctaatg 2160

agtgaatatt gcaccactag tgactttctg tttaaagttc agctcttaga aaatggaatc 2220

ttacctgacc cctagtgaat tatgtacata agcagggaat gtttccaact agatctccct 2280

tcagaagagt ccctgtgctg gaataggtca ctgaatctta tttgttttgt aaaacaaagc 2340

ttttgggtct cgtgggtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtagctt 2400

gagtatggag aaccggcttt caaattgctt ttcatttttc aggttgtgtt ttacattgag 2460

ggctttagca tgcaaatgaa attaccaatt agtaatccca tgtgaacctt ttcctggatt 2520

tattcattca gatctgccct gctttggctg agagagagag ttctgtgtac ctttttgaag 2580

gtctggataa aatgagttgg tgggttccat ctgcttccag tgggctggtg tctgctctat 2640

gctactatta caactcctac cttttgtgga aaatgcagtc aagcgttcta ggactggtgc 2700

tgtggtacat gtcaaacctg ccctcacatt ccagaaaggg aaccctttta gggttgagtc 2760

ctctgttgct aagcttcaag ggtgctctcc atggtcatca cgttttatta aaggcttgtg 2820

gttccatcct gttagcattt ccaagtctac gcgtaaacct gtggtttagt gacaagcaaa 2880

ttgatgttga gggtttctgg tagtttcatt tcacaggagt aagctccagt taggtaatca 2940

ctgtcaacga aaaccttgaa gttccttaat tgcattttac tgaagcctct ttgcatgtgt 3000

ctagcaaaag atataagtcc aagatgctta tttttttttt gataaattag aaattgtcct 3060

ctcctctact tgctatttaa tgcagaagat actctaaaag gttcatattt atacttagaa 3120

gcaagatgtt cttgttcctg attcaaatat attgccctca aagggattag gagaggaatt 3180

ttcatttccc ggagggatta ctgtttaaaa actggttgta aacctcttta aaaactgctt 3240

atcacttcac cagattttcc attcttttgc ctcctccctt agaggatgtc agcagttaat 3300

ttttttttta aattaaaaaa agttcaattc tgagacctcc tagtttcaaa aaatacatta 3360

aacaattccc aagagtgtta agagtgtctg ggtgcttaga aattcttgct ttgattcatg 3420

tattctgatt tttttttttt ttttgagacg gagtttcgct cttgttgccc aggctggagt 3480

gcagtggctc gatctcagct caccgcaacc tctgcctccc aggttcaagc gattctgctg 3540

cctcagcctc ccgagtagct gggattacag gcgcttgcca ccacgcctgg ctaatttttt 3600

atttttagta gagacggggt ttcttcatgt tggtcaggct ggtctcgaac tcctgacctc 3660

aggtgatctg cccgtcttgg cctcccaaag gactgggatt acaggcatga gccaccgtgc 3720

ccggcctcat tatcctgatt tctttttttt cttttgagac tgggtctcac tctgctgcct 3780

aggctggagt ggagtgacgt gatcatagct cactgtatcc tctaactctt gggctcaagt 3840

gatcctcctg ccttagcttc ctggagtagc tgggactaca ggcacatgtc accacacctg 3900

cctaattttt ttatttttac tttttgtaga gatggggcct ccatttgttg cctaggctgg 3960

tcttcaaccg gcctcaagca gtcctcccac cttggcctca cagagtgctg ggattatagg 4020

catgagccac cattctcgcc agtatcctta tttcttaact ttagaaagtt tttctatttt 4080

taatataggt atttaaaaaa atctgaattc agagtgcacc tcgatgttat gctgttctga 4140

gattaaatat actaaaactg ttaccattgt tttctgaatt cttaagatgt gactgatagt 4200

tagctaatag gttaacacat tgtggtggtt cttggcctct gaactgatag tccagatggg 4260

gagaggagac cagaaagcat gtgaaaatgg actagaacca tgggacagct atatagtctc 4320

tcgcagctgt cttttgtgtt ctctgcttcc accaaattgg ttgatttatt tagaatgctg 4380

acctcttgca ttgcctaagt ccttgatgtt tttggtttct cctctgaact ctcaaaggta 4440

ctcacttcat gctcttggta tagcccactt atgtttaact ttccttttat tatgtgttcc 4500

ctcttacaca tgacatggac atttctttaa tatgtagagt aagatattgg atttcatcct 4560

aaagtcttca aaataaaact cttgagctca tcatctcaga cttcttcatg tacccacaga 4620

ccagggattt tgtttgcttt ttaaaacatt tttttatttt gtgttttatt atttttaaat 4680

tttaatttaa ttttatggag acagggtctc gctctgttgc ccaggctgga gtgcagtggt 4740

gtgatctcgg ctcactgcag cctttgcctg ggctcaagcc atccacatgc cttggcctcc 4800

cagtgtgctg ggattacagg tgtgagccac tgtgcctggc ctaaatttat ttttttaatt 4860

ttttttgaga cagggtcttg ctctgtcgct caggctggag tgcagtgtca taatcatggg 4920

tcacagcagc cttggcctcc caggctgaag tgaacttccc acctcagcct cctgagtagt 4980

tgggactaca ggcgagtgcc accatgcctg gctcattttg gttttttttg taaagatggg 5040

gtcttgtcat gttgcccatg aaggtctcca actcctggtc caagtgatcc tcccgcctcc 5100

gcctagcaaa atgttgggat tacaggtgtg agccaccatg cctggcctta tttatttatt 5160

taattatgaa tgaatgaatg aattaatgag agggagtctt gctctcttgc ccaggctgga 5220

gtgtggtggc acaatcttgg cccactgcaa cctccgtctc ccaggttcga gcaattctcc 5280

tgcctcagcc tcccgagtaa ctgggattac aggcgcccgc caccatgccc aggtaatttt 5340

tgtattttta gtagagatgg ggtctcacca tgttggccag actggtttcg aacttctgac 5400

ctcaagtgat ctgcccacct tggcttccca aagtgtcagg attacaggca tgagccacca 5460

tgcctggcct ggccttttat gttttaagtt gcttccactg attctcttgg gctttgctcc 5520

cctccagaac tggccatggt ttaggatgct gtccacctgc tgctgcttgt ccatgaaaac 5580

gagccataaa cccttttctt ttgaaagact taattgttta tcactatgga gaaagagggg 5640

atggcaagaa gtagcaaata cagggaattt gcagaacttg gtcttgagcc ctgggtccag 5700

aaacttcttc tggaaggtgc ttggtgtttg tccaagctca tgataggttt ctgttggctg 5760

tactgccaga tctgtagatg cttttttaag gcttggatga cttgttcaaa acaatgtttt 5820

ggagtacaaa tttggctgtg gggacatcaa gaccttgttg ggaaacttgg gtttaaggta 5880

caatttctta aactaggatg gtgggaatgg ggatgtgaag ggagaatgaa tgtgagaggt 5940

attacagggt aaggatggag atgattcaga ttccttaagt ggatttaata atcacactgt 6000

agctttgaac ttgagtgact ggggaaatat ttgtggtgtt tttggaaata agggccagaa 6060

ggactattgg tttgggtaag aagatagtag ggggatgtat aggtggacct gctagtgggg 6120

agctgagatt tggagggctg agatgtagtg ctcttcactg ccgtagggca gtatcctctt 6180

gtatgtgcca tcctctagtg cccattgttc atcatgtcat agtaagccca agatgttcat 6240

gccttttttc agcactgcat tagggcttat atctgcttct ctttctctct ctctctcgct 6300

ctcgctccct ccctctctct ctctttctgt tttttttttt tttttagacg gagtttcact 6360

tgtgttgccc aggttggagt gcagtggcgc gatcttggct cattgcaacc tctgactccc 6420

gggttcaagc aattctcctg cctcagcctc ccaagtagct gggattacag gcatgtgcca 6480

ccatgcctaa ttttgtatct ttagtagaga tggggtttct ccatgttggt caggctggtg 6540

tcaaactccc aacatcaggt gatctacctg cctcggccgc ccaaagtgct gggattacag 6600

gcatgagcca ccgcgcccgg cctctctctg cttatttcta cacagtgtta ccaatgagat 6660

tggtgttact gctgggctcc aaagcaatca gacagattaa agtagattga atatgaaaga 6720

atttagaggc ctttttccaa gtgatttgtg ctctatttaa tttctgtgca tttgcagata 6780

tagcccacag taattcttag tgaactagaa ccttcaggtt attgaatttt actgatttgg 6840

gtactgacat gcgcttttaa gaagacatta ggttttctat agtgtagatt gtacactaac 6900

aatataattc atatttaaga atgtctcaaa atttagtata ctgtgttcaa ctaacttaac 6960

tttctttgtt ttttttgttt tgttttgttt ttgttttttg agacggagtc ttgctatgcc 7020

acccaggctg gagtgcagtg gcgtgatctt ggcttactgc aacttcaaca ctcctgggtt 7080

caagtgattt tcctgcctca gcctcctgag tagctgggat tacaggcacc cgccaccaca 7140

ccggctaatt tttgtatttt tagtagagac ggggtttcgc cgtgttggcc aggctggtct 7200

tggactcctg actcaaatga tctgcctgcc ttggcctccc acagtgctag gattacagac 7260

atgagccact gcgcccggcc gctaacttaa ctttcattcc acaacttcca tcttttatcc 7320

aaaatctgtg atcattgaat actgtcacca ttaatcattg gcatttcagt gtttggactt 7380

tttttttccc ccttcgtctt tgtggactct tttttaacac tcataaagtt ttaactattg 7440

aaaagcaaag gaaacggtga gtgacttttt ggagtctgtc tacccagtgg tcacacaaaa 7500

ggcttactac attacaggaa agataggatg ggaaagggat actagaaaat tctaagtcag 7560

gaacgggggt gtgtattaga aaaattctga tcctggcatg ccagatggcc ttacatctca 7620

atttcttccg tgaaattcct gccaacaaat catagtgtta gaagtacaga agggtccatg 7680

ggaacagaat ttaagggctc cgttggtgat acggaactga tcagatggtt ctcacttgtt 7740

ctcagataac ctgtatactg aatatcacag gaagggtata gacgtcatgg cagtggttag 7800

atattcttgc acctgctgaa gctgagaaaa ttaaagtaat tttttttcct gtggaaagta 7860

gaaaatcaag cttttgtatg atttcacaca gctttctatt ctctcttttg ttgactctgt 7920

taagagtaac atttagtggt ggaaactatt tcaggatcac acccacaaca ctagagactg 7980

tattaatcac ttacacacac ataggtatag agtaatcttg aaggggctgt aggccaaaga 8040

taatgctttt ttgaagaatt agagactagt taccagcacc tggtatttgc tgtttcctac 8100

agagctgact ggacagccta gagtctgctg aggaattcag aggatggcca gtagaatgtt 8160

ctttccaccc cagaatattt ggtagggact cagctgctgt ggaatgccaa aaaggctttg 8220

agtttgtttc actattctta agattacacg taattgtttt tttgtaagag attatatata 8280

ttcaagttga ggatggcttt gagttagact ttccttaatt tggaatcaca cagcagatga 8340

tacatttatt tccatctgat aagttacttg atgatgtaaa aagacatttg agttaaagat 8400

ttttgggaaa aaagctgaat gttgagccat ttatgttgtg tactggttcc ctattcactt 8460

ggacaatttt aagtcttaaa acaatcttaa ccatgtgcac aagagatttc acatagtatt 8520

tggtaattaa attaaggaat tctagctcaa gtcatgcttt ttgctgaaat agttgtatat 8580

atttagtgcg gaaacctgtg ttttcaaatt aatgtaataa aagtttcaat aaaatggaag 8640

cctttattac cgtgtttcaa atgctatgct aaaccttttc catttgttat tatattaacc 8700

tcctcataca tagccctact aattttttta ctttctattt tgaaataatt acagatttat 8760

aggaagttgt gaaaaatagt acagagccca tgttcccttc accaagtttc acctaatggt 8820

agtagctcac ataacgataa tttaatgtca agaaccagga aattgtcatc gttgcaatcc 8880

ataagccttt tttagatttc accagtttca catgtatttg tgtgtgtgtg tatatatata 8940

attgtatgca attttatcat gtgtagatct ggatagccac tgtaacagtc tatagttcta 9000

tatacagagc tactccatca cctcagggct ccctatgcta ccactttata gccgcacgca 9060

cccttccagc aaccactaat ctgtttgcat ctctgtaatt ttgccatttt gagaatgtta 9120

tataaatgga atcatacaga atgtaacttt ggcttttttt cttttaccat acttcctttg 9180

agagccatcc aaattgctgc atgtatcagt agttcatttc tttttactat tgagtagtag 9240

tccatagtat ggctgaacca cacaatttgt ttaaccattt acttattgaa ggacatacca 9300

gaagggtggt ttccagtttt ttggctattg caaataaagc tgctataaac attcatgtat 9360

ataaatattt ttatgtgaat ataaagtttt cattttgggg gaataaatgc ccaaatgttt 9420

ggattgtatg gtaagtgcat gtttggtttt tagagaaact gctgaactat ttattttcta 9480

gaatgactat atcctcttat attcctatca acaatatatg agatatccag tttctctgca 9540

tccttgctag catttagtgt taccactttt ttatttgagc ggttctaata tgtgtagtga 9600

tagcctgttt tgccttatat taatcaataa aaatagcctc atctaatctt aacttttttt 9660

attttaaaac atcttggcag tattgaactt tctcaatgaa aaatctctaa aattgtgact 9720

tgaaaggctt taattttcca gtttttcttt ggttttactc ttagcagtaa cattttaact 9780

tttttttgtc tttgaagtaa ttttcagtgt ttcctttaca tgttgctttt tcttagaaac 9840

tagttactag catgaagtag atctttagcc tcgttttcta aaaacataaa aaagtaaaac 9900

tgtggggttt atttcaaaat tgagagtcct gtcttttcat atgaggatat tttatagtct 9960

gttggcttgg ctatatttta gggagtaaac ctgtggttag tggtttgttg ttggtggtgg 10020

taaagttttc ttacagtatt tttatacctg aataatacct ttagactcta tagaatagat 10080

acttgatctt caaatctatc ctagaataaa ttgttttatc taaacagctt tgtgacctga 10140

gaattgggac ttagtccctt agttttccct tactggccct ttgtagtcac tgttttgatt 10200

ttgtgaaagt aacttaactc ttagcactgt caggtattgt acattcctgc caaagcaaga 10260

ataagaatac ataggattgt gttttaattc tataattagg tgacttttgg ctaatttcca 10320

ggaacttgga cttaataaag tactagtgat aagtttggaa attttagtgt ccttgttctt 10380

tgaagttatt caccctttac tttcttgttt gtttggggtg tttatactac tgtccctaaa 10440

tatagctgaa ataaaggaag aaaaataacc cctgtaatat cactaccagg atataatttc 10500

tttttttttt ttttttttga gatggagtct cgctctgtcg cccaccatct cggctcactg 10560

caagctctgc ctcctgggtt cacgccattc tcctgcctca tcctcccgag tagctgggac 10620

tacaggcgcc cgccaccaca cccggcttat tttttgtatt tttagtagag acggggtttc 10680

actgtgttag ccaggatggt cttgatctcc tgatcttgtg atccacctgc ctcggcctcc 10740

caaagtactg ggattacagg catgagccac cgcgcccggc ctgatataat ttctgttaac 10800

agtttgatgt aaatattttt tgacttttta gtgtttttat atatatatat attttatgtt 10860

tttcttttat caatacgcac tcttactgtg ggaataattt taatgttttt aaagagttgg 10920

gttttatttg tttattttat tttatagaaa tggggtctcg ccgggtgcga tggctcacgc 10980

ctgtaatccc agtactttgg gaggccaagg caggagcatc acctgaggtc gggagttcga 11040

gaccagcctg accaacatgg ataaaccgcc tctctactaa aaatacaaaa ttagccgggc 11100

gtggtggcac gtgcctgtaa ttccagctac ttgggaggct gaggcaggag aatcacttga 11160

acccggccgg tggaggttgc agtgagcaaa gattgtgcca ttgcactcca tcctgggcag 11220

caagagtgaa acttcatctc aaaaaaaata aaaaataaaa aagaaagaaa gaaagaaatg 11280

ggatctcacc attttggctg gttttgaact tgtggtctca agcagtcttc ctacctcagc 11340

atcccaaagt attgggatta caggtgtgag cccatcctgt ttgttgttgt tcttttgttg 11400

ttgttgtttt tagatgaagt ctccctctgt cacccaggct ggagtgcagt ggcgctatct 11460

tggctcactg caagccccgc cacccaagtt caagcaattt tctgcctcag cctcccgagt 11520

agctgggatt acaggcgccc accaccatac ctggctaatt tttgtatttt tagtggagac 11580

gaggtttcac catattggcc aggctagtct tgagctcctg acctcgtgat ccacctgcct 11640

cggcctccca aagtgctggg attacaggtg tgagccactg cgcctggcct gttgttgttt 11700

aaataaaaga aatttattct cttacagtcg aggccagaac ttagaactgg ttttcaatct 11760

aaattttttt tcttctttgg gagaagggca tcagaatatt gtggatatac ttttttgact 11820

taaaaaaaaa ggttttactg ggctgggcat ggtggctcac ctgggattaa ctgcctgtaa 11880

ccttggcact ttgggaggct gaggcaggtg gatcgcttga gtccaggagt tcaagagcag 11940

cttgggtgac atggtgaaac tccgtctcta ccaaaaaaaa aaaattagcc aggcatggtg 12000

atggcgtgcc cttgaagtcc cagctacttg ggaggcttag ctgggaggat cgcttgagac 12060

caagaggcag aggttgcagt gagctaagtt catgccactg cactccagcc tgggtgacag 12120

agcgagacct cgtctgaaaa attttttttt ttttttacta atatgacaaa catcttttca 12180

tttcaaatat atttctatac catttttaat atctcattgc ctttagaatg accttgtatt 12240

catagtacat atgtatgtga tattccattt atttattttt tttcttttgt ctttttttgg 12300

ttatattcca ttgatttaat gtaccttaat ttatcttacc aatttcttgt tgaccatttt 12360

gtttccagtc ttttgttttt ttaccagaca tggattaagc tgagcctttg ccccagacga 12420

cattatttct tttttatcag caaaatatgc gtgtaatgaa attagaatta aaaggcaaaa 12480

aaggttatcc tttatttttc tacttatttt tattgagata gtaattcaca taccataaat 12540

ttaacccttt taaagtgtac agttcagtgg ttttcatata ttagaaggtt gtacaaccat 12600

cgcaactaat tccagaacat tttcatcacc ccagaaagaa actctgaacc cattatcact 12660

ccccactccc tcacacaccc taaccctggc agtcacatat agactctctg tctctgtgga 12720

tttgtttact ctggaccttt catataagtg gaatcataac agtttgtggc cttttgtgct 12780

tggcttctca aacttatctg tttccaaagg ttatctgtgt cgtagcatgt gtcagtactt 12840

cattcctttt tatggctgaa tattttattg catgtatatg ccacattttg tttatccatt 12900

cacctgtaga aggacattta ggttgtttcc attttttggc tgttatgaat attactgctg 12960

tagacgttca tgtacaagtt tttatgtgaa cgtgttttca tttttcttgg gtatatactt 13020

aagtgaggaa ttcctgggtc ttaagttaac tctctgttta acattttgag gaactgccaa 13080

attatttttt aaagtggctg tgacatttta tattctacca gcagtgaatg aaatttccaa 13140

tttctccaca tacttgacag cacttttttt tttttttttt tttgaggtga agtcttgctt 13200

tattgcccag gctggagtgc agtagcatga tcttggctca ctgcaacctc cacctcccag 13260

gttcaagcaa ttcttgtatc tctcagcctc ccgagtagct gggattacag gcgcatgtca 13320

ccatgcctgg ctaatttttg tattttttat agagacaggg ttttgccatg ttggtcaggc 13380

tggtcttgaa ctcctgattt caagtgatcc acctgcctta gcctcccaga gttctgggat 13440

tacaggcgtg agccactgca cccagtctgc actttcttta ttatctgtct tctttattat 13500

agccaatcta gtgggtatga agtaagtgtg tcatttgtga ttttgattgt tagtggtgac 13560

taaaaatgtt gaatatcttt acatgagctt gttggccatg tgcacatctt tgttggagaa 13620

atatctattc aaatcttttg actattttaa aattgggtta tttatctttt tattgttgag 13680

ctataggagt tctttatttt attttactga gacagggtct tgctctgtca cctaggctgg 13740

agtgtagtga tgccatcttg actcactgca acctctgccc ccaccccagg ctcaagtgat 13800

cctcccacct cagtcagcat cccacagctg ggaccacagg cgcatgccac catgcctggc 13860

taattttttt tttttttttt tttttgtatt ttagtataga cagagtctca ccttattgcc 13920

caggctggtc tcaaactcct gagctgaagc aatccgccca tctcagcttc ccaaagtgct 13980

ggaattagag gcatgagcca ctgtgcctgg cctattttat tttaaagatg aggcctcact 14040

ttgtcaccca ggttggagtg cagtggcgtg atcatagttc actgccattt tgccctcctg 14100

ggctcaaaca gtactcacga ctcatcttcc tgagtagcta ggactgcagg catgtcgcta 14160

gcatgcccag ctaaaacagt tctttatatt ctagatcggg gtgtccaatc ttttgacttc 14220

cctgggccac attagaagaa gaagaattgt cttgggccac acataaaata cactaacagt 14280

aatgacagct gatgagctaa aaaaagaatt accaaaacat ctcataatgt tttaagaaag 14340

tttacaagtt tatgttgggc cacattcaaa gccatcgtgg gcctctggcc gtgggttgga 14400

tgagcttgtt ctaaatgcta gacccttatc agatggatgg tttgtagata tttatcgcat 14460

gctgtgggtt tttttttttt actttctttt aggttttttt ttttcttaaa taattaaact 14520

gattaaaagc tttaatcttt tcattttctt gataatgtct tttaaagcac aaagttttgt 14580

ttcaatgatg tctaatttgt ctattttttt ttctttggtt gcttgtcata cgtaagaaac 14640

tgttgctaaa tccagaatgc tgaagattta cttgtgaact ttgtttcctt ctatgagttt 14700

tatagtttta gctcttgtat ttaggtcttt gatacatttt gaggtttttt tgttgttgtt 14760

gagacagtct tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg tgtgatcttg gcttactgca 14820

ccctctgcct cctcggttca agcaattctc atgcttcagc acccgagtag ctcggattac 14880

aggcgtgcac caccaagcct ggctaatttt tgtattttta gtaaagaggg ggcttcacca 14940

tgtttgtcag gttggtcttg aactcctggg ctcaagcaat cctctcatct cggcctcccc 15000

aagtgctggg attacaggca tgagccacca cgcccagcct gttttgagtt catttttaaa 15060

atatggtgtg aggtagaggt cccatttcat tcctttgcct gtgggtatcc agttgtccca 15120

gaaccatttg ttgaaatgac tcttgtttcc tcattgagca atgtcgtgag accctatctc 15180

cataaaaaat aattaaaaaa aaaaaagaat gcagaaggaa acagttttgc caattttgta 15240

gtatttactg acaatttgca tatgtcttta cattctttag ctatttattt ttcttttgaa 15300

ttactgcctt tgttcatttt tcttttggag ttgtttgtct ttttcttatt aatttgtaag 15360

agattttgca aatatataca atttcttttc tctttttttt gagatggagt tttgctcttc 15420

ttgcccaggc tggagtgcag tggcatgatc ttggcttact gcagcctctg cctcctggtt 15480

tcaagagatt cttctgcctc agcttcctga gtagctggga ttacaggtgc ccaccaccac 15540

acccagctaa tttttttttt ttttttttgt atttttagta gagactcggt ttcatcatgt 15600

tggccagact ggtctcaaac tcctcacctc agttgatcca cccaccttgg cctcccaaag 15660

tgctgggatt acagttgtga gccaccgtgc ctggacctcc cacattattt tgaaacaaat 15720

tccatatcac ataatttctt ttttttgaga cagagtctcg ctctgtcacc caggctggaa 15780

tgctgtggcg tgacctgtgc ttactgtacc ttctgcctcc taggttcaag cgattctcct 15840

gcctcagtct cctgagtagc tgggattaca ggcacgcacc accacacctg gctagttttt 15900

gtatttttag tagagatggg gtttcaacat gttggccagg ctggtcttga actcctggcc 15960

tcaggtggtc cgtccacttc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggctt gagccactgc 16020

acccagccaa tatcatataa tttcatataa atagttcttt gtgtatcttt agataaggac 16080

ttaaaagaag gcataatcgt aacaccatta ttaataccta aaagaagtga gcaataaata 16140

attcatttgc cgtatcaaat atccaatgtt catatttcct ccattgtccc ataataattt 16200

ttaaaagttt gctcaaatca aaatccaaac aagattattt caaagcattg tttgaggtac 16260

attttaaatc ttaatttata gatttctctg ctgtctcttt tcccccatat ttatttgttg 16320

aagaaaccaa gcgttgtttc ctgtggactt tcctactctc tggattttgc tggttatatt 16380

cctctggtat cagtttacta tgatcccttt ttcccctgta ttttctgtaa atttgtaact 16440

agatctagag atttgtttag attttgtggg tttttttttt tttttttttt ttttttgcaa 16500

aaatgcatca taaatggtgg tgtgtacatc tctcagaaga cacatatctt aatgtctttt 16560

tgtggtatta gttattaatg attactgcct atatttatta attcattatt tggattgtaa 16620

gtttatgata gtctcttgat gctttttctg ttgttagctg gaatgcttct aaaaggagaa 16680

ggctttcctc ttcaagctac ttggttgtct tgagggtttg cttcttatag ggaaagcagg 16740

ctaagggtga aaaaggaaat agtttctaac tgggtctgtt aatgagctgt caccccaggc 16800

aaagagaagc aaggcaggtc acaggaaagt gaagtgggct tgggatgatt ggtgccccat 16860

gcgtgcatgc atgaagggaa gttaatcctc cctgtagtga actctactgg gcttttggtc 16920

agtagccaag actgtcaagg aagacctttg tcagaagcca tacctggcct ttgcttttag 16980

ctgttggtag ctgaaggaaa ccagaacaga cctatgacct gtgaacttct gctcagtaga 17040

caaagttctc tcagcctaaa ttcagtaagc aggagtaaga tgcttgcttt cccttgaagt 17100

gaaacgtgaa ttatatgttt cttcaacttg tgctaatatt cttttttttt ttgagatgga 17160

gtctcacact gtctcccagg ctggagtgca gtggtgcaat ctccgctcac tgcaacctca 17220

gcctcccgag tagctgggat tacaggcgcc tgccaccacg cctggctaat tttttgtatt 17280

tttagcagag atggggtttc actatgttgg ccaggctgga cttgaactcc tgacctcacg 17340

atctgcctgc ctcggtctcc caaagtgctg ggattacagg cgtgagccac cacacctggg 17400

caacttgtgc taatattctt aaccttcatg tgaatcattc ctgccctcag gctagcataa 17460

cccatacagc cttccttata ggaagatttc ctactgggag tgaatttgtc cagtgattcc 17520

cccaagatat cccccaatca aatattttaa aagtcatcat ttacatgtaa aaactatgta 17580

acaagcatgg tagcagcagc gttaaagaaa tggcagtatg gcccctgtaa gggaaggctc 17640

cagaagatga gccgcactca gcctctaggt cacagctacc ttaggagttt gcagttgttc 17700

ctggggaagt cagtagacaa agctatctct caggcctggg caagataggg attttttttt 17760

tttctttgag atggagtctc accctgtcat ccaggctgga gtgcagcagc atgatctcgg 17820

ttcaccacaa cctccacctc ctgggttcaa gtgattttac tgcctcagcc tcctgagtag 17880

ctgggactac aggtgcgggc catcatgcct ggctcatttt tgtattttta gtagagatgg 17940

ggtttcacca tgttggctag gctagtctca aactcctgac ctcaggtgat ccacctgcct 18000

cccagagtgc tgggattata ggcatgagcc actgtgccca gtgttttttt ttttttaatt 18060

gtagtgacag gatctcactt tgtttcctgg gctattccca aactccaggc ctcaagccgt 18120

cctcctacct tagcctccca gagtgctggg gttacaggtt tgacccactg tgcctagtct 18180

cagaattcat gtttttaaaa gtcactctgt gccaggctca tgcctgtaat cctaatactt 18240

tgggaggctg aggcaggagg gttgcttgag cccaggagtt tgagaccagc ctggaaacca 18300

tagcaaaatc ctaactctac aaaaaataca aaaaatagcc aggtgtggtg gcatgcacct 18360

gtagtcccgg ttacttggga ggctgaagtg caaggatcgc ttgagcctag gaagttgagg 18420

ctgcagtgag ctgtgatcat gccactgcac aacagcctgg gcaacagagt gagaagtaac 18480

tctggctgtg gtggggaaag tggattagtg gagaatggaa gctgggaaac atggtggttc 18540

ttgctaagtc agtatcaagg gatcacagat gagggggcta tttcgtccta ataagggcct 18600

tggtctccca gatagtcatg gatttttcta tttagaagct ccttctcagt ttttcttgcc 18660

caaggcatat acggttgata tttgtacaac acaggctgga tctgtatggg tccacttata 18720

tgtggatttt ttttcaacca aacttggatt aaaaatatag ttgtaggcca ggcacagtga 18780

cttatgcctg taagcctagc actttgggag cccaaggcag gcggatcagc tgaggtcagg 18840

agtttgagac cagcctggcc aatgtggtga aaccatgtgc ctactaaaaa tacaaaaaat 18900

agctgggtgt ggtggtgtgc acttgtaatc ccagctactc aggaggctga agccagagaa 18960

ttgcttgaac ccgggaggtg gaggttgcag tgagctaacg cagcagaggt tgcagtgagc 19020

taacgcagca gaggttgcag tgagccaacg gggtggaggt tgcagtgagc caagattgca 19080

ccaccacact ctagcctgtg tgacagagca agactctgtc tcaaaaataa ataaataaaa 19140

atacagtgta ggccaggtat agtggctcat gcctataatc ccagaacttt gagaggccaa 19200

ggcaggcaga tcagttgaag ccaggagttt gagaccaacc tggctaacat ggtagaaccc 19260

cacctctact aaacagaagt acagaaatta accaggcata ggtggtgcat gcctgtaatc 19320

ccagctgctt gctaaactga ggcaggagaa ttgggaggca gaggttgcag tgagctacga 19380

ttgtgccact ggactccaga ctgggtgaca gagcgagact ctgtctccaa gagaaaaaaa 19440

aaaattgtac ttacaggaca tgaaacccac ctgtacggtg tgctgactgg gagactggag 19500

tatgcatagt tcttggtaaa caaggggatt cctgaaacca atcccctgag tatatggagg 19560

gttgactata tattttaata gaatttatta cttttttttt tttttttagc agttttaggt 19620

ttatggaaaa attgagcagg agtacatagt ttctctatct ccctcacatt tccccattac 19680

tagcatcttg aaatagtgtg gtacatttgt tacaactgaa gagccaaata ttgatacatt 19740

actgttaact aaggtccgta atttacttta gagttcactc ttggtgttgc agtttctatg 19800

agtgttggca aatatatcat gacatgtatc tagcattata gtatcatatt gagtagtttc 19860

actgccctaa aaatcccctt tgttccacct tttcatccct ccatctacct gaacccctga 19920

taaccactga tccttttaca gtctctatag ttttaccttt tacagaatgt catatagttg 19980

gaatcataca gattggcttc tttccatgtt ccttcctggc ttgatagctc ttttcttttt 20040

tttgagatgg agtctcgctc tcgcccaggc tggagtgcag tggcgcaatc ttggctcact 20100

gcaaactctc cgcctcctgg gttcaagcaa ttctcctgtc tcagcctccc aagtagcttg 20160

gactacaggc gcatacctcc cctgcctggc taatgtttgt atttttggta aaggtggggt 20220

tttaccatat tggtcaggct ggtctcaaac acctgtcctc aggtgatcca cccacctcgg 20280

cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga gccaccctgc cctgccagct cttttttttg 20340

tactgctgaa taatactcca ttgtataggt gtatgagttt atctattcac cttctgaagg 20400

acattttggt tgctcctaag ttttggcaat tatgcatgaa gttactataa acatctgtgt 20460

gtaggttttt gtgtggtcat gtttttagct catttggata aataccaagg agcacgattg 20520

ttggatcgta tggtaagagt atgtttagtt ttgtaagaaa ctgccaaact gtctttcagg 20580

gtgactgtac cattttgcat tcccaccagc aatgaatcaa gttcctgtcg ctccacatcc 20640

tcgttagcat ttggtgttgt cagtgttttg gcttttcacc attctaatag atatgtagtg 20700

atatcttgtc ttactttgca gttctctaat gacgtatgat gttgagcatc ttttcatctg 20760

cttatttgtt gttgttgttg ttgtgttgtt cattgaaatg gaatctcgct ctattgccca 20820

ggctggagtg caatggtaca atcttggctc actgcaacct ctgcctcctg ggttcaagtg 20880

attctcctgc ctcagctccc caggtagctg ggattacagg cgcccgccac catgcccggc 20940

tagtttttgt atttttagta gagacaggat ttcaccatgt tggccaggct ggtcttgaac 21000

tcctgacctt aggtgatctg cccgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga 21060

gccactgcgc ctggctttca tctgcttatt tgatatgtgt atatgttatt tggcaaagta 21120

tctgttctga tcttttgccc attttttaat cagattgttc ttttattgct tctggggttc 21180

tttttgtttg ctttttttga gacagagtct tgctctgtcg cccagtctgg aatgcagtgg 21240

catgatctca gctcactgcg acctctgctt cctgggttca agtgattctt gtgccttagc 21300

ctcccaaata gctgggatta caagcatgtg ccactgcacc tggctaattt ttgtatttat 21360

agtagggaca gggttttgcc atgttggcca ggctggtctt ggactcctgg tcttcagtga 21420

tccacccacc tttgcctccc aaagtaatga gattacaggc gtgagccacc atgcccggct 21480

tattgttaag ttttaagagt tctttgtata tgtgtatttt ttgattcttt taaaattaat 21540

acttaataaa ataattgtac atatttatgg gatgcatgtg atattttgat acatgcatac 21600

aatgtggatc aaatcaaggt aattagagta ttacctcaaa catttgtcat ttctttatgt 21660

tgggaacatt tcaaaatgtc tagctatttt gaaatataca ataaattatt atctataagt 21720

cacctcattg tgctgtcaaa cattagaact tattctttct acctggcttt atttttttta 21780

ccccttaacc aaccattctt catcagctcc ccgtctcccc tactcttttt tttttttttt 21840

ttttttgata cggagtcgct ctgttaccca ggctagagta cagtggcaca atctcgactc 21900

actgcagctt ccgcctccca ggtttaagca attctctgcc tcagcctccc gagtagctgg 21960

gattacaggc gaatgctacc acacccgact aatttttata tttttagtag agatggggtt 22020

tcaccatctt agccagactg gtcttgaact cttgacctcc tgatccaccc gcctcagcct 22080

cccaaagtgc cgggattaca ggggtgagcc accatgcctg gcccctctta ctcttttctt 22140

agcctctggt atctatcatt ctactctcta cttctatgag atcaactttt ttttagctcc 22200

cacatatgag taagaacatg taatatttct ctttctgggt ctggcttctt tgtatatttt 22260

ggataataag tcttttatta gatacgtgtt ttgcaaatat tttttccgag tccgtgactt 22320

atcttttcat tctcttaaat agtgtctttt gcagagcaca cattatacat tttagtgcag 22380

tccagtttac caattctttc tttgatggat tttgcttttg gtattgtgtc tagaaagtct 22440

tcgccaaacc acagtcatct agagttcccc ttatattatc ttacaggagt tttatagttt 22500

ttgttttaca tttaggtctg tgatctattt taagttaatt tttatgtgaa agatataaga 22560

tctatgtctg gattctctct ttttttgaga tggagtctcg ctttgtcgcc aggctgaagt 22620

gcagtggcgc gatctcggct cactgcaacc tctgactccc tggttcaagg gattctcctg 22680

cctcagcctc ccgagtagca catgacacca cgcccagcta atttttgtat tttgagtaga 22740

gacggggttg caccatgttg gccaggatgg tcttgatctc ttgacctcgt gatccgcccg 22800

cctcagcctc ccaaagtgct gagattacag gcatgagcca ccacgtccgg ccagtttttt 22860

tgttttattt atttatttat ttgaaacagg gtcttgttct gttgcccagg ctgcagtata 22920

gtgacaccat caaggcttcg ttgcagcctt gacctcctag ggtcaagtta tcttcttgct 22980

tcagcctcct gagtagctgg gactacaggt gagcaccact ctgaccaggt actttttaaa 23040

tttattttag agacagggtt ttaccatgtt gcccaggctg gtcttgaact cctgggctga 23100

aatgcccctc ctaccttggc ctcccaaagt gttgggatta cagacatgag gcactcagcc 23160

cagccaatat aattcttttt tttttttttg agacagtctt actctgttgc ccaggctgga 23220

gtgcagtggc atgatcacag ctcactgcaa cctctgcctc ctggactcaa gctgtcctcc 23280

cacctcagcc tcccaagcag ctgggattat gggtgcccat gaccacaccc agctaagttt 23340

ttaaattttt ttagagattg aatctttctt tttctcagcc tggtctcaaa ctcctgagct 23400

catatgatct gcccgcctcc gtctcccaaa gtgctgcgat tacaggcatg aaccactacg 23460

cccagcctac aatttatttg taatccaagt tttattgaaa aaaaaatcca catataagtg 23520

gacatatgta gatccaacct gtgttgttcc agtgtcaacc atatatacca ataattcttt 23580

tttttttttt tttttttttt tttttttgag atggagtctt gctctgtcgc ccaggctgga 23640

gtgcagcggt gcaatctcat ctcactgcaa cctctgcctc ccgggttcaa gtaattctcc 23700

tgcctcagcc tcctgagcag ctgggactac aggcatgcac caccacgccc agataatttt 23760

tgtattttta gtagagatgg ggtttcacca tattggccag gctggtctca aactcctgac 23820

ctcaagtgat ccacccgcct tggcctccca aagtgttggg attacaggag tgagccactg 23880

tgcctggcct ataattcttt acgtatattg ttagattcag tttgctagta ttttatttag 23940

catttgtgta tctgtgttca tgagaggtat tgttctgtag ttttctttgg tttcttttct 24000

gtctggttta gggtaatgct ggcctcatag aataggttag gaaatatttc ctctgcttct 24060

gtttctgaaa gagaattgag gtaatatcta tttttttttt tttgagatgg aatcttgctc 24120

tgtcgcctag gctggagtgt agtggcgcaa tcttggttca ctgcaacctc tgcctcccag 24180

gttcaagtga ttctcctgcc tcagtctcct gagtagctag aattacaggc atgcaccacc 24240

atgcctggct aatttttgta tttttagtag agatggggtt tcactatgtg ggccaggctg 24300

gtcttgaact tctgatctca ggtgatccac ctgtcttgtc ctcccaatgt gctgggatta 24360

caggcgtgag tcactgtgcc tggcccgaga taatatctaa tttaacagtt tggtagaatt 24420

caccagtgaa cccatctggg cctggtgcct tttgctttag aaggttattg attattgatt 24480

caatttcctt aatagataaa ggtgcattga gattgtcttt tcttcttggg taagttttaa 24540

tacattgtgt ctttcaagaa attgttccat ttcatctagg ttatcaaatt tgtgggatta 24600

gagtccttca taatatttct ttgttttgct tttggtgtcc ataggttcag aagtgatggc 24660

cctttttcat tttttctatt agtaatttgt gtctttgccc ttttttttct ttgttaatct 24720

ggctagaagc ttatcaattt tgttgatctt ttcaaagaac cagtttttgg tttcactgat 24780

ttttctctat taattttgtt ttcaatttaa ttgatttctg ctctaattgg ttttcttctg 24840

ctcactttgg atttaatttt ttttagtttt tctagaaaac taagttttta agtgaaaact 24900

gagattattg atttttagat cttttttcta atgtttacag ttaacactgt acaatttcct 24960

gtaagcactg ctttctctat atcttacaaa ttttgatgtc atattttcat tttcatttag 25020

ttagaaatat ctcttgagac ttctttgacc catctgttat ttagaagtgt attgtttaat 25080

ctccaagtat gtattttggg atttttctgg ctatctttct gctgttgatt tctagtttaa 25140

ttacatgtgg tctgagagca taccttgtat gctttctatt cttttcaatt tgttaaggtg 25200

ctctttgtgg ctcaaggtgg tctacttttt tttttttttt ttttttaaag aaaagctggc 25260

caggtgcagt ggcttatgcc tgtactccag cactttggga ggcgtaagtg ggaggatcac 25320

ttgaggtcag gagtttgaga ccagcctggg caacatatag agacttcact tgcacaacaa 25380

atttttaaaa tattagttgg gtatggtggc atatacctgt atatggctga agtgggagga 25440

ttgcttgagc cctggaggtt gaggctacat gagccatgat cgcaccactg tactccagcc 25500

tgggcaacag agtgaaattt tgttctctct tgaaaagaaa aaaaaagttg atgacataaa 25560

gttcattcat cttttttgta tgtgacttca aaataactac tgatggttaa aaaaaaaatc 25620

agaatgatgc aacccaagtg tccatcaatg gatgaataga taatatgtgg tgtatgaata 25680

caatgggcta ctattattca gcctttaaaa ataagaaaat gctgacactg ctgtaacatg 25740

gatgaacgtt cagatcatta tgctaaatga gaaaagccag acacaaaagg acaaatattg 25800

catgattgca cttatatgag gtatctggaa tataagagtc atagaaacag taattcagta 25860

attagaataa tgcttgccag ggcctgtggg gaggagggaa tgaggaattc atgtttaatg 25920

ggtacagagt ttcatttgga aaagattaaa aagttatgga ggtggatggt ggtgaggatt 25980

gcacaacagt gtgaatgtac ttaataccac tgaactgtac acctaaaaat gattaaaatg 26040

gtacatttta tgttacatat gttttacaac aatttttaca gatggaaaaa aattataaaa 26100

aacatcagga tggtgttgac agtgaaaagg ttaaagagtt actttaaaaa tttactttat 26160

tccagccggg tgcggtggct cacacctgta atcccagcac tttgggagac cgaggcgggt 26220

ggatcacctg aggtcaggag tttgagacca gcctgaccaa catggagaaa ccccgtctct 26280

actaaaaata caaaattagc caggtgtggt ggcgcatgcc tgtaatccca gctacttggg 26340

aggctgaggc aggagaatcg cttgaacccg ggtggtggag gttgcagtga gccgagatct 26400

tgccattgca ctccagcctg ggcaacaaag cgcaactccg tctcaaaaga aaattttttt 26460

tttttacttt atcccaaatg tttatattta ctttggggct tatgtgacca gtttaatttt 26520

catttgtaat tgacttgata gaacacacta atgttcagtt aagatttctt atggtgtggt 26580

gaggagtagg atttttatgt aaataagccc aaaattgtat atatgaggtt aatctgatat 26640

ttgcagaaga tattcatgca ttactgtaag gaccactctg cttattcatt tgaccgattt 26700

gttacaacat ggttagaaat catcaaggtg tttgagatca aaggatcttc agaggtgatt 26760

tactccaatc cttttttaaa aaattaataa cttgagcctc agagaagtta agtgacatta 26820

ccaagttctg ctgttagtat agtgacttta tctttacctg aatccagggt ttcttagccc 26880

tagtctgtaa tgtgtcctag tgtgcctcta gaatctggtc ctgtcagccc aagtctgtta 26940

aatcaaataa aaccagggct tggtgcttca ccttgtcttc tgccataccg ttgggtttcc 27000

tgtggaccat gcagataatg atgatgggct cagtgggctt gatagtgata actcctaaag 27060

cagctccttc taagtgcggt tctcaatctg aggaagttaa aaaaaaaatt agtgactaga 27120

acccacttct caggtactct gataaaatac atttgtaggg gagtgatagt tttcactttc 27180

tttttttctt tttctttttt ttttgagatg gcgtctcgct cttttgccca ggctggagtg 27240

caatggtgcg atctcagctt actgcaacct ctgcctccca gtttcaagtg attcttctgc 27300

cttagcttcc tgagtagctg agattacagg tgtgtgccac catgcctggc taatttttgt 27360

atttttatta gagacgggat ttcaccatgg ttggtcaggt tggtctcgaa ctcctaacct 27420

tgtgatctgc ctgcctcagc ctcccagagt gctgggatta caggcatgag ccactgtgcc 27480

cagccttcac atattttttg aaataatagg ccagttgcgg tggttcatgc ctgtaatctc 27540

acactttggg aggccgaggt gggcagatca cttgaggcca ggagttcaag gccaccctgg 27600

ccaacatggc gaaaccctgt ttctactaaa aatacaaaaa aattagccgg gtatgatggc 27660

atgtgcctgt ggtcccagct actctggaag ttgaggcatg agaatcgctt taacttagga 27720

ggtggaggtt gcagtgaggc aagatcgtgc ccctgcactc cagcctgggt gacagagcga 27780

gactccatct caaaaaaaaa aaaaaaaatc gtatgcagta aaggttgaaa actgctgccc 27840

aaaggcgcta ttaaactata ggttcccaaa cctggccaat tgtcaaaatc cctcaagaag 27900

gggcagtggg gtctaaggga ccccattgct gtagaggaga ttagtagtcc aagagtgaga 27960

tgaactgttg gaagtcctca aacttccaaa ctattaaaat agaatagttt tgcttcctta 28020

aaatagaata gttttcttcc tcactgattt ttctgtattg attagaacca taacaagtga 28080

attaaacaac tacaaaatag ttatgtgggc cacagacatt attgtaatga agtgaagttt 28140

ggctcaggcc ttgtaacaca attgcttttt ggattaaaag taaaaatatt aaattgtgaa 28200

attatgtgta agttttaaaa aattggtctt gtacaaaagt gttgggtttt tctttgtttt 28260

taactggatt tgtttttaag caagacagaa tatttatatt gttggagagt cacaaaggag 28320

gtgtgtttgt ggatttaaat gtggagacag tgtgccttga aatgcccttt atcagtctga 28380

ttcaagccac ctgcaatcat ggatttgaac tttttttttt ttttcccctg agatagggtt 28440

gcctaggctg gggtgcagtg gtgtgatctt ggctcactgc aacctctggc tcagcctctt 28500

ggagtacctg ggactatagg cacacaacat catatccagc tattgtattt tttttttttt 28560

ttttttttat agagacagag tttcaccatg ttgtccaggc tggtcttgaa ctcctgagct 28620

caagcaactc acctgcctcg gccttccaga gtgctgagat tataggtgtg agccaccatg 28680

cccagccttc actttattta aaaaccatag tttttaaaag ccacattcct actgatgaac 28740

acagaggttg tttccagtgt tttcatttgc agggctgtag tgattgtttt tgcacatgcc 28800

tctttatgta catgtgctgt gtcttctggg acagagagtg gacattttaa gtgttttatt 28860

ggtcctgcta aattgtcttt cagccaaact gctgcagagg tgatggagat gaggtgggta 28920

ctcaggagaa ttatgctcag tgcttgtgtg ctagtcactg acctggaaac attttattaa 28980

aaatgctaga ttaggttagt gatgtaaata ccaggtgata gtaaccagaa taattgtgtc 29040

aaaacatcaa gaatcatcaa gagatgccag gcatggtggc tcatgcctgt aatctcagcc 29100

ctttagtagg aggccgaggt gggcagattg cttgagctca ggagttcaag accagcctag 29160

gcaacatggt gaaaccctgt ctctaccaaa aatacaaaaa tttgctggat gcagtggtac 29220

gtgcatgtgg tcccagctac tcagtaggct gaggcgggag gatcgcttga gcctgggagg 29280

cagaggttgc agtgagccaa gactacacta cagcccgggc aacagagtga aaccctgcca 29340

taaaaaaagg agaaaaagaa tcatcaagag aaaacttaat ttgatgtgct ctgcgttttc 29400

tttggtgctt catgtcagtg ttagaaacta taggttgtat atttattaat ttttctccta 29460

catttgttca acttgactaa aatattaact ccaaatgcct agaatttcaa aatacctctt 29520

cgttataaag tatcaactat ttcttagtcc ccttaagctg atagtattgt gtcattgtaa 29580

aagatccctt gtgaaaaata atttttgtca acatgaaagg tcttaatgtg tctcctagtt 29640

tacattttac atggtctttt ccatgtattt atatagttga catatatagc tttttttgta 29700

aatacacttt cctatgtgaa catgccaagg tttacttaag cattctctta ttcttggaca 29760

tctaaattgc ttcttatttt ctattgtaaa taaagtgcta gaagcttctt tcctgaaaag 29820

ttatttactt ttcacctagt atttccatct gtgttcctca aaataagatt gctgagattc 29880

atgtatgttg ccagaaagat tgtgaggttt aacagtgaat gaggaaaact tttaacactc 29940

aaggtctacc aagtacagca agttttattt tacctttttt tttttttttt tttttttttt 30000

tttttgagtt aggccaagtt gcctaggctg ggctcaagca atccttctgc ctcagcctcc 30060

ggagtagctg ggattatagg tgtgcagcac cacacccggc tttcttgtat ttttttttta 30120

tttttattta tttatttatt tttgagatgg agtttcactc ttgtcaccca ggctggagtg 30180

caatggccca atctcgactc accgcaacct ctgcctccca ggttcaagcg attcttctgc 30240

ctcagcctcc caagtagctg ggattacagg catgtgccac cacacccggc taatttttct 30300

atttttagta gagacggggt tcctccatgt tggtcaggct ggtctcaaac tcccgacctc 30360

aggtgatcca cccacctgag cctcccaaag tgctgggatt acaggtgtga gccaccgtgc 30420

ctggctgctt tcttgtattt tatcttgctg tagcggttgt gggatttttg cctggtgtgt 30480

tcattggagt gtgtgtgtgt gttttgagat gtatgactgt gttggttgtg ttgtcatact 30540

ttgaaggttc attaatgtgc tggtctttct atttttcttg ttatacttag tcacttaaaa 30600

accctttttt tttttttttt ggaattctta tttttacagt actttgaatt cctgttttat 30660

taatcacctt cttatctgaa agtgaagtaa tagtgtactt ggcaccattg aattagaaaa 30720

ttgtgtgtcc ttggccagaa gatcacatac acaggaactc gataagttga gagatttagc 30780

cgtttcagaa atgggcattt gtgtcttcca gtggagaagc atctgcaaaa gaattgggca 30840

gatttggcca ggcgcggtag ctcatgcctg taatcccagc actttgggag gccgaggtgg 30900

gcagatcacc tgaggtcagg agtttgagac cagcctggcc aacatggtga aaccccgtct 30960

ctactaaaaa tacaaaatta gccaggcgtg gtggctaacc catttaaagt gggtgaatta 31020

tatcttttat gttttaatgt attcctagag ttgtgcaacc atcaccagaa taagttgtag 31080

aacattttca tcaacccaaa aagaaacttt gtattcatta gtcgttcctc ctcatttctc 31140

ccctaacctc ccagcactag gcaaccatca gaatactttt tgtctccacg gatttgactg 31200

ttttggacat ttcatattaa tggaatgcac aatacagtag tataatacat taattttgga 31260

aggccaaaat taatggcttt tgatgtctgc cttttttcac ttagaataat gtcttccagg 31320

tccatctgtg ttatagcatg tatcattact ttatccttta tgtggctggg taatattcca 31380

ttgtatggtt ataccatgtt ttgtttatct attcatcagt tgatggacat ttaggttgtt 31440

ttccattgac tattaagagt aatgctgccg gccgggcgcg gtggctcacg cctgtaatcc 31500

cagcactttg ggaggctgag gcgggtggat acgagggtca ggagatcgag accatcctgg 31560

ctaacacggt gaaaccccgt ctctactaaa aaacaaaaaa ttagccgggc gtggtggcgg 31620

gcgcctatag tcccagctac gcaggaggct gaggcaggag aatggcgtaa acccgggagg 31680

cggagctggc agtgagccga gatggcgcca ctgcactcca gcctgggcga cagagcgaga 31740

ctccatctca aaaagaaaaa aaaaagagaa taatgctgcc atcatgcttg agggtttttt 31800

tttattttgt tttgttttgt ttgtgggggg agcggagggc acagtctcac tctgttacgc 31860

aggctggagt gtagtaggct tactgcagcc tcctccgccc cctggttcta gtgattcttg 31920

tgcctcaggc tcctgagtat catgctgcaa tttttgtgtg agcatacatt tttcatttct 31980

cttgggtcaa tatctaggag tatccccact tttggttctg agtgttaatt gagcctgttg 32040

tgttctcaca ttccctgtac ttagatggaa atagtgcttt gcctaaaaag aaaataaaag 32100

acctgattgt gcaggcgagt gagaaagaga gagaggcgct agggttattt ccaccctgat 32160

actctttggg tagtcttggt atgactagca aagaagcaag ctccaagttg tagtttgctt 32220

ccaagtttct ggcttctgtg ggaatttctg catctaagta atgacaattt tcagttactt 32280

gcagtaagta aattatcaac caatcttact gtgtattact agcctagtag gaatttactt 32340

gtatatcgag aggaatgctg cagctttcac cttacttcta atggggatta atgcttactt 32400

aacttgcagt tttggaggca agtacaaagt acaggaccaa ttatggtcat gaagtgagag 32460

agaagtctgg ctagtgaatg gtgattggca actccagttg actgttcatg gcatcttaga 32520

tctgtgagga gggaggaggg aaggaaagtt caagctggtc tttatggtaa gttctggaac 32580

atttccctgt gtcaatgggt catctgttca ttcactgtgt aaaatggttg agggaagttt 32640

taatttacat gcttccttat tgtgtaaacc tttgattttt agtgatttca gagtttgttt 32700

ttataattac ttaacacgtg aagaggatgc agagtaacgt atcgaagctc tggttacctt 32760

ccactgggat ttgacacatt tgatttcctt tattccctcc ttccttccct tcctccctct 32820

ctcttttctt aaggaatgca actactcaga ttcacctgca cacccttggc atacctctca 32880

ctccccctta cccccacttc ctcagaggtg acctgtcctc agaggcaaat gtgtgccctt 32940

tccatccgta cttttatgct ctcatctatg tttacatcta ttagtacact attgtctgta 33000

tttttaaaca ttacataaat ggtgtaattt ttacttttaa ttctgtagtg gtgtttctca 33060

aattaagttc tgcacaaaac atttttatag atatccagtg ttagcttaac gtttttctta 33120

ttgtggtaaa atatacataa gataaaattt accattttag ccatttttaa gtttacaagt 33180

cagtggcatt aagtacattc acagtgttgt ataaccatca ccattgtcca ttgccagaac 33240

ttttcatcat cctaaacaga aactctgtac tcattaaaca atagtttatc actccttccc 33300

tgcaactaga tgctggcaat caccattcta ctttctatct ctatcaattt gcctcttcca 33360

tctaagtgga atcctacata tttgtcgctt tgtttctggc ttttttttct tcttgtgatg 33420

ctttgtttta attatgttcc tggctttcat catctagcag gctgattcca aggtttgtcc 33480

atgtggtagc ttgtatcact ttaatgtttt tagagatagt taatattaca ttgtttatat 33540

ataccacatt ttgttttttc attcaacctt gatggacatt tgaattgttt ccccctttac 33600

ctgttgtgaa taatgctgcc gtgaacattg ataaccaaat atttgtttga atctctgatt 33660

tcagttcttt tggttccata cctaggagtg gaattgctgg atcatatgat aattctatgt 33720

ttaactcttt gagggatggc cagacttttc caccatagct aaatcatttt accttcccac 33780

aagcaaagtt caagggctcc agtctctccc cataaggtcc tttgcacttt tttttttgag 33840

acggaatctc actctgttgc ccaggctgga gaacagtggc accatcttgc ctgacctcaa 33900

gtggcacctg ccttggcctc ccaaagtgct aggattgtag gcgtgggcca ctgcactctg 33960

ccaatttttt aatttttatt ttcatttatt tttctttttt taatttttaa tttttttatt 34020

ttttgaaggg ataaggtctc actttgttgc ccaggctggt cttgaactcc tggcttcaag 34080

caatcctcct acctcggctt ctcagagtgc tgagattata ggtgtaagcc cctgcacatg 34140

gcctttactc tcttgatagt gtcctttgat gcacaaaagc tttcaatttt gatgaagttt 34200

attttttatc ttgttacctg tacatttggt gtcatatatc taagagacca ttgccaaatg 34260

cagtgtcatg aagctttccc tcagtgtttt ctttctgcag ttttatgatt ttagctccta 34320

agtttaggtc tttgatccat tttgagttaa tttttgtata cagtttgaga gtcacacttg 34380

aggctctggg cgcagtggct cacgcctgta atcccactac ttggggaggc cgaggcggat 34440

ggatcacctg aggtcaggag tttgagacca gcctggccaa catgccgaaa ccctgtctct 34500

actaaaaata caaaaattag ccaggcatgg tgatgcatac ctgtggtccc agctacttgg 34560

gaggctgagg caggagaatt gcttgaacac aggaggcgga ggttgcagtg agccgagatt 34620

gtgccactgc actccagcct gggcgacaga gcgagactcc atcgtgcggg gtggggggta 34680

aaagtcaaac ttgagtcttt tgcctgtgga tatccagttt tcccatcact atttgttgaa 34740

aagactatcc tttctcaact gtgaatggtc ttggtaccct agctgaagtt atttttatta 34800

ttatgttact taggaatgca cataaggcct ggcacggtgg ctcatgcttg taattgcagc 34860

actttgagag gtcaaggtgg gaggattcct tgagccgagg agtttgagac cagcctgggc 34920

aatatagcag caagacccca tctctatatt ttaaaaaaag aagaaaaaaa aacctctgat 34980

gcataaaata tttaaacttg tatgcattct tttctttctt tattttttaa aaattgagac 35040

agcagcttac tctgttgtcc aggctggtct tgaactcctg ggctcaagca gttcctctca 35100

ccttggcctg cagtgctgag atgacaggtg tgaaccacta cacctggcct gcttacagat 35160

tataaaaaga aaataagttt acaagttaaa gacagataaa atgacaaaat cagtaaaatt 35220

aaaattactt ttatggagcc gatgatgttt attccagttg ctcctctcat tgtgaatatg 35280

gtattgttgc tgtggcagat ttggaggccg tggcagattt ggaggctttg gcaatggctt 35340

ctgttacctt gccatgaggt aactcagttc cctcatcact tttctctgag aactataaaa 35400

ccttggaggg gtgccttctg cccttcgctt ggcatgtata ttatgcaggg atcaggtctt 35460

actccgttct tgattgttag tacaaattag ttaaaattgt attgtttggc cttagcctga 35520

tggtaaacac aacagcacac gtgggctgtg aaatctctgg gcagctctgt gtttctaggg 35580

aagcatctcg atgatccaga acaggcttat actaatgttt tagtgtaatt ttgaaatgaa 35640

aacacagcat ttaaaaattc ttatagagaa tgtatagacc ttgagaagtg ttagcagacc 35700

cagtttacga catgtctcaa tattatgaaa cattgcttta ttccctatcc tgcttgtaca 35760

tttaattttt tcatccagtt ttaaacaact tgggtactgt ggcctgtgcc tgtattccca 35820

gctactaggg aggctgaggc aggaggattg cttgagcaca ggactttgag ggctgtagtg 35880

agctgtgatt gtgcctgtga atagccattg tgctccagcc tgggcaacat agcaagaccc 35940

tgataccttg ggtttttaaa aaacaaaaca agatacatgc tgacatttct ggtttggcag 36000

gcagagcttg ttctgctccc caccctccct tttcccatag taaccattta taggacatct 36060

cactgttgtc tactctgtgt tgcctctgct tccctgcgtg gtagatctag gaatcttagg 36120

atttcttagt tttagctggt gatccgtatc tttttcttaa ttccattgta acttcagctt 36180

ttcttattgc ttgtaggaag gctgtttcca ttgaatacaa acaaaataaa agcttttatt 36240

cttaatctta gagataggat gtttgtattt aaaaataatt gtgctgtcaa aattctgtca 36300

agttggcttt taccacatta gtttttttta atgtggttta tatgaccctg gagtaccttg 36360

tcttctcact gttaaattct caactgagtt gtccctattt aaagtgtgag actgtgccag 36420

tttgatttta aaatattgca agtgcgttat ggcaagataa aactgcaaag aaagaacctt 36480

catgtccctt tgattataaa tgcttttggc acttgtttct actttttcct aatgtttttt 36540

gaggaaagaa cctccaactc tccagacagg tctgggggca aatgactaaa acatgaactg 36600

aggccctggg ctgtctctgt gaggatatcc cctctattct ctctgaaatg tcccagcatg 36660

tggtgcattt cttgttagtg tggactcctc tgtatataac acatcttatt tatcttctgt 36720

gcataacatg aagtagtgcc ctaatgcaat tccaggatgt aattcagcat ttctataaaa 36780

atacagtgtt tttctacatt tgcatcaaaa aataaccaga taattatatt tattaagaaa 36840

atagcatttt tggctgggtg tggtagctca cgtaatccca gcactttggg aggccgaggc 36900

aggcagatca cttgaggtca ggagtgaggc aggcagatca cttgagatca ggagttcgag 36960

accagcctgg ccaacatggt gaaaccccat ctctactaaa aatgcaaaat tagcctggcg 37020

tagtggtgca tgcctgtaat cctagctact caggagactg aggcaggaga atcacttgaa 37080

cttgggaagg ggagattgca gtgagctgag attgtgccac tgcactccag cctaggcaac 37140

agagtgagac tctgtttcaa aaaaaaaaaa aaaaaacaaa gaaaagaaaa gaaagaaaga 37200

aatgtatttt tggtatttgt tttcacaaac tagagcattt atgtgaaata acattgctag 37260

tattgatatt ataccatagt ataatactta gttcttcagc gatgtatctc tgctgatcag 37320

ctacatgata tctacttgag ctgttggatt ttttttaaga acagtgcatt tttgaatgct 37380

tttgaaaaat tgtagtaaaa tacataaaac aacatttacc ttgtaagcat tttaattggt 37440

acaattcagt gacattaagt acagtcccag tttagtgcaa ccactgttac tgtctagttt 37500

cagaacgttt ttgccccaga tggatactct gtacctgttg aacattcagt cctcatggcc 37560

caataatctt tatgtctgta tagatttgcc tattctgcat attttatata aatggaatca 37620

tgtcttttgt gtctggcttc ttttacctag catagtattt tcaaggttca tccatgttgc 37680

agcatgtttc aatactttgt tcctttttat gtccattgta tggatatgcc acatttcgtt 37740

aatgacaatt cttttgggta gctacatttt aaaacattat agtagaatac atatagcata 37800

caatttacta tcttaaccat ttaagcctgc agttcagtgg cattaaatac attcacgtta 37860

ctgtgcaatt atcaccacca tctgtttgca gaaacttttc atctcctcca tttgaaactc 37920

tgtatacatt aaacatgaac tctcccttct ccccttcctc cagccctggc agccaccgtt 37980

ctacattttt atctttctga cagagatttt actactctag gtacctcaca taagtgaaat 38040

caaccagtat ttatcctttt gtgaccagct tatttcatta gcttaatgtc ctcaaggttc 38100

atccatgttg tagcatatgt caacatgact ttccttttaa ggttgaataa tattccattg 38160

tatgtatatg tcacaatttg tttctccatt tatccatcac tggacatttg ggttgctttt 38220

acctatcggc tgtcttgaat catgttgcta tagctgtaca agtatctatt tgagtttctg 38280

ctatcaattc tttaagtata tgcccagaag tggaattgct ggatcatatg gtaattccgt 38340

gtctggtttt ttttttgagg aagtgccatg ctgttttcca cacagctgta ccattgtaca 38400

ttccccccag caatgtacga gggctctgat ttcttcacat ccttgctaac acttagtatt 38460

ttttttgata gaatagccat cctaatggct acttttaaag tatgtttaac attatttatt 38520

tatttttaat tttttttgta gagatggcat cttactgtgt tgcccaggct ggtcatgaac 38580

tcctgggctc aagcagtcct cctgcttcag cctcccaaag tgttcggatt ataggcgtga 38640

gccaccatgc ccagcccaaa tttaaatata taactaaaca catagcagct aacaccaagc 38700

ctttaaaaat atcattaata ggccaggcgc agtggctcat gcctgtaatc ccagcacttt 38760

gggaggccga ggcgggcaga tcacctgagg tcgcgagttc gagaccagcc tgaccaacat 38820

ggagaaaccc tgtctctact aaaaatacaa aattagccgg gcatggtggc acatgcctgt 38880

aatcccagct actggggagg ctgaggcagg agaatcactt gaacctggga ggcggaggtt 38940

gcggtgagtc gagatcgcac cattgccctc cagcctgggc aacaagagca aaactccatc 39000

tcaaaaaaac aaacaaacaa acaaaatata tatatcatta ataggccggg catggtgtct 39060

cacgcttgta atcccagtgc tttgagaggc cgaggtgggc agatcactgg ggtcaggagt 39120

tcgataccag cctgggcaac atggtgaaac cctgtctctg ctaaaaatac aaaaattagc 39180

cacgcatggt ggtaagcacc tgtaatccca gctactcagg aggctgaggc tggagaatgc 39240

ttggacctgg gaggtggagg ctacagtgag ctgagatcac actccagcct gggtgacaga 39300

gcaagactct gtctcaaaaa aaaaaaaaaa aatcattaat aaatgtgatc ttttttcttc 39360

ctatacaaca agttgtcaag caagtatgac cttcttaatt gaccctttga catgaactgg 39420

gatgagatcg tggaggatgt tgaggagaca gttgttacca tagtgcactt ctaaaaactt 39480

taattctata gatttcttta aaattttttt taaaattatt atgagtacac aataggtgca 39540

tctatagatt tcattaccct caaataaatg tacaaggcaa tgcagagaaa tgcacagtgt 39600

aacttggtag acttgaccta tcaagttact gttgaatata ttatggagcc tgtgtattac 39660

caggggcagc agacttttcc tgtaaagata gttgttttca gctttgttga atctgtggtc 39720

tctgtcttaa ctacaactga gaaagccatt gacaatatat agatgaatgt acatgactat 39780

tctaataaaa ctgtgtacac tgtaatttga attgcacata attttcatgt gtctcctgta 39840

taattcttct tttgacttct tttcaaccat taaaaaatgt aaaaacaggc caggcgtggt 39900

ggctcatgct tgtaatccca gcactttggg aggctgggtg gattgctgga gcccaggagc 39960

ttgagatcag cctgagcaat gtgatgaaac cctgtctcta caaaaaatta gctgggcatg 40020

gtgttatgtg cctgtggtcc cagctacttg ggaggctgag gtaggaggat tgcctgaacc 40080

cgaggaagtc aaggctacag tggtttgtgc cactgcactc tagcctaggt gacagagtga 40140

gaccctgtct cagtgaatga atgaatacat tattagcttg tggactatac aaaaatcaga 40200

ggctggaggt gagctgggta tggccattgg gtgtggtttg ctgacttctg gtagagagga 40260

attaggagat gttaaaggtg gtggaactgt cagatacttg cattctttta gaaatacttt 40320

ggagttagct ttttggttca ggcaaaggac caaagggtta ggagagtcag gccggtaaag 40380

aggagtggtg ggcccatagc agcagttcct ggagtttttt tttttttttt ttttttgtga 40440

gacggagttt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg cacgatctcg gctcactgca 40500

acctctgcct cctgggctca agcaattctc ctgcctcagc ctcccgagta gctgggacta 40560

caggtgccca ccgccacgcc cggccaattt ttttctattt ttagtagaga tgggatttca 40620

ccgtgtttgc taggatggtc tcgatctcct gacctcgtga tccacctgcc tcggcctccc 40680

aaagtgttgg gattacaggt gtgagtcacc gcgcctggcc aggtcctgga gtctttaaga 40740

ggaggtttgt ctgatggttg gttggacaaa agcctgggca tgttgtcacc ttccataagt 40800

gtttgtggga atgtaggtaa tgaggaggag taaaggattc ctgaaggatg aggaggaggg 40860

ctggtggctg ccataggaag tgatcactgt tttggcagac ctgtcttaga gtaatgaccg 40920

tcatactctc tcattgccct tgtgaactca tgaaatccca tggctgctaa agctgaaggt 40980

caagtgggga cttcccggcc actgggctta gcaccccaca gagctgtgga gtgggcatta 41040

atgtcccttt tttatagatg cggagactga gaatgaggac tgttggtaac ttttgaaagg 41100

gcactcagct agaaaagtct gagccaggat ttcaagtccc atggctttac ctctgtggtc 41160

ctaatatttg gtgtgttcaa gtgagatctg tttttttcct atttcatttt gattattgat 41220

tttcataaat ttttttctct tttgagatag tatcttctct ctcttttctt ttttctgttc 41280

tttctttctc ttttctttct tttttttttt ttctctgaga cggagtcttg ctctgtcgcc 41340

caggctggag tgcaatggtg caatctcagt tcactgcaac ctctgcctct cgggttcaag 41400

cgattctccc atctcagcct cctgagttgc tgagattaca ggcacctgcc atcttgcctg 41460

gctagttttt gtatttttgt agagacgggg tttcatcacg ttggccaggc tggtcttgaa 41520

cttctgacct caggcgatcc acccgcctct gcctcccaaa gcgctgtgat tatatgcatg 41580

agccaccatg cctggccatt atttctttct ttctttcttt ttcttttttt caggttcatt 41640

gaatttgctt tgagacaggg tcttgctctg ttgcccaggc tgaagcgcag tggtgcagtc 41700

atggctcact ggagcatcaa tttcctgggc tcaagcgata cttgcacttc agcacccctc 41760

cacccccacc cgctcctttc ccccacagta gctggaacta caggcgctag ccaccgtgct 41820

tggctaattt tttttttttt tttttttttg agacggagtc tcgctctgtc acccaggctg 41880

gagtgcagtg gcgcgatctc ggctcactgc aagctctgcc tcccaggttc acatcattct 41940

cctgcctcag cctcccaagt agctgggact acaggcgccc gccaccatgc ccggctaatt 42000

ttttgtattt tttagtagag acggggtttc accgtgttag ccaggatggt ctcgatctcc 42060

tgaccttgtg atccgcctgc ctcggcctcc caaagtgctg ggattacagg catgagccac 42120

tgcacccggc ctggctaatt tttaaatttt tttttgtaga ctgcccaggc ttgtttaatt 42180

gattttctat gtgatcttag ggaaatcgat tatttcccat aaacattttt ttaattagaa 42240

gttaaattct gcctagtttg attcacagga ttattgtgga tgactgaaac agagaatagg 42300

taagagcttc tttgaaaaat atgaggtacc atacagaagt tagatgcttt gtcctggtga 42360

taccccctcc aaagcacagc taaggaaatg tggaaggcac tcttatctca tcatatagct 42420

ttgaaagcct agcattgaaa gtacgaactt gattcttttg gagaaatcct ttggctctca 42480

gtgagtttac tttctattaa tgactgtgtt aagcggaatg aaaactgaaa gaggaaaggg 42540

gaggaagtca gaattaagca ggaagagtga gcccatagca gagtccagat ttagacccca 42600

agctacttgg aatgatactg gacaattatg ggtgtgttta atgatggtcc tgagtcatga 42660

aaacaaaagg aggctttaaa ttatgtctgg cttagtgtac agcatatttt tgtcattatt 42720

caagttttag catgtaaaga ggaaagtgtg cagtacttat gcatatcatt ttcattaatg 42780

aaactaaatg aggcctcttt aaaattatca gtgttcacag tatcttccaa aagacatgta 42840

aatgtataaa ggtataaaaa atatacatat aaattttaca attttgtgag ctatatagta 42900

gatctcttat tttgtccata ggtcttaaag atcttatact gtattcagga ataaagataa 42960

cttcagtggg aggcctttac agggctaatg agtaagcatt attttgataa agttctgtgt 43020

tgtctacaat agatatagta gaaatactct tggaatggta atcatcccag gccctgcttt 43080

ggagcggaag aaatagtcaa tgtagaactt tacagtatat tgtacacaga tgtgcctgct 43140

aataacttct gtagacagca aagtttaaga gaaattaggt ggtaaatgca acatatgtat 43200

ctaaataaat ttggtctgag ggatttgata agatgaaaca gtacatagtc cagaaaattt 43260

ttatactcaa agaattatag aaaatatctg aaatgttttc agttttgtgc atatccagaa 43320

aatgtcatcc tgtgatctgc tggttggcag cccaatggca gtattagatg tattgttttt 43380

attttgtttt gtttgctatt tatttggtta agagagttac ctaattagga gtgtgaaaaa 43440

aaagatttat tatagtagtg ggcttttgtt tgacttaaaa catttttgtt gttaccacag 43500

tatgagtgcc ttgtttgtga aatttgttta ccgggaagcc atatacttag agtagctttt 43560

agtttatcat tatcatcatc atcatcatca tcatcatcat catcatcatc tccttcatca 43620

tgaaaggaag aagctaccaa tgttgcttta ttctgcaaaa aatacaatag atgcttgttg 43680

aaagtatgga gtgaaatctt aaatatgtct gttaaaaaga gtacaactgg ccaggggtag 43740

tgcctcatgc ctgtaatccc agcactttgg gaggccaagg cgggcagatc gcttgagcca 43800

ggagtttgag accagcctgg gcaacatggt gaaatcctgt ctctacaaaa aaaaaaaaaa 43860

tagacaaaaa ttagctgggt gtgatggcat gcagctgtag tcccagctac agtggggctg 43920

aggcaggggg attgcttgag cccaggaagt aaaggctgca gtgagctatg gttgtgccac 43980

tgcattccag tgtgggtaac agaacgaaac cctgtctcaa aaaaaaaaaa atagtacaac 44040

tttaagcagg atgtgggcac atgcctgtag tctcagctac ttgggaggct aagtcaggag 44100

agtcacttga gcccaggagc ttgatgctgc agtgagatgt gattgtgcca ctgccttcca 44160

gcctggggat gatagcaaga ccccatctct aaaaaaaaaa caaaaaacaa aaaaaaaaca 44220

gagtacaaca acctttggta aacttggaat ataaaggtgt ttccttaacc tgttaaagag 44280

ctgataaaga gtggtacttt caaaccagta cacattatgt gaaacactag agacacttcc 44340

catttgttaa aagaaaaacc ttagccaaat taaatttaag ttttttttgg agacagagtc 44400

ttgctttgtc acccaggctg gagtgcagtg gtgcaagcac agctcactgc aacctccgcc 44460

ttctgggttc aagtgatttt cctgcctcag cctcctgcgt agctgggact acaggtgtgc 44520

accaccacgc ctgggtgatt tttgtatttt ttgtagacat ggggttttgc catgttgccc 44580

agtctggtct tgaactcctg ggctcaagca atctgcctgc ctgggcctct gaaagtgctg 44640

ggattacagg cgtgagccac catgccattt aatggtttaa ttgagcaaag aatgatttgc 44700

aaattgggca gcctcccgag ccagagtagg ttcagagact ccagcacagc catgtcgtgg 44760

aaaaagattt atgaatggaa agaggaaagt gatgtaccga aaacggaagt gaggtacaga 44820

aacagccgga ttggttacag ctctgaattt gccttatttg aacacaagtt gaggtttgta 44880

cagttggcca cctttgattg gccaaaactc ggtgattggc acaagagcag gttatagtct 44940

gtttacatct ccattttggt tatagttcat tatggacaga aaaacctgta ggtcaaactt 45000

aaaatatgta aggagacagt tttaggctaa acttgattta acacattaaa tccgtaacaa 45060

gacaggatgc ctgccctcac catgttattt gatcttattt tagtaattct agccaatgta 45120

gtagggcaag aaaactgcct gcttggctac aaaataaaca cacaaaagtc agtatctgta 45180

atatgtgaca gaaaatataa ttaaaaaaaa aaaaaaaagc cgggcacagt ggcccatgac 45240

tgtaatccta gcactttggg aggccaacgt gggtggatct cttgagctca ggagttcaag 45300

accatcctag gcaacatggc aaaaccccgt ctctacaaaa aatacaaaaa aattagccac 45360

gtgtggtggt gagctcctat agtcccagct actttggagg ctgaggttgg aggatcattt 45420

gaacctgaga agcacaggtt atagtgagct gagatcacgc cactgcactc cagcctgggt 45480

gacaaagtga gactctgtct aaaaaaaaaa aaaaaagaag aaaaggaaag gaaagtaaaa 45540

gaaaaaataa tttcacttac tagagcatca aatccctaag ataatttaga gcaaagccag 45600

aaaagtgaag aaaatataaa aatctttaca gtgggttgca ttttaaaaaa aaacttgaag 45660

atatcagatc aactcactaa tgtattaatt aatataattt aaattaaaat cccactgatt 45720

tttttgtggg gagggtggga gagtcatttg ttaaaatgat tctaaagagc atctggaaga 45780

ataagcaggc aagaatagcc aagaacattt tgaaaactaa agatgagttt ggaagacgat 45840

tggttttgta ctgtcaacta cttatagatt ttacatgaat tttaaagggt aatctgagcc 45900

ctcgaataga cagaaatagc catagatctg aaagaacact taagacctga tccagctatc 45960

catgagagta tatataatca aagtctttgt gtgtgaatca ggagtctttc aggtgcaagg 46020

taaataaact cataattgct tacgcaaagg tggtatttgc tttagtgact ccagagaaag 46080

ctcaagtgcc tatctctccc ctgactttga ttctttttgg ggttggctcc attctctcct 46140

gttgctaatg gcttcctttg tgcagccaga ggaaaggagg tgtggttttt tgatacttcc 46200

aggcttctat ttttatagct tgagatcaaa gagggaagtg accttcctta gagtcagtgt 46260

gtaaagtcct aaggaagata ccacgtgggg tgctggggcc atgtgcccat ccctggccca 46320

tgaccatggg gatgctacac taactggggg ccacgcatgg ctgttcctgc cctgaactgc 46380

cagctggctt tgcagtgcag cctcaccaga atcacatgga atagtaggga tatgaattgt 46440

ttcccaaaga aagtgtgtgg ggtggtagaa ttactagtgg gggagtaagg ggacaggcca 46500

ttgggcatac tggagcagca tttactcagt cattgagaaa aggatggaac attcaataaa 46560

gggtgctgga cacatttgtg ctctaaaaat tttgtgtttc acctattaat ttatccctcc 46620

ccttagcccc tggcaaacac tgatctgttt actgtctcca tagttttgcc tttcccagaa 46680

tgtcacaccc ttggaatcat acagcatgta accttttcag attggcttct tttacgtagt 46740

aatatgcatt taggattcct tcatgccttt tcctggattg atagctcatt tctttttagt 46800

cctgaataat attccattct atggatatac cacaattgat ccattcacct actgaaggtc 46860

attttgattg cttccaagtt ttgataattt aaaaaatttt ttaagacagg gtgtcattgt 46920

gttttccata ctggtctcct gaacacctgg gctgatgtga acccctctcc tcagcctcct 46980

gggtaactgg gattacagct atacaccact gtgcccagtg tgacaattat gaataaggct 47040

gctgtaaact tctgtgtagg tttttttgtg tgtggacatt ggttttcagt tcattatggt 47100

aaataccaag gagtgcagtt gctggattgt atggtaaaag tatgtttagt ttgctaagga 47160

actgccagct gggtgtggtg gctcatgcct gtaatcctag cataatggga ggctgagaca 47220

ggaggatccc ttgaagccag gagttcgaga ctagcctggg caacatagtg agacctcatc 47280

tctacaaaaa atttaaaaat tagctgggcg tggtcttatg tgcctatagt cctaactgct 47340

tgggagactg aggtgggagg atcacttgag cccaggagct ggaggtggca gtaaactgtg 47400

atcataccac tgcactgctg cctgggtgac aaagcaagac cctgacttaa aaaaaaaaag 47460

agaaaagaaa aaaagatgag tcagagggta aggaagcaaa aataagtaaa taaataaata 47520

gaagagaaaa gaaaaaagaa aaaactgtct ttcaaagtgg ctgcgccatt ttgcattcct 47580

accagcaatg aatgagagtc tgttgttgca catcctcacc agcatttggt gttgtcagtg 47640

ttctggattt tgaatattct attaggtata taatgctgtc tcacttgttt taatcaatga 47700

tatatgacat tgagcatctt tttaatatgt ttacttctca tctatgtatc ttctttagtg 47760

aggcctttgt ttaggtcttc tgcccatttt aaaaaatggg ttcattttct tattgttgaa 47820

tatcatgagt tctttgtcta ttttgaatac ctgccttttg ctttattttt gtgtttttta 47880

tttttttttt ttattgagac aagttctcac tctgttgccc aggctagagt gcagtggcat 47940

gaacatggct cactgcagcc tcaacttctc ccagcctcaa gcaatcctct tgcctcagcc 48000

ttccgagtag ctgggactat aggcacacac caccatgccc tgctaattta aaagagtttt 48060

tttttgtaga ggtgggatct cgccatgtta cccaggtggt cttgaactcc tggcctcagg 48120

caatcttcca gccctcagcc tcccaaagtg ctgattatag gcctgagcca cttagcctag 48180

ctcagaattt attttttatt tgttaatttt gaaaaaatat aggacctcat aaaagtcagt 48240

ctacatttgt acacattatg tttttggtga atatgtaaat ggattctttg tgaatcaatt 48300

tggttttgtt tttttgcttt taaaaatacc agccctgggc tggatgcggt ggctcacgcc 48360

tgtaatccta gcactttggg aggctgaggc aggtggatct cctgaggtca ggagtttgag 48420

accagcctgg ccaacatggt gaaacgctgt ctctactaaa aatacaaaaa ttagctgggc 48480

gtggtggcgc atgtcagtaa tcccagctac ttaggaggct gaggcatgag aatcgattga 48540

acctgggagg cagaggttgc agtgagccga gatcgcgcca ctgcactcca accttggcga 48600

tagagcaaga ctctgtctca agaaaaaaaa aaatgccagc agtggctggc tgaggtggct 48660

cacacctata atcccagcac tttgggaagc caaggcaggt agatctcttg tggtcaggag 48720

ttcaagacca gcctggcgaa catggcgaaa ccccatctct accaaaaata caaaaattag 48780

ctggatgtgg tagtgcgcac ctgtaatttc agctgctggg gaggctgaga catgagaatc 48840

acttggaccc tggaggcaga ggttggagtg agccactgta ttccagcctg ggtgaaagag 48900

ggatactcta tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aagcgggctg gatacagtgg tgcacacctg 48960

taaccctagc actttgggag gctgaggtgc tcagattgct tgagctcagg agtttgagac 49020

cagcctagac aacatagtga gacatcgtcc ctaaagaaaa aaaaaaaata ccagcactta 49080

gccaaaagat ttcaacagtg cagaaaaaga aagttgtgat atcttttctc caaattagtc 49140

ttgttttcag tttcattatc caagtaacca ctactaatag ttaaaacatt tgaaatacgt 49200

gtgggagctt gtcctattta atataaatta tttattgagc aaataatcac cactagtatg 49260

ttttggatac tggaattttc atatgtagga gtccttgaat gtaaggtgcc cctttggtag 49320

ttctgtgctt cttttacctg tactgtaaca tagggaaaga tgttacaaat ggttgtattt 49380

ttaacagagc agtatctatt cttaaacacc agcccttcca ctaaaggtaa acaacaaatg 49440

aatacataaa tgaagttttg gtattgggat tatgtgggtt aaacacatcc atatttcatt 49500

attaatattt aagaatataa caaacttttt attggcattt ggaccttgta gctaaggaaa 49560

gattaaactt tgtttatttg tgctttgttt tttttcttca ctcagatatt tgaggatttc 49620

ccatttgagg aatacattta ttaatcaagc tttagtttca agatccttga tcttagggaa 49680

taccatcaac cgttcttctt taagcttcct aactttgccc aaatttggtt agaactactc 49740

aagagtagtt tgggtaattc agaaatttta ttggaagggg aaagaatttt tgacccaaat 49800

tagataaagc aactcttggg taatgatttc ttttcttgtt ctctctttat aatcaattga 49860

aagtagtagt aaggctgggt ggcaaaagaa agaggcctgg ggagaatcgc gtggttttca 49920

ttatctcttt tcatagcagc aaagtgggaa gggaccaaga ggaaatcaac tgaaaaacca 49980

tccttctgaa acattggcct aaaaaactgt agtccagaaa ttgagtgcaa ctggcagtgg 50040

catttaaaag gaatgctcta atttctagga aagcaggcac gagtacctct taaaagaaga 50100

aaaaaatgaa aactgtaatt taggacacat agacgagtat ccattccctg tacttttact 50160

ctcatgtcct aaccaaggaa gggttgccat agcaaatatg gcattcctta gccatgattc 50220

actgttgtaa atgcctgcag cattcataaa agtaagatat atgggctctt ctttttcctt 50280

ttaaatcttt atttctgtat ttaaatctgt atgtcatcat ctgtattttc tctcttgttt 50340

tttttaaatc ttgggagatg gtacaaatta tttaggggag ggaatgagtt tcttgtccac 50400

aaatagagga gagagagggc tttttgtctt tctgctttgg aactggagag cttcctattt 50460

aggcatggcc tttttcaagt gaccttgtat tgttatcagt actgtagaag gtaggcacgt 50520

tgtgtaaact ttaaaattga aagccattag gcattccact tgtaaacctt ggctttttaa 50580

agaaaattac atgttcattg tgaatatttt cttatcgacc tatctctgtg cacatgcaga 50640

cttcctttgc ctacattctg aaaggtgtaa ttgccttctt taaggacagc ggacatctat 50700

agttcttggg tcaaattgtc ctccttctgg ttttgtcagt tctcagccac actgtgtgag 50760

catccatttt cttggattct ggttcggagc tcattttaag gaacatcatg tcccttttga 50820

gactctgtgg acattggggt gggtagatgt ccccctgtga acagaaggtc cctccctaag 50880

gaggtgcttc tctgtgttga gtcctgcatc tgggcacaca gagcccgaag caggaagagt 50940

tgagtctgaa tagggaggcc tgtaagcctg actgctctgc cacgggtagg cctggtctgc 51000

catgctccag gagcccccag gaggctctga agtcattctg cctctgggaa ttttacagag 51060

gagctaatat ttgagctgag tgagaaggtg attcttgaaa aagcaaggcg tgccctggtc 51120

cagttctgtg gggctgtcgt agaagagggc tcggaagctc ttgggagtga ggctagaaag 51180

gtaggcagtg ttaccataag gaggttggaa gtgacacaga taggctaagg aaggggactt 51240

cagtaatcat gcagcaatgg cctggaaaag ggagaggctc atagtaggga gaccagtttg 51300

gaggctgcca tagtgttcta ctgagagaga aaaagacttg aactcagagc acggtcaggg 51360

aaggtggagg ggcagggtct gatttggaag tgttttgttt tttggttttg ggaacaagga 51420

tttggaaacc tcttggctcc gtagatgaag aaaggtgaac caaggaagac tgaagtttcc 51480

actcaaggaa acagtaactc agggaagaaa acacaggagt aggaataggt ttaagagaat 51540

gacaagcagt tgtgttttgg acttgtttag ttcgaggtga catctttgta gggatgtcta 51600

gctggtagct gcaagtatag gaggaggctg gatgtgtgca tgagtttctt ggtaaagatc 51660

catctgcagt ctcctgaaga tgtcacccag attgccctgc catcacccca gggccttgag 51720

tcactcgctt ctcttggtgt ctaggcaggc ttgaagaaaa tcaaacagta caaaatcatg 51780

caaattcaga cctctattcc accccagagg aaagtcctgc tagcagtttt tgtgtattct 51840

tccagaaatt tgccttgcaa cgcgtttgag tatataaata atcccagaaa ggatgggcca 51900

gacactagca gaaactcacc acacacactg cactgggcat gcagaaactt tgcaaaatgt 51960

actggtgtgt gctgtcactg cattcctggg tttggaggtc ttctgtgtcc ccagctgtca 52020

gtattgccca caggctgacc actgagctcc ttccacagcc ggcccatatc accctctttc 52080

gaagtgtgtc tgcaaggcta gattattaga gtaatttaag tgtttctgct ttgtgttttc 52140

tttaatgaat ttttttatga tgaagttctt gttttaaaaa tatacagtgg taattaacat 52200

gtatgcattt ttcttaaaat gaccccccca gtccctcttc ggatgtgatc actgttaaca 52260

gtatcgtata tagaccctgt tctgtgtggg gcgggcagag ggctggttag tgggtggaac 52320

atgcatactc acaaccatat ttttcacatg ggaaaatata aaggtgacaa caaatctcct 52380

ggactataat ctcatcaagc agacaataat ctctgtttca aaagtggaca aatacatgct 52440

gattttttaa aaaaaattat aatagtacag aaagatacaa aaataagtta aagtcttcct 52500

aactctcctg cctgtgccct ccactgggca aaagtccctg tccctaaggt aatatctgtt 52560

aacagttctc cttccagaaa acttgcaatg caaataggaa cattttgtgt gtctgcctct 52620

gtgtgtatgt gtttacatgt cttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 52680

tttttttttt tgagacagag tcttgctctg ttatccaggc tggagtgcag tggcatgatc 52740

tcagcttgct gtgatctctg cctcctgggt tcaagtgatt ctcatgcctc agcctcccga 52800

gtagctggaa ttacaggcgc ctgccaccac acccagctaa tttttgtatt tttagtagag 52860

atggggtttc gccatgttgg ccaggctggt ctgaaactcc tgacatcaag tgatctaccc 52920

gcctcagcct cccaaagtgc tgggattaca ggtgtgagcc actgcttctg cccctgcaca 52980

tgtctaacgc acacaaaaga gattctgctg aacacatttt ttatgctttt tctttccaat 53040

ttaacatatt tgacatcttt atcagcttat atagctttat ttttttaaga ggttattggc 53100

tataaaggga aagtgcttta tgggtgcttc tgttgttatt taattggatc ctgttgatgg 53160

acattgatat catttctaaa ttttttagta tcctaattaa tcctgtggtg agcatcctta 53220

tacagatatc cttgttccct catgaaaata tttctggagg atggaaagaa gggaaatttt 53280

aaaaattatt tgtgtaaaca ttatcgtttg ttagtagaat gacctcagga gagattgtag 53340

taatttatac ttccccacat gcatatgaat gccttttcaa tatattgttt caaaattgga 53400

tatcatgaac cttaagagat aaatatatat gtatgtattt tttttttttt tttttttttg 53460

gtgggggcat gtcctgttat tgacagtttg ttttggtgga gggatgtcct gttattgaca 53520

gttatcgaat agaactttgt cagttccttc atgtaaggga tgaatttggt aataaaacag 53580

gtctgacttc agttatggaa ctgggaaagc tggaccttga tgtggaggtg ggctcagaca 53640

tgctgtgtct gggcaggtat ctcttgggaa gcagtgtcat ccctgaacag aaacatggat 53700

gagccgcagg ggacggtgct gagcagaggg gctggccgtg ggtcatctgc ctcccttggc 53760

ctagaaggca caagggagct ttccaccttg cctttggttt tgagaatgca gaagctacta 53820

agcaactcac agtgtgccca gggtggtcca gctgaaggat gcgaaatggt tcttcctttt 53880

ccagccaaag atcttgaacc tcccacccca tgacaagcat tataaaattc acataatttt 53940

gataggctgg attccttttc tgtagcagat ctttcctcag aacagaagtt tgtttttttt 54000

ttttaaccta aattacctgt gagttttatt ttttaaatat ggaatctgtt ttttggacac 54060

ctccttgtca tattaaatgt tctgttatta attttgagat tttaatgtaa attttacccc 54120

agcaaattaa ttttgtttct cttgctctct cttttttttt ttttggcatc ctttcccgtt 54180

gtatagtggt gctcatttta tcatactgct tttatatgac ttttcttttg tgaacaggga 54240

tcttgttcac ttttcctttt ttaaaaattt ttttattttt ttgagacgga gtcttgctct 54300

gttgcccagg ctggagaaca gaggcacaat ctcagcccac tgcaagtttt gtcttccggg 54360

ctcaagcgat tctcccacct tagcctcttg agtagctggg attacaggcg tgcaccatca 54420

cgcctggcta atttttttgt atttttgtag agatggggtt tcactatgtc atccaggctg 54480

gtctcgaact cctggactca agcgatccac ccgcctcagc ctcacaaaat gctagggtta 54540

caggcgtgag ccactgtgcc cgagccactt ttccttttaa cataaaaaca ttgatatcct 54600

agagagggca ctgtattttg ggtacataca ggttcagatc acggaagagt tgtattctat 54660

actttttttc atcattctta gttcagtatg atgtatttta taatttcata tgagaaactg 54720

taacaatggg catgtgtcat ccagcaatac ctactcataa atcatattaa attttgatcc 54780

aaacatggga gaaactgaag ttttctctgt gtacttggat gctttcagag gcataaaatt 54840

atattaccat gtgaaagcaa gcctacaaaa ttcctcaggt ggtccactct gccactcaaa 54900

tgagagccag acttacagtg cacactctac aaacggactt ccagctcgtc agggtatttt 54960

aagtgcctga atatgcaagg cactgtgcca gtaaaattac tcagtcctga ggatagagcc 55020

tgttagaatt attttaaaat ctgtacttga agtttatttc ctcagtattc caagatattt 55080

tatctggttg ttctctgagt atttcacacg tagctagtta catataggtg agatggtgat 55140

gcttgtgcct ggtgtggatg agaaactgag cctggcagac ccgagattgg atttcctctt 55200

ctgactttgc aagtgtggct ttgctttaat aatagccctc ctctttttct gtattcctct 55260

tttctccttc cagtgtggca aatatgcatc aatcaaaata caataacctg tggaaccatt 55320

ttttctaaaa taggaaggtg gtgccatggg ctattgattg ttgagggtag tcttcagagc 55380

ctgtcttata aatctataat aattcccccc aaattaatgt gctagttaga accctagaat 55440

tgcagcactg aaagtgaatt ttagaatctt ttccaacttt ttaccaagct cagaaagccc 55500

ttttattgga cctttgtttg cctcatggtc atctggtttc tttatgctgg tagtaacagg 55560

aaccttacta acctacaagg tgacccagtc catcctgggc agctgtgatc attggaaagc 55620

tctgaatcat tcatctggaa gctgcctgtg gcagaatagt acagaacata tgcattgcac 55680

acactacaaa actgctttaa ataagtgttc cttttcattg ttagatggaa gtgacccagg 55740

gcaaggatca tgttttatga gccagttttc tcctagtgcc ttgaacatag gcacttggta 55800

gtgtttagag aatgaattgt cttttttttt tttgagacaa agtctcactc cattgcccag 55860

gctggattgc agtggcacgg tgtcagctca ctgcagcctc cacctcccaa gttgaagtga 55920

tttttgtgcc tcatcctccc gaggagctgg aattacaggc atgcgccacc acacccagct 55980

aatttttata tttttagtag agatggggtt ttgcgtgttg gccagatggt ctccaactcc 56040

tggcctcagg cgatctgcct gcctcagcct cccaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc 56100

actgcgcctg gccagagaat gaattcttaa taagtttctt atgacttcag attgactggc 56160

agttgtgcta aatatttttt gcctttattt gaattagaaa attcgtaagg gggccttgag 56220

agtagatgca gtcacattta ggagattttt cccccccatt ggttaaaatg cagtttttct 56280

atggatctgc tttagaacta caaataaact ccgatcactc acagcagact acgcaatgag 56340

ataagaagca gtccatttgt tctgtcgttt attcatggcc ctcatctttg ccagccaacc 56400

tgtgcagaag agcacagcaa agcataagct tcctaacagc tattcccatt cagctgctgt 56460

cttcaagaag cagaagggtt tagataacct tagagaacat aatcaaacct gggaaactca 56520

aatcaaaaca aaacttcgaa acggaagttg aaggtcctga ggtacccaga ggcatagcaa 56580

ggaaaacgtc cccactggga tatcttctgg attcacctac agacctctct ggagttttaa 56640

gatccacgtt ttatgacata ttgcatagca aacaggccga acgctgttgt aaatcatcct 56700

ctacgaaagg cccaggtttt gaaactgaag gcctgaaaag gctcctgctt accagctgtg 56760

tgctgtacct gacacactga agcctgagag tgccagtcac ctgtcagagg gaacacagct 56820

gccctcaggc agaacctgag tctagaactc aaggtttttg actcttaggc taaaaataaa 56880

aaatcagaag gaggaactat ggattgctta atcagtcaca ttttcacttt ctaaggtttc 56940

ttgtagcaaa agttatagtc tttggggatt gggatgtaga cacttttttt tccttcccta 57000

aaacaatttt tggcctgcca gtttttcgag cttcctgctc tggaccctga agttgccatg 57060

cagttgcaga catgctcctc cttcaaggct ctgttaagct gtggctgccc ttccttacca 57120

ctgctgtgcc ccaggccaaa ccccctgccc ctccttcccc taaggcactt tgcacctgtt 57180

gctccgagcc ttctggtcta tcccagttgg tagagtccct gtgcttacct ctgtggctca 57240

gtcctcgtgg gtggtcagtg ctctagggaa ggtgagctga ccacttcact ttcccttccc 57300

agccatagct cttcacagcc tcaccaactt agaaaggaat gctgcttttc tctctgtccc 57360

ccgtcctgac tatgttcaag tcattgctca gcccagtgag tttgtccttt cttccagacc 57420

agtagttttc ccccagtccc tcaggcttca gcccttgaag gcatccttag ccccccacca 57480

ccatgatagt caggcgctgc gcctatccgc agggtgtggg tatgtgtgtg tcttttgttt 57540

ctggagccca ttcctttcct tccaccagcc tctaggcctt catccaatcc ttttgcaact 57600

cagtgattca tgacttttcc ctgcatccag tctagtctct ttgctggtcc attgtttcca 57660

tagttgccag tttaatcttc ttaaaatgct gcatttttga agtcagtctc ttttggtccc 57720

tctcagaaac atttaaatag ctatctgttg ccacaggggg aaagcttgaa cctcttagcc 57780

agtcattcag agcctgccct ctgctggggc ctgctttcct ctacagatgc ttctcccact 57840

ctgcctgcca cagcccttgt agctggctga ttgccctgta cctcgcaggc tctggaagtc 57900

ttcagctcct tcatggagcc tttgccagcc attcttttca agactttgct gttgttcact 57960

gcctgatttg ttcatttgac acttaattca ctgagcaaac attatgaaag atgtactgtt 58020

tgctactgtg aggaatggat ccccaagaga taagagggtc agtccctact gccaggaaac 58080

ttgcctgtgt cacctgggtt cagtatcttg tgtctattag atcagaagtg gaaaggcaga 58140

ggccagcccg tatgcttgtt ttattttatt taaatcacca gcaccccagc aagtgttttg 58200

cacaggaaat ttctcattat ttaattattt tgggtttttt gattaaattc tgtacattcc 58260

cattttagct tatcttgagt tataacatta aaattaaggt agtcatcagc tgaattataa 58320

gacttaatta gataagatta tttaagatag tgatttctca ttagattggc cctgttcata 58380

ttaacttttc tgtttttttc ttcagtctgc atgaagaaat cagtgatttt tatgaataca 58440

tgtctccaag acctgaggag gagaagatgc ggatggaggt ggtgaacagg atcgagagtg 58500

taattaagga gctctggccc agcgctgacg tgagtccctt cctgggtagc ttatgcttcg 58560

gacagtcctt gtccacgggc tagaagccta tctgctggta tctcatgcta gtcctcacat 58620

gcaagtagaa gtgctctgta gagttgtggt ctaattaaat tttaaaggca aacaattttc 58680

tgcagtcttt agaattgagg cttcctaact attttcattg gattggatga ctaacaacta 58740

tttttttttt gtagtgctaa tagcaactac taaaggcaag ctatccttag aaattattag 58800

tgtaaagaga agaaagacaa atcaaacctc attgttgtag tggtctgtta ttggatatga 58860

tatatcaaaa cctcattact acttagttcc agcctgccag ggtaaacatt atataattgt 58920

ttacagctaa atgaaaatgt caagtaagaa cttttgtcac ttgaagttca tttcctttgg 58980

ctaatgcacg cataagtctt ttcttatttc tttcctgaaa ttgccatttt tcatctctct 59040

cagaccagct aattgccttt tagacagctc ccagtcagtg aacaaaatga ttactcagga 59100

tttcttcttg gcttatttgt cgtttttgtt actggtacta agtcttttgt tttttgtttt 59160

tgagatgggg tctcactctg ttgctgaggc tggagtgcaa tagtgcgatc acgacttact 59220

gcagcctcga tttcctgggc tcaggtgatc cacctcagca tcccgagtag ctgggactgc 59280

aggtgcacgc caccacactt agctaatttt tgtatttttt tgtagagact gagtctcact 59340

atgttgccca ggttggtctt gaactcctgg gttcaagcaa tgtgcccgcc ttggcctccc 59400

aaagtgctag gattacaggt gtgagccacc acacttggcc tgttactggt actaagttaa 59460

tacgtcactt tttagggcac tttgagggcc tgttctacaa ttttgtgtat gcaaagaagt 59520

acacaaaata atactaataa aatccattac tttgtgtttg tagcttttct tcaggcactg 59580

tcctgggtgg tggtgggaag ctagggaagg tttttttcca attggcaaaa caaagaagtt 59640

tcattgtatg taaaacttgc aagtatatga cagtatgtat atgacactgt aggtaaaggg 59700

aaaaggcaag ggtactaatg ttttatgagc aatgaccata catcgcattc tttctcctat 59760

gtgatccaaa tcagtggttc tcagctagtg gctattttgt tctccagggg gcatttggca 59820

atgtccgaga catatttgat tgtcctgact gggtacgcac tgctagtacc tagtgggtag 59880

aggccatgga tgccatcagc cattctatga tgaacagtat aggcccttac aacaaagaat 59940

tatccacccc caaatgccaa tgttgagaag ccgtgatcta acttaaccct tatctttctt 60000

aggtggaggt tgattatcta tctatctctt tctctccagc cagccaggca gccatcatct 60060

gtctacctac agatgaggaa catgagcttg tggttaggtt cccaggtcca tctcgcctca 60120

gaggttgaac tggtttcact gtttatcatt tttttccccc gagatggagt ctcgctctgt 60180

cgcccaggct ggagtgcagt gacatgatct cagctcactg cagcctttgc ctcccaggtt 60240

caagaaattt tcctgtctca gcctcccaag tagctggggt tcaggcgccc gtcaccacac 60300

ctggctgatt tttgtaattt tagtagaggt gggatttcat catgttggcc aggctggtct 60360

tgaactcctg acatcaggtg acccacctgc cttggcctcc caaagtgctg ggattacagg 60420

cgtgagccac tgtgcccggc ctatcctttt tttattacaa ttacctgcat acatatttct 60480

gcctgagttc caccgttctc catgggttga gatggaatgc atcccagttt tatgccacag 60540

catgatgtta cctgatgttc tttgtggaat tgacctaaag gccctcactt gccctacagt 60600

taaagtagtc tgatcccaat ttagtaatct attcgaagac tcctgcttag agaacaaaaa 60660

tgaaggattt gtgattgtgt ctctggataa tgagggaaca ttagtgatct gaactgcttc 60720

tgaaagtttc ctgtggttgg ctttctgtat ccacaggtac cacacctcca tattaaacca 60780

acaatggatt gaaaatattc agaaaaaact ataaaaataa caatgtacca ataaaaacaa 60840

tacaaattat tttaaaaata cagtataaca actatttagg tagcatttac atcatacttg 60900

gtattatagg tattataagt aatctaaaga tgatgtaaag tacatgggag gactagcata 60960

ggttgcatgc aaatactcta ccattttata gcagggactc aagcatcttc agattttggc 61020

atggtgggac tggaaccaat ctcctgccga taccaaggga caactgtatt ttggtctatg 61080

tgtttcatat tgaaccagat aagtttaaat tatattcaga atgtctgctt gtgaaacaga 61140

atccccgctt catgaagctt ggggttagaa aaaaatgctc ttgtcatacc aaaaagtacc 61200

agtagagggt agcaaaaact gacatttctc catatcttgg tgactcaata tgataacaac 61260

ttctgataac tcaatataat aacaacttct ttttctgttt caggtccaga tatttggaag 61320

ttttaaaact ggactttatt tacctactag gttagtacac tcatgaatct ttcaaaggac 61380

ttttcttaga gtgtattcat tttggctgtc aaatttgtaa ggagtagaaa caaaacaaat 61440

ttataaaaca aaatggggct gggcatggtg gctcatgcct gtaatcctag cacttcggga 61500

ggccaaggag ggtggatcat ttgaggtcag gagttcaaga ccagcctggc caacatggta 61560

aaaccccatc tctactagaa atacaagaat tagccaggcg tagcagtgcg cacctgtaat 61620

cccagctact caggaggctg aggcaggaga attgcttgaa cccgggaggt gaaggttgca 61680

gtgagccgag atcgcgccac tgcactccag cctgggcgac agagcaagac tctgtctcaa 61740

aaaataagta agtaaataaa taaaggattt accagcattt aatttgattt accttgaagt 61800

agaatatcac ttcacatcat cttaccaaga catagatggt acagagagat ggaaaaggga 61860

tcatgttgca atggaatcaa ttagttacta attttagaaa ttgactgcct ggcagagtat 61920

tgctcagtcc cataacttaa cccactgaca cagatgttaa tgtagtatca tgataaaatg 61980

tctgattata tatcctcttg aatgtgagtt cccgctgtct tgctcactca ctcttacact 62040

caccctcgct ttcaaattaa gaactcattc tactagttat ggctccagca tcctgatcca 62100

gaaattcagg gtacagatct cttctctgag aaagatcttg gcctttcagg actgttgttc 62160

agtttcagtc ttctcaaatg agacctcttg tgacgcacag ccttggaggc tctcttttgg 62220

gaaatgataa tgtttctcca aagggtgaat acttgctctc taagaattga aattgtttga 62280

acattccatc atggttatta ttattattac cttaaatttt aatctctcca gaataaagtc 62340

agcatcatgt ttttccattt gagcttgatt tggtatactt taccccaact taaagtgtgc 62400

tgaagtggat ggaccctggc aatttccgtt cttctcatag atgcccttgg cctgcaaaag 62460

tcataaaata ctcaacttcg agttaatatt tcttatttag gttgtcagca tcagtaaaac 62520

atgaaaaatc acctttctta aaaaatttaa ttaaatttta tgaataggta gtacattcac 62580

atagttcaca tttggaaaag gcacaaaaat caatacaggg aaaagtctca gtcccacctc 62640

tgccccctgg ttctccttgg aacagccgct tttaccagtt tctcacatat cctttcagag 62700

atatctgtgc atataaaagg acatgtgtgt atattaacac aaatggtagc atgctggata 62760

cctgttctgc atccagctta aagcacttca taatatttct gagttgcaat taatctcatc 62820

cggataggaa aatcattatg tctagtacca caagcgttta ttaaagaaaa tacatgaagt 62880

gctttttgtt tttttttctt tgaggtttta cttctttcaa aatcacccta tttcctgagg 62940

cctgaattct gtgaaatgac tgagaggagg agtttgttaa aatcaacaac tactatttcc 63000

cttctccaca aaaccattat caccaacaca tttagtcttc gttggccagg gtgggaaata 63060

ggttttaatt gtactaatga agtctataag catgagtgtc agttaaaaca agtttccaac 63120

ttcttccgac cctcttgtat atgtattctg tgttcagtga catcgaccta gtggtgtttg 63180

ggaagtggga gaacctaccc ctctggactc tggaagaagc tcttcggaaa cacaaagtcg 63240

cagatgagga ttcggtgaaa gttttagaca aagcaactgt aagttctgca gcatttcata 63300

ttaaaatcct tagttattta cctatgaaac ttgaattaaa attaaagttt ggtgagcaca 63360

gttgcattgc aagtgagtga ttctttcatt ttgttaatgt caccgtgctt gcacataaaa 63420

agttttctgg ttgtccacac tggagtgtga ccatacaatc tcggctcact acaacctgtg 63480

cctcctcggc tcaagtgatc cttctacctc agcctcttgg ggagctgtac tacaaacaca 63540

acctgccatg cctggctaat tttgttgtat tttttgtaga gacggggttt caccgtgtta 63600

cccagactga tctccaactc ctgggctcaa gtgatccacc cacctctgcc tcccaaaatg 63660

ctgggattac aggcgtgagc cactgcacct ggtctgcatt tcttttcaca gcagcaaaat 63720

atgcaatttt attatacaca gtactcactg tagagatttt tgtttgtttt attcattttt 63780

tttagagaga tacagtctca ctatgttgcc caggctggtc tctaactcct ggactcaagt 63840

gatcctccca cctcagcctt atgtgtatct gggactaagg cgcaccctac cacgccctgc 63900

ttatttaaaa aatttttttt tgtagagata gggtctccct gtgttgccca agttaggcca 63960

ttttttgaaa agaactgctg atagctcatg taaataatcc tgtcagcttt ttagaataat 64020

ttttatattt tatcttgtca ggttgttttt tgggctattt gcaaaactga ccagtaatgc 64080

aagtgggttg tagtgtacac cttaagaatc cagcaatttt cttattagaa acagtttgat 64140

gatacaaaac atttaatacc tggcattcct agttcttcat cttatactca gaaagtgttc 64200

tccaaattat tgaggaaggt ttttgttcat tttaaaatta tcattataac tatatgtcaa 64260

ctaataaatg agatgatggg catattaatt tatttaactg tagtaatcac ttcagtatgt 64320

atatcaagat aagtatatca aaacatgtac accttaaata taaacaataa aaataaataa 64380

taaaaaattg gacaccaaac aaaattctcg gttgatagaa attatactgt aatatactgt 64440

atgggaccca gtgctaaata tgcagcatat agtatttgta gcagaccagg tttactgggg 64500

tgtgccatat ttagaatact cagtgttctt atgctctcat gagatgatgg agacctcatg 64560

tctagtaggc ttccatcccc tgattttatc atttaatctg gttaaagcat ttacatttta 64620

cctttcttct ctttataggt acctattatt aaattaacag attcttttac tgaagtgaaa 64680

gttgatatca gctttaatgt acagaatggc gtgagagcag ctgacctcat caaagatttt 64740

accaaggtca gagaatttag cgtttataca acaaaactat tagaaacgta attttaagat 64800

tctgttgtgg tggtgttcta atatttttat atgcatgttg ctgtctctct ctctctcttt 64860

taaatagagc tagggtctca ctctgtcacc taggctggag tgcagtggct ggatcatggc 64920

ccgctgcagc ctcaaactcc tgggttcaag tggtcatctc acctcagcct cccaagtagc 64980

tgggactaca gacgtgagcc actacacctg gctatttttt gtattttttt ttttttttta 65040

gtgttggggt ctcgctgtgt tggccaggct ggtctcttaa ctcctggcct tagcctccca 65100

aagcactggg attacaggca tgagccacca tgctcagcct gcaccttact tttgtatgca 65160

acggttttgc tttctttgaa tctgcttgta atgatcagtg attaacttat aatgtgacct 65220

caagtaagaa ttaaaagttg agaaagcttt tgaagaaatt gtctgctcta gatccttcct 65280

tgtagagaca gaagagatgg aattctacta cacagttgat tccatctgtt tttaaccttc 65340

aggagttcag attaagaacc tttcctttaa cccatttccc atatgcccca agaatactgt 65400

gcgggcagtg agctgcactt tttttttttc ttttttcgag gcagagtctc tctctgtcac 65460

ccgggctgga gtgcagtggc acgatcttgg ttcactgcca cctccgcctc ccgggttcaa 65520

gcaattcttc tgcctcagtc tcatgagtac ctgggactcg tgcctgggac gagtaccagg 65580

cacctgccac catgcctggc taatttttgt atttttatta gagatggggt ttcaccatat 65640

tggccaggct ggtctcgaac tcctgacctt gtgatccgcc tacctcggcc tcccaaagtg 65700

cccggattac aggcgtgagc caccgtgccc agctgtactt ttttttttcc taaacaggaa 65760

ataggttaag agttttaaga gccttttcta gatttcaatc cctaaattac ctttaaggtg 65820

tttcctacag gcttccttac ttctgttttg aaattattta agtttatttc tattctgttt 65880

tcttccaaga tagagaataa tttgtcacca tcatctgtgg aacattttac atacttaggt 65940

agttgtcagc tttctcacct ctaacctaag ccattaactc ctttggcttc tgttagaata 66000

ttcacaattt tttttttctg tagcagctct aaagtttcta tttcttcttt tttgtttttt 66060

aagaaaaaaa tgttaactac ttgatgttac aagcattatc atcttgcata aatgtatgga 66120

agacagaaaa gcagaaaaat aaaagaaaga ttatccataa tcgcactata ttgggggtgt 66180

gtgtgtgtgt gtctgtctaa tattttcttt ttctggaaaa aacttttaaa aattgaaatt 66240

catatgcatg ataacattca tcagtataaa gagacagtgt aaagtgagtc acccttacac 66300

catagatact tagatcattt ttacagaatt tctcattgcc aattattgtt ttttgcgttg 66360

cttttttatg ttctttaaaa ttataagcaa aaggagtagc acattataca cacattgtct 66420

tataacttca taaaaactta atgttttgga ggtttcttcc atattagcac atacaggctt 66480

gctttattct ttttgttggt tacacaggca gtagtctttt ataaggctgt gactgcttga 66540

tttagcagtt cttcagtatt gttccagttt tcttttgcta ttagaaaaag ggattgatga 66600

atatacttcc atacatgcat cttgctttac acatgcaaaa tgtttgtaga aagattccca 66660

aaagcaaaat tttgaggtcg aagggtatat ccagataaaa ttctgttgga tatttcccta 66720

attatttatt ctttcatatt ctcattttct ctctctccct cccccttttc ttctccctcc 66780

ccctcttcct ctatccctcc ctttcccttt tctctctttt tctttccctc ccttttcttt 66840

tctcttttct cttcttcctt tttcttcctt cccctttccc ttttccttcc ttctgcttcc 66900

tttttttcct ttctttcatt ttttgacacc gagtctcact ctgttaccca ggctagagcg 66960

cagtgatcat ggctcactgc agcctcggct tcttgggctc aagtgatcct cccaccttgg 67020

cctgagtatc tgggatcaca ggcttgccca ccacacctgg ctaacttttt ttttaatttt 67080

tttttttttg agatggagtc tcactctgtt gcccaggctg gagtgcagtg gcgcgatctt 67140

ggctcactgc aacctccgtc tcccaggttc aagcgattct cctgccttag cctcctgagt 67200

agctgggatt agaggcgcac accaccacgc tcagctaatt tttgtatttg tagtagagat 67260

gtggttgcac catgttggcc agggtggtct caaaccctga cctcaggtga tccgccctcc 67320

tcagcctccc gcagtgctgg gattacaggc gtgagccact gagcccggcc acttttttat 67380

tttatttttt aagtagagat gaggtcttgc tatgtggcca cttttttttt tctttttttt 67440

taagtagaga taaggtcttg ctatgttgcc caagctgttc ttaaactcct gggctcaagc 67500

agtcctcctt ccttgacctc ccaaagtgtt gggattacag gcatgaacca ccacacctga 67560

cccctaattg ttctttgaaa gggaactgta tctagactga cttaaccacc atgttttgtt 67620

ttgttttttg agacagagtc ttgctctgtc actcaggctg gagtgcaatg gtgcgatcat 67680

ggctcattgt accctccgcc tcctgagttc aaacgattct tgtgcctcag cctccagaat 67740

agctgggact acatatgtgt gccaccacgc tgggctaatt tttgtatttt tagtagagat 67800

ggggtttctc catgttggcc aggctggtct tgaactcctg acctcaagag atccacccgc 67860

ctcagcctcc cagagtgctg ggattacaga tatgagccac cgtgcccagc ccacaatgtt 67920

taaaaatact tatttctcca tatttttgtt ctttcctatg cttgcttagt ttgatacaat 67980

ttgcaaaagt ataagctttt ttttcttttt tatagaagcc atgcgtgttc attgtaggac 68040

atctagaaaa cagagataag agtaaagaaa aaaaaatgga aatcaccggc caggtgctat 68100

gtttcacacc tgtaatccca acactttggg aggcccagac aggcagatca tttgagctta 68160

ggagttcaag accagcccgg gcaatgtggt gaaaccctgt ctctacaaaa atacaaaaat 68220

tagctgggca tggtgggctg aggtcggagg atcacttgag cccaggagct ggagattgca 68280

atgagccaag attgtgctac tgtactccag cctgggtgac agaatgaggg ggaaaaaaat 68340

ggaaatcact agtaatttta ccaccctaag taataatagc tgttaagact tctttgaaga 68400

tgttgtgcct gctttgtttc cctccgtggc cccagcctat ggcatggttt acagaggagt 68460

gaatgaatat gtgcacagca aaaggtggac tcattctgta catacttgcc cactcaggtg 68520

ttctctcggg tagccctgcc tcattccctg tgaagcgtgg aagggagggg tggtctgtgt 68580

gtagtcatca gcccatgtgc aagtcagcag gcaggactct tgtttgcccc agggctgtgg 68640

cagaataatc taaaggtcgc tagtctacag tggtacatca ccaagaaaag tgattcttaa 68700

aaatctcact gatttagtgc tttaagatgt tggttacttt gtccttgtac tctttctatt 68760

ctctgtttac aaatgaatat tagagggtca tggtcacaaa tgagcatcat cagttacatg 68820

ctgttagtgt ttctatccta tagcaagtac tttttttttt ttttgagatg gagtcttgct 68880

ctgtcaccca ggctggggtg caatggcacg atctcgcctc actacatcct ctgcctcccg 68940

ggttcaagtg attctcctgc ctcagcctcc caagtagctg ggattacagg ctcccaccac 69000

cactcctggc tattttttgt atttttagta gagataggcg tttcaccatg ttggccaggc 69060

tggtctcgaa ctcctgacct caggtgatct gcccgccttg gtctcccaaa gtgctaggat 69120

tacaggcatg agccaccatg cccagccctg tagcaagtac ttagatacta ttattcattt 69180

gtacatgtct tacaatttaa gtataagggg agaaccattc attacctata gtttactttt 69240

ttttaatagc ttactcttaa aatagaaaat taagtatgtt gtatatctct accaaatttt 69300

ataatgtaag gaccaattta tgcccctctt aatgcttaga tctgttgctg atacaggaat 69360

tcattgaaaa tacaattttc tttttcagaa atatcctgta ttgccatact tggttttagt 69420

attgaaacaa ttcctattgc agagggacct taatgaagta tttacaggtg gaattggttc 69480

ttatagtctc tttttaatgg cagtcagttt ccttcaggta agtcatatgg gtatagcatg 69540

ctagtgcaca ctaaaagcaa aagtgatcaa tcagctggga aacattttgg aaaaaatcga 69600

aatcaacctg taattgcatt gctttccttg attacttaac ggcttttccc tttaaactgg 69660

gtacatttta tcatttagca aatatgtatt tttaaattcc tatgaaagaa tatttttggt 69720

tttaaatccc atacattcta gtatttttga gacttttcac tgcaaatttt aacatgcaaa 69780

atgtacggcc tggtttccat aagcataaat agtataaatg ccaacaataa gaatgtcttc 69840

taagcagcta aatcttgtaa gtttagttgg aattgagacc agctatttgg gtaagcgaat 69900

tagagtctta gtattgtaag tgggtatgtt tatgtggcac agggttgcca actgcctgag 69960

tctattcgtg agtcagaacg actttgctga tgtgttgggc caagccagcc ctggttggca 70020

gcctggtgca gccgtaaaat tcagccttac aaacagtctc ccgccattcc cgcaccatgg 70080

gactttagtg ttgtgtgtaa caacagtata acctgctgtt agcccattat caactgactg 70140

ctatgctaaa ccaaaattat aataatattg cttgtagaag ttagaatata atttattccc 70200

cctctccttg ataatttagc aaaaatccaa tataatttct tcttttctgc ttttagttac 70260

atcccaggga agatgcttgc atccccaata caaactatgg tgttctctta atagaatttt 70320

ttgaattata tggacgacac ttcaattatt taaagactgg catccggata aaggatggtg 70380

gttcatatgt ggccaaagat gaagtacaga aaaatatgct agatggctac aggccatcaa 70440

tgctttatat cgaagatcct ttacaaccag gtattgaaat taggtaaatt tgtgggcatt 70500

caaagagagg gcactgtcag tcaccttatt atactttaaa ttctctttag atgaaaaatg 70560

aaggaacaac ttctaattgt tattcttttt tcatcgaaat atttcatgag caaacatact 70620

aaaataaaca gacacagaca atagaaaaac accttggaga cttccagata agtagggagt 70680

agaatctgtt taaccctaaa agcatagtag aaaaggcatt cacttatttg gatgggttca 70740

tgtttggtgg ctgtttctcc ttcttgggtc cttattgcct tgattacaac caattgtcag 70800

caattaatga ggctttaatg agatgattct gaagtcctga gaggcagcaa gcatagtaat 70860

atatctttga attcatgagc agaagggtgc aaggagacaa tgtattttct ttttgaattt 70920

ctcctttcct gtttgatttt gcatgtctct ttgtgctttt tccagcttca tgtgggcttg 70980

aaagtaagca gaaagtaaat tccttccatg cttttctgaa gttctgtttg cttgcttgtg 71040

tcctgatttt tgtgagcaat attttttctt gatataattg taaaatagat tctgcgttat 71100

tggacttcag tggaagtgct tttagtcatt tgctttaatg tgtaaacttt gaaaatgagt 71160

aaggaaaggg ggtgaagaga tagagtagtt gcctaggaac cattttctgg cttattgagc 71220

tgccttataa acattaatag ttctatgtgt ttattcattg aggaaacatt acattgattg 71280

ggagcctgct ctgttcaaaa gtattgggcc aaaggacacg aagacttttc agcaagacga 71340

tccttgcttt ttaggggctc ataatttaga gtgagaaata gatatatagc taatataaac 71400

ccaaaaaata tagaagtatt tctgatgtaa cttggggttt cactcttagg agtgaacagg 71460

gcactatttc ttttgtttgc ataactgttt atgtatggaa tgggataatt cttgatgggc 71520

cagaatacat tccggcaact gatacaccat aatgaagtac caactgcatg attcacatat 71580

tcagagactg gggagctttg gggacagctc acagctcagc ttccaggcac aactctggtg 71640

ggataactat ggcccttgct ctcctggaag agagtcatca acatttagtg catattaagc 71700

acagtcaggc ttactatgtt acgtatattt cttttaaagg taacgatgtt ggaaggagtt 71760

catatggggc catgcaagtg aagcaggcct ttgattatgc ctacgttgtt ttgagtcatg 71820

ctgtatcacc aatagcaaag tactatccca acaatgaaac agaaaggtaa aagttcatct 71880

ataaccagcc cattgtgtca aaattagttg tggcttctta tcttcaaatt aatgttattc 71940

cctccctctc cctttctttt taaacacatg cagcatacta ggtagaataa ttagagtaac 72000

agatgaagtt gccacatata gagattggat atcaaagcag tggggcttga agaatagacc 72060

tgagccttca tgcaatggta agatattttc cttggtcgat tgactgagta ttagaggctt 72120

ttctgtgttg tgtgcgttta atgggaagaa acgttttcca atcttttgcc actctttcag 72180

gaaatggtgt taccttgata gtagatactc agcagttaga taaatgtaat aataatctat 72240

ctgaagaaaa tgaagccctt ggaaaatgta gaagtaaaac ctcggaatct cttagtaaac 72300

actcttcaaa ctcttcatca ggtccagtgt cgtcctcttc tgccacacag tccagctcta 72360

gtgatgtagt aagtatgaaa gcctcggctc ttctgaactc agatgcatgc acgttctctt 72420

gctggggtta acactgtctc gaaggctaag gctacttcct ttgcttacat gttactggga 72480

tattttaata actttcatgc ttgtacattt tctcaacatt ttgttatgaa aaagttcaag 72540

catatagtaa aagtgaacaa attttagtga gcattcatgt actcaccagt agattctgct 72600

attaaccttt tacttgctta tgtcatacct gtctatccat cactctatcc attaattcat 72660

cttattcttt gatccatttc aaagtagatt acagacatca gttcccctag agtactgtag 72720

cttgtgcatc cttgtagcca gactccagta tttgtttatt gttttttcct tttttttttt 72780

tttgagacgg gatctccctc tgtcacccag gctggagtgc agtggtatga tctcggctca 72840

ctgcaacctc cgcctcccat gttcaaacga ttctcctgcc tcaacctcct gagtagctgg 72900

gattacaggt gcgtaccacc atacccagct aattttttgt atttttagta gagacggggt 72960

ttcaccatgt tggtcaggct ggtcctgaac tcctgatctt gtgatccacc cgcctcaacc 73020

tcctaaattg ctgggattac aggcatgagc caccacacct ggcctttaac gtttttcttt 73080

tcttttcttt tctttttttt gagacggagt cttgctctgt cacccaggct ggaatgtaat 73140

ggcatgatct tcactcacct caaccttcgc ctcctgggtt caagcgattc tcctgcctca 73200

gcctcctgag tatctaggat tacaggcatg tgccaccaca cccagctaat tttttgtatt 73260

tttagtagag atggggtttc accatgttgg ccaggctggt ctcgaattcc tgacctcaag 73320

agatccaccc gcctcagcct cccaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc cagctgttat 73380

gactttttaa caccatagtt agttttgcct gtttcagaat ttcatacaaa tggaaccaca 73440

tagaatatag tcttgtgtaa ggcttctttc actcaatttt ttttcagctt tctggttgaa 73500

ttttttgttg ttgttgtttt gttttgtttt ttgagacgga gtctcgctct gtcgcccagg 73560

ctggagtgca gtggcgcgat cttggctcac tgcaagctcc gcctcccggg ttcatgccat 73620

tctgcctcag cctcccaagt agctgggact acaggtgccc gccaccacac ccggctaatt 73680

ttttgtattt ttagtagagc cagggtttca ccgtggtctt gatcgcctga cctcatgatc 73740

cgactgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt gagccaccac gcctggccaa 73800

attttttttt agttgagata tagttaacat aaaattcagc attaaaaatg tacaattcag 73860

tggtttttag aacatattca caatgttgtg cagccatctc cagtaattct agaacatttc 73920

catcacccca agaagaaacc ctgcatttag cagtagtttc ttctaattct tccttccctc 73980

ccttaacctc tggtaacctc taatctactt tctctttcta tcctgataga attttttttg 74040

ttcccccatc ctgatagaat ttatgtgtca attataatgt aagttacctt ttaaaatcaa 74100

agtgaatttg tagtgtactg atttgagatc taaagcaggc ttacctgttt gagtttaact 74160

ttattaagtg taggacatga aaagtaatct aaatattgta tgttgttgat gatgaccatg 74220

tgtcaatatg gaatcataaa tcctcctgtg cagaatctcc ctgtgtgctt ttttggttcc 74280

tagagcagta tgctttggag gacagaagcc aagctagatg tcacagacac agggagatgg 74340

agtgttgggg actgagagaa tgtgactctg acatgctggg tagagtgcca gggccagggt 74400

ggagacctgc agagagacgt agcattgtca tggcccatgc agcccagaaa taggtggagc 74460

tcagcccact gtcgcgggaa gtccaccccc acccacacca gtatgtttgg ttagaatgat 74520

cactgatttg tcatcacaga ctctcagaga ttgaacccct taaacccatc atcttgtgtc 74580

tggctgaagc cagggactag gacctaggtt cctcactctt taccatactc tttcattttc 74640

tataaataaa aaaacaaata aacttagacc tctgtgagct ccttcaaggt cagatgtggg 74700

cagtggattt aacaatgaac agaagctctc tgataaaatc agtcatttta aatgtttgga 74760

ggaaaattta aacaaacagt taattttttg tgtgcttctt ttaactccca aatgtttaaa 74820

tttagtccag agagtacttt aaccaaaatt gtttttcttt ctgaatattg agtatctaaa 74880

ttactaatat gtcacattat aactcacgtg acttgtgtta ggattccgat gcaacaccat 74940

gcaaaacccc gaaacagctg ctttgccgtc cgtccactgg gaaccgagta gggtcgcaag 75000

atgtatcctt ggagtcctct caggcagttg ggaaaatgca aagcacccaa accactaaca 75060

catccaacag caccaacaaa tctcaggtgt gtggaacgtg ggtttttaat tgttagtatt 75120

tgatacaaaa tatttagaat ttcccacatg taaataatat gcagcatggg tttgaagaaa 75180

acgctagatt gaagaacaaa cttattttat tctaagaggt tccaacacat gacagtgctt 75240

ctaggaacag gatgtcctaa ggatccttgt gagacaccat tgtaacataa atctcttcag 75300

gaatctattg actggtcctt ataagatgtt ccagccaaac taccatataa aaagtgtctc 75360

agttgtacat gaaataagct ggcatgaagg ttttgtgagg cctcatggca gtgtgcatat 75420

ctgggaataa tgtatccttt tctaatattt taatgttcaa taccttgttg ctggtgttga 75480

aatgatcagc tggctgtcag gcgtggtcag ttgattaaca ttagcttgga cttaaaaggc 75540

cacagagata ctctagttta agtttttttg ttgcctagaa ttgtcattaa ctgagtaatg 75600

actcagagtg aggggaggaa gccattgata tggggctctg gcctaaggct gggtcactcc 75660

tcactatagc tgggaacctg ggaataggcc tcttggctgt aaccttgtgt ctgatttgac 75720

tcactgagtt cactttacct acgcggcctt agccatgtat gccagacaca gacttatcac 75780

aaaataccag ttcaagtgac agggttgaca gaagggactg aggtcacgag aaagccacag 75840

gccatgagta gcaggaaggg agtagccacc tgtgctgacc caaacctacc agtgtgcctg 75900

tcatgcccaa gagcctcttc ccgctctgtc acttatgatg tggtgtttgg gttggtaagt 75960

ttcttaagaa aacctttgca tcccacacac tgttaagaag gcgggcgagt ggtctatgct 76020

tttcattatt tccattaaaa taaagtaagg gttttagagc taaaaagaac ccctgtaaca 76080

gctttttctg cccactagat aagtcagtga tcagtaaggt aacaatctag ccagcatatt 76140

cctagttttg aaagcttccc caaatccagg tgtttgagaa cactctgctt ttctgcaata 76200

ctgatgtctt tgtggtcgtt ttctgtttct gcagcatgga tcagcaaggc tctttcgttc 76260

ttccagcaaa ggcttccaag gtacaactca aacaagccat ggttccttga tgacaaacaa 76320

acaacatcaa ggcaaatcca ataatcagta ttaccatggc aaaaagagga aacacaagag 76380

ggacgcgccc ctctcagacc tctgtagata gtcagcgctg cgcggtggac tgtcttctct 76440

gtgcaatgat ctcatgctca ggacagttgc gcagggactc ctgggagata ttcaggagcc 76500

tcacactgtt cagacgttga cttagcaact gcgttttttc ccagctcgcc acagaatgga 76560

tcatgaagac tgacaactgc aaaaaaaaca aaacaaaaca aaaaaaaaag caagcaaaaa 76620

agagggaaaa aaaaggctgc ttatttgata agtcatatgc tacaacaggg tcattttaag 76680

atttaaagct tgaatgtaaa ataaatatat ttctcattgg ctttatgcag agttataggg 76740

aatagtattc agtgttggta gggtgataga aacaaaaaac agtatcagag gatgaggtgg 76800

ggaaggaaaa caaaggtatc tgataggaag tccagattcc aaaggggaaa gtgatctgtg 76860

catgtttttt ttttaaatat ttttgcatat atttaccatt ttattgtgtg tatatataga 76920

agaccatata ggagattgat atttgtaata gtggatttgt taataatact ttttacataa 76980

cattactgtt taaattgtaa acagattttt tctcaggatt agtttgaaaa ataatctaaa 77040

ttgtcatctt aacatccata tatagggaag tgattagttc tattactcaa tttgtttttc 77100

tcagcattga aatgacttaa tagaaccctt gtgtcctgct gcaaaaattt ttcctctcta 77160

aagaaaaggt ttatggtggc aaatgatgtt tattttattt tgtaaaaaaa aaaaaatgta 77220

ctatgtactt ttgtgtaaac actgaaaaat ctctggtcat ctccgagaat taacttgcaa 77280

ctgttttcta tagtgctgtc gtcttgggca atgggcaatt acatgacttt gtgtttgctt 77340

cctttgcagt cttttttttt tccccccatt tcttcctaat aggaaaaaaa aaaaaaaaaa 77400

ggtcacccat gtctggtctc attcctgttg cagtgaaact tcgagttcca cagactttgc 77460

atgctggctt ctctaaccct gtgtgctgcg tgtgcctgtt tctcatctct tattcttttt 77520

aaaattcatg cttaactact gtgggagaat aactgtaaac agctttaatt aaatcatact 77580

tataaaaaac tattttctta tattccactc tatgcttttg gtattgttga tctttacaaa 77640

ttaaatggtc tttgataatg gatctatttt gtattgcctt attaagacca aatacttctt 77700

gtcatcccat tctttatcct cttctttcat ggaattgtta tcgttaatta aaactttttt 77760

aaacattggc ttgtttcaat catactgtaa attttggttg tagtcagctt tgagtgcaat 77820

gagatgtata attctgttat cattacctgt tgagtttgaa actcagttgg gaatatttaa 77880

tataatagaa tgtaagtgac atttctgaaa atgctttctt tcagggtgaa agctcttatg 77940

tttagcatca atgtgtatgg ctctgttaaa tgcagccatt tctgagacga gattctttta 78000

tatatatata catataaagt actattggct tttaggagtt tcttttatat acatttatga 78060

aatactgaag accaatcaga ccattaatgg acacttagtg taacttttta taaagaaaat 78120

aatgctaaag taagaccaaa actgatgtca tcactgaaat taacaatttt caatatgttc 78180

atattttaat tcacaatgga aaaatgtgtt ccaaaactgg aaactcatag tactcgtgta 78240

aactgtggaa gatttcaaat gtgatgttat tttgacaatg ttttaaattt tagagtcaca 78300

ttttattctg atcagaattt ttattgagat gttgagcttt tgtttttgaa actagtttgt 78360

cataacattg tgcataatca cagtatttat tttctaggac aattgtgaat gtgtagactt 78420

atgtttactg ctaagggaac aattatttat aaaataatat taaatccagt attagctgcc 78480

tatttcagac acttaatact tgcagagatc tatgttacat ttaccacact gaagtttttt 78540

ttgttgtttt ttgtttgttt ttaaagaatc accctcattg ttgaaagtaa atgtactctt 78600

agggtgcgaa tattagtgtt ccaataagca tgtgattata ttaaggtggt ggtagcggga 78660

agataattct gattccattg ggaatcttag gttttcgtaa atttattggg aaaatagttt 78720

ttcctgtact gctgaagttt ctttttggta aacagtatct ttctaaaaga aaaaagcatg 78780

aaggagaaat tgaggtgtgt atacatttcc tcaaatgacc agcattgtat tcgtgaatac 78840

tgtgtatctt gcagtgaaca gtgtggaagc tgttcatttt tcaatctgaa gtaaaatact 78900

ttcaagaact tttagtttgc ctgctcattt gttttataca tttcatctat ttgactccta 78960

tcttatttct tttttgagtt ttaatacttc ctatattttg tgaatatatc agaaatgtgt 79020

catttatata ttagagtcca ttcatatcca tgaatcataa ccttcctttg ctaatacttg 79080

ttgaatggga ttttacaaat tctccctcac tctggtgaca tttctcaggc agtcatgtat 79140

gtgtacctgg ccattagaaa tattaatatt taaagactgt tttttagagg agctgatggg 79200

ttggtgaggt gtcagcacaa aatcttactg gttatgtttt gatgataaaa gtatatccat 79260

tttttccctc cagctttaag gtgactgtga aggtgcctgg ttttgaatgt ctttgtttgg 79320

tttggagatg tcgcactcag ttttcaaatc tagcttggat ctgtaggacc tatgtttttt 79380

acaagtaatt gccctccagt cttcaacagt tgattctgtt ttatttttat cctgttttga 79440

gtgtacttta cctttacttg cattttgagc ctcattaata tttaggttat ttgatttggc 79500

tccagatatt cctagatctg cacagggcaa aacatgggct atagggtgag catttttaat 79560

tgtctttttc tgctggaacc ttatatctct ccatgtgttt tctgctcctt ccctccccca 79620

tgaaatggta agtgtgactt gtgtttgcct gaacctgtgg actagtgttt ggggtttctg 79680

gaaacactag agggtcagaa aagagtaatg accaccgtga cgtgcaggat tctcttgctg 79740

tgacatgttc attgcaaagc cctctccagt gactaggagg tgtagttatt aaggttgatc 79800

tgttagaaat caccattatt aggtattagt ggtagatgtt gctgatactt ttattggtca 79860

tgactacatc tcagttttac tttaatattg atctatagtt tgatcagttc cttgaattct 79920

aatatgttga tttctcagtg tttctgtcac taaccaagaa tgtttctagg cagttggttg 79980

cttcacagtc aaaactaaat ggtaaactat caaaaataca ttcccaattt tgctgtgata 80040

aatattgaaa tgttaaaatt aatgaacaga agaatttatt cttacccatc tattcttgtt 80100

ctcctagttc attaaacttt cagttattgg aaaggcacat tctcaaagta ttttatgagc 80160

aaaatattct ataaatgcgt ctaacaaacc taattgaata taaaagttat atttagtagt 80220

tactgttgat agtaattttc atcagggtca tagttcatct agtaaaatat ttagagaatg 80280

atgttaacat tccagcatta aagtgggaac aaagatttat atatgaaatt ccttaaaaga 80340

gttcatcttg ccttggtttc tgaccctcaa gactctagct acctgccatc ttgtcaaaac 80400

atttgtgggt agaataagtg ttaaagatca aattttaata tgcttctcga tatttaacat 80460

agctaagaag ccagatttta ctgtagaagt tatttacatg atttgaaaac ttgacctaac 80520

tggaagcctt tttctcagtc atcttgttct aagccatctt gacttcacac ccttagcgac 80580

ttttcttttt tttttggtca aagataatga gctaaatata tatagacgtt gaatgttgac 80640

aaaattatta accagaaaaa ttgcttataa aggctgctga tctatttgat acctagaatt 80700

aaatatttga ggacagtttt tagttaataa actgctaatg tttattttac tgtctctcag 80760

gtttttggtt tttttaaaaa aaatgtgttt ggcctttaca ttttctactt aagtgtgtac 80820

tttattgagt ttaaccttgt ctgtagccta gtagcctgaa agaaaaggag acagaaccag 80880

agagatggat gtagtgcatt ccctttggtt attacacatt tgtggtagct cctggattta 80940

ctgagagata ttttagctat gtcaataaga acagctaatg atgtggaaat caggtgttct 81000

cttgtgtatt tcagtgaaca tttttattag tagttgcata tcatctctag ttccacattt 81060

taacttaacg tctttgtggc ttcaccactg agctaccttt cactacacca gcttctgtgt 81120

ggcctggtaa catggaaggt ctctcctaag gacagtctgg acgtattttg ggggaatgtt 81180

atttatctta aagatgccta gaaacaaaac gcatatagta ccagtgagaa actatgaagt 81240

aaacaagttg ctcaggccgg gcatggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg 81300

ccgaagcggg aggatggctt gaggctggga gtttgagacc ttcatctctt aaaaaaacaa 81360

acaaaaacct gaatggtgag gtgtggtgga attgggtagg ggagggaaag gaggacttgg 81420

aaaagcattc tccaaagcca gcaacttggt gaagttcagt acttgcctct tagaggttag 81480

gccatgcctt tcaaagagag tgaaatgatg ggttatcagc cacattcttg gagttaatat 81540

ttttcttcat ctttcagttt gggttctgtg ctattcatag ttcttcccta agaccatttc 81600

attattacct tttatattta gttgcaattt attataatat gttgttttgt ccctgaactt 81660

aatctcctaa ttttaagatc ctctctgatt tttgcatatt gaaacttaca gaagtcactt 81720

taaaaaagtc ttttgaaagt cctacaatcc taaaataaat cacaagcttg tttgttagac 81780

gtgtcaagag tctccagtct ttactactaa aaagcagcac tgccttaaca cacattgtta 81840

tgggtgaaaa gtgagggacg accagtgtag tttctggata taaagtgtga aggactgttg 81900

agttaaacat ttttagtgga atatacatag ataacgtgta tttagaaact ttggtgaagc 81960

cagtatttgt ttttagtaac ctttttatgt atttccttct ttgattagca ttgtcttcag 82020

tgttaagaaa tgtggactcc tgtgaggtgc tggaggtttg aatcatcttg aaaactttcc 82080

aatcttgtct agttaccact gcagagacac taaggaattt accagaaaaa gatatttgat 82140

acaagtgatt taagaaatct caacatttcc tgaggccgta tcactgggca accagtgatg 82200

aaaactatga atgaattgca cacctggaag attttttaag ctaatgacag tttcttcaaa 82260

gatgtcaatt atttgccttg gaaattttat aaattgcatt tctatgcaca tcggcctcta 82320

gtgcttacca ctcggtttat tattcataat ctgcaattca ataaaggctt tgtgttttca 82380

tttatcttca aaa 82393

<210> 11

<211> 44042

<212> ДНК

<213> macaca fascicularis

<400> 11

ccacgctgcc ctgcgcacgc gcagcgcggc tcaggcggca gcccggtgac accggcccta 60

gcgcgcatgt ctgcacgccg gggtctgcgc gccgcggcgg gccgagggcg gcgtgcgggc 120

cttccagccg ctgcctattc cacccaacgc cggcctagtc agtaatggct caacgccacc 180

gcctctccct ccagcccctc ccagtcgcgt agcttctgac gccgtcctca ccccgcccgc 240

ggccgacggg gccccaacgc gcaggcgcgg taaccacggc ggcagtgtct agtgaggatt 300

tgaaatcggt cgcgcgtgcg caccggcgac acggcccggc gaccgaggcc gcgcttcctc 360

ctgccgcccc cgtccccgcc ccctcccccg cccctcattg gagcggacgc ggcggcggcc 420

ccctccttcc cccgcgctgt cgccgccgag agtgtctttt caccgccgcc gccgccgccg 480

ccgcaggagc gccgagccag cggcgcgagc gtgactgagg gctagccgca cgggcggcgg 540

cgcctcccgc gggtccttca gccgctcggc gcctgggccc gccccctcgg ccccgccgcc 600

cgcccttctc cgatggcctc tccccgcggc ccgagtggaa cgccgccgcc gccgcggccc 660

ccgcgcccgc cccgcgccgc gtgaagcggg agcccggaga ccgcagccgc ccgctgggac 720

gcgccaagcg ccggagccgc ccgccgcggc ctgccggggc ccatcaccgc cgccgccgcc 780

ccacgccgga gcccgacggg agcgcggcta gagcaggagg ccggggctcg gcccgcccgc 840

cgccgccgcc gccgccgccg ccaccggccc aggcccgtcc gtccgtccgt gcgcgcgcgg 900

ccgggcctcg gggcgcggcg ggggcggggc cgcgtcgggg cgggcgggcg cgcgggcccc 960

gcgggggcgg cgcgtggatg gatccgcgcg tggcctggat ccagcccgag cagaaggggc 1020

cggccaatgc cctgtggatg cagatctggg agacctcgca gggcgtgggc cgcggcggct 1080

cgggcttcgc gtcctatttc tgcctcaact cgccggcgct ggacacggcg gccgcggcgg 1140

gggcggccgg gcggggcagt ggcggcctgg gccccgcgct gcccgccgcg tcgcccccgc 1200

cgcccggccc caccgcgccc gccgcgctgc cccccgcgct gctgacggcg ctggggcccg 1260

cggccgaggg cgcgcggcgc ttgcacaagt cgccgtcgct gtcgtcctcg tcgtcgtcct 1320

cctcgtccaa cgcggagtcg ggcaccgaga gccccggctg ctcgtcgtcg tcctccagca 1380

gcgcctcgct gggccggccg ggcggcggcc gcggcggcgc cttcttcaac ttcgccgacg 1440

gcgcgcccag cgcccctggc acagccaacg ggcaccccgg gccgcgcggc cccgcgcccg 1500

ccggctcccc gtcgcagcac cagttccacc cgggtcgccg gaaacgcgag aacaaggcca 1560

gcacctacgg cctcaactac ctgctgtccg gcagccgcgc ggccgctctc agcggagggg 1620

gcggccccgg ggcccaggcg ccgcggcccg gcaccccgtg gaagagccgc gcgtacagcc 1680

cgggcatcca ggggtgagtg cgcggggagg ccgcgggggc gggggcgggg cccatggtcc 1740

tggccggcgc ccgcggtgca gacacccgtc ccaggcgccc gggcttttgg aggatggatg 1800

ttgaaggcta aggccaaggc ccgactctgc actgaaagtt ttttttttaa acatcagact 1860

catttatcgt ggagtgactt gcccagatcc tacaagtaac agtccaagaa aaggggctgc 1920

tgggtaggac ctgcaggtat ttgtcttttt tactcttgag attggaacgg gaaatcgact 1980

ctctacccct ccaccccgcc tccgggcaag tgaggaaccc cttgtcaaag tggggcgtag 2040

ataagtgtgg agtttcacgt aagttaagtt gcagaataat ttagcattgc caggaactcg 2100

aatcacgtcg aaggtaaata ttaacctttt taatttcatt ttttaaaaaa atttaactgt 2160

caacttagag gtgattcatt ttttgggggg tgttgtgtcc tttaattttg tgctgcaatt 2220

accataagca tcgcctatgg tttataaaca ttggcttaat tcaaagaaaa aaccagattt 2280

gtcatatatg tctattcttt ggaaggtgcc atttttattt taaatatttc tacatccgcc 2340

tagagggaat tagaggctct acttaaattt agtgcactta cagacggcaa ggaatgaaac 2400

gaaaggtggt gtgtgtttcg gggttggaat tgtcccaggt gaggctgttc aggtgtgatg 2460

ctgttgacgc agcccctttg ccattttggg cttttctgag cgtctggaag caatttatgt 2520

gtaggttgta tgtcagtatt ttaagactta aatgataatt tttccttgca caatttttcc 2580

ccccaattta aaaaacaatt aaggatttgc tggggtatga gggttgttgc atgcagtaga 2640

gtcctacaaa taaccacaat tgctaggtgt tgggagttct tatagtaaac ttttgcttgt 2700

aactcttttt ctcatttgaa gtatgttggg aaacacgagt tgatacttct ttaaagcgtg 2760

tgatacactg taatagctgc atgttctgta acttatttca cctggcttgg gctacaagcg 2820

ataccttcta aatttcccga agtgtaaaca tgcagtgcag acgccggcag gagcgcagac 2880

tcctcttctc tccctccagt tcttacctgt agaactttct gagagcaggt ggttgggagc 2940

agtttcttct tgatgaatag caatatatac ctaagggctc gcttggggag gacctttagg 3000

tttccagcct gttatgtaac tggaatggac tccgtttctc ttagcactag aaaaaacagg 3060

aagacacgtg gtctctgcca gtcttgggtt gtacctctgc tcttagaaag tggtagcgca 3120

tcaggtccca tgcacctcac ttgggctccc cgagctgttt cctccaggta actctagtca 3180

ggctcagtag gtggtgttgc ttttgttagt gaatgagccc actaggatca ggtgctgtgc 3240

taggatctgg ggatctgggg cagggacggc atgggagaca cagtctcatg atcttgaccc 3300

accctgaaac ctgcctgcaa gtgccccctg cctagagcac aagagtaccc tgctcagttg 3360

tgcaggtccc ctctcacgct cttcgtcacc cacgtccagt ctctcatcac atgctgttcg 3420

tttggccctt ttaatctctc cacacctcat cctccctcat gcaggctctt gttacttctg 3480

tggagattgc tcaagcagcc ggaggtgcct ttgatgcact ctggtcctgc ttgagtcctt 3540

tcccatcaca ggtaatgggg caatcttctc tgccagcagg tctggtcaga ttccccttca 3600

ccctgtgatg tcacctcccc catctccaat cccccacatt aaagactaaa gcctaaaact 3660

cagcaacacc tccagggctc tgctgctcag atgcccctag gtcctggctc ctggccccac 3720

cccttgccaa cccgttagaa cctagctgta aggcagtatg gtgtagggca tgagagggct 3780

ctgaagccca ccaggaggtc tggtttgata ctgcagtcat gctcttggaa ctttcctttt 3840

cccctttgct ggagacctct ccttgcctgt ctctgggtgg tgtgtaccat gcctccagta 3900

tggccttggg tgcatccgct tcctgccgtc tctgcccaaa ggggcctgtg aggaccacct 3960

gctctgtgcc cagaagggca cggtgacctc tgcttgggct gctattccag ctactctttc 4020

agaagcaaac ctaagctgtg gtagagttgg gcctgtggct agaggaggta aggtcccccc 4080

tgtgatcatt tccacatggc ctgttggtcc tatataaact aacctttttg tatcaataaa 4140

tagttctgtc tagaacttgc ttctggccat cagcttaccc agagtgttga gaaaggccac 4200

caaaaagtct ttcggttgtg gcttagctaa ggaaataact gagttttaaa ggctcacctg 4260

ggctggccaa tagtaaagga ccttgttgct gagaagctgc ttggggttgt gatatagtcc 4320

caggacatgc acttctgaaa atgcagtgtg tattcctcat gggaggatga gcctgctgtg 4380

gagcattggc tgaacccagt tgggtctttg cctggtagcc catgtggcaa ccctcactgt 4440

ttgtcctttt ctggggagga gttttctgcc cttggacact ttgcctggtg gcttggcctt 4500

gtgagactgc cagtctgcct tctgcttcaa gtaggatgaa gaaaaagcag gtgaaagagg 4560

acagggattg gtgcaagaac cttcagagga gaggaggtga aatgcttctt ttggctctgg 4620

ttcttgaatc attgtttgat tgaaatctca agcctttgtt ttgggagtgg tgtgcttagc 4680

gtgagctgtg ctatctacct gggcttctga cctagagatg ttgggcaggt gtttggacag 4740

gccctgggcc ctttgcatcc cagcctctgg ctgctgtcac ttgcaagtgc tctcatcccc 4800

tgacccagca gggctttggg ctgttgttac tttgtcatgg tcgttctagc agctttggaa 4860

acctcttcag gttaagagtc ttgcataagt gagagtggga gcatggccct cagatatttg 4920

gccacatcct tactggtgtg ttacagagac ccaggaagaa tgtagttgaa cgaggacaca 4980

tgcaggtgtc ccgggccctg aacagcttct attcagagtt tggcctttcg aaggctgtgc 5040

catctcaggt gtgcctgcag tgtgcagcag gtgtatgcag cttcctcttt gcaggtttct 5100

tggtatttaa tctcatcctt taatatcttc tattaactca aaggaaattc tgttcttagt 5160

ttgaagtctg agagagaccg acgactgtcg gcataggaca tggtcagcca tgccccgcaa 5220

ggcgtctggt gagagtcgtt tccaacttgg tgcatgtttt tctcaattct ttcttgcgaa 5280

ggagtcacag cttggaggcg caaccaggat cccccctctc cctctagcct gacctcactg 5340

acataaagta gagcaggtgt gacctgtccg gaacatcctt gtgatgctca gcagggcctg 5400

ctgcagagca cgggaggcat cactctaggg gcctttccct cccatacttt cctgtgagtg 5460

tccaggatgc atgagagagg ttgttgtgag acctgcctta aagggtggcg gtggcacgtg 5520

tggaccttgc tttctgagtt tcactctccg agtcccagag gtataagctt gtgaagagaa 5580

gcgtgtatgt atgatcacac taagcagata cttgctcctg cactgttgga ggaggaagag 5640

gagttaattt catcaattaa ctcttccaac actccttcca tttagtaata gcatcacttg 5700

ttcctgtctt ttgttccatg gccaagctcc acaaggtgaa attgaaaatc gagtgcaaga 5760

cactggctgt gctggagttg aggaaagttt tgctggagac ctgcttgcac catatgtctg 5820

gtcactgata gatgaggact ggccaggtca ggacagctga cacttggaga aggggctgcc 5880

caggagggca tgacagactc tggaaaagga gggtcggagt attaaactgg ctgggaatga 5940

gaggcctcca atcttttcgc aggaaaaaaa aaaaaaggct taatgctcgt gctgtggaag 6000

tcagaatgga gcaaagtggg ttctgtctgt cttgctgctg tgagcgtgtg atggaacaac 6060

agtgtcattt gctttttctc agaaatattt aatgcatgtt tgtgacataa tttttcaaag 6120

taattttaag taaatatttt aaagtaaaaa gttctaagat ttgtgtctca aggtaaagtc 6180

tcaaacgttc tttggtcact atttaatatg agattttgtc ctcattttaa atggattcat 6240

gtaagcgtcc tgtggaagaa gagttaatag ttatccttgg aaaataagaa ctttttatgc 6300

ctcagttagg tcatatggtt taggatctga ttttgtagtt gtggagtaaa ggttaagaaa 6360

aaaaaacagc aaaccttgat attcaaattc agaaacttga tttttgagga tgcaaccaga 6420

atttggacta aaggtacaga ggggtggcag agtcagacca cccagacttg cagaagattg 6480

aagaagccgc agtgctgcca tgaagaggcc ctttctagga ggtgtggctg gcttgtcagt 6540

gctttgtctt ctctgcagtg aattggatgg caagcctcgc cctcttcgaa agctgccact 6600

ctgaacctgc cttgagaagc acctcaggga gggcaggcag gtggtctcag tcagcgctga 6660

caggtgtcca agttacctga cctgttggga acatgtgcct gagtgaggtg gccaggatgc 6720

cttttctccc aacactgggg atgcacactc gtcagcatcc tatttttgag atttctatgt 6780

tgtggtagtt ctctgttgct gtgtagcaaa ttaacataaa ctcagaggct tagaagaaca 6840

ctcacttatg gtcttaagga ttttgtgtgt cagatcaggg atggcggggc tgggttctct 6900

gcttaggctt ttgcaaggct gaagtcaagg tgttggccag ctgtgttctc agctggcact 6960

cagggtcctc ttaccagcac attcctgtta ttgtcagaat tcagttcctt gcaggatgga 7020

agtccttgat tgcttgctag ctgccagcag gggaattggg tagggcgctg tcagcttctt 7080

aaggccacct gcattccatc tgcaaagcaa ggtactttga atttctctga tgttttccgc 7140

cagctggagg aagccccctg tttctatggg cttgtgttat tgagtcaggc tcctgcagat 7200

aacctgccta cctgaaggtc atgtagtagt acaacatgat catggtgtga taacctcatc 7260

agagccacag gttccaagga gtagggtgta ggaccttgag gggaggaggt tcttctgtgg 7320

gtagacttcc cctggcatag aatccgttga tgagcaggtt gtggttcttc ttgtccaaca 7380

cttttcccct gactggactc cagcccatcg caatgactct tgcagattgc cagttccgtc 7440

ctctggcttg gtggttacta ctgaactcag gcagccacta taaccaggag aacctttctg 7500

tgctgcactc agatgaacat tctttaaaat atgtcattta agaaaagttt gcaggactac 7560

tcgggaggca gaggcaggag aatcctttga actggagagt tggaggttgc agtgagccga 7620

gatcgcacca cagcactcta gcctggtgac agagcgagac tctgtctcaa aataaataaa 7680

taaataaata aataaataaa taaataaata aataaaagtt tgcaggaaag ccgtgtgaat 7740

atatgaaaat acagtgattg aaaagtcctg ttcacgaggt gtcctgcatt ggctagttta 7800

ggaaaggggt ctttcctatg caggtggggg ttgatgactt acccaagagt cacctctgga 7860

acccagttct cttaagttga tagcagtcta tctttgcttt gcagaagatg tggggaacac 7920

ttgtcctgca agcccaggtt cgtagcaatg ttggcttccc cagaaccttg gcttcagagc 7980

actgtgcctc ctttaggagg cacaagaaaa ctcccacacg gttcttccct ctgtcccttc 8040

ctgagccccc tgagtgtttg gctcttgtgg agttgctgct attactaagt tgatcccact 8100

gccctcctga gtctcctcag ggaaggaggg gctgtattgt agcccgcatt cttagtgcca 8160

agcacacggt agccactaag taagtatctc ccaagaaaga agagcaggag gaggatctgc 8220

caactcagga gagcaggtgg gggatggcaa gtcttcggag tattcataaa ccaaatgcta 8280

agggaaactt ttgttgtttg tcttagaatt ttaaaaaata aagtctgttg cagtttatct 8340

gctttccttc ctggagagtg gctaaactag tgttctgttt tacaatgtag aatgcaaaag 8400

cagaaaacat tcaagaaaat tctatactgt atttgaaaaa catcaccatt tagttttaac 8460

tgctctttgt ttcttattat aaaaattaat acctaactat gaaaagttag aaagcctgga 8520

gaagtatgga ggtgagttgt ccaccattgg gccactagag agtgccctat gagcctgtcc 8580

ctggtgtcct ggactctggt ggtgtgcact gcatttgctg gcagtgagcc agggggtggg 8640

ccacatctgg gcccgggcgg ggtggatctc tgcagaagtt tatccatctc ttggctgaca 8700

gggtgggcga gatgggagca gctctgaggg tccctgttgg cagagaatgt ctttgattat 8760

caacaacatg cctttttgtt gtgggcttgt gatccttttc tttcctaaat cagctgccgt 8820

gcataaccag ttaggctctc ctgtggcttc agattggagt tagtttccca agtgctagga 8880

tgtgggtgtt aggtgatttc tgtctttccg tttgaaagag atttcagatc attgtaacat 8940

ttctggaatc ctgtcgatct gaaggaatgg ctaggatgta gtagtttaag ggaaatgaaa 9000

agtcgaatgt attttgatgt ttctgcatca gacctgctcg gtggagtcca tttctcagct 9060

tcgggagcca cgtgcttggc tcttgagagc ctagctccat cagcccatgt cacacactca 9120

caggtctggc tttagctggt ttcgccatgg tttctaactt gagcctcagt ttccccccct 9180

gtgaagcaga gcctgtggca cccacctcag agagtacatg aaagacttgg aagcactctg 9240

tgagttgtca tgcgagagat taaaaaggcc accgctgccc ttttctcctc tctttaagga 9300

aattgaaacc aaaaattaag tccttcttgc cagctggaca ggaaaagcct ttttcttggt 9360

ttttgaaaat acaacttcca ctttcagacc aaagtgaaaa ctgctaaaga ctgaatattc 9420

tgagtcttgg gagtgggggg ctagaggggt gttgtgaatt gaaagatacc tttctatttt 9480

taaaacattt taacaatgcc ttaatgatga ataatgtctg ttctagtttt gcatttgtta 9540

gttttttttt tttttttttt ttaactgttc tgaaggtaca tcagcactgt tctacagctt 9600

taaataagaa tctcatctcc ccagaggcaa gggtactctt gatgtatttg ctcagggctg 9660

tatgtgctgc tccgtgtaac tcatttaaag ttggttaagg tttttttatt tcttgcacat 9720

agtagaagga gtggatgaag tgttttctga actctttgca gcttctaaca tagtgttctg 9780

tgtatagtga aggaaaacaa aattaagggc cagggaacat taagtaggca actagaacag 9840

cactgtccag tagaacttcc tgtggagatg gaataattct atttttgcac taatacagta 9900

gccactggcc atatgtgact tttgagcact tgaaatgtga caaatgcaac tgaggagctg 9960

aattttaatt ttatttactt ttaattaaaa tttaaatggc catgtattta gacagctctg 10020

aactgcagta actttaggct ctatttgaaa cagtgtttga ttcagtaact gttgctgaaa 10080

taaattgaaa ctcatacaac agtaaaagct gtgttactca gcaagttatc actgtgaaag 10140

ctctagaaat tgtttgagtt tccaatgcaa atccttttca aaaagccgct gttttaatag 10200

cacatgaagc ataaaatagg ttcatagcag agcgcagcac agagcaacat ggagcaactg 10260

ttatgacctg gagtgtctcc agtccagcat gcaggtgata ggtctcagca tttttgcacg 10320

caggttaatg atggtgcaga cggtcacttc cttctctcaa cagtcttcct ggtcacgagc 10380

accattgtgg ctcgtgtgtg gggctctttt ggcttagctc tctgcacgag tttgctcctt 10440

tagttcccag agctgaccct tgaaatgagt gatattactc ctgttttgta gacagaaaac 10500

tgaagccttg acagtctgac gtgacctggc aagaggtgct gcagttggaa atgtgaattc 10560

acggctgaca tctgggcact ttactcctaa cagtgttcag tgaacaagac gtcgctaaca 10620

tgcgggggat ggaacctagc aactcattct acaaacatgg ttcaaatatg ttggtgcagg 10680

gccttttgct ttgttttcct aaagagatta gattcagatg tggtggggtg ctttgacagc 10740

caccgcagga caaagttgat agctgtgggg ttgcggagtg ttgaggattt catagggaag 10800

ccagtcctgc gcagtagtac gctcaggttc gtgctttctt gaggtgttcc agaactggcc 10860

tggagggagg ctgcagtgtg gaagcgggat ttctgtcacc tggagtattc ttagaagttg 10920

cattctatga agagtggagc atctgatgag ctgtttactc gctgtttcat ctgacggcag 10980

ttgaaagaca aggcaggact ggcagcgcag ctgcctcagt cagcactgct gcactggggg 11040

cttgacctgc agtctcgcaa tcctggacta taactcattt tgaagagaga aaaattaagc 11100

attaagtgat tcaagcgtct tgcccaaggc gctactagaa aataaaggca ctggtgccca 11160

gatgcaggtc tgcatggtat gcaagcctgg gcttcttccc acctccccca cagagagggc 11220

actggtatgt tggagtgaag agccacgcaa gacctctgtg aatgggcaga gatgggccag 11280

tgacgcaaca cagtaaagtg tattttggtt ataggcatcg tctctaaact tatgtaaaac 11340

attattaaaa aatggaagga caacgatgaa atgatggcca aaaatataga aaaggatacc 11400

ttgcatgtcc tgtgaaatgc aaaggaattc taaagtgtca ttatgagtta cctcatggaa 11460

gaaagcaaaa ggtgaatcta tctagagttt gtggttctga ctcacaagag actgatgttc 11520

atgctgaagg acgagtgtga caggtggaag gatagagcac cgagaccaca ctctaaaggg 11580

taggaatcta tgggaactat tcagggagat gaaagcatgg aatgaactga agcttgcaga 11640

ctcgttgagt aaaaagcgcg ttttaggatt ggttttagaa taaaataaca aggcctgtgg 11700

ttggggaaga tgacttgctg ttcacagagc ctcccttaat aggtggggac ctcagctttt 11760

cctctgctgc catcaggtga gtggtgtaca gtcctagcca cagtagtaat caccactggc 11820

ctgactgagc cctcaccctt tatacagtgt ctcctgccac cctcctggga gaggctgttc 11880

tcggcacagc tggcctgggg tcacacagct ggtaggtgta aagcaggcat tggagtccag 11940

gtagtctcac tccgtagcct gtctctttag ccactggaaa tgtagagcaa agcgagaatt 12000

gtccaaagag ataagctaat aaagaggaaa acaggctggg tgcaatggct cacgcctgta 12060

atcccagcac tttgggaggc caaggagggc ggatcacaag ttcaggagat cgagaccatc 12120

ctggctaaca cagtaaaacc ccatctctac taaaaataca aaaaattatc cgggcgtgat 12180

ggcacgcacc tgtagtccca gctacttggg aggctgaggc aggagaatct cttgaatcca 12240

ggaggcggag gttgcagtga gccgagatca cactactgca ctccagcctg cgtgacagag 12300

cgagactccg tctcaaaaaa agaaaaaaaa aagaaaacaa ttatgctgag ttccagagaa 12360

gtgatgtctg tcttctcagg agagatgccg atgctgtctg agggcctgcc cagtctccac 12420

atgattcaga gactccagag atggacagct agtgccctga ttttcccaag aggattctga 12480

gggtgacttc tgtcaaccaa acaggaggac ctggtgctgt catcaccagt tgtagagagg 12540

ctgcggacca cctgctgtgt gtgccatctt acactgccat ttgctgattg cttcaaagct 12600

agaggttgtt tctaagagtg cttcgtgcta actaactaaa acataatgac attgtttttg 12660

taaaactgat ccgtggtttg ttttttaaag cagaaagctc taaagtcact cagtcccacc 12720

acccagaagc acaagcaggt ggctgccact gtaggacctc tctctctagg ctcgtgtaga 12780

tggacacatg gattggtcag tagaaatact tttattaaaa gtcttatctt tacataaatt 12840

tgccaaatta ttaattttgc ttgaaaggga aaggtgtcca acttcagttg gaaatactag 12900

tttctaagag atactgctga gactaagagc ataaaacatg atgaaaacct taagtggcta 12960

agtgcagcaa cgtcagagta aaagctttga tgaagtcttg gtttgcttgg gctgtgtagg 13020

ttggaggctc agcctttgtt tctccctcct ctggtgccca gtggtggtgt ttgtgtccgt 13080

gaattttcaa cctctgtagt ttgtttgtag ttatgaccac tgttgcaccg aacccttacc 13140

gagggccagg ccctgtgcta agcacttgcc agtgtggatt tattaagtct tcatgacagc 13200

accatgtagg gggagctgcg tccctgtgtt gtacttggga cgcgatctga cctcaggcac 13260

ttcaggctcc tgaagggtct gcagtctcgt ctctgcctgg gaaaccacga tttgcagcat 13320

attccacaga cctcatgctc atcatcagga ggcttcccgg gactgctgcc tgagatttct 13380

aagttcctaa tgtggttcat gcttctggtg agtttctttg aggcgacgcc ccctgcgttg 13440

cctctggtca gctcagtcct gtggtcctgc agggcatcct acagtgtcct ctgtctgtga 13500

cttgtgccgt gccaccttga cctggcatcc actgtcctct accgcgtttg cagataggag 13560

ccactgttgg tgcctttttg tcgtgtgtgt tgaatggtca gggtcccaaa tagctgattg 13620

ggagcactct ccttgaatct gccatgtgcc tgggtctcag gtgactgggc ccctccttgc 13680

ttcagaaccc acgtgcgttg cctgtcctct ctggcttgga gggttgtgtg gaatcagagg 13740

tgagacccag tccccaggga tgggcagttg cctttgattg cccagctgtc ctcagcgccc 13800

tccctcctgc gcccaactgc tgtctcagtt gcttgcttga ggatccggat atagactgag 13860

gtcggcctta gcgtggcggg gggttttctc ttgagtcttg gatactttgt taccggtccc 13920

atcttcctgt gggtgggagt gtctgtcttg cttggcccag cctcccagag accttagctc 13980

tcttagtaca tgggctctgc ctaccttgat ccccagctca ccaccctagt gcagttgctt 14040

cttcgctctt gttccactcc ttgtcgccat ccaccctgtg ctttctcgat gtgtccttac 14100

tcggtgtttc tgtggagcag ggcatcctgg gcttcctttc tgatccctgg ctcctgtgat 14160

cttccgtgct gggctccctc ttcccttccc ttttccactg tgttgccctc acacagctgg 14220

catgccatgg atgtcgctca cccaagccct tcctaatgtt gctcaccaaa acccctccca 14280

ccttgcccct gggaccttct ccccttccag gctgcatgca ggccgagggc ctggcgtctc 14340

agcaggaggc agtggggcct ttgctggcac ctgggctctg catcctgacc ttctgagggc 14400

ttggtccttt aggtccatct tgaatctcct ccaggcttcg gactctctgc tctgtagctg 14460

gcccatggag acgggtacac tcaggcctgg tcttagactc cgctgcttgg gctgtgctgg 14520

tgcctttggt gccctcttag tccatcccac ctgggggccc tgtcctgctg tccattgtgc 14580

cagagtgctg tccccttgtc tttccgtaac tggctgctcg ttacctttcc catctcagcc 14640

tcagtaccag ccacttggta tcagggaggc tctccctgac caacctaaag ttcacagccg 14700

tggttgccag tttaaatttc tgcatagcaa ctttttggtt tattttggct acttatcttc 14760

cccatcatgc cccctgtccc tcccatataa actcagtgag agtaggggcc acatctcatc 14820

atcctgccca cagctctgct gtctgtatca gccagggtat gctgtgcaga ggctcacggt 14880

aaatagctgc agaccacgaa tcccatctgc ttgctgtgct ttaatattgg cttacatctt 14940

tggatccagt gagttctttt ctctgtctcc ctctctctca ctcgctcata cttactttgt 15000

gtaattggtg atttccagcc ttttgtatag tcctttctcg aatagttgtt ttctgtcatc 15060

ttggcggggg cctcaagggg ttgactgtac ggagggcagg ggctgcagag ctgcagctgc 15120

tgcctggggt ctcacggcgc ccgtgaggtg taggcaggtg ctttgcctct gagctgtctg 15180

tagaatgggg tgacggcggt ttcatcagac tcagtgaagc atgtcataca gtgagtgtct 15240

ggtcacagca ggaagatggt gaatgtcagc taatgagtat tcatcaccaa tgaatagtaa 15300

cagttttttt tactaaggct atgtaatgta gcctcagaat tccactcagc acagccccct 15360

ggcagcggtg cctctgagag ctggcatgat ggagagagcc tggttggcct tactggtgtg 15420

gttggggcac ttgggagaac gccttcctca caaagctcat ctggagggtt ttcggacttg 15480

taggatagct ttttcagggg ccttgccttt ggcagggcag ggacgtgtac tgctgcagtc 15540

tagggtatgg gataactttc taaaccagac ccagaacttc atggccgcag gggcctttta 15600

gccatgcggg gctaggagct gacacagcgt cagcagcatg agggcctgtg gtgctgggcg 15660

gcagagccca gagggagccc ctgctggtgt gactttagtg taaaggctgg gggataccag 15720

attcttacag aagacttaag acgggcacag tgatgtctgc tctttgaccc ttgcagtatg 15780

aattagtaaa actgaaatta ttacatttcc tttattagga ttataaaagc aatgatgact 15840

tattgaagaa aatttggaaa atacagaaac tacctataat ttttccattg ttaacatttg 15900

agcatatttc ttgtcacttt taatggtgct ttaaatatgt agcaaatgta tcatttcgta 15960

ttttaaaaaa atgctaggta agcatttcct cctgtcctta aaaagctctt ttaaacaact 16020

ttaaaatatt gtatagatag atgtacacaa ttttctgaat aattggagtt atatttacat 16080

cttttcactc tttaggaaag gactggcctg tttctgtgtt gggttccttc ctgagtgtgg 16140

cttccagctc agtggctcag acttcaagat gaagacttca gtcctggttg tgtatggtct 16200

tgggccagtt accatatgtc taatgaatac ttagttttgt catctacaaa atgaaaatag 16260

taatatttgc ctcaaagact attatttggg aggatctagt gcaaatgtta gtaatgtgga 16320

tattgtgtag tgtcccagga tattaatgtt tttagcctct tggcttttat tctgtattgt 16380

tgccccaaaa gatgatgctc acttatcttt catccagtgt aaggatatct ggaaagacaa 16440

cagaaagtat agctgttttc atttcaaaag tgatcagctg cttgagctag caagcaaggc 16500

ttgcactagc ttccaggcgc agtcacgcag tttcacagca ggcgcggttc cctcggagca 16560

cccagagctg ccctgcggta gtcagcagtt gtgctgtggc tgcactgcca ggctgggtgg 16620

caggtggatc ggagccagca gatgtggctc aggaagtgcc ttcttggcct ctccttaatc 16680

tctttcagag tctgtgggcc cttgattgca ctgtgggttg tttcagactc cagtattagg 16740

agactgaacc ccttggtggt ttttttgtgt gtgtgtgctg agctgggttg aggacatgtt 16800

aagcaggtgg ggtgcctccc ctgggtttgc tccgggtggt acctgtggtg tggggtggtt 16860

ctgagtagtt ctggccccac tgctggagta tctgcccact cagtttgtga gatggcaggg 16920

cttcatcctg gtctggtgcc tcattttctt ctttagcagt gggcttagaa ccaatgcaga 16980

ttcccaagtt aagtattttt tctgtagctt aattattaca ggcttctggt acctaagccc 17040

tttcttactt tctgttctga ggggaagaga agataatgtt gtttctccgc ccccccccgg 17100

agtggcccca ggaccttgca tggcatttgc agcatttgca gcgtgcttgg gtttgcttta 17160

ctagggtgaa agtgttgcac cccccagcac ccacaaaggc acctctgctc acactccggt 17220

gaggttctga ctggccctgg gacatcacct gctccaggat cctatgtggc tcatcccagg 17280

agagatgtgg gagggaaggg gaaaaaaggc ttacatttgc tgagtggaat tcatgtagat 17340

ctgagttccg cattgattcc taagctgcag agcccttatg ccttggctgt tttgtgaatg 17400

ttagtcggtc ttaacctttt tcaccgagtt agcattggct gtctcaggag gctcacagct 17460

cctgctcctc ctccagggga gtgcgccctc ctcctctgtc ggtagctgtc aggtgcccct 17520

ttcctctgca gcagactgtc ctgggtcctt gcctggcctt ccccttacac gtgagcctgc 17580

agcttcattc acagcccctg tgtagaaaga taggcacatc gataggtccc tccctgccca 17640

gagtgggcgg aactgaggca ggcactaaaa gcagctgact ggcagcccta gaaacatgaa 17700

gggtttcatt tatagtttca gtccttttcc ttctttcgag ccttaattta aaaaaaaaaa 17760

aaaaaaaagc cttgaagtcc tgcttctgag ttttctaatt tgtgcaggta ttagttgcct 17820

tgtaacataa tcaaaaataa ataaaaatga tttataatta gcttattaac tgtatcagta 17880

aatggatact ttaaagagga tcattgatcc ctcaaaatag aagcaatgca gtcattccct 17940

cattatgctt tacttgtgat ttgcttacaa cccactcttc ctagttaaag ttaaatatta 18000

atccagaccc tatcagtgcg atgtagtagt gtctgaatca gttgttgttt tggtgtaatc 18060

gtatcaaagc atgttataaa atctacaaaa ttgcagggtt aactccaaat attttcacta 18120

aggtattgtt tttttgggca aaaatgcata gtgaacattg tggagctgaa gtgagggaac 18180

ttcgatttct gagaaaccac tagttttaag ggttttgaag gaagagttgg aggaggagag 18240

gaagagaata aattcacagt taatgagttt ccagtatttt ctgtcgcatt ttacgttgta 18300

atggaaaaga ctgggaactg aactcacatg cagtttgtca aatcactttt tccctagaat 18360

tcaggattga tgagattaac ggggtgttaa aggtaaactg aggcacataa ttaacatgga 18420

cagaactgta gacctgagtg ttgagagttg ggaaatttca gtgagttggg aagactggaa 18480

gcacctgttc ttcagagtgc aggtcctcat attcagtggg tttaaggtgc tgaaactttt 18540

tttttttttt tgagatgggg tcttgcactg ttgcccagac tagagtgcag tggtgtaatc 18600

accactcact gtagcttcga atcctgggct gtcagcctat cctcccacat cagcctcctg 18660

actagctgga ctgcaggcct gggccaaaac tcctggcttg aaacttcttg taaccagatt 18720

ggaggaggag ggcatgttca ttttcgtgac gtttcctttc ccttaaacat ccagtgaaat 18780

ctgacctttg accatcactt tgcttaaaag aagctactgg atttaaagtc taggagaatg 18840

tcctagacaa gcccatagta tgttcctgta tgttccccac ccagagacct gcgttatgaa 18900

gtgtttggtg tgcttcttcc agccccactg ttctttctaa agtgttttat tttacatacg 18960

ctgtcctggc ttctgggcta tgacctttgc cttttttgcc ctttagttcc tttgcccttt 19020

acctactgca gtgcagctgc ctgtccttgg gttgactaca aagaagtcac ctttgaacaa 19080

cttagaaatt gtgacttttg gggaaggcag ggcagagcct tggggctgag atgggggagg 19140

agccagctct gccctgggag agatacaaag cgcctgcctg ggtgaggcag tgcacgggtg 19200

ggcttgcttc acctctttgg ccccagcttc aaaaccagcc agtcctccct ggctttggct 19260

ttaattcaca tttacaagct tgaaaaccag ttaatcccat tagctcagct tctaaagctg 19320

aaaatcgtcc cctaaatggg tcacctgttg tcatcaatag ctttattagc tatggaataa 19380

tatagttttg ttctctaact gtaggatcct tcttttgctc ttaaaatagc tcagtaagtt 19440

gggtctcata aatacataca gcaagcatat accagatact aaaatacaaa aacattgctg 19500

atcttgcttt tcagtactaa aagcagaaaa tcgggaattt actaaattga gaagtcagtc 19560

attacctttc gatgggtttg gactcttgca aggcagtgat tgtaaacgag agtgatcttt 19620

tgttgttttt caatgaactt tattctctaa tttttagtaa agcacactag gaaataatgc 19680

ttcagaattc tgttttcgag tagtttcctg actaaaataa aaattcacta aaaaaaacct 19740

ctgctgtcac catttccttt tttcttaaga taactaggaa atgaatcatt aagagtttgc 19800

tccgtggcaa tggatcggga agctgaccct gctctctgtg gggctggagc cttgctaatg 19860

tcccaggatt tcacttcaca gagacaagca tcagaggctt gcttcattta tagatcctac 19920

ttcttttcta caccacagcc aactcaaaat ggtgacagaa tctaagacga ggctagaagt 19980

caccacggag cagttggaag ctctgcttcc ggttctgggg gcagtgttcc tggcgttgtg 20040

tcctttggcc ccacctcagt ttgtccgttt agctcctcag ctgagaatga gatgtgtatc 20100

atataggagt ttcctgggcc actcacagcc ccaagctgga gagtgccagc ctaatgtgtc 20160

aggagtaggg ggtgaggcca gagggctgtg tgccaactcc tccctaagaa gcctcctggg 20220

aaagccctcc caggcacttc ccaggtctca ctggccgcct gaggctgcag gggaggatgg 20280

tcaggccgcc tcttggctgg cactgcttcc cggcgtgccg ccagcctttc tcatggggag 20340

gggaatgatg gcatgcctgg ggggcagcag ggccccaggg ctgcctaggg ctctcactgt 20400

gtcctcctgg ttctgagatg ccacctttgt gatccactgt agagggattt attctattat 20460

gatcaatgca tagaaatttc ttcgatttgg agactgaaca ctagtgagca gaactgaaat 20520

tgagctttaa aagatattga tgacgggtct gtggatagga gactttagtg tggtttttat 20580

gcagacgtcc tgccagctgt aaattccctg gaggtttggt atgtgagaac ataagactaa 20640

acttatttct attttgttga ggagaaatga ttaaaacttt tcattgatgt acttctgtgg 20700

cagacttttt ggagaattga accagcgggc atattcagta tttgaagtca tagatgagta 20760

aaggaggtat gttgtagttt gcgctggcgg cgtggcctgt ggtcggcagg gcttatctgt 20820

gaaggtatgt gcacagcttc ctaaggcagt gaaaagtcct ggcagtgtta gtattgaatg 20880

agataatcca aaaaatgtaa aaatgtttac atttttaaag ggatagttgg cgatttaaat 20940

ggtttctgct aacaaatcaa attattcatt gcagaggtaa aatattttca gaatgttaat 21000

tttagatgtc gtagagagtg tacatcagca atgacaaggt cagcaaaata tcttagcaaa 21060

acttgattga ttgattccat gcacaggcaa gcgctgttct gggcaccgga gacggagcag 21120

tgcgctgttg cgtccatcca cagatggcct ccagagtcat gcggttgcag ggaggccgaa 21180

gggccaggga ggccgctggg tgggcacggc tgggcggtgc cctcacgtgg gttttgttgg 21240

gctactctta ctgtgcactt tttctcagtt tggtcagtgt tccgccttgc tgcctggccc 21300

ccaaccctcg ccctctgagg gcctcacaaa gagccaagca gaaggcaggc tgggggcttt 21360

tcaggccagc ccagaggatg taatgatgat ggttggcact gtcccacggc cgccaccagt 21420

ctcacactgc ctcgtgggca gtcctggagt cgtgcggcac cttgctggtc cctgctctcc 21480

ttgaagaagg gccagtgggg cacttcgcca gagccttctt gtctgactcc gtcatccaag 21540

aggcatggat ggccgggccc ccggcagttt ccattctatt ctgagaaggc aaaacaaaat 21600

tattcctgtc tcttattatc taatatttgt tacagcagtt gctcactttt aggtgcattt 21660

tattacagat ttcagacagg tgtggttatt agtgcagctt actgtttgga cacaatgcca 21720

aggtcaggag gacagtgttc ccctgagcac cacttctgct aggagcatgg gcaggccatg 21780

cctcgccatt aatctctcct gatttagggg aggaatacca ggccaccccc tcttctccct 21840

gtgcaaggga acagacattt gacaaaaacg gatgccatgt tacgctgatt ttgtgtgtct 21900

aaggcagact gcagcaggtg ttatctccgt gctcttcctt tcctggagtg ttgagcatct 21960

cttgatagta ggggatgccc ctgagggtgg tgaatgtggc tgcacaggtc ctgaaagcta 22020

tttgatgttg ccgttacttc aggtagaact taaagttgac agtacattct actctgcagg 22080

tggaaatgtg gagtgccatt ttgacaaatt ggaatgccct gtttacaata tgctttaatg 22140

agttaaatct gggggatgtg gatagaattt tagtatccta gctttggcat tcttccatga 22200

ctttgggcca attatttaat aattccaagc ctgcatcttt gttagaatct ctaaatttct 22260

ctactcctgt tattatcctc agaacaggac tgtgaggtgc agtaggccac atggtgtagt 22320

ggtttaggtg gacagacttg ccagtgctgt tctcatggat agcctaggac tgtccctagc 22380

tctctgcagt gacagtgata gtgactggtg aaggtgaagg gatccaccca gacgttcttc 22440

ctgatggaga gaggctggcc tgtggctctt ccctggggtg gatgttaacc tgctaacgtg 22500

acatatctag tcctgcttac attactaagt ggtaggaaat tttaggtaac acctcagact 22560

ttaaagtggc ctactgagct ggtagaaaag tgtgtagttg gtgctcagta attgttgaaa 22620

agatagaagc tttacttcaa agctcttgta gtttgatcag tttggaaaaa atattttaat 22680

gttgggctct gttaacagct ggactggtgg ctgtctgaat tgggaccatg cttggggtga 22740

ggttttttct tacttttttt tttttttttg gtgagacaga gtcttgctct gtcgcccagg 22800

ctggagtaca gtggtgcaat ctcggcccac tgcagcctct gcctcctggg ttcaagcgat 22860

tctcctgcct cagttttctg agtagctggg actacaagca tgtgccacca cgcctggcta 22920

atttttttct atttttagca gagatggggt ttcaccattt tagtcaggat ggtcttgatc 22980

tcctgaactt gtgatccatc cacctcagcc tcccaaagtg ctgggattac aggcgtgagc 23040

caccgcatct ggccacatat ttttttaaat taaatgtgat acataaaatt aggctgcagg 23100

catggcctga tttgcaggtg cttcatgagc aagcgtgcac agcatttatt tgctgctcct 23160

ggagtctctc gtgtgtgctt gtagcctagc cttaagccct ctgtggacgg cttggaatgc 23220

gtactccaaa tgactctttt ggcggggtgg gaagtggcaa tactttaggt gactgacagt 23280

tgaaattaac cttacacaag agccaaactg taggctgatg cagggccact cacctttgta 23340

ctcacccctg gcaggtcctg taagaggtgc tacttgcttc cactttgcca gctgttcgtt 23400

ggccctgttt tgtcttctgc tgtttgcctt atttatgaaa cagaatggaa acaggcgagt 23460

ttgatttgtt ataattccta ggagtcatag aatggaagca ggtgagtttg atttgttata 23520

attcctagga ttggataatt tgccttcccc tctctccatc tttaattaat cccttaaagg 23580

aaaagaggac gacagcactt ttcctgcagt catctgtgta ggcctcagcc ttaactcatg 23640

acataggctg gtgccactgg ccacagggct gacctcagct cttggagccc atggggtgac 23700

aggagatcag cacctttgag gtggcggcgt gaggcgtctt ccaggccttg ctcatggtgc 23760

ttgaaaacac tgctttagag ctttgttaag agagagaggc cctacttact cctgtcccac 23820

aggcatttgg gtgttgacct ccttgttggc ctcttaagga gagaatactt gagtattgaa 23880

ttcgatcagc ttttctgcct ccagggaccc tgtttctctc tgctgagact gtggcggatg 23940

aaaccaggat ttagtggatg gtcaccaggt agcttgggca gacctgggcc gcggggcccc 24000

tgaggactca tacgtctttt tcctgttcac atgttccttc cccacacctt ggcccattct 24060

cagtccctcc catgctcctt agcgtgaggc actcagggag gtgcccatgg ggccttgggg 24120

cctgtgctgg agctggttcc cagcctcaga agtgtgccta actgtgccac attcattgga 24180

aagctgcttt cacacttcct ggatggaatt ctctcatttt ttcaatataa agtcactgag 24240

atgatttttt tggagaagtc tttaaaggcc agttatacat ttattgatac ttggtattga 24300

caaagttcag ttgtttagtg ttgctaagtc atactgtgta agtttgttga gcacagagtt 24360

ttcattttat actttcagag gagaaatgaa actgaatttc gtggccagaa atatgtttga 24420

gcgtcatcct gatgtaagaa cagaacagaa aatgtggtga catttcattg taactctagt 24480

atgttttctt ttttgtccat tagactacat gaggaaataa ttgactttta taacttcatg 24540

tccccttgtc ctgaagaagc agctatgaga agagaggtgg tgaaacggat cgaaactgtg 24600

gtgaaagacc tttggccgac ggctgatgtg agtatgttct ttggagttct gtgtcgcacg 24660

tcacgtgcga gtaaatttaa ataccctgtg atgatgatgt gtcggctaga tccacacaga 24720

ccttttctcg ttggcccgag gcagcagttc tccaagtgtg ctttgagaag gcctccgttg 24780

cctggaatgc atggcccccg gcgcacctgc acctgctgtc ttagacacct gcggtggccg 24840

cacatcttcg tgatgctggc gcgcactcaa gtgcgaagac catcggctga gggatttgtt 24900

gggttttttt tttttttttt tggaaggggg agaatggtgt gattgtttct cttaagttca 24960

ccttaaaatt tagaaatttc accctgtcac ccacccctgc ttccccacca ccacacatag 25020

tagcatataa tgtgctcatt tttgtaaaac ttggaagtgt tccctcatca cacaccactc 25080

ttgcagtgaa ggaacaagtg ttttttgaca tgtggagtgg ggccttctgg aatgcttggt 25140

gcaggtggcg tgaagcctgc ccctggccgg ctctattcag cagccttccc tactgctgac 25200

tgggctcagt ggaccagcag ggctggccgt gccccagctg tgaggggcat gtgtgctctt 25260

ggtgggcaag ggcaacccag ttttctgcgc ctcttttaaa atgatacaga tttttggctt 25320

taaacttcag agtcctagga caaagccctg ccccagtgcc ttagctgtgg gtttaagaag 25380

aggttgaagg gtttgaagct agctctgaaa agtcctcagc tttgaagggt tatagggtga 25440

ggacaaaact tgtttcacct cttaattttg agtttttaaa cattcctttt ttgggcatgt 25500

ctttaactta aagggaattt tctggttgat tgttatacgg tcccctccat cagtttccaa 25560

ggtagtttta ttttttaccc aagggtatag tgagggcttt cttttagtaa gaaataatgg 25620

tagtgtgact gcttggtttg tggtatacat tttaaggcaa ccactctttc tttcaggtac 25680

agatatttgg cagctttagt acaggtcttt atcttccaac taggtgagta ccagactgca 25740

tggcatgggc tagtgggggg ctgggatggt gtctatgcaa tattaagggc tacaaataga 25800

ttctttgtaa ttgagtctaa ggcgagaaat gccagctaaa ggaaaagact gtggttacag 25860

agggaaattg gcagaaagat ttaatttagt gttatgatga attcattgct ttgcattttt 25920

cctctcacac ttaatttgtt ggggtgcaaa aatgcttcat gctggaaata tgaagaagac 25980

aggtgggagg actgtgggaa gtaaacgcaa tagaagacat tctgctgata ttttaggaca 26040

tgtgtttgaa aaattgatct tatgttttga tgaagattca agcaaaattc tctttaaata 26100

gtattttcta agtattttta cctgatagga aaatgtcaaa caagtttgca ttctaaaata 26160

caaactagta ttttctcatt aaggattctt gatagccaaa taaatttcct gtgcactgtc 26220

tcattaaaag cttaccttct attaacccac tgctagttag catttggagg ccgaagaggc 26280

tataatctca ggatttgggg gttgacatta gcagggccag tgggtaattg aacaggtttg 26340

ggtatccagg aatctctggg tccgcaggag tgatccagcg taggcagtgc cggagtaggt 26400

gctgggagag cggggcctca gcctggtttg ggggcaggca ttttcatttg aatcccctca 26460

catacctagt gctgttggga gaatgattta accttcttgc tttccatctt atgctacaaa 26520

tatggaagtc ttcccttaag ttcagcgagg acttgctgta gttcatgaac tgcacttcac 26580

ctccttaggg gccataggct agtgggattg tgtcttggcc tttgtgggag acacaggcac 26640

atgtgccttg gtgcttatcc tccccacacg agtgtgtagg ctgtggcgag gggagcagtg 26700

gctgacgtgc gttttcttct gtcagcgaca tagacctggt ggtcttcggg aaatgggagc 26760

gtcctccttt acagctgctg gagcaagccc tgcggaagca caacgtggct gagccgtgtt 26820

ccatcaaagt ccttgacaag gctacggtga gtgcctggct ttggcccctc tgaccgggca 26880

ggagccttgt cacatcccag gtggtcacag gatacgcctg cgtcacgagc ttgtggtatt 26940

ttacacagtt attggctaca gttttgaaga ttaatctgct tctggtatag acatgtgttt 27000

tatgtttttg tttcatagtc gtgatcacca actgagaaca tgtttagtga cagtctgaac 27060

ttttgggact tgtgagccca ttaaactgtt cttggaatga aaatatatga ttgtgtctac 27120

ttgtgttagg atgaatagga aaggagagtc atctgaaacc ggacactgac attcaggtgc 27180

tgcccattat ggagagtgtg gctcaatgat taaaccatgg tttttatgat taccatttgc 27240

tatgttatgt taaagaggaa caacttagct gttcctttcg tggttccaaa aaatatacat 27300

atatgaaaag ccttttatct ttgggggaag tttgaagatg agactgtttc tggtgtgtac 27360

ttgctaaggt ttatgtcagt tcaagattat aagcccccca gggactatga ggtacttgcc 27420

tgttgtatga cagttcttag ctcacctgtg cgaccggcta gcatttcatt tttaaatttg 27480

tgtgtcaact tgtgtgtgat tcacatcctt atagtgttta gcagaatgta agttaaggca 27540

ggagcttcct cctgcctgtg tggtgatagg ggagggggca ttcacatgtt tctcattgtc 27600

aggtgctttt gattgaggct gggggcaagt tttaaaacat gatatatgca ctgaaaagtg 27660

cacatgtacc aggtgcacct cttggtgaga gttaacgaag tgcacatgct catgtcactg 27720

tcatgtggac cagagcgagc aggcagcacc agaggttccc tccaggccca ggttccagaa 27780

ggggctgttg gctcttctca ttagcacgag acaagccctg gccggccact ttctcaaatg 27840

cttacgggcc ttattgcact tagctctccc agccactctc atcagcagat gctgttgctg 27900

ttcacatttt acaggtgagg aaactgagat gcggagaggt gaggtcatta gcccaaggtg 27960

ggtcagcggc atagtccagg ccgctgttgt ctgctgctcc tctgtgtgtg ccaaggggca 28020

gcggggaggt gggtgggaat cctgaccagg cgaccacctt tggagtagag gaactaaggc 28080

gcggctgtcc tgaggccaca cagtaggttg agcagttaca gtaactgctt agtcccagtg 28140

acctcgttac tgtcgcatat tggctactaa gtatcttttc ctctgttacc tgagggccag 28200

tgtagactgt agggagagcc tggagcctgc cactgctcat ttctggggag cactgtgcag 28260

ccggccagtc atgggcacaa gagacccagg gcgagggctg agtttaaggt gaaatcttgt 28320

ctatttggaa caacaaccca aaactgtgtt acagtgttaa ctcctcacct ccaggatttg 28380

gggttcctgc cgtgagtgag tgtgtgcaag agtagggcag gagagtgcca ggagtgattg 28440

tgggaaggag tctatgagat ggaaaggaag ctgcttccta aactgtgggt gtcagggagg 28500

catagccatt gagtgttggc ttcttccaaa gcagtttctg atgagttctt tgggaaagta 28560

tttctttctc tgccttctta agaacatact ggcctcaggg cttaccctgc ctggtggtcg 28620

cagtggtgtc caggtgactc tggccccact ggcatgtcct cacacgctga gtccttggtt 28680

ggttgccctc aagtgtagac attaaagccc agaataggtg tgtactgaat gcactgtccc 28740

tacgttgcct atcactggca tttgaacttt tcgttagaca ctgattgttt tggttaaagg 28800

aattcctttt tttaatcctt caaggctgaa ggaaacaaaa cattgccttt tcttctggaa 28860

gaattcagtt ttactggtgg ggtggagggt ggggcatgag tgtggtctgg acagttgctc 28920

aggcagattt tgaatgccat tcggtgacag ttcttgttgg tgagaatatt tctaaaatag 28980

ccttttattt gctgaatttt ttaggggaaa aattttttta gtaaagttgt cttaaagagt 29040

gaaaacccaa agtagagaaa caatatcagt ataacataca atttaaaaaa tggcttcgaa 29100

gttacattaa atgatttcaa aaattctgcc aaataaaagt ctggggccaa gcacctctct 29160

ccatcccagc acatagggtg ggcgtggcag agactaactc ctgttccctg ttggctccct 29220

cccctcacgt ctctttgatg cttggtcacc tctggtgctg atccagggct acaggggctg 29280

ggcagaatgt gggtcctgct gtgaggggct ggggcctggg agtcgtcctg ggttcaggga 29340

ctactgatgc tgacagtgtt ctctgacccc ctttcattac taagaaaaaa caccaaacct 29400

ctgtacagct ttggcagcat tttgatgcct ggctgtggag agtcctgcat gttaaagcag 29460

tttttaaaat gaaatcttta caggtaccaa taataaagct cacagatcag gagactgaag 29520

tgaaagttga catcagcttt aacatggaga cgggcgtccg ggcagcggag ttcatcaaga 29580

attacatgaa ggtactgtgc ttggtgaccc agcgcggcga gagtgcagga ctggagtgct 29640

tgtgcttggt ggcatcctac gatgtttaca gctgtcagct gcacacacaa gtctttcgta 29700

acacagacta cacttacatt atttctccta caatattatt tctagagata ctttgaaatt 29760

acatagctgt ttttaaaatt tgcttttcct gagtaaccat tttataaagt tgacaattat 29820

tttagagagc tttgttaaaa tgttctttct agttattaca gactttgctt ctagctcagt 29880

gtgcctcatt cgcaggtttt acccaggtgg aagttgataa atcatgaggt gccttaaata 29940

tactcacttt gggaggtctc agtgcctgag gatgggcaga gagacttggt tgagctgaca 30000

tgtttgggac tctgaccatg tgcctggtct taaacgggtg gtcatgacct cctgttacag 30060

tagaggccgt gcagtcctta gcaggggcag acgcacctcc gggtggtcgt gacctcctgt 30120

tgcagtagag gctgttgcaa tccttagcag gggcaaatcc acccctgcaa tctggtccca 30180

tcttgttcca ttttcaaggg ccttgctctt caggttcccc cttccccctt gtcatctggt 30240

ctgagggagc atgtccaccc caagcgcaac acgaacagca gcagccaggc tttccctccc 30300

tcctgccatc tcctgccgct ctgccttcct tgccagcctc actctgctct cctgctccgg 30360

aggcccccac tgtcctcatg gcctgtgtag caagcacata aacactccag tgaacgcgct 30420

ggtctcttcc tgagttcctt tgtgcctgtg gactcgtcat ggtaggggtg cacccctgct 30480

gagtcgtaac ccagggagag ctccacagtc tcgattttca caagcccctc aggaaattaa 30540

ttcttagcgt cccccaacca aagtttgaga cttaatgact gagagccttc agatgggcaa 30600

gaggatcgag gaaactttcc tttctgtctt gtgtgatttg ctatgtgaaa tctctttgaa 30660

agtatggtaa ttactcagta aatctttttc ttttggaatt tacagaaata ttcattgctg 30720

ccttacttga ttttagtatt gaaacagttc cttctgcaga gggacctgaa tgaagttttt 30780

acaggtggaa ttagctcata cagcctaatt ttaatggcca ttagctttct acaggtatgt 30840

atgctttctt gagactgttt ctgttgagac atgtgtaaga gtagactctt ccaaccagtt 30900

gcctagtggg ttccagcagc ctttgctctc cttttactgt attgtttcaa tttggtagag 30960

gctgatttct gattcttaca atcaaaccct cttgattaat gcacctttct ggatgctcat 31020

tttgtactgg gtgtaactgt tggtgcaggg gtgcccgtct ggttctgtga gtccagtgca 31080

catcagtcca agctcaggga attctctgta ttcagaaatg tccatttcat ggtaaacaat 31140

aaacatttct tggtgcttgt ctgtgattta tattgaaaaa aatttgtctc agaataaagt 31200

tgagtaccac atatgagaaa aggatttaca agagagcttt ctcagactga tgaaacatca 31260

ttattttgtc ttaaattata tgtggtcctt attttgctga gtaacatgga aaatctatca 31320

atagaaaacc tacgtgtttt aaaaagtatt gttaaatgct gtgatgtatt gataaactgt 31380

aattatactt tttaaacata taaaatcatc tctaattgga acagtaatta ttccgtttat 31440

attttcttga gtgaagaatt ctgtccttta caaaatcttg cctatataat ttagccgcac 31500

ggctgtattt ctccagtgtt taccattaat ttggtctttg tgattgtgct gagattaccg 31560

aatctgtcca tgatttggta atgttctcac tgtcatgaat gctatgatag tagaatcact 31620

gggtaactac ctgtgatgat cgcagcttcc ttggtctgtc tctgccaaga tgctttaaaa 31680

gtagtgaaaa tggaattcca tgtctgtttt cttacagttc tagtcacact gtcctgtctt 31740

cactttcccc tctgagatgt ggcccttata tatagccttt cttccatagt ttttggacat 31800

tattttgaat taaacatggg cctctgttct ttactgatat actcctgact tgcactattt 31860

tcatggcctt gtagtaacaa cagctactta atactttgat catgcatgtg ccatgtgcca 31920

ggcctgggtc cagggcctcc tccaccccct cagggggtcc tttcagtgat cctgtgaccc 31980

cacaggaggc caccacagca tgagtgggat tcctgtgttc actgccacat ccctgtgcct 32040

tgtccagtgc ccagagcttg tcctgcctca gcggtgtgac tgtggcagca tctgagtttc 32100

ttgactaagt gaggggagga ggcccaccct ggcaccggcc aggctcttgg atatgtgatt 32160

ttggctaaaa gacaaggaat aaggaaggga ataaaggtca ggccagaatc ggaatcctcc 32220

tcttgtgtgg tggaaatatg cagagaactc cggaattctt ctgaacccta aaaacatttg 32280

tatgctttct agctgcagct cctcctggca ctctgtgtta taaatagttt caagcaccgt 32340

gcttctctga gggctttctc tcatgtgccc tcgtccatcc ctttcgagtt ggcactgtcc 32400

gatagaattc tgtgatggtg atggccactt ctgcatggtc cggcaagggg cagggcgcca 32460

catgtggcta ctgagtattg cagtgtggct ggtgagagca acaagctgga tttttaatta 32520

atttgtttta attcatttaa atagacatgt gggcaatgca ggtctggaca gctgagaatt 32580

atgaccctca ggaggtgtgg tggacagtgg tttacttccg aacaagccca gtgcctgctt 32640

ttgaagacga tatggcactg aactgagagt ggtgctcatc tgtgtgacaa gcaggatgga 32700

agcttgctat aaatattgtg atataatgct aatgaccttt acacagctaa aatcaatcct 32760

ttcacttttc cggttttatg tgatactgcc atactagtca gtctaacact gacccctgtt 32820

ggttgtgctt cagcataacg aaattaggat gacgagaatc tgaaattaca tctaccatcc 32880

aggtgactaa gttatgcaga atatagtcca acttatttgc ccatatttgg ttaatcagat 32940

atctgtgttt gcaggaagtt tgctgtatgg attaccaatt tcaaaaatca aactacacta 33000

aaattcagat gagtccgttg tgttcctttt gaacactcct cgttgaagag gctgctgttc 33060

aggcttcctc gtggtgctgg tgagtgagcg agtgccactc actggtattg ccttgaagag 33120

gctgctggac agcagacttc gtcgcgtgct attttcttta gaacatgcca tgaatccata 33180

caaattgtgg gtgcattgct tttacagttg catccaagaa ttgatgcccg gagagctgat 33240

gaaaaccttg gaatgcttct tgtagaattt tttgaactct atgggagaaa ttttaattac 33300

ttgaaaaccg gtattagaat caaagaagga ggtgcctata tcgccaaaga ggagatcatg 33360

aaagccatga ccagcgggta cagaccgtcg atgctgtgca ttgaggaccc cctgctgcca 33420

ggtaagggcg ccctgatctc cactgctgag agctgggcca gcctcgggga cgtgctggtg 33480

acagggcctg tgttggggct ctgagagccc cgggcagttc atttgctctt gatgcaggtt 33540

tctcttatac taaccagtta ataatcacac tttgagaaat ccttatttaa tgcttctaat 33600

taacttttgt ctttctaact gtttacattc tataataaag aagaattaag gaaaatcttt 33660

tctttttctg attattgaag tataacatat ccaccctaaa ccatttgttt ctctgaagta 33720

tgtaatatag aaaaaccatg gatgccataa tcccctttta tttggacatg tatttctcca 33780

ctttttccct atatggatat taatgtttat tattgttatc ttgttgaaca catcccacaa 33840

cgcaaacacg tttgtcactt ggcttttgac ttaacgctta cccttgaccc tttcctatgt 33900

gtgtaggttg tgttttgtcg tgaggattgc cgcattgaag agtctaaggc tgggctagag 33960

gtttcccggt tttattccca ttggcgtatt caggggtatt tatgtcctca ttcctttggt 34020

gacagtcttt taaaatcttt gccaatctga taaaaccatg tgttaacgct tttaaattta 34080

tatttcttta atgattagtg gggttaaaca cattgctatt tatgaattcc acaaattttg 34140

attgagcgtc tgttaggtga gataccattc ttactgttgg tgataaaatc gttggcggac 34200

gggtgacaga acaggtggtg gagagcccag ctccaggcgc gtgtccctgg gccttctcct 34260

ctgtgtggct ctgtgtgctg tccgcccggt tgctggctgc cctcctctgc tgtgtgcaag 34320

gcctgtgtgt gtcggggaag cctttcttgt cacacatgtc atactttttc caatttgttt 34380

tttgcatttg tattttttta ttcagctcct atacatttaa aaaaacacct cagatttaat 34440

ggttgttttt gttttatggc ttctgggatg tgagctttat ttatttccta aagatcgtct 34500

caaggaaaac acattggctg atgtgttttg ttgttgttta tagatggcat gatttgtgca 34560

ggctcttgag tggttttctt ggtagcacgg tatggcagtg tatcatccat ttttgtccgt 34620

tggatgagtc acattggaga cattggcatt gtcttcaagt gtctgctgaa atgtactcaa 34680

aaaacaaaga cccacataat cgttgagtta taatataaat ctagaaaaga taaaactcca 34740

gtacttagaa catatatcct ttaaaagaaa tccacactta acctgattgt gaagaatgag 34800

ttgtttgtag attaaaatta gaaacagtgc ttttcttatg aaaattaagc ttctcctgac 34860

tggcttcctt ggtgactgct gtgacagatt cctttgattt gctgtcccag ttttccacac 34920

gtgagaattc acattccatt ctaaaggatt tacttcctgt aggttccatt agcgttgact 34980

gagttgtgat gcacttgggg tgagctgccc ttctacctgc cctgttgggg cactgtgagg 35040

cctcctgatt gtcagatcag cgatcacagt gggtcggtgc tgctggtctg cacaatggta 35100

gtctttggct tcctcatgtt tctgccacct ggagaggtgg ctttttgtgg gctgtcactc 35160

cgtctgtgaa tggcagccgc ctccgtgagg tgggccatga gcacaggggc actgatgatg 35220

cagaccagtc ctctcggcac tcacagactg tgccctgtgc atggtgattg acagggcctt 35280

tgccagtgcc aagtgccacc cgtgcccatt gtgttcgcct gtctgggctt tgctggtagg 35340

gtctggaaga gtttcagtgg tgagggcctg cttcagagtc acttgtatga gaagatccaa 35400

aacatgtgga cgatggtgtg catgtgggga gggtctgaca tagccttttt gctgcaggga 35460

atgacgttgg ccggagctcc tatggcgcca tgcaggtgaa gcaggtcttc gattatgcct 35520

acatagtgct cagccatgct gtgtcaccgc tggccaggtc ctatccaaac agagacgccg 35580

aaaggtaatg ggttgtgtgt ctgcgtctgg gctcagcgtg cctgtgggat ggtacttatc 35640

cctttcctgt gtcatttacc tccatgaaat ttatgaaggg atgttctgcc gtatttcagt 35700

agaatctaga tatgttggtg aaggaaggcc ttctaggaat atgggatggc tgtgtgggat 35760

tcatccatgg ttgagagttg aaaatttctt tcttggagat ttgacatttt cttcagggtc 35820

ttttgttttg gggaggtgat ttctggcttt taaaattcag tccctaccat cttctcttat 35880

gtacactcgt cccttgttct acattttggg gcatttttac agtcccaaaa tgtagtcaga 35940

agtatttact tctcacccag atcattctgt ggtagtggaa agggtggtat ttgaaggggt 36000

gggagatgag ataggaatgg gaaggaagag taacgtggtc gtcaagagtg gaattcgaaa 36060

cagtttgata gatctgttct gtggtggatg atggaataaa caggtttcga ggcctggctc 36120

agcagccgct gcaggtgctg gtggtgctgg agctctgtgt gttcctgagc cgctgtctgc 36180

tcggtgtttt caggcggagc tctgggcccc atgtagggca ctcgtctcgg taccgtctcc 36240

attctcgtcc gtgcagtggg aagtgaaatg tcagcactgt atgatcatcg tgggtgggaa 36300

ggccccgctc ccctacttgg agctgcattt cacagtggtc ttctgtaggt agatgtactg 36360

cgatcccagg gtatgcttga gctgaatcat taaaagtcag agatatttgt caacgtattt 36420

tagctccttt cctactgtcc ttcacctagc gagatgatct gttaggggta taaggtagct 36480

gttcgagagg ggttctcagc tccctgacac ctgttgtact ctgttgatct ccaacaatgt 36540

ccctttgcag tactttagga agaatcatca aagtaactca ggaggtgatt gactaccgga 36600

ggtggatcaa agagaagtgg ggcagcaaag cccacccgtc gccaggcatg ggtgagagat 36660

taattcattt gtgttcatcc taaccactgg ctggcatgtt catgcagaag tgtctctatt 36720

cctttgtggt aaattggtca aattaagaaa atagctagtt tttctgatga gcattaatta 36780

agaagacaat aagatctaga gcagcactgt ccagtagaag caatataatg catgccacac 36840

atagaatttc aaagtttcta ggctgtgtca aatgtgaaaa gaaacaggtg aaataatttt 36900

gatagatttt attccactca agtcaaaata ttaacatttc aacatgtaat caacataaaa 36960

ataattaaga tattttatag ctgtttcttg tactgtctga aatccggtgt gtatttattc 37020

gtacttatag tacatcctaa ttaggatgct aaattttcgt aaaaaatact tgatctatat 37080

ttagatttta gaaagttcac agttgaagat gatttgcata cccaagttat tacaaacatg 37140

tttaatgttt tccaacaact aattgaatgt aatttttaaa attaaattag gcaaaaccta 37200

atgttgggtt tgttagtcac attagcagcg ttcccggctc agcagagccc gtgactgatg 37260

ctgccggggc ggctccacgc cgcagttctc aggagttatt aaccaaggct ttttccctcc 37320

acagacagca ggatcaagat caaagagcga atagccacat gcaatgggga gcagacgcag 37380

aaccgagagc ccgagtctcc ctatggccag cgcttgactt tgtcgctgtc cagcccccag 37440

ctcctgtctt caggctcctc ggcctcttct gtgtcttcac tttctgggag tgacgttgta 37500

agtgccctcc cctcctccgt gtgtctgttg gacagtttgt gtctctggta aatgtccata 37560

gccgcgagct taaaatctcc cccttggttt tgctcaggtt ttgtttcctt gtatgtgtgt 37620

ggaggtgggt ggggggcagc cccgtgatgt gggcaccagg cttcctttcc cctgccgtga 37680

accttcagaa cctgtctgtg cgactcatgc ggctgtcgag ggcagtaatc ctctaaatgg 37740

ttgaactaca gtggacttcc ttgagtagtt tttaaaaatt tatttgaaga ttaaaaaaaa 37800

aattaaatcc aagtatctct tctgtatttc ctttaacatt ctttttcagt tgtgatgaaa 37860

ttacttgaag gaagcctggg taggtttggg ctgcctgttc agaagttaga cttaatttga 37920

ataacctttc atagccagcc tggatgcagg cgtttctttt catagcttta aggaagtagt 37980

agtgcacctt tgtggtacag ctgtcctttt tgttttttgt accgggttca aggattcaga 38040

cacaccgccc tgcacaacgc ccagtgttta ccagttcagt ctgcaagcgc cagctcctct 38100

catggccggc ttacccaccg ccttgccaat gcccagtggc aaacctcagc ccaccacttc 38160

cagaacactg atcatgacaa ccaacaatca ggtacgtggc cctctggcac ccttcccgct 38220

ggtggcccct gggaacagca tccgagctgt gatatgcact agaggagatt gatggtcctt 38280

tgaattagaa gagtaacttt ttgagtattt ggccattggt gtgttgttct aggaaatcct 38340

ctcttttttg tggtgttgag gtcccccatg tatagtttca gcagcgagga cactgtggtt 38400

cttgagtgct gccgtggctt ttcacggggg ccaggttgac tgccttcctg caagtttcct 38460

cactgcccca gcatgagact gctgtcgagg gtcatcttga gagagcgact cagtcacgac 38520

ccacttagct gggcgccaag ccgtgccaga cacttgtccc tacttcctct cagaatctca 38580

atgaaagttt taatgtgaac ttattagact tttttcatgt ttgaaattag gcataatttc 38640

taaggctttt tctgttggaa tatactgttt ttaaaattta gataaaatta gaaatctaaa 38700

ggataatttt ataaatacta aattttgtat ctacttgcga ttatacatca cttgaatatg 38760

tgtgggtata aaacccaaca tgttaattga cttaaaacca ttttctgaaa tgtggggtat 38820

aatttgagca taaagctatg taggtacatg caaaagtgtt ttgactcatt tcttggagtt 38880

ttgcactctg ctctggggaa gacattctca caggatccac cgtgattctg gcggagcttc 38940

tgggatgctg gctctgtaat gacccacaga gctgatgagc agagccatgg cccagccgga 39000

caccgtaacg tgtctaattg cagcataagt gtaaaattca ggggcaatta tttacactct 39060

taaaatgaat tataccacag ataaacttgg tcgccttttt atggtcatca cagtggccct 39120

gacgtcctgg ccatgtgtca caaaggtgtt tgttttaacc acccacaagc cttggggccc 39180

ttgagagccc agtgcggctg ctgagctaca gagccacact ctgcggctgc ttgtgtggtt 39240

cgagtgtgaa gtccagggac gctgagggtt tataggtttt tatctaagaa gactcttggc 39300

cacagtcaat ctccagaggt tgttggggta aatgcacggg atgccaagat gcaaccaggt 39360

cagtattgca agtctgagaa aaggggttct cgttagcgca cttctgctgc tgacagtaac 39420

gggtgatgct gacatagaag cagcctggga cctggacagc aggcaaggaa ggaactgcca 39480

gccgtcccac ggcctctcag gccaccagtt gggccagcct tgggctgtga cccctgagtt 39540

cagcgtgtga gtagggggtt caccacgggg gtgacggttg ttcttctgat gactctaatg 39600

tcttgatcgt ttgatcttca atgagtttca aactttatga cttggattac tgggcatact 39660

ttatatgcca gttgctgttt tagaatacga agtatttcca attcaaagca caatattgtt 39720

aggtaatagt aaaacagact gctctatgga gcccacatgc aactgtgcca tttatcagct 39780

gccctttggt ggtgctgagc ttagaagccg gatggttttc ctctgattgc tttggtaccc 39840

atggccgtct ctcattttgt tcctagacca ggtttactat acctccaccg accctagggg 39900

ttgctcctgt tccttgcaga caagctggtg tagaaggaac tgcgtctttg aaagccgtcc 39960

accacatgtc ttccccggcc attccctcag cgtcccccaa cccgctctcg agccctcatc 40020

tgtatcataa ggtatagctc tgtcctggtg cattcaccta cctgttcaag ctgccatgtg 40080

agaggcggtg ctaaatgttt tctcctccag agagaattcc agagagatca tttgaaaacg 40140

gaatttgctt tgttgtcatt cagcctgttt gcttgtcttt ccaaacaaaa cttaaaaaag 40200

ttaaattatt ttaagatgta atatatagtt taattggttg ccacaaacat ctcttaattc 40260

ctctgttgaa ctgattagca taaaactgaa gtttgaaata aggctcaaaa tgaagacttt 40320

tcccatttac ataattcatt tatatgctaa ataccttggt tttcaagaag caaatgataa 40380

aaccaagagc agatcttgcc atgatgtccc gtgtatgctg ctgtcattcc cacgttgcct 40440

gatccccgcc tggggcagga gcaagcgtca gggctggcag agctgtgtgc tgggcctcag 40500

cagggccctg gcatgcgtgc ccttgtggct cctctcaagt ccagctgtgt gcatggagga 40560

aacaggtcac gttaagtctc tatattcttg aagtacctga atgattggga gagccatggc 40620

gaggatcttc caggtcagcc cccgtcgtgt gtgatgttcc ttgggctctg cggatgctcg 40680

gtgctttcat cggtgtccac acctctttat tccgctcctc ctttgcttgt ctaatcctat 40740

tttgccagta agttttttat tcttgaggct ttgttggccc tgtgttgtat gatgattgtt 40800

tttaggagtt aagtaataga acatttcctc ttggatttat ccatccccga tagacacatt 40860

cagggtgaaa gaacaacttc gcacaccggc ctcttctttg cattttggct ttgctttccc 40920

agtctcctcc tgctgttttt cttgctctga gactttcctg aagccggcgt gtgttccctc 40980

tcagtctgct tggccgcgac tttgcagtgc agggaatgtg ctttgggtgt agcccaagca 41040

caggctgctg catgctggga tcgacaggct gctgagggcg agagcgccag gtcctggcac 41100

gtgtgacttg cttggttctt tctagaaggt cacagctggg ggaagaacat gacagggacc 41160

ttcttacttc tgtttttttg gagacagaat ctcactccat cacccaggct ggagtgcagt 41220

ggtgtgatct cagctcactg caacctccgc ctcccgggtt caagcaattc ttgtgcctca 41280

gcttcttgag tagctggaat tacaggtgtg tgccaccaca cccagccaat ttttgtattt 41340

ttagtagaga cggggtttca ccatgttggt caggctggtc tcaagctcct gacctcaagt 41400

gacatgcctg cctcggcctc ccaaagtggt ggaattacag gtgcaagcca ttggcacctg 41460

gctagggacc ttcttatttc tatggataag tggaacaagt tagaagtgag gttctgctga 41520

atttgtgtgg tttgatcctg gtacatggtt cttgccttta gtcattcacg gaatgggaag 41580

aatgcttttc tctcagatgg aggagttggg aagtcccaga gggcaggtgt ccatccctgc 41640

tctctatgta acatcacgtc ggtgcttagt gtggtcactg cccgaggacg tgggcattgt 41700

gcctgctgtc tggctccaac actgctgtct ctctctttct ccagcagcac aacggcatga 41760

aactgtccat gaagggctct cacggccaca cccaaggcgg cggctacagc tctgtgggta 41820

gcggaggtgt gcggccccct gtgggcaaca ggggacacca ccagtataac cgcaccggct 41880

ggaggaggaa aaaacacaca cacacacggg acagtctgcc cgtgagcctc agcagataat 41940

ggctcctggc tgcgtcagcc tcccccaccc ctctgcagac tgccccgcgg cctcggccac 42000

cggcagggga accgagacca gcaccccgca cgtcagccgg gctcgcggca cgcccgccgc 42060

tgatcactct gcatgtttct tcgtgtggtg gtcgcgtcca tcttcaagaa cagctcgttg 42120

tgctcatctg tgaagcctta ttaaacgtgg acgttgtttt ctgccttccc aggattcttc 42180

cttcagtgct gaggcaggtc gggctcagga actgcaggga cgtgaacatg cgcttgcggt 42240

ttgaggtagc cgtgtctgtt ccttcgcggt ttgctatttt catttcctgt tcgtcaaagc 42300

agcagaggag atcaaacccc gttcgtgtgt ctttcctcca cggataagct tgggaggtca 42360

ttgttttact gccctcacat tttgtttgaa atttcagaac tgtttttcta tgtaaatatt 42420

gaaaacttat gatttgtgca ataactcaga tattttttat ttaatttcct attttcacat 42480

aagttatatt taagggagga gggaattttt tttaaacaag cttaggtcct ttcccgagct 42540

gcattttcta agttgggtca tcgtgtcggc tggttgtctg acgagcatcg ttacaaacac 42600

catgatgagg ggtttggggt tttattttga tgtcttttct tttggtcgga agtgagtgaa 42660

ggagccaggt cgccctgaag gttttccaaa gggcttggct ccagagccac ctggcagact 42720

gcccgtggcc ctgctgtcgg gccccaggcc gttgtcctgc tctgaccaca gagttttaat 42780

gttttggttt tcacttcttt taaactggac aacaaatcca gcatttcaag tgccagaagt 42840

ataactttct aaggagagaa gggttgtcac attataaaat ctttaggaaa atgtgaactg 42900

gaaaacgctt cggtcagttt tagtgacata gcctgtgatg atgggtctgg tgactattat 42960

tgcggaccgt ggtacccagt tttaggaatg tggagaaagg aattctgttg attccgttga 43020

ggaatctgta gcgtatgcat tcgttctgtt aagagcaaat ctaggagaag tgcttcagct 43080

gcccagtgcg ccgtggggag tgttttaacg gatcgtgtcg caggagagca cagcccagcg 43140

ttggggccgg gaccgctggc gcccgacgtc ggaagcatac aggtatacta tgcaagtgta 43200

ttctgccaca acaaccactg tctttgttac ctttttttga acaagaatat atccatcctg 43260

cctaaccctg agtttttgga gcaccacagt tgtcctggga gttggttgca tcttgtaggc 43320

catctgactt cctgttttta aaacgggggt ctggtcttgc taaacactac aggtaggttg 43380

gtctttgaag tccactagtg gagaatgtca agacaagata cttattacca tgacatctga 43440

tgcatgtgca gcagtgggga gttctagatt gatctctgaa tgtgatcgac gcccagcaag 43500

gacaagcttt aaaatgtctg cggtctgccc ttttgaagca ggactggctc actctgtcat 43560

tgggagctgt cagctgcgac tgcaggttct ctaggaggca ttccagaata gagtagcaca 43620

ctgtgtctgc agttctcgat gaccgaaagt tatcaaaaat atttaaaata tttaaattgt 43680

gaacctattg ataaagaata tttataaaaa ctgatctgta ggcctgtact aatctctacg 43740

cattagcaat attgactgta aacccacatt aaggaaacca ctacgggtct ggcagtgcgt 43800

gtcccgtggg gtgtgcattt taaaactcga ttcatagaca caggtaccat gttccatttc 43860

cgtcatggtg aagcaaatga attggcctgg ctaccactgt ggtcgcgtgc tacaggtttg 43920

acaaaaagat atcatgtttc gatttttttg tgtgtggaca acaatatgga agctaaaatt 43980

gacatatttt tatgtaaagt ttttctattc tttgattttt aataaacttt ggaaaccagt 44040

tt 44042

<210> 12

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 12

agggtagatg tgtttaact 19

<210> 13

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 13

cagcctaaac ttagtgg 17

<210> 14

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 14

aagccctcaa tgtaaaacac 20

<210> 15

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 15

aatagcaagt agaggagag 19

<210> 16

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 16

aaataaggat actggcga 18

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 17

gagggaacac ataataaaag 20

<210> 18

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 18

gtaatacctc tcacattc 18

<210> 19

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 19

agtaacacca atctcattg 19

<210> 20

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 20

gtgacagtat tcaatgatc 19

<210> 21

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 21

cagttccgta tcaccaac 18

<210> 22

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 22

aagtctaact caaagccatc 20

<210> 23

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 23

aggcttccat tttattgaa 19

<210> 24

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 24

ttttagaaaa cgaggcta 18

<210> 25

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 25

gtattcttat tcttgct 17

<210> 26

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 26

attattccca cagtaaga 18

<210> 27

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 27

aacaacaaac aggatgggc 19

<210> 28

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 28

atatccacaa tattctgat 19

<210> 29

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 29

aaagaaataa tgtcgtctgg 20

<210> 30

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 30

ccagagtaaa caaatcc 17

<210> 31

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 31

attcaacatt tttagtcacc 20

<210> 32

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 32

tttggtaatt ctttttttag 20

<210> 33

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 33

caatgaggaa acaagagtca 20

<210> 34

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 34

ttcaaaataa tgtgggaggt 20

<210> 35

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 35

ggatatttga tacggcaaat 20

<210> 36

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 36

ctataagaag caaaccc 17

<210> 37

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 37

atataattca cgtttcactt 20

<210> 38

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 38

aatgattcac atgaaggtta 20

<210> 39

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 39

gttaggattt tgctatg 17

<210> 40

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 40

gtacaaatat caaccgtat 19

<210> 41

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 41

cacactattt caagatgcta 20

<210> 42

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 42

cacctataca atggagtatt 20

<210> 43

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 43

atcatacgtc attagagaac 20

<210> 44

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 44

cagaacagat actttgcca 19

<210> 45

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 45

aagaatggtt ggttaaggg 19

<210> 46

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 46

agaattggta aactggactg 20

<210> 47

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 47

agaattatat tggctgg 17

<210> 48

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 48

cctaaaccag acagaaaaga 20

<210> 49

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 49

accaattaga gcagaaatc 19

<210> 50

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 50

ttctaaataa cagatgggtc 20

<210> 51

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 51

tttataattt ttttccatct 20

<210> 52

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 52

gcaaatatca gattaacctc 20

<210> 53

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 53

aacggtatgg cagaagacaa 20

<210> 54

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 54

ttcaaccttt actgcat 17

<210> 55

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 55

actgataaag ggcatttcaa 20

<210> 56

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 56

cagtaggaat gtggctt 17

<210> 57

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 57

ttttatggca gggtttcac 19

<210> 58

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 58

tcactgttaa acctcac 17

<210> 59

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 59

caattttcta attcaatggt 20

<210> 60

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 60

aagatataat tcacccact 19

<210> 61

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 61

gccacataaa ggataaagt 19

<210> 62

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 62

cccattagaa gtaaggtga 19

<210> 63

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 63

atgtaaatta aaacttccc 19

<210> 64

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 64

tgagagcata aaagtacgga 20

<210> 65

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 65

ttcacaacag gtaaaggg 18

<210> 66

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 66

tgcattccta agtaacataa 20

<210> 67

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 67

agagaaaagt gatgagggaa 20

<210> 68

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 68

atacggatca ccagctaaa 19

<210> 69

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 69

catgttatgc acagaagat 19

<210> 70

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 70

cgctgaagaa ctaagtatta 20

<210> 71

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 71

caaacagatg gtggtgata 19

<210> 72

<211> 16

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 72

agtagccatt aggatg 16

<210> 73

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 73

atacacaggc tccataata 19

<210> 74

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 74

gatttttgta tagtccacaa 20

<210> 75

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 75

gcatctataa aaaagggaca 20

<210> 76

<211> 15

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 76

agtgcaagta tcgct 15

<210> 77

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 77

ccaaaagaat caagttcgta 20

<210> 78

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 78

cctcagacca aatttattt 19

<210> 79

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 79

ttcaacaagc atctattgta 20

<210> 80

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 80

caaaggttgt tgtactct 18

<210> 81

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 81

tcataaatct ttttccacg 19

<210> 82

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 82

cttgttacgg atttaatgtg 20

<210> 83

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 83

gctataaaaa tagaagcc 18

<210> 84

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 84

tccttagcaa actaaacat 19

<210> 85

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 85

agcaaaaggc aggtattcaa 20

<210> 86

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 86

gaatccattt acatattcac 20

<210> 87

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 87

tccagtatcc aaaacatac 19

<210> 88

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 88

agcttaaaga agaacggtt 19

<210> 89

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 89

cacaacgtgc ctacctt 17

<210> 90

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 90

ccagaatcca agaaaatgg 19

<210> 91

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 91

tcacctcgaa ctaaacaagt 20

<210> 92

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 92

gtatctttct gtactatt 18

<210> 93

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 93

gtcattctac taacaaacg 19

<210> 94

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 94

tggaaaagga agaaccatt 19

<210> 95

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 95

aatacaactc ttccgtgat 19

<210> 96

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 96

aataccctga cgagctg 17

<210> 97

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 97

tcataaaaca tgatccttgc 20

<210> 98

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 98

ctaaagcaga tccatagaa 19

<210> 99

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 99

agactataac ttttgctaca 20

<210> 100

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 100

agcaatgact tgaacatagt 20

<210> 101

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 101

ataaaacaag catacgggc 19

<210> 102

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 102

atgagatacc agcagatag 19

<210> 103

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 103

agaagaaatc ctgagtaatc 20

<210> 104

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 104

ccctaaaaag tgacgta 17

<210> 105

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 105

ttaagttaga tcacggc 17

<210> 106

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 106

gtggatacag aaagcca 17

<210> 107

<211> 16

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 107

gtatcggcag gagatt 16

<210> 108

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 108

taactaattg attccattgc 20

<210> 109

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 109

agaagaacgg aaattgcc 18

<210> 110

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 110

ataatgattt tcctatcc 18

<210> 111

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 111

atggttttgt ggagaagg 18

<210> 112

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 112

tgctgctgtg aaaagaaatg 20

<210> 113

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 113

gtgtccaatt ttttattat 19

<210> 114

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 114

gatggaatca actgtgtagt 20

<210> 115

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 115

gatggtgaca aattattct 19

<210> 116

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 116

tgcttttggg aatcttt 17

<210> 117

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 117

gatgtcctac aatgaacacg 20

<210> 118

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 118

gtacaaggac aaagtaacc 19

<210> 119

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 119

tgaaacgcct atctcta 17

<210> 120

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 120

atactattta tgcttatgga 20

<210> 121

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 121

ttgtaatcaa ggcaataagg 20

<210> 122

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 122

gaagtccaat aacgcaga 18

<210> 123

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 123

atatccaatc tctatatgtg 20

<210> 124

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 124

gccttacaca agactatatt 20

<210> 125

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 125

tgctgaattt tatgttaac 19

<210> 126

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 126

cacaagatga tgggtttaag 20

<210> 127

<211> 16

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 127

ttagtggttt gggtgc 16

<210> 128

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 128

agattgttac cttactgat 19

<210> 129

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 129

tattacaaat atcaatctcc 20

<210> 130

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 130

taccaaaagc atagagtgg 19

<210> 131

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 131

aattatcttc ccgctac 17

<210> 132

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 132

gttgggtgga ataggca 17

<210> 133

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 133

tcgatttccc gttccaa 17

<210> 134

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 134

acaacctaca cataaattgc 20

<210> 135

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 135

actataagaa ctcccaaca 19

<210> 136

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 136

gagaaaaaga gttacaagc 19

<210> 137

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 137

aactggaggg agagaagag 19

<210> 138

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 138

tttctaagag cagaggtaca 20

<210> 139

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 139

agaagtaaca agagcct 17

<210> 140

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 140

agtatcaaac cagacctc 18

<210> 141

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 141

ccacaaccga aagactt 17

<210> 142

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 142

aatacacact gcattttca 19

<210> 143

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 143

ccaggtagat agcacag 17

<210> 144

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 144

ccatgacaaa gtaacaacag 20

<210> 145

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 145

cagaatttcc tttgagtta 19

<210> 146

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 146

ccttcgcaag aaagaattga 20

<210> 147

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 147

tcatacatac acgcttct 18

<210> 148

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 148

tgcgaaaaga ttggagg 17

<210> 149

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 149

cacaggacgc ttacatgaat 20

<210> 150

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 150

gctgtttttt tttcttaac 19

<210> 151

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 151

accataagtg agtgttctt 19

<210> 152

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 152

acacaagccc atagaaacag 20

<210> 153

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 153

cagtagtaac caccaag 17

<210> 154

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 154

cctgcaaact tttatttat 19

<210> 155

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 155

acttagtaat agcagca 17

<210> 156

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 156

atgaatactc cgaagactt 19

<210> 157

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 157

aaagaaaagg atcacaagcc 20

<210> 158

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 158

agacagaaat cacctaaca 19

<210> 159

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 159

tagaacagac attattcatc 20

<210> 160

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 160

agttacacgg agcagcac 18

<210> 161

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 161

cactatacac agaacactat 20

<210> 162

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 162

agctgtctaa atacatgg 18

<210> 163

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 163

atgaacctat tttatgcttc 20

<210> 164

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 164

accatcatta acctgcgt 18

<210> 165

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 165

agtaaagtgc ccagatgt 18

<210> 166

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 166

ttccctatga aatcctcaa 19

<210> 167

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 167

cactcttcat agaatgcaac 20

<210> 168

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 168

aatgcttaat ttttctctct 20

<210> 169

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 169

ttagagacga tgcctataac 20

<210> 170

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 170

tgaatagttc ccatagatt 19

<210> 171

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 171

cagcataatt gttttcttt 19

<210> 172

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 172

atgtcattat gttttagtt 19

<210> 173

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 173

cagcagtatc tcttagaa 18

<210> 174

<211> 16

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 174

cggtaagggt tcggtg 16

<210> 175

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 175

catgaaccac attaggaac 19

<210> 176

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 176

cattcaacac acacgacaa 19

<210> 177

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 177

aagtatccaa gactcaaga 19

<210> 178

<211> 16

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 178

ccacagaaac accgag 16

<210> 179

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 179

tggaaaaggg aagggaaga 19

<210> 180

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 180

agagagtccg aagcctg 17

<210> 181

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 181

atgggaaagg taacgagc 18

<210> 182

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 182

ctatcctaca agtccgaa 18

<210> 183

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 183

cattgctttt ataatccta 19

<210> 184

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 184

ctttttaagg acaggagg 18

<210> 185

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 185

gatgaaagat aagtgagcat 20

<210> 186

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 186

gaagcctgta ataattaagc 20

<210> 187

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 187

caccctagta aagcaaac 18

<210> 188

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 188

gcaaatgtaa gccttttt 18

<210> 189

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 189

acctgacagc taccgac 17

<210> 190

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 190

aagagtgggt tgtaagc 17

<210> 191

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 191

tagtgaaaat atttggagtt 20

<210> 192

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 192

tttcagcacc ttaaaccc 18

<210> 193

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 193

ttaagggaaa ggaaacgtca 20

<210> 194

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 194

gtaggtaaag ggcaaaggaa 20

<210> 195

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 195

gtgaattaaa gccaaagc 18

<210> 196

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 196

tgtttttgta ttttagtat 19

<210> 197

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 197

gaggtttttt ttagtgaatt 20

<210> 198

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 198

gaggagctaa acggaca 17

<210> 199

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 199

gtttagtctt atgttctcac 20

<210> 200

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 200

caaatactga atatgcccg 19

<210> 201

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 201

accatttaaa tcgccaac 18

<210> 202

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 202

cagtaagagt agcccaacaa 20

<210> 203

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 203

taacggcaac atcaaatagc 20

<210> 204

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 204

actgagcacc aactacac 18

<210> 205

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 205

cctaatttta tgtatcacat 20

<210> 206

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 206

ctaggaatta taacaaatca 20

<210> 207

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 207

actccaaaga acatactcac 20

<210> 208

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 208

taagagaaac aatcacacca 20

<210> 209

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 209

tgtcctaaaa tatcagcag 19

<210> 210

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 210

cttttaatga gacagtgca 19

<210> 211

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 211

ttgtagcata agatggaaag 20

<210> 212

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 212

aaactgtagc caataactgt 20

<210> 213

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 213

attcatccta acacaagtag 20

<210> 214

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 214

cacgaaagga acagctaag 19

<210> 215

<211> 16

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 215

acaacaggca agtacc 16

<210> 216

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 216

gctaaacact ataaggat 18

<210> 217

<211> 18

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 217

cccgtaagca tttgagaa 18

<210> 218

<211> 20

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 218

agccaatatg cgacagtaac 20

<210> 219

<211> 20

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 219

taaccaaaac aatcagtgtc 20

<210> 220

<211> 18

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 220

aacagggaac aggagtta 18

<210> 221

<211> 17

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 221

atttatcaac ttccacc 17

<210> 222

<211> 17

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 222

cgtttaagac caggcac 17

<210> 223

<211> 20

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 223

acaaaggaac tcaggaagag 20

<210> 224

<211> 17

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 224

tcacagacaa gcaccaa 17

<210> 225

<211> 20

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 225

tactttttaa aacacgtagg 20

<210> 226

<211> 19

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 226

gcacaatcac aaagaccaa 19

<210> 227

<211> 18

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 227

tcagtaaaga acagaggc 18

<210> 228

<211> 19

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 228

catatttcca ccacacaag 19

<210> 229

<211> 16

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 229

agtaaaccac tgtcca 16

<210> 230

<211> 17

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 230

tcctctttgg cgatata 17

<210> 231

<211> 19

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 231

cataaatacc cctgaatac 19

<210> 232

<211> 17

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 232

cgattttatc accaaca 17

<210> 233

<211> 20

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 233

acaatcaggt taagtgtgga 20

<210> 234

<211> 17

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 234

gaagccaaag actacca 17

<210> 235

<211> 20

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 235

tggtagggac tgaattttaa 20

<210> 236

<211> 15

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 236

cggtagtcaa tcacc 15

<210> 237

<211> 20

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 237

ctatcaaaat tatttcacct 20

<210> 238

<211> 20

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 238

acgaaaattt agcatcctaa 20

<210> 239

<211> 15

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 239

tggtaaacac tgggc 15

<210> 240

<211> 17

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 240

gattgttggt tgtcatg 17

<210> 241

<211> 19

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 241

aattataccc cacatttca 19

<210> 242

<211> 19

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 242

tgcaattaga cacgttacg 19

<210> 243

<211> 17

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 243

ggcaaccaat taaacta 17

<210> 244

<211> 17

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 244

cagttttatg ctaatca 17

<210> 245

<211> 20

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> oligonucleotide motif

<400> 245

gcaaaggagg agcggaataa 20

<210> 246

<211> 20

<212> ДНК

<213> Artificial sequence

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 246

aaacagaagt aagaaggtcc 20

<210> 247

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 247

tccacttatc catagaaa 18

<210> 248

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 248

gctttgacga acaggaaat 19

<210> 249

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 249

ttccgaccaa aagaaaagac 20

<210> 250

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 250

gcgacacgat ccgttaaa 18

<210> 251

<211> 15

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный мотиф

<400> 251

ccccgtttta aaaac 15

<210> 252

<211> 19

<212> РНК

<213> искусственная

<220>

<223> Human PAPD5 target RNA

<400> 252

caucaaugcu uuauaucga 19

<210> 253

<211> 19

<212> РНК

<213> искусственная

<220>

<223> Human PAPD5 target RNA

<400> 253

ggacgacacu ucaauuauu 19

<210> 254

<211> 19

<212> РНК

<213> искусственная

<220>

<223> Human PAPD5 RNA target sequence

<400> 254

gauaaaggau ggugguuca 19

<210> 255

<211> 19

<212> РНК

<213> искусственная

<220>

<223> последовательность мРНК-мишени человеческого PAPD5

<400> 255

gaauagaccu gagccuuca 19

<210> 256

<211> 19

<212> РНК

<213> искусственная

<220>

<223> последовательность мРНК-мишени человеческого PAPD7

<400> 256

ggagugacgu ugauucaga 19

<210> 257

<211> 19

<212> РНК

<213> искусственная

<220>

<223> последовательность мРНК-мишени человеческого PAPD7

<400> 257

cggaguucau caagaauua 19

<210> 258

<211> 19

<212> РНК

<213> искусственная

<220>

<223> последовательность РНК-мишени человеческого PAPD7

<400> 258

cggaguucau caagaauua 19

<210> 259

<211> 19

<212> РНК

<213> искусственная

<220>

<223> последовательность мРНК-мишени человеческого PAPD7

<400> 259

gcgaauagcc acaugcaau 19

<210> 260

<211> 58

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> кшРНК

<400> 260

ccgggccaca tatagagatt ggatactcga gtatccaatc tctatatgtg gctttttg 58

<210> 261

<211> 58

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> кшРНК

<400> 261

ccggccaaca aatctcagca tggatctcga gatccatgct gagatttgtt ggtttttg 58

<210> 262

<211> 58

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> кшРНК

<400> 262

ccggcgcctg taatcccagc actttctcga gaaagtgctg ggattacagg cgtttttg 58

<210> 263

<211> 58

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> кшРНК

<400> 263

ccgggcctgt aatcccagca ctttactcga gtaaagtgct gggattacag gctttttg 58

<210> 264

<211> 58

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> кшРНК

<400> 264

ccggcgatgt tggaaggagt tcatactcga gtatgaactc cttccaacat cgtttttg 58

<210> 265

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> праймер

<400> 265

ctgtgccttg ggtggcttt 19

<210> 266

<211> 24

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> праймер

<400> 266

aaggaaagaa gtcagaaggc aaaa 24

<210> 267

<211> 25

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> зонд

<400> 267

ttctttataa gggtcgatgt ccatg 25

<---

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ лечения или предупреждения инфекции вируса гепатита В (HBV) у субъекта. Способ включает введение эффективного количества композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты и фармацевтически приемлемый носитель, где указанная молекула нуклеиновой кислоты непосредственно ингибирует экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени поли(А)-полимераза-ассоциированного доменсодержащего 5 (PAPD5). В одном из вариантов реализации изобретения нуклеиновая кислота-мишень содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения инфекции вируса гепатита В. 13 з.п. ф-лы, 11 ил., 22 табл., 9 пр.

Формула