Двухцистронная бактериальная система экспрессии - RU2732148C2

Код документа: RU2732148C2

Чертежи

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к двухцистронной независимой системе экспрессии в одном векторе, применяемой для получения представляющего интерес белка, включая рекомбинантные Fab-фрагменты антител или другой фрагмент антитела, пептиды и белки, экспрессируемые в виде нерастворимых телец включения, образующихся в бактериях E. сoli. Также настоящее изобретение предлагает способ экспрессии представляющего интерес белка с применением бицистронного вектора.

Предпосылки к созданию изобретения

Технология рекомбинантных ДНК (рДНК) полностью изменила способ получения терапевтических средств. В настоящее время требуемые белки получают внутри чужеродной клетки и осуществляют их очистку.

Белки с посттрансляционными модификациями (PTM) обычно экспрессируются в виде рекомбинантных молекул в дрожжевых системах или системах клеток млекопитающих. Дрожжевые системы экспрессии, такие как Pichia и Saccharomyces, являются наиболее близкими к системам млекопитающих в части PTM, но все же отличаются по типам гликозилирования, как, например, гликаны с высоким содержанием маннозы в случае Pichia, что делает их неподходящими для экспрессии рекомбинантных белков для использования у человека.

Моноклональные антитела (mAb), антитела, белки слияния, Fab-фрагменты mAb используют в качестве терапевтических средств. В технологии рДНК используют специальные векторы и системы экспрессии для получения терапевтических белков. Cистемы экспрессии включают, главным образом, бактериальные, дрожжевые системы экспрессии, системы экспрессии на основе клеток насекомых или млекопитающих. Изначально, большую часть рекомбинантных белков экспрессировали в бактериальной системе экспрессии с использованием E. coli в качестве хозяина. Существует ряд преимуществ от использования E. coli в качестве хозяина для экспрессии, таких как простота клонирования, простота экспрессии, сокращенные сроки, сокращенные периоды инкубации и высокие выходы. Таким образом, белки, не требующие каких-либо PTM, могут надежно экспрессироваться в E. coli.

Необходимость в экспрессии Fab, представляющих собой антигенсвязывающие фрагменты mAb, в системах млекопитающих отсутствует, поскольку они не содержат сайты гликозилирования, присутствующие в Fc-части антитела. Таким образом, экспрессию Fab обычно осуществляют в системе на основе E. coli. На протяжении 1980-90 несколько исследователей предпринимали попытки экспрессировать Fab в E. coli. Plückthun Aet. al.,1990 Behring Inst. Mitt. (87): 48-55 являются одними из самых первых исследователей, которые сообщили о секретировании Fab антитела из E. coli. Williamson R.A. et. al., 1991 Biochem J. 277 (Pt 2): 561-3 сообщили об использовании векторов на основе бактериофага-лямбда для экспрессии молекул Fab в E. coli. Система фагового дисплея используется для получения фрагментов Fab, бивалентного антитела или химерного антитела в E. coli.

Кроме того, Fab получали в E. coli в виде неправильно свернутых телец включения, а затем их подвергали рефолдингу с получением функциональной молекулы и, таким образом достигали 40% повышения выходов антител.

В большинстве упомянутых выше исследований использовали один промотор, т. e., phoA для управления экспрессией как тяжелых, так и легких цепей. Сайт связывания рибосом (rbs), присутствующий между последовательностями легких и тяжелых цепей, управляет транскрипцией и трансляцией второго гена.

В US5648237 также использовали аналогичную стратегию с одним промотором (phoA) для экспрессии генов Fab в E. coli для достижения секреции продукта. Основной недостаток упомянутой выше стратегии заключается в том, что уровни экспрессии второго гена обычно ниже, чем первого гена, что таким образом ограничивает выходы функционального Fab.

В патенте под № WO03018771 раскрывается способ получения антитела при помощи двух функциональных единиц трансляции, кодирующих, соответственно, легкую и тяжелую цепи определенного антитела или фрагмента, где обе цепи экспрессируются последовательно, со специфическим разделением тем самым получения легкой и тяжелой цепей и обеспечения возможности сборки легкой и тяжелой цепей.

В патенте № EP1356052B1 раскрывается способ получения полных антител в прокариотических клетках. В системе присутствует первый промотор и первый цистрон для получения легкой цепи иммуноглобулина, и второй промотор и второй цистрон для получения тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом обе цепи подвергают фолдингу и сборке с образованием биологически активного иммуноглобулина.

Краткое описание изобретения

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к двухцистронной независимой системе экспрессии с одним промотором, используемой для получения рекомбинантных белков и пептидов, экспрессируемых в бактериальных клетках в виде нерастворимых телец включения.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения двухцистронной независимой системы экспрессии в одном векторе, имеющем два разных промотора, для получения рекомбинантных белков и пептидов, экспрессируемых в виде нерастворимых телец включения в бактериальных клетках.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к двухцистронной независимой системе экспрессии в одном векторе, имеющем два разных промотора, используемой для получения фрагментов антител, экспрессируемых в виде нерастворимых телец включения в бактериальных клетках.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к двухцистронной независимой системе экспрессии в одном векторе, имеющем два разных промотора, для получения рекомбинантного Fab-фрагмента антител, экспрессируемых в виде нерастворимых телец включения в бактериальных клетках.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к двухцистронной независимой системе экспрессии в одном векторе, имеющем два разных промотора, используемой для получения рекомбинантных пептидов, экспрессируемых в виде нерастворимых телец включения в бактериальных клетках.

В другом варианте осуществления двухцистронная система экспрессии содержит

a) первый цистрон, содержащий промотор, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок;

b) второй цистрон, содержащий промотор, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок;

где первый и второй цистроны расположены в одном векторе и экспрессируют полинуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок в виде телец включения в бактериальной клетке.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к двухцистронному вектору, содержащему промотор, функционально связанный с сайтом множественного клонирования, содержащим представляющий интерес ген, сайт связывания рибосом и терминатор.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения представляющего интерес белка с использованием двухцистронной системы экспрессии.

Подробности одного или более вариантов осуществления настоящего изобретения, изложенные ниже, являются исключительно иллюстративными по своему характеру и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения будут понятны из описания.

Краткое описание прилагаемых графических материалов

На фигуре 1 изображена схема бицистронного вектора.

На фигуре 2 изображена карта вектора клона pET21a-HC-LC.

На фигуре 3 изображены результаты анализа в SDS PAGE нерастворимой осадочной фракции из клона E. coli BL21A1 вместе с контролями и эталонным продуктом.

На фигуре 4 изображены результаты анализа с помощью RP-HPLC для образцов растворимых IB с пиками LC и HC, отмечаемыми для клона, по сравнению с молекулой восстановленного Fab.

На фигуре 5 изображены циклы HPLC с отделенными пиками, соответствующими тяжелым цепям, от пиков, соответствующих другим белкам.

На фигуре 6 показано значимое повышение экспрессии клона SAK-Lira в двухцистронной конструкции по сравнению с одноцистронным клоном в линии клеток E. coliBL21 A1.

На фигуре 7 показана карта вектора pBAD24M-LC.

Подробное описание изобретения

Определения

Используемое в данном документе выражение «представляющий интерес белок» в данном документе относится к любому полипептиду, включая белок и пептиды, используемому в отрасли получения биотерапевтических средств или для диагностических, или для исследовательских целей.

Используемое в данном документе выражение «полинуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес белок», в данном документе включает ДНК, кодирующую ген, предпочтительно гетерологичный ген, экспрессирующий полипептид.

Используемые в данном документе термины «рекомбинантный белок и пептид» относятся к белку или пептиду, которые продуцируются в результате экспрессии рекомбинантной ДНК в живых клетках.

Используемые в данном документе термины «Fab» и «антитело» используют взаимозаменяемо, поскольку антитело содержит две части, т.e., Fab- и Fc-участок.

Используемый в данном документе термин «вектор» относится к молекуле ДНК, используемой в качестве носителя для искусственного переноса чужеродного генетического материала в бактериальную клетку, где он может реплицироваться и экспрессироваться.

Используемый в данном документе термин «цистрон» относится к части ДНК, которая содержит генетический код для одного полинуклеотида и функционирующей в виде функциональной единицы наследственности.

Используемое в данном документе выражение «двухцистронная независимая экспрессия» относится к двум отдельным цистронам, которые используют для независимой экспрессии двух одинаковых или двух разных белков.

Используемое в данном документе выражение «одинаковый» является взаимозаменяемым с идентичным или подобным.

Выражение «двухцистронная независимая система экспрессии», используемое в данном документе, включает полинуклеотидную последовательность, кодирующую подлежащий экспрессии полипептид, и последовательности, контролирующие ее экспрессию, такие как промотор и необязательно энхансерная последовательность. Промотор по настоящему изобретению либо функционально связан с подлежащим экспрессии геном, т. е. функциональной единицей транскрипции, либо отделен от нее промежуточным участком ДНК, таким как, например, 5'-нетранслируемый участок гетерологичного гена. Предпочтительно система экспрессии фланкирована одним или более подходящими сайтами рестрикции для обеспечения встраивания кассеты экспрессии в вектор и/или ее вырезания из вектора. Таким образом, система экспрессии в соответствии с настоящим изобретением может быть использована для конструирования вектора экспрессии, в частности, бактериального вектора экспрессии.

Используемый в данном документе термин «промоторы» относится к регуляторному участку ДНК, как правило располагающемуся против хода транскрипции гена, обеспечивающему контрольную точку регуляции транскрипции гена.

Используемое в данном документе выражение «функционально связанный» относятся к функциональной взаимосвязи между двумя или более сегментами ДНК в конкретных последовательностях подлежащих экспрессии генов и к последовательностям, контролирующим их экспрессию.

Используемый в данном документе термин «малые пептиды» или «пептиды» относится к пептидам с массой в диапазоне от 2 до 10 кДа, используемым в отрасли получения биотерапевтических средств и для диагностических или исследовательских целей, к таким как лираглутид, эксанетид, PTH и т. д.

Настоящее изобретение предлагает двухцистронную систему экспрессии для получения ряда представляющих интерес рекомбинантных белков. В определенном варианте осуществления двухцистронная система экспрессии содержит два цистрона, имеющие промотор, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок, и с терминатором.

В определенном варианте осуществления двухцистронная система экспрессии содержит два цистрона, экспрессирующие полинуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, которые расположены в одном векторе.

В одном варианте осуществления двухцистронная система экспрессии содержит:

a) первый цистрон, содержащий промотор, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок;

b) второй цистрон, содержащий промотор, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок;

где первый и второй цистроны расположены в одном векторе и экспрессируют полинуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, в виде телец включения, образующихся в клетке-хозяине.

В одном варианте осуществления промотор может быть выбран из промотора T7, арабинозного промотора, промотора phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, trp, trc, а предпочтительно из промотора T7 и арабинозного промотора. В определенном варианте осуществления двухцистронная система экспрессии содержит два цистрона, экспрессирующие полинуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, под контролем двух промоторов. В одном варианте осуществления оба промотора контролируют экспрессию полинуклеотидной последовательности, кодирующей один и тот же представляющий интерес белок. В другом варианте осуществления оба промотора контролируют экспрессию полинуклеотидной последовательности, кодирующей представляющий интерес белок, отличающийся по длине аминокислотной цепи или по физико-химическим свойствам.

В определенном варианте осуществления представляющий интерес белок может быть выбран из пептидов и белков.

В некоторых вариантах осуществления белки могут экспрессироваться с помощью бицистронного вектора. Белок представляет собой антитело или его фрагмент. Фрагмент антитела может экспрессироваться в бицистронной системе экспрессии. Фрагмент антитела может быть выбран из Fab-фрагмента тяжелой и легкой цепей антител или других фрагментов антител, таких как scFv, диатела, триатела, тетратела, бис-scFv, минитела Fab2 (биспецифические), Fab3 (триспецифические). В предпочтительном варианте осуществления в бицистронной системе экспрессии экспрессируется полинуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую и легкую цепь антитела, образующие Fab-фрагмент антитела. В таком варианте осуществления Fab-фрагмент антитела проявляет аффинность в отношении рецептора VEGF, при этом указанный Fab-фрагмент антитела представляет собой ранибизумаб.

В другом варианте осуществления белок может быть выбран без ограничения из G-CSF, IFN, эритропоэтина, инсулина и его вариантов, PTH (аминокислоты 1-84), FSH, LH, GH и протеиндисульфидизомеразы (PDI).

В некоторых вариантах осуществления пептид может экспрессироваться в бицистронном векторе. Пептиды содержат аминокислотную последовательность, выбранную из по меньшей мере менее 40 аминокислот, или предпочтительно менее 31 аминокислоты, или более предпочтительно менее 10 аминокислот. В определенном варианте осуществления молекулярная масса пептида выбрана из диапазона от приблизительно 2 до приблизительно 10 кДа. Пептид может быть выбран без ограничения из аналога пептида GLP-1, такого как лираглутид или эксендинор, тедуглутида, подобного пептиду GLP-2, и PTH (аминокислоты 1-34), и инсулина. В другом предпочтительном варианте осуществления в бицистронной системе экспрессии экспрессируется полинуклеотидная последовательность, кодирующая агонист рецепторов пептида GLP-1. В таком варианте осуществления пептид GLP-1 представляет собой лираглутид.

В другом варианте осуществления оба промотора независимо контролируют экспрессию разных представляющих интерес белков, таких как тяжелая цепь или легкая цепь антитела, которые отличаются по длине аминокислотной последовательности и физико-химическим свойствам.

В одном варианте осуществления двухцистронная система экспрессии содержит:

a) первый цистрон, содержащий промотор T7, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей тяжелую цепь антитела;

b) второй цистрон, содержащий арабинозный промотор, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей легкую цепь антитела;

где первый и второй цистроны расположены в одном векторе и экспрессируют тяжелую цепь и легкую цепь антитела в виде телец включения, образующихся в клетке-хозяине.

В таком варианте осуществления тяжелая цепь антитела и легкая цепь антитела предусматривает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления положение первого и второго цистрона является взаимозаменяемым, при этом второй цистрон можно клонировать в вектор в положение первого цистрона, а первый цистрон можно поместить в положение второго цистрона. Тяжелая цепь и легкая цепь антитела независимо экспрессируются в виде телец включения и могут быть дополнительно обработаны с получением Fab-фрагмента антитела, который проявляет аффинность в отношении рецептора VEGF, при этом указанный Fab-фрагмент антитела представляет собой ранибизумаб.

В определенном варианте осуществления тяжелая цепь и легкая цепь антитела необязательно экспрессируются в комбинации с сигнальным пептидом, предпочтительно pelB. Сигнальный пептид управляет экспрессией белка в периплазматическом пространстве клетки-хозяина.

В одном варианте осуществления двухцистронная система экспрессии в одном векторе имеет два разных промотора, арабинозный промотор и промотор T7, регулирующие продуцирование рекомбинантных Fab-фрагментов тяжелой и легкой цепей, соответственно, при этом обе цепи имеют метку pelB, которые продуцируются в виде нерастворимых телец включения в периплазматическом пространстве E. coli.

В определенном варианте осуществления тяжелая цепь или легкая цепь антитела необязательно эксперссируется в комбинации с регулятором, предпочтительно геном AraC, для дополнительного повышения экспрессии белка.

Двухцистронная система экспрессии обеспечивает экспрессию представляющего интерес белка в эквимолярных количествах. Экспрессия в эквимолярном количестве является особенно желательной для получения представляющего интерес белка подходящего качества и в подходящем количестве. Она зависит от соотношения тяжелой и легкой цепи или соотношения функциональных единиц полипептида в случае клонирования нуклеотидной последовательности в вектор. В определенном варианте осуществления последовательности тяжелой и легкой цепи клонированы при подходящем соотношении, предусматривающем, что количество последовательностей тяжелой цепи равно или больше количества последовательностей легкой цепи, с достижением экспрессии тяжелой и легкой цепи в эквимолярном количестве. Последовательности тяжелой цепи и легкой цепи клонируют при соотношении, выбранном из от 1:5:0,7 до 1:1, которое включает 1:3:0,8, 1:2:0,9, 1:2:1 1:1.

В одном варианте осуществления двухцистронная система экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 19.

В другом варианте осуществления двухцистронная система экспрессии содержит:

a) первый цистрон, содержащий промотор T7, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей пептид;

b) второй цистрон, содержащий арабинозный промотор, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей пептид;

где первый и второй цистроны расположены в одном векторе и экспрессируют пептид в виде телец включения, образующихся в клетке-хозяине.

В таком варианте осуществления пептид представляет собой аналог GLP-1, содержащий нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 6, кодирующую агонист рецепторов пептида GLP-1, представляющий собой лираглутид, имеющий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 7.

В определенном варианте осуществления пептид может быть необязательно экспрессирован с сигнальным пептидом или регулятором/энхансером, известным специалисту в данной области.

В определенном варианте осуществления пептид может быть необязательно экспрессирован с партнером для слияния или меткой слияния для предупреждения деградации пептида. Партнер для слияния представляет собой аминокислотную последовательность из от 30 аминокислот до 300 аминокислот. Партнер для слияния представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из приблизительно 50 аминокислот, 100 аминокислот, приблизительно 136 аминокислот, приблизительно 175 аминокислот, приблизительно 250 аминокислот, 300 аминокислот, предпочтительно приблизительно 136 аминокислот. Метка слияния может быть выбрана без ограничения из гистидиновой метки, глутатион-s-трансферазы (GST), мальтозосвязывающего белка, NusA, тиоредоксина (TRX), полигистидина (HIS), малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO) и убиквитина (Ub), а также гена стафилокиназы (SAK). В предпочтительном варианте осуществления метка слияния представляет собой ген SAK. Подробности использования гена SAK в качестве метки слияния с представляющим интерес белком раскрываются в US8853380, который включен в данный документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления бицистронная система экспрессии дополнительно включает в себя селективный маркер, который выбран из гена устойчивости к ампициллину, канамицину, предпочтительно из гена устойчивости к ампициллину.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предлагает способ получения представляющего интерес белка, предусматривающего стадии:

(i) трансформации клетки-хозяина одним вектором, включающим в себя, по сути, двухцистронную систему экспрессии;

(ii) культивирования трансформированной клетки в подходящей среде для экспрессии представляющего интерес белка, при этом первый и второй цистрон экспрессирует представляющий интерес белок в тельцах включения;

(iii) проведения солюбилизации телец включения;

(iv) проведения рефолдинга представляющего интерес белка.

В одном варианте осуществления бицистронной системой экспрессии трансфицируют подходящую бактериальную клетку-хозяина для того, чтобы экспрессировать представляющий интерес белок. Подходящая бактериальная клетка-хозяин представляет собой E. coli, в которой представляющий интерес белок экспрессируется в виде телец включения. Тельца включения представляют собой нерастворимые материалы, образовавшиеся в периплазме или цитоплазме E. coli. Тельца включения можно выделять, солюбилизировать, а представляющий интерес белок можно извлекать в активной форме посредством хорошо известных в данной области методик.

В одном варианте осуществления Fab-фрагмент тяжелой и легкой цепей антител или другие фрагменты антител, такие как scFv, диатела, триатела, тетратела, бис-scFv, минитела Fab2 (биспецифические), Fab3 (триспецифические) экспрессировали в виде нерастворимых телец включения в периплазматическом пространстве E. coli при помощи конструкций, созданных из двух независимых цистронов в одном векторе, имеющем два разных промотора, арабинозный промотор и промотор T7. Два разных промотора, т. e., промотор T7 и арабинозный промотор, обеспечивают экспрессию тяжелой и легкой цепей молекулы Fab-фрагмента, соответственно. Тяжелую и легкую цепи антитела получали в виде нефункциональных телец включения в бактериальной клетке, т. е, E. сoli,, которые в дальнейшем экстрагировали, подвергали рефолдингу и очищали.

В одном варианте осуществления по настоящему изобретению цистрон является таким, что каждый ген (тяжелой и легкой цепи) будет иметь свой собственный промотор и терминатор в одном векторе. Последовательность тяжелой цепи клонировали под контролем промотора T7, тогда как последовательность легкой цепи клонировали под контролем арабинозного промотора. Обе цепи начинались метками в виде сигнальных последовательностей pelB, используемых для получения продукта в периплазматическом пространстве бактериальной мембраны.

Преимущество бицистронной системы экспрессии заключается в том, что как арабинозный промотор, так и T7 являются сильными промоторами, причем высокий уровень экспрессии как легкой, так и тяжелой цепей, достигается в результате однократного цикла ферментации вместо отдельных циклов ферментации с клонами последовательностей легкой и тяжелой цепи. Двухцистронная система экспрессии облегчает характеристику и поддержание единого банка клеток вместо отдельных банков клеток для клонов легкой и тяжелой цепи. Кроме того, полученные таким образом тельца включения являются относительно чистыми, если их экстрагируют из периплазматического пространства бактериальных клеток. Высокий уровень экспрессии и более чистые формы легкой и тяжелой цепей, полученных в виде телец включения, обеспечивают возможность более легкого фолдинга в функциональные Fab ex vivo, значительно повышая тем самым выход продукта.

Другое преимущество данной системы заключается в том, что нуклеотидную последовательность представляющего интерес белка можно клонировать и экспрессировать под контролем арабинозного промотора и промотора T7, при этом может значительно повышаться уровень экспрессии белка.

Раскрытые далее примеры лишь иллюстрируют настоящее изобретение и не предназначены для ограничения.

Пример 1. Клонирование последовательности тяжелой цепи в вектор pET21a

Последовательность ДНК, используемая для клонирования последовательности тяжелой и легкой цепи Fab-фрагментов, приведена под SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно. Вставку последовательности тяжелой цепи амплифицировали из синтетической ДНК с использованием специфических к генам праймеров. Праймеры конструировали в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. ПЦР-продукт последовательности тяжелой цепи затем расщепляли с использованием ферментов NdeI-HindIII и лигировали в вектор pET21a, который расщепляли теми же самыми ферментами. Клоны подвергали скринингу посредством ПЦР для отбора колоний и их подтверждали с помощью рестрикционного анализа. Полученному в результате клону присвоили обозначение pET21a-HC. Рекомбинантный вектор вводили в линию клеток BL21A1 и проверяли клетки в отношении экспрессии тяжелой цепи.

Пример 2. Клонирование последовательности легкой цепи в вектор pBAD24M

Вставку последовательности легкой цепи амплифицировали из синтетической ДНК с использованием специфических к генам праймеров. Праймеры конструировали в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Амплифицированную последовательность легкой цепи расщепляли с использованием ферментов NdeI-HindIII и лигировали в расщепленный вектор pBAD24M (имеется в лаборатории) в те же самые сайты. Клоны подвергали скринингу посредством ПЦР для отбора колоний и их подтверждали с помощью рестрикционного анализа. Полученному в результате клону присвоили обозначение pBAD24M-LC. Рекомбинантный вектор вводили в линию клеток BL21A1 и проверяли клетки в отношении экспрессии легкой цепи.

Пример 3. Конструкция из двух независимых цистронов в одном и том же векторе

Праймеры конструировали для амплификации последовательности легкой цепи вместе с арабинозным промотором, терминатором и геном araC. Праймеры конструировали в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Данные праймеры присоединяли линкер с сайтом BglII к амплифицированному продукту. Вектор pET21a имел отдельный сайт BglII выше промотора T7. Кассету экспрессии с последовательностью легкой цепи амплифицировали из матрицы pBAD24M с использованием специфических к вектору праймеров и клонировали в клон pET21a-HC по сайту BglII. Клон подтверждали с помощью расщепления рестриктазами и подвергали секвенированию. Полученному в результате клону присваивали обозначение pET21a-HC-LC, а подходящие клоны вкратце перечислены с учетом экспрессии. Карта клона pET21a-HC-LC представлена на фигуре 2.

Полученный таким образом клон содержит все части, требующиеся для независимой регуляции и экспрессии как тяжелых, так и легких цепей.

Пример 4. Анализ экспрессии

Линию клеток E. coli BL21 A1 использовали в качестве хозяина для экспрессии. Помимо BL21 A1, использовали BL21 DE3 или какую-либо другую линию клеток, содержащую в своем геноме промотор T7. Клетки BL21 A1 трансформировали с использованием выбранного выше клона вместе с pET21a-HC и pBAD24M-LC в качестве контролей. Экспрессию тяжелой цепи индуцировали IPTG, тогда как экспрессию легкой цепи индуцировали арабинозой. Концентрация индуцирующего средства составляла 13 мM арабинозы и 1 мM IPTG, а индуцирование завершали тогда, когда OD600 культуры составляла ~1. Клетки собирали через 4 ч. после индуцирования. Исследование проводили во флаконах при встряхивании. Собранные клетки лизировали с помощью бус и центрифугировали для разделения растворимых и нерастворимых фракций. Образцы наносили на 12% гели для SDS PAGE с проведением электрофореза для проверки экспрессии. Анализ результатов SDS PAGE показан на фигуре 3. Восстановленный ранибизумаб вносили в лунку 5, что показано на фигуре 3, для подтверждения экспрессии восстановленных легкой и тяжелой цепей.

Анализ SDS PAGE показал экспрессию обеих цепей в нерастворимой осадочной фракции, и тот же самый результат подтвердили с помощью анализа RP-HPLC, где значения времени удерживания легкой и тяжелой цепей референтного продукта соответствовали значениям времени удерживания полученного в лаборатории продукта. Используемыми контролями были молекула восстановленного Fab (референтный продукт), и продукты клона pET21a-HC и клона pBAD24M. Таким образом, подтвердили экспрессию как тяжелой, так и легкой цепи в одном клоне. Анализ результатов RP-HPLC показан на фигурах 4 и 5. В ходе RP-HPLC солюбилизированные и восстановленные IB из двухцистронного клона сравнивали с восстановленным ранибизумабом (RMP) и клонами, экспрессирующими тяжелую и легкую цепи по отдельности, т. e. pET21-HC и pBAD24MLC.

Время удерживания (RT) основного пика солибилизированного IB из pBAD24MLC, экспрессирующего только легкую цепь, соответствовало RT легкой цепи восстановленного RMP. Пик примесей при RT в 13 минут соответствовал времени удерживания для тяжелой цепи, что было показателем аналогичной гидрофобности. Таким образом, примеси характеризовали посредством LC-MS/MS и в заключении установили, что это белок OMP C клетки-хозяина и легкой цепи с неотщепленной лидерной последовательностью при RT в 17 минут. Тяжелая цепь, экспрессируемая pET21a-HC, соответствовала референтной стандартной тяжелой цепи. На профиле также виден хвостовой пик на RT 19, который соответствовал тяжелой цепи с неотщепленной лидерной последовательностью. Клон pET21a_HC_LC с двумя цистронами, который экспрессирует как LC, так и HC, характеризуется 2 главными пиками, которые имеют значения время удерживания, эквивалентные значениям времени удерживания для LC и HC референтного стандарта. Но, поскольку OMP C элюировался одновременно с тяжелой цепью, способ анализа с обращенной фазой имел лучшую разрешающую способность, что показано на фигуре 4.

Существующий способ анализа на колонке Zorbax C8 RP модифицировали для Aeriswidepore C8 и проводили одновременное элюирование фрагментов с лучшей разрешающей способностью. Солюбилизированное IB из pET21a_HC_LC на Aeriswidepore C8 проявляло отчетливые пики, соответствующие LC, HC и OMP C, что давало возможность идентификации и точного количественного определения отдельных субъединиц в IB, что видно на фигуре 5.

Хотя некоторые варианты осуществления и примеры были подробно описаны выше, специалист в данной области техники сможет отчетливо понять, что в вариантах осуществления и примерах возможно много модификаций без отступления от их идей.

Пример 5. Клонирование нуклеотидной последовательности малого пептида (лираглутида) с меткой слияния в виде нуклеотидной последовательности стафилокиназы (SAK) в вектор pET24a

Гены SAK и лираглутида амплифицировали из синтетической ДНК с использованием специфических к генам праймеров. Праймеры сконструировали в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники, а ПЦР-продукты расщепляли ферментами NdeI-BamHI и BamHI-HindIII и лигировали в расщепленный вектор pET24a по сайтам NdeI-HindIII. Клоны подвергали скринингу посредством ПЦР для отбора колоний и их подтверждали с помощью рестрикционного анализа. Полученному в результате клону присвоили обозначение pET24a-SAK-Lira.

Пример 6. Клонирование нуклеотидной последовательности малого пептида (лираглутида) с меткой слияния в виде нуклеотидной последовательности стафилокиназы в вектор pBAD24M

Как описано в примере 5, нуклеотидную последовательность лираглутида с меткой SAK клонировали в вектор pBAD24M. Клону присвоили обозначение pBAD24M-SAK-Lira.

Пример 7. Конструкция из двух независимых цистронов в одном и том же векторе, причем оба цистрона экспрессируют пептидслияния SAK-Lira

Стратегию конструирования клона, используемую в примере 3, использовали для конструирования клона с двумя цистронами, экспрессирующего лираглутид, где ген слияния SAK-Lira вместе с кассетой экспрессии, контролируемой арабинозным промотором, амплифицировали из клона pBAD24M-SAK-Lira и клонировали в клон pET24a-SAK-Lira с получением конструкции, содержащей два цистрона. Клону присвоили обозначение pET-ara-SAK-Lira.

Пример 8. Анализ экспрессии двухцистронного клона с белком слияния SAK-Lira

Линию клеток E. coli BL21 A1 использовали в качестве хозяина для экспрессии. Помимо BL21 A1, использовали BL21 DE3 или какую-либо другую линию клеток, содержащую в своем геноме промотор T7. Клетки BL21 A1 трансформировали с использованием одно- или двухцистронной конструкций. Осуществляли индуцирование клонов с использованием IPTG и арабинозы. Концентрация индуцирующего средства составляла 13 мM арабинозы и 1 мM IPTG, а индуцирование завершали тогда, когда OD600 культуры составляла ~1. Клетки собирали через 4 ч. после индуцирования. Исследование проводили во флаконах при встряхивании. Собранные клетки лизировали с помощью бус и центрифугировали для разделения растворимых и нерастворимых фракций. Образцы наносили на 12% гели для SDS PAGE с проведением электрофореза для проверки экспрессии.

Анализ посредством SDS PAGE электрофореза четко показал повышение экспрессии белка-слияния SAK-Lira в двухцистронном клоне (фигура 6, дорожка 2) по сравнению с одноцистронным клоном pET24a-SAK-Lira (фигура 6, дорожка 3).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЛЮПИН ЛИМИТЕД

<120> Двухцистронная бактериальная система экспрессии

<130> FPAA4613PCT

<150> 2245/MUM/2014

<151> 2014-07-09

<160> 19

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 762

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Ранибизумаб, последовательность тяжелой цепи

<400> 1

atgaaatacc tgctgccgac agctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggccgaag tccaactggt cgaatcgggt ggtggtctgg tccaaccggg tggctctctg 120

cgtctgtcgt gtgctgcctc gggctatgat tttacccatt atggtatgaa ctgggtccgt 180

caggccccgg gtaaaggtct ggaatgggtg ggctggatta atacctacac gggtgaaccg 240

acctatgcgg ccgattttaa acgtcgcttt acgttctctc tggacacctc gaagagcacg 300

gcatatctgc agatgaacag tctgcgcgcg gaagataccg ccgtgtatta ctgcgcgaag 360

tacccgtatt actatggcac gtcccactgg tattttgacg tttggggcca aggtaccctg 420

gtcaccgtga gcagcgcgag caccaaaggc ccgagcgtgt tcccgctggc cccgagttcc 480

aagtctacca gtggcggtac ggcagctctg ggttgtctgg ttaaagatta ttttccggaa 540

ccggttaccg tctcctggaa cagcggcgca ctgacctctg gtgtgcatac gttcccggct 600

gttctgcagt catcgggcct gtacagcctg agcagcgtgg ttaccgttcc gagttcctca 660

ctgggtaccc aaacgtatat ctgcaacgtc aatcacaaac cgagcaatac caaagtggac 720

aaaaaagtgg aaccgaaatc gtgtgataaa acgcatctgt aa 762

<210> 2

<211> 711

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Ранибизумаб, легкая цепь: последовательность нуклеотидов 2295-3005

<400> 2

atgaaatacc tgctgccgac agctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggccgaca ttcaactgac gcaaagtccg agcagcctga gcgcatccgt gggcgaccgt 120

gtgacgatta cctgttccgc aagccaagac atctctaact atctgaattg gtaccagcaa 180

aaaccgggca aggcaccgaa agtcctgatt tattttacca gctctctgca ttccggcgtt 240

ccgtcacgtt ttagcggctc tggtagtggc accgatttca ccctgacgat cagttccctg 300

cagccggaag actttgctac gtattactgc cagcaataca gcaccgtgcc gtggacgttc 360

ggtcagggca ccaaggttga aattaaacgt acggttgcgg ccccgtctgt ctttatcttc 420

ccgccgagtg atgaacagct gaaatcgggt accgcaagcg tggtttgtct gctgaacaat 480

ttctatccgc gcgaagcaaa ggtccagtgg aaagtggaca acgctctgca gtccggcaat 540

tcacaagaat cggtgaccga acaagatagc aaggactcta cgtacagtct gtcatcgacc 600

ctgacgctgt ccaaagcgga ttatgaaaaa cacaaggttt acgcctgcga agtcacccat 660

caaggtctgt cgtctccggt taccaagagt ttcaatcgtg gcgaatgtta a 711

<210> 3

<211> 253

<212> БЕЛОК

<213> искусственная

<220>

<223> Ранибизумаб, аминокислотная последовательность тяжелой цепи

<400> 3

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro

65 70 75 80

Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr

85 90 95

Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser

115 120 125

His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

145 150 155 160

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

165 170 175

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

180 185 190

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

195 200 205

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

210 215 220

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

225 230 235 240

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu

245 250

<210> 4

<211> 236

<212> БЕЛОК

<213> искусственная

<220>

<223> Ранибизумаб, аминокислотная последовательность легкой цепи

<400> 4

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

130 135 140

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 5

<211> 762

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Комплементарная последовательность тяжелой цепи 940-178

<400> 5

ttacagatgc gttttatcac acgatttcgg ttccactttt ttgtccactt tggtattgct 60

cggtttgtga ttgacgttgc agatatacgt ttgggtaccc agtgaggaac tcggaacggt 120

aaccacgctg ctcaggctgt acaggcccga tgactgcaga acagccggga acgtatgcac 180

accagaggtc agtgcgccgc tgttccagga gacggtaacc ggttccggaa aataatcttt 240

aaccagacaa cccagagctg ccgtaccgcc actggtagac ttggaactcg gggccagcgg 300

gaacacgctc gggcctttgg tgctcgcgct gctcacggtg accagggtac cttggcccca 360

aacgtcaaaa taccagtggg acgtgccata gtaatacggg tacttcgcgc agtaatacac 420

ggcggtatct tccgcgcgca gactgttcat ctgcagatat gccgtgctct tcgaggtgtc 480

cagagagaac gtaaagcgac gtttaaaatc ggccgcatag gtcggttcac ccgtgtaggt 540

attaatccag cccacccatt ccagaccttt acccggggcc tgacggaccc agttcatacc 600

ataatgggta aaatcatagc ccgaggcagc acacgacaga cgcagagagc cacccggttg 660

gaccagacca ccacccgatt cgaccagttg gacttcggcc atcgccggct gggcagcgag 720

gagcagcaga ccagcagcag ctgtcggcag caggtatttc at 762

<210> 6

<211> 96

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> ДНК-последовательность лираглутида

<400> 6

catgcagaag gcacctttac gagtgatgtg agctcttatc tggaaggcca ggcggccaaa 60

gaatttattg cgtggctggt tcgtggccgt ggttaa 96

<210> 7

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность лираглутида

<400> 7

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 8

<211> 456

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность SAK (с сайтом EK)

<400> 8

catatgtcaa gttcattcga caaaggaaaa tataaaaaag gcgatgacgc gagttatttt 60

gaaccaacag gcccgtattt gatggtaaat gtgactggag ttgatggtaa aggaaatgaa 120

ttgctatccc ctcattatgt cgagtttcct attaaacctg ggactacact tacaaaagaa 180

aaaattgaat acctgcagga tgatgatgat aaatacgtag aatgggcatt agatgcgaca 240

gcatataaag agtttagagt agttgaatta gatccaagcg caaagatcga agtcacttat 300

tatgataaga ataagaaaaa agaagaaacg aagtctttcc ctataacaga aaaaggtttt 360

gttgtcccag atttatcaga gcatattaaa aaccctggat tcaacttaat tacaaaggtt 420

gttatagaaa agaaaggatc cgatgatgat gataaa 456

<210> 9

<211> 151

<212> БЕЛОК

<213> искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность SAK (с меткой EK)

<400> 9

Met Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala

1 5 10 15

Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly

20 25 30

Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe

35 40 45

Pro Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Leu

50 55 60

Gln Asp Asp Asp Asp Lys Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu

85 90 95

Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe

100 105 110

Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile

115 120 125

Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys

130 135 140

Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys

145 150

<210> 10

<211> 17

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Промотор T7: 1011-1027

<400> 10

ctatagtgag tcgtatt 17

<210> 11

<211> 52

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Терминатор T7:26-72

<400> 11

ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa ggggttatgc ta 52

<210> 12

<211> 10

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> RBS из pET21a: 947-957

<400> 12

tctccttctt 10

<210> 13

<211> 879

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Ген AraC: 1048-1927

<400> 13

ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac ggaactcgct 60

cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat cgtcaaaacc 120

aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca gcttcgcctg 180

gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct ggcggaaaag 240

atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga tatcaaaatt 300

gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat tatccatcgg 360

tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gcgccgcagt aacaattgct caagcagatt 420

tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga tttgcccaaa 480

caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg tattggcaaa 540

tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt aaacccactg 600

gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc ctggcgggaa 660

cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca ccaccccctg 720

accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt cgataaaaaa 780

atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg cattaaacga 840

gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccat 879

<210> 14

<211> 27

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Арабинозный промотор: 2203-2230

<400> 14

acgcttttta tcgcaactct ctactgt 27

<210> 15

<211> 425

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Арабинозный терминатор: 3011-3438

<400> 15

gctgttttgg cggatgagag aagattttca gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa 60

gcggtctgat aaaacagaat ttgcctggcg gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca 120

tgccgaactc agaagtgaaa cgccgtagcg ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga 180

gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt 240

cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg 300

gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact 360

gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa 420

actct 425

<210> 16

<211> 1084

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Последовательность LacI: 3810-4890

<400> 16

tgtgaaacca gtaacgttat acgatgtcgc agagtatgcc ggtgtctctt atcagaccgt 60

ttcccgcgtg gtgaaccagg ccagccacgt ttctgcgaaa acgcgggaaa aagtggaagc 120

ggcgatggcg gagctgaatt acattcccaa ccgcgtggca caacaactgg cgggcaaaca 180

gtcgttgctg attggcgttg ccacctccag tctggccctg cacgcgccgt cgcaaattgt 240

cgcggcgatt aaatctcgcg ccgatcaact gggtgccagc gtggtggtgt cgatggtaga 300

acgaagcggc gtcgaagcct gtaaagcggc ggtgcacaat cttctcgcgc aacgcgtcag 360

tgggctgatc attaactatc cgctggatga ccaggatgcc attgctgtgg aagctgcctg 420

cactaatgtt ccggcgttat ttcttgatgt ctctgaccag acacccatca acagtattat 480

tttctcccat gaagacggta cgcgactggg cgtggagcat ctggtcgcat tgggtcacca 540

gcaaatcgcg ctgttagcgg gcccattaag ttctgtctcg gcgcgtctgc gtctggctgg 600

ctggcataaa tatctcactc gcaatcaaat tcagccgata gcggaacggg aaggcgactg 660

gagtgccatg tccggttttc aacaaaccat gcaaatgctg aatgagggca tcgttcccac 720

tgcgatgctg gttgccaacg atcagatggc gctgggcgca atgcgcgcca ttaccgagtc 780

cgggctgcgc gttggtgcgg atatctcggt agtgggatac gacgataccg aagacagctc 840

atgttatatc ccgccgttaa ccaccatcaa acaggatttt cgcctgctgg ggcaaaccag 900

cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg ccaggcggtg aagggcaatc agctgttgcc 960

cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccaccct ggcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg 1020

cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 1080

gtga 1084

<210> 17

<211> 861

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> bla (ген устойчивости к ампициллину): 7085-7942

<400> 17

ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 60

agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 120

cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 180

ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 240

gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 300

cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 360

cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 420

ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 480

catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 540

tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 600

ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 660

catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 720

cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 780

cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 840

acggaaatgt tgaatactca t 861

<210> 18

<211> 1

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Последовательность инициации репликации 6323 в pBR322

<400> 18

t 1

<210> 19

<211> 8540

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Полная последовательность клона с двухцистронным вектором, включающим в себя последовательности тяжелой и легкой цепи fab

<400> 19

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagctttt 180

acagatgcgt tttatcacac gatttcggtt ccactttttt gtccactttg gtattgctcg 240

gtttgtgatt gacgttgcag atatacgttt gggtacccag tgaggaactc ggaacggtaa 300

ccacgctgct caggctgtac aggcccgatg actgcagaac agccgggaac gtatgcacac 360

cagaggtcag tgcgccgctg ttccaggaga cggtaaccgg ttccggaaaa taatctttaa 420

ccagacaacc cagagctgcc gtaccgccac tggtagactt ggaactcggg gccagcggga 480

acacgctcgg gcctttggtg ctcgcgctgc tcacggtgac cagggtacct tggccccaaa 540

cgtcaaaata ccagtgggac gtgccatagt aatacgggta cttcgcgcag taatacacgg 600

cggtatcttc cgcgcgcaga ctgttcatct gcagatatgc cgtgctcttc gaggtgtcca 660

gagagaacgt aaagcgacgt ttaaaatcgg ccgcataggt cggttcaccc gtgtaggtat 720

taatccagcc cacccattcc agacctttac ccggggcctg acggacccag ttcataccat 780

aatgggtaaa atcatagccc gaggcagcac acgacagacg cagagagcca cccggttgga 840

ccagaccacc acccgattcg accagttgga cttcggccat cgccggctgg gcagcgagga 900

gcagcagacc agcagcagct gtcggcagca ggtatttcat atgtatatct ccttcttaaa 960

gttaaacaaa attatttcta gaggggaatt gttatccgct cacaattccc ctatagtgag 1020

tcgtattaat ttcgcgggat cgagatcttt atgacaactt gacggctaca tcattcactt 1080

tttcttcaca accggcacgg aactcgctcg ggctggcccc ggtgcatttt ttaaataccc 1140

gcgagaaata gagttgatcg tcaaaaccaa cattgcgacc gacggtggcg ataggcatcc 1200

gggtggtgct caaaagcagc ttcgcctggc tgatacgttg gtcctcgcgc cagcttaaga 1260

cgctaatccc taactgctgg cggaaaagat gtgacagacg cgacggcgac aagcaaacat 1320

gctgtgcgac gctggcgata tcaaaattgc tgtctgccag gtgatcgctg atgtactgac 1380

aagcctcgcg tacccgatta tccatcggtg gatggagcga ctcgttaatc gcttccatgc 1440

gccgcagtaa caattgctca agcagattta tcgccagcag ctccgaatag cgcccttccc 1500

cttgcccggc gttaatgatt tgcccaaaca ggtcgctgaa atgcggctgg tgcgcttcat 1560

ccgggcgaaa gaaccccgta ttggcaaata ttgacggcca gttaagccat tcatgccagt 1620

aggcgcgcgg acgaaagtaa acccactggt gataccattc gcgagcctcc ggatgacgac 1680

cgtagtgatg aatctctcct ggcgggaaca gcaaaatatc acccggtcgg caaacaaatt 1740

ctcgtccctg atttttcacc accccctgac cgcgaatggt gagattgaga atataacctt 1800

tcattcccag cggtcggtcg ataaaaaaat cgagataacc gttggcctca atcggcgtta 1860

aacccgccac cagatgggca ttaaacgagt atcccggcag caggggatca ttttgcgctt 1920

cagccatact tttcatactc ccgccattca gagaagaaac caattgtcca tattgcatca 1980

gacattgccg tcactgcgtc ttttactggc tcttctcgct aaccaaaccg gtaaccccgc 2040

ttattaaaag cattctgtaa caaagcggga ccaaagccat gacaaaaacg cgtaacaaaa 2100

gtgtctataa tcacggcaga aaagtccaca ttgattattt gcacggcgtc acactttgct 2160

atgccatagc atttttatcc ataagattag cggatcctac ctgacgcttt ttatcgcaac 2220

tctctactgt ttctccatac ccgttttttt gggctagaaa taattttgtt taactttaag 2280

aaggagatat acatatgaaa tacctgctgc cgacagctgc tgctggtctg ctgctcctcg 2340

ctgcccagcc ggcgatggcc gacattcaac tgacgcaaag tccgagcagc ctgagcgcat 2400

ccgtgggcga ccgtgtgacg attacctgtt ccgcaagcca agacatctct aactatctga 2460

attggtacca gcaaaaaccg ggcaaggcac cgaaagtcct gatttatttt accagctctc 2520

tgcattccgg cgttccgtca cgttttagcg gctctggtag tggcaccgat ttcaccctga 2580

cgatcagttc cctgcagccg gaagactttg ctacgtatta ctgccagcaa tacagcaccg 2640

tgccgtggac gttcggtcag ggcaccaagg ttgaaattaa acgtacggtt gcggccccgt 2700

ctgtctttat cttcccgccg agtgatgaac agctgaaatc gggtaccgca agcgtggttt 2760

gtctgctgaa caatttctat ccgcgcgaag caaaggtcca gtggaaagtg gacaacgctc 2820

tgcagtccgg caattcacaa gaatcggtga ccgaacaaga tagcaaggac tctacgtaca 2880

gtctgtcatc gaccctgacg ctgtccaaag cggattatga aaaacacaag gtttacgcct 2940

gcgaagtcac ccatcaaggt ctgtcgtctc cggttaccaa gagtttcaat cgtggcgaat 3000

gttaaaagct tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata cagattaaat 3060

cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc 3120

cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt 3180

ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa 3240

gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 3300

ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc 3360

ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt 3420

gcgtttctac aaactcttag atctcgatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca 3480

ccggcgccac aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc 3540

gggctcgcca cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg 3600

tggccggggg actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc 3660

tcaacggcct caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc 3720

gtcgagatcc cggacaccat cgaatggcgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc 3780

ccggaagaga gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca 3840

gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt 3900

tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac 3960

cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt 4020

ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg 4080

ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg 4140

gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc gctggatgac 4200

caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc 4260

tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc 4320

gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt 4380

tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat atctcactcg caatcaaatt 4440

cagccgatag cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg 4500

caaatgctga atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg 4560

ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta 4620

gtgggatacg acgataccga agacagctca tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa 4680

caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc 4740

caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg 4800

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 4860

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg taagttagct 4920

cactcattag gcaccgggat ctcgaccgat gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc 4980

cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt atgactgtct tctttatcat 5040

gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg 5100

ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc 5160

tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc 5220

cggcatggcg gccccacggg tgcgcatgat cgtgctcctg tcgttgagga cccggctagg 5280

ctggcggggt tgccttactg gttagcagaa tgaatcaccg atacgcgagc gaacgtgaag 5340

cgactgctgc tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca tgaatggtct tcggtttccg 5400

tgtttcgtaa agtctggaaa cgcggaagtc agcgccctgc accattatgt tccggatctg 5460

catcgcagga tgctgctggc taccctgtgg aacacctaca tctgtattaa cgaagcgctg 5520

gcattgaccc tgagtgattt ttctctggtc ccgccgcatc cataccgcca gttgtttacc 5580

ctcacaacgt tccagtaacc gggcatgttc atcatcagta acccgtatcg tgagcatcct 5640

ctctcgtttc atcggtatca ttacccccat gaacagaaat cccccttaca cggaggcatc 5700

agtgaccaaa caggaaaaaa ccgcccttaa catggcccgc tttatcagaa gccagacatt 5760

aacgcttctg gagaaactca acgagctgga cgcggatgaa caggcagaca tctgtgaatc 5820

gcttcacgac cacgctgatg agctttaccg cagctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 5880

tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 5940

cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc 6000

catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag 6060

cagattgtac tgagagtgca ccatatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga 6120

gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 6180

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 6240

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 6300

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 6360

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 6420

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 6480

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 6540

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 6600

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 6660

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 6720

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 6780

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 6840

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 6900

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 6960

actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 7020

taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 7080

gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 7140

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 7200

ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 7260

accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 7320

agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 7380

acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 7440

tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 7500

cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 7560

tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 7620

ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 7680

gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 7740

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 7800

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 7860

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 7920

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 7980

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 8040

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgaaattgt aaacgttaat attttgttaa 8100

aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca 8160

aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga 8220

acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc 8280

agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc 8340

gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc 8400

cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg 8460

caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac 8520

agggcgcgtc ccattcgcca 8540

<---

Реферат

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен способ получения антитела или его фрагмента. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в производстве такого антитела как Ранибизумаб. 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 8 пр.

Формула

1. Способ получения антитела или его фрагмента, предусматривающий стадии:
(i) трансформации бактериальной клетки-хозяина одним вектором, состоящим из двухцистронной системы экспрессии, содержащей:
a) первый цистрон, содержащий промотор Т7, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей тяжелую цепь антитела или его фрагмента;
b) второй цистрон, содержащий арабинозный промотор, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей легкую цепь антитела или его фрагмента;
(ii) культивирования трансформированных бактериальных клеток в подходящей среде для экспрессии тяжелой цепи и легкой цепи антитела или его фрагмента в виде телец включения, где тяжелая и легкая цепи экспрессируются на эквимолярных уровнях, в форме телец включения;
(iii) осуществления солюбилизации указанных телец включения и
(iv) осуществления рефолдинга антитела или его фрагмента; где двухцистронная система экспрессии содержит полинуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:19.
2. Способ по п. 1, где фрагмент антитела представляет собой ранибизумаб.
3. Способ по п. 1, где бактериальная клетка-хозяин представляет собой E. coli.

Патенты аналоги

Авторы

Патентообладатели

Заявители

0
0
0
0
Невозможно загрузить содержимое всплывающей подсказки.
Поиск по товарам