Карбазолсодержащие сульфонамиды в качестве модуляторов криптохрома - RU2654484C1
Код документа: RU2654484C1
Описание
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет и преимущество предварительной заявки на патент США № 61/645918, поданной 11 мая 2012 года, предварительной заявки на патент США № 61/778176, поданной 12 марта 2013 года, содержание которых включено в настоящую заявку в их полном объеме.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
Каждая из заявок на патент и патентов, цитируемых в тексте, а также каждый документ или ссылка, цитируемые в каждой из заявок и патентов (в том числе в процессе делопроизводства по каждому выданному патенту: “документы, на которые имеется ссылка в материалах заявки”), и каждая из американских или иностранных заявок или патентов, соответствующих и/или испрашивающих приоритет из любой из этих заявок и патентов, и каждый из документов, цитируемых или на которые имеется ссылка в каждом из цитируемых в заявке документов, являются, таким образом, специально включенными в настоящую заявку посредством ссылки. В более общем смысле, документы или ссылки цитируются в данном тексте либо в списке ссылочных материалов перед формулой изобретения, либо в самом тексте; и каждый из этих документов или ссылок (“ссылочные документы, указанные в настоящей заявке”), а также каждый документ или ссылка, цитируемые в каждом из ссылочных документов, указанных в настоящей заявке (включая любые спецификации, инструкции изготовителя и т.д.), специально включены в настоящую заявку посредством ссылки. Документы, включенные посредством ссылки в данный текст, могут быть использованы при практическом осуществлении настоящего изобретения.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Предмет изобретения, раскрываемый в настоящей заявке, относится, среди прочего, к карбазол-содержащим сульфонамидным производным, фармацевтическим композициям, содержащим эти соединения, способам их применения в лечении криптохром- опосредованных заболеваний или расстройств и способам их получения. Также представлены способы диагностики, детекции или мониторинга развития криптохром-зависимых заболеваний у субъектов, получающих соединения и композиции, раскрываемые в настоящей заявке.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Циркадные часы представляют собой внутренний хронометрический механизм, который контролирует суточные ритмы многих физиологических процессов, таких как поведение, сон/бодрствование, температура тела, секреция гормонов и метаболизм (Takahashi, J. S. et al. Nat. Rev. Genet. 2008, 9, 764; Green, C. B. et al. Cell, 2008, 134, 728; Zhang, E. E. et al. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2010, 11, 764). Циркадные ритмы генерируются клеточно-автономным образом через транскрипционные регуляторные сети часовых генов. В петле обратной связи ядра транскрипционные факторы CLOCK и BMAL1 активируют экспрессию Период (Per1 и Per2) и Криптохром (Cry1 и Cry2) генов. После трансляция и ядерной локализации PER и CRY белки ингибируют функцию CLOCK-BMAL1, приводя к устойчивой ритмической генной экспресси. Многие физиологические пути находятся под контролем циркадных часов (Panda, S. et al. Cell, 2002, 109, 307), включая непосредственную регуляцию различных гепатических процессов (Rey, G. et al. PLoS Biol. 2011, 9, e1000595; Bugge, A. et al. Genes Dev. 2012, 26, 657).
Циркадную десинхронию связывают с нарушением чувствительности к инсулину (Spiegel, K. et al. J. Appl. Physiol. 2005, 99, 2008; Spiegel, K. et al. Lancet, 1999, 354, 1435), пониженными уровнями лептина, и это приводит к гипергликемии, гиперинсулинемии и возникающим после приема пищи ответам глюкозы, которые сопоставимы с преддиабетическим состоянием (Scheer, F. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106, 4453). Некоторые широкие ассоциативные исследования генома привели к открытию, что Cry2 может иметь важное значение в регуляции уровней глюкозы у млекопитающих (Dupuis, J. et al. Nat. Genet. 2010, 42, 105; Liu, C. et al. PLoS One, 2011, 6, e21464; Barker, A. et al. Diabetes, 2011, 60, 1805).
Концентрации глюкозы в крови являются высоко ритмическими из-за изменений чувствительности к инсулину и способности эндокринной поджелудочной железы к секреции инсулина (Polonsky, K. S. et al. N. Engl. J. Med. 1988, 318, 1231). У мышей с ClockΔ19 мутацией развивается зависимая от возраста гипергликемия, и у этих животных также развивается склонность к диета-индуцируемому ожирению, они имеют несоответственно низкие концентрации инсулина (Turek, F. W. et al. Science, 2005, 308, 1043) и демонстрируют более резкое падение уровня сахара в крови в ответ на лечение инсулином, что указывает на тот факт, что эти животные имеют повышенную чувствительность к инсулину, маскируя, таким образом, их β-клеточный дефицит (Marcheva, B. et al. Nature, 2010, 466, 627). Печень-специфическая делеция Bmal1 у мышей приводит к нарушенной толерантности к глюкозе и повышенной чувствительности к инсулину (Lamia, K. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105, 15172). Субъекты с диабетом 2 типа и даже их ближайшие родственники, еще не пораженные этим заболеванием, демонстрируют измененную ритмичность толерантности к глюкозе (Boden, G. et al. Diabetes, 1999, 48, 2182). Также, экспрессия Per2, Per3 и Cry2 существенно ниже у людей с диабетом 2 типа по сравнению с людьми, не страдающими этим заболеванием (Stamenkovich, J. A. et al. Metabolism, 2012, 61, 978). Глюконеогенные гены фосфоенолпируваткарбоксикиназы (Pck1) и глюкоза 6-фосфатазы (G6pc) контролируются посредством CRY и Bmal1 ген регулятором REV-ERB (Zhang, E. E. et al. Nat. Med. 2010, 16, 1152; Lamia, K. A. et al. Nature, 2011, 480, 552; Yin, L. et al. Science, 2007, 318, 1786). Глюконеогенез строго контролируется различными сигнальными механизмами, и, более того, исследования на мышах выявили, что модуляция Cry1 и Cry2 может нарушать глюконеогенез и регулировать уровни сахара в крови (Zhang, E. E. et al. Nat. Med. 2010, 16, 1152).
В контексте моно- или комбинированной терапии, новые и одобренные для применения пероральные антидиабетические средства имеют неоднородную и ограниченную эффективность. Пероральные антидиабетические терапии страдают такими недостатками, как плохой или ограниченный гликемический контроль или плохое соблюдение пациентами режима и схемы лечения из-за неприемлемых побочных эффектов, таких как отек, прибавка в весе или даже более серьезные осложнения, такие как гипогликемия. Метформин, замещенный бигуанид, может вызывать диарею и желудочно-кишечный дискомфорт. Наконец, отек, прибавка в весе, а в некоторых случаях гепатотоксичность и кардиотоксичность, связывают с введением некоторых тиазолидин-2,4-дионовых антидиабетических средств (например, Розиглитазон и Пиоглитазон). Комбинированная терапия с использованием двух или более из указанных выше средств является общепринятой, но, как правило, только приводит к ступенчатым улучшениям гликемического контроля.
Cry1 и Cry2 также взаимодействуют с глюкокортикоидным рецептором (GR) для глобального изменения транскрипционного ответа на глюкокортикоиды (Lamia, K. A. et al. Nature, 2011, 480, 552). Потеря Cry1 и/или Cry2 приводит к непереносимости глюкозы и конститутивно высоким уровням циркулирующего кортикостерона, предполагая пониженную супрессию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси вместе с повышенной глюкокортикоидной трансактивацией в печени. С точки зрения геномики, Cry1 и Cry2 связываются с глюкокортикоидным респонсивным элементом в Pck1 промоторе гормон-зависимым образом, и дексаметазон-индуцируемая транскрипция Pck1 гена была поразительно повышенной в криптохром-дефицитных печенях. Это говорит о том, что нежелательные метаболические побочные эффекты глюкокортикоидов (например, гипергликемия, инсулинорезистентность и супрессия функции надпочечников), используемых для супрессии воспаления, можно облегчить путем сочетания их со средствами, которые могут стабилизировать Cry1 и/или Cry2.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к криптохром (Cry)- модулирующим соединениям, фармацевтическим композициям, включающим Cry-модулирующие соединения, и способам лечения Cry-опосредованных заболеваний или расстройств, таких как, например, диабет, ожирение, метаболический синдром, синдром Кушинга и глаукома, путем введения Cry-модулирующих соединений.
В одном аспекте, объект изобретения, раскрываемый в настоящей заявке, направлен на соединение формулы I:
или его фармацевтически приемлемую соль или гидрат, где:
каждый из A, B, C, D, E, F, G и H независимо представляет собой N или C;
каждый из R1 и R2, когда A, B, C, D, E, F, G или H представляет собой C, независимо выбран из H, галогена, циано, нитро, -CF3, -CHF2, -CH2F, трифторметокси, азидо, гидроксила, (C1-C6)алкокси, (C1-C6)алкила, (C2-C6)алкенила, (C2-C6)алкинила, -(C=O)-R8, -(C=O)-O-R8, -O-(C=O)-R8, -NR8(C=O)-R10, -(C=O)-NR8R9, -NR8R9, -NR8OR9, -S(O)cNR8R9, -S(O)d(C1-C8)алкила, -O-SO2-R8, NR8-S(O)c, -(CR8R9)d(3-10)-членного циклоалкила, -(CR8R9)e(C6-C10)арила, -(CR8R9)e(4-10)-членного гетероциклила, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(C6-C10)арила, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(4-10)-членного гетероциклила, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арила, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членного гетероциклила, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арила и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членного гетероциклила;
каждый из R3 и R5 независимо выбран из H, циано, -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкила, (C2-C6)алкенила, (C2-C6)алкинила, -(C=O)-R8, -(C=O)-O-R8, -(C=O)-NR8R9, -S(O)cNR8R9, -S(O)d(C1-C8)алкила, -(CR8R9)d(3-10)-членного циклоалкила, -(CR8R9)e(C6-C10)арила, -(CR8R9)e(4-10)-членного гетероциклила, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(C6-C10)арила, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(4-10)-членного гетероциклила, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арила, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членного гетероциклила, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арила и - (CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членного гетероциклила;
где каждая из R3 групп необязательно связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца;
где каждая из R5 групп необязательно связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца;
R4 представляет собой H, -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(C=O)-R8, -(C=O)-O-R8, -(C=O)-NR8R9, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил;
R6 представляет собой H, -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(C=O)-R8, -(C=O)-O-R8, -(C=O)-NR8R9, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил;
где R5 и R6 необязательно связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца;
R7 представляет собой -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(C=O)-R8, -(C=O)-O-R8, -NR8(C=O)-R10, -(C=O)-NR8R9, -NR8R9, -NR8OR9, - NR8-S(O)c, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил;
где R6 и R7 необязательно связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца;
каждый из R8, R9 и R10 независимо выбраны из H, (C1-C6)алкила, -(CR11R12)e(3-10)-членного циклоалкила, -(CR11R12)g(C6- C10)арила и -(CR11R12)g(4-10)-членного гетероциклила;
любые атомы углерода групп (C1-C6)алкил, (3-10)-членный циклоалкил, (C6-C10)арил и (4-10)-членный гетероциклил из описанных выше R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15 и R16 независимо необязательно замещены 1-3 заместителями R14, каждый из которых независимо выбран из галогена, циано, нитро, -CF3, -CHF2, -CH2F, трифторметокси, азидо, гидроксила, -O-R15, -(CR8R9)e(C1-C6)алкокси, (C1-C6)алкокси, (C1-C6)алкила, (C2-C6)алкенила, (C2-C6)алкинила, -(C=O)-R11, -(C=O)-R15, -(C=O)-O-R11,-(C=O)-O-R15, -O-(C=O)-R11, -O-(C=O)-R15, -NR11(C=O)-R13, -(C=O)-NR11R12, -(C=O)-NR11R15, -NR11R12, -NR11R15, -NR11OR12, -NR11OR15, -S(O)cNR11R12, -S(O)cNR11R15, -S(O)d(C1-C6)алкила, -S(O)dR15, -O-SO2-R11, -O-SO2-R15, -NR11-S(O)c, -NR15-S(O)c, -(CR11R12)e(3-10)-членного циклоалкила, -(CR11R12)e(C6-C10)арила, -(CR11R12)e(4-10)-членного гетероциклила, -(CR11R12)f(C=O)(CR11R12)e(C6-C10)арила, -(CR11R12)f(C=O)(CR11R12)e(4-10)-членного гетероциклила, -(CR11R12)eO(CR11R12)f(C6-C10)арила, -(CR11R12)eO(CR11R12)f(4-10)-членного гетероциклила, -(CR11R12)fS(O)d(CR11R12)e(C6-C10)арила и -(CR11R12)fS(O)d(CR11R12)e(4-10)-членного гетероциклила;
любые атомы углерода групп (C1-C6)алкил, (3-10)-членный циклоалкил, (C6-C10)арил и (4-10)-членный гетероциклил из описанного выше R14 независимо необязательно замещены 1-3 заместителями R16, каждый из которых независимо выбран из галогена, циано, нитро, -CF3, -CHF2, -CH2F, трифторметокси, азидо, (CH2)eOH, (C1-C6)алкокси, (C1-C6)алкила, (C2-C6)алкенила, (C2-C6)алкинила, -(C=O)-R11, -(C=O)-R15, -(C=O)-O-R11, -(C=O)-O-R15, -O-(C=O)-R11, -O-(C=O)-R15, -NR11(C=O)-R13, -(C=O)-NR11R12, -NR11R12 и -NR11R15;
любые атомы азота (4-10)-членного гетероциклила из описанных выше R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R14 и R15 независимо необязательно замещены (C1-C6)алкилом, (C2-C6)алкенилом, (C2-C6)алкинилом, -(C=O)-R11, -(C=O)-O-R11, -(C=O)-NR11R12, -(CR11R12)e(3-10)-членным циклоалкилом, -(CR11R12)e(C6-C10)арилом, -(CR11R12)e(4-10)-членным гетероциклилом, -(CR11R12)f(C=O)(CR11R12)e(C6-C10)арилом или -(CR11R12)f(C=O)(CR11R12)e(4-10)-членным гетероциклилом;
каждый R11, R12 и R13 независимо представляют собой H или (C1-C6)алкил;
R15 представляет собой -(CR11R12)e(3-10)-членный циклоалкил, -(CR11R12)e(C6-C10)арил или -(CR11R12)e(4-10)-членный гетероциклил;
a и b, каждый независимо, имеют значения 1, 2, 3 или 4;
c имеет значение 1 или 2;
d имеет значение 0, 1 или 2; и
e, f и g, каждый независимо, имеют значения 0, 1, 2, 3, 4 или 5.
В некоторых вариантах воплощения, каждый из A, B, C, D, E, F, G и H представляют собой C; каждый из R1 и R2 независимо выбран из H или галогена; R4 представляет собой H или (C1-C6)алкил, R3 и R5 представляют собой H; R6 представляет собой -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил; R7 представляет собой -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил; R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, a, b, c, d, e и f имеют значения, определенные в настоящей заявке.
В других вариантах воплощения, каждый из A, B, C, D, E, F, G и H представляют собой C; каждый из R1 и R2 независимо выбран из H или галогена; R4 представляет собой H или (C1-C6)алкил, R3 и R5 представляют собой H; R6 и R7 связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца; R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, a, b, c, d, e и f имеют значения, определенные в настоящей заявке.
В других вариантах воплощения, каждый из A, B, C, D, E, F, G и H представляют собой C; каждый из R1 и R2 независимо выбран из H или галогена; R4 представляет собой H или (C1-C6)алкил; R3 и один R5 представляют собой H; один R5 и R6 связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца; R7 представляет собой -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил; R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, a, b, c, d, e и f имеют значения, определенные в настоящей заявке.
В некоторых вариантах воплощения, соединение формулы I представляет собой отдельный энантиомер, имеющий (S)-конфигурацию или (R)-конфигурацию по C-3, где каждый из A, B, C, D, E, F, G и H представляет собой C; каждый из R1 и R2 независимо выбран из H или галогена; R4 представляет собой H или (C1-C6)алкил, R3 и R5 представляют собой H; R6 представляет собой -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил; R7 представляет собой -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил; R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, a, b, c, d, e и f имеют значения, определенные в настоящей заявке.
В других вариантах воплощения изобретения, раскрываемого в настоящей заявке, соединение формулы I представляет собой отдельный энантиомер, имеющий (S)-конфигурацию или (R)-конфигурацию по C-3, где каждый из A, B, C, D, E, F, G и H представляет собой C; каждый из R1 и R2 независимо выбран из H или галогена; R4 представляет собой H или (C1-C6)алкил, R3 и R5 представляют собой H; R6 и R7 связаны друг с другом в виде 4-12- членного моно- или бициклического кольца; R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, a, b, c, d, e и f имеют значения, определенные в настоящей заявке.
Другие варианты воплощения изобретения, описанного в настоящей заявке, представляют собой соединения, выбранные из группы, включающей:
(S)-N-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-1,2-тиазинан-1,1-диоксид;
N-(3-(3,6-Дифтор-9H-карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-изотиазолидин-1,1-диоксид;
(S)-N-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)изотиазолидин-1,1-диоксид;
2-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-5-фтор-изотиазолидин-1,1-диоксид;
2-(3-(3,6-Дифтор-9H-карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-1,2,6-тиадиазинан-1,1-диоксид;
N-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-N-(1-метилциклопентил)метансульфонамид;
N-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)изотиазолидин-1,1-диоксид;
N-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-2,3-дигидробензо[d]изотиазол-1,1-диоксид;
N-(3-(2,6-Дифтор-9H-карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-1,2-тиазинан-1,1-диоксид;
2-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-1,2,6-тиадиазинан-1,1-диоксид; или их фармацевтически приемлемые соли или гидраты.
В другом аспекте, соединения, описанные в настоящей заявке, модулируют Cry1 или Cry2. Модуляция Cry1 или Cry2 включает любое одно из следующих: связывание с Cry1 или Cry2; ингибирующую модификацию Cry1 или Cry2; изменение локализации Cry1 или Cry2; повышение или снижение стабилизации Cry1 или Cry2; увеличение или уменьшение связывания Cry1 или Cry2 с мишенью; повышение или снижение активности Cry1 или Cry2; и повышение или снижение активности мишени Cry1 или Cry2. Мишени Cry1 и/или Cry2 включают, но не ограничиваются этим, Per1, Per2, глюкокортикоидный рецептор (GR), CLOCK, BMAL1 или CLOCK-BMAL1 промоторную последовательность.
В другом аспекте, изобретение, описанное в настоящей заявке, обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую соединение в соответствии с пунктом 1 формулы изобретения или его фармацевтически приемлемую соль или гидрат и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или разбавитель. В некоторых вариантах воплощения, фармацевтическая композиция дополнительно включает одно или несколько дополнительных терапевтических средств.
В других аспектах, обеспечивается способ лечения Cry-опосредованного заболевания или расстройства у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке. В следующем аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ облегчения симптома Cry-опосредованного заболевания или расстройства у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке. Заболевание или расстройство может быть выбрано из группы, включающей диабет, метаболический синдром, синдром инсулинорезистентности, ожирение, глаукому, синдром Кушинга, психотическую депрессию, болезнь Альцгеймера, невропатическую боль, лекарственную зависимость, остеопороз, рак, макулярную дегенерацию и миопатию. В некоторых вариантах воплощения, способ может дополнительно включать введение субъекту одного или нескольких дополнительных терапевтических средств.
В другом аспекте, обеспечивается способ мониторинга развития или прогнозирования Cry-опосредованного заболевания или расстройства у субъекта, включающий измерение эффективного количества одного или нескольких криптохромов в первом образце от субъекта в первый период времени; измерение эффективного количества одного или нескольких криптохромов во втором образце от субъекта во второй период времени; и сравнение количества одного или нескольких криптохромов, обнаруженных в первом образце, с количеством одного или нескольких криптохромов, обнаруженных во втором образце, или с контрольным значением. В некоторых вариантах воплощения, мониторинг включает в себя оценку изменений риска развития Cry-опосредованного заболевания или расстройства у субъекта.
Субъект может включать в себя того, кто ранее получал лечение по поводу Cry-опосредованного заболевания или расстройства, того, кто ранее не получал лечение по поводу Cry-опосредованного заболевания или расстройства, или того, у кого ранее не было диагностировано Cry-опосредованное заболевание или расстройство. Образец может представлять собой цельную кровь, сыворотку, плазму, клетки крови, клетки эндотелия, биопсию ткани, лимфатическую жидкость, свободную жидкость брюшной полости, интерстициальную жидкость, костный мозг, спинномозговую жидкость (CSF), семенную жидкость, слюну, слизь, мокроту, пот или мочу.
В некоторых вариантах воплощения, первый образец берут у субъекта до лечения Cry-опосредованного заболевания или расстройства, а второй образец берут у субъекта после лечения Cry-опосредованного заболевания или расстройства. В других вариантах воплощения, субъекта лечат при помощи фармацевтической композиции, включающей соединения формулы I, раскрытые в настоящей заявке. В некоторых вариантах воплощения, мониторинг дополнительно включает выбор лечения для субъекта и/или мониторинг эффективности лечения Cry-опосредованного заболевания или расстройства, где лечение Cry-опосредованного заболевания или расстройства включает хирургическое вмешательство, введение фармацевтической композиции, определенной в настоящей заявке, отдельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, хирургическое вмешательство после введения или предшествующее введению фармацевтической композиции, представленной в настоящей заявке, или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, или не предпринимая никаких дальнейших действий.
В других вариантах воплощения, контрольное значение включает индексное значение, значение, полученное с использованием одного или нескольких алгоритмов прогнозирования риска Cry-опосредованного заболевания или расстройства, значение, полученное от субъекта, не имеющего Cry-опосредованного заболевания или расстройства, или значение, полученное от субъекта с диагнозом Cry-опосредованного заболевания или расстройства. В некоторых вариантах воплощения, измерение включает обнаружение присутствия или отсутствия одного или нескольких криптохромов, определение количества одного или нескольких криптохромов, уточнение типа одного или нескольких криптохромов и оценку способности одного или нескольких криптохромов к связыванию с мишенью. Мишень может представлять собой Per1, Per2 или CLOCK-BMAL1 промоторную последовательность. Как раскрыто в настоящей заявке, Cry-опосредованное заболевание или расстройство может быть выбрано из группы, включающей диабет, ожирение, метаболический синдром, синдром инсулинорезистентности, синдром Кушинга и глаукому, психотическую депрессию, болезнь Альцгеймера, невропатическую боль, лекарственную зависимость, остеопороз, рак, макулярную дегенерацию и миопатию.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют такое же значение, которое обычно известно рядовым специалистам в области, к которой относится данное изобретение. Хотя способы и вещества, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящей заявке, можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения, подходящие способы и вещества описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, указанные в настоящей заявке, включены исключительно посредством ссылки в полном объеме. В случае противоречий, преимущество имеет настоящее описание, включая определения. Кроме того, вещества, способы и примеры, описанные в настоящей заявке, являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.
Другие характерные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Характерные признаки, структуры или характеристики, описанные в данном описании, могут быть объединены любым подходящим образом в одном или нескольких вариантов воплощения. Например, использование фраз “иллюстративные варианты воплощения”, “приведенные в качестве примера варианты воплощения”, “некоторые варианты воплощения” или других подобных фраз в тексте настоящего описания относится к тому факту, что конкретный характерный признак, структура или характеристика, описанные в связи с вариантом воплощения, могут быть включены в, по меньшей мере, один вариант воплощения, описанный в настоящей заявке. Таким образом, фразы “иллюстративные варианты воплощения”, “приведенные в качестве примера варианты воплощения”, “в некоторых вариантах воплощения”, “в других вариантах воплощения” или другие подобные фразы в тексте настоящего описания необязательно все относятся к одной и той же группе вариантов воплощения, и описанные характерные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом в одном или более вариантов воплощения.
Для облегчения понимания данного раскрытия ниже определен ряд терминов. Термины, определенные настоящей заявкой, имеют значения, обычно известные рядовым специалистам в области, к которой относится данное изобретение. Такие термины, как “a”, “an” и “the” не предназначены для обозначения только единственной структуры, но включают общий класс, конкретный пример из которого может быть использован для иллюстрации. Термины в настоящей заявке использованы для описания конкретных вариантов воплощения изобретения, описанного в настоящей заявке, но их использование не ограничивает изобретение, кроме указанного в формуле изобретения.
Как используется в настоящей заявке, термины “включающий”, “включая” или “содержащий” используют в их открытом, не ограничивающем смысле.
Термин “галоген”, как он используется в настоящей заявке, если не указано иное, означает фтор, хлор, бром или йод.
Термин “алкил”, как он используется в настоящей заявке, если не указано иное, включает насыщенные моновалентные углеводородные радикалы с линейными или разветвленными фрагментами.
Термин “алкенил”, как он используется в настоящей заявке, включает моновалентные группы с прямой или разветвленной цепью, если не указано иное, с 2-6 атомами углерода, содержащие одну или несколько углерод-углеродных двойных связей, и в качестве примера можно указать этенил, 1-пропенил, 2-пропенил, 2-метил-1-пропенил, 1-бутенил, 2-бутенил и подобные.
Термин “алкинил”, как он используется в настоящей заявке, включает моновалентные группы с прямой или разветвленной цепью, содержащие, если не указано иное, от двух до шести атомов углерода, содержащие углерод-углеродную тройную связь, и в качестве примера можно указать этинил, 1-пропинил и подобные.
Термин “алкокси”, как он используется в настоящей заявке, если не указано иное, включает O-алкильные группы, где алкил имеет значение, определенное выше.
Термин “Me” означает метил, и “Et” означает этил.
Термин “циклоалкил”, используемый в настоящей заявке, если не указано иное, относится к не-ароматическому, насыщенному или частично насыщенному моноциклическому или конденсированному, спиро или неконденсированному бициклическому или трициклическому углеводороду, упоминаемому в настоящей заявке, содержащему в общей сложности от 3 до 10 атомов углерода. Иллюстративные примеры циклоалкила, получены из, но не ограниченные этим, следующих:
Термин “арил”, как он используется в настоящей заявке, если не указано иное, включает органический радикал, образованный из ароматического углеводорода путем удаления одного водорода, такой как фенил или нафтил.
Термин “(4-12)-членный гетероциклил”, как он используется в настоящей заявке, если не указано иное, включает ароматические и неароматические гетероциклические группы, содержащие от одного до четырех гетероатомов, каждый из которых выбран из O, S и N, где каждая гетероциклическая группа содержит от 4 до 12 атомов в своей кольцевой системе, и при условии, что кольцо указанной группы не содержит два смежных атома O или S. Неароматические гетероциклические группы включают группы, содержащие только 3 атома в их кольцевой системе, но ароматические гетероциклические группы должны содержать по меньшей мере 5 атомов в их кольцевой системе. Гетероциклические группы включают бензо-конденсированные кольцевые системы. Примером 3-членной гетероциклической группы является азиридин, примером 4-членной кольцевой гетероциклической группы является азетидинил (образованный из азетидина). Примером 5-членной гетероциклической группы является тиазолил, примером 7-членного кольца является азепинил, и примером 10-членной гетероциклической группы является хинолинил. Примеры не-ароматических гетероциклических групп включают пирролидинил, тетрагидрофуранил, дигидрофуранил, тетрагидротиенил, тетрагидропиранил, дигидропиранил, тетрагидротиопиранил, пиперидино, морфолино, тиоморфолино, тиоксанил, пиперазинил, азетидинил, оксетанил, тиетанил, гомопиперидинил, оксепанил, тиепанил, оксазепинил, диазепинил, тиазепинил, 1,2,3,6-тетрагидропиридинил, 2-пирролинил, 3-пирролинил, индолинил, 2H-пиранил, 4H-пиранил, диоксанил, 1,3-диоксоланил, пиразолинил, дитианил, дитиоланил, дигидропиранил, дигидротиенил, дигидрофуранил, пиразолидинил, имидазолинил, имидазолидинил, 3-азабицикло[3.1.0]гексанил, 3-азабицикло[4,1,0]гептанил, 3H-индолил и хинолизинил. Примеры ароматических гетероциклических групп включают пиридинил, имидазолил, пиримидинил, пиразолил, триазолил, пиразинил, тетразолил, фурил, тиенил, изоксазолил, тиазолил, оксазолил, изотиазолил, пирролил, хинолинил, изохинолинил, индолил, бензимидазолил, бензофуранил, циннолинил, индазолил, индолизинил, фталазинил, пиридазинил, триазинил, изоиндолил, птеридинил, пуринил, оксадиазолил, тиадиазолил, фуразанил, бензофуразанил, бензотиофенил, бензотиазолил, бензоксазолил, хиназолинил, хиноксалинил, нафтиридинил и фуропиридинил. Вышеуказанные группы, как видно из перечисленного выше, могут быть C-присоединенными или N-присоединенными, где такое возможно. Например, группа, образованная из пиррола, может представлять собой пиррол-1-ил (N-присоединенная) или пиррол-3-ил (C-присоединенная). Кроме того, группа, образованная из имидазола, может представлять собой имидазол-1-ил (N-присоединенная) или имидазол-3-ил (C-присоединенная). 4-12-Членный гетероцикл, необязательно, может быть замещен по любому кольцевому атому(атомам) углерода, серы или азота одной или двумя оксогруппами, в одном кольце. Примером гетероциклической группы, где 2 кольцевых атома замещены оксогруппами, является 1,1-диоксо-тиоморфолинил. Другие иллюстративные примеры 4-12-членного гетероцикла, получены, но не ограничиваясь этим, из следующих:
Термин “4-12-членное моно- или бициклическое кольцо”, как он используется в настоящей заявке, означает, если не указано иное, циклоалкил, арил и (4-12)-членные гетероциклические группы, где циклоалкил, арил и (4-12)-членный гетероциклил имеют значения, определенные выше.
Термин “замещенный”, как он используется в настоящей заявке, означает что любой один или несколько атомов водорода на указанном атоме замещен заместителем, выбранным из указанных групп, при условии, что нормальная валентность указанного атома не превышена, и что замещение приводит к образованию стабильного соединения. Когда заместитель представляет собой кето-группу (то есть, =O), тогда 2 атома водорода на атоме замещены. Кето-заместителей нет на ароматических группах. Двойные связи в кольце, как это используется в настоящей заявке, представляют собой двойные связи, которые образованы между двумя смежными кольцевыми атомами (например, C=C, C=N или N=N). Неограничивающие примеры таких групп включают, без ограничения, H, CH3, NO2, SO2N(CH3)2, SO2N((CH3)SO2), COOH, COOCH3, CO(N(CH3)), алкил, алкенил, алкинил, арил, аралкил, циклоалкил, гетероциклил, алкиларил, гетероарил, гетероциклоалкил, алкокси (то есть метокси, этокси и т.д.), алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, алкиламинокарбонил, аралкиламинокарбонил, алкениламинокарбонил, алкилкарбонил, арилкарбонил, аралкилкарбонил, алкенилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкилтиокарбонил, трифторметил, пентафторэтил, галоген (то есть хлор, фтор, бром, йод), циано, тио, амидо, простой эфир, сложный эфир, гидроксил, гидроксиалкил, насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты, азидо, фосфонамидо, сульфонамидо, лактам, фосфат, фосфонато, фосфинато, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), амидино, имино, гуанидино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, циано, азидо и т.д.
Изобретение, раскрываемое в настоящей заявке, обеспечивает карбазол-содержащие сульфонамидные соединения, которые модулируют одну или несколько молекул криптохрома. Эти соединения имеют общую структуру, представленную в формуле I:
или их фармацевтически приемлемые соли или гидраты, где
каждый из A, B, C, D, E, F, G и H независимо представляет собой N или C;
каждый из R1 и R2, когда A, B, C, D, E, F, G или H представляет собой C, независимо выбран из H, галогена, циано, нитро, -CF3, -CHF2, -CH2F, трифторметокси, азидо, гидроксила, (C1-C6)алкокси, (C1-C6)алкила, (C2-C6)алкенила, (C2-C6)алкинила, -(C=O)-R8, -(C=O)-O-R8, -O-(C=O)-R8, -NR8(C=O)-R10, -(C=O)-NR8R9, -NR8R9, -NR8OR9, -S(O)cNR8R9, -S(O)d(C1-C8)алкила, -O-SO2-R8, NR8-S(O)c, -(CR8R9)d(3-10)-членного циклоалкила, -(CR8R9)e(C6-C10)арила, -(CR8R9)e(4-10)-членного гетероциклила, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(C6-C10)арила, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(4-10)-членного гетероциклила, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арила, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членного гетероциклила, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арила и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членного гетероциклила;
каждый из R3 и R5 независимо выбран из H, циано, -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкила, (C2-C6)алкенила, (C2-C6)алкинила, -(C=O)-R8, -(C=O)-O-R8, -(C=O)-NR8R9, -S(O)cNR8R9, -S(O)d(C1-C8)алкила, -(CR8R9)d(3-10)-членного циклоалкила, -(CR8R9)e(C6-C10)арила, -(CR8R9)e(4-10)-членного гетероциклила, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(C6-C10)арила, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(4-10)-членного гетероциклила, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арила, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членного гетероциклила, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арила и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членного гетероциклила;
каждая из групп R3 необязательно связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца;
каждая из групп R5 необязательно связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца;
R4 представляет собой H, -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(C=O)-R8, -(C=O)-O-R8, -(C=O)-NR8R9, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил;
R6 представляет собой H, -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(C=O)-R8, -(C=O)-O-R8, -(C=O)-NR8R9, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил;
где R5 и R6 необязательно связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца;
R7 представляет собой -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(C=O)-R8, -(C=O)-O-R8, -NR8(C=O)-R10, -(C=O)-NR8R9, -NR8R9, -NR8OR9, - NR8-S(O)c, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)f(C=O)(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил;
где R6 и R7 необязательно связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца;
каждый из R8, R9 и R10 независимо выбран из H, (C1-C6)алкила, -(CR11R12)e(3-10)-членного циклоалкила, -(CR11R12)g(C6-C10)арила и -(CR11R12)g(4-10)-членного гетероциклила;
любые атомы углерода (C1-C6)алкила, (3-10)-членного циклоалкила, (C6-C10)арила и (4-10)-членного гетероциклила из описанных выше R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15 и R16 независимо необязательно замещены 1-3 заместителями R14, каждый из которых независимо выбран из галогена, циано, нитро, -CF3, -CHF2, -CH2F, трифторметокси, азидо, гидроксила, -O-R15, (C1-C6)алкокси, -(CR8R9)e(C1-C6)алкокси, (C1-C6)алкила, (C2-C6)алкенила, (C2-C6)алкинила, -(C=O)-R11, -(C=O)-R15, -(C=O)-O-R11,-(C=O)-O-R15, -O-(C=O)-R11, -O-(C=O)-R15, -NR11(C=O)-R13, -(C=O)-NR11R12, -(C=O)-NR11R15, -NR11R12, -NR11R15, -NR11OR12, -NR11OR15, -S(O)cNR11R12, -S(O)cNR11R15, -S(O)d(C1-C6)алкила, -S(O)dR15, -O-SO2-R11, -O-SO2-R15, -NR11-S(O)c, -NR15-S(O)c, -(CR11R12)e(3-10)-членного циклоалкила, -(CR11R12)e(C6-C10)арила, -(CR11R12)e(4-10)-членного гетероциклила, -(CR11R12)f(C=O)(CR11R12)e(C6-C10)арила, -(CR11R12)f(C=O)(CR11R12)e(4-10)-членного гетероциклила, -(CR11R12)eO(CR11R12)f(C6-C10)арила, -(CR11R12)eO(CR11R12)f(4-10)-членного гетероциклила, -(CR11R12)fS(O)d(CR11R12)e(C6-C10)арила и -(CR11R12)fS(O)d(CR11R12)e(4-10)-членного гетероциклила;
любые атомы углерода (C1-C6)алкила, (3-10)-членного циклоалкила, (C6-C10)арила и (4-10)-членного гетероциклила из описанного выше R14 независимо необязательно замещены 1-3 заместителями R16, каждый из которых независимо выбран из галогена, циано, нитро, -CF3, -CHF2, -CH2F, трифторметокси, азидо, (CH2)eOH, (C1-C6)алкокси, (C1-C6)алкила, (C2-C6)алкенила, (C2-C6)алкинила, -(C=O)-R11, -(C=O)-R15, -(C=O)-O-R11, -(C=O)-O-R15, -O-(C=O)-R11, -O-(C=O)-R15, -NR11(C=O)-R13, -(C=O)-NR11R12, -NR11R12 и -NR11R15;
любые атомы азота (4-10)-членного гетероциклила из описанных выше R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R14 и R15 независимо необязательно замещены (C1-C6)алкилом, (C2-C6)алкенилом, (C2-C6)алкинилом, -(C=O)-R11, -(C=O)-O-R11, -(C=O)-NR11R12, -(CR11R12)e(3-10)-членным циклоалкилом, -(CR11R12)e(C6-C10)арилом, -(CR11R12)e(4-10)-членным гетероциклилом, -(CR11R12)f(C=O)(CR11R12)e(C6-C10)арилом или -(CR11R12)f(C=O)(CR11R12)e(4-10)-членным гетероциклилом;
каждый R11, R12 и R13 независимо представляют собой H или (C1-C6)алкил;
R15 представляет собой -(CR11R12)e(3-10)-членный циклоалкил, -(CR11R12)e(C6-C10)арил или -(CR11R12)e(4-10)-членный гетероциклил;
a и b, каждый независимо, имеют значения 1, 2, 3 или 4;
c имеет значение 1 или 2;
d имеет значение 0, 1 или 2; и
e, f и g, каждый независимо, имеет значение 0, 1, 2, 3, 4 или 5.
В иллюстративных вариантах воплощения соединений формулы I, каждый из A, B, C, D, E, F, G и H представляют собой C; каждый из R1 и R2 независимо выбран из H или галогена; R4 представляет собой H или (C1-C6)алкил, R3 и R5 представляют собой H; R6 представляет собой -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил; R7 представляет собой -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил; R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, a, b, c, d, e и f имеют значения, определенные в настоящей заявке.
В некоторых вариантах воплощения, каждый из A, B, C, D, E, F, G и H представляют собой C; каждый из R1 и R2 независимо выбран из H или галогена; R4 представляет собой H или (C1-C6)алкил, R3 и R5 представляют собой H; R6 и R7 связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца; R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, a, b, c, d, e и f имеют значения, определенные в настоящей заявке.
В других вариантах воплощения, каждый из A, B, C, D, E, F, G и H представляют собой C; каждый из R1 и R2 независимо выбран из H или галогена; R4 представляет собой H или (C1-C6)алкил; R3 и один R5 представляют собой H; один R5 и R6 связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца; R7 представляет собой -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2- C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил; R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, a, b, c, d, e и f имеют значения, определенные в настоящей заявке.
В некоторых вариантах воплощения изобретения, раскрываемого в настоящей заявке, соединение формулы I представляет собой отдельный энантиомер, имеющий (S)-конфигурацию или (R)-конфигурацию по C-3, где каждый из A, B, C, D, E, F, G и H представляют собой C; каждый из R1 и R2 независимо выбран из H или галогена; R4 представляет собой H или (C1-C6)алкил, R3 и R5 представляют собой H; R6 представляет собой -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил; R7 представляет собой -CF3, -CHF2, -CH2F, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, -(CR8R9)d(3-10)-членный циклоалкил, -(CR8R9)e(C6-C10)арил, -(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(C6-C10)арил, -(CR8R9)eO(CR8R9)f(4-10)-членный гетероциклил, -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(C6-C10)арил и -(CR8R9)fS(O)d(CR8R9)e(4-10)-членный гетероциклил; R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, a, b, c, d, e и f имеют значения, определенные в настоящей заявке.
В других вариантах воплощения, соединение формулы I представляет собой отдельный энантиомер, имеющий (S)-конфигурацию или (R)-конфигурацию по C-3, где каждый из A, B, C, D, E, F, G и H представляют собой C; каждый из R1 и R2 независимо выбран из H или галогена; R4 представляет собой H или (C1-C6)алкил, R3 и R5 представляют собой H; R6 и R7 связаны друг с другом в виде 4-12-членного моно- или бициклического кольца; R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, a, b, c, d, e и f имеют значения, определенные в настоящей заявке.
В некоторых вариантах воплощения, соединение может быть выбрано из группы, состоящей из следующих:
(S)-N-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-1,2-тиазинан-1,1-диоксид;
N-(3-(3,6-Дифтор-9H-карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-изотиазолидин-1,1-диоксид;
(S)-N-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)изотиазолидин-1,1-диоксид;
2-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-5-фтор-изотиазолидин-1,1-диоксид;
2-(3-(3,6-Дифтор-9H-карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-1,2,6-тиадиазинан-1,1-диоксид;
N-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-N-(1-метилциклопентил)метансульфонамид;
N-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)изотиазолидин-1,1-диоксид;
N-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-2,3-дигидробензо[d]изотиазол-1,1-диоксид;
N-(3-(2,6-Дифтор-9H-карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-1,2-тиазинан-1,1-диоксид;
2-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-1,2,6-тиадиазинан-1,1-диоксид; или фармацевтически приемлемой соли или гидрата такого соединения.
Термин “фармацевтически приемлемый”, как он используется в настоящей заявке, относится к веществу, такому как носитель или разбавитель, которое не нарушает биологическую активность или свойства соединений, описанных в настоящей заявке, и является относительно нетоксичным, то есть к веществу, которое можно вводить субъекту, не вызывая при этом нежелательные биологические эффекты или нежелательные взаимодействия с каким-либо из компонентов композиции, в которое оно содержится.
Термин “фармацевтически приемлемая соль”, как он используется в настоящей заявке, относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность свободных кислот и оснований указанного соединения, и которые не являются биологически или иным образом нежелательными. Фармацевтически приемлемые соли соединений формулы I включают кислотно-аддитивные и соли оснований таких соединений. Подходящие кислотно-аддитивные соли получают из кислот, которые образуют нетоксичные соли. Примеры включают соли, такие как ацетат, адипат, арабогалактансульфонат, аскорбат, аспартат, бензоат, безилат, бикарбонат/карбонат, бисульфат/сульфат, борат, камсилат, холат, цитрат, эдисилат, эстолат, эсилат, формиат, фумарат, галактуронат, глуцептат, глюконат, глюкуронат, глутамат, гексафторфосфат, гибензат, гиппурат, гидрохлорид/хлорид, гидробромид/бромид, гидройодид/йодид, 3-гидрокси-2-нафтоат, 1-гидрокси-2-нафтоат, изетионат, лактат, лактобионат, малат, малеат, малонат, манделат, мезилат, метилсульфат, муцинат, нападисилат, нафталат, 2-напсилат, никотинат, нитрат, олеат, оротат, оксалат, пальмитат, памоат, фосфат/гидрофосфат/дигидрофосфат, сахарат, салицилат, стеарат, сукцинат, сульфосалицилат, тартрат, тозилат, трифторацетат и триптофанат.
Подходящие соли оснований получают из оснований, которые образуют нетоксичные соли. Примеры включают соли аденина, алюминия, 2-амино-2-метилпропан-1-ола, аргинина, бенетамина, бензатина, кальция, холина, цитозина, диэтиламина, диоламина, эполамина, эрбумина, этилендиамина, глюкозамина, глицина, гуанидина, гуанина, гидрабамина, лизина, магния, меглумина, морфолина, никотинамида, оламина, омитина, пиперазина, калия, прокаина, пролина, пиридоксина, серина, серебра, натрия, троламина, трометамина, тирозина, валина и цинка. Обзор подходящих солей см. в “Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use” by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002).
Фармацевтически приемлемую соль соединения формулы I можно легко получить путем смешивания вместе растворов соединения формулы I и желаемой кислоты или основания, как это является подходящим. Соль может осаждаться из раствора, и ее можно собирать путем фильтрования или можно выделить путем выпаривания растворителя. Степень ионизации в соли может варьироваться от полностью ионизированной до почти неионизированной.
Соединения формулы I также могут существовать в различных кристаллических формах, известных как полиморфы. Полиморфы включают различные кристаллические упаковки одного и того же элементного состава соединения. Полиморфы могут иметь разные рентгеновские дифрактограммы, инфракрасные спектры, температуры плавления, плотность, твердость, форму кристалла, оптические и электрические свойства, стабильность, сольваты и растворимость. Различные факторы, такие как растворитель перекристаллизации, скорость кристаллизации и температура хранения, могут привести к доминированию отдельной кристаллической формы.
“Сольват” означает фармацевтически приемлемую форму сольвата указанного соединения, которая сохраняет биологическую эффективность такого соединения. Примеры сольватов включают соединения по настоящему изобретению в комбинации с водой, изопропанолом, этанолом, метанолом, диметилсульфоксидом, этилацетатом, уксусной кислотой или этаноламином. Термин “гидрат” относится к сольвату, где растворитель представляет собой воду. Термин “алкоголят” относится к сольвату, где растворитель представляет собой спирт. Гидраты получают путем комбинации одной или нескольких молекул воды с одной молекулой вещества, в которой вода сохраняет свое молекулярное состояние как H2O. Неограничивающие примеры гидратов включают моногидраты, дигидраты и т.д.
Соединения по настоящему изобретению включают соединения формулы I, определенные в настоящей заявке, их полиморфы, пролекарства и изомеры (включая оптические, геометрические и таутомерные изомеры), а также изотопно-меченные соединения формулы I.
Соединения по настоящему изобретению можно вводить в виде пролекарств. Таким образом, некоторые производные соединений формулы I, которые сами могут обладать незначительной или вообще не обладать фармакологической активностью, могут, при внутреннем или наружном введении в организм, преобразовываться в соединения формулы I, имеющие желаемую активность, например, путем гидролитического расщепления. Такие производные указаны как ‘пролекарства’. Дополнительную информацию, касающуюся использования пролекарств можно найти в “Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, ACS Symposium Series (T. Higuchi and W. Stella) и “Bioreversible Carriers in Drug Design”, Pergamon Press, 1987 (Ed. E. B. Roche, American Pharmaceutical Association). Пролекарства, например, можно получить заменой подходящих функциональных групп, присутствующих в соединениях формулы I, некоторыми группами, известными специалистам в данной области как ‘про-группы’, описанные, например, в “Design of Prodrugs” by H. Bundgaard (Elsevier, 1985).
Некоторые примеры таких пролекарств включают такие, где соединение формулы I содержит карбоновокислотную функциональную группу (-CO2H), сложный эфир такого соединения, например, замещение водорода (C1-C8)алкилом; где соединение формулы I содержит спиртовую функциональную группу (-OH), простой эфир такого соединения, например, замещение водорода (C1-C8)алканоилоксиметилом; и где соединение формулы I содержит вторичную амино функциональную группу (-NHR, где R является отличным от H), амид такого соединения, например, замещение одного водорода (C1-C10)алканоилом. Другие примеры замещающих групп в соответствии с описанными выше примерами и примеры других типов пролекарств известны рядовым специалистам в данной области.
Соединения формулы I содержат один или несколько асимметричных углеродных атомов. Должно быть понятно, что все энантиомеры и/или диастереомеры, соответствующие соединениям формулы I, можно получить аналогичными способами. Все оптические изомеры и стереоизомеры соединений формулы I и их смеси рассматриваются как охватываемые объемом настоящего изобретения. Что касается соединений формулы I, изобретение включает использование рацемата, одной или нескольких энантиомерных форм, одной или нескольких диастереомерных форм или их смесей. Соединения формулы I также могут существовать в виде таутомеров. Настоящее изобретение относится к использованию всех таких таутомеров и их смесей.
Некоторые функциональные группы, содержащиеся в соединениях по настоящему изобретению, могут быть замещены биоизостерными группами, то есть группами, которые имеют такие же пространственные или электронные требования к исходной группе, демонстрируют отличающиеся или улучшенные физико-химические или другие свойства. Подходящие примеры хорошо известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваются этим, группы описанные в Patini, et al. Chem Rev. 1996, 96, 3147-3176 и в цитируемых в этой работе ссылочных документах.
В объем заявленных соединений формулы I включены фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли или соли оснований, где противоион является оптически активным, например, D-лактат или L-лизин, или рацемические, например, DL-тартрат или DL-аргинин. Цис/транс изомеры можно разделить с использованием традиционных процедур, хорошо известных специалистам в данной области, например, хроматографии и фракционной кристаллизации. Традиционные процедуры для получения/выделения индивидуальных энантиомеров включают хиральный синтез из подходящего оптически чистого предшественника или разделение рацемата (или рацемата соли или производного) с использованием, например, хиральной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Альтернативно, рацемат (или рацемический предшественник) можно подвергнуть взаимодействию с подходящим оптически активным соединением, например, спиртом, или в случае, когда соединение формулы I содержит кислотную или щелочную группу, с кислотой или основанием, например винной кислотой или 1-фенилэтиламином. Полученную диастереомерную смесь можно разделить при помощи хроматографии и/или фракционной кристаллизации и диастереомеры преобразовать в соответствующие чистые энантиомеры и/или диастереомеры способами, хорошо известными специалистам в данной области. Хиральные соединения по настоящему изобретению (и их хиральные предшественники) можно получить в энантиомерно- и/или диастереомерно-обогащенной форме с использованием хроматографии, типично ВЭЖХ, на асимметричной смоле с подвижной фазой, состоящей из углеводорода, типично гептана или гексана, содержащего от 0 до 50% изопропанола, типично от 2 до 20%, и от 0 до 5% алкиламина, типично 0,1% диэтиламина. Концентрирование элюата дает обогащенную смесь. Смеси энантиомеров и/или диастереомеров можно разделить с использованием традиционных процедур, известных специалистам в данной области. Смотри, например, “Stereochemistry of Organic Compounds” by E. L. Eliel (Wiley, New York, 1994).
Соединения формулы I могут быть изотопно-меченными, где один или несколько атомов замещены атомами, имеющими такой же атомный номер, но атомная масса или массовое число которых отличны от атомной массы или массового числа, обычно встречающихся в природе. Примеры изотопов, подходящих для включения в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, такие как2H и3H, углерода, такие как11C,13C и14C, хлора, такие как36Cl, фтора, такие как18F, иода, такие как123I и125I, азота, такие как13N и15N, кислорода, такие как15O,17O и18O, фосфора, такие как32P, и серы, такие как35S. Некоторые изотопно-меченные соединения формулы I, например, соединения, включающие радиоактивный изотоп, являются полезными в исследованиях дистрибуции лекарственного средства и/или субстрата ткани. Радиоактивные изотопы трития, т.е.3H, и углерода-14, т.е.14C, являются особенно полезными для этих целей в свете простоты их включения и легкой доступности средств детекции. Замещение более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий, т.е.2H, может дать некоторые терапевтические преимущества, являющиеся результатом большей метаболической стабильности, например, более высокий период полужизни in vivo или снижения уровня необходимых доз, и, следовательно, может быть предпочтительным в некоторых обстоятельствах. Замещение позитрон-испускающими изотопами, такими как11C,18F,15O и13N, может быть полезным в исследованиях методом Позитрон-Эмиссионной Томографии (PET) для определения заполнения субстрата рецептором. Изотопно-меченные соединения формулы I, как правило, могут быть получены с использованием традиционных процедур, известных специалистам в данной области, или способами, аналогичными тем, которые описаны в сопроводительных Примерах и Получениях, с использованием соответствующего изотопно-меченного реагента вместо не-меченного реагента, используемого ранее.
Соединения по настоящему изобретению модулируют Cry1 и/или Cry2. Как используется в настоящей заявке, “модулирование” относится к повышению, снижению или изменению Cry1 и Cry2 функции, активности или присущей им характеристик. Модуляция Cry1 или Cry2 включает любое одно из следующих: связывание с Cry1 или Cry2; ингибирующую модификацию Cry1 или Cry2; изменение локализации Cry1 или Cry2; повышение или снижение стабилизации Cry1 или Cry2; увеличение или уменьшение связывания Cry1 или Cry2 с мишенью; повышение или снижение активности Cry1 или Cry2; и повышение или снижение активности мишени Cry1 или Cry2, или любую их комбинацию. Мишени Cry1 и/или Cry2 включают, но не ограничиваются этим, Per1, Per2, глюкокортикоидный рецептор (GR), CLOCK, BMAL1 или CLOCK-BMAL1 промоторную последовательность.
Модуляция Cry1 и Cry2 включает: связывание соединения по настоящему изобретению с Cry1 и/или Cry2, либо через прямое взаимодействие, или опосредованное взаимодействие. В некоторых аспектах, соединение по настоящему изобретению может связываться с комплексом, содержащим Cry1 и/или Cry2. Способы для детекции взаимодействия между малыми молекулами и белками известны из уровня техники, например, методы иммунопреципитации, хроматографии и различные матричные форматы.
Собственные характеристики Cry1 и Cry2, такие как пост-трансляционная модификация, стабильность или локализация, можно изменить с использованием соединений по настоящему изобретению. Пост-трансляционная модификация Cry1 и Cry2 может играть критическую роль в определении активности, стабильности или клеточной локализации Cry1 и Cry2. Некоторые исследования показали, что фосфорилирование может изменить стабильность Cry1 и Cry2. Соединения по настоящему изобретению могут предотвращать или увеличивать пост-трансляционную модификацию Cry1 и Cry2, например, фосфорилирование, убихитинирование, ацетилирование, гликозилирование, рибозилирование или сумоилирование. Способы детекции пост-трансляционной модификации Cry1 или Cry2 легко могут осуществить специалисты в данной области. Такие способы детекции включают вестерн-блот и радиоиммуноанализы. Cry1 и Cry2 локализуются к ядру в определенных условиях, например, в результате гетеродимеризации с Per1 и Per2. Попадая в ядро, Cry1 и Cry2 играют роль, прерывая инициацию транскрипции ядерным CLOCK-BMAL1 комплексом, приводя, таким образом, к даун-регуляции генов циркадного ритма с отрицательной петлей обратной связи, что является критическим для поддержания циркадных осцилляций. Локализацию белков легко может определить специалист в данной области, например, с использованием анализов иммунофлуоресценции, субклеточного фракционирования и вестер-блоттинга. Даун-регуляция Cry1 и Cry2 также является критической для циркадных осцилляций и опосредована на транскрипционном и белковом уровне. Стабильность Cry1 и Cry2 можно измерить способами, известными из уровня техники, а также способами, представленными в Примерах 5-8.
Активность Cry1 и Cry2, как это используется в настоящей заявке, включает связывание Cry1 или Cry2 с мишенью и активность мишени, находящейся ниже на пути Cry1 или Cry2. Соединения по настоящему изобретению могут увеличивать или уменьшать связывание Cry1 или Cry2 с мишенью. Мишени, которые связываются с Cry1 и/или Cry2, известны из уровня техники и включают Per1, Per2, глюкокортикоидный рецептор, CLOCK-BMAL1 промоторную последовательность и VEGF промоторную последовательность. Мишени Cry1 и Cry2, на которые ссылаются в настоящей заявке, также включают такие мишени, которые еще не идентифицированы. Связывание Cry1 или Cry2 с мишенью можно определить, например, методом иммунопреципитации, дрожжевым двух-гибридным, аффинной хроматографии. Направляемая по ходу транскрипции активность мишени Cry1 или Cry2 включает CLOCK-BMAL1-опосредованную транскрипцию, связывание Cry1 или Cry2 с CLOCK-BMAL-1 промотором, связывание Cry1 или Cry2 с VEGF промотором, Per1 или Per2 локализацию или стабильность, CLOCK-BMAL1 димеризацию, экспрессию CLOCK-BMAL1 генов-мишеней, таких как Cry1, Cry2, Per1, Per2, Rev-erb α и β, Rora, TIM белки и VEGF. Способы для детекции активности промотора включают метод иммунопреципитации хроматина, анализ сдвига электрофоретической подвижности или промотор-люциферазные анализы, описанные в Примерах 3 и 4. Способы определения экспрессии генов-мишеней включают анализ генной экспрессии и микроматрицы, которые легко смогут осуществить рядовые специалисты в данной области.
В других аспектах изобретения, раскрываемого в настоящей заявке, обеспечивается фармацевтическая композиция, включающая соединение в соответствии с формулой I и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или разбавитель. Способы получения различных фармацевтических композиций с определенным количеством активного соединения известны, или должны быть очевидны, специалистам в данной области. Кроме того, рядовым специалистам в данной области известны способы формулирования и введения. Такие вопросы обсуждаются, например, в Goodman and Gilman’s “The Pharmaceutical Basis of Therapeurics”, в действующей редакции, Pergamon Press; и в “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, в действующей редакции, Mack Publishing, Co., Easton, PA. Эти способы можно использовать в соответствующих аспектах и вариантах воплощения способов и композиций, описанных в настоящей заявке. Фармацевтические композиции предпочтительно получают в GMP условиях. Следующие примеры представлены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
Поскольку соединения, описанные в настоящей заявке, предназначены для использования в фармацевтических композициях, должно быть очевидно, что каждое из них предпочтительно обеспечивается в по существу чистой форме, например, по меньшей мере с 50% чистоты, по меньшей мере с 55% чистоты, по меньшей мере с 60% чистоты, по меньшей мере с 65% чистоты, по меньшей мере с 70% чистоты, по меньшей мере с 75% чистоты, по меньшей мере с 80% чистоты, по меньшей мере с 85%, по меньшей мере с 90% чистоты, по меньшей мере с 95% чистоты, по меньшей мере с 96% чистоты, по меньшей мере с 97% чистоты, по меньшей мере с 98% чистоты или по меньшей мере с 99% чистоты. Проценты, представленные в настоящей заявке, указаны в расчете на массу. Препараты соединений, которые содержат примеси, можно использовать для получения более чистых форм, используемых в фармацевтических композициях; эти менее чистые препараты соединений должны содержать по меньшей мере 1%, более подходяще по меньшей мере 5%, например, от 10 до 49% соединения формулы I.
Соединения формулы I могут быть представлены в подходящих местных, пероральных, назальных, глазных, мукозальных, ректальных, вагинальных и парентеральных фармацевтических композициях для использования в лечении Cry-опосредованных заболеваний. Соединения по настоящему изобретению можно вводить перорально в виде таблеток или капсул, в виде масляных или водных суспензий, лепешек, пастилок, порошков, гранул, эмульсий, сиропов или эликсиров. Композиции для перорального использования могут включать одно или несколько веществ, таких как отдушки, подсластители, красители и консерванты, для получения фармацевтически привлекательных и имеющих приятный вкус и запах препаратов. Таблетки могут содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, носители, разбавители и адъюванты в качестве веществ, способствующих получению таких таблеток. Как принято в данной области, эти таблетки могут иметь фармацевтически приемлемое энтеросолюбильное покрытие, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, для замедления разложения и абсорбции в желудочно-кишечном тракте для обеспечения продолжительного действия в течение более длительного периода времени. Скорость растворения соединений с плохой водорастворимостью можно повысить с использованием высушенной методом распылительной сушки дисперсии, такой как описанные в Takeuchi, H. et al. J. Pharm. Pharmacol. 1987, 39, 769-773.
Композиции для перорального использования могут быть в форме твердых желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан и инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином. Они также могут быть в форме мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, такой как арахисовое масло, жидкий парафин или оливковое масло.
Водные суспензии обычно содержат активные ингредиенты в смеси с эксципиентами, подходящими для получения водной суспензии. Такие эксципиенты могут представлять собой суспендирующее вещество, такое как Kolliphor, натрий карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, камедь трагаканта и аравийскую камедь; диспергирующее или смачивающее вещество, которое может представлять собой природный фосфатид, такой как лецитин, продукт конденсации этиленоксида и длинноцепочечной жирной кислоты, например, полиоксиэтиленстеарат, продукт конденсации этиленоксида и длинноцепочечного алифатического спирта, такой как гептадекаэтиленоксицетанол, продукт конденсации этиленоксида и неполного сложного эфира, образованного из жирной кислоты и гекситола, такой как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или ангидриды жирных кислот гекситола, такие как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат.
Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильной водной или масляной суспензии для инъекций. Такую суспензию можно сформулировать в соответствии с известными способами в виде водных изотонических растворов или суспензий, и суппозитории можно получить из жирных эмульсий или суспензий. Композиции могут быть стерилизованными и/или могут содержать адъюванты, такие как консервант, стабилизатор, смачивающее вещество или эмульгатор, вещества, способствующие растворению, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они также могут содержать другие терапевтически ценные вещества. Стерильный препарат для инъекций также может быть сформулирован в виде суспензии в нетоксичном парентерально-приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Из приемлемых носителей и растворителей, которые можно использовать, можно указать воду, раствор Ригнера и изотонический раствор хлорида натрия. Для этой цели можно использовать любое светлое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, можно использовать для получения препаратов для инъекций.
Соединения формулы I также можно вводить в форме суппозиториев для ректального введения лекарственного средства. Эти композиции можно получить путем смешивания лекарственного средства с подходящим нераздражающим эксципиентом, который является твердым при температуре около 25°C, но жидким при ректальной температуре, и поэтому будет плавиться в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такие вещества включают масло какао и другие глицериды.
Для препаратов для местного или чрескожного применения используют, например, кремы, мази, желе, растворы или суспензии, содержащие соединения по настоящему изобретению. Подходящие композиции для чрескожного применения включают эффективное количество соединения по настоящему изобретению с носителем. Носитель может включать абсорбируемые фармакологически приемлемые растворители, способствующие прохождению через кожу хозяина. Например, чрескожные устройства могут быть в форме повязки, включающей поддерживающий слой, резервуар, содержащий соединение, необязательно с носителями, необязательно контролирующий скорость барьер для доставки соединения на кожу хозяина с контролируемой и предварительно определенной скоростью в течение продолжительного периода времени, и средства для удержания устройства на коже. Матричные чрескожные препараты и устройства для ионофореза также можно использовать. Подходящие композиции для местного применения, например, кожного и глазного, предпочтительно представляют собой водные растворы, мази, кремы или гели, хорошо известные из уровня техники. Они могут содержать солюбилизаторы, стабилизаторы, повышающие тоничность вещества, буферы и консерванты.
Активные соединения могут быть получены с фармацевтически приемлемыми носителями, которые будут защищать соединение от быстрого выведения из организма, например, в виде композиции контролируемого высвобождения, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких композиций должны быть очевидны специалистам в данной области.
Соединения формулы I также можно получить в форме липосомных систем доставки, таких как мелкие однослойные везикулы, крупные однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы из различных фосфолипидов, таких как холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины.
Подходящая форма длительного высвобождения любого из активных фармацевтических ингредиентов или обоих может представлять собой матричную композицию таблетки или капсулы. Подходящие образующие матрицу вещества включают, например, воски (например, карнауба, пчелиный воск, парафиновый воск, церезин, шеллак, жирные кислоты и жирные спирты), масла, отвержденные масла или жиры (например, отвержденное рапсовое масло, касторовое масло, говяжий жир, пальмовое масло и соевое масло) и полимеры (например, гидроксипропилцеллюлоза, поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза и полиэтиленгликоль). Другие подходящие вещества матрицы для получения таблеток представляют собой микрокристаллическую целлюлозу, измельченную в порошок целлюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, этилцеллюлозу, с другими носителями и наполнителями. Таблетки также могут содержать грануляты, порошки или гранулы с покрытиями. Таблетки также могут быть многослойными. Многослойные таблетки являются особенно предпочтительными, когда активные ингредиенты имеют сильно различающиеся фармакокинетические профили. Готовая таблетка, необязательно, может быть с покрытием или без покрытия.
Композиция для покрытия типично содержит нерастворимую полимерную матрицу (приблизительно 15-85% масс. композиции покрытия) и водорастворимое вещество (например, приблизительно 15-85% масс. композиции покрытия). Необязательно можно использовать или включить энтеросолюбильный полимер (приблизительно 1-99% масс. композиции покрытия). Подходящие водорастворимые вещества включают полимеры, такие как полиэтиленгликоль, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, и мономерные вещества, такие как сахара (например, лактоза, сахароза, фруктоза, маннит и подобные), соли (например, хлорид натрия, хлорид калия и подобные), органические кислоты (например, фумаровая кислота, янтарная кислота, молочная кислота и винная кислота) и их смеси. Подходящие энтеросолюбильные полимеры включают гидроксипропилметилцеллюлозу, ацетат сукцинат, гидроксипропилметилцеллюлозу, фталат, поливинилацетатфталат, фталат ацетилцеллюлозы, тримеллитат ацетилцеллюлозы, шеллак, зеин и полиметакрилаты, содержащие карбоксильные группы.
Композиция покрытия может быть пластифицирована в соответствии со свойствами смеси для покрытия, такими как температура стеклования основного компонента или смеси компонентов или растворитель, используемый для нанесения композиции покрытия. Подходящие пластификаторы можно добавлять в количестве от 0 до 50% масс. композиции покрытия, и они включают, например, диэтилфталат, цитратные сложные эфиры, полиэтиленгликоль, глицерин, ацетилированные глицериды, ацетилированные цитратные сложные эфиры, дибутилсебацинат и касторовое масло. Если желательно, композиция покрытия может включать наполнитель. Количество наполнителя может составлять от 1% до приблизительно 99% масс. в расчете на общую массу композиции покрытия, и может представлять собой нерастворимое вещество, такое как диоксид кремния, диоксид титана, тальк, каолин, оксид алюминия, крахмал, измельченную в порошок целлюлозу, MCC или полакрилин калий. Композицию покрытия можно наносить в виде раствора или латекса в органических растворителях или водных растворителях или в их смесях. Если используют растворы, растворитель может присутствовать в количествах приблизительно 25-99% масс. в расчете на общую массу растворенных твердых веществ. Подходящие растворители представляют собой воду, низший спирт, низшие хлорированные углеводороды, кетоны или их смеси. Если используют латексы, растворитель присутствует в количествах приблизительно 25-97% масс. в расчете на количество полимерного вещества в латексе. Растворитель преимущественно может представлять собой воду. Уровни доз соединений по настоящему изобретению составляют порядка около 0,5 мг/кг массы тела до около 100 мг/кг массы тела или любой инкремент в этих пределах. Предпочтительная доза составляет от около 30 мг/кг массы тела до около 100 мг/кг массы тела. Общую суточную дозу можно вводить в виде одной или дробных доз. Подходящие терапевтические дозы соединений формулы I могут составлять от 1 микрограмма (мкг) до 1000 миллиграмм (мг) на килограмм массы тела реципиента в день и или любой инкремент в этих пределах, например, 1, 2, 3, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мкг (1 мг); 2, 3, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мг. Должно быть понятно, однако, что конкретный уровень доз для любого конкретного пациента будет зависеть от различных факторов, включая активность конкретного вводимого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, режим питания, время введения, путь введения, скорость выведения из организма, комбинацию лекарственных средств и тяжесть конкретного заболевания, подлежащего лечению.
Схему лечения можно регулировать для получения оптимального желаемого ответа. Например, введение можно осуществлять в виде разового болюса, некоторые дробные дозы можно вводить в течение определенного периода времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в соответствии с острой необходимостью в данной терапевтической ситуации. Особенно выгодно формулировать парентеральные композиции в виде стандартной лекарственной формы для простоты введения и равномерного дозирования. Стандартная лекарственная форма, как это используется в настоящей заявке, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве стандартных доз для субъектов-млекопитающих, подлежащих лечению; при этом каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для обеспечения желаемого терапевтического эффекта, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем. Требования к стандартным лекарственным формам по настоящему изобретению диктуются и непосредственно зависят от (a) уникальных характеристик терапевтического средства и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, который должен быть достигнут, и (b) ограничений, типичных в области компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов. Таким образом, специалистам в данной области должно быть понятно, на основании раскрытия, представленного в настоящей заявке, что дозу и схему введения корректируют в соответствии со способами, хорошо известными в терапии. А именно, максимально переносимую дозу легко можно определить, и также можно определить эффективное количество, обеспечивающее определяемую терапевтическую пользу пациенту, как это может быть в виде временных требований для введения каждого вещества для получения определяемой терапевтической пользы пациенту. Соответственно, хотя некоторые дозы и схемы введения проиллюстрированы в настоящей заявке, эти примеры никоим образом не ограничивают дозу и схему введения, которые могут обеспечиваться для пациента при практическом осуществлении настоящего изобретения.
В другом аспекте изобретения, раскрываемого в настоящей заявке, обеспечивается способ лечения Cry-опосредованного заболевания или расстройства, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения в соответствии с формулой I, описанной в любом из представленных выше вариантов воплощения. Предпочтительный вариант воплощения настоящего изобретения представляет способ в соответствии с описанным выше вариантом воплощения, где заболевание или расстройство, характеризующееся аномальными уровнями Cry, выбрано из группы, включающей диабет, метаболический синдром, синдром инсулинорезистентности, ожирение, глаукому, синдром Кушинга, психотическую депрессию, болезнь Альцгеймера, невропатическую боль, лекарственную зависимость, остеопороз, рак, макулярную дегенерацию и миопатию. Еще один предпочтительный вариант воплощения представляет способ в соответствии с описанным выше вариантом воплощения, где Cry-опосредованное заболевание или расстройство представляет собой диабет, метаболический синдром, синдром инсулинорезистентности, ожирение, синдром Кушинга, глаукому, психотическую депрессию, болезнь Альцгеймера, невропатическую боль, лекарственную зависимость, остеопороз, рак, макулярную дегенерацию или миопатию. Особенно предпочтительные раковые заболевания включают солидные раковые опухоли или эпителиальные раковые опухоли, включая, но не ограничиваясь этим: рак легкого; рак головного мозга; панкреатический рак; рак головы и шеи (например, сквамозноклеточная карцинома); рак молочной железы; колоректальный рак; рак печени; рак желудка; рак почки; рак яичника; рак предстательной железы; или аденокарциному. Другие предпочтительные раковые заболевания включают заболевания с повышенной экспрессией VEGF, повышенным ангиогенезом или гипоксические опухоли.
Термины “вводить”, “вводимый”, “введение” и подобные, используемые в настоящей заявке, относятся к способам, которые можно использовать для осуществления доставки соединений или композиций к желаемому участку биологического действия. Эти способы включают, но не ограничиваются этим, пероральное, парентеральное, местное, мукозальное, окулярное, офтальмическое, вагинальное и ректальное введение. Специалистам в данной области известны приемы введения, которые можно применять с использованием соединений и способов, описанных в настоящей заявке, например, которые обсуждаются в Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current ed.; Pergamon; and Remington's, Pharmaceutical Sciences (в действующей редакции), Mack Publishing Co., Easton, Pa. Как это используется в настоящей заявке, “парентеральное введение” фармацевтической композиции включает любой путь введения, характеризующийся физическим разрывом ткани субъекта и введение фармацевтической композиции через разрыв ткани. Парентеральное введение, таким образом, включает, но не ограничивается этим, введение фармацевтической композиции путем инъекции, нанесение композиции через хирургический разрез, нанесение композиции через проникающую через ткань не-хирургическую рану и т.п. В частности, предусматривается, что парентеральное введение включает, но не ограничивается этим, подкожную, интраперитонеальную, внутримышечную и интрастернальную инъекцию и методы почечной диалитической инфузии.
“Субъект” в контексте настоящего изобретения предпочтительно представляет собой млекопитающее. Млекопитающее может представлять собой человека, отличного от человека примата, мышь, крысу, собаку, кошку, лошадь или корову, но не ограничивается этими примерами. Млекопитающих, отличных от человека, преимущественно можно использовать в качестве субъектов, которые являются животными моделями Cry-опосредованного заболевания или расстройства, например, ob/ob мыши. Субъект может быть мужского или женского рода. Субъект может представлять собой такого субъекта, у которого ранее было диагностировано или которого идентифицировали как имеющего Cry-опосредованное заболевание или расстройство, и необязательно который уже подвергался или подвергается терапевтической интервенции или лечению по поводу такого заболевания или расстройства. Альтернативно, субъект может представлять собой такого субъекта, у которого у которого ранее не было диагностировано Cry-опосредованное заболевание или расстройство. Например, субъект может представлять собой такого субъекта, который демонстрирует один или несколько факторов риска развития Cry-опосредованного заболевания или расстройства, или субъекта, который демонстрирует факторы риска развития Cry-опосредованного заболевания или расстройства, или субъекта, который является асимптоматическим для Cry-опосредованного заболевания или расстройства. Субъект может представлять собой такого субъекта, который страдает от, или имеет риск развития Cry-опосредованного заболевания или расстройства, или который страдает от, или имеет риск развития рецидива Cry-опосредованного заболевания или расстройства. Субъект может представлять собой такого субъекта, который ранее проходил лечение по поводу Cry-опосредованного заболевания или расстройства либо путем введения соединений и композиций, раскрываемых в настоящей заявке, отдельно или в комбинации с другими терапевтическими средствами, либо путем хирургического вмешательства, или в любой комбинации вышеперечисленных лечений.
“Cry-опосредованное заболевание или расстройство” может включать, без ограничений, диабет (включая, без ограничений, инсулин-зависимый диабет “Типа I”, инсулин-независимый диабет “Типа II”, диабет беременных и связанные с диабетом осложнения, такие как диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая кардиомиопатия, диабетическая нефропатия, заболевание периодонта и диабетический кетоацидоз), метаболический синдром, синдром инсулинорезистентности, ожирение, глаукому, синдром Кушинга, психотическую депрессию, болезнь Альцгеймера, невропатическую боль, лекарственную зависимость, остеопороз, рак, макулярную дегенерацию и миопатию.
Термин “лечащий”, “лечить” или “лечение”, как он используется в настоящей заявке, включает превентивное (например, профилактическое), паллиативное, вспомогательное и терапевтическое лечение. Например, лечение диабета 2 типа, как это используется в настоящей заявке, означает, что пациента имеющего диабет 2 типа или риск заболевания диабетом 2 типа, можно лечить в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке. Для пациентов, принимающих превентивное лечение, достигаемое снижение вероятности возникновения заболевания, по поводу которого осуществляют такое превентивное лечение, означает измеряемый результат превентивного лечения.
Термин “облегчение” или “облегчать”, как он используется в настоящей заявке, описывает способ, посредством которого тяжесть признака или симптома расстройства ослабляется, уменьшается или ингибируется. Важно отметить, что симптом можно облегчить, не устраняя его. В предпочтительном варианте воплощения, введение фармацевтических композиций по настоящему изобретению приводит к устранению симптома, однако устранение не является обязательным. Ожидается, что терапевтически эффективные количества соединений или фармацевтических композиций, описанных в настоящей заявке, будут снижать тяжесть симптома.
Как это используется в настоящей заявке, термин "симптом" определяется как указание на заболевание, болезнь, травму или на то, что в организме что-то не в порядке. Симптомы ощущаются или замечаются субъектом, испытывающим такой симптом, но могут быть легко замечены другими. “Другие” определяются как специалисты, занимающиеся медицинским обслуживанием или лечением пациентов.
Термин “метаболический синдром”, как он используется в настоящей заявке, если не указано иное, означает псориаз, сахарный диабет, заживление ран, воспаление, нейродегенеративные заболевания, галактосемию, болезнь кленового сиропа, фенилкетонурию, гиперсаркозинемию, тимин урацилурию, сульфинурию, изовалериановую ацидурию, сазаропуринурию, 4-гидроксимасляную ацидурию, дефицит глюкоза-6-фосфат дегидрогеназы и дефицит пируватдегидрогеназы.
Термин “ожирение” или “страдающий ожирением”, как он используется в настоящей заявке, относится, в основном, к субъектам, которые имеют массу тела по меньшей мере на около 20-30% больше средней массы тела для его/ее возраста, пола и роста. Технически, “страдающий ожирением” определяется, для субъектов мужского пола, как субъекты, у которых индекс массы тела больше чем 27,8 кг/м2, и, для субъектов женского пола, как субъекты, у которых индекс массы тела больше чем 27,3 кг/м2. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что способ по настоящему изобретению не ограничивается теми, которые подпадают под указанные выше критерии. Действительно, способ по настоящему изобретению также могут выгодно применять на практике субъекты, не попадающие в рамки этих традиционных критериев, например, те, которые могут быть склонны к ожирению.
Термин “воспалительные расстройства”, как он используется в настоящей заявке, относится к расстройствам, таким как ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит, псориаз, хондрокальциноз, подагра, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, фибромиалгия и кахексия.
Фраза “терапевтически эффективное количество”, как это используется в настоящей заявке, относится к количеству лекарственного средства или фармацевтического средства, которое будет вызывать такой биологический или медицинский ответ ткани, системы, животного или человека, достижение которого добивается исследователь, ветеринар, лечащий врач или другой специалист.
Фраза “количество……эффективное для снижения уровней глюкозы в крови”, как это используется в настоящей заявке, относится к уровням соединения, достаточным для получения циркулирующих концентраций, достаточно высоких для достижения желаемого эффекта. Такая концентрация типично находится в пределах от около 10 нМ до 2 мкМ; при этом концентрации в пределах от около 100 нМ до 500 нМ являются предпочтительными. Как указано выше, поскольку активность различных соединений, которые подпадают под определение формулы I, представленное выше, может существенно варьироваться, и поскольку индивидуальные субъекты могут демонстрировать широкие различия тяжести симптомов, специалист, который лечит субъекта, сам должен определять ответ субъекта на лечение и изменять дозы соответствующим образом.
Фраза “инсулинорезистентность”, как это используется в настоящей заявке, относится к пониженной чувствительности к действиям инсулина в организме в целом или в отдельных тканях, таких как ткань скелетной мышцы, ткань миокарда, жировая ткань или ткань печени. Инсулинорезистентность возникает у многих субъектов, у которых имеется или не имеется сахарный диабет.
Фраза “синдром инсулинорезистентности”, как это используется в настоящей заявке, относится к кластеру проявлений, которые включают инсулинорезистентность, гиперинсулинемию, инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM), артериальную гипертензию, центральное (висцераьное) ожирение и дислипидемию.
Соединения по настоящему изобретению также могут быть полезными для лечения других метаболических расстройств, связанных с нарушенной утилизацией глюкозы и инсулинорезистентностью, включая серьезные осложнения поздней стадии NIDDM, такие как диабетическая ангиопатия, атеросклероз, неалкогольный стеатогепатит (NASH), неалкогольное ожирение печени, диабетическую нефропатию, диабетическую невропатию и диабетические глазные осложнения, такие как ретинопатия, образование катаракты и глаукома, и многие другие осложнения, связанные с NIDDM, включая дислипидемию, глюкокортикоид-индуцируемую инсулинорезистентность, синдром поликислозного яичника, ожирение, гипергликемию, гиперлипидемию, гиперхолестеремию, гипертриглицеридемию, гиперинсулинемию и гипертензию. Краткое описание этих состояний можно найти в любом медицинском словаре, например, в “Stedman’s Medical Dictionary” (Xth Ed.).
Соединения и композиции, раскрываемые в настоящей заявке, можно вводить в терапевтически эффективных количествах в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, определенными в настоящей заявке. Например, синергические эффекты могут быть получены с другими веществами, используемыми в лечении Cry-опосредованных заболеваний или расстройств. Когда соединения по настоящему изобретению вводят в сочетании с другими терапиями, дозы совместно вводимого соединения, конечно, будут варьироваться в зависимости от типа совместно используемого лекарственного средства, от конкретного лекарственного средства, которое используют, от состояния, подлежащего лечению, и т.д.
Как это используется в настоящей заявке, термины “комбинированное лечение”, “комбинированная терапия”, “комплексное лечение” или “комбинаторное лечение”, используемые взаимозаменяемо, относятся к лечению субъекта по меньшей мере двумя разными терапевтическими средствами. Термины “совместное введение” или “комбинированное введение” или подобные, как используется в настоящей заявке, охватывают введение выбранных терапевтических средств одному субъекту, и предусматривается, что они включают схемы лечения, в которых средства необязательно вводят одним и тем же путем введения или в одно и то же время. Термин “фармацевтическая комбинация” означает продукт, который получают в результате смешивания или объединения более чем одного активного ингредиента, и включает как фиксированные, так и нефиксированные комбинации активных ингредиентов. “Фиксированная комбинация” означает, что активные ингредиенты, например, соединение, раскрываемое в настоящей заявке, и дополнительное терапевтическое средство, оба вводят пациенту одновременно в форме одной единицы или дозы. “Нефиксированная комбинация” означает, что активные ингредиенты, например, соединение, раскрываемое в настоящей заявке, и дополнительное терапевтическое средство, оба вводят пациенту в виде отдельных единиц либо одновременно, либо параллельно, либо последовательно без каких-либо определенных ограничений по времени, при этом такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни 2 соединений в организме пациента. Последнее также относится к коктейльной терапии, например, введению 3 или более активных ингредиентов.
Терапевтические средства для лечения диабета, метаболического синдрома, ожирения, синдрома инсулинорезистентности, диабетических осложнений или рака включают, без ограничений, следующие: инсулин, гипогликемические средства, противовоспалительные средства, средства, снижающие уровень липидов, гипотензивные средства, такие как блокатор кальциевых каналов, блокаторы β-адренергических рецепторов, ингибиторы циклооксигеназы-2, ингибиторы системы ангиотензина, ингибиторы ACE, ингибиторы ренина, химиотерапевтические средства, лучевая терапия, гормон-модулирующие средства, иммуномодулирующие средства, анти-ангиогенные средства, вместе другими обычными модифицирующими факторы риска средствами.
Инсулин включает быстродействующие формы, такие как Инсулин lispro рДНК происхождения: ГУМАЛОГ (1,5 мл, 10 мл, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Ind.), Инсулин для инъекций (Обычный Инсулин) бычий и свиной (обычный ИЛЕТИН I, Eli Lilly], человеческий: рДНК: ГУМУЛИН R (Eli Lilly), НОВОЛИН R (Novo Nordisk), полусинтетический: ВЕЛОСУЛИН Человеческий (Novo Nordisk), рДНК Человеческий, Забуференный: ВЕЛОСУЛИН BR, свиной: обычный Инсулин (Novo Nordisk), очищенный свиной: Свиной Обычный ИЛЕТИН II (Eli Lilly), Обычный Очищенный Свиной Инсулин (Novo Nordisk) и Обычный (Концентрированный) ИЛЕТИН II U-500 (500 единиц/мл, Eli Lilly); промежуточно-действующие формы, такие как Инсулин Цинк Суспензия, бычий и свиной: ЛЕНТЕ ИЛЕТИН G I (Eli Lilly), Человеческий, рДНК: ГУМУЛИН L (Eli Lilly), НОВОЛИН L (Novo Nordisk), очищенный свиной: ЛЕНТЕ ИЛЕТИН II (Eli Lilly), Изофан Инсулин Суспензия (NPH): бычий и свиной: NPH ИЛЕТИН I (Eli Lilly), Человеческий, рДНК: ГУМУЛИН N (Eli Lilly), Новолин N (Novo Nordisk), очищенный свиной: Свиной NPH Илетин II (Eli Lilly), NPH-N (Novo Nordisk); и долгодействующие формы, такие как Инсулин цинк суспензия, длительного действия (УЛЬТРАЛЕНТЕ, Eli Lilly), человеческий, рДНК: ГУМУЛИН U (Eli Lilly).
Гипогликемические средства включают, без ограничений, сульфонилмочевины: Ацетогексамид (Dymelor), Хлорпропамид (Diabinese), Толбутамид (Orinase); сульфонилмочевины второго поколения: Глипизид (Glucotrol, Glucotrol XL), Глибурид (Diabeta; Micronase; Glynase), Глимепирид (Amaryl); Бигуаниды: Метформин (Glucophage); ингибиторы α-глюкозидазы: Акарбоза (Precose), Миглитол (Glyset), Тиазолидиндионы: Розиглитазон (Avandia), Пиоглитазон (Actos), Троглитазон (Rezulin); Меглитиниды: Репаглинид (Prandin); и другие гипогликемические средства, такие как Акарбоза; Буформин; Бутоксамин Гидрохлорид; Камиглибоза; Циглитазон; Энглитазон Натрий; Дарглитазон Натрий; Этоформин Гидрохлорид; Глиамилид; Глибомурид; Глицетанил; Гликлазид Натрий; Глифлумид; Глюкагон; Глигексамид; Глимидин Натрий; Глиоктамид; Глипарамид; Линоглирид; Линоглирид Фумарат; Метил Пальмоксират; Пальмоксират Натрий; Пироглирид Тартрат; Проинсулин Человеческий; Сеглитид Ацетат; Толазамид; Толпиррамид; Зополрестат.
Противовоспалительное средства включают Алклофенак; Алклометазон Дипропионат; Алгестон Ацетонид; α-Амилазу; Амцинафал; Амцинафид; Амфенак Натрий; Амиприлоз Гидрохлорид; Анакинра; Аниролак; Анитразафен; Апазон; Балсалазид Динатрий; Бендазак; Беноксапрофен; Бензидамин Гидрохлорид; Бромелаины; Броперамол; Буденозид; Карпрофен; Циклопрофен; Цинтазон; Клипрофен; Клобетазол Пропионат; Клобетазон Бутират; Клопирак; Клотиказон Пропионат; Корметазон Ацетат; Кортодоксон; Дефлазакорт; Десонид; Дезоксиметазон; Дексаметазон Дипропионат; Диклофенак Калий; Диклофенак Натрий; Дифлоразон Диацетат; Дифлумидон Натрий; Дифлунизал; Дифлупреднат; Дифталон; Диметил Сульфоксид; Дроцинонид; Эндризон; Энлимомаб; Эноликам Натрий; Эпиризол; Этодолак; Этофенамат; Фелбинак; Фенамол; Фенбуфен; Фенклофенак; Фенклорак; Фендосал; Фенпиралон; Фентиазак; Флазалон; Флуазакорт; Флуфенамовую кислоту; Флумизол; Флунисолид Ацетат; Флуниксин; Флуниксин Меглумин; Флуокортин Бутил; Фторметолон Ацетат; Флуквазон; Флурбипрофен; Флуретофен; Флутиказон Пропионат; Фурапрофен; Фуробуфен; Галцинонид; Галобетазол Пропионат; Галопредон Ацетат; Ибуфенак; Ибупрофен; Ибупрофен Алюминий; Ибупрофен Пиконол; Илонидап; Индометацин; Индометацин Натрий; Индопрофен; Индоксол; Интразол; Изофлупредон Ацетат; Изоксепак; Изоксикам; Кетопрофен; Лофемизол Гидрохлорид; Лорноксикам; Лотепрендол Этабонат; Меклофенамат Натрий; Меклофенамовую кислоту; Меклоризон Дибутират; Мефенамовую кислоту; Месаламин; Мезеклазон; Метилпреднизолон Сулептанат; Морнифлумат; Набуметон; Напроксен; Напроксен Натрий; Напроксол; Нимазон; Олсалазин Натрий; Орготеин; Орпаноксин; Оксапрозин; Оксифенбутазон; Паранилин Гидрохлорид; Пентосан Полисульфат Натрий; Фенбутазон Натрий Глицерат; Пирфенидон; Пироксикам; Пироксикам Циннамат; Пироксикам оламин; Пирпрофен; Предназат; Прифелон; Продолиновую кислоту; Проквазон; Проксазол; Проксазол Цитрат; Римексолон; Ромазарит; Салколекс; Салнацедин; Салсалат; Салицилаты; Сангвинарим Хлорид; Секлазон; Серметацин; Судоксикам; Сулиндак; Супрофен; Талметацин; Талнифлумат; Талосалат; Тебуфелон; Тенидап; Тенидап Натрий; теноксикам; Тесикам; Тесимид; Тетридамин; Тиопинак; Тиксокортол Пивалат; Толметин; Толметин Натрий; Триклонид; Трифлумидат; Зидометацин; Глюкокортикоиды; Зомепирак Натрий. Важным противовоспалительным средством является аспирин.
Другие противовоспалительные средства включают ингибиторы цитокинов, в том числе антагонисты цитокинов (например, антагонисты IL-6 рецептора), аза-алкил лизофосфолипиды (AALP) и ингибиторы Фактора Некроза Опухоли-α (TNF-α), такие как анти-TNF-α антитела, растворимый TNF рецептор, TNF-α, анти-смысловые нуклеиновокислотные молекулы, мультивалентный гуанилгидразон (CNI-1493), N-ацетилцистеин, пентоксифиллин, окспентифилин, карбоциклические нуклеозидные аналоги, малая молекула S9a, RP 55778 (ингибитор синтеза TNF-α), Дексанабинол (HU-211), MDL 201,449A (9-[(1R, 3R)-транс-циклопентан-3-ол] аденин и триходимерол (BMS-182123). Другие ингибиторы TNF-α включают Этанерсепт (ENBREL, Immunex, Seattle) и Инфликсимаб (REMICADE, Centocor, Malvern, Pa.).
Средства, снижающие уровень липидов, включают гемфиброзил, холистирамин, колестипол, никотиновую кислоту и ингибиторы HMG-CoA редуктазы. Ингибиторы HMG-CoA редуктазы, полезные для введения или совместного введения с другими средствами в соответствии с изобретением, включают, но не ограничиваются этим, симвастатин (Патент США № 4444784), ловастатин (Патент США № 4231938), правастатин натрий (Патент США № 4346227), флувастатин (Патент США № 4739073), аторвастатин (Патент США № 5273995) и церивастатин.
Блокаторы кальциевых каналов включают дигидропиридины, такие как нифедипин, фенилалкиламины, такие как верапамил и бензотиазепины, такие как дилтиазем. Другие блокаторы кальциевых каналов включают, но не ограничиваются этим, амринон, амлодипин, бенциклан, фелодипин, фендилин, флунаризин, исрадипин, никардипин, нимодипин, пергексилен, галлопамил, тиапамил и аналоги тиапамила (такие как 1993RO-11 -2933), фенитоин, барбитураты, а также пептиды динорфин, омега-конотоксин и омега-агатоксин и подобные, и/или их фармацевтически приемлемые соли.
Средства, блокирующие β-адренергические рецепторы, включают, но не ограничиваются этим, атенолол, ацебутолол, алпренолол, бефунолол, бетаксолол, бунитролол, картеолол, целипролол, гедроксалол, инденолол, лабеталол, левобунолол, мепиндолол, метипранол, метиндол, метопролол, метризоранолол, окспренолол, пиндолол, пропранолол, практолол, практолол, соталолнадолол, типренолол, томалолол, тимолол, бупранолол, пенбутолол, тримепранол, 2-(3-(1,1-диметилэтил)-амино-2-гидроксипропокси)-3-пириденкарбонитрилНСl, 1-бутиламино-3-(2,5-дихлорфенокси-)-2-пропанол, 1-изопропиламино-3-(4-(2-циклопропилметоксиэтил)фенокси)-2-пропанол, 3-изопропиламино-1-(7-метилиндан-4-илокси)-2-бутанол, 2-(3-трет-бутиламино-2-гидрокси-пропилтио)-4-(5-карбамоил-2-тиенил)тиазол, 7-(2-гидрокси-3-трет-бутиламинпропокси)фталид. Указанные выше соединения можно использовать в виде изомерных смесей или в их соответствующей левовращающей или правовращающей форме.
Различные селективные ингибиторы COX-2 известны из уровня техники и включают, но не ограничиваются этим, ингибиторы COX-2, описанные в Патенте США № 5474995; Патенте США № 5521213; Патенте США № 5536752; Патенте США № 5550142; Патенте США № 5552422; Патенте США № 5604253; Патенте США № 5604260; Патенте США № 5639780; Патенте США № 5677318; Патенте США № 5691374; Патенте США № 5698584; Патенте США № 5710140; Патенте США № 5733909; Патенте США № 5789413; Патенте США № 5817700; Патенте США № 5849943; Патенте США № 5861419; Патенте США № 5922742; Патенте США № 5925631; и Патенте США № 5643933. Ряд указанных выше ингибиторов COX-2 представляют собой пролекарства селективных ингибиторов COX-2 и включают соединения, описанные в WO 95/00501, WO 95/18799 и Патенте США № 5474995, выданном 12 декабря 1995 года.
Примеры антагонистов ангиотензина II включают: пептидные соединения (например, сараласин, [(San1)(Val5)(Ala8)] ангиотензин-(1-8) октапептид и родственные аналоги); N-замещенный имидазол-2-он (Патент США № 5087634); имидазолацетатные производные, включающие 2-N-бутил-4-хлор-1-(2-хлорбензил)имидазол-5-уксусную кислоту (см. Long et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 247(1), 1-7 (1988)); 4,5,6,7-тетрагидро-1H-имидазо[4,5-c]пиридин-6-карбоновую кислоту и производные аналоги (Патент США № 4816463); N2-тетразол β-глюкуронидные аналоги (Патент США № 5085992); замещенные пирролы, пиразолы и триазолы (Патент США № 5081127); фенольные и гетероциклические производные, такие как 1,3-имидазолы (Патент США № 5073566); имидазо-конденсированные 7-членные кольцевые гетероциклы (Патент США № 5064825); пептиды (например, Патент США № 4772684); антитела к ангиотензину II (например, Патент США № 4302386); и аралкилимидазольные соединения, такие как бифенил-метил-замещенные имидазолы (например, EP 253310, 20 января 1988 года); ES8891 (N-морфолиноацетил-(-1-нафтил)-L-аланил-(4, тиазолил)-L-аланил (35,45)-4-амино-3-гидрокси-5-цикло-гексапентаноил-N-гексиламид, Sankyo Company, Ltd., Tokyo, Japan); SKF108566 (E-α-2-[2-бутил-1-(карбоксифенил)метил]-1H-имидазол-5-ил[метилан]-2-тиофенпропановая кислота, Smith Kline Beecham Pharmaceuticals, Pa.); Лосартан (DUP753/MK954, DuPont Merck Pharmaceutical Company); Ремикирин (RO42-5892, F. Hoffman LaRoche AG); A2 агонисты (Marion Merrill Dow) и некоторые не-пептидные гетероциклы (G. D. Searle and Company).
Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (ACE) включают аминокислоты и их производные, пептиды, включая ди- и три-пептиды, и антитела к ACE, которые вмешиваются в ренин-ангиотензин систему путем ингибирования активности ACE, таким образом, снижая или подавляя образование вазопрессорного вещества ангиотензина II. Другие ингибиторы ACE включают ацилмеркапто и меркаптоалканоил пролины, такие как каптоприл (Патент США № 4105776) и зофеноприл (Патент США № 4316906), карбоксиалкил дипептиды, такие как эналаприл (Патент США № 4374829), лисиноприл (Патент США № 4374829), хинаприл (Патент США № 4344949), рамиприл (Патент США № 4587258) и периндоприл (Патент США № 4508729), карбоксиалкил дипептидные миметики, такие как цилазаприл (Патент США № 4512924) и беназаприл (Патент США № 4410520), фосфинилалканоилпролины, такие как фосиноприл (Патент США № 4337201) и трандолоприл.
Ингибиторы ренина включают аминокислоты и их производные, пептиды и их производные и антитела к ренину. Другие ингибиторы ренина включают мочевинные производные пептидов (Патент США № 5116835); аминокислоты, связанные не-пептидными связями (Патент США № 5114937); ди- и три-пептидные производные (Патент США № 5106835); аминокислоты и их производные (Патенты США №№ 5104869 и 5095119); диол сульфонамиды и сульфинилы (Патент США № 5098924); модифицированные пептиды (Патент США № 5095006); пептидил β-аминоациламинодиолкарбаматы (Патент США № 5089471); пирролимидазолоны (Патент США № 5075451); фтор- и хлор-статин или статон-содержащие пептиды (Патент США № 5066643); пептидиламинодиолы (Патенты США №№ 5063208 и 4845079); N-морфолино производные (Патент США № 5055466); пепстатиновые производные (Патент США № 4980283); N-гетероциклические спирты (Патент США № 4885292); моноклональные антитела к ренину (Патент США № 4780401); и ряд других пептидов и их аналогов (Патенты США №№ 5071837, 5064965, 5063207, 5036054, 5,036,053, 5034512 и 4894437).
Другие терапевтические средства, полезные для лечения диабета и связанных с ним расстройств, включают, но не ограничиваются этим, ингибиторы липазы, такие как цетилистат (ATL-962); синтетические амилиновые аналоги, такие как Симлин прамлинтид с рекомбинантным лептином или без него; ингибиторы натрий-глюкозного котранспортера 2 (SGLT2), такие как серглифлозин (869682; KGT-1251), YM543, дапаглифлозин, GlaxoSmithKline молекула 189075 и Sanofi-Aventis молекула AVE2268; активаторы двух ферментов адипозтриглицеридлипазы и PI3 киназы, такие как Адивиа (ID 1101); антагонисты нейропептидных Y2, Y4 и Y5 рецепторов, такие как Nastech молекула PYY3-36, синтетический аналог человеческих гормонов PYY3-36 и панкреатического полипептида (7TM молекула TM30338); Shionogi молекула S-2367; антагонисты каннабиноидного CB1 рецептора, такие как римонабант (Acomplia), таранабант, CP-945,598, Solvay молекула SLV319, Vernalis молекула V24343; гормоны, такие как олеоил-эстрон; ингибиторы серотонина, допамина и норэпинефрина (также известные из уровня техники как тройственные ингибиторы повторного поглощения моноаминов), такие как тезофенсин (Neurosearch молекула NS2330); ингибиторы повторного поглощения норэпинефрина и допамина, такие как Contrave (буприон плюс опиоидный антагонист налтрексон) и Excalia (буприон плюс антиконвульсант зонисаминд); ингибиторы 11b-гидроксистероид дегидрогеназы типа 1 (11b-HSD1), такие как Incyte молекула INCB13739; ингибиторы синтеза кортизола, такие как кетоконазол (DiObex молекула DIO-902); ингибиторы глюконеогенезы, такие как Metabasis/Daiichi молекула CS-917; активаторы глюкокиназы, такие как Roche молекула R1440; антисмысловые ингибиторы протеинтирозинфосфатазы-1B, такие как ISIS 113715; а также другие средства, такие как NicOx молекула NCX 4016; инъекции аналогов гастрина и эпидермального ростового фактора (EGF), такие как Islet Neogenesis Therapy (E1-I.N.T.); бетагистин (Obecure молекула OBE101); вещества, усиливающие секрецию желчных кислот (например, холестирамин и холестипол), витамин B3 (также известный как никотиновая кислота или ниацин), витамин B6 (пиридоксин), витамин B12 (цианокобаламин), производные фибриновой кислоты (например, гемфиброзил, клофибрат, фенофибрат и бензафибрат), пробукол, нитроглицерин и ингибиторы абсорбции холестерина (например, β-ситостерол и ингибиторы ацилСоА-холестеринацилтрансферазы (ACAT), такие как мелинамид), ингибиторы HMG-CoA синтазы, ингибиторы скваленэпоксидазы и ингибиторы скваленсинтетазы.
Примеры анальгетических средств, часто применяемых для лечения боли, включая невропатическую боль, включают, без ограничений, опиоидные или не-опиоидные анальгетические средства. Подходящие опиоидные анальгетические средства включают, но не ограничиваются этим, морфин, героин, гидроморфон, гидрокодон, оксиморфон, оксикодон, метопон, апоморфин, норморфин, эторфин, бупренорфин, меперидин, лопермид, анилеридин, этогептазин, пиминидин, бетапродин, дифеноксилат, фентанил, суфентанил, алфентанил, ремифентанил, леворфанол, декстрометорфан, феназоцин, пентазоцин, циклазоцин, метадон, изометадон и пропоксифен. Подходящие не-опиоидные анальгетические средства включают, но не ограничиваются этим, аспирин, целекоксиб, рофекоксиб, диклофинак, дифлусинал, этодолак, фенопрофен, флурбипрофен, ибупрофен, кетопрофен, индометацин, кеторолак, меклофенамат, мефенамовую кислоту, набуметон, напроксен, пироксикам и сулиндак.
Примеры терапевтических средств, часто применяемых для лечения глаукомы, включают холинергические агонисты (например, пилокарпин и карбахол), ингибиторы холинэстеразы (например, физостигмин, неостигмин, демакарим, экотиофат йодид и изофлуорофат), ингибиторы карбонангидразы (например, ацетазоламид, дихлорфенамид, метазоламид, этоксзоламид и дорзоламид), не-селективные адренергические агонисты (например, эпинефрин и дипиверфин), α2-селективные адренергические агонисты (например, апраклонидин и бримонидин), β-блокаторы (например, тимолол, бетазолол, левобунолол, картеолол и метипранолол), аналоги простагландинов (например, латанопрост) и осмотические диуретики (например, глицерин, маннит и изосорбид); кортикостероиды, такие как беклометазон, метилпреднизолон, бетаметазон, преднизон, преднизолон, дексаметазон, флутиказон и гидрокортизон, и аналоги кортикостероидов, такие как будесонид.
Примеры терапевтических средств, часто применяемых для лечения болезни Альцгеймера, включают ингибиторы β-секретазы или ингибиторы γ-секретазы; ингибиторы транспорта глицина, ингибиторы tau фосфорилирования; блокаторы образования Aβ олигомера ингибиторы; p25/CDK5; ингибиторы HMG-CoA редуктазы; агонисты PPARγ, такие как пиоглитазон и розиглитазон; антагонисты NK1/NK3 рецептора; НСПВЛС, включая ибупрофен; витамин E; анти-амилоидные антитела, включая анти-амилоидные гуманизированные моноклональные антитела; ингибиторы COX-2; противовоспалительные соединения, такие как (R)-Флурбипрофен; антагонисты CB-1 рецептора или обратные агонисты CB-1 рецептора; антибиотики, такие как доксициклин и рифампин; антагонисты рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA), такие как мемантин и нерамексан; антагонисты NR2B; модуляторы андрогеновых рецепторов; ингибиторы ацетилхолинэстеразы, такие как галантамин, ривастигмин, донепезил и такрин; модуляторы mGluR5; средства, повышающие секрецию гормона роста, такие как ибутаморен, ибутаморен мезилат и капроморелин; антагонисты гистамина H3; агонисты AMPA; ингибиторы PDE IV; обратные агонисты GABAA; лиганды GABAA α5 рецепторов; лиганды GABAB рецепторов; блокаторы калиевых каналов; нейрональные никотиновые агонисты; ингибиторы P-450, такие как ритонавир.
Примеры терапевтических средств, часто применяемых для лечения аффективных расстройств, таких как депрессия, включают, без ограничений, амитриптилин, амитриптилин оксид, десипрамин, дибензепин, досулепин, доксепин, хлоримипрамин, имипрамин, нортриптилин, миансерин, мапротилин, тримипрамин, CP-122721, элзасонан, PD-171729, MK-869, DOV-216303, DOV-21947, ликарбазепин, амфебутамон, радафаксин, вилазодон, GSK-679769, GW-597599, NS-2359, GSK-876008, прамипексол, дулоксетин, атомоксетин, LY-628535, десвенлафаксин, эскиталопрам, LU- AA21004, саредутант, SR-58611, SSR-149415, SSR-146977, моклобемид, R-673, R-1204, BMS-469458, DPC-368, Org-34517, Org-34850, ингибиторы CRH рецепторов, ONO-2333Ms, NBI-876008, AAG-561, NBI-34041, DPC-368, PD-171729, SSR-125543, вилоксазин, тразодон, нефазодон, миртазапин, венлафаксин, ребоксетин, транилципромин, брофаромин, моклобемид, циталопрам, эсциталопрам, пароксетин, флуоксетин, флувоксамин, сертралин, Hypericum (St. John's Wort), алпразолам, клоназепам, диазепам, лоразепам, галазепам, хлордиазепоксид и другие лекарственные средства, такие как буспирон, клонидин, пагоклон, рисперидон, оланзапин, кветиапин, зипразидон, целекоксиб, пироксикам, парекоксиб, валдекоксиб, PMI-001, PH-686464, SC-58236, эторикоксиб, рофекоксиб, L-776967, лумиракоксиб, GW-406381, GW-644784, мелоксикам, SVT-2016, PAC-10649, CS-706, LAS-34475, цимикоксиб, A-183827,0 или нимесулид.
Примеры терапевтических средств, часто применяемых для лечения привыкания и лекарственной зависимости включают, без ограничений, фенелзин, фенилалкилгидразин (Патент США № 4786653), дисульфирам (“Antabuse”), 2-имино-5-фенил-4-оксазолидинон, α-метил-пара-тирозин или фузаровую кислоту, пиперазиновые производные (Патент США № 4325952), клонидин в сочетании с трициклическим антидепрессантом (Патент США № 4788189), γ-пироны, такие как мальтол или этилмальтол (Патент США № 4276890), акампросат, габапентин, вигабартин, баклофен, N-ацетилцистеин, нокаин, моданафил, пароксетин, буприон, миртазапин, топирамат, ондасетрон, варениклин, антагонисты опиоидных рецепторов, такие как налтрексон, налоксон, налмефин, антаксон, L-α-ацетилметадол, пентазоцин, буторфанол, налбуфин, бупренорфин и метадон.
Примеры терапевтических средств, часто применяемых для лечения остеопороза и которые могут модулировать содержание минералов в кости, включают, но не ограничиваются этим, бисфосфонаты, такие как алендронат (Fosamax®), риседронат (Actonel®), этидронат (Didronel®), памидронат, тилудронат (Skelid®), клодронат (Bonefos®; Loron®), неридронат, олпадронат, золедронат (Zometa®) и ибандронат (Boniva®), селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов (SERM), такие как ралоксифен (Evista®), арзоксифен, кломифен, базедоксифен, ласофоксифен, ормелоксифен, тамоксифен и торемифен, анаболические терапевтические средства, такие как терипаратид (Forteo®; рекомбинантный паратиреоидный гормон) и стронций ранелат, и фрагменты рекомбинантного пептида паратиреоидного гормона, эстроген/прогестерон заместительные терапии, моноклональные антитела, ингибиторы активатора рецептора лиганда ядерного фактора kB (RANKL), такие как деносумаб, остеопротегерин и Пепстатин A, ингибиторы катепсина K, такие как, но не ограничиваясь этим, OST-4077 ((1-{1-[4-фтор-2-(2-оксо-пирролидин-1-ил)-фенил]-3-оксо-пиперидин-3-илкарбамоил}-циклогексил)-амид фуран-2-карбоновой кислоты), лейпептин, Cbz-Phe-Ala-CHN2, Cbz-Leu-Leu-Leu-альдегид, цистатин, необратимые ингибиторы цистеинпротеазы, такие как пептид галометилкетоны, пептид диазометилкетоны и эпоксиды, статические необратимые ингибиторы цистеинпротеазы, такие как ацилоксиметилкетоны, азапептиды, акцепторы Михаэля, такие как пептид виниловые сложные эфиры, сульфоны и сульфонаты, обратимые ингибиторы цистеинпротеазы, такие как пептид альдегиды, a-кетоэфиры и a-кетоамиды, пептид метилкетоны и их гидроксильные, алкилокси, арилокси, алкилтио и арилтио производные, 1,3-бис-(ациламино)-2-пропаноны, 1,3-бис-(ацилгидразино)-карбонилы, ациламино-пиразолоны, пиперидиноны и тиазон-карбонил-гидразиды, антагонисты интегрина Avb3 (также известный из уровня техники как витронектин), кальцилитические соединения (антагонисты Ca2+ рецепторов, которые повышают секрецию PTH), кальцитонин (MiacalcinÒ), нитраты, включая, но не ограничиваясь этим изосорбид мононитрат (ISMO) или нитроглицериновую мазь (NTG), и пищевые добавки, такие как кальций и витамин D, и комбинации таких средств.
Другой вариант воплощения настоящего изобретения представляет способ идентификации пациентов, нуждающихся в лечении, основанном на измерении уровней экспрессии генов, управляющих биологическими часами (например, Cry1 и Cry2), в образцах, взятых у субъекта (Bjarnason, G. A. et al. Am. J. Pathol. 2001, 158, 1793; Akashi, M. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107, 15643). Профили ритмической мРНК экспрессии для человеческих генов, управляющих биологическими часами, включая Cry1 и Cry2, измеренные в образцах, взятых у субъекта, показывают, что циркадные часы присутствуют в периферических тканях (Mohawk, J. A. et al. Ann. Rev. Neurosci. 2012, Epub ahead of print). Было продемонстрировано, что экспрессия связанных с циркадными часами генов в этих образцах варьируется в течение суток. Кроме того, характер экспрессии генов, управляющих биологическими часами (например, Cry1 и Cry2), в периферических мононуклеарных клетках крови изменяется у людей при заболеваниях, таких как ожирение (Tahira, K. et al. Arch. Med. Sci. 2011, 7, 933). Изменение в экспрессии генов, управляющих биологическими часами (например, Cry1 и Cry2), в периферических мононуклеарных клетках крови можно соотнести с уровнями лептина, адипонектина, инсулина и hsCRP в сыворотке, уровнями липидов, глюкозы, мелатонина и кортизола в плазме и, у животных, с экспрессией генов, управляющих биологическими часами (например, Cry1 и Cry2), в тканях, включая печень, жировую ткань, поджелудочную железу и скелетную мышцу. Путем контактирования образцов, взятых у субъекта, которого лечили соединением формулы I, и измерения профилей ритмической экспрессии мРНК или белка, можно идентифицировать пациентов, нуждающихся в лечении, и можно определить фармакологическую активность. В других вариантах воплощения, можно определить активности одного или нескольких криптохромов, например, способность криптохромов к связыванию с мишенью, такой как Per1, Per2, глюкокортикоидный рецептор (GR) или промоторная последовательность, содержащая сайты распознавания Cry, такая как, например, CLOCK-BMAL1 промотор.
Соответственно, один аспект изобретения, раскрываемого в настоящей заявке, относится к способу мониторинга развития или прогнозирования Cry-опосредованного заболевания или расстройства у субъекта, включающему измерение эффективного количества одного или нескольких криптохромов в первом образце, взятом у субъекта в первый период времени; измерение эффективного количества одного или нескольких криптохромов во втором образце, взятом у субъекта во второй период времени; и сравнение количества одного или нескольких криптохромов, обнаруженного в первом образце, с количеством одного или нескольких криптохромов, обнаруженном во втором образце, или с контрольным значением.
“Диагноз”, “диагностировать”, “прогнозировать” или “прогноз” не ограничиваются дефинитивным или около дефинитивным определением, что индивидуум имеет заболевание, но также включают определение, что индивидуум имеет повышенную вероятность наличия или развития заболевания по сравнению со здоровыми субъектами или с остальной популяцией.
Как это используется в настоящей заявке, “экспрессия” и “уровни экспрессии” включают, но не ограничиваются этим, одно или несколько из следующих: транскрипцию гена в предшественник мРНК; сплайсинг и другой процессинг мРНК-предшественника с образованием зрелой мРНК; мРНК стабильность; трансляцию зрелой мРНК в белок (включая использование кодонов и наличие тРНК); и гликозилирование и/или другие модификации продукта трансляции, если это необходимо для правильной экспрессии и функции.
“Формула”, “алгоритм” или “модель означает любое математическое уравнение, алгоритмический, аналитический или программируемый процесс или статистический метод, который берет одно или несколько исходных значений из непрерывно вводимых или категорийных данных (здесь называемых “параметрами”) и рассчитывает выходное значение, иногда указываемое как “индекс” или “индексное значение”. Неограничивающие примеры “алгоритмов” включают суммы, отношения и операторы регрессии, такие как коэффициенты или экспоненты, трансобразования и нормализации значений (включая, без ограничений, такие схемы нормализации, которые основаны на клинических параметрах, таких как пол, возраст, масса тела индекс или этническая принадлежность), правила и руководства, статистические классификационные модели и нейронные сети, натренированные на исторических популяциях. Особенно полезными для измерения Cry, как определено в настоящей заявке, являются линейные и нелинейные уравнения и статистические классификационные анализы для “соотнесения” взаимосвязи между уровнями Cry, определенными в образце, взятом у субъекта, и риском развития у субъекта Cry-опосредованного заболевания или расстройства.
“Определение” или “измерение” означает оценку присутствия, отсутствия, величины или количеста (которое может представлять собой эффективное количество) данного вещества в клиническом или взятом у субъекта образце, включая деривацию качественных или количественных уровней концентрации таких веществ, либо оценку значений или категоризацию клинических параметров субъекта. Определение или измерение также может включать квалификацию типа или идентификацию вещества. Определение или измерение также может включать способность одного или нескольких Cry к связыванию с мишенью, где мишень может представлять собой определяющие период гены или белки Per1 и Per2, глюкокортикоидный рецептор (GR) или промоторную область CLOCK-BMAL1 гена. Измерение Cry можно использовать для диагностики, детекции или идентификации Cry-опосредованного заболевания или расстройства у субъекта, для мониторинга прогрессирования или прогнозирования Cry-опосредованного заболевания или расстройства у субъекта, для прогнозирования рецидива Cry-опосредованного заболевания или расстройства у субъекта или для классификации субъекта как имеющего низкий риск или высокий риск развития Cry-опосредованного заболевания или расстройства или рецидив Cry-опосредованного заболевания или расстройства.
“Риск” в контексте настоящего изобретения относится к вероятности, что событие произойдет в течение определенного периода времени, как при развитии Cry-опосредованного заболевания или расстройства, и может означать “абсолютный” риск или “относительный” риск для субъекта. Абсолютный риск можно измерить либо на основании измерений после действительного периода наблюдений для соответствующей временной когорты, либо на основании индексных значений, выведенных из статистически значимых исторических когорт, которых придерживаются в течение соответствующего периода времени. Относительный риск относится к отношению абсолютных рисков субъекта по сравнению либо с абсолютными рисками когорт низкого риска, либо со средним для популяции риском, который может варьироваться в зависимости от того, как оцениваются клинические факторы риска. Отношения вероятностей наступления и ненаступления события, отношение положительных событий к отрицательным событиям для данного результата испытания, также широко используются (вероятности рассчитывают в соответствии с формулой p/(1-p), где p означает вероятность события, и (1-p) означает вероятность отсутствия события). Альтернативные непрерывные измерения, которые можно оценить в контексте настоящего изобретения, включают отношения, такие как время к развитию Cry-опосредованного заболевания или расстройства, или прогрессирование к другой стадии Cry-опосредованного заболевания или расстройства, включая прогрессирование или развитие Cry-опосредованного заболевания или расстройства и снижение риска терапевтической конверсии.
“Оценка риска” или “оценивание риска” в контексте изобретения, раскрываемого в настоящей заявке, охватывает предсказание возможности, шансов или вероятности, что событие или состояние болезни может наступить, скорости наступления события или перехода из одного состояния болезни в другое, то есть из “нормального” состояния в состояние риска развития Cry-опосредованного заболевания или расстройства, или от состояния риска до Cry-опосредованного заболевания или расстройства или развития рецидивирующего заболевания или расстройства. Оценка риска также может включать предсказание других индексов Cry-опосредованного заболевания или расстройства, либо в абсолютном либо в относительном выражении, со ссылкой на ранее измеренную популяцию. Способы по настоящему изобретению можно использовать для осуществления непрерывных или категорийных измерений риска перехода Cry-опосредованного заболевания или расстройства, таким образом, диагностируя и определяя спектр риска категории субъектов, определенных как имеющих риск развития такого заболевания или расстройства. В категорийном сценарии, изобретение можно использовать для распознавания между нормальными и находящимися в группе риска когортами субъектов. В других вариантах воплощения, настоящее изобретение можно использовать для разграничения состояния риска от состояния болезни или состояния болезни от нормального.
“Образец”, как это используется в настоящей заявке, представляет собой биологический образец, выделенный у субъекта, и может включать, в качестве примера, а не для ограничения, цельную кровь, сыворотку, плазму, клетки крови, клетки эндотелия, биопсию ткани, лимфатическую жидкость, свободную жидкость брюшной полости, интерстициальную жидкость (также известную как “внеклеточная жидкость” и охватывающую жидкость, обнаруженную в пространствах между клетками, включая, среди прочего, жидкость десневой бородки), костный мозг, семенную жидкость, спинномозговую жидкость (CSF), слюну, слизь, мокроту, пот, мочу или любую другую секрецию, экскрецию или другие жидкости организма.
Под “статистически значимым”, подразумевается, что изменение больше, чем то, которое, как можно было бы ожидать, должно было случиться в отдельном случае (которое могло быть “ложно положительным”). Статистическую значимость можно определить любым способом, известным из уровня техники. Обычно используемые показатели значимости включают p-значение, которое представляет вероятность получения результата по меньшей мере такого предельного, как данная точка данных, принимая эту точку данных как результат отдельного случая. Результат часто считается высоко значимым при p-значении 0,05 или меньше.
Риск Cry-опосредованного заболевания или расстройства можно определить путем измерения “эффективного количества” одного или нескольких криптохромов в образце (например, образце, полученном от субъекта) и сравнения эффективных количеств с контрольными значениями, часто с использованием математических алгоритмов или формул, чтобы объединить информацию из результатов нескольких субъектов в одно измерение. Субъектов, идентифицированных как имеющие повышенный риск Cry-опосредованного заболевания или расстройства, необязательно, можно выбрать для схем лечения или терапевтических интервенций, таких как введение соединений формулы I, определенных в настоящей заявке, в виде монотерапии или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, или осуществления хирургических вмешательств (которые можно осуществлять после или до введения соединений формулы I, отдельно или в комбинации с дополнительными терапевтическими средствами или другими терапиями).
Способы детекции этих криптохромов в образце имеют множество применений. Например, один или несколько криптохромов можно измерить, чтобы способствовать диагностике или прогнозированию Cry-опосредованного заболевания или расстройства. В другом примере, способы детекции криптохромов можно использовать для мониторинга ответов субъекта на лечение Cry-опосредованного заболевания или расстройства. В другом примере, способы можно использовать для анализа и идентификации соединений, которые модулируют экспрессию криптохромов in vivo или in vitro.
Настоящее изобретение можно использовать для осуществления непрерывных или категорийных измерений риска перехода в Cry-опосредованное заболевание или расстройство, таким образом, диагностируя и определяя спектр риска для категории субъектов, определенных как имеющих риск развития такого заболевания или расстройства. В категорийном сценарии, для распознавания между нормальными и находящимися в группе риска когортами субъектов. В других вариантах воплощения, настоящее изобретение можно использовать для разграничения состояния риска от заболевания, или заболевания от нормального состояния. Для такого использования для установления различий могут потребоваться различные комбинации в индивидуальной панели или профиле, математический алгоритм и/или точки отсечки, но при этом необходимы указанные выше измерения точности для предполагаемого использования.
Идентификация имеющих риск субъектов дает возможность выбрать и начать различные терапевтические интервенции или схемы лечения для отсрочки, уменьшения или предотвращения перехода состояния субъекта в Cry-опосредованное заболевание или расстройство. Уровни эффективного количества криптохромных белков, нуклеиновых кислот, полиморфизмов, метаболитов или других аналитов также делают возможным осуществление мониторинга курса лечения. В этом способе, биологический образец может быть получен от субъекта, для которого используют схемы лечения, например, терапевтические лечения, Cry-опосредованного заболевания или расстройства. Такие схемы лечения могут включать, но не ограничиваются этим, хирургическое вмешательство и лечение терапевтическими средствами, используемыми для субъектов, у которых диагностировано, или идентифицированных как имеющие, Cry-опосредованное заболевание или расстройство, например, соединениями формулы I, описанными в настоящей заявке. Если желательно, биологические образцы получают от субъекта в разных точках времени до, в процессе и после лечения. Например, определение статуса заболевания путем сравнения a профиля криптохрома у субъекта с контрольным профилем криптохрома можно повторить несколько раз, при этом профиль для субъекта может быть получен из отдельных образцов, получаемых каждый раз при повторении этого способа. Образцы можно получать от субъекта с определенными промежутками времени, такими как, например, 4 часа, 8 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа или любой подходящий промежуток времени, который может выбрать специалист в данной области.
Различия в организации генетического материала субъектов могут привести к различиям в их относительных способностях метаболизировать различные лекарственные средства, которые могут модулировать симптомы или факторы риска Cry-опосредованного заболевания или расстройства. Субъекты, которые имеют Cry-опосредованное заболевание или расстройство, или которые имеют риск развития Cry-опосредованного заболевания или расстройства, могут отличаться по возрасту, этнической принадлежности и другим параметрам. Соответственно, измерение эффективных количеств одного или нескольких криптохромов, определенных в настоящей заявке, как отдельно, так и в комбинации с известными генетическими факторами для лекарственного метаболизма, обеспечивает предопределенный уровень прогнозируемости, что предполагаемое терапевтическое или профилактическое средство, подлежащее испытанию на выбранном субъекте, будет подходящим для лечения или профилактики Cry-опосредованного заболевания или расстройства у субъекта.
Для идентификации терапевтических средств или лекарственных средств, которые являются подходящими для конкретного субъекта, испытываемый образец, полученный у субъекта, также можно подвергнуть воздействию терапевтического средства или лекарственного средства, и можно определить уровень или активность одного или нескольких из криптохромных белков, нуклеиновых кислот, полиморфизмов, сплайсированных вариантов, метаболитов или других аналитов. Другие гены или белки, которые подвержены воздействию или которые непосредственно или опосредованно связываются с одним или несколько криптохромов (например, Per1, Per2, GR, CLOCK-BMAL1 промотором и т.д.) также можно измерить. Уровень одного или нескольких криптохромов можно сравнить с образцом, полученным у субъекта до и после мероприятий, осуществляемых для субъекта в связи Cry-опосредованным заболеванием или расстройством, например, лечения или воздействия при помощи терапевтического средства или лекарственного средства, или можно сравнить с образцами, полученными от одного или нескольких субъектов, которые показали улучшение факторов риска в результате такого лечения или воздействия.
Нуклеиновые кислоты можно получить из образцов различными путями, известными специалистам в данной области, например, способами экстракции, включая например, экстракцию растворителем, аффинную очистку и центрифугирование. Метод селективного осаждения также можно использовать для очистки нуклеиновых кислот. Также можно использовать хроматографические методы, включая, гель-фильтрацию, ионный обмен, селективную адсорбцию или связывание по сродству. Нуклеиновые кислоты могут представлять собой, например, РНК, ДНК или могут быть синтезированы в кДНК. Нуклеиновые кислоты можно определить с использованием методов микроматриц, которые хорошо известны из уровня техники, например, Affymetrix матрицы с последующим использованием методов многомерного шкалирования. См. R. Ekins, R. and Chu, F.W. (1999) Trends Biotechnol. 17: 217-218; D. D. Shoemaker, et al., (2001) Nature 409(6822): 922-927, и Патент США № 5750015.
Если желательно, образец может быть получен для повышения обнаружительной способности одного или нескольких криптохромов, например, путем пред-фракционирования. Способы пред-фракционирования включают, например, хроматографию на Cibacron blue агарозе, хроматографию с исключением по размеру, ионо-обменную хроматографию, гепариновую хроматографию, лектиновую хроматографию, аффинную хроматографию, одноцепочечную ДНК-аффинную хроматографию, последовательную экстракцию, гель-электрофорез и жидкостную хроматографию. Аналиты также могут быть модифицированы до осуществления детекции. Образец может быть пре-фракционирован путем удаления белков, которые присутствуют в большом количестве, или которые могут препятствовать детекции молекул, представляющих интерес, в образце. Например, в образце сыворотки крови, сывороточный альбумин присутствует в большом количестве и может мешать анализу одного или нескольких криптохромов. Таким образом, образец сыворотки крови может быть пре-фракционирован путем удаления сывороточного альбумина с использованием, например, субстрата, который включает адсорбенты, которые специфическим образом связываются с сывороточным альбумином, можно использовать аффинную колонку или антитела против сывороточного альбумина.
В других вариантах воплощения, молекулы представляющие интерес, в образце можно разделить при помощи электрофореза высокого разрешения, например, одно- или двухмерного гель-электрофореза. Фракцию можно выделить и далее анализировать при помощи газофазной ион-спектрометрии. Предпочтительно, двухмерный гель-электрофорез используют для получения двухмерной матрицы пятен, включающих один или несколько криптохромов. См., например, Jungblut and Thiede, (1997) Mass Spectr. Rev. 16: 145-162. Двухмерный гель-электрофорез можно осуществить с использованием способов, известных из уровня техники. См., например, Deutscher ed., Methods in Enzymology vol. 182. Типично, образец можно разделить, например, при помощи изоэлектрического фокусирования, в процессе которого один или несколько криптохромов в образце разделяют в условиях pH градиента, пока каждый из них не достигнет пятна, где их результирующий заряд будет равен нулю (то есть, изоэлектрической точки). Эта первая стадия разделения приводит к одномерной матрице. Молекулы в одномерной матрице далее разделяют с использованием метода, в основном отличного от тех, которые используют на первой стадии разделения. Например, во втором измерении молекулы, представляющие интерес, разделенные путем изоэлектрического фокусирования, далее разделяют с использованием полиакриламидного геля, например, при помощи электрофореза на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). SDS-PAGE гель делает возможным дальнейшее разделение на основании молекулярной массы. Типично, двухмерный гель-электрофорез может разделить химически различные молекулы, представляющие интерес, с молекулярной массой в пределах 1000-200000 Da в комплексных смесях.
Молекулы, представляющие интерес, в двухмерной матрице можно определить с использованием любых подходящих способов, известных из уровня техники. Например, молекулы, представляющие интерес, в геле могут быть меченными или окрашенными (например, окрашивание Кумасси синим или серебряным). Если гель-электрофорез образует пятна, которые соответствуют молекулярной массе одного или нескольких криптохромов по настоящему изобретению, это пятно можно вырезать и далее анализировать при помощи, например, газофазной ионной спектрометрии, масс-спектрометрии или высоко-эффективной жидкостной хроматографии. Альтернативно, гель, содержащий молекулы, представляющие интерес, можно перенести на инертную мембрану путем приложения электрического поля. Затем пятно на мембране, которое приблизительно соответствует молекулярной массе молекулы, представляющей интерес, можно анализировать, например, при помощи газофазной ионной спектрометрии, масс-спектрометрии или ВЭЖХ.
Необязательно, молекулу, представляющую интерес, можно модифицировать до анализа для улучшения ее разделения или для определения ее идентичности. Например, образец можно подвергнуть протеолитическому расщеплению до осуществления анализа. Можно использовать любую протеазу. Протеазы, такие как трипсин, которые, как полагают, расщепляют белки на дискретное количество фрагментов, являются особенно полезными. Фрагменты, которые являются результатом расщепления, могут функционировать как отпечаток пальцев для молекулы, представляющей интерес, позволяя, таким образом, осуществлять их опосредованную детекцию. Это является особенно полезным, когда присутствуют молекулы, представляющие интерес, с одинаковой молекулярной массой, которые можно спутать с предпочтительной молекулой, то есть, криптохромами, которые обсуждаются. Также, протеолитическая фрагментация является полезной для молекул с высокой молекулярной массой, поскольку боле мелкие молекулы легче разделить при помощи масс-спектрометрии. В другом примере, молекулы можно модифицировать для улучшения детекционного разрешения. Например, нейраминидазу можно использовать для удаления концевых остатков сиаловой кислоты из гликопротеинов для улучшения связывания с анионным адсорбентом (например, канионо-обменные матрицы) и для улучшения детекционного разрешения. В другом примере, молекулы можно модифицировать путем присоединения метки определенной молекулярной массы, которая специфическим образом связывается с другой молекулярной структурой, еще более разграничивая их. Необязательно, после детекции таких модифицированных молекул, представляющих интерес, идентичность молекул можно далее определять путем подгонки физических и химических характеристик модифицированных вариантов в базе данных белков (например, SwissProt).
После захвата на субстрате, например, биочипе или антителе, любой подходящий способ, такой как способы, описанные в настоящей заявке, а также другие способы, известные из уровня техники, можно использовать для измерения одного или нескольких криптохромов в образце. Действительные уровни или количества таких молекул можно определить с использованием любого способа, известного из уровня техники. Эти способы включают, без ограничений, масс-спектрометрию (например, лазерную десорбционную/ионизационную масс-спектрометрию), флуоресценцию (например, сэндвичевый иммуноанализ), поверхностно-плазмонный резонанс, эллипсометрию и атомнно-силовую микроскопию. Способы также могут включать, при использовании одной или нескольких микроматриц, ПЦР способы, масс-спектрометрию (включая, например, и без ограничений, ESI-MS, ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, матричную лазерную десорбционную ионизационную масс-спектрометрию по времени пролета (MALDI-TOF-MS), поверхностно-усиленную лазерную десорбционную/ ионизационную масс-спектрометрию по времени пролета (SELDI-TOF-MS), десорбцию/ионизацию на кремнии (DIOS), вторичную ионную масс-спектрометрию (SIMS), квадрупольную по времени пролета (Q-TOF), масс-спектрометрию с химической ионизацией атмосферного давления (APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS)n, масс-спектрометрию с фотоионизацией атмосферного давления (APPI-MS), APPI-MS/MS и APPI-(MS)n, квадрупольную масс-спектрометрию, масс-спектрометрию с Фурье преобразованием (FTMS) и масс-спектрометрию с ионной ловушкой), нуклеиновокислотные чипы, Нозерн-блот гибридизацию, TMA, SDA, NASBA, ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, ПЦР с обратной транскриптазой, ПЦР с обратной транскриптазой в режиме реального времени, in situ ПЦР, хроматографическое разделение в сочетании с масс-спектрометрией, захват белков с использованием иммобилизованных антител или с использованием традиционных иммуноанализов. См., например, Патенты США №№ 5723591; 5801155 и 6084102 и Higuchi, 1992 и 1993. ПЦР анализы можно осуществить, например, в формате многолуночных планшетов или в чипах, таких как the BioTrove OPEN ARRAY Chips (BioTrove, Woburn, MA).
Например, последовательности, содержащиеся в базе данных последовательностей, соответствующие криптохромам, можно использовать для конструирования зондов для детекции РНК последовательностей, например, в Нозерн-блот анализах гибридизации или в способах, которые специфически и, предпочтительно, количественно амплифицируют специфические нуклеиновокислотные последовательности. В качестве другого примера, последовательности можно использовать для конструирования праймеров, которые специфически или селективно гибридизуются с последовательностями криптохромов, и которые используют для амплификации таких последовательностей, например, в основанных на амплификации способах детекции, таких как основанная на обратной транскрипции полимероазная цепная реакция (ОТ-ПЦР), например, количественный ОТ-ПЦР анализ в режиме реального времени. Когда изменения генной экспрессии связаны с амплификацией, делецией, полиморфизмами и мутациями генов, сравнения последовательностей в испытываемой и контрольной популяциях можно осуществить путем сравнения относительных количеств исследуемых ДНК последовательностей в клеточной популяции субъекта и контрольной клеточной популяции. Как это используется в настоящей заявке, термин “специфически (или селективно) гибридуется” когда он относится к нуклеиновой кислоте, относится к реакции связывания, которая является детерминативом присутствия такой нуклеиновой кислоты в гетерогенной популяции нуклеиновых кислот. Таким образом, в указанных условиях анализа, специфический нуклеиновокислотный зонд (включающий ингибиторные нуклеиновые кислоты) может связываться или гибридизоваться с конкретной нуклеиновой кислотой, представляющей интерес, по меньшей мере в два раза сильнее по сравнению с фоном, и по существу не связывается и не гибридизуется в значимом количестве с другими нуклеиновыми кислотами, присутствующими в образце.
Уровни криптохромов также можно определить при помощи иммуноанализа. Антитело может быть моноклональным, поликлональным, химерным или может представлять собой фрагмент вышеперечисленных, как подробно обсуждается в настоящей заявке, и стадию детекции продукта реакции можно осуществить с использованием любого подходящего иммуноанализа. Фраза “специфически (или селективно) связывается” с антителом или “является специфически (или селективно) иммунореактивным с”, в отношении белка или пептида, относится к реакции связывания, которая является детерминативом присутствия такого белка в гетерогенной популяции белков и других биологических веществ. Таким образом, в указанных условиях иммуноанализа, указанные антитела связываются с конкретным белком по меньшей мере в два раза сильнее по сравнению с фоном, и по существу не связываются в значимом количестве с другими белками, присутствующими в образце. Для специфического связывания с антителом в таких условиях может потребоваться антитело, которое выбирают на основании его специфичности в отношении конкретного белка. Например, поликлональные антитела, выработанные к криптохрому, от определенных видов, таких как крыса, мышь или человек, можно выбирать таким образом, чтобы получить только те поликлональные антитела, которые являются специфически иммунореактивными с этим криптохромом, но не с другими белками, за исключением полиморфных вариантов и аллелей криптохрома. Такой выбор можно осуществить путем исключения антител, которые перекрестно взаимодействуют с криптохромами из других видов.
Иммуноанализы, осуществляемые в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой гомогенные анализы или гетерогенные анализы. В гомогенном анализе иммунологическая реакция обычно включает специфическое антитело (например, антитело против белка криптохрома), меченный аналит и образец, представляющий интерес. Сигнал, происходящий из метки, модифицируется, непосредственно или опосредованно, при связывании антитела с меченным аналитом. Как иммунологическую реакцию, так и детекцию степени ее осуществления можно осуществить в гомогенном растворе. Иммунохимические метки, которые можно использовать, включают свободные радикалы, радиоизотопы, флуоресцентные красители, ферменты, бактериофаги или коферменты.
В подходе гетерогенного анализа, реагенты включают образец, антитело и средства для продуцирования детектируемого сигнала. Можно использовать образцы, описанные выше. Антитело может быть иммобилизовано на носителе, таком как шарик (например, белок A и белок G агарозные шарики), пластина или предметное стекло, и контактировать с образцом, который предположительно содержит антиген в жидкой фазе. Носитель затем отделяют от жидкой фазы и либо фазу носителя либо жидкую фазу исследуют на обнаруживаемый сигнал с использованием средств, продуцирующих такой сигнал. Сигнал связан с присутствием аналита в образце. Средства, продуцирующие определяемый сигнал, включают использование определяемых меток. Примеры определяемых меток включают магнитные шарики (например, DYNABEADS™), флуоресцентные красители, ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие, обычно используемые в анализе ELISA), радиоактивные метки (например,35S,125I,131I) и флуоресцентные метки (например, флуоресцеин, Alexa, зеленый флуоресцентный белок, родамин) и колориметрические метки, такие как коллоидное золото или цветное стекло или пластиковые шарики, в соответствии с известными методами.
Альтернативно, молекулу, представляющую интерес, в образце можно определить с использованием косвенного анализа, где, например, второе, меченное антитело используют для детекции связанного криптохром-специфического антитела, и/или в конкурентном анализе или анализе ингибирования, где, например, моноклональное антитело, которое связывается с отдельным эпитопом криптохрома, инкубируют одновременно со смесью. Например, если антиген, подлежащий детекции, содержит второй сайт связывания, антитело, которое связывается с этим сайтом, может быть конъюгировано с определяемой путем детекции группой, и его можно добавить к жидкофазному реакционному раствору до стадии разделения. Присутствие определяемой метки на твердом носителе указывает на присутствие антигена в испытываемом образце. Способы измерения количества или присутствия комплексов антитело-антиген включают, например, детекцию флуоресценции, люминесценции, хемилюминесценции, поглощающую способность, отражательную способность, коэффициент пропускания, двулучепреломление или коэффициент преломления (например, поверхностно-плазмонный резонанс, эллипсометрию, резонансно-зеркальный метод, волновод с решеточным выводом или интерферометрия). Оптические методы включают микроскопию (конфокальную и не-конфокальную), методы визуализации и не-визуализационные методы. Электрохимические методы включают вольтаметрический метод и амперометрический метод. Радиочастотные методы включают мультиполярную резонансную спектроскопию. Примеры подходящих иммуноанализов включают, но не ограничиваются этим, иммуноблоттинг (например, Вестерн-блоттинг, блот-анализ в ячейках), иммунопреципитацию, методы иммунофлуоресценции, методы хемилюминесценции, электрохемилюминесценцию (ECL) или ферментные иммуноанализы, например, твердофазный иммуно-ферментный анализ (ELISA) и радиоиммуноанализ (RIA). См., главным образом, E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.); см. также Патенты США №№ 4727022; 4659678; 4376110; 4275149; 4233402; и 4230767. Эти способы также описаны, например, в Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993); Basic ns Clinical Immunology (Stites и Terr, eds., 7th ed. 1991); и Harlow и Lane, supra. Все они включены в настоящую заявку посредством ссылки.
Иммуноанализы можно использовать для определения присутствия или отсутствия одного или нескольких криптохромов в образце, а также количества в образце. Количество комплекса антитело-маркер можно определить путем сравнения со стандартом. Стандарт может представлять собой, например, известное соединение или другой белок, который известен как присутствующий в образце. Как указано выше, испытываемое количество одного или нескольких криптохромов необязательно измерять в абсолютных единицах, при условии, что единицу измерения можно сравнивать с контролем.
Белки часто присутствуют в образце во множестве различных форм, характеризующихся определяемо разной массой. Эти формы могут образовываться в результате либо пред- либо пост-трансляционной модификации, или и той и другой. Пред-трансляционно модифицированные формы включают аллельные варианты, вырезанные варианты и формы РНК сборки. Пост-трансляционно модифицированные формы включают формы, являющиеся результатом протеолитического расщепления (например, фрагменты исходного белка), гликозилирования, фосфорилирования, взаимодействия с липидами, окисления, метилирования, цистинилирования, сульфонирования и ацетилирования. Антитела также могут быть полезными для детекции пост-трансляционных модификаций белков, полипептидов, мутаций и полиморфизмов, таких как фосфорилирование тирозина, фосфорилирование треонина, фосфорилирование серина, гликозилирование (например, O-GlcNAc). Такие антитела специфически определяют фосфорилированные аминокислоты в белке или белках, представляющих интерес, и их можно использовать в иммуноблоттинге, иммунофлуоресцентном и ELISA анализах, описанных в настоящей заявке. Эти антитела хорошо известны специалистам в данной области и являются коммерчески доступными. Пост-трансляционные модификации также можно определить с использованием метастабильных ионов в отражательной матричной лазерной десорбционной ионизационной время-пролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF) (Wirth, U. et al. (2002) Proteomics 2(10): 1445-51). Коллекция белков, включая специфический белок и все его модифицированные формы, указана настоящей заявке как “кластер белков”. Коллекция всех модифицированных форм специфического белка, за исключением специфического белка как такового, указана в настоящей заявке как “кластер модифицированных белков”. Модифицированные формы любого криптохрома также можно использовать как таковые в способах, раскрываемых в настоящей заявке. В некоторых случаях модифицированные формы могут демонстрировать лучшую дикриминационную способность в диагнозе, чем специфические формы, описанные в настоящей заявке. Модифицированные формы можно изначально определить любым методом, известным из уровня техники.
Альтернативно, белок криптохрома и нуклеиновокислотные метаболиты можно измерить. Термин “метаболит” включает любой химический или биохимический продукт метаболического процесса, такой как любое соединение, полученное в результате процессинга, расщепления или поглощения биологической молекулы (например, белка, нуклеиновой кислоты, углевода или липида). Метаболиты можно определить различными способами, известными специалистам в данной области, включая спектроскопию с распределением показателя преломления (RI), спектроскопию в ультра-фиолетовой области (УФ), анализ флуоресценции, радиохимический анализ, спектроскопию в ближней инфракрасной области (ближнюю-ИК), спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР), светорассеивающий анализ (LS), масс-спектрометрию, пиролизную масс-спектрометрии, нефелометрию, дисперсионную рамановскую спектроскопию, газовую хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией, жидкостную хроматографию (включая высоко-эффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ)), которую можно использовать в сочетании с масс-спектрометрией, матричную лазерную десорбционную ионизационную масс-спектрометрию по времени пролета (MALDI-TOF) в сочетании с масс-спектрометрией, спектроскопию с ионным распылением в сочетании с масс-спектрометрией, капиллярный электрофорез, ионоподвижную спектрометрию, поверхностно-усиленную лазерную десорбционную/ионизационную масс-спектрометрию (SELDI), оптические методы, электрохимические методы, атомно-силовую микроскопию, радиочастотные методы, поверхностно-плазмонный резонанс, эллипсометрию, ЯМР и ИК детекцию. (См. Международные публикации №№ WO 04/056456 и WO 04/088309, каждая из которых включена посредством ссылки во всей полноте). В этой связи, другие аналиты можно измерить с использованием выше-указанных способов детекции или других способов, известных специалистам в данной области. Например, циркулирующие кальциевые ионы (Ca2+) можно определить в образце с использованием флуоресцентных красителей, таких как Fluo серия, Fura-2A, Rhod-2, среди прочих. Другие метаболиты подобным образом можно определить с использованием реагентов, которые специально предназначены или разработаны для детекции таких метаболитов.
Cry-опосредованное заболевание или расстройство может включать изменения активности одного или нескольких криптохромов или способности одного или нескольких криптохромов к связыванию с мишенью. Не желая быть связанным теорией, считается, что белки криптохрома связываются с Период белками Per1 и/или Per2 в виде гетеродимера, которые затем связываются с промоторной областью CLOCK-BMAL1 гена, способствуя транскрипционной регрессии петли обратной связи, которая может сталкиваться с различными метаболическими процессами. Таким образом, измерение эффективного количества одного или нескольких криптохромов в соответствии со способами по настоящему изобретению может включать оценку повышения или снижения способности Cry белков к связыванию с Per1 и/или Per2, с глюкокортикоидным рецептором (GR) или любой другой мишенью связывания Cry, известной специалистам в данной области. Измерение взаимодействий белок-белок можно облегчить любым способом, известным из уровня техники, включая ко-иммунопреципитацию, дрожжевой двухгибридный анализ, поверхностно-плазмонный резонанс, бимолекулярную флуоресцентную комплементацию, тандемную аффинную очистку, демонстрацию фага, поляризацию флуоресценции/анизотропию, двойную поляризационную интерферометрию, флуоресцентную корреляционную спектроскопию, перенос резонансной энергии флуоресценции и подобные.
Активность одного или нескольких криптохромов также можно измерить по повышению или снижению способности к связываниюс ДНК последовательностью, то есть, промоторной областью CLOCK-BMAL1 гена или другого гена, который содержит сайты связывания, распознаваемые одним или несколькими криптохромами. “Промотор”, “промоторная последовательность” или “промоторная область” относится к ДНК последовательности, способной к связыванию с РНК полимеразой в клетке, инициируя транскрипцию расположенной далее по ходу транскрипции (3’ направление) кодирующей последовательности, контролируя, таким образом, ее экспрессию. В целях определения настоящего изобретения, промоторная последовательность связана на ее 3' конце сайтом инициации транскрипции и продолжается в направлении против хода транскрипции (5' направление), включая минимальное количество оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, определяемых выше фона. В промоторной последовательности можно найти сайт инициации транскрипции (удобно определяемый, например, картирования с нуклеазой S1), а также белок-связывающие домены (консенснусные последовательности), ответственные за связывание РНК полимеразы. Промоторы могут происходить, в целостности, из природного гена или могут состоять из различных элементов, происходящих из разных промоторов, присутствующих в природе, или даже включают синтетические ДНК сегменты. Во многих случаях, точные границы регуляторных последовательностей полностью не определены, ДНК фрагменты различной длины могут иметь одинаковую промоторную активность.
CLOCK-BMAL1 промотор (или любая другая промоторная область, содержащая сайты связывания или распознавания для Cry) может быть “функционально связан” с репортерным геном. Термин "функционально связанный" относится к ассоциации нуклеиновокислотных последовательностей на одном нуклеиновокислотном фрагменте таким образом, что одна влияет на функцию другой. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, когда он способен влиять на экспрессию этой кодирующей последовательности (то есть, кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации. Термин “репортеный ген” означает нуклеиновую кислоту, кодирующую идентифицирующий фактор, который может быть идентифицирован на основании эффекта репортеного гена, где эффект используют для отслеживания наследственности нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, для идентификации клетки или организма, которые наследовали нуклеиновую кислоту, представляющую интерес, и/или для измерения индукции генной экспрессии или транскрипции. Примеры репортерных генов, известных и используемых в данной области, включают: люциферазу (Luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP), щелочную фосфатазу (ALP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), β-галактозидазу (LacZ), β-глюкуронидазу (Gus) и подобные. Селективные маркерные гены также можно считать репортерными генами. Конструкция промотор-репортерный ген может содержаться в плазмиде или векторе экспрессии, который переносят или трансфицируют в клетку. Детекцию экспрессии репортерного гена можно осуществить путем определения активности генного продукта, например, активности фермента в случае использования репортерного гена, описанного выше.
Термина “плазмида” относится к внехромосомному элементу, часто несущему ген, который не является частью центрального метаболизма клетки, и обычно в форме круглой двухцепочечной ДНК молекулы. Такие элементы могут представлять собой автономно реплицирующиеся последовательности, геном-интегрирующие последовательности, фаг или нуклеотидные последовательности, линейные, кольцевые или сверхспиральные, одно- или двухцепочечной ДНК или РНК, происходящие из любого источника, в которых ряд нуклеотидных последовательностей объединены или рекомбинированы в уникальную конструкцию, которая способна к введению промоторного фрагмента и ДНК последовательности для выбранного генного продукта вместе с соответствующей 3' нетранслируемой последовательностью в клетку. Термин “вектор экспрессии” означает вектор, плазмиду или носитель, разработанный для обеспечения возможности экспрессии вставленной нуклеиновокислотной последовательности после трансформации в организме хозяина. Векторы можно вводить в желаемые клетки хозяина способами, известными из уровня техники, например, путем трансфекции, электропорации, микроинъекции, трансдукции, слияния клеток, DEAE декстран, кальцийфосфатного осаждения, липофекции (лизосомное слияние), использования генного ружья или ДНК векторного транспортера. Любую клетку можно использовать для осуществления репортерных анализов, например, прокариотическую клетку или эукариотическую клетку. Предпочтительно, клетка может представлять собой бактериальную клетку, грибковую клетку, дрожжевую клетку, клетку нематоды, клетку насекомого, клетку рыбы, клетку растения, клетку птицы, клетку животного и клетку млекопитающего. Клетки могут представлять собой первичные клетки или можно осуществлять их непрерывный пассаж в виде клеточных линий. Примеры клеток и клеточных линий известны специалистам в данной области.
Другие способы измерения активности или способности одного или нескольких криптохромов к связыванию с ДНК последовательностью включают хроматиновый иммунопреципитационный анализ, анализ сдвига электрофоретической подвижности, ДНК pull-down анализ, захват и детекцию на микропластинах и подобные.
Уровни эффективного количества криптохромных белков, нуклеиновых кислот, полиморфизмов, метаболитов или других аналитов или активности криптохромных белков или мишеней, которые непосредственно или опосредованно связаны с криптохромными белками, затем можно определить и сравнить с контрольным значением, например, контрольным субъектом или популяцией, чей статус заболевания известен, или индексным значением или базовым значением. Контрольный образец или индексное значение или базовое значение могут быть взяты, или выведены, от одного или нескольких субъектов, которые подвергались лечению, могут быть взяты, или выведены, от одного или нескольких субъектов, которые имеют низкий риск развития Cry-опосредованного заболевания или расстройства, могут быть взяты, или выведены, от субъектов, которые показали улучшения факторов риска заболевания, как результат воздействия лечения. Альтернативно, контрольный образец или индексное значение или базовое значение могут быть взяты, или выведены, от одного или нескольких субъектов, которые не подвергались лечению. Например, образцы могут быть собраны от субъектов, которые получали начальное лечение Cry-опосредованного заболевания или расстройства и последующее лечение этого заболевания или расстройства для мониторинга прогресса лечения. В некоторых вариантах воплощения, первый образец можно взять у субъекта в первый период времени, например, до лечения соединением формулы I, определенным в настоящей заявке, либо отдельно, либо в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, с последующим измерением или детекцией одного или нескольких криптохромов (или мишеней криптохромов), описанных в настоящей заявке. Затем, второй образец можно взять у субъекта во второй период времени, например, после лечения соединением формулы I, определенным в настоящей заявке, либо отдельно, либо в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, и осуществить измерение одного или нескольких криптохромов или мишеней криптохромов. Любое количество образцов может быть взято с любым промежутком времени на протяжении всего периода лечения для оценки эффективности.
Контрольное значение также может включать значение, выведенное из алгоритмов предсказания риска или рассчитанных индексов из исследований популяции, таких как раскрываемые в настоящей заявке. Подобным термином в этом контексте является “контроль”, который может представлять собой, например, усредненное или среднее количество криптохромов, присутствующих в сравниваемых образцах нормальных субъектов у нормальных субъектов или у не страдающих заболеванием субъектов, таких, у которых Cry-опосредованное заболевание или расстройство не определяется. Контрольное количество измеряют в таких же или по существу таких же экспериментальных условиях, как при измерении испытываемого количества. Корреляция может учитывать присутствие или отсутствие криптохромов в испытываемом образце и частоту детекции этой же самой молекулы в контроле. Корреляция может учитывать оба эти фактора, что способствует определению статуса заболевания.
Контрольный профиль тех субъектов, которые не имеют Cry-опосредованного заболевания или расстройства и у которых не ожидается развитие Cry-опосредованного заболевания или расстройства, также можно получить в соответствии со способами, раскрываемыми в настоящей заявке. Измерение одного или нескольких криптохромов также можно использовать для создания “профиля субъекта”, получаемого от субъектов, которые имеют Cry-опосредованное заболевание или расстройство. Профили субъектов можно сравнить с контрольным профилем для диагностики или идентификации субъектов, имеющих риск развития Cry-опосредованного заболевания или расстройства, для мониторинга прогрессирования заболевания, а также скорости прогрессирования заболевания и для мониторинга эффективности способов терапевтического воздействия или лечения субъекта.
Контрольные профили и профили субъектов по настоящему изобретению могут содержаться в машинно-считываемой среде, такой как, но не ограничиваясь этим, аналоговые или цифровые магнитные ленты, такие как ленты, считываемые при помощи VCR, CD-ROM, DVD-ROM, USB флэш-среды, среди прочего. Такие машинно-считываемые среды также могут содержать дополнительные результаты испытаний, такие как, без ограничений, измерения клинических параметров и традиционных лабораторных факторов риска. Альтернативно или дополнительно, машинно-считываемые среды также могут включать информацию, касающуюся субъекта, такую как медицинская история и любая релевантная семейная история. Машинно-считываемые среды также могут содержать информацию, относящуюся к другим алгоритмам риска и рассчитанным показателям, таким как показатели, описанные в настоящей заявке.
В любом из способов, раскрываемых в настоящей заявке, данные от образца могут подаваться непосредственно из средств детекции означает в компьютер, содержащий диагностический алгоритм. Альтернативно, полученные данные могут подаваться вручную или автоматически в отдельный компьютер, который содержит диагностический алгоритм. Соответственно, варианты воплощения настоящего изобретения включают способы, включающие корреляцию детекции криптохромов с возможным диагнозом Cry-опосредованного заболевания или расстройства. Корреляция может учитывать количество одного или нескольких криптохромов в образце по сравнению с контрольным количеством (повышающая или даун-регуляция криптохромов) (например, у нормальных субъектов, у которых Cry-опосредованное заболевание или расстройство не определяется). Корреляция может учитывать присутствие или отсутствие криптохромов в испытываемом образце и частоту детекции этой же самой молекулы в контроле. Корреляция может учитывать оба эти фактора, что способствует определению, имеется у субъекта Cry-опосредованное заболевание или расстройство или нет.
Анализ данных может включать стадии определения силы детектируемого сигнала (например, высота пиков) маркера, и удаления “выбросов” (данные, отклоняющиеся от предварительно определенной статистической дистрибуции). Наблюдаемые пики могут быть нормализованы способом, при помощи которого рассчитывают высоту каждого пика относительно некоторого контроля. Например, контроль может представлять собой фоновый шум, производимый инструментом и химическими веществами (например, поглощающая энергию молекула), который устанавливают как ноль в шкале. Силу сигнала, определенную для каждой молекулы, представляющей интерес, можно представить в форме относительных интенсивностей по желаемой шкале (например, 100). Альтернативно, стандарт (например, сывороточный белок) может допускаться с образцом так, чтобы пик от стандарта можно было использовать в качестве контроля для расчета относительных интенсивностей сигналов, наблюдаемых для каждой молекулы, представляющей интерес, детекцию которой осуществляют.
Полученные данные могут быть трансформированы или преобразованы в различные форматы для их представления. В одном формате, когда указывается “изображение спектра или ретентивная карта”, может быть представлено стандартное спектральное изображение, где изображение отображает количество молекул, достигающих детектор при каждой конкретной молекулярной массе. В другом формате, когда указывается “карта пиков”, только информация, относящаяся к высоте пиков и массе, сохраняется из спектрального изображения, давая более ясное изображение и позволяя легче разглядеть молекулы, представляющие интерес, с почти одинаковыми молекулярными массами. Еще в одном формате, когда указывается “картина геля”, каждую массу из картины пика можно преобразовать в плутоновое изображение на основании высоты каждого пика, получая изображение, подобное полосам на электрофоретических гелях. Еще в одном формате, когда указывается “3-D наложения”, некоторые спектры могут перекрываться для исследования незначительных изменений относительных высот пиков. Еще в одном формате, когда указывается “разностное отображение”, два или более спектров можно сравнить, удобно выделяя уникальные молекулы, представляющие интерес, регуляция которых повышается или понижается между образцами. Профили (спектры) любых двух образцов можно сравнивать визуально. Еще в одном формате, можно использовать Spotfire Scatter Plot, где молекулы представляющие интерес, которые были определены, представляют графически в виде точки на графике, где одна ось графика представляет кажущуюся молекулярную массу криптохромов, которые были определены, а другая ось представляет интенсивность сигналов криптохромов, которые были определены. Для каждого образца, представляющие интерес молекулы, которые были определены, и количество молекул, присутствующих в образце, могут храниться в компьютерной считываемой среде. Эти данные затем можно сравнить с контролем или контрольным профилем или контрольным значением (например, профилем или количеством молекул, определенных в контроле, например, у субъектов, у которых Cry-опосредованное заболевание или расстройство не определяется).
Данные, которые получают в способах, раскрываемых в настоящей заявке, можно классифицировать с использованием способа распознавания образцов, в котором используют модель классификации. В некоторых вариантах воплощения, данные, которые получают с использованием образцов, таких как “известные образцы”, затем можно использовать для “тренировки” модели классификации. “Известный образец” представляет собой образец, который предварительно классифицирован (например, заболевание или отсутствие заболевание). Данные, которые получают с использованием известных образцов, затем можно использовать для “тренировки” модели классификации. “Известный образец” представляет собой образец, который предварительно классифицирован. Данные можно использовать для формирования модели классификации, и могут быть указаны как “набор обучающих данных”. После тренировки, модель классификации может распознавать образцы в данных, полученных с использованием неизвестных образцов. Модель классификации затем можно использовать для классификации неизвестных образцов по классам. Это может быть полезным, например, для предсказания, ассоциируется или нет конкретный биологический образец с определенным биологическим состоянием (например, имеющий заболевание vs. не имеющего заболевания). Набор обучающих данных, который используют для формирования модели классификации, может включать необработанные данные или предварительно обработанные данные. В некоторых вариантах воплощения, необработанные данные могут быть получены непосредственно из спектров по времени пролета или масс-спектров и затем, необязательно, могут быть предварительно обработаны” любым подходящим способом. Стадии предварительной обработки, такие как указанные выше, можно использовать для сокращения количества данных, которые используют для тренировки модели классификации.
Модели классификаци могут быть сформированы с использованием любого подходящего метода статистической классификации (или “итеративного” метода), который пытается разделить большие количества данных на классы на основании объективных параметров, присутствующих в данных. Классификационные процессы могут быть либо контролируемыми, либо неконтролируемыми. Примеры контролируемой и неконтролируемой классификации описаны в Jain, “Statistical Parren Recognition: A Review”, IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, Vol. 22, No. 1, January 2000, который включен в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. В контролируемой классификации обучающие данные, содержащие примеры известных категорий, представляют для механизма обучения, который обучается одному или нескольким наборам взаимосвязей, которые определяют каждый из известных классов. Новые данные затем можно применить для механизма обучения, который затем классифицирует эти новые данные с использованием выученых взаимосвязей.
Примеры методов контролируемой классификации включают методы линейной регрессии (например, множественной линейной регрессии (MLR), частичной регрессии с использованием метода наименьших квадратов (PLS) и регрессии основных компонентов (PCR)), методы двоичного дерева решений (например, методы рекурсивного разделения, такие как CART - классификация и дерево регрессии), искусственные нейронные сети, такие как нейронные сети с обучением по алгоритмуу обратного распространения, дискриминантные анализы (например, байессовский классификатор или метод Фишера), логистические классификаторы и вспомогательные векторные классификаторы (автоматические вспомогательные векторные классификаторы). Предпочтительным методом контролируемой классификации является метод рекурсивного разделения (Публикация патентной заявки США № 20020138208). Неконтролируемая классификация пытается выучить классификации, основанные на сходствах в наборе обучающих данных, без предварительной классификации спектров, из которых был выведен набор обучающих данных. Методы неконтролируемого обучения включают кластерные анализы. Кластерный анализ пытается разделить данные на “кластеры” или группы, которые в идеале должны содержать члены, которые очень схожи друг с другом и сильно отличаются от членов других кластеров. Схожесть затем измеряют с использованием некоторого дистанционного измерения, которое определяет расстояние между элементами данных и собирает вместе элементы данных, которые ближе друг к другу. Методы кластеризации включают алгоритм обучения методом K-средних Мак-Квина и алгоритм самоорганизующейся карты Кохонена. Алгоритмы обучения, утвержденные для использования в классификации биологической информации, описаны, например, в публикации международной патентной заявки № WO 01/31580 и Публикациях патентных заявок США №№ 20020193950, 20030004402 и 20030055615. Другой метод классификации включает многомерные прогнозирующие модели с использованием не-линейной версии Unified Maximum Separability Анализ (“USMA”) классификаторов. USMA классификаторы подробно описаны в публикации патентной заявки США № 20030055615.
Другие классификационные алгоритмы и формулы включают, но не ограничиваются этим, Анализ Главных Компонент (PCA), кросс-корреляцию, чередование факторов, Логистическую Регрессию (LogReg), Линейный Дискриминантный Анализ (LDA), Eigengene Линейный Дискриминантный Анализ (ELDA), Случайный Лес (RF), Дерево Рекурсивного Разделения (RPART), а также другие связанные с деревом решений методы классификации, Сжатые Центроидные Методы (SC), StepAIC, метод Kth-Ближайшего Соседа, Бустинг, методы Дерева Решений, Нейронные Сети, Байессовские Сети, Вспомогательные Векторные Машины, Leave-One-Out (LOO)(оставить один из), 10-Кратную кросс-валидацию (10-Fold CV) и Скрытые Марковские Модели, среди прочего.
Детекцию и корреляци одного или нескольких криптохромов также можно анализировать с использованием любых подходящих средств, включая пакеты программ, например, Applied Maths, GenExplore™, 2-мерный кластерный анализ, анализ основных компонент, дискриминантный анализ, самоорганизующиеся карты; BioDiscovery, Inc., Los Angeles, California (ImaGene™, специальная программа обработки изображения и вывода данных, обладатель прав MatLab®; GeneSight: иерархический кластеринг, искусственная нейронная сеть (SOM), анализ основных компонент, временной ряд; AutoGene™; CloneTracker™); GeneData AG (Basel, Switzerland); Molecular Pattern Recognition веб-сайт на MIT’s Whitehead Genome Center; Rosetta Inpharmatics, Kirkland, Washington. Resolver™ Expression Data Analysis System; Scanalytics, Inc., Fairfax, VA. Его комплект микроматриц позволяет исследователям получать, визуализировать, обрабатывать и анализировать микроматричные данные генной экспрессии; TIGR (The Institute for Genome Research) предлагает инструментальные программные средства для анализа матрицы. Например, см. также Eisen and Brown, (1999) Methods Enzymol. 303: 179-205.
В некоторых вариантах воплощения способов определения статуса заболевания, способы дополнительно включают осуществление или модификацию клинического лечения субъекта на основании статуса заболевания или расстройства. Например, если результат способов по настоящему изобретению является неубедительным или существует причина того, что подтверждение статуса является необходимым, лечащий врач может заказать дополнительные тесты (например, CT сканирования, PET сканирования, MRI сканирования, PET-CT сканирования, рентген, биопсии, пробы крови. Альтернативно, если статус указывает на то, что лечение является соответствующим, лечащий врач может определить схему лечения для субъекта. В других случаях, субъект может получать терапевтические лечения (такие как введение терапевтических средств (таких как, например, соединения формулы I, определенные в настоящей заявке, либо отдельно, либо в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами), либо вместо либо в дополнение к хирургической операции. Никакое другое действие не может быть оправданным. Кроме того, если результаты показывают, что лечение было успешным, может быть необходима поддерживающая терапия, или не нужны никакие дополнительные мероприятия.
Изобретение, раскрываемое в настоящей заявке, также обеспечивает такие способы, где криптохромы измеряют снова после клинического лечения субъекта. В этих случаях, способы используют для мониторинга статуса Cry-опосредованного заболевания или расстройства, например, ответа на лечение, ремиссии заболевания или прогрессирования заболевания. Способы модно повторять после каждого лечения, принимаемого субъектом, позволяя лечащему врачу отслеживать эффективность курса лечения. Если результаты показывают, что лечение не является эффективным, курс лечения можно соответственно изменить.
Изобретение обеспечивает наборы для определения статуса заболевания и/или детекции или диагностики заболевани, при этом такие наборы можно использовать для детекции одного или нескольких криптохромов. Например, наборы можно использовать для детекции любого одного или нескольких криптохромов, описанных в настоящей заявке, при этом один или несколько криптохромов дифференцированно присутствуют в образцах имеющих заболевание субъектов и нормальных субъектов. Наборы по настоящему изобретению имеют множество применений. Например, наборы можно использовать в любом из способов по настоящему изобретению, описанных в настоящей заявке, например, среди прочего, определения имеет ли субъект Cry-опосредованное заболевание или расстройство или имеет отрицательный диагноз, способствуя, таким образом, определению диагноза. В другом примере, наборы можно использовать для идентификации соединений, которые модулируют экспрессию одного или нескольких криптохромов, соединений, которые модулируют активность одного или нескольких криптохромов (то есть, которые влияют на способность одного или нескольких криптохромов к связыванию с мишенью, такой как Per1, Per2, глюкокортикоидный рецептор (GR) или промоторная последовательность, распознаваемая криптохромами, такая как CLOCK-BMAL1 промотор или любая другая промоторная последовательность), с использованием in vitro или in vivo животных моделей для Cry-опосредованного заболевания или расстройства. В другом примере, наборы можно использовать для идентификации связывания мишеней одного или нескольких криптохромных белков, определенных в настоящей заявке.
Наборы по настоящему изобретению могут включать реагент для детекции, например, нуклеиновые кислоты, которые специфически идентифицируют одну или несколько криптохромных нуклеиновых кислот, имея гомологичные нуклеиновокислотные последовательности, такие как олигонуклеотидные последовательности, праймеры или аптамеры, комплементарные к части этих нуклеиновых кислот, или антитела к белкам, кодируемым такими нуклеиновыми кислотами, упакованные вместе. Олигонуклеотиды могут представлять собой фрагменты генов. Олигонуклеотиды могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Например, олигонуклеотиды могут представлять собой 200, 150, 100, 50, 25, 10 или меньше нуклеотидов в длину. Альтернативно, реагент для детекции может представлять собой одно или несколько антител, которые специфически или селективно связываются с одним или несколькими криптохромными белками или их мишенями. Набор может содержать в отдельных контейнерах нуклеиновую кислоту или антитело (либо уже связанной с твердой матрицей или упакованное отдельно с реагентами для связывания их с матрицей), контрольные композиции (положительные и/или отрицательные) и/или определяемую метку, такую как флуоресцеин, зеленый флуоресцентный белок, родаминовый, цианиновый красители, Alexa красители, люцифераза, радиоактивные метки, среди прочего. Инструкции (например, письменные, лента, VCR, CD-ROM и т.д.) для осуществления анализа и для соотнесения со статусом заболевания могут быть включены в набор.
Например, реагент детекци может быть иммобилизован на твердой матрице, такой как пористая полоска, с образованием по меньшей мере одного участка детекции. Область измерения или детекции пористой полоски может включать множество сайтов, содержащих нуклеиновую кислоту. Испытываемая полоска также может содержать сайты для отрицательных и/или положительных контролей. Альтернативно, контрольные сайты могут быть на полоске отдельной от испытываемой полоски. Необязательно, различные сайты детекции могут содержать различные количества иммобилизованных нуклеиновых кислот, например, большее количество в первом сайте детекции и меньшие количества в последующих сайтах. При добавлении испытываемого образца, количество сайтов, демонстрирующих определяемый сигнал, обеспечивает количественное показание количества криптохромов, присутствующих в образце. Сайты детекции могут быть сконфигурированы в любую подходящую определяемую форму, и типично имеют форму столбца или не охватывают всю ширину испытываемой полоски. Субстратная матрица может представлять собой, например, твердый субстрат, например, “чип”, описанный в Патенте США № 5744305. Альтернативно, субстратная матрица может представлять собой растворенную матрицу, например, xMAP (Luminex, Austin, TX), Cyvera (Illumina, San Diego, CA), CellCard (Vitra Bioscience, Mountain View, CA) и Quantum Dots’ Mosaic (Invitrogen, Carlsbad, CA). Набор также может содержать реагенты и/или ферменты для амплификации или выделения ДНК образца. Наборы могут включать реагенты для ПЦР в режиме реального времени, например, TaqMan зонды и/или праймеры и ферменты.
В некоторых вариантах воплощения, набор включает: (a) субстрат, включающий адсорбент на его поверхности, где адсорбент удерживает криптохром, либо является подходящим для связывания криптохрома, и (b) инструкции для детекции криптохрома путем контактирования образца с адсорбентом и детекции криптохрома, удерживаемого адсорбентом. В некоторых вариантах воплощения, набор может включать элюант (в качестве альтернативы или в сочетании с инструкциями) или инструкции для получения элюанта, где комбинация адсорбента и элюанта обеспечивает возможность детекции криптохрома с использованием газофазной ионной спектрометрии.
В других вариантах воплощения, набор может включать первый субстрат, включающий адсорбент на его поверхности (например, частица, функционализированная адсорбентом), и второй субстрат, на котором может располагаться первый субстрат с образованием зонда который можно извлечь и вставить в машину, такую как, например, газофазный ионный спектрометр. В других вариантах воплощения, набор может включать один субстрат, который имеет форму зонда с адсорбентами на поверхности субстрата, который можно извлечь и вставить в машину. Еще в одном варианте воплощения, набор может дополнительно включать предварительно-фракционированную вращающуюся колонку (например, Cibacron blue агарозную колонку, анти-HSA агарозную колонку, K-30 вытеснительную колонку с исключением по размеру, Q-анионо-обменную вращающуюся колонку, колонку с одноцепочечной ДНК, колонку с лектином и т.д.). В другом варианте воплощения, набор включает (a) антитело, которое специфически связывается с одним или несколькими криптохромами; и (b) реагент для детекции. Антитело может представлять собой, например, антитело, направленное против генных продуктов криптохромного гена.
Необязательно, набор может дополнительно включать стандартную или контрольную информацию, чтобы испытываемый образец можно было сравнить с контрольным информационным стандартом для определения, является или нет испытываемое количество одного или нескольких криптохромов, обнаруженное в образце, диагностическим количеством, согласующимся с диагнозом Cry-опосредованного заболевания или расстройства.
Хотя несколько вариантов было описано подробно выше, возможны другие модификации или дополнения. В частности, могут обеспечиваться другие характерные признаки и/или варианты в дополнение к тем, которые описаны в настоящей заявке. Например, осуществления, описанные выше, могут быть направлены на различные комбинации и субкомбинации раскрытых характерных признаков и/или комбинаций и субкомбинаций некоторых дополнительных характерных признаков, раскрытых выше. Кроме того, логическая схема, описанная в настоящей заявке, не требует конкретного порядка, который показан, или последовательного порядка для достижения желаемых результатов. Другие варианты воплощения могут охватываться объемом формулы изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Схемы реакций для синтеза соединений
Следующие схемы реакций, Схемы реакций I, II и III, способах получения соединений формулы I, переменные R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, a и b являются такими, как определено выше для соединения формулы I, если не указано иное. Схемы реакций, описанные в настоящей заявке, предназначены для обеспечения общего описания методологии, используемой для получения многих соединений, описанных в данных Примерах. Однако, из подробных описаний, приведенных в экспериментальной части, будет очевидно, что используемые способы получения распространяются дальше, чем общие процедуры, описанные в настоящей заявке. В частности, следует отметить, что соединения, полученные в соответствии со схемами, можно далее модифицировать, чтобы обеспечить новые Примеры в рамках объема настоящего изобретения. Реагенты и промежуточные соединения, используемые в следующих примерах, либо являются коммерчески доступными, либо могут быть получены специалистами в области органического синтеза в соответствии со стандартными описанными в литературе способами.
Схема реакций I, ниже, отображает синтез соединений формулы I. Обработка соответствующим образом замещенного бромидного производного формулы VI соответствующим карбазолом формулы VII в соответствующем растворителе, таком как N,N-диметилформамид или N,N-диметилацетамид, в температурном диапазоне приблизительно от 0°C до 150°C в течение приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее оксирановое соединение формулы V. Предпочтительные условия для взаимодействия бромидного соединения формулы VI с карбазолом формулы VII для получения соединений формулы V включают осуществление реакции в N,N-диметилформамиде при температуре от 0°C до комнатной температуры в присутствии гидроксида калия в течение времени от 20 до 24 часов, с последующей экстракцией. Обработка соединения формулы V соответствующим амином формулы IV в соответствующем растворителе, таком как этанол, в температурном диапазоне приблизительно от комнатной температуры до 150°C в течение времени приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее аминоспиртовое соединение формулы III. Предпочтительные условия для взаимодействия оксиранового соединения формулы V для получения соединений формулы III включают осуществление реакции в этаноле при 40°C в течение 20-24 часов, с последующей экстракцией. Альтернативно, оксирановое соединение формулы V может быть подвергнуто взаимодействию с амином формулы IV в соответствующем растворителе, таком как этанол, при микроволновом облучении с получением соединения формулы III. Обработка соединения формулы III соответствующим сульфонилхлоридом формулы II, в соответствующем растворителе, таком как метиленхлорид, в температурном диапазоне от 0°C до 150°C в течение времени приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее сульфонамидное соединение формулы I. Предпочтительные условия для взаимодействия аминоспиртового соединения формулы III с сульфонилхлоридом формулы II для получения соединения формулы I включают осуществление реакции в метиленхлориде при температуре от 0°C до комнатной температуры в присутствии триэтиламина или пиридина в течение 1-24 часов с последующей экстракцией.
Схема реакций II, ниже, отображает альтернативный синтез соединений формулы I. Обработка соответствующим образом замещенного оксиранового производного формулы V соответствующим сульфонамидом формулы VIII, в соответствующем растворителе, таком как N,N-диметилформамид или N,N-диметилацетамид, в температурном диапазоне от 0°C до 150°C в течение периода времени приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее сульфонамидное соединение формулы I. Предпочтительные условия для взаимодействия оксиранового соединения формулы V с сульфонамидом формулы VIII для получения соединения формулы I включают осуществление реакции в N,N-диметилформамиде при температуре от комнатной до 70°C в присутствии гидрида натрия в течение 20-24 часов. Альтернативно, оксирановое соединение формулы V может быть подвергнуто взаимодействию с сульфонамидом формулы VIII в соответствующем растворителе, таком как N,N-диметилацетамид, при 100°C в присутствии карбоната цезия в течение 20-24 часов.
Схема реакций III, ниже, отображает альтернативный синтез соединений формулы I. Обработка аминового соединения формулы IV соответствующим сульфонилхлоридом формулы II, в соответствующем растворителе, таком как метиленхлорид, в температурном диапазоне от 0°C до 150°C в течение периода времени приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее сульфонамидное соединение формулы VIII. Предпочтительные условия для взаимодействия аминового соединения формулы IV с сульфонилхлоридом формулы II для получения соединения формулы VIII включают осуществление реакции в метиленхлориде при температуре от 0°C до комнатной температуры в присутствии триэтиламина или пиридина в течение 1-24 часов с последующей экстракцией. Обработка соединения формулы VIII соответствующим бромидом формулы X в соответствующем растворителе, таком как N,N-диметилформамид или N,N-диметилацетамид, в температурном диапазоне от 0°C до 150°C в течение периода времени приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее оксирановое соединение формулы IX. Предпочтительные условия для взаимодействия сульфонамидного соединения формулы VIII с бромидом формулы X для получения соединения формулы IX включают осуществление реакции в N,N-диметилформамиде при температуре от комнатной до 70°C в присутствии гидрида натрия в течение 20-24 часов. Обработка соединения формулы IX соответствующим карбазолом формулы VII, в соответствующем растворителе, таком как N,N-диметилформамид или N,N-диметилацетамид, в температурном диапазоне от 0°C до 150°C в течение периода времени приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее сульфонамидное соединение формулы I. Предпочтительные условия для взаимодействия оксиранового соединения формулы IX с карбазолом формулы VII для получения соединения формулы I включают осуществление реакции в N,N-диметилформамиде при температуре от комнатной до 115°C в присутствии карбоната цезия в течение 1-24 часов. Альтернативно, оксирановое соединение формулы IX может быть подвергнуто взаимодействию с карбазолом формулы VII в соответствующем растворителе, таком как N,N-диметилформамид, при микроволновом облучении с получением соединения формулы I.
Схема реакций IV, ниже, отображает альтернативный синтез соединений формулы I. Обработка аминоэфира соединения формулы XIV соответствующим сульфонилхлоридом формулы II в соответствующем растворителе, таком как метиленхлорид, в температурном диапазоне от 0°C до 150°C в течение периода времени приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее сульфонамидное соединение формулы XIII. Предпочтительные условия для взаимодействия аминоэфира соединения формулы XIV с сульфонилхлоридом формулы II для получения соединения формулы XIII включают осуществление реакции в метиленхлориде при температуре от 0°C до комнатной температуры в присутствии триэтиламина в течение 1-24 часов с последующей экстракцией. Обработка соединения формулы XIII соответствующим восстановителем, в соответствующем растворителе, таком как тетрагидрофуран, в температурном диапазоне от 0°C до 150°C в течение периода времени приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее спиртовое соединение формулы XII. Предпочтительные условия для восстановления сложноэфирного соединения формулы XIII для получения соединения формулы XII включают осуществление реакции в тетрагидрофуране при температуре от 0°C до комнатной температуры в присутствии литийалюминийгидрида в течение 1-24 часов с последующей экстракцией. Обработка соединения формулы XII соответствующим окислителем, в соответствующем растворителе, таком как метиленхлорид, в температурном диапазоне от 0°C до 150°C в течение периода времени приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее альдегидное соединение формулы XI. Предпочтительные условия для окисления спиртового соединения формулы XII для получения соединения формулы XI включают осуществление реакции в метиленхлориде при температуре от 0°C до комнатной температуры в присутствии перйодинана Десса-Мартина в течение 24-48 часов с последующей фильтрацией. Обработка соединения формулы XI триметилсульфоксониййодидом, в соответствующем растворителе, таком как диметилсульфоксид, в температурном диапазоне от 0°C до 150°C в течение периода времени приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее оксирановое соединение формулы IX. Предпочтительные условия для преобразования альдегидного соединения формулы XI для получения соединения формулы IX включают осуществление реакции в диметилсульфоксиде при температуре от 0°C до комнатной температуры в присутствии триметилсульфоксониййодида и гидрида натрия в течение 2-24 часов с последующей экстракцией. Обработка соединения формулы IX соответствующим карбазолом формулы VII в соответствующем растворителе, таком как N,N-диметилформамид или N,N-диметилацетамид, в температурном диапазоне от 0°C до 150°C в течение периода времени приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее сульфонамидное соединение формулы I. Предпочтительные условия для взаимодействия оксиранового соединения формулы IX с карбазолом формулы VII для получения соединения формулы I включают осуществление реакции в N,N-диметилформамиде при температуре от комнатной до 115°C в присутствии карбоната цезия в течение 1-24 часов. Альтернативно, оксирановое соединение формулы IX может быть подвергнуто взаимодействию с карбазолом формулы VII в соответствующем растворителе, таком как N,N-диметилформамид, при микроволновом облучении, с получением соединения формулы I.
Схема реакций V, ниже, отображает альтернативный синтез соединений формулы I. Обработка соответствующим образом замещенного оксиранового производного формулы XV или XVI соответствующим сульфонамидом формулы VIII в соответствующем растворителе, таком как N,N-диметилформамид или N,N-диметилацетамид, в температурном диапазоне от 0°C до 150°C в течение периода времени приблизительно от 5 минут до 24 часов обеспечивает соответствующее сульфонамидное соединение формулы I. Предпочтительные условия для взаимодействия оксиранового соединения формулы XV или XVI с сульфонамидом формулы VIII для получения соединения формулы I включают осуществление реакции в N,N-диметилформамиде при температуре от комнатной до 70°C в присутствии гидрида натрия в течение 20-24 часов. Альтернативно, оксирановое соединение формулы XV или XVI может быть подвергнуто взаимодействию с сульфонамидом формулы VIII в соответствующем растворителе, таком как N,N-диметилацетамид, при 100°C в присутствии карбоната цезия в течение 20-24 часов.
Следует понимать, что в схемах реакций, описанных в настоящей заявке, гидроксильные группы в промежуточных соединениях, полезные для получения соединений формулы I, могут быть защищены при помощи обычных групп, известных специалистам в данной области техники, как это требуется. Например, промежуточные соединения, содержащие гидроксильную группу, могут быть защищены как соответствующий трет-бутилдиметилсилиловый эфир, и затем защитная группа может быть удалена путем обработки тетра-н-бутиламмонийфторидом с получением свободного гидроксильного производного. Подходящие защитные группы и способы их удаления проиллюстрированы в “Protective Groups in Organic Synthesis”, 3rd Ed., T. W. Greene and P. G. M. Wuts (Wiley и Sons, 1999).
1H Спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) во всех случаях соответствуют предлагаемым структурам. Характеристические химические сдвиги (δ) представлены в виде миллионных долей ниже от тетраметилсилана с использованием обычных сокращений для обозначения основных пиков: например, с=синглет; д=дублет; т=триплет; кв.=квартет; м=мультиплет; шир.=широкий. Масс-спектры (m/z) были получены или с использованием ионизации электрораспылением (ESI) или химической ионизации при атмосферном давлении (APCI). Где использована тонкослойная хроматография (ТСХ), это относится к ТСХ на силикагеле с использованием пластин с силикагелем 60 F254, Rf представляет собой расстояние, пройденное соединением, деленное на расстояние, пройденное фронтом растворителя на ТСХ пластине. ВЭЖХ относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Следующие конкретные примеры будут включены в иллюстративных целях, и не должны быть истолкованы как ограничение данного раскрытия.
Получение 1: 2-Фтор-N-фениланилин
В реакционный сосуд загружали йодбензол (1,42 г, 7 ммоль), ацетат палладия (II) (0,079 г, 0,35 ммоль), 2,2'-бис(дифенилфосфино)-1,1'-бинафтил (0,217 г, 0,35 ммоль), карбонат цезия (6,8 г, 21 ммоль), 2-фторанилин (0,777 г, 7 ммоль) в безводном толуоле (18 мл). В атмосфере азота, смесь нагревали при 115°C в течение 24 часов. Охлажденную смесь разбавляли водой и простым эфиром. Органический слой отделяли, промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением остатка. Неочищенный продукт очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (0-30% этилацетата в гексане) с получением желаемого продукта в виде прозрачного масла (1,1 г, 81%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,36-7,29 (м, 3H), 7,20-7,14 (м, 3H), 7,09-7,00 (м, 2H), 6,88-6,85 (м, 1H), 5,82 (уш. с, 1H), ESI m/z: 188,2 (M+H).
Получение 2: 1-Фтор-9H-карбазол
В реакционный сосуд загружали 2-фтор-N-фениланилин (0,4 г, 2,1 ммоль), диацетат палладия (0,025 г, 0,1 ммоль), карбонат калия (0,030 г, 0,21 ммоль) и пивалиновую кислоту (1,8 г), помещали под баллон с кислородом и нагревали при 120°C. Дополнительные порции диацетата палладия (0,025 г, 0,1 ммоль) добавляли через 48 часов и 72 часа и смесь нагревали в течение 4 дней. Охлажденную реакционную смесь разбавляли метиленхлоридом, промывали насыщенным водным раствором карбоната натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали через слой силикагеля и концентрировали. Неочищенный продукт очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (5-30% метиленхлорида в гексане) с получением желаемого продукта в виде белого твердого вещества (0,181 г, 46%).1H ЯМР (d6-ДМСО, 300 МГц) δ 11,65 (с, 1H), 8,13-8,11 (дд, 1H, J=0,6, 7,5 Гц), 7,94-7,91 (д, 1H, J=7,8 Гц), 7,50-7,38 (м, 2H), 7,25-7,07 (м, 3H).
Анализ ВЭЖХ (C18, 5-95% ацетонитрила в H2O+0,1% трифторуксусной кислоты в течение 20 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 9,65 минут, 100%.
Получение 3: 4-Фтор-2-нитро-1,1'-бифенил
В микроволновой реакционный сосуд загружали 2-хлор-5-фторнитробензол (0,175 г, 1 ммоль), фенилбороновую кислоту (0,134 г, 1,1 ммоль), карбонат натрия (0,317 г, 3 ммоль), диацетат палладия (0,009 г, 0,04 ммоль), тетрабутиламмонийбромид (0,322 г, 1 ммоль) в воде (2 мл). Смесь нагревали до 165°C в микроволновом реакторе в течение 7,5 минут. Реакционную смесь охлаждали и вливали в простой эфир и 0,1н водный раствор гидроксида натрия. Эфирный слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (5-30% метиленхлорида в гексане) с получением желаемого продукта в виде бледно-желтого масла (0,179 г, 82%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,62-7,58 (дд, 1H, J=2,7, 8,1 Гц), 7,46-7,40 (м, 4H), 7,38-7,34 (м, 1H), 7,31-7,26 (м, 2H).
Анализ ВЭЖХ (C18, 5-95% ацетонитрила в H2O+0,1% трифторуксусной кислоты в течение 20 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 9,95 минут, 96,3%.
Получение 4: 2-Фтор-9H-карбазол
Раствор 4-фтор-2-нитро-1,1'-бифенила (0,170 г, 0,78 ммоль) и трифенилфосфина (0,513 г, 1,9 ммоль) в безводном 1,2-дихлорбензоле (1,5 мл) нагревали до 175°C в микроволновом реакторе в течение 8 часов. Охлажденную смесь концентрировали в вакууме и очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (7-50% метиленхлорида в гексане) с получением не совсем белого твердого вещества (0,129 г, 89%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 8,06 (уш. с, 1H), 8,03-7,95 (м, 2H), 7,43-7,39 (м, 2H), 7,26-7,21 (м, 1H), 7,12-7,08 (дд, 1H, J=2,3, 9,3 Гц), 7,00- 6,93 (м, 1H).
Анализ ВЭЖХ: (C18, 5-95% ацетонитрила в H2O+0,1% трифторуксусной кислоты в течение 20 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 9,67 минут, 98,8%.
Получение 5: 4-Фторфенил трифторметансульфонат
К охлажденному до 0°C раствору 4-фторфенола (1,5 г, 13,3 ммоль) в безводном метиленхлориде (44 мл) добавляли пиридин (2,2 мл, 27 ммоль) и трифторметансульфоновый ангидрид (2,7 мл, 16 ммоль). Раствору давали медленно нагреться до температуры окружающей среды и перемешивали в течение 16 часов. Раствор разбавляли простым эфиром и последовательно два раза промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия. Органический раствор сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением коричневой жидкости (3,2 г, 99%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,28-7,24 (м, 2H), 7,16-7,11 (м, 2H).
Получение 6: 3-Фтор-9H-карбазол
Смесь 4-фторфенилтрифторметансульфоната (0,753 г, 3 ммоль), анилина (0,307 г, 3,3 ммоль), ацетата палладия (0,067 г, 0,3 ммоль), карбоната цезия (1,17 г, 3,6 ммоль) и 2-дициклогексилфосфино-2′,4′,6′-триизопропилбифенила (0,215 г, 0,45 ммоль) в безводном толуоле (7,5 мл) помещали в азотную среду, дважды откачивая и повторно заполняя азотом, и нагревали при 100°C в течение 2 часов. В охлажденную реакционную смесь добавляли уксусную кислоту (25 мл) и реакционную смесь помещали в кислородную среду (баллон) и нагревали при 100°C в течение 48 часов. Смесь концентрировали с получением остатка, растворяли в этилацетате, промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле с получением желаемого продукта в виде рыжеватого твердого вещества (0,1 г, 18%).1H ЯМР (d6-ДМСО, 300 МГц) δ 11,26 (с, 1H), 8,11-8,08 (д, 1H, J=7,5 Гц), 7,94-7,90 (дд, 1H, J=2,4, 9,3 Гц), 7,47-7,35 (м, 3H), 7,23-7,10 (м, 2H).
Получение 7: 2-Хлор-3-фтор-N-фениланилин
В реакционный сосуд загружали 2-хлор-3-фторанилин (1,5 г, 10,3 ммоль), ацетат палладия (II) (0,140 г, 0,62 ммоль), 2,2'-бис(дифенилфосфино)-1,1'-бинафтил (0,386 г, 0,62 ммоль), карбонат цезия (6,7 г, 20,6 ммоль) и йодбензол (2,1 г, 10,3 ммоль) в безводном толуоле (28 мл). Сосуд продували азотом и смесь нагревали при кипении с обратным холодильником в течение 24 часов. Смесь охлаждали, разбавляли метиленхлоридом, фильтровали через слой диоксида кремния, концентрировали и очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (10- 50% метиленхлорида в гексане) с получением желаемого продукта в виде прозрачной жидкости (1,24 г, 54%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,38-7,32 (м, 2H), 7,20-7,19 (м, 2H), 7,16-6,98 (м, 3H), 6,67-6,61 (м, 1H), 6,17 (уш. с, 1H), ESI m/z: 222,1 (M+H).
Анализ ВЭЖХ: (C18, 5-95% ацетонитрила в H2O+0,1% трифторуксусной кислоты в течение 20 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 11,03 минут, 98,6%.
Получение 8: 4-Фтор-9H-карбазол
Из смеси 2-хлор-3-фтор-N-фениланилина (0,300 г, 1,3 ммоль), карбоната калия (0,374 г, 2,7 ммоль), диацетата палладия (0,024 г, 0,1 ммоль), трициклогексилфосфонийтетрафторбората (0,079 г, 0,2 ммоль) в безводном N,N-диметилацетамиде (6,7 мл) откачивали воздух и заполняли аргоном и нагревали при 150°C в течение 45 минут. Смесь охлаждали, разбавляли этилацетатом и водой. Органический слой промывали водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (7-50% простой эфир в гексане) с получением не совсем белого твердого вещества (0,06 г, 24%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 8,23-8,20 (д, 1H, J=7,8 Гц), 8,10 (уш. с, 1H), 7,48-7,25 (м, 4H), 7,20-7,17 (д, 1H, J=8,1 Гц), 6,95-6,89 (дд, 1H, J=7,8, 9,9 Гц)
Анализ ВЭЖХ: (C18, 5-95% ацетонитрила в H2O+0,1% трифторуксусной кислоты в течение 20 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 9,84 минут, 96,5%.
Получение 9: 9-(Оксиран-2-илметил)-9H-карбазола
Измельченный в порошок гидроксид калия (3,36 г, 60 ммоль) добавляли к раствору карбазола (8,36 г, 50 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (50 мл) и перемешивали при температуре окружающей среды в течение 1 часа. Реакционную смесь охлаждали на ледяной бане и добавляли эпибромгидрин (10,3 мл, 125 ммоль). Ледяную баню удаляли и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов. Смесь распределяли между этилацетатом и водой. Органический слой промывали последовательно водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Неочищенное вещество растирали с гексаном и перекристаллизовывали из смеси этилацетат/гексан с получением желаемого продукта в виде белых игольчатых кристаллов (6,41 г, 58% выход). Вторую порцию кристаллов кристаллизовали из маточного раствора с получением дополнительного продукта (1,2 г, 11%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 8,11-8,08 (м, 2H), 7,46-7,44 (м, 4H), 7,28-7,25 (м, 2H), 4,68-4,62 (дд, 1H, J=3,1, 15,8 Гц) 4,45-4,38 (дд, 1H, J=4,8, 15,9 Гц), 3,37 (м, 1H), 2,84-2,81 (дд, 1H, J=4,2, 4,3 Гц), 2,60-2,57 (дд, 1H, J=2,5, 5,0 Гц).
Анализ ВЭЖХ: (C18, 5-95% ацетонитрила в H2O+0,1% трифторуксусной кислоты в течение 20 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 7,83 минут, 98,7%.
Получение 10: (S)-9-(Оксиран-2-илметил)-9H-карбазол
К перемешиваемому раствору карбазола (2,0 г, 12 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (20 мл) добавляли 85% водный раствор гидроксида калия (0,95 г, 14,4 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь охлаждали на ледяной бане и добавляли (R)-(-)-2-(хлорметил)оксиран (2,77 г, 29,9 ммоль). Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и затем распределяли между водой и этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали при помощи перекристаллизации из смеси этилацетат/гексан с получением желаемого продукта в виде белых кристаллов (0,8 г, 30%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,10 (д, 2H, J=7,5 Гц), 7,55-7,40 (м, 4H), 7,32-7,22 (м, 2H), 4,66 (дд, 1H, J=15,9, 3,3 Гц), 4,43 (дд, 1H, J=15,9, 4,8 Гц), 3,38 (м, 1H), 2,83 (т, 1H, J=4,5 Гц), 2,60 (дд, 1H, J=4,8, 2,4 Гц).
Получение 11: (R)-9-(Оксиран-2-илметил)-9H-карбазол
К перемешиваемому раствору карбазола (5,0 г, 29,9 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (20 мл) добавляли 85% водный раствор гидроксида калия (2,171 г, 32,9 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь охлаждали на ледяной бане и добавляли (S)-(+)-эпихлоргидрин (4,68 мл, 59,8 ммоль). Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и затем распределяли между водой и этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (30% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде белого твердого вещества (3,9 г, 58%). [α]D −10,4 (c 1,92, CHCl3).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,10 (д, 2H, J=7,5 Гц), 7,60-7,40 (м, 4H), 7,35-7,20 (м, 2H), 4,64 (дд, 1H, J=15,9, 3,3 Гц), 4,41 (дд, 1H, J=15,9, 4,8 Гц), 3,37 (м, 1H), 2,82 (т, 1H, J=4,2 Гц), 2,59 (дд, 1H, J=4,5, 2,4 Гц).
Получение 12: 1-(9H-Карбазол-9-ил)-3-((фуран-2-илметил)амино)пропан-2-ол
Суспензию 9-(оксиран-2-илметил)-9H-карбазола (2,97 г, 13,3 ммоль) в растворе фурфуриламина (5,3 мл, 60 ммоль) и этанола (11 мл) нагревали до 110°C в течение 15 минут в микроволновом реакторе Biotage Initiator. Полученный раствор разбавляли метанолом и охлаждали на ледяной бане для осаждения белого твердого вещества. Твердое вещество перекристаллизовывали путем растворения в минимальном объеме горячего метанола и медленно охлаждали с получением желаемого продукта в виде тонкоизмельченного кристаллического белого твердого вещества (2,4 г, 57%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 8,10-8,08 (д, 2H, J=8,1 Гц), 7,46-7,44 (м, 3H), 7,32-7,25 (м, 4H), 6,29-6,27 (дд, 1H, J=1,8, 3,3 Гц), 6,11-6,10 (д, 1H, J=3 Гц), 4,39-4,38 (д, 1H, J=2,1 Гц), 4,37 (д, 1H, J=0,9 Гц), 4,21-4,17 (м, 1H), 3,75 (с, 2H), 2,85-2,79 (дд, 1H, J=3,8, 12,3 Гц), 2,69-2,62 (дд, 1H, J=8,4, 12,3 Гц), 2,00 (уш. с, 2H), ESI m/z: 321,1 (M+H).
Анализ ВЭЖХ: (C18, 10-90% ацетонитрила в воде+0,1% трифторуксусной кислоты в течение 10 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 6,1 минут, 99,0%.
Получение 13: 2-((трет-Бутилдиметилсилил)окси)-3-(9H-карбазол-9-ил)-N-(фуран-2-илметил)пропан-1-амин
К перемешиваемому раствору 1-(9H-карбазол-9-ил)-3-((фуран-2-илметил)амино)пропан-2-ола (1,80 г, 5,6 ммоль) и имидазола (1,912 г, 28,1 ммоль) в безводном метиленхлориде (50 мл) добавляли трет-бутилдиметилсилилхлорид (2,117 г, 14,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при 70°C. Реакционную смесь промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия и насыщенным водным раствором карбоната натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (0-40% этилацетата в гексане) с получением продукта в виде густого масла (2,4 г, 98%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,08 (д, 2H, J=7,8 Гц), 7,53-7,40 (м, 4H), 7,37 (д, 1H, J=1,5 Гц), 7,22 (т, 2H, J=7,2 Гц), 6,32 (дд, 1H, J=3,3, 1,8 Гц), 6,16 (д, 1H, J=3,3 Гц), 4,56 (дд, 1H, J=14,4, 6,0 Гц), 4,41-4,22 (м, 2H), 3,85 и 3,75 (дд, 2H, J=14,4, 14,4 Гц), 2,74 (дд, 1H, J=12,0, 4,5 Гц), 2,61 (дд, 1H, J=12,0, 3,6 Гц), 1,60 (уш. с, 2H), 0,80 (с, 9H), -0,13 (с, 3H), -0,42 (с, 3H), ESI m/z: 435,2 [M+H].
Получение 14: N-(Фуран-2-илметил)метансульфонамид
Метансульфонилхлорид (3,2 мл, 42 ммоль) медленно добавляли к перемешиваемому раствору фурфуриламина (4,2 г, 43,2 ммоль) и триэтиламина (6 мл, 43 ммоль) в безводном метиленхлориде (110 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при температуре окружающей среды и затем разбавляли этилацетатом. Органический раствор последовательно промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты три раза, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия) и фильтровали. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением желаемого продукта в виде коричневой жидкости (6,6 г, 89 %).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,39-7,38 (м, 1H), 6,33-6,31 (м, 2H), 5,02 (уш. с, 1H), 4,33-4,31 (д, 2H, J=6 Гц).
Получение 15: N-(2-Метоксиэтил)метансульфонамид
К перемешиваемому раствору 2-метоксиэтиламина (2,67 мл, 31,0 ммоль) в безводном метиленхлориде (100 мл) и N,N-диизопропилэтиламине (8,54 мл, 51,7 ммоль) при 0ºC медленно добавляли метансульфонилхлорид (2,0 мл, 25,8 ммоль). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (0-100% этилацетата в гексане) с получением продукта в виде бесцветного масла (2,8 г, 71%),1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,66 (уш. с, 1H), 3,54 (т, 2H, J=4,8 Гц), 3,39 (с, 3H), 6,37-3,29 (м, 2H), 3,00 (с, 3H).
Получение 16: 1,1-Диоксид 2,3-дигидробензо[d]изотиазола
К холодному раствору литийалюминийгидрида (0,414 г) в безводном тетрагидрофуране (30 мл), выдерживаемому при 0ºC с внешней ледяной баней, добавляли сульфобензимид (1 г, 5,5 ммоль). Реакционную смесь оставляли нагреваться до температуры окружающей среды и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь гасили добавлением воды и 2,5M водного раствора серной кислоты. Смесь фильтровали через целит и промывали этилацетатом. Органический слой промывали 1M водным раствором серной кислоты, сушили (безводный сульфат магния), фильтровали и концентрировали с получением не совсем белого твердого вещества (0,75 г, 81%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,81-7,78 (д, 1H, J=7,8 Гц), 7,64-7,59 (дт, 1H, J=1,2, 7,5 Гц), 7,52-7,49 (дт, 1H, J=0,75, 7,5 Гц), 7,41-7,37 (д, 1H, J=8,1 Гц), 4,8 (уш. с, 1H), 4,55-4,54 (д, 1H, J=3,6 Гц).
Получение 17: 2,2-Диоксид 1,3-дигидробензо[c]изотиазола
Указанное в заголовке соединение получали с использованием способа, описанного в WO 98/32438 A1. К раствору 2-нитро-альфа-толуолсульфонилхлорида (5,1 г, 21,6 ммоль) в безводном этилацетате (250 мл) добавляли хлорид олова (II) (19,3 г, 86 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при 70°C, затем выливали на лед и нейтрализовали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Раствор фильтровали через целит, экстрагировали этилацетатом и органический слой концентрировали. К неочищенному остатку добавляли безводный метиленхлорид (200 мл) и триэтиламин (5 мл). Раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и концентрировали при пониженном давлении. Продукта получали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (30-100% этилацетата в гексане) с последующей перекристаллизацией из смеси метиленхлорид/гексан с получением белого твердого вещества. (0,24 г, 6,5%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,30-7,22 (м, 2H), 7,07-7,02 (т, 1H, J=7,4 Гц), 6,89-6,86 (дд, 1H, J=0,6, 8,1 Гц), 6,66 (уш. с, 1H), 4,39 (с, 1H).
Получение 18: 2,2-Диоксид 3,4-дигидро-1H-бензо[d][1,2]тиазина
Указанное в заголовке соединение получали в соответствии со способом, описанным в Bravo, R. D. et al. Synth. Commun. 2002, 32, 3675. В колбу загружали альфа-толуолсульфонамид (1 г, 5,8 ммоль) и 1,3,5-триоксан (0,175 г, 1,9 ммоль) в безводном дихлорэтане (23 мл) и смолу amberlyst 15 H+ (3,7 г). Смесь перемешивали при 80°C в течение ночи, затем смолу отфильтровывали и промывали метиленхлоридом. Органический раствор концентрировали с получением белого твердого вещества (0,848 г, 79%).1H ЯМР (d6-ДМСО, 300 МГц) δ 7,41-7,37 (т, 1H, J=6,8 Гц), 7,30-7,24 (м, 2H), 7,19-7,16 (м, 1H), 7,12-7,09 (м, 1H), 4,42-4,40 (д, 2H, J=6,6 Гц), 4,35 (с, 2H).
Получение 19: N-(2-(Гидроксиметил)фенил)метансульфонамид
Указанное в заголовке соединение синтезировали в соответствии со способом, описанным в WO 2008/073956 A2. Раствор метансульфонилхлорида (3,4 мл, 44 ммоль) в безводном метиленхлориде (40 мл) добавляли по каплям к перемешиваемому раствору 2-аминобензилового спирта (5 г, 40,6 ммоль) и безводного пиридина (16 мл, 203 ммоль) в безводном метиленхлориде (80 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов и концентрировали до 1/3 объема и разбавляли этилацетатом. Органический раствор последовательно промывали два раза 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, водой, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Неочищенный остаток пропускали через слой силикагеля, промывая смесью этилацетатом/гексан с получением желтого масла (6,1 г, 75%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,84 (уш. с, 1H), 7,53 (д, 1H, J=8,1 Гц), 7,36-7,30 (дт, 1H, J=1,5, 7,8 Гц), 7,25-7,21 (дд, 1H, J=1,5, 7,8 Гц), 7,16-7,11 (дт, 1H, J=1,2, 7,5 Гц), 4,77-4,75 (д, 2H, J=5,1 Гц), 3,04 (с, 3H), 2,60 (т, 1H, J=5,2 Гц).
Получение 20: N-(2-Формилфенил)метансульфонамид
Указанное в заголовке соединение синтезировали в соответствии со способом, описанным в WO 2008/073956 A2. К раствору N-(2-(гидроксиметил)фенил)метансульфонамида (3,44 г, 17,1 ммоль) в безводном метиленхлориде (68 мл) добавляли диоксид марганца (85% Aldrich, 17 г) и смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение ночи. Добавляли дополнительное количество диоксида марганца (1,6 г) и смесь перемешивали при 30°C в течение 8 часов. Смесь фильтровали через целит, промывали метиленхлоридом, и органический раствор концентрировали. Неочищенный остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (40-60% этилацетата в гексане) с получением белого твердого вещества (2,1 г, 62%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 10,59 (уш. с, 1H), 9,91 (с, 1H), 7,75-7,59 (м, 3H) 7,28-7,23 (т, 1H, J=7,5 Гц), 3,12 (с, 3H).
Получение 21: 2,2-Диоксид 1-(4-метоксибензил)-1H-бензо[c][1,2]тиазина
Указанное в заголовке соединение синтезировали в соответствии со способом, описанным в WO 2008/073956 A2. К раствору N-(2-формилфенил)метансульфонамида (2,0 г, 10 ммоль) в безводном ацетонитриле (45 мл) добавляли карбонат цезия (6,5 г, 20 ммоль) и 4-метоксибензилхлорид (2,7 мл, 20 ммоль). Смесь нагревали до 50°C и перемешивали в течение 48 часов, разбавляли этилацетатом, фильтровали через целит и концентрировали. Неочищенный продукт очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (50-100% метиленхлорида в гексане) с получением продукта (0,9 г, 31%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,40-7,32 (м, 2H), 7,28-7,24 (м, 3H), 7,16-7,11 (м, 2H), 6,85-6,81 (м, 3H), 5,15 (с, 2H), 3,77 (с, 3H).
Получение 22: 2,2-Диоксид 1H-бензо[c][1,2]тиазина
Указанное в заголовке соединение синтезировали в соответствии со способом, описанным в WO 2008/073956 A2. К раствору 2,2-диоксида 1-(4-метоксибензил)-1H-бензо[c][1,2]тиазина (0,9 г, 3 ммоль) в безводном метиленхлориде добавляли трифторуксусную кислоту (18 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов и затем концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (25-70% этилацетата в гексане) с получением белого твердого вещества. (0,6 г, 72%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,43-7,38 (м, 2H), 7,29 (м, 1H), 7,20-7,14 (дт, 1H, J=1,2, 7,5 Гц), 7,02-6,99 (д, 1H, J=7,8 Гц), 6,78-6,75 (дд, 1H, J=2,4, 10,5 Гц).
Получение 23: 2,2-Диоксид 3,4-дигидро-1H-бензо[c][1,2]тиазина
Раствор 2,2-диоксида 1H-бензо[c][1,2]тиазина (0,381 г, 2,1 ммоль) и 10% палладия на углероде (0,05 г) в безводном метаноле (6 мл) помещали под наполненный водородом баллон и перемешивали при комнатной температуре в течение 17 часов. Смесь фильтровали через целит и концентрировали с получением белого твердого вещества (0,366 г, 95%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,25-7,16 (м, 2H), 7,07-7,01 (м, 1H), 6,76-6,73 (д, 1H, J=8,4 Гц), 3,51-3,46 (т, 2H, J=6,8 Гц), 3,34-3,29 (уш. т, 1H, J=6,9 Гц).
Получение 24: N-(2-Бромэтил)-4-хлорбензолсульфонамид
В перемешиваемую смесь 4-хлорбензолсульфонилхлорида (5,0 г, 23,7 ммоль) и 2-бромэтиламингидробромида (5,4 г, 26,3 ммоль) в безводном метиленхлориде (50 мл) при 0°C медленно добавляли N,N-диизопропилэтиламин (8,6 мл, 52,1 ммоль) и смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа. Реакционную смесь промывали последовательно водой, 2н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором карбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия. Органический слой сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме с получением белого твердого вещества (7 г, 99%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,82 (д, 2H, J=8,7 Гц), 7,52 (д, 2H, J=8,7 Гц), 4,96 (с, 1H), 3,50-3,30 (м, 4H).
Получение 25: 1,1-Диоксид 6-хлор-3,4-дигидро-2H-бензо[e][1,2]тиазина
Двухгорлую колбу, снабженную конденсатором и резиновой пробкой, загружали N-(2-бромэтил)-4-хлорбензолсульфонамидом (2,80 г, 9,4 ммоль) и безводным бензолом (50 мл). Реакционный сосуд дегазировали и наполняли аргоном и затем нагревали до кипения с обратным холодильником. При кипячении с обратным холодильником, раствор гидрида трибутилолова (5,05 мл, 18,8 ммоль) и 2,2′-азобис(2-метилпропионитрил) (0,77 г, 4,7 ммоль) в безводном бензоле (25 мл) добавляли медленно в течение 8 часов с использованием шприцевого насоса и смесь кипятили с обратным холодильником в течение следующих 12 часов. После охлаждения, реакционную смесь концентрировали и остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (0-40% этилацетата в метиленхлориде) с последующей препаративной ТСХ (1:2 этилацетат в гексане) с получением чистого продукта в виде белой пены (0,085 г, 4%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,77 (д, 1H, J=8,4 Гц), 7,37 (дд, 1H, J=8,1, 2,1 Гц), 7,26 (с, 1H), 4,47 (т, 1H, J=7,5 Гц), 3,83 (дт, 2H, J=7,5, 6,0 Гц), 3,00 (т, 2H, J=6,0 Гц).
Получение 26: N-(Фуран-2-илметил)-N-(оксиран-2-илметил)метансульфонамид
Гидрид натрия (60% дисперсия в минеральном масле, 0,524 г, 13,1 ммоль) добавляли порциями к охлажденному до 0°C раствору N-(фуран-2-илметил)метансульфонамида (2,0 г, 11,4 ммоль) в 38 мл безводного N,N-диметилформамида (38 мл) и полученную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Медленно добавляли эпибромгидрин (1,2 мл, 14,3 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре и 16 часов при 70°C. Реакционную смесь охлаждали, разбавляли этилацетатом и последовательно промывали два раза водой и один раз насыщенным водным раствором хлорида натрия. Органический слой сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (25-60% этилацетата в гексане) с получением бледно-желтой жидкости (2,2 г, 84%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,40-7,39 (м, 1H), 6,37-6,35 (м, 2H), 4,64-4,50 (уш. дд, 2H, J=25,8, 16,5 Гц), 3,61-3,55 (м, 1H), 3,22-3,12 (м, 2H), 2,82 (с, 3H), 2,82-2,79 (м, 1H), 2,62-2,60 (м, 1H), ESI (m/z): 232,0 (M+H).
Получение 27: N-(Фуран-2-илметил)-N-(2-метилаллил)метансульфонамид
Гидрид натрия (60% дисперсия в минеральном масле, 0,284 г, 7,1 ммоль) добавляли порциями к перемешиваемому раствору N-(фуран-2-илметил)метансульфонамида (1,0 г, 5,7 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (12 мл), который выдерживали при 0°C при помощи внешней ледяной бани. Ледяную баню удаляли и смесь перемешивали в течение 50 минут при температуре окружающей среды. Одной порцией добавляли 3-бром-2-метилпропан (1,15 г, 8,6 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение ночи при 65°C перед разбавлением этилацетатом. Органический слой последовательно промывали водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Неочищенное вещество очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (0-50% этилацетата в гексане) с получением прозрачной жидкости (1,24 г, 95%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,41-7,40 (м, 1H), 6,38-6,34 (м, 1H), 6,29-6,28 (м, 1H), 5,03-5,00 (м, 2H), 4,37 (с, 2H), 3,73 (с, 2H), 2,76 (с, 3H), 1,77 (с, 3H).
Получение 28: N-(Фуран-2-илметил)-N-((2-метилоксиран-2-ил)метил)метансульфонамид
К перемешиваемому раствору N-(фуран-2-илметил)-N-(2-метилаллил)метансульфонамида (1,0 г, 4,3 ммоль) в безводном метиленхлориде (20 мл) добавляли 3-хлорпербензойную кислоту (70%, 2,1 г, 8,6 ммоль). Смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 2 часов и при 40°C в течение 18 часов. Смесь разбавляли метиленхлоридом и последовательно промывали насыщенным водным раствором сульфита натрия, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия. Органический слой сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Неочищенный остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (10-60% этилацетата в гексане) с получением прозрачного масла (0,278 г, 26%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,40-7,35 (дд, 1H, J=0,9, 1,8 Гц), 6,33-6,30 (м, 2H), 4,52-4,51(м, 2H), 3,48-3,43 (д, 1H, J=15 Гц), 3,13-3,09 (д, 1H, J=15 Гц), 2,73-2,72 (д, 1H, J=4,5 Гц), 2,70 (с, 3H), 2,62-2,61 (д, 1H, J=4,5 Гц), 1,35 (с, 3H).
Получение 29: Метил 1-(метилсульфонил)пирролидин-2-карбоксилат
Метансульфонилхлорид (2,3 мл, 30 ммоль) медленно добавляли к перемешиваемому раствору гидрохлорида D/L-пролинметилового эфира (5,0 г, 30,2 ммоль) и триэтиламина (8,4 мл, 60 ммоль) в безводном метиленхлориде (75 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при температуре окружающей среды и затем разбавляли этилацетатом. Органический слой последовательно промывали водой, два раза 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия) и фильтровали. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением желаемого продукта в виде коричневой жидкости (4,45 г, 72%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 4,53-4,49 (дд, 1H, J=8,7, 3,6 Гц), 3,75 (с, 3H), 3,57-3,54 (м, 1H), 3,52-3,42 (м, 1H), 3,01 (с, 3H), 2,32-2,22 (м, 1H), 2,11-1,98 (м, 3H).
Получение 30: (1-(Метилсульфонил)пирролидин-2-ил)метанол
Метил 1-(метилсульфонил)пирролидин-2-карбоксилат (1,1 г, 4,6 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (10 мл) добавляли медленно к перемешиваемой суспензии литийалюминийгидрида (0,259 г, 6,8 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (10 мл), выдерживаемой при 0ºC с внешней ледяной баней. После пятнадцати минут, ледяную баню удаляли и реакционную смесь оставляли нагреваться до температуры окружающей среды и перемешивали еще один час. Смесь охлаждали до 0ºC и добавляли по каплям воду (1 мл), с последующим добавлением 15% водного раствора гидроксида натрия (1 мл) и воды (3 мл). Смесь перемешивали в течение 15 минут при комнатной температуре, с последующим добавлением сульфата магния и снова перемешивали. Смесь фильтровали через целит, промывали три раза простым эфиром и объединенные органические фракции концентрировали при пониженном давлении с получением желтого масла (0,7 г, 77%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 3,78-3,57 (м, 3H), 3,49-3,36 (м, 2H), 2,87 (с, 3H), 2,64 (уш. с, 1H), 2,09-1,82 (м, 4H).
Получение 31: 1-(Метилсульфонил)пирролидин-2-карбальдегид
Перйодинан Десса-Мартина (1,7 г, 4 ммоль) добавляли к раствору (1-(метилсульфонил)пирролидин-2-ил)метанола (0,570 г, 3,18 ммоль) в безводном метиленхлориде (20 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов и добавляли вторую порцию перйодинана Десса-Мартина (1 г, 2,3 ммоль). Полученную суспензию перемешивали в течение 24 часов, фильтровали и концентрировали. Неочищенный остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (1-15% этилацетата в метиленхлориде) с получением белого воскового твердого вещества (0,44 г, 78%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 9,58 (д, 1H, J=1,2 Гц), 4,25-4,20 (тд, 1H, J=6,9, 1,2 Гц), 3,55-3,44 (м, 2H), 2,97 (с, 3H), 2,21-2,13 (м, 2H), 2,05-1,90 (м, 2H).
Получение 32: 1-(Метилсульфонил)-2-(оксиран-2-ил)пирролидин
Безводный диметилсульфоксид (0,750 мл) добавляли к триметилсульфоксониййодиду (0,187 г, 0,85 ммоль) и гидриду натрия (60% дисперсия в минеральном масле, 0,034 г, 0,85 ммоль) и полученную суспензию перемешивали в течение 1 часа. К перемешиваемому раствору добавляли 1-(метилсульфонил)пирролидин-2-карбальдегид (0,100 г, 0,56 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (1 мл) и смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Добавляли насыщенный водный раствор хлорида натрия (3 мл) и смесь экстрагировали этилацетатом (3×30 мл). Объединенные органические вещества сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением диметилсульфоксидного раствора (0,473 г), содержащего неочищенный продукт, который использовали непосредственно на следующей стадии.
Получение 33: Этил 1-(метилсульфонил)пиперидин-2-карбоксилат
Метансульфонилхлорид (4,0 г, 35 ммоль) медленно добавляли к перемешиваемому раствору этилпипеколината, (5,5 г, 35 ммоль) и триэтиламина (4,9 мл, 35 ммоль) в безводном метиленхлориде (88 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при температуре окружающей среды и затем разбавляли этилацетатом. Органический слой последовательно промывали водой, два раза 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия) и фильтровали. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением желаемого продукта в виде коричневой жидкости (6,9 г, 84%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 4,72-4,71 (уш. д, 1H, J=3,6 Гц), 4,24-4,16 (кв. д, 2H, J=6,9, 2,6 Гц), 3,74-3,68 (м, 1H), 3,22-3,13 (тд, 1H, J=12,3, 3,0 Гц), 2,93 (с, 3H), 2,31-2,25 (м, 1H), 1,83-1,51 (м, 5H), 1,32-1,27 (тд, 3H, J=7,0, 0,6 Гц), 3,52-3,42 (м, 1H), 3,01 (с, 3H), 2,32-2,22 (м, 1H), 2,11-1,98 (м, 3H). ESI (m/z): 235,9 (M+H).
Получение 34: (1-(Метилсульфонил)пиперидин-2-ил)метанол
Этил 1-(метилсульфонил)пиперидин-2-карбоксилат (6,9 г, 29,3 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (40 мл) добавляли медленно к перемешиваемой суспензии литийалюминийгидрида (1,5 г, 40 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (80 мл), выдерживаемом при 0ºC с внешней ледяной баней. Через пятнадцать минут ледяную баню удаляли и реакционную смесь оставляли нагреваться до температуры окружающей среды и перемешивали в течение дополнительных 4,5 часов. Смесь охлаждали до 0ºC и добавляли по каплям воду (1,5 мл), с последующим добавлением водного раствора гидроксида натрия (1,5 мл) и воды (4,5 мл). Смесь перемешивали в течение 15 минут при комнатной температуре, с последующим добавлением сульфата магния и дополнительным перемешиванием. Смесь фильтровали через целит, промывали три раза простым эфиром и объединенные органические фракции концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный остаток пропускали через слой силикагеля, промывали этилацетатом, с получением желаемого продукта в виде прозрачной жидкости (4,9 г, 87%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 4,06-4,03 (м, 1H), 3,96-3,92 (дд, 1H, J=11,1, 9,3 Гц), 3,73-3,68 (уш. д, 1H, J=14,1 Гц), 3,61-3,56 (дд, 1H, J=11,1, 4,8 Гц), 3,12-3,03 (уш. т, 1H, J=12,1 Гц), 2,96 (с, 3H), 2,17 (уш. с, 1H), 1,74-1,47 (м, 6H).
Получение 35: 1-(Метилсульфонил)пиперидин-2-карбальдегид
Перйодинан Десса-Мартина (21 г, 50 ммоль) добавляли к раствору (1-(метилсульфонил)пиперидин-2-ил)метанола (4,9 г, 25,4 ммоль) в безводном метиленхлориде (125 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов, фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (25-75% этилацетата в гексане) с получением белого воскового твердого вещества (1,1 г, 24% выход).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 9,56 (с, 1H), 4,61-4,58 (уш. д, 1H, J=6,3 Гц), 3,75-3,68 (м, 1H), 3,13-3,04 (тд, 1H, J=12,0, 3,2 Гц), 2,97 (с, 3H), 2,33-2,22 (м, 1H), 1,89-1,55 (м, 4H), 1,27-1,21 (м, 1H).
Получение 36: 1-(Метилсульфонил)-2-винилпиперидин
н-Бутиллитий (2,5н в гексане, 1,96 мл, 4,92 ммоль) добавляли к холодной суспензии трифенилфосфонийбромида (1,76 г, 4,92 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (10 мл), который выдерживали при -78ºC с внешней охлаждающей баней. Смесь оставляли нагреваться до 0°C и перемешивали в течение 1 часа, затем охлаждали до -78ºC. Добавляли 1-(метилсульфонил)пиперидин-2-карбальдегид (0,626 г, 3,28 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (5 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 10 минут при -78°C, затем нагревали до 0ºC и перемешивали в течение 3 часов. Добавляли насыщенный водный раствор хлорида натрия (10 мл) и смесь экстрагировали этилацетатом (3×50 мл). Объединенные органические вещества сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (25-70% этилацетата в гексане) с получением прозрачного масла (0,369 г, 60%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 6,08-5,97 (м, 1H), 5,33-5,26 (м, 2H), 4,52 (уш. с, 1H), 3,69-3,63 (м, 1H), 3,05-3,00 (м, 1H), 2,81 (с, 3H), 1,86-1,55 (м, 6H).
Получение 37: 1-(Метилсульфонил)-2-(оксиран-2-ил)пиперидин
К раствору 1-(метилсульфонил)-2-винилпиперидина (0,369 г, 2,0 ммоль) в безводном метиленхлориде (10 мл) добавляли очищенную 3-хлорпербензойную кислоту (100%, 1,0 г, 6 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 65 часов. Реакционную смесь фильтровали, добавляли насыщенный водный раствор сульфита натрия и двухфазный раствор перемешивали в течение 5 минут. Смесь разбавляли этилацетатом и органический слой последовательно промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (30-60% этилацетата в гексане) с получением белого полутвердого вещества (0,128 г, 31%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 3,78-3,74 (уш. д, 1H, J=13,2 Гц), 3,66-3,61 (м, 1H), 3,37-3,32 (м, 1H), 3,24-3,15 (м, 1H), 2,98 (с, 3H), 2,88-2,85 (дд, 1H, J=4,8, 4,2 Гц), 2,68-2,66 (дд, 1H, J=4,8, 2,6 Гц), 1,81-1,60 (м, 6H). ESI (m/z): 205,9 (M+H).
Получение 38: 2-Хлор-4-фтор-N-(4-фторфенил)анилин
В круглодонную колбу загружали 1-бром-4-фторбензол (6,011 г, 34,4 ммоль), 2-хлор-4-фторанилин (5,000 г, 34,3 ммоль), Xantphos (0,795 г, 1,4 ммоль), безводный толуол (200 мл) и трет-бутоксид натрия (4,952 г, 51,5 ммоль). Смесь дегазировали и заполняли азотом и затем добавляли трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (0,944 г, 1,0 ммоль) и реакционную смесь перемешивали под азотом при 100ºC в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры смесь фильтровали через целит и фильтровальный слой промывали метиленхлоридом. Фильтрат концентрировали и остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-20% этилацетата/гексан) с получением желтоватого масла (5,63 г, 68%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,14 (дд, 1H, J=8,4, 3,0 Гц), 7,12-6,98 (м, 5H), 6,88 (тд, 1H, J=8,7, 3,0 Гц), 5,80 (уш. с, 1H).
Получение 39: 3,6-Дифтор-9H-карбазол
В реакционную пробирку загружали трет-бутоксид натрия (7,218 г, 75,1 ммоль), 2-хлор-4-фтор-N-(4-фторфенил)анилин (3,600 г, 15,0 ммоль), три-трет-бутилфосфонийтетрафторборат (0,305 г, 1,1 ммоль), диацетат палладия (0,169 г, 0,8 ммоль) и безводный 1,4-диоксан (80 мл). Пробирку плотно закрывали под азотом и нагревали в масляной бане при 110ºC в течение 20 часов. После охлаждения до комнатной температуры смесь обрабатывали 2M водным раствором хлористоводородной кислоты (90 мл) и экстрагировали метиленхлоридом (3×50 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия) и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (20-50% метиленхлорид/гексан). Твердые вещества промывали гексаном и сушили с получением чистого соединения в виде белого порошка (1,1 г, 36%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,99 (уш. с, 1H), 7,67 (дд, 2H, J=8,7, 2,4 Гц), 7,36 (дд, 2H, J=8,7, 4,2 Гц), 7,19 (тд, 2H, J=9,0, 2,4 Гц).
Получение 40: 3,6-Дифтор-9-(оксиран-2-илметил)-9H-карбазол
К перемешиваемому раствору 3,6-дифтор-9H-карбазола (0,500 г, 2,5 ммоль) в N,N-диметилформамиде (5 мл) при 0°C добавляли 85% гидроксид калия (0,195 г, 3,0 ммоль) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Добавляли эпибромгидрин (0,407 мл, 4,9 ммоль) и смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь распределяли между водой и этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (10-50% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде белого твердого вещества (0,575 г, 90%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,69 (дд, 2H, J=8,7, 2,7 Гц), 7,39 (дд, 2H, J=9,0, 3,9 Гц), 7,24 (тд, 2H, J=9,0, 2,7 Гц), 4,68 (дд, 1H, J=15,9, 3,0 Гц), 4,33 (дд, 1H, J=15,9, 5,1 Гц), 3,35 (м, 1H), 2,84 (т, 1H, J=4,5 Гц), 2,55 (дд, 1H, J=4,8, 2,4 Гц).
Получение 41: 4,4'-Дифтор-2-нитро-1,1'-бифенил
В микроволновой реакционный сосуд загружали 2-хлор-5-фторнитробензол (0,878 г, 5,0 ммоль), 4-фторфенилбороновую кислоту (0,770 г, 5,5 ммоль), карбонат натрия (1,590 г, 15,0 ммоль), диацетат палладия (0,045 г, 0,2 ммоль), тетрабутиламмоний бромид (1,612 г, 5,0 ммоль) в воде (10 мл). Смесь нагревали до 165°C в микроволновом реакторе в течение 10 минут. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и вливали в диэтиловый эфир и 0,1н водный раствор гидроксида натрия. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (10-30% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде желтого твердого вещества (0,61 г, 52%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,61 (дд, 1H, J=8,1, 2,7 Гц), 7,44-7,30 (м, 2H), 7,30-7,21 (м, 2H), 7,16-7,07 (м, 2H).
Получение 42: 2,7-Дифтор-9H-карбазол
Раствор 4,4'-дифтор-2-нитро-1,1'-бифенила (0,580 г, 2,5 ммоль) и трифенилфосфина (1,617 г, 6,2 ммоль) в безводном 1,2-дихлорбензоле (5 мл) нагревали до 175°C в микроволновом реакторе в течение 4 часов. Смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали до черного остатка в высоком вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (5-50% метиленхлорид/гексан) с получением продукта в виде светло-коричневого порошка (0,41 г, 82%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 8,10 (уш. с, 1H), 7,93 (дд, 2H, J=8,7, 5,4 Гц), 7,11 (дд, 2H, J=9,3, 2,4 Гц), 6,99 (ддд, 2H, J=9,6, 9,0, 2,4 Гц).
Получение 43: 2,7-Дифтор-9-(оксиран-2-илметил)-9H-карбазол
К перемешиваемому раствору 2,7-дифтор-9H-карбазола (0,400 г, 2,0 ммоль) в N,N-диметилформамиде (5 мл) при 0°C добавляли 85% гидроксид калия (0,156 г, 2,4 ммоль) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Добавляли эпибромгидрин (0,326 мл, 3,9 ммоль) и смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь распределяли между водой и этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (10-50% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде белого твердого вещества (0,47 г, 92%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,93 (дд, 2H, J=8,4, 5,4 Гц), 7,14 (дд, 2H, J=9,9, 2,4 Гц), 6,99 (тд, 2H, J=9,0, 2,4 Гц), 4,60 (дд, 1H, J=15,9, 2,7 Гц), 4,25 (дд, 1H, J=15,9, 5,1 Гц), 3,35 (м, 1H), 2,86 (т, 1H, J=4,5 Гц), 2,57 (дд, 1H, J=4,8, 2,7 Гц).
Получение 44: 2,4'-Дифтор-6-нитро-1,1'-бифенил
В микроволновой реакционный сосуд загружали 2-хлор-3-фторнитробензол (1,500 г, 8,5 ммоль), 4-фторфенилбороновую кислоту (1,315 г, 9,4 ммоль), карбонат натрия (2,717 г, 25,6 ммоль), диацетат палладия (0,077 г, 0,3 ммоль), тетрабутиламмоний бромид (2,755 г, 8,5 ммоль) в воде (10 мл) и 1,4-диоксан (1 мл). Смесь нагревали до 100°C в микроволновом реакторе в течение 1 часа. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и вливали в диэтиловый эфир и 0,1н водный раствор гидроксида натрия. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (10-30% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде желтого твердого вещества (1,15 г, 57%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,70 (дт, 1H, J=8,4, 1,5 Гц), 7,51 (тд, 1H, J=8,4, 5,4 Гц), 7,41 (тд, 1H, J=8,4, 1,2 Гц), 7,35-7,26 (м, 2H), 7,22-7,11 (м, 2H).
Получение 45: 2,5-Дифтор-9H-карбазол
Раствор 2,4'-дифтор-6-нитро-1,1'-бифенила (1,100 г, 4,7 ммоль) и трифенилфосфина (3,067 г, 11,7 ммоль) в безводном 1,2-дихлорбензоле (2 мл) нагревали до 175°C в микроволновом реакторе в течение 4 часов. Смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток затем очищали при помощи хроматографии на силикагеле (5-50% метиленхлорид/гексан) с получением продукта в виде белого твердого вещества (0,84 г, 88%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 8,17 (уш. с, 1H), 8,12 (дд, 1H, J=8,7, 5,1 Гц), 7,33 (тд, 1H, J=8,1, 5,1 Гц), 7,20 (д, 1H, J=8,1 Гц), 7,12 (дд, 1H, J=9,3, 2,4 Гц), 7,02 (тд, 1H, J=9,3, 2,4 Гц), 6,93 (дд, 1H, J=9,6, 7,8 Гц).
Получение 46: 2,5-Дифтор-9-(оксиран-2-илметил)-9H-карбазол
К перемешиваемому раствору 2,5-дифтор-9H-карбазола (0,530 г, 2,6 ммоль) в N,N-диметилформамиде (5 мл) при 0°C добавляли 85% гидроксид калия (0,207 г, 3,1 ммоль) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Добавляли эпибромгидрин (0,432 мл, 5,2 ммоль) и смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь распределяли между водой и этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (10-50% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде белого твердого вещества (0,59 г, 87%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,13 (дд, 1H, J=8,7, 5,7 Гц), 7,38 (тд, 1H, J=8,1, 5,4 Гц), 7,23 (д, 1H, J=8,4 Гц), 7,15 (дд, 1H, J=9,6, 2,1 Гц), 7,03 (ддд, 1H, J=9,6, 9,0, 2,4 Гц), 6,95 (ддд, 1H, J=9,9, 8,1, 0,6 Гц), 4,64 (дд, 1H, J=15,9, 3,0 Гц), 4,31 (дд, 1H, J=15,9, 5,1 Гц), 3,36 (м, 1H), 2,85 (т, 1H, J=4,5 Гц), 2,57 (дд, 1H, J=4,5, 2,4 Гц).
Получение 47: 2-Хлор-5-фтор-N-(4-фторфенил)анилин
В круглодонную колбу загружали 1-бром-4-фторбензол (4,809 г, 27,5 ммоль), 2-хлор-5-фторанилин (4,000 г, 27,5 ммоль), Xantphos (0,636 г, 1,1 ммоль), безводный толуол (100 мл) и трет-бутоксид натрия (3,961 г, 41,2 ммоль). Смесь дегазировали и наполняли аргоном и затем добавляли трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (0,755 г, 0,8 ммоль) и реакционную смесь перемешивали под аргоном при 110ºC в течение 5 часов. После охлаждения до комнатной температуры, смесь обрабатывали водой и экстрагировали диэтиловым эфиром. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат магния), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-20% этилацетата/гексан) с получением продукта в виде бесцветного масла (5,75 г, 87%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,27 (дд, 1H, J=9,0, 5,4 Гц), 7,23-7,03 (м, 4H), 6,71 (дд, 1H, J=10,8, 2,4 Гц), 6,47 (тд, 1H, J=8,1, 3,0 Гц), 6,09 (уш. с, 1H).
Получение 48: 2,6-Дифтор-9H-карбазол
Смесь трет-бутоксида натрия (11,429 г, 118,9 ммоль), 2-хлор-5-фтор-N-(4-фторфенил)анилина (5,700 г, 23,8 ммоль) и безводного 1,4-диоксана (120 мл) дегазировали и повторно наполняли аргоном. Добавляли три-трет-бутилфосфонийтетрафторборат (0,483 г, 1,7 ммоль) и диацетат палладия (0,267 г, 1,2 ммоль) и смесь перемешивали в масляной бане при 110ºC в течение 20 часов. После охлаждения до комнатной температуры смесь обрабатывали 2M водным раствором хлористоводородной кислоты (90 мл) и экстрагировали метиленхлоридом (3×50 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (20-50% метиленхлорид/гексан). Твердые вещества промывали гексаном и сушили с получением чистого соединения в виде белого порошка (0,80 г, 17%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,05 (уш. с, 1H), 7,94 (дд, 1H, J=8,7, 5,7 Гц), 7,67 (дд, 1H, J=8,7, 2,7 Гц), 7,35 (дд, 1H, J=9,0, 4,5 Гц), 7,14 (тд, 1H, J=9,0, 2,7 Гц), 7,11 (дд, 1H, J=9,3, 2,4 Гц), 6,98 (ддд, 1H, J=9,3, 8,4, 2,4 Гц).
Получение 49: 2,6-Дифтор-9-(оксиран-2-илметил)-9H-карбазол
К перемешиваемому раствору 2,6-дифтор-9H-карбазола (0,460 г, 2,3 ммоль) в N,N-диметилформамиде (5 мл) при 0°C добавляли 85% гидроксид калия (0,179 г, 2,7 ммоль) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Добавляли эпибромгидрин (0,375 мл, 4,5 ммоль) и смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь распределяли между водой и этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (10-50% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде белого твердого вещества (0,55 г, 94%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,95 (дд, 1H, J=8,7, 5,7 Гц), 7,68 (дд, 1H, J=8,7, 2,7 Гц), 7,38 (дд, 1H, J=8,7, 4,2 Гц), 7,20 (тд, 1H, J=9,0, 2,7 Гц), 7,13 (дд, 1H, J=9,9, 2,1 Гц), 6,98 (ддд, 1H, J=9,6, 9,0, 2,4 Гц), 4,64 (дд, 1H, J=15,9, 2,7 Гц), 4,29 (дд, 1H, J=15,9, 5,1 Гц), 3,35 (м, 1H), 2,85 (т, 1H, J=4,5 Гц), 2,56 (дд, 1H, J=4,8, 2,4 Гц).
Получение 50: 2,2'-Дифтор-6-нитро-1,1'-бифенил
К раствору 2-бром-3-фторнитробензола (1,500 г, 6,8 ммоль), 2-фторфенилбороновой кислоты (1,145 г, 8,2 ммоль), N,N-диметилформамида (50 мл) и 2,0 M водного раствора карбоната калия (10 мл) в атмосфере аргона добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (0) (0,394 г, 0,3 ммоль). Смесь перемешивали при 110ºC в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры, смесь разбавляли этилацетатом (100 мл) и промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-30% метиленхлорид/гексан) с получением бледно-желтого твердого вещества (0,780 г, 49%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,86 (дт, 1H, J=7,8, 1,2 Гц), 7,56 (тд, 1H, J=8,1, 5,7 Гц), 7,52-7,40 (м, 2H), 7,35-7,15 (м, 3H).
Получение 51: 4,5-Дифтор-9H-карбазол
Раствор 2,2'-дифтор-6-нитро-1,1'-бифенила (0,740 г, 3,1 ммоль) и трифенилфосфина (2,063 г, 7,9 ммоль) в безводном 1,2-дихлорбензоле (1,5 мл) нагревали до 175°C в микроволновом реакторе в течение 3 часов. Смесь охлаждали до комнатной температуры и очищали при помощи хроматографии на силикагеле (5-50% метиленхлорид/гексан) с получением продукта в виде белого твердого вещества (0,28 г, 44%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 8,26 (уш. с, 1H), 7,39 (тт, 2H, J=8,1, 2,4 Гц), 7,22 (д, 2H, J=8,1 Гц), 6,97 (дт, 2H, J=8,1, 5,1 Гц).
Получение 52: 4,5-Дифтор-9-(оксиран-2-илметил)-9H-карбазол
К перемешиваемому раствору 4,5-дифтор-9H-карбазола (0,270 г, 1,3 ммоль) в N,N-диметилформамиде (5 мл) при 0°C добавляли 85% гидроксид калия (0,105 г, 1,6 ммоль) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Добавляли эпибромгидрин (0,220 мл, 2,7 ммоль) и смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 4 часов. Смесь распределяли между водой и этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (10-50% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде белого твердого вещества (0,315 г, 91%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,45 (тт, 2H, J=8,1, 2,4 Гц), 7,25 (д, 2H, J=8,1 Гц), 6,99 (дт, 2H, J=9,9, 4,2 Гц), 4,68 (дд, 1H, J=15,9, 3,0 Гц), 4,38 (дд, 1H, J=15,9, 5,1 Гц), 3,37 (м, 1H), 2,85 (т, 1H, J=4,5 Гц), 2,57 (дд, 1H, J=4,5, 2,4 Гц).
Получение 53: 2',5-Дифтор-2-нитро-1,1'-бифенил
К раствору 2-бром-4-фторнитробензола (1,500 г, 6,8 ммоль), 2-фторфенилбороновой кислоты (1,145 г, 8,2 ммоль), N,N- диметилацетамида (50 мл) и 2,0 M водного раствора карбоната калия (10 мл) в атмосфере аргона добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (0) (0,394 г, 0,3 ммоль). Смесь перемешивали при 110ºC в течение 6 часов. После охлаждения до комнатной температуры, смесь распределяли между этилацетатом (100 мл) и водой. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-30% метиленхлорид/гексан) с получением светло-желтого масла (1,5 г, 94%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,12 (дд, 1H, J=9,0, 5,1 Гц), 7,44 (м, 1H), 7,34 (тд, 1H, J=7,5, 2,1 Гц), 7,31-7,10 (м, 4H).
Получение 54: 3,5-Дифтор-9H-карбазол
Раствор 2',5-дифтор-2-нитро-1,1'-бифенила (1,400 г, 6,0 ммоль) и трифенилфосфина (3,903 г, 14,9 ммоль) в безводном 1,2-дихлорбензоле (5 мл) нагревали до 175°C в микроволновом реакторе в течение 4 часов. Смесь охлаждали до комнатной температуры и очищали при помощи хроматографии на силикагеле (5-50% метиленхлорид/гексан) с получением продукта в виде светло-коричневого твердого вещества (0,62 г, 51%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 8,12 (уш. с, 1H), 7,87 (дд, 1H, J=9,0, 2,4 Гц), 7,41-7,31 (м, 2H), 7,24-7,15 (м, 2H), 6,91 (дд, 1H, J=10,2, 8,1 Гц).
Получение 55: 3,5-Дифтор-9-(оксиран-2-илметил)-9H-карбазол
К перемешиваемому раствору 3,5-дифтор-9H-карбазола (0,300 г, 1,5 ммоль) в N,N-диметилформамиде (5 мл) при 0°C добавляли 85% гидроксид калия (0,117 г, 1,8 ммоль) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Добавляли эпибромгидрин (0,244 мл, 3,0 ммоль) и смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 4 часов. Смесь распределяли между водой и этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (10-50% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде не совсем белого твердого вещества (0,36 г, 94%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,88 (дд, 1H, J=8,7, 2,7 Гц), 7,46-7,36 (м, 2H), 7,29-7,20 (м, 2H), 6,92 (дд, 1H, J=9,9, 7,8 Гц), 4,68 (дд, 1H, J=15,9, 3,0 Гц), 4,35 (дд, 1H, J=15,9, 5,1 Гц), 3,36 (м, 1H), 2,85 (т, 1H, J=4,5 Гц), 2,56 (дд, 1H, J=4,5, 2,7 Гц).
Получение 56: 1,1-Диоксид 6-метил-1,2-тиазинана
К перемешиваемому раствору 3-хлорпропиламингидрохлорида (3,000 г, 23,1 ммоль) в безводном ацетонитриле (60 мл) и триэтиламине (7,056 мл, 50,8 ммоль) при 0ºC медленно добавляли этансульфонилхлорид (2,967 г, 23,1 ммоль). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Триэтиламингидрохлорид удаляли при помощи фильтрации и фильтровальный слой промывали тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали и остаток растворяли в этилацетате и промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением галогенсульфонамидного промежуточного соединения (4,35 г), которое растворяли в безводном тетрагидрофуране (60 мл) и охлаждали до −30°C. После добавления диизопропиламина (0,584 г, 5,8 ммоль) и 1,10-фенантролина (0,010 г), медленно добавляли раствор n-BuLi в гексане (50 ммоль, 2,5 M) через капельную воронку в течение 30 минут, поддерживая внутреннюю температурный диапазон от −30°C до −10°C. Полученный раствор медленно нагревали до 0°C в течение 2 часов. Еще через 2 часа при 0°С реакционную смесь гасили добавлением 2н водного раствора хлористоводородной кислоты (pH доводили до 5). После добавления насыщенного водного раствора хлорида натрия смесь экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат магния), фильтровали и концентрировали с получением продукта в виде желтого масла (2,73 г, 79%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,20 (уш. с, 1H), 3,54-3,28 (м, 2H), 3,06 (м, 1H), 2,13 (м, 1H), 1,98 (м, 1H), 1,77 (м, 1H), 1,65 (м, 1H), 1,41 (д, 3H, J=6,6 Гц).
Получение 57: Бут-3-ен-1-сульфонамид
Смесь 4-бром-1-бутена (3,000 г, 22,2 ммоль) и сульфита натрия (3,356 г, 26,6 ммоль) в воде (15 мл) нагревали при кипении с обратным холодильником в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры, водный раствор промывали диэтиловым эфиром и концентрировали в вакууме с получением белого порошка, который сушили в вакууме при 100°C с получением смеси неочищенной бут-3-ен-1-сульфоновой кислоты и солей (приблизительно 6,2 г), которую затем обрабатывали оксихлоридом фосфора (20,7 мл, 222,2 ммоль). Смесь нагревали при 130°C в течение 6 часов и затем концентрировали. Остаток обрабатывали ацетонитрилом (50 мл) и медленно вводили газообразный аммиак при 0°C. Смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа и затем разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом (100 мл). Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением желтого масла (2,1 г, 70%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 5,85 (м, 1H), 5,19 (д, 1H, J=17,4 Гц), 5,15 (д, 1H, J=9,9 Гц), 4,69 (уш. с, 2H), 3,24 (т, 2H, J=7,5 Гц), 2,65 (кв., 2H, J=7,5 Гц).
Получение 58: 2,2-Диоксид 2-тиа-1-азабицикло[3.1.0]гексана
К смеси бут-3-ен-1-сульфонамида (1,300 г, 9,6 ммоль), йодозобензолдиацетата (3,252 г, 10,1 ммоль), оксида алюминия (1,030 г, 10,1 ммоль) и метиленхлорида (50 мл) в атмосфере аргона при комнатной температуре добавляли ацетат родия(II) (0,80 г). Полученную суспензию энергично перемешивали при 40°C в течение 5 часов. Смесь фильтровали через слой целита и фильтровальный слой промывали метиленхлоридом. Фильтрат упаривали и остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-100% этилацетата/гексан) с получением продукта в виде белого твердого вещества (0,61 г, 48%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 3,21 (м, 1H), 3,15 (дт, 1H, J=13,2, 4,5 Гц), 2,82 (м, 1H), 2,72-2,62 (м, 2H), 2,49 (дд, 1H, J=5,1, 2,4 Гц), 2,31 (дд, 1H, J=4,5, 3,0 Гц).
Получение 59: 1,1-Диоксид 4-метокси-1,2-тиазинана
Смесь 2,2-диоксида 2-тиа-1-азабицикло[3.1.0]гексана (0,600 г, 4,5 ммоль), гидрата пара-толуолсульфоновой кислоты (0,086 г, 0,5 ммоль) и метанола (50 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-100% этилацетата/гексан) с получением продукта в виде белого твердого вещества (0,56 г, 75%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,43 (уш. с, 1H), 3,65-3,40 (м, 2H), 3,40 (с, 3H), 3,36-3,23 (м, 2H), 3,08 (дт, 1H, J=13,5, 3,9 Гц), 2,50-2,23 (м, 2H).
Получение 60: 9-(2-Метилбут-3-ин-2-ил)-9H-карбазол
К перемешиваемому раствору карбазола (2,500 г, 15,0 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (30 мл) при 0°C добавляли 60% гидрид натрия в минеральном масле (0,718 г, 17,9 ммоль) и смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа. Добавляли 3-хлор-3-метил-1-бутин (2,300 г, 22,4 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа и затем медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь распределяли между водой и этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (10-70% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде светло-коричневого твердого вещества (1,7 г, 49%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,10 (д, 2H, J=7,5 Гц), 8,04 (д, 2H, J=8,7 Гц), 7,41 (тд, 2H, J=8,1, 1,5 Гц), 7,24 (т, 2H, J=7,5 Гц), 2,67 (с, 1H), 2,28 (с, 6H).
Получение 61: 9-(2-Метилбут-3-ен-2-ил)-9H-карбазол
Смесь 9-(2-метилбут-3-ин-2-ил)-9H-карбазола (1,600 г, 6,9 ммоль), хинолина (0,810 мл, 6,9 ммоль), бензола (70,0 мл) и 5% палладия на сульфате бария (0,190 г) перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре. После того, как расходовалось нужное количество водорода (~45 минут), реакцию останавливали и фильтровали через целит и фильтрат концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-20% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде бесцветного масла (1,55 г, 96%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,10 (д, 2H, J=7,5 Гц), 7,81 (д, 2H, J=8,4 Гц), 7,35 (т, 2H, J=8,1 Гц), 7,21 (т, 2H, J=7,5 Гц), 6,41 (дд, 1H, J=17,7, 10,5 Гц), 5,32-5,20 (м, 2H), 2,06 (с, 6H).
Получение 62: 3-(9H-Карбазол-9-ил)-3-метилбутан-1,2-диол
К перемешиваемому раствору 9-(2-метилбут-3-ен-2-ил)-9H-карбазола (0,400 г, 1,7 ммоль) и N-оксида 4-метилморфолина (0,398 г, 3,4 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) и воде (3 мл) добавляли 4% раствор тетраоксида осмия (0,540 мл, 0,1 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов. Реакционную смесь концентрировали и остаток распределяли между этилацетатом и водой. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением желтого твердого вещества (0,43 г, 94%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,10 (д, 2H, J=7,5 Гц), 7,84 (д, 2H, J=8,4 Гц), 7,37 (т, 2H, J=7,5 Гц), 7,23 (т, 2H, J=7,5 Гц), 4,84 (м, 1H), 3,80-3,50 (м, 2H), 2,30 (уш. с, 1H), 2,11 (с, 3H), 2,05 (с, 3H), 1,82 (уш. с, 1H), ESI m/z: 269,8 (M+H).
Получение 63: 9-(2-(Оксиран-2-ил)пропан-2-ил)-9H-карбазол
К перемешиваемому раствору 3-(9H-карбазол-9-ил)-3-метилбутан-1,2-диола (0,430 г, 1,6 ммоль) в пиридине (5,0 мл, 61,8 ммоль) и метиленхлориде (5 мл) при 0ºC медленно добавляли пара-толуолсульфонилхлорид (0,609 г, 3,2 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь концентрировали и остаток растворяли в этилацетате. Органическую фазу промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, 1н водным раствором хлористоводородной кислоты и затем насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением неочищенного тозилата (0,650 г). В перемешиваемую смесь неочищенного тозилата (0,650 г, 1,5 ммоль) в метаноле (20 мл) при 0°C добавляли карбонат калия (0,255 г, 1,8 ммоль). Полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 2 часов и затем медленно нагревали до комнатной температуры. Смесь концентрировали и остаток распределяли между водой и этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-50% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде белого твердого вещества (0,295 г, 76%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,10 (д, 2H, J=7,5 Гц), 7,91 (д, 2H, J=8,7 Гц), 7,39 (т, 2H, J=7,5 Гц), 7,23 (т, 2H, J=7,5 Гц), 3,66 (м, 1H), 3,09 (т, 1H, J=4,2 Гц), 2,98 (м, 1H), 1,96 (с, 3H), 1,86 (с, 3H).
Получение 64: 2-(2-Метилбут-3-ин-2-ил)-изотиазолидин-1,1-диоксид
К перемешиваемому раствору 1,3-пропансултама (2,000 г, 16,5 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (30 мл) при 0°C добавляли 60% гидрид натрия в минеральном масле (1,981 г, 49,5 ммоль) и смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа. Добавляли 3-хлор-3-метил-1-бутин (2,300 г, 22,4 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа и затем медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Реакционную смесь осторожно гасили водой и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия) и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-70% этилацетата/гексан) с получением желаемого продукта в виде желтого масла (1,35 г, 44%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 3,52 (т, 2H, J=6,6 Гц), 3,23 (т, 2H, J=7,5 Гц), 2,46 (с, 1H), 2,42-2,28 (м, 2H), 1,74 (с, 6H).
Получение 65: 2-(2-Метилбут-3-ен-2-ил)-изотиазолидин-1,1-диоксид
Смесь 2-(2-метилбут-3-ин-2-ил)-изотиазолидин-1,1-диоксида (1,350 г, 7,2 ммоль), хинолина (0,852 мл, 7,2 ммоль), бензола (70,0 мл) и 5% палладий на сульфате бария (0,20 г) перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре. После того, как расходовалось нужное количество водорода (~1 час), реакцию останавливали и фильтровали через целит и фильтрат концентрировали. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-70% этилацетата/гексан) с получением продукта в виде желтоватого масла (2,22 г), содержащего около 40% хинолина.1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 6,04 (дд, 1H, J=17,4, 10,5 Гц), 5,16 (д, 1H, J=17,4 Гц), 5,15 (д, 1H, J=10,8 Гц), 3,29 (т, 2H, J=6,6 Гц), 3,21 (т, 2H, J=7,5 Гц), 2,35-2,20 (м, 2H), 1,56 (с, 6H).
Получение 66: 2-(2-(Оксиран-2-ил)пропан-2-ил)-изотиазолидин-1,1-диоксид
К перемешиваемому раствору 60% 1,1-диоксида 2-(2-метилбут-3-ен-2-ил)изотиазолидина (1,0 г, 3,2 ммоль), N-оксида 4-метилморфолина (0,743 г, 6,3 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) и воде (3 мл) добавляли 4% раствор тетраоксида осмия (1,007 мл, 0,2 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов. Реакционную смесь концентрировали и остаток распределяли между этилацетатом и водой. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением неочищенного диола. К перемешиваемому раствору 2-(3,4-дигидрокси-2-метилбутан-2-ил)-изотиазолидин-1,1-диоксида (0,065 г, 0,3 ммоль) в пиридине (1,0 мл, 12,4 ммоль) и метиленхлориде (2 мл) при 0ºC медленно добавляли пара-толуолсульфонилхлорид (0,111 г, 0,6 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь концентрировали и остаток растворяли в этилацетате. Органическую фазу промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением неочищенного тозилата (0,040 г). В перемешиваемую смесь неочищенного тозилата (0,040 г, 0,1 ммоль) в метаноле (5 мл) при 0°C добавляли карбонат калия (0,048 г, 0,3 ммоль) и смесь перемешивали при 0°C в течение 2 часов и затем медленно нагревали до комнатной температуры. Смесь концентрировали и остаток распределяли между водой и этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением неочищенного эпоксида (0,02 г), который использовали без дополнительной очистки.
Получение 67: 3,6-Дифтор-9-((2-метилоксиран-2-ил)метил)-9H-карбазол
К перемешиваемому раствору 3,6-дифтор-9H-карбазола (2,0 г, 9,8 ммоль) в N,N-диметилформамиде (50 мл) при 0°C добавляли 85% гидроксид калия (0,780 г, 11,8 ммоль) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Добавляли 2-(хлорметил)-2-метилоксиран (2,098 г, 19,7 ммоль) и смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь распределяли между водой и этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (10-50% метиленхлорид/гексан) с получением желаемого продукта в виде белого твердого вещества (1,7 г, 63%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,68 (дд, 2H, J=8,4, 2,4 Гц), 7,41 (дд, 2H, J=9,0, 4,2 Гц), 7,23 (тд, 2H, J=9,0, 2,4 Гц), 4,62 и 4,22 (AB, 2H, J=15,6 Гц), 2,71 и 2,66 (AB, 2H, J=4,5 Гц), 1,33 (с, 3H).
Получение 68: N-Изопропилметансульфонамид
К перемешиваемому раствору 2-аминопропана (1,200 г, 20,3 ммоль), N,N-диизопропилэтиламина (3,355 мл, 20,3 ммоль) и пиридина (1,642 мл, 20,3 ммоль) в метиленхлориде (30 мл) при 0ºC медленно добавляли метансульфонилхлорид (1,571 мл, 20,3 ммоль). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь концентрировали и остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-80% этилацетата/гексан) с получением твердого продукта с низкой температурой плавления (2,7 г, 97%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,25 (уш. с, 1H), 3,67 (м, 1H), 2,99 (с, 3H), 1,27 (д, 6H, J=6,6 Гц).
Получение 69: N-Циклопропилметансульфонамид
К перемешиваемому раствору циклопропиламина (1,200 г, 21,0 ммоль), N,N-диизопропилэтиламина (3,474 мл, 21,0 ммоль) и пиридина (1,700 мл, 21,0 ммоль) в метиленхлориде (30 мл) при 0ºC медленно добавляли метансульфонилхлорид (1,627 мл, 21,0 ммоль). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь концентрировали и остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-80% этилацетата/гексан) с получением твердого продукта с низкой температурой плавления (2,7 г, 95%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,86 (уш. с, 1H), 3,02 (с, 3H), 2,60 (м, 1H), 0,85-0,65 (м, 4H).
Получение 70: N-Циклобутилметансульфонамид
К перемешиваемому раствору циклобутиламина (0,400 г, 5,6 ммоль), N,N-диизопропилэтиламина (0,930 мл, 5,6 ммоль) и пиридина (0,455 мл, 5,6 ммоль) в метиленхлориде (10 мл) при 0ºC медленно добавляли метансульфонилхлорид (0,435 мл, 5,6 ммоль). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь концентрировали и остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-80% этилацетата/гексан) с получением твердого продукта с низкой температурой плавления (0,82 г, 98%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,62 (уш. с, 1H), 3,94 (м, 1H), 2,94 (с, 3H), 2,50-2,30 (м, 2H), 2,10-1,85 (м, 2H), 1,85-1,60 (м, 2H).
Получение 71: 2-(2,4-Диметоксибензил)изотиазолидин-1,1- диоксид
Раствор 1,1-(азодикарбонил)дипиперидина (1,874 г, 7,4 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (10 мл) добавляли по каплям к охлажденному до 0°C раствору 1,3-пропансултама (0,6 г, 4,95 ммоль), трифенилфосфина (1,95 г, 7,4 ммоль) и 2,4-диметоксибензилового спирта (1,0 г, 6,2 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (20 мл). Полученный раствор перемешивали при 0°C в течение 3 часов, нагревали до комнатной температуры и перемешивали еще 16 часов. Раствор концентрировали при пониженном давлении и суспендировали в смеси этилацетат/гексан для осаждения белого твердого вещества. Твердое вещество удаляли при помощи фильтрации и фильтрат очищали при помощи хроматографии на силикагеле (25-70% этилацетата/гексан) с получением бледно-желтого масла (0,505 г).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,31-7,28 (дд, 1H, J=0,6, 7,8 Гц), 6,49-6,44 (м, 2H), 4,17 (с, 2H), 3,81 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 3,19-3,13 (м, 4H), 2,32-2,23 (м, 2H).
Получение 72: 2-(2,4-Диметоксибензил)-5-фтор-изотиазолидин-1,1-диоксид
К раствору 2-(2,4-диметоксибензил)-изотиазолидин-1,1-диоксида (4,0 г, 14,7 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (200 мл), в атмосфере азота и охлаждении до -78°C, медленно добавляли н-бутиллитий (11,5 мл, 2,5н в гексане) и полученный раствор перемешивали в течение 1,5 часов. Раствор N- фторбензолсульфонимида (10,5 г, 33 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (60 мл), охлажденном до 0°C, добавляли медленно в течение 30 минут, перемешивали при -78°C в течение 3 часов, затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение дополнительных 2,5 часов. Добавляли насыщенный водный раствор хлорида аммония (250 мл) и смесь экстрагировали этилацетатом (250 мл). Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт экстрагировали диэтиловым эфиром, фильтруя через стеклянный фильтр для удаления нерастворимых продуктов. Твердые вещества экстрагировали небольшим количеством метиленхлорида и фильтрат пропускали через слой силикагеля (промывали раствором 50% этилацетата/гексан) и объединяли с экстрактом диэтилового эфира. Объединенные органические растворы концентрировали и очищали при помощи хроматографии на силикагеле (20-60% этилацетата/гексан). Этот материал далее очищали при помощи препаративной ВЭЖХ, (колонка C18 с градиентом ацетонитрил/вода) с получением коричневого твердого вещества с низкой температурой плавления (0,519 г).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,24-7,21 (д, 1H, J=7,5 Гц), 6,49-6,44 (м, 2H), 5,51-5,31 (ддд, 1H, J=1,8, 5,1, 54 Гц), 4,44-4,39 (д, 1H, J=2,7 Гц), 4,20-4,15 (д, 1H, J=2,7 Гц), 3,82 (с, 3H), 3,81 (с, 3H), 3,27-3,18 (м, 2H), 2,65-2,35 (м, 2H). Анализ ВЭЖХ: (C18, 25-95% ацетонитрила в воде+0,1% трифторуксусной кислоты в течение 10 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 7,51 минут, 97%.
Получение 73: 5-Фтор-изотиазолидин-1,1-диоксид
К раствору 2-(2,4-диметоксибензил)5-фтор-изотиазолидин-1,1-диоксида (0,519 г, 1,9 ммоль) в метиленхлориде (50 мл), охлажденному до 0°C, добавляли трифторуксусную кислоту (25 мл). Раствор перемешивали при 0°C в течение 2,5 часов и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (20-70% этилацетата/гексан) с получением коричневого твердого вещества (0,212 г).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 5,52-5,50 (ддд, 1H, J=1,5, 4,5, 53,1 Гц), 4,57 (уш. с, 1H), 3,57-3,33 (м, 2H), 2,78-2,48 (м, 2H).
Получение 74: 2-(2,4-Диметоксибензил)-1,2-тиазинан-1,1-диоксид
В 0,5 M раствор 2,4-диметоксибензилового спирта (4,94 г, 29,3 ммоль) в безводном диэтиловом эфире добавляли безводный пиридин (4,75 мл, 58,7 ммоль). Смесь охлаждали до 0°C и медленно добавляли тионилхлорид (5,98 мл, 80,7 ммоль) в течение 5-10 минут и реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 1,5 часов. Реакционную смесь вливали в ледяную воду (120 мл) и слои разделяли. Водный слой экстрагировали диэтиловым эфиром (2×60 мл) и объединенные органические слои промывали ледяной водой (60 мл) и раствором 5:1 насыщенный водный раствор хлорида натрия:насыщенный водный раствор бикарбоната натрия (2×60 мл), сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали до ~5 мл жидкости. Неочищенный раствор растворяли в бензоле (200 мл) и повторно концентрировали до 10-15 мл жидкости, которую сразу же использовали на следующей стадии. 1,4-Бутансултам (2,800 г, 20,7 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (50 мл) охлаждали до 0°C и небольшими порциями добавляли гидрид натрия, перемешивая в течение 5 минут при 0°C и 1 час при комнатной температуре. Реакционную смесь превращалась в суспензию и ее охлаждали до 0°C и добавляли раствор 1-(хлорметил)-2,4-диметоксибензола в бензоле, перемешивание при 0°C и медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь вливали в воду (300 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×). Объединенные органические слои промывали водой, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенное вещество очищали при помощи хроматографии на силикагеле (15-60% этилацетата/гексан) с получением белого твердого вещества (4,78 г).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,28-7,25 (д, 1H, J=8,4 Гц), 6,48-6,45 (дд, 1H, J=2,4, 8,1 Гц), 6,43-6,42 (д, 1H, J=2,1 Гц), 4,29 (с, 2H), 3,79 (с, 6H), 3,31-3,27 (м, 2H), 3,04-3,00 (м, 2H), 2,18-2,15 (м, 2H), 1,60-1,56 (м, 2H). Анализ ВЭЖХ: (C18, 25-99% ацетонитрила в воде+0,1% трифторуксусной кислоты в течение 10 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 6,93 минут, 98%.
Получение 75: 2-(2,4-Диметоксибензил)-6-фтор-1,2-тиазинан-1,1-диоксид
1,1-Диоксид 2-(2,4-диметоксибензил)-1,2-тиазинана (4,780 г, 16,8 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (250 мл) охлаждали до -78°C и добавляли по каплям н-бутиллитий (13 мл, 2,5н в гексане). Реакционную смесь перемешивали при -78°C в течение 1 часа и медленно добавляли раствор N-фторбензолсульфонимида (11,885 г, 37,7 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (50 мл) в течение 20 минут. Полученный раствор перемешивали при -78°C в течение 3 часов и в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь вливали в насыщенный водный раствор хлорида аммония и экстрагировали этилацетатом (2×). Объединенные органические слои промывали водой, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный остаток экстрагировали смесью этилацетат/гексан, отфильтровывают твердый осадок и раствор концентрировали. Неочищенное вещество очищали при помощи хроматографии на силикагеле (20-60% этилацетата/гексан) с последующей препаративной ВЭЖХ (C18, 25-95% ацетонитрил/вода+0,1% диэтиламин) с получением бледно-желтого масла (0,99 г).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,26-7,24 (д, 1H, J=8,1 Гц), 6,49-6,46 (дд, 1H, J=8,1, 2,4 Гц), 6,44-6,43 (д, 1H, J=2,4 Гц), 5,35-5,16 (м, 1H), 4,55-4,37 (дд, 2H, J=15,0, 38,4 Гц), 3,81 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 3,50-3,46 (м, 1H), 3,26-3,22 (м, 1H), 2,60-2,42 (м, 2H), 2,02-1,97 (м, 1H), 1,47-1,39 (м, 1H),19F ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ -156,7 (т, 1F, J=42 Гц). Анализ ВЭЖХ: (C18, 10-95% ацетонитрила в воде+0,1% трифторуксусной кислоты в течение 20 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 13,5 минут, 97%.
Получение 76: 6-Фтор-1,2-тиазинан-1,1-диоксид
1,1-Диоксид 2-(2,4-диметоксибензил)-6-фтор-1,2-тиазинана (0,532 г, 1,8 ммоль) в метиленхлориде (40 мл) охлаждали до 0°C. Добавляли трифторуксусную кислоту (25 мл) и полученный красный раствор перемешивали в течение 1,5 часов при 0°C, концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (20-70% этилацетата/гексан) с получением прозрачной жидкости (0,213 г, 79%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 5,35-5,33 (дд, 0,5H, J=5,0, 2,4 Гц), 5,19-5,17 (т, 0,5H, J=3,6 Гц), 4,76 (уш. с, 1H), 3,52-3,32 (м, 2H), 2,56-2,40 (м, 2H), 1,91-1,81 (м, 1H), 1,59-1,52 (м, 1H).
Получение 77: 2-(2,4-Диметоксибензил)-6,6-дифтор-1,2-тиазинан-1,1-диоксид
К раствору 2-(2,4-диметоксибензил)-6-фтор-1,2-тиазинан-1,1-диоксида (0,500 г, 1,8 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (30 мл), охлажденном до -78°C, медленно добавляли 2,5н раствор н-бутиллития в гексане (1,262 мл, 3,2 ммоль). Раствор перемешивали при -78°C в течение 1 часа, медленно добавляли раствор N-фторбензолсульфонимида (1,243 г, 3,9 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (5 мл) в течение 10 минут и смесь перемешивали при -78°C в течение 3 часов и при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционную смесь вливали в насыщенный водный раствор хлорида аммония и экстрагировали этилацетатом (2×). Объединенные органические слои промывали водой, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (15-60% этилацетата/гексан) с получением желтого масла (0,09 г).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,25-7,21 (д, 1H, J=8,4 Гц), 6,50-6,47 (дд, 1H, J=2,4, 8,4 Гц), 6,45-6,44 (д, 1H, J=2,4 Гц), 4,43 (с, 2H), 3,82 (с, 3H), 3,81 (с, 3H), 3,38-3,37 (т, 2H, J=5,1 Гц), 2,58-2,45 (м, 2H), 2,00-1,92 (м, 2H).
Получение 78: 6,6-Дифтор-1,2-тиазинан-1,1-диоксид
К раствору 2-(2,4-диметоксибензил)-6,6-дифтор-1,2-тиазинан-1,1-диоксида (0,090 г, 0,3 ммоль) в метиленхлориде (7 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (4 мл) и полученный красный раствор перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Смесь концентрировали в вакууме с получением неочищенного остатка. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (10-60% этилацетата/гексан) с получением прозрачного масла (0,034 г).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 4,85 (уш. с, 1H), 3,46-3,40 (м, 2H), 2,60-2,47 (м, 2H), 2,01-1,93 (м, 2H).
Получение 79: N-(Фуран-2-илметил)пропан-2-сульфонамид
К перемешиваемому раствору фурфуриламина (1,040 г, 10,7 ммоль) в пиридине (10 мл) при 0ºC медленно добавляли 2-пропансульфонилхлорид (1,0 мл, 8,9 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь концентрировали и остаток растворяли в этилацетате. Органический слой промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-50% этилацетата/гексан) с получением продукта (0,84 г, 46%) в виде желтоватого густого масла.1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,40 (дд, 1H, J=1,8, 0,9 Гц), 6,35 (дд, 1H, J=3,3, 1,8 Гц), 6,29 (д, 1H, J=3,3 Гц), 4,42 (уш. с, 1H), 4,33 (д, 2H, J=5,7 Гц), 3,08 (м, 1H), 1,35 (д, 6H, J=6,9 Гц).
Получение 80: 1,1,1-Трифтор-N-(фуран-2-илметил)метансульфонамид
К перемешиваемому раствору фурфуриламина (0,899 г, 9,3 ммоль) в пиридине (10 мл) при 0ºC медленно добавляли трифторметансульфонилхлорид (1,300 г, 7,7 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь концентрировали и остаток растворяли в этилацетате. Органический слой промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-50% этилацетата/гексан) с получением продукта (1,5 г, 85%) в виде желтоватого масла.1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,43 (дд, 1H, J=1,8, 0,9 Гц), 6,38 (дд, 1H, J=3,3, 1,8 Гц), 6,36 (д, 1H, J=3,3 Гц), 5,10 (уш. с, 1H), 4,48 (с, 2H).
Получение 81: N-(Фуран-2-илметил)циклогексансульфонамид
К перемешиваемому раствору фурфуриламина (0,319 г, 3,3 ммоль) в пиридине (5 мл) при 0ºC медленно добавляли циклогексансульфонилхлорид (0,500 г, 2,7 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь концентрировали и остаток растворяли в этилацетате. Органический слой промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-50% этилацетата/гексан) с получением продукта (0,325 г, 49%) в виде белого твердого вещества.1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,40 (дд, 1H, J=1,8, 0,9 Гц), 6,35 (дд, 1H, J=3,3, 2,1 Гц), 6,30 (д, 1H, J=3,0 Гц), 4,43 (м, 1H), 4,32 (д, 2H, J=5,7 Гц), 2,75 (тт, 1H, J=12,0, 3,3 Гц), 2,15-2,05 (м, 2H), 1,95-1,80 (м, 2H), 1,70 (м, 1H), 1,60-1,40 (м, 2H), 1,30-1,10 (м, 3H).
Получение 82: N-(Фуран-2-илметил)тетрагидрофуран-3-сульфонамид
К перемешиваемому раствору фурфуриламина (0,171 г, 1,8 ммоль) в пиридине (2 мл) при 0ºC медленно добавляли тетрагидрофуран-3-сульфонилхлорид (0,250 г, 1,5 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь концентрировали и остаток растворяли в этилацетате. Органический слой промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-50% этилацетата/гексан) с получением продукта (0,220 г, 65%) в виде густого масла.1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,41 (с, 1H), 6,36 (дд, 1H, J=3,3, 2,1 Гц), 6,31 (д, 1H, J=3,3 Гц), 4,68 (т, 1H, J=5,4 Гц), 4,36 (д, 2H, J=6,0 Гц), 4,05 (дд, 1H, J=10,2, 5,7 Гц), 4,02-3,78 (м, 3H), 3,65 (м, 1H), 2,36-2,10 (м, 2H).
Получение 83: 1,2,6-Тиадиазинан-1,1-диоксид
В перемешиваемую смесь 1,3-диаминопропана (1,0 мл, 11,9 ммоль) в пиридине (20 мл) добавляли сульфамид (2,282 г, 23,7 ммоль). Смесь нагревали в масляной бане при 120°C в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры смесь концентрировали и остаток распределяли между этилацетатом и насыщенным водным раствором хлорида натрия. Органический слой промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия, фильтровали и концентрировали с получением белого твердого вещества (0,085 г, 5%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,26 (уш. с, 2H), 3,70-3,50 (м, 4H), 1,80-1,60 (м, 2H).
Получение 84: 2-Метил-1,2,6-тиадиазинан-1,1-диоксид
В перемешиваемую смесь N-метил-1,3-диаминопропана (1,70 мл, 16,3 ммоль) в пиридине (20 мл) добавляли сульфамид (1,877 г, 19,5 ммоль). Смесь нагревали в масляной бане при 120°C в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры, смесь концентрировали и остаток распределяли между этилацетатом и насыщенным водным раствором хлорида натрия. Органический слой промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия, фильтровали и концентрировали с получением бесцветного масла (1,3 г, 53%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,11 (уш. с, 1H), 3,60-3,48 (м, 2H), 3,32 (т, 2H, J=5,7 Гц), 2,78 (с, 3H), 1,85-1,72 (м, 2H).
Получение 85: 3-Метоксициклогексанамин
Смесь 3-метоксициклогексанкарбоновой кислоты, смесь цис и транс 97% (1,50 г, 9,5 ммоль), дифенилфосфорилазида (2,043 мл, 9,5 ммоль) и триэтиламина (1,582 мл, 11,4 ммоль) в безводном толуоле (65 мл) нагревали при кипении с обратным холодильником в течение 3 часов. Смесь охлаждали до 0°C, добавляли триметилсиланолат натрия (18,964 мл 1 M раствора в тетрагидрофуране, 19,0 ммоль) и смесь перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакционную смесь гасили 5% водным раствором лимонной кислоты (100 мл), перемешивали, концентрировали до приблизительно половины объема при пониженном давлении, промывали диэтиловым эфиром (2×), доводили до щелочного рН при помощи гидроксида натрия и экстрагировали метиленхлоридом (3×). Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенное вещество очищали при помощи хроматографии на силикагеле (5-12% метанол/метиленхлорид) с получением частично очищенного вещества. Остаток растворяли в метиленхлориде и экстрагировали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты (3×). Объединенные водные слои доводили до основного рН 15% водным раствором гидроксида натрия и экстрагировали метиленхлоридом (3×). Объединенные органические фракции сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали, концентрировали, суспендировали в смеси гексан/метиленхлорид и фильтровали. Концентрирование органических слоев давало желтую жидкость (0,272 г).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) (смесь диастереомеров) δ 3,52 (м, 1H), 3,28 (с, 3H), 2,99 (м, 1H), 1,95-1,00 (м, 10H).
Получение 86: 7-Оксабицикло[2.2.1]гептан-2-амин
Смесь 7-оксабицикло[2.2.1]гептан-2-карбоновой кислоты (0,233 г, 1,6 ммоль) в безводном толуоле (10 мл), триэтиламина (0,273 мл, 2,0 ммоль) и дифенилфосфорилазида (0,353 мл, 1,6 ммоль) нагревали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 3 часов, затем охлаждали до 0°C и добавляли триметилсиланолат натрия (3,278 мл 1 M раствора в тетрагидрофуране, 3,3 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 5% водный раствор лимонной кислоты (15 мл) и смесь концентрировали до приблизительно половины объема при пониженном давлении. Смесь промывали диэтиловым эфиром (2×) и один раз этилацетатом и водный слой доводили до щелочного рН 15% водным раствором гидроксида натрия и экстрагировали метиленхлоридом (3×). Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия (+3 капли гидроксида натрия), сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением прозрачной жидкости (0,121 г).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) (смесь диастереомеров) δ 4,6-4,14 (м, 2H), 3,48-3,42 (м, 1H), 2,21-0,86 (м, 8H).
Получение 87: Бензил (3,3-дифторциклобутил)карбамат
К раствору бензил(3-оксоциклобутил)карбамата (0,900 г, 4,1 ммоль) в безводном метиленхлориде (9 мл) по каплям добавляли трифторид диэтиламиносеры (2,170 мл, 16,4 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Смесь вливали в холодный насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и перемешивали в течение 5 минут. Смесь экстрагировали метиленхлоридом (3×) и объединенные органические слои последовательно промывали водой, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (5-30% этилацетата/гексан) с получением коричневого твердого вещества (0,6 г).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,36-7,34 (м, 5H), 5,10 (с, 2H), 4,99 (уш. м, 1H), 4,10 (м, 1H), 2,97 (м, 2H), 2,48 (м, 2H).
Получение 88: 3,3-Дифторциклобутанаминийхлорид
Суспензию бензил(3,3-дифторциклобутил)карбамата (0,600 г, 2,5 ммоль) и 10% палладия на углероде (0,350 г, 50% влажность) в метаноле (8 мл) помещали в атмосферу водорода. Через 24 часа добавляли дополнительное количество 10% палладия на углероде (0,25 г, 50% влажность) и смесь перемешивали еще 24 часа. Реакционную смесь фильтровали через целит, промывали метанолом и концентрированную хлористоводородную кислоту (0,3 мл) добавляли к метанольному раствору. Неочищенный раствор концентрировали под вакуумом с получением не совсем белого полутвердого вещества (0,303 г).1H ЯМР (d6-ДМСО, 300 МГц) δ 8,61 (уш. с, 3H), 3,65-3,58 (м, 1H), 2,93-2,81 (м, 4H).
Получение 89: Бензил (3-оксоциклогексил)карбамат
К раствору 2-циклогексен-1-она (1,442 г, 15,0 ммоль) в безводном метиленхлориде (15 мл) добавляли бис(ацетонитрил)дихлор-палладий(II) (0,231 г, 1,0 ммоль) и бензилкарбамат (1,497 г, 9,9 ммоль) и перемешивали в атмосфере азота в течение 24 часов. Реакционную смесь фильтровали через слой силикагеля, промывали этилацетатом и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (20-65% этилацетата/гексан) с получением твердого бледно-желтого вещества с низкой температурой плавления (1,9 г).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,34 (м, 5H), 5,09 (с, 2H), 4,81 (уш. с, 1H), 3,99 (уш. с, 1H), 2,73 (м, 1H), 2,36-2,26 (м, 3H), 2,11-1,97 (м, 2H), 1,67-1,64 (м, 2H), ESI m/z: 248,0 (M+H).
Получение 90: Бензил (3,3-дифторциклогексил)карбамат
К раствору бензил(3-оксоциклогексил)карбамата (1,0 г, 4 ммоль) в безводном дихлорэтане (8 мл), добавляли Deoxo-Флуor® (1,1 мл) и смесь нагревали при 65°C в закрытом сосуде в течение 16 часов. Смесь охлаждали до 0°C и добавляли холодный насыщенный водный раствор бикарбоната натрия. Смесь экстрагировали этилацетатом (3×) и объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (5-40% этилацетата/гексан) с получением белого твердого вещества (0,435 г).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,41-7,28 (м, 5H), 5,09 (с, 2H), 4,89 (уш. с, 1H), 3,92 (уш. с, 1H), 2,34 (м, 1H), 2,05-1,67 (м, 6H), 1,40 (м, 1H), ESI (m/z): 269,9 (M+H).
Получение 91: 3,3-Дифторциклогексанаминийформиат
К суспензии бензил(3,3-дифторциклогексил)карбамата (0,43 г, 1,6 ммоль) в 4% растворе муравьиной кислоты в метаноле (25 мл) добавляли 10% палладий на углероде (0,4 г, 50% влажность). Полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 20 часов. Смесь фильтровали через целит, промывали метанолом и концентрировали под вакуумом с получением не совсем белого твердого вещества (0,3 г).1H ЯМР (d6-ДМСО, 300 МГц) δ 8,36 (с, 1H), 3,03 (м, 1H), 2,97 (м, 1H), 1,97-1,63 (м, 5H), 1,39-1,22 (м, 2H),19F ЯМР (d6-ДМСО, 400 МГц) -60,33--60,97 (д, 1F, J=252 Гц), -70,73--71,54 (дт, 1F, J=252, 36 Гц), ESI (m/z) 136,2 (M+H).
Получение 92: Бензил 2-гидроксициклогексилкарбамат
Раствор 2-аминоциклогексанола (3,524 г, 30,6 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (85 мл) охлаждали до 0°C и порциями добавляли триэтиламин (3,402 мл, 24,5 ммоль) с последующим добавлением N-сукцинимида бензилоксикарбонила (6,100 г, 24,5 ммоль). Полученную смесь перемешивали при 0°C и медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь разбавляли водой и этилацетатом, органический слой отделяли и последовательно промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты (2×), насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (25-60% этилацетата/гексан) с получением белого твердого вещества (4,2 г).1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 7,35 (м, 5H), 5,09 (м, 3H), 3,96 (м, 1H), 3,67 (м, 1H), 1,82-1,28 (м, 8H).
Получение 93: Бензил (2-оксоциклогексил)карбамат
Реагент Джонса получали с триоксидом хрома (1,7 г), суспендированном в серной кислоте (1,7 мл), которую добавляли в холодной воде (13 мл), чтобы сделать активным раствор.
К раствору бензил(2-гидроксициклогексил)карбамата (4,200 г, 16,8 ммоль) в ацетоне (15 мл) по каплям добавляли реагент Джонса в течение нескольких минут (с водяной охлаждающей до комнатной температуры баней) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часов. Растворы насыщенного водного карбоната натрия и затем насыщенного водного бикарбоната натрия добавляли пока раствор не доходил до нейтрального значения рН и полученную смесь экстрагировали этилацетатом (3×). Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (10-50% этилацетата/гексан) с получением прозрачной жидкости (3,3 г).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,36-7,29 (м, 5H), 5,75 (уш. с, 1H), 5,10 (с, 2H), 4,29-4,25 (м, 1H), 2,65 (м, 1H), 2,57-2,50 (м, 1H), 2,43-2,33 (м, 1H), 2,17-2,10 (м, 1H), 1,88-1,60 (м, 3H), 1,48-1,34 (м, 1H). ESI (m/z): 248,0 (M+H).
Получение 94: Бензил (2,2-дифторциклогексил)карбамат
К раствору бензил(2-оксоциклогексил)карбамата (1,25 г, 5,0 ммоль) в безводном метиленхлориде (20 мл) добавляли трифторид диэтиламиносеры (2 мл) и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь охлаждали до 0°C и вливали в холодный насыщенный водный раствор бикарбоната натрия. Смесь экстрагировали этилацетатом (3×) и органические слои промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (5-55% этилацетата/гексан) с получением твердого вещества желтого цвета. Это вещество перекристаллизовывали из смеси диэтиловый эфир/гексан с получением белого твердого вещества (0,227 г).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,41-7,25 (м, 5H), 5,17-5,07 (м, 2H), 4,99 (м, 1H), 3,99-3,85 (м, 1H), 2,20-2,16 (м, 1H), 2,00 (м, 1H), 1,78-1,38 (м, 6H). ESI (m/z): 269,9 (M+H).
Получение 95: 2,2-Дифторциклогексанаминийформиат
К раствору бензил(2,2-дифторциклогексил)карбамата (0,200 г, 0,7 ммоль) в 4% растворе муравьиной кислоты в метаноле (10 мл) добавляли 10% палладий на углероде (0,15 г, 50% влажность). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 18 часов, фильтровали через целит, промывали метанолом и концентрировали под вакуумом с получением не совсем белого твердого вещества (0,1 г).1H ЯМР (d6-ДМСО, 300 МГц) δ 8,21 (с, 1H), 3,03-2,95 (м, 1H), 2,07-2,04 (м, 1H), 1,76-1,34 (м, 7H). ESI (m/z): 136,2 (M+H).
Получение 96: N-Пропилметансульфонамид
К охлажденному, 0°C, раствору 1-пропиламина (1,0 г, 16,9 ммоль) и триэтиламина (2,587 мл, 18,6 ммоль) в безводном метиленхлориде (30 мл) по каплям добавляли метансульфонилхлорид (1,309 мл, 16,9 ммоль). Реакционной смеси давали медленно нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь разбавляли этилацетатом и последовательно промывали 1,0н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствора хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением чистого продукта (1,730 г, 75%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 4,49 (уш. с, 1H), 3,12-3,08 (кв., 2H, J=7,5 Гц), 1,67-1,54 (с, 2H, J=7,5 Гц), 0,99-0,94 (т, 3H, J=7,5 Гц).
Получение 97: N-Этилметансульфонамид
К охлажденному, 0°C, раствору этиламина (0,763 г, 16,9 ммоль) в безводном метиленхлориде (20 мл), по каплям добавляли триэтиламин (2,587 мл, 18,6 ммоль) и метансульфонилхлорид (1,309 мл, 16,9 ммоль). Смеси давали медленно нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Полученную смесь разбавляли этилацетатом и промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты (2×), насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия. Органический слой сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением полутвердого вещества (0,633 г, 30%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 4,60 (уш. с, 1H), 3,21-3,12 (кв. д, 2H, J=6,0, 7,2 Гц), 1,28-1,19 (т, 3H, J=7,2 Гц).
Получение 98: 2-Метил-1,2,5-тиадиазолидин-1,1-диоксид
В перемешиваемую смесь N-метилэтилендиамина (1,200 г, 16,2 ммоль) в пиридине (20 мл) добавляли сульфамид (1,867 г, 19,4 ммоль). Смесь нагревали в масляной бане при 120°C в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры, смесь концентрировали и остаток распределяли между этилацетатом и насыщенным водным раствором хлорида натрия. Органический слой промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением бесцветного масла (0,61 г, 28%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,30 (уш. с, 1H), 3,53 (м, 2H), 3,40 (м, 2H), 2,76 (с, 3H).
Получение 99: 2-Бензил-1,2,5-тиадиазолидин-1,1-диоксид
В перемешиваемую смесь N-бензилэтилендиамина (2,000 г, 13,3 ммоль) в пиридине (20 мл) добавляли сульфамид (1,919 г, 20,0 ммоль). Смесь нагревали в масляной бане при 120°C в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры, смесь концентрировали и остаток распределяли между этилацетатом и насыщенным водным раствором хлорида натрия. Органический слой промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-80% этилацетата/гексан) с получением продукта в виде светло-желтого густого масла (1,4 г, 50%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7,40-7,30 (м, 5H), 4,38 (уш. с, 1H), 4,20 (с, 2H), 3,50 (кв., 2H, J=6,6 Гц), 3,29 (т, 2H, J=6,6 Гц).
Получение 100: 1,2,5-Тиадиазолидин-1,1-диоксид
Смесь 2-бензил-1,2,5-тиадиазолидин-1,1-диоксида (1,000 г, 4,7 ммоль) и 20% раствора гидроксида палладия (0,200 г) в метаноле (20 мл) перемешивали в атмосфере водорода (1 атм) в течение 16 часов. Смесь фильтровали через целит и фильтрат концентрировали с получением белого твердого вещества (0,570 г, 99%).1H ЯМР (300 МГц, d6-ДМСО) δ 6,68 (с, 2H), 3,30-3,25 (м, 4H).
Получение 101: 2-(2,4-Диметоксибензил)-5-метилизотиазолидин-1,1-диоксид
К охлажденному до -78°C раствору 2-(2,4-диметоксибензил)изотиазолидин-1,1-диоксида (0,600 г, 2,2 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (29 мл) медленно добавляли н-бутиллитий (1,725 мл 2,5н раствора в гексане, 4,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при -78°C, добавляли йодметан (0,688 мл, 11,1 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 2,5 часов при -78°C и 30 минут при комнатной температуре. Смесь вливали в насыщенный водный раствор хлорида аммония и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенное вещество очищали при помощи хроматографии на силикагеле (20-60% этилацетата/гексан) с получением продукта в виде прозрачного масла (0,3 г).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,25-7,22 (д, 1H, J=8,1 Гц), 6,48-6,43 (м, 2H), 4,27-4,13 (кв., 2H, J=14,1 Гц), 3,80 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 3,25-3,02 (м, 3H), 2,43-2,32 (м, 1H), 1,95-1,83 (м, 1H), 1,42-1,40 (д, 3H, J=6,6 Гц).
Получение 102: 2-(2,4-Диметоксибензил)-5,5-диметилизотиазолидин-1,1-диоксид
Используя описанную выше процедуру, указанное в заголовке соединение также получали в виде прозрачного масла (0,237 г).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,26-7,23 (д, 1H, J=7,8 Гц), 6,48-6,43 (м, 2H), 4,23 (с, 2H), 3,80 (с, 6H), 3,07-3,03 (т, 2H, J=7,1 Гц), 2,10-2,05 (т, 2H, J=6,9 Гц), 1,42 (с, 3H).
Получение 103: 5-Метилизотиазолидин-1,1-диоксид
К охлажденному до 0°C раствору 2-(2,4-диметоксибензил)-5-метилизотиазолидин-1,1-диоксида (0,292 г, 1,0 ммоль) в метиленхлориде (10 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (5,000 мл, 67,3 ммоль) и полученный красный раствор перемешивали при 0°C в течение 3 часов и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (30-75% этилацетата/гексан) с получением прозрачного масла (0,117 г, 90%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) 4,38 (уш. с, 1H), 3,38-3,32 (м, 2H), 3,21-3,14 (м, 1H), 2,60-2,47 (м, 1H), 2,13-2,00 (м, 1H), 1,43-1,40 (д, 3H, J=7,2 Гц).
Получение 104: 5,5-Диметилизотиазолидин-1,1-диоксид
К охлажденному до 0°C раствору 2-(2,4-диметоксибензил)-5,5-диметилизотиазолидин-1,1-диоксида (0,220 г, 0,7 ммоль) в метиленхлориде (10 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (3,591 мл, 48,3 ммоль) и полученный красный раствор перемешивали при 0°C в течение 3 часов и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали при помощи хроматографии на силикагеле (20-80% этилацетата/гексан) с получением прозрачного масла (0,087 г, 86%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,61 (уш. с, 1H), 3,32-3,26 (тд, 2H, J=5,1, 7,1 Гц), 2,25-2,20 (т, 2H, J=7,2 Гц), 1,43 (с, 6H).
Получение 105: N-Аллилэтенсульфонамид
К охлажденному, 0°C, раствору аллиламина (1,926 г, 33,7 ммоль) и триэтиламина (12,789 мл, 92,0 ммоль) в безводном метиленхлориде (50 мл) медленно добавляли раствор 2-хлорэтансульфонилхлорида (5,000 г, 30,7 ммоль) в метиленхлориде (10 мл). Полученную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение 4 часов. Смесь последовательно экстрагировали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты (2×), водой, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением желтой жидкости.1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 6,57-6,48 (дд, 1H, J=9,9, 16,8 Гц), 6,28-6,22 (д, 1H, J=16,8 Гц), 5,96-5,92 (д, 1H, J=9,6 Гц), 5,90-5,77 (м, 1H), 5,30-5,29 (м, 1H), 5,24-5,17 (м, 1H), 4,44 (уш. с, 1H), 3,69-3,64 (тт, 2H, J=1,5, 6,0 Гц).
Получение 106: 2,3-Дигидроизотиазол-1,1-диоксид
Раствор N-аллилэтенсульфонамида (0,700 г, 4,8 ммоль) в безводном метиленхлориде (7 мл) помещали в атмосферу аргона и добавляли (1,3-бис(2,4,6-триметилфенил)-2-имидазолидинилиден) дихлор(фенилметилен)(трициклогексилфосфин)рутений (0,02 г). Смесь нагревали при кипении с обратным холодильником и добавляли дополнительные порции (0,02 г каждой) (1,3-бис(2,4,6-триметилфенил)-2-имидазолидинилиден)дихлор (фенилметилен)(трициклогексилфосфин)рутения с интервалом 30 минут, пока в общей сложности было добавлено 0,1 г (2,5 мол. %). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в общей сложности 6 часов, охлаждали до комнатной температуры и концентрировали в вакууме. Неочищенное вещество очищали при помощи хроматографии на силикагеле (50-100% этилацетата/гексан) с получением коричневого масла (0,46 г).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 6,90-6,86 (дт, 1H, J=2,4, 6,6 Гц), 6,75-6,6,71 (дт, 1H, J=2,4, 6,3 Гц), 4,92 (уш. с, 1H), 4,15-4,12 (м, 2H).
Получение 107: 4-Метоксиизотиазолидин-1,1-диоксид
К раствору 2,3-дигидроизотиазол-1,1-диоксида (0,100 г, 0,8 ммоль) в метаноле (1 мл) добавляли 25% раствор метоксида натрия в метаноле (0,181 г, 0,8 ммоль) и раствор перемешивали при 60°C в течение 2 часов и при 70°C в течение 3 часов. Смесь концентрировали и суспендировали в 1н водном растворе хлористоводородной кислоты. Водную смесь экстрагировали этилацетатом (3×) и органические слои сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенное вещество очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-6% метанол/метиленхлорид) с получением продукта (0,011 г, 13%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,53 (уш. с, 1H), 4,33-4,29 (м, 1H), 3,48-3,30 (м, 3H), 3,37 (с, 3H), 3,19-3,13 (м, 1H).13C ЯМР (100 МГц, CDCl3) δ 80,8, 57,1, 53,3, 48,7.
Получение 108: 2-(2,4-Диметоксибензил)-5,5-дифторизотиазолидин-1,1-диоксид
К раствору 2-(2,4-диметоксибензил)5-фторизотиазолидин-1,1-диоксида (5,700 г, 19,7 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (225 мл), охлажденном до -78°C, медленно добавляли н-бутиллитий (14,973 мл 2,5н раствора в гексане, 37,4 ммоль) и полученный темно-оранжевый/красный раствор перемешивали в течение 1 часа. Медленно добавляли раствор N-фторбензолсульфонамида (14,6 г, 46,3 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (60 мл) в течение 30 минут, перемешивали при -78°C в течение 3 часов и при комнатной температуре в течение 2,5 часов. Реакционную смесь вливали в насыщенный водный раствор хлорида аммония, разбавляли этилацетатом и органический слой отделяли. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенное вещество суспендировали в метиленхлориде и фильтровали через слой силикагеля, промывали метиленхлоридом и концентрировали раствор. Неочищенное вещество очищали при помощи хроматографии на силикагеле (20-75% этилацетата/гексан) и затем при помощи препаративной ВЭЖХ (C18, 32-95% ацетонитрил/вода в течение 17 минут) с получением желтовато-коричневого масла (0,106 г, 2%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 7,21-7,18 (д, 1H, J=8,4 Гц), 6,49-6,45 (м, 2H), 4,28 (с, 2H), 3,82 (с, 3H), 3,14 (с, 3H), 3,19-3,15 (м, 2H), 2,70-2,55 (м, 2H).
Получение 109: 5,5-Дифторизотиазолидин-1,1-диоксид
К охлажденному до 0°C раствору 2-(2,4-диметоксибензил)-5,5-дифторизотиазолидин-1,1-диоксида (0,100 г, 0,3 ммоль) в метиленхлориде (6 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (2,182 мл, 29,4 ммоль). Полученный красный/фиолетовый раствор перемешивали при 0°C в течение 3,5 часов и концентрировали в вакууме. Неочищенное вещество очищали при помощи хроматографии на силикагеле (30-75% этилацетата/гексан) с получением желтовато-коричневого масла (0,036 г).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 4,78 (уш. с, 1H), 3,46-3,40 (кв., 2H, J=6,6 Гц), 2,79-2,65 (м, 2H).19F ЯМР (CDCl3, 282 МГц) -105,96--106,07 (т, J=15,4 Гц).
Получение 110: 3-(1,1-Диоксидоизотиазолидин-2-ил)-3-метилбутан-2-он
Смесь 2-(2-метилбут-3-ин-2-ил)изотиазолидин-1,1-диоксида (3,500 г, 18,7 ммоль) и оксида ртути(II) (0,810 г, 3,7 ммоль) в метаноле (100 мл) и 2н водном растворе серной кислоты (50 мл) нагревали при 90ºC в течение 3 часов. Реакционную смесь фильтровали через целит и фильтрат концентрировали в вакууме. Остаток обрабатывали водой и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-100% этилацетата/гексан) с получением желаемого продукта в виде желтого масла (1,65 г, 43%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 3,38 (т, 2H, J=6,6 Гц), 3,21 (т, 2H, J=7,5 Гц), 2,42-2,30 (м, 2H), 2,28 (с, 3H), 1,60 (с, 6H).
Получение 111: 2-(2-(2-Метилоксиран-2-ил)пропан-2-ил)изотиазолидин-1,1-диоксид
К перемешиваемой суспензии 60% гидрида натрия в минеральном масле (0,039 г, 1,0 ммоль) в безводном диметилсульфоксиде (5 мл), в атмосфере азота, добавляли триметилсульфоксониййодид (0,214 г, 1,0 ммоль). Смесь перемешивали при 70ºC в течение 1 часа и затем охлаждали до комнатной температуры. Добавляли 3-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-3-метилбутан-2-он (0,100 г, 0,5 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и затем нагревали при 70°C в течение 4 часов. Смесь охлаждали до 0ºC, гасили водой и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-80% этилацетат/гексан) с получением продукта в виде густого масла (0,065 г, 61%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 3,52-3,12 (м, 4H), 2,76 (д, 1H, J=4,5 Гц), 2,54 (д, 1H, J=4,5 Гц), 2,42-2,20 (м, 2H), 1,60 (с, 3H), 1,43 (с, 3H), 1,35 (с, 3H).
Получение 112: N-(1-Метилциклобутил)метансульфонамид
К перемешиваемому раствору 1-метил-циклобутиламингидрохлорида (0,100 г, 0,8 ммоль) в пиридине (1 мл) добавляли метансульфонилхлорид (0,095 мл, 1,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали 2н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением продукта в виде коричневого масла (0,090 г, 67%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,49 (уш. с, 1H), 3,03 (с, 3H), 2,40-2,25 (м, 2H), 2,12-2,00 (м, 2H), 1,95-1,75 (м, 2H), 1,58 (с, 3H).
Получение 113: N-(1-Метилциклопропил)метансульфонамид
К перемешиваемому раствору 1-метилциклопропан-1-амингидрохлорида (0,100 г, 0,9 ммоль) в пиридине (1 мл) добавляли метансульфонилхлорид (0,108 мл, 1,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали 2н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением продукта в виде желтого масла (0,105 г, 76%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,68 (уш. с, 1H), 3,02 (с, 3H), 1,50 (с, 3H), 1,02-0,94 (м, 2H), 0,71-0,64 (м, 2H).
Получение 114: N-(3-Метилциклобутил)метансульфонамид
К перемешиваемому раствору 3-метилциклобутанамингидрохлорида (0,100 г, 0,8 ммоль) в пиридине (1 мл) добавляли метансульфонилхлорид (0,095 мл, 1,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали 2н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением продукта в виде коричневого твердого вещества (0,125 г, 93%). Материал использовали без дальнейшей очистки.
Получение 115: N-(2-Метилциклопентил)метансульфонамид
К перемешиваемому раствору 2-метилциклопентанамингидрохлорида (0,100 г, 0,7 ммоль) в пиридине (1 мл) добавляли метансульфонилхлорид (0,095 мл, 1,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали 2н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением продукта в виде коричневого твердого вещества (0,100 г, 84%). Материал использовали без дальнейшей очистки.
Получение 116: N-(2-Метилаллил)этенсульфонамид
К перемешиваемому раствору 2-метилпроп-2-ен-1-амина (0,500 г, 7,0 ммоль), N,N-диизопропилэтиламина (3,486 мл, 21,1 ммоль) и N,N-4-диметиламинопиридина (0,043 г, 0,4 ммоль) в метиленхлориде (20 мл) при 0ºC медленно добавляли 2-хлорэтансульфонилхлорид (0,734 мл, 7,0 ммоль). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь концентрировали и остаток очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-80% этилацетат/гексан) с получением продукта в виде бесцветного масла (0,59 г, 52%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 6,54 (дд, 1H, J=16,5, 9,6 Гц), 6,27 (д, 1H, J=16,5 Гц), 5,96 (д, 1H, J=9,6 Гц), 4,97 (с, 1H), 4,93 (с, 1H), 4,37 (уш. с, 1H), 3,60 (д, 2H, J=6,3 Гц), 1,79 (с, 3H).
Получение 117: 4-Метил-2,3-дигидроизотиазол-1,1-диоксид
Раствор N-(2-метилаллил)этенсульфонамида (0,700 г, 4,3 ммоль) в безводном метиленхлориде (10 мл) перемешивали в атмосфере аргона и добавляли (1,3-бис(2,4,6-триметилфенил)-2-имидазолидинилиден)дихлор(фенилметилен)(трициклогексилфосфин) рутений (0,02 г). Смесь нагревали при кипении с обратным холодильником и добавляли дополнительные порции (0,02 г каждая) (1,3-бис(2,4,6-триметилфенил)-2-имидазолидинилиден) дихлор(фенилметилен)(трициклогексилфосфин)рутения с интервалом 30 минут, пока в общей сложности не было добавлено 0,1 г (2,5 моль%). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в общей сложности 72 часа, охлаждали до комнатной температуры и концентрировали в вакууме. Неочищенное вещество очищали при помощи хроматографии на силикагеле (0-100% этилацетат/гексан) с получением желаемого продукта в виде коричневого масла (0,380 г, 66%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 6,45 (с, 1H), 4,55 (уш. с, 1H), 3,99 (м, 2H), 2,06 (с, 3H).
Получение 118: 4-Метилизотиазолидин-1,1-диоксид
Смесь 4-метил-2,3-дигидроизотиазол-1,1-диоксида (0,380 г, 2,9 ммоль) и 20% гидроксида палладия на углероде (0,050 г) в метаноле (10 мл) перемешивали в атмосфере водорода в течение 2 часов. Смесь фильтровали через целит и фильтрат концентрировали с получением продукта в виде коричневого масла (0,385 г, 100%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,25 (уш. с, 1H), 3,53 (м, 1H), 3,34 (дд, 1H, J=12,0, 7,5 Гц), 3,05-2,70 (м, 3H), 1,27 (д, 3H, J=6,6 Гц).
Получение 119: N-(1-Метилциклопентил)метансульфонамид
К перемешиваемому раствору 1-амино-1-метилциклопентангидрохлорида (0,165 г, 1,2 ммоль) в пиридине (1 мл) добавляли метансульфонилхлорид (0,169 мл, 2,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и затем концентрировали. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением продукта в виде коричневого масла (0,100 г, 46%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 4,27 (уш. с, 1H), 3,04 (с, 3H), 2,00-1,60 (м, 8H), 1,50 (с, 3H).
Получение 120: N-(3-Метоксициклогексил)метансульфонамид
К перемешиваемому раствору 3-метоксициклогексанамина (0,200 г, 1,5 ммоль) в пиридине (1 мл) добавляли метансульфонилхлорид (0,144 мл, 1,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и затем концентрировали. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением продукта в виде коричневого масла (0,140 г, 44%). Материал использовали без дальнейшей очистки.
Получение 121: N1-Циклобутилэтан-1,2-диамин
К раствору циклобутанона (5,830 г, 83,2 ммоль), этилендиамина (39,711 мл, 594,0 ммоль), уксусной кислоты (34,006 мл, 594,0 ммоль) и 4Ǻ молекулярных сит (25 г) в безводном метаноле (250 мл) добавляли цианоборгидрид натрия (7,466 г, 118,8 ммоль). Смесь перемешивали в течение 48 часов, фильтровали для удаления твердых веществ и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в 3н водном растворе гидроксида натрия (300 мл) и экстрагировали метиленхлоридом (3×500 мл). Объединенные органические слои промывали щелочным насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением неочищенного продукта. Материал отгоняли под вакуумом с получением желаемого продукта в виде прозрачной жидкости (4,8 г, 50%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 3,24-3,17 (м, 1H), 2,76-2,72 (т, 2H, J=6,0 Гц), 2,57-2,53 (тд, 2H, J=0,8, 6,0 Гц), 2,23-2,14 (м, 2H), 1,71-1,58 (м, 4H), 1,22 (уш. с, 3H).
Получение 122: N1-Циклопентилэтан-1,2-диамин
К раствору циклопентанона (2,000 мл, 22,6 ммоль), этилендиамина (10,860 г, 180,7 ммоль), уксусной кислоты (10,345 мл, 180,7 ммоль) и 4Ǻ молекулярных сит (10 г) в безводном метаноле (113 мл) добавляли цианоборгидрид натрия (2,839 г, 45,2 ммоль). Смесь перемешивали в течение 48 часов, фильтровали для удаления твердых веществ и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в 3н водном растворе гидроксида натрия (150 мл) и экстрагировали метиленхлоридом (3×300 мл). Объединенные органические слои промывали щелочным насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением неочищенного продукта. Материал отгоняли под вакуумом с получением желаемого продукта в виде прозрачной жидкости (1,0 г, 35%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 3,08-2,99 (кв., 1H, J=6,8 Гц), 2,80-2,76 (т, 2H, J=5,9 Гц), 2,65-2,61 (т, 2H, J=5,9 Гц), 1,87-1,77 (м, 2H), 1,72-1,60 (м, 2H), 1,57-1,46 (м, 2H), 1,35-1,24 (м, 5H).
Получение 123: N1-Циклогексилэтан-1,2-диамин
К раствору циклогексанона (6,260 г, 63,8 ммоль), этилендиамина (42,640 мл, 637,8 ммоль), уксусной кислоты (36,515 мл, 637,8 ммоль) и 4Ǻ молекулярных сит (25 г) в безводном метаноле (250 мл) добавляли цианоборгидрид натрия (8,017 г, 127,6 ммоль). Смесь перемешивали в течение 48 часов, фильтровали для удаления твердых веществ и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в 3н водном растворе гидроксида натрия (150 мл) и экстрагировали метиленхлоридом (3×300 мл). Объединенные органические слои промывали щелочным насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали с получением неочищенного продукта. Материал отгоняли под вакуумом с получением желаемого продукта в виде прозрачной жидкости (4,1 г, 45%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 2,80-2,76 (тд, 2H, J=0,9, 6,0 Гц), 2,68-2,64 (тд, 2H, J=0,9, 6,0 Гц), 2,43-2,34 (м, 1H), 1,89-1,83 (м, 2H), 1,74-1,70 (м, 2H), 1,62-1,57 (м, 1H), 1,32-0,98 (м, 8H).
Получение 124: 3-(Циклобутиламино)пропаннитрил
При комнатной температуре к раствору акрилонитрила (4,76 г, 89,7 ммоль) в метаноле (7 мл) добавляли по каплям циклобутиламин (5,90 мл, 59,8 ммоль) в течение 15 минут. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут и при кипении с обратным холодильником в течение 1 часа, охлаждали до комнатной температуры, концентрировали при пониженном давлении. Желаемый продукт получали дистилляцией под вакуумом с получением прозрачной жидкости (7,7 г, 98%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 3,29- 3,21 (м, 1H), 2,88-2,83 (т, 2H, J=6,6 Гц), 2,50-2,46 (т, 2H, J=6,6 Гц), 2,26-2,20 (м, 2H), 1,76-1,63 (м, 4H), 1,30 (уш. с, 1H).
Получение 125: N1-Циклобутилпропан-1,3-диамин
К охлажденной (0ºC) суспензии литийалюминийгидрида (3,056 г, 80,5 ммоль) в безводном диэтиловом эфире (120 мл) добавляли раствор 3-(циклобутиламино)пропаннитрила (5,000 г, 40,3 ммоль) в безводном диэтиловом эфире (40 мл), по каплям в течение 45 минут. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут и при кипении с обратным холодильником в течение 4 часов, охлаждали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Смесь охлаждали до 0ºC и энергично перемешивали в то время, как добавляли по каплям воду (3,1 мл), с последующим добавлением 15% водного раствора гидроксида натрия (3,1 мл) и наконец, воды (9,3 мл). Полученную суспензию нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 15 минут и добавляли безводный сульфат магния, перемешивали еще 15 минут. Твердые вещества удаляли при помощи фильтрации, промывали несколько раз теплым метиленхлоридом и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением желаемого продукта в виде светло-желтой жидкости (3,44 г, 66%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) 3,14 (м, 1H), 2,69-2,62 (м, 2H), 2,53-2,45 (м, 2H), 2,13-2,10 (м, 2H), 1,56-1,48 (м, 6H), 1,33 (уш. с, 3H).
Получение 126: 3-(Циклопентиламино)пропаннитрил
При комнатной температуре к раствору акрилонитрила (5,79 мл, 88,1 ммоль) в метаноле (7 мл) добавляли по каплям циклопентиламин (5,794 мл, 58,7 ммоль). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут и при кипении с обратным холодильником в течение 1 часа, охлаждали до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении. Желаемый продукт получали дистилляцией под вакуумом в виде прозрачной жидкости (7,4 г, 91%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 3,14-3,04 (кв., 1H, J=6,3 Гц), 2,91-2,87 (т, 2H, J=6,9 Гц), 2,53-2,48 (тд, 2H, J=0,9, 6,9 Гц), 1,88-1,78 (м, 2H), 1,73-1,49 (м, 4H), 1,36-1,24 (м, 2H), 1,19 (уш. с, 1H).
Получение 127: N1-Циклопентилпропан-1,3-диамин
К охлажденной (0ºC) суспензии литийалюминийгидрида (3,295 г, 86,8 ммоль) в безводном диэтиловом эфире (150 мл) добавляли раствор 3-(циклопентиламино)пропаннитрила (6,000 г, 43,4 ммоль) в безводном диэтиловом эфире (40 мл), по каплям в течение 45 минут. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут и при кипении с обратным холодильником в течение 4 часов, охлаждали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Смесь охлаждали до 0ºC и энергично перемешивали в то время, как добавляли по каплям воду (3,4 мл), с последующим добавлением 15% водного раствора гидроксида натрия (3,4 мл) и наконец, воды (10,2 мл). Полученную суспензию нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 15 минут и добавляли безводный сульфат магния, перемешивали еще 15 минут. Твердые вещества удаляли при помощи фильтрации, промывали несколько раз теплым метиленхлоридом и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением желаемого продукта в виде прозрачного масла (4,5 г, 73%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 3,05-2,96 (кв., 1H, J=6,6 Гц), 2,74-2,71 (т, 2H, J=6,6 Гц), 2,68-2,58 (т, 2H, J=6,9 Гц), 1,85-1,68 (м, 2H), 1,62-1,42 (м, 6H), 1,34 (уш. с, 3H), 1,30-1,21 (м, 2H).
Получения 128-138
Получения 128-138 осуществляли в соответствии со следующей общей процедурой:
К перемешиваемому раствору диамина (1,0 эквив., 0,5 M) в безводном пиридине добавляли сульфамид (1,2 эквив.). Смесь нагревали при 120-125°C в течение 18-24 часов в герметично закрытой пробирке. После охлаждения до комнатной температуры, смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток распределяли между этилацетатом и водой. Органический слой последовательно промывали 1н водным раствором хлористоводородной кислоты (2×), насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением желаемого продукта. Продукты, как правило, использовали непосредственно на следующей стадии без какой-либо дополнительной очистки.
Пример 2: Получение соединений формулы I
Соединение 1: N-(3-(9H-Карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-N-(фуран-2-илметил)метансульфонамид
Метансульфонилхлорид (0,650 мл, 8,4 ммоль) добавляли по каплям в холодный перемешиваемый раствор 1-(9H-карбазол-9-ил)-3-((фуран-2-илметил)амино)пропан-2-ола (2,7 г, 8,4 ммоль) и триэтиламина (1,3 мл, 9,2 ммоль) в безводном метиленхлориде (55 мл), который выдерживали при температуре 0-5°C с внешней ледяной баней. Раствор перемешивали при 0°C в течение 2 часов и затем разбавляли метиленхлоридом и последовательно промывали два раза 0,25н водным раствором хлористоводородной кислоты, водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия. Органические вещества сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (0-10% этилацетат в метиленхлориде) с получением желаемого продукта в виде белого твердого вещества (1,5 г, 45%).1H ЯМР (d6-ДМСО, 300 МГц) δ 8,09-8,06 (д, 2H, J=8,1 Гц), 7,42-7,37 (м, 5H), 7,18-7,14 (м, 2H), 6,37-6,35 (дд, 1H, J=1,8, 3 Гц), 6,31-6,30 (д, 1H, J=3 Гц), 4,52-4,39 (дд, 2H, J=15,9, 24,6 Гц), 4,39-4,30 (дд, 1H, J=3,3, 14,4 Гц), 4,22-4,10 (м, 1H), 4,20-4,05 (уш. м, 1H), 3,40-3,33 (м, 1H) 3,26-3,17 (м, 1H), 2,90 (с, 3H). ESI (m/z): 398,9 (M+H). Анализ ВЭЖХ: (C18, 10-90% ацетонитрил в воде+0,1% трифторуксусная кислота в течение 10 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 8,6 минут, 97,9%.
Соединения 2-12
Соединения 2-12 получали при помощи процедур, аналогичных тем, которые использовали для Соединения 1 или с использованием пиридина (4 эквив.) вместо триэтиламина.
Соединения 13-19
Соединения 13-19 получали при помощи следующей общей методики:
К перемешиваемому раствору 2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-3-(9H-карбазол-9-ил)-N-(фуран-2-илметил)пропан-1-амина (0,100 г, 0,2 ммоль) в безводном пиридине (1 мл) добавляли соответствующий сульфонилхлорид (0,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и смесь концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток обрабатывали водой и экстрагировали этилацетатом (20 мл). Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия и насыщенным водным раствором карбоната натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (0-80% этилацетат в гексане) с получением TBS-защищенного продукта. Продукт растворяли в безводном тетрагидрофуране (5 мл) и добавляли водный раствор тетрабутиламмонийфторида (0,040 г, 0,1 ммоль) в воде. Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и затем концентрировали. Неочищенный остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (0-50% этилацетат в гексане) с получением чистого продукта.
Соединение 20: 1,1-Диоксид N-(3-(9H-карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)изотиазолидина
К перемешиваемому раствору 1,3-пропансултама (0,80 г, 6,6 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (20 мл) добавляли гидрид натрия (60% в минеральном масле, 0,053 г, 1,3 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 9-(оксиран-2-илметил)-9H-карбазол (1,622 г, 7,3 ммоль) и смесь перемешивали при 70°C в течение ночи. После охлаждения, реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали три раза этилацетатом. Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (0-70% этилацетат в гексане) и затем перекристаллизовывали из смеси этилацетат/гексан с получением чистого соединения в виде белого твердого вещества (1,6 г, 70%).1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,10 (д, 2H, J=7,5 Гц), 7,48 (д, 4H, J=3,9 Гц), 7,30-7,22 (м, 2H), 4,55-4,35 (м, 3H), 3,42-3,12 (м, 6H), 2,59 (д, 1H, J=3,0 Гц), 2,37 (м, 2H). ESI (m/z): 344,9 (M+H). Анализ ВЭЖХ: (C18, 10-90% ацетонитрил в воде+0,1% трифторуксусная кислота в течение 10 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 11,8 минут, >98%.
Соединения 21-235
Соединения 21-235 получали при помощи процедур, аналогичных тем, которые использовали для Соединения 20 или с использованием карбоната цезия (1 эквив.) в N,N-диметилацетамиде при 100ºC в течение ночи.
Энантиомерные избытки оптически активных соединений примеров получали при помощи ВЭЖХ с использованием колонки Chiralpak AD-H, 0,46 см×25 см, 0-30 мин. элюирование с 25% изопропанолом в гексане; скорость потока: 1 мл/мин., УФ 254 нМ.
Соединение 236: N-(3-(1-Фтор-9H-карбазол-9-ил)-2-гидроксипропил)-N-(фуран-2-илметил)метансульфонамид
Суспензию 1-фтор-9H-карбазола (0,099 г, 0,54 ммоль) и N-(фуран-2-илметил)-N-(оксиран-2-илметил)метансульфонамида (0,142 g,0,62 ммоль) и карбоната цезия (0,174 г, 0,54 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (1 мл) нагревали при 110°C в течение 30 минут в микроволновом реакторе. Реакционную смесь охлаждали и вливали в воду и этилацетат. Органический слой отделяли, промывали водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (безводный сульфат натрия), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (10-80% этилацетат в гексане) с получением белого твердого вещества (0,103 г, 46%).1H ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 8,08-8,06 (дт, 1H, J=0,9 Гц, 7,5 Гц), 7,88-7,85 (м, 1H), 7,50-7,48 (м, 2H), 7,29-7,27 (м, 1H), 2,24-2,12 (м, 3H), 6,16-6,14 (дд, 1H, J=2,1, 3,3 Гц), 5,97-5,96 (д, 1H, J=3,3 Гц), 4,54-4,31 (м, 5H), 3,51-3,43 (дд, 1H, J=8,3, 14,8 Гц), 3,27-3,22 (дд, 1H, J=3,0, 15 Гц), 2,85 (с, 3H), 2,65-2,64 (д, 1H, J=3,3 Гц). ESI (m/z): 417,1 (M+H), 349,3 (M-Фуран). Анализ ВЭЖХ: (C18, 10-90% ацетонитрил в воде+0,1% трифторуксусная кислота в течение 10 минут: время удерживания, % площади при 254 нм): 9,73 минут, 100%.
Соединения 237-245
Соединения 237-245 получали при помощи процедур, аналогичных тем, которые использовали для Соединения 236.
Конкретные анализы полезный для оценки соединений формулы I включают Per2 Анализ для оценки эффективности испытываемых соединений и Cry1 анализ для оценки мишени испытываемых соединений, как описано ниже.
Пример 3: Per2 Анализ для оценки активности испытываемых соединений
Соединения скринировали с использованием системы циркадного анализа с высокой пропускной способностью, как ранее было описано в Zhang, E. E. et al. Cell, 2009, 139, 199-210. Вкратце, стабильные U2OS репортерные клетки, несущие Per2-dLuc, высевали при плотности 8000 клеток/лунка в 96-луночные микропланшеты Corning, твердые белые, плоскодонные, TC-обработанные (Corning®), и инкубировали в течение 24 часов при 37ºC в присутствии 5% CO2. Клетки затем синхронизировали при помощи сывороточного шока путем обмена среды на минимальную эксплантатную среду (10 мM HEPES (pH 7,0), 2% B27, 1×PSG (Invitrogen®) и 1,0 мM люциферина жука (Promega®)) с последующим добавлением соединений формулы I, растворенных в диметилсульфоксиде (0,5% конечная концентрация диметилсульфоксида). Генную экспрессию контролировали путем измерения люминесценции (Tecan® M200) в течение 4-5 дней при 35ºC. Период, амплитуду и фазу ассоциированных циркадных ритмов определяли с использованием программного обеспечения Multicycle™ (Actimetrics, Inc). Значения EC50 соединений формулы I рассчитывали с использованием программы Graphpad™ (Prism®).
В следующей таблице представлены данные Per2 EC50 для конкретных Примеров. Значения EC50 представлены в виде микромолярной концентрации.
Таблица данных анализа Per2
Специалист в данной области сможет легко оптимизировать этот анализ для определения EC50 данных Per2 для любых соединений, описанных в настоящей заявке.
Пример 4: Cry1 Анализ для оценки мишени испытываемых Соединений
Клетки HEK293 (2,5×106 клеток) обратимо трансфицировали на 6-луночных планшетах при помощи 2 мкг вектора экспрессии Липофектамином 2000. Через 28 часов клетки собирали в охлажденном на льду PBS и повторно суспендировали в 100 мкл инкубационного буфера (50 мM Трис, 50 мM NaCl, 2 мM EDTA, 10% глицерина, 1мM DTT, полный коктейль ингибиторов протеаз, коктейль ингибиторов фосфатаз 1 и 3; pH 8,0). Смесь дополняли при помощи NP-40 (конечная концентрация 1%) и инкубировали на льду в течение 15 минут, с последующим центрифугированием (16000×g) при 4ºC в течение 10 минут. Супернатант использовали для анализов. Векторы экспрессии для 3XFlag-меченого на С-конце mCRY1 были основаны на p3XFLAG-CMV-14 (Sigma).
Cry1::Luc или Luc репортерные клетки HEK293 (1,0×104 клеток) высевали на 384-луночные белые планшеты с твердым дном в концентрации 50 мкл на лунку. Через 24 часа 500 нл соединения (конечная концентрация диметилсульфоксида 1%) наносили на среду. Через 24 часа среду дополняли люциферином (конечная концентрация 1 мМ) и HEPES-NaOH (pH7,2; конечная концентрация 10 мМ) и данные люминесценции записывали каждые 7,5 минут в течение 1 часа при помощи считывающего устройства для микропланшетов. Параметр интенсивности люминесценции рассчитывали при помощи среднего значения интенсивности в ходе эксперимента. Первую точку данных исключали из анализа из-за неустойчивых изменений люминесценции. Интенсивность Cry::Luc нормализовали к Luc интенсивности с получением конечного значения EC50. Значения EC50 соединений формулы I рассчитывали с использованием программы Graphpad™ (Prism®).
В следующей таблице представлены данные Cry1 EC50 для конкретных Примеров. Значения EC50 представлены в виде микромолярной концентрации.
Таблица данных анализа Cry1
Пример 5: Транзиторный анализ устойчивой стабилизации белка CRY1
Клетки HEK293 трансфицировали в 24 луночных планшетах вектором экспрессии млекопитающего (0,5 мкг/лунку), содержащим кДНК, кодирующую полноразмерный CRY1 с С-концевой кодируемой MycDDK меткой (Origene) или FLAG-меткой (Sigma) с использованием Липофектамина 2000 или эквивалентного реагента. Через 24 часа клетки обрабатывали испытываемыми соединениями с достижением конечной концентрации DMSO 1%. Еще через 24 часа клетки лизировали в RIPA буфере (150 мМ NaCl, 1,0% IGEPAL® CA-630 (или NP-40), 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS и 50 мМ Трис, pH 8,0), содержащем смесь ингибиторов протеаз. Буфер для образца в виде белкового геля добавляли к эквивалентным количествам каждого образца и их разделяли на SDS-полиакриламидном геле и электрофоретически переносили на PVDF мембрану. Меченые белки обнаруживали при помощи направленного на метку первичного антитела и вторичного антитела, конъюгированного с HRP. Меченный CRY1 белок выявляли при помощи хемилюминесценции с использованием ECL+ или другого подобного реагента и регистрировали при помощи цифровой камеры в виде RAW файла. Программы Photoshop и ImageJ использовали для количественной оценки отдельных полос. Количество меченого CRY1 белка можно сравнить с общим количеством белка в загруженном образце или с обнаруженным в дальнейшем внутренним контрольным белком, таким как GAPDH. Относительное количество меченого CRY1 белка можно определить путем сравнения образцов клеток, обработанных соединением, с образцами клеток, обработанных DMSO. Увеличение количества меченого CRY1 белка по сравнению с контрольными образцами указывает, что соединение повышает стабильность CRY1. Снижение количества меченого CRY1 белка по сравнению с контрольными образцами указывает, что соединение снижает стабильность CRY1. Описанный выше анализ может быть легко модифицирован и оптимизирован специалистом в данной области техники для измерения или определения уровней эндогенного белка любого из белков, вовлеченных в циркадный ритм и/или CRY-регулируемые пути, например, Cry2, Per1, Per2, CLOCK, BMAL1, TIM белка или VEGF.
Пример 6: Анализ стабильной клеточной линии на устойчивую стабилизацию CRY1 белка
Стабильную клеточную линию, экспрессирующую меченый CRY1 белок, обрабатывали испытываемыми соединениями в течение 24 часов до концентрации DMSO 1%. Еще через 24 часа клетки лизировали в RIPA буфере (150 мМ NaCl, 1,0% IGEPAL® CA-630 (или NP-40), 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS и 50 мМ Трис, pH 8,0), содержащем смесь ингибиторов протеаз. Буфер для образца в виде белкового геля добавляли к эквивалентным количествам каждого образца и их разделяли на SDS-полиакриламидном геле и электрофоретически переносили на PVDF мембрану. Меченые белки обнаруживали при помощи направленного на метку первичного антитела и вторичного антитела, конъюгированного с HRP. Меченный CRY1 белок выявляли при помощи хемилюминесценции с использованием ECL+ или другого подобного реагента и регистрировали при помощи цифровой камеры в виде RAW файла. Программы Photoshop и ImageJ использовали для количественной оценки отдельных полос. Количество меченого CRY1 белка можно сравнить с общим количеством белка в загруженном образце или с обнаруженным в дальнейшем внутренним контрольным белком, таким как GAPDH. Относительное количество меченого CRY1 белка может быть определено путем сравнения образцов клеток, обработанных соединением, с образцами клеток, обработанных DMSO. Увеличение количества меченого CRY1 белка по сравнению с контрольными образцами указывает, что соединение повышает стабильность CRY1. Снижение количества меченого CRY1 белка по сравнению с контрольными образцами указывает, что соединение снижает стабильность CRY1. Описанный выше анализ может быть легко модифицирован и оптимизирован специалистом в данной области техники для измерения или определения уровней эндогенного белка любого из белков, вовлеченных в циркадный ритм и/или CRY-регулируемые пути, например, Cry2, Per1, Per2, CLOCK, BMAL1, TIM белка или VEGF.
Пример 7: Определение периода полураспада CRY1-меченого белка
Транзиторно трансфицированные клетки HEK293 или стабильные клеточные линии, экспрессирующие меченый белок CRY1, подвергали воздействию испытываемых соединений в течение 24 часов и затем подвергали воздействию циклогексимида (1 мкг/мл). Клетки лизировали в RIPA буфере после инкубации от 15 минут до 6 часов. Буфер для образца в виде белкового геля, содержащий SDS, добавляли к эквивалентным количествам каждого образца и их разделяли на SDS-полиакриламидном геле и электрофоретически переносили на PVDF мембрану. Меченые белки обнаруживали при помощи направленного на метку первичного антитела и вторичного антитела, конъюгированного с HRP. Меченный CRY1 белок выявляли при помощи хемилюминесценции с использованием ECL+ или другого подобного реагента и регистрировали при помощи цифровой камеры в виде RAW файла. Программы Photoshop и ImageJ использовали для количественной оценки отдельных полос. Количество меченого белка CRY1 можно сравнить с общим количеством белка в загруженном образце или с обнаруженным в дальнейшем внутренним контрольным белком, таким как GAPDH. Скорость снижения количества меченого CRY1 белка можно сравнить между образцами, обработанными соединением для испытаний, и образцами, обработанными контролем или DMSO. Более быстрая скорость снижения меченого CRY1 белка в образцах, обработанных соединением, по сравнению с контрольными образцами указывает на то, что соединение снижает стабильность CRY1. Более медленное снижение количества меченого CRY1 белка в образцах, обработанных соединением, по сравнению с контрольными образцами указывает на то, что соединение повышает стабильность CRY1. Описанный выше анализ может быть легко модифицирован и оптимизирован специалистом в данной области техники для измерения или определения периода полужизни любого из белков, вовлеченных в циркадный ритм и/или CRY-регулируемые пути, например, Cry2, Per1, Per2, CLOCK, BMAL1, TIM белка или VEGF.
Пример 8: Анализ эндогенного CRY белка
Клетки или ткани подвергали воздействию испытываемых соединений или носителя в течение периода времени от 2 часов до 4 дней до сбора и гомогенизации в RIPA буфере, содержащем смесь ингибиторов протеаз. Буфер для образца в виде белкового геля, содержащий SDS, добавляли к эквивалентным количествам каждого образца и их разделяли на SDS-полиакриламидном геле и электрофоретически переносили на PVDF мембрану. Количества эндогенных белков обнаруживали при помощи специфических антител, направленных на CRY белки, и вторичного антитела, конъюгированного с HRP. Белок CRY выявляли при помощи хемилюминесценции с использованием ECL+ или другого подобного реагента и регистрировали при помощи цифровой камеры в виде RAW файла. Программы Photoshop и ImageJ использовали для количественной оценки отдельных полос. Количество меченого CRY1 белка можно сравнить с общим количеством белка в загруженном образце или с обнаруженным в дальнейшем внутренним контрольным белком, таким как GAPDH. Относительное количество CRY1 белка можно определить путем сравнения образцов клеток или тканей, обработанных соединением, с образцами клеток или тканей, обработанных контролем или DMSO. Увеличение количества CRY1 белка по сравнению с контрольными образцами указывает, что соединение повышает стабильность CRY. Снижение количества CRY белка по сравнению с контрольными образцами указывает, что соединение снижает стабильность CRY. Описанный выше анализ может быть легко модифицирован и оптимизирован специалистом в данной области техники для измерения или определения периода полужизни любого из белков, вовлеченных в циркадный ритм и/или CRY-регулируемые пути, например, Cry2, Per1, Per2, CLOCK, BMAL1, TIM белка или VEGF.
Все документы, процитированные в данной заявке, включая научные публикации, патенты и патентные заявки, включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте.
Реферат
Изобретение относится к карбазолсодержащим сульфонамидным производным формулы I и их фармацевтически приемлемым солям, а также к фармацевтическим композициям, включающим соединение формулы I, для лечения Cry-опосредованного заболевания или расстройства, такого как диабет, ожирение, метаболический синдром, синдром Кушинга и глаукома. Также предложены способы лечения, облегчения и мониторинга Cry-опосредованных заболеваний или расстройств у субъекта. 5 н. и 34 з.п. ф-лы, 4 табл., 8 пр.
Формула
Документы, цитированные в отчёте о поиске
Производные тетрагидрокарбазолов, способ их получения и фармацевтические композиции, содержащие их
