Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая ионное соединение, имеющее связь с ионом металла - RU2780016C1

Чертежи

Показать все 18 чертежа(ей)

Описание

[Область техники]

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения рака. Более конкретно, оно относится к фармацевтической композиции для лечения рака, которая: содержит ионное соединение, в котором два соединения, выбранные из аскорбиновой кислоты, дихлоруксусной кислоты и лактата, скомбинированы с одним ионом металла; имеет улучшенный терапевтический эффект за счет перекрытия и комплексных нарушений метаболизм раковых клеток, поскольку различные соединения одновременно поглощаются раковыми клетками, и каждое действует через различные механизмы на раковые клетки, по сравнению с традиционными лекарственными средствами против рака, сфокусированными на одну специфическую мутацию или сигнал роста раковой клетки; и может более эффективно ингибировать пролиферацию, инвазию и метастаз раковых клеток, поскольку оно менее чувствительно к лекарственному средству.

[Уровень техники]

В целом, существует три способа лечения рака: хирургическая операция, лучевая терапия и химиотерапия. Каждый способ может использоваться независимо для лечения рака или может использоваться комбинация двух или более способов. Многие ранние стадии рака можно лечить путем хирургической операции, однако если рак прогрессирует или распространяется, самой по себе хирургической операции недостаточно для лечения, и другие способы должны быть использованы совместно. Лучевая терапия используется для лечения областей, с которыми трудно работать во время хирургического вмешательства, или типов рака, которые особенно восприимчивы к облучению, и может использоваться в комбинации с лекарственными препаратами перед или после хирургического вмешательства. Однако лучевая терапия обладает недостатками, заключающимися в том, что она приводит к повреждению нормальной кожи на локальном участке, являясь побочным эффектом от излучения высокой энергии, и в случае метастатического рака, раковые стволовые клетки являются стойкими к облучению, и происходит последующий рецидив или метастаз. Для лечения рака с высокой смертностью, первым приоритетом является хирургическое лечение, противораковая терапия лекарственными средствами или лучевая терапия, которые возможны на ранних и промежуточных стадиях рака. Однако текущие терапии рака в целом имеют различные побочные эффекты, заключающиеся в том, что, например, они могут лечить только рак на ранней стадии или имеют высокую вероятность рецидива и разрушают нормальные клетки вместе с раковыми клетками. В частности, в случае пациентов с раком на серьезной конечной стадии, побочные эффекты агрессивной терапии могут быть более острыми. Таким образом, зачастую выбирают способы лечения, которые замедляют прогрессирование раковых клеток для снижения побочных эффектов и повышения качества жизни.

В целом, химиотерапия является способом разрушения или ингибирования ДНК, или связанных ферментов, необходимых для пролиферации раковых клеток, путем введения лекарственных средств перорально или путем инъекции. Химиотерапия используется в качестве стандартной терапии для лечения метастатического рака и заключается в том, что она может доставлять лекарственные средства в область рака и лечить метастатический рак в любой части тела, по сравнению с лучевой терапией или хирургической операцией. Безусловно, химиотерапия не может полностью вылечить метастатический рак, однако она играет важную роль в смягчении симптомов, улучшении качества жизни и продлении жизни пациента. Однако большинство химиотерапевтических лекарственных средств имеют проблему, заключающуюся в том, что они воздействуют не только на раковые клетки, но также и на нормальные клетки, особенно на костный мозг, волосяные фолликулы и желудочно-кишечные эндотелиальные клетки, которые разрастаются в теле человека. Таким образом, пациенты, страдающие от рака, которые подвергаются лечению лекарственными средствами, могут иметь побочные эффекты, такие как бактериальная инфекция, спонтанное кровотечение, потеря волос, тошнота и рвота, вызванные снижением лейкоцитов и тромбоцитов, которые являются иммунными клетками, продуцируемыми в костном мозге. Кроме того, устойчивость к лекарственным средствам сперва казалась эффективной, но в конечном итоге не имела успеха при лечении. Иммунная химиотерапия, являющаяся индивидуализированной терапией, которая использует родовую технологию для усиления иммунитета для лечения рака, обладает недостатками, заключающимися в том, что устранить раковые клетки не просто только за счет иммунной функции ввиду повышенной активности раковых клеток на прогрессирующей стадии рака, и она не является эффективной для пациентов, иммунная система которых слишком повреждена, и пациентов, которые не экспрессируют слишком много PD-1 (белок, присутствующий на поверхности активированных Т-клеток). Кроме того, иммунная химиотерапия имеет потенциал по обеспечению неожиданных недостатков, например, поскольку массовое производство не возможно, требуются значительные затраты, и пациенты погибают в ходе клинических исследований.

Недавно стал увеличиваться выпуск нацеленных лекарственных средств против рака, которые выборочно убивают только раковые клетки, при этом снижая побочные эффекты существующих лекарственных средств против рака и защищая нормальные клетки. Однако ввиду того, что они атакуют только некоторые факторы процесса продуцирования рака, они обладают недостатком, заключающимся в том, что даже в случае раков одного и того же типа, они являются эффективными только для пациентов со специфическими мишенями. В течение многих лет были разработаны многие лекарственные средства против рака для лечения рака, которые основаны на регуляции ингибирования характеристик раковых клеток, таких как непрерывная клеточная пролиферация и метастаз. Однако разработка лекарственных средств против рака, которые эффективно ингибируют пролиферацию раковых клеток, управляемую сложной сетью путей сигналинга, по-прежнему остается проблематичной.

Существует срочная потребность в разработке новых терапий, которые были бы легко применимы для лечения раковых заболеваний и которые обеспечивали бы эффективное лечение с минимальным воздействием на нормальные ткани.

Для ее удовлетворения, в недавнее время внимание было привлечено к новому метаболическому лекарственному средству против рака, использующему свойственные метаболические характеристики раковых клеток. Разработка технологий генной инженерии и молекулярной биологии в 1970-ых годах привела к выявлению мутаций, вызывающих рак, и хромосомных аномалий, и исследования рака были сфокусированы на генетических причинах рака. Уникальный метаболический путь рака не изучался в течение длительного времени, поскольку он рассматривается в качестве побочного эффекта развития рака, а не в качестве причины рака. Однако ввиду того, что мутации в генах и различных метаболитах, связанных с раковыми метаболическими сигналами, продемонстрировали себя, как напрямую индуцирующие рак, достижения в биотехнологии обеспечили возможность анализа метаболитов, метаболических путей в раковых клетках, которые повторно рассмотрены в качестве мощных противораковых мишеней для лечения рака. Сперва, Отто Варбургом, который является немецким биохимиком и обладателем Нобелевской премии, было выявлено, что раковые клетки используют метаболический путь, отличный от нормальных клеток, и он объявил, что раковые клетки используют метаболический путь глюкозы через новый путь, аэробный гликолиз (эффект Варбурга).

Нормальные клетки продуцируют энергию путем полного окисления глюкозы до воды и углекислого газа путем окислительного фосфорилирования в присутствии кислорода, тогда как раковые клетки выбирают путь для окисления глюкозы до пирувата, а затем восстанавливают пируват до лактата (молочной кислоты) в дефицитной по кислороду среде (гипоксия). Таким образом, было обнаружено, что раковые клетки потребляют меньше кислорода чем нормальные клетки, и путем выявления наличия огромных количеств лактата в асцитах пациентов с раком, раковые клетки используют специфический метаболический путь, который продуцирует АТФ через гликолиз, потребляя избыточные количества глюкозы, в отличие от нормальных клеток для продуцирования лактата в избытке.

Во многих случаях, раковые клетки, особенно клетки солидного рака, используют аэробный гликолиз в качестве метаболического пути для продуцирования источников энергии (АТФ), среди которых механизмы включают в себя митохондриальные дефекты и дисфункции, адаптация опухолей к микросреде гипоксии, индуцированные раком пути сигналинга и аномальная экспрессия метаболических ферментов. Эффект Варбурга также может быть результатов адаптации раковых клеток к микросреде гипоксии. Среда гипоксии стабилизирует HIF1 (фактор транскрипции, индуцируемый тогда, когда клетки не имеют кислорода) и индуцирует его активацию в качестве фактора транскрипции путем ингибирования убиквитинированной протеосомальной деградации HIF1. С другой стороны, экспрессия белка-переносчика глюкозы типа 1 (GLUT1) индуцируется HIF1 для поддержания притока глюкозы в раковые клетки, а транспортер монокарбоксилата (MCT4), также являющийся прямой мишенью HIF1, вызывает высвобождение лактата изнутри раковых клеток наружу лактатдегидрогеназой А (LDHA), которая преобразует пируват в лактат. Кроме того, HIF1 индуцирует экспрессию киназы пируватдегидрогеназы, которая ингибирует пируватдегидрогеназу (PDH), являющуюся ферментом, который преобразует пируват в ацетил-Co, тем самым закрывая путь к окислительному фосфорилированию. Таким образом, HIF1 является очень важным фактором, который индуцирует эффект Варбурга через прямой контроль экспрессии различных факторов, связанных с притоком глюкозы и гликолизом.

Между тем, раковые клетки быстро высвобождают лактат, являющийся конечным продуктом аэробного гликолиза, для предотвращения самостоятельного окисления. Высвобожденный лактат деактивирует цитокин, который продуцируется в цитотоксических Т- и дендритных клетках и играет важную роль в противораковых эффектах, ингибирует экспрессию NKp46 (рецептора распознавания природной клетки-киллера (NK-клетки)), активатора природных клеток-киллеров, а также промотирует продуцирование подавляющих иммунитет веществ, тем самым ингибируя апоптоз раковых клеток. Кроме того, эндотелиальные клетки вокруг раковых клеток индуцируют экспрессию IL-8 (белка, действующего в качестве хемоаттрактанта, который активирует воспалительные клетки и привлекает их к воспаленному участку) и VEGF (фактора роста сосудистого эндотелия) путем включения высвобожденного лактата, а также промотируют миграцию эндотелиальных клеток, тем самым индуцируя ангиогенез. Это метаболическое перепрограммирование раковых клеток является эволюционно выбранной стратегией метаболической трансформации для продуцирования предшественников, таких как нуклеотиды, липиды и аминокислоты, которые необходимы для синтеза клеточных компонентов быстро растущих раковых клеток, а не просто продуцирующих АТФ, и следует понимать, что непрерывно растущие раковые клетки стратегически используют этот метаболический путь. В результате, развитие рака за счет существующих различных карциногенных факторов, которые индуцируют формирование и рост рака, тесно связано с метаболизмом раковой клетки, и перепрограммирование клеточного метаболизма может быть важной противораковой мишенью для эффективного лечения рака. Для выборочного удаления опухолей за счет понимания этого специфического метаболического сигнала раковых клеток, осуществлялась интенсивная разработка лекарственных средств, нацеленных на метаболизм, для контроля метаболизма глюкозы у раковых клеток. В частности, проводится разработка лекарственных средств против рака с использованием различных лекарственных средств, которые ранее использовались при заболеваниях метаболизма глюкозы и инфекционных заболеваниях.

[Документы уровня техники]

[Патентные документы]

(Патентный документ 1) Выложенный опубликованный патент республики Корея № 10-2016-0082918 (2016. 07. 11.)

(Патентный документ 2) Выложенный опубликованный патент США № US2011/0117210 (2011. 05. 19.)

(Патентный документ 3) Выложенный опубликованный патент республики Корея № 10-2005-0058278 (2005. 06. 16.)

[Раскрытие]

[Техническая проблема]

В результате различных исследований, направленных на понимание метаболических сигналов, специфических для раковых клеток, а также на разработку терапевтических средств и способов лечения, нацеленных на рак, которые могут выборочно удалять опухоли, авторами настоящего изобретения было реализовано настоящее изобретение благодаря выявлению того, что пролиферация, инвазия, метастаз и подобное у раковых клеток могут быть эффективным образом сдержаны в случае использования ионного соединения, в котором два соединения, выбранные из аскорбиновой кислоты, дихлоруксусной кислоты и лактата, скомбинированы с одним ионом металла, выбранного из Ca, Zn, Mg и Fe.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в представлении фармацевтической композиции для лечения рака, которая содержит ионное соединение, в котором два соединения, выбранные из аскорбиновой кислоты, дихлоруксусной кислоты и лактата, скомбинированы с одним ионом металла, выбранного из Ca, Zn, Mg и Fe, в качестве активного ингредиента.

[Техническое решение]

Для решения указанных выше задач, авторы настоящего изобретения сфокусировались на основных метаболических путях, уникальных для раковых клеток, для разработки способов для эффективного ингибирования пролиферации и метастаза раковых клеток.

Первым значимым метаболическим путем раковых клеток является аэробный гликолиз. Раковые клетки в основном используют аэробный гликолиз, который не требует кислород, вместо окислительного фосфорилирования, являющегося процессом энергетического метаболизма, который требует кислород. Таким образом, раковые клетки могут выжить в среде гипоксии, такой как солидные формы рака, в которой нормальные клетки выжить не могут, и при этом деактивируются процессы контроля апоптоза, исходящие от митохондрий.

Второй значимый метаболический путь раковых клеток включает большие количества лактата, продуцируемые посредством аэробного гликолиза. Лактат быстро высвобождается из раковых клеток для предотвращения окисления самих раковых клеток и делает кислой среду, окружающую раковые клетки (ацидоз). Окисленная среда ингибирует активность NK- и CTL-клеток, и, в конечном итоге, индуцируются ангиогенез, метастаз раковых клеток и подавление иммунитета.

В-третьих, было отмечено, что кальций играет важную роль в буферировании цитозольного кальция, что является существенным фактором для выживания и пролиферации раковых клеток, а также оказывает существенное влияние на апоптоз и аутопатию в клетках, вовлеченных в продуцирование активных форм кислорода. В частности, известно, что в раковых клетках поддерживаются низкие концентрации кальция. Снижение поступления кальция в митохондрии в раковых клетках ингибирует пролиферацию раковой клетки ввиду истощения энергии, при этом повышение поступления кальция перегружает митохондрии и убивает раковые клетки. Таким образом, было отмечено, что раковые клетки реагируют на кальций более чувствительно чем нормальные клетки, и при разрушении гомеостаза кальция в раковых клетках, раковые клетки умирают после ингибирования пролиферации раковой клетки.

В настоящем изобретении представлена фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая ионное соединение, эффективно воздействующее на основные метаболические пути, специфические для таких раковых клеток, в котором два соединения, выбранные из аскорбиновой кислоты, дихлоруксусной кислоты и лактата, скомбинированы с одним ионом металла, выбранного из Ca, Zn, Mg и Fe.

[Полезные эффекты]

Фармацевтическая композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, может быть использована в качестве метаболического лекарственного средства против рака, содержащего ионное соединение, в котором два соединения, выбранные из аскорбиновой кислоты, дихлоруксусной кислоты и лактата, скомбинированы с одним ионом металла, выбранного из Ca, Zn, Mg и Fe, в качестве активного ингредиента, и она может эффективным образом подавлять пролиферацию раковых клеток.

Кроме того, поскольку фармацевтическая композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, содержит соединения, имеющие различные механизмы, такие как соединения для ингибирования роста раковой клетки и соединения для ингибирования метастаза раковых клеток, она может одновременно воздействовать на основные метаболические ферменты, вызывая перекрытие и комплексные нарушения метаболизма раковой клетки, в результате оказывая свои эффекты одновременно на клеточном уровне в отличие от традиционных лекарственных средств против рака, которые сфокусированы на одной специфической мутации или блокировании метаболических процессов.

Кроме того, фармацевтическая композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой ионное соединение, которое может усилить поглощение у раковых клеток при введении в тело.

Кроме того, фармацевтическая композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, улучшает поглощение у раковых клеток путем преобразования кислых соединений в нейтральные соли металла, является менее чувствительной к стойкости к лекарственным средствам, а также может эффективно ингибировать действие раковых клеток, такое как пролиферация, инвазия и метастаз.

Кроме того, в настоящем изобретении может быть представлен способ лечения рака и способ подавления метастаза рака с использованием фармацевтической композиции для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, в настоящем изобретении может быть представлена пищевая композиция для подавления метастаза рака или для облегчения рака, содержащая фармацевтическую композицию для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, фармацевтическая композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, обладает слабыми побочными эффектами в теле, так что она может быть использована в качестве пищевой добавки и может вводиться в высоких дозах.

[Описание чертежей]

ФИГ. 1a представляет собой график, на котором показана концентрация кальция в раковых клетках, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3.

ФИГ. 1b представляет собой изображение, на котором показан кальций в раковых клетках, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3.

ФИГ. 2 представляет собой график, на котором показана концентрация лактата в раковых клетках, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3.

ФИГ. 3 представляет собой график, на котором показана концентрация лактата, высвобожденного из раковых клеток, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3.

ФИГ. 4 представляет собой график, на котором показана концентрация аскорбиновой кислоты, обработанной кальциевыми солями из Примеров 1 и 2 и Сравнительных Примеров 1 и 2.

ФИГ. 5 представляет собой график, на котором показано pH в раковых клетках, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3.

ФИГ. 6 представляет собой график, на котором показана концентрация пирувата в раковых клетках, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3.

ФИГ. 7 представляет собой график, на котором показана концентрация α-KG в раковых клетках, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3.

ФИГ. 8 представляет собой график, на котором показаны уровни экспрессии PARP, β-катенина, VEGF и β-актина, экспрессированных из раковых клеток, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3.

ФИГ. 9 представляет собой график, на котором показан уровень экспрессии активного кислорода, экспрессированного из раковых клеток, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3.

ФИГ. 10 представляет собой график, на котором показан апоптоз раковых клеток, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3.

ФИГ. 11 представляет собой изображение, подтверждающее колониеобразующую способность, путем обработки кальциевыми солями из Примеров 1-3 линий клеток рака толстой и прямой кишки.

ФИГ. 12 представляет собой график, подтверждающий колониеобразующую способность, путем введения солей кальция из Примеров 1-3 в комбинации с традиционным лекарственным средством против рака 5-FU в линии клеток рака толстой и прямой кишки.

ФИГ. 13 представляет собой график, подтверждающий эффект совместной доставки путем обработки кальциевыми солями из Примера 1 и лекарственным средством против рака 5-FU вместе в HCT-116, линию клеток рака толстой и прямой кишки.

ФИГ. 14 представляет собой график, подтверждающий эффект совместной доставки путем обработки кальциевыми солями из Примера 2 и лекарственным средством против рака 5-FU вместе в HCT-116, линию клеток рака толстой и прямой кишки.

ФИГ. 15 представляет собой график, подтверждающий эффект совместной доставки путем обработки кальциевыми солями из Примера 1 и лекарственным средством против рака SN-38 вместе в HCT-116, линию клеток рака толстой и прямой кишки.

ФИГ. 16 представляет собой график, подтверждающий эффект совместной доставки путем обработки кальциевыми солями из Примера 2 и лекарственным средством против рака SN-38 вместе в HCT-116, линию клеток рака толстой и прямой кишки.

ФИГ. 17 представляет собой график, подтверждающий эффект совместной доставки путем обработки кальциевыми солями из Примера 1 и лекарственным средством против рака паклитакселем вместе в HCT-116, линию клеток рака толстой и прямой кишки.

ФИГ. 18 представляет собой график, подтверждающий эффект совместной доставки путем обработки кальциевыми солями из Примера 2 и лекарственным средством против рака паклитакселем вместе в HCT-116, линию клеток рака толстой и прямой кишки.

ФИГ. 19а представляет собой результаты визуализации, полученные после инъекции солей кальция из Примера 1 в мышиную модель (ортотопическую модель DLD-1) и рассечения спустя 1 неделю, а ФИГ. 19B представляет собой график, на котором показан вес раковой ткани после рассечения спустя 1 неделю после введения солей кальция из Примера 1 в мышиную модель (ортотопическую модель DLD-1).

ФИГ. 20 представляет собой изображение степени насыщенности роста, полученное к дате люминесцентной визуализации, после введения солей кальция, согласно Примерам 1-3, в мышиную модель с имплантированными в легкие клетками A549/LUC.

ФИГ. 21 представляет собой график, на котором показано изображение с ФИГ. 20, путем измерения изучаемой области (ROI), которая является программой «IVIS spectrum» (Xenogen).

ФИГ. 22 представляет собой график, на котором показан коэффициент выживаемости, измеренный после введения солей кальция, согласно Примерам 1-3, в мышиную модель с имплантированными в легкие клетками A549/LUC.

[Наилучший вариант реализации]

В настоящем изобретении представлена фармацевтическая композиция для лечения рака, которая содержит ионное соединение, в котором два соединения, выбранные из аскорбиновой кислоты, дихлоруксусной кислоты и лактата, скомбинированы с одним ионом металла, выбранного из Ca, Zn, Mg и Fe, в качестве активного ингредиента.

Аскорбиновая кислота (L-аскорбиновая кислота) представляет собой витамин C, который уже был идентифицирован, как нетоксичное лекарственное средство против рака, в исследовании Лайнуса Поулинга, являющегося лауреатом Нобелевской премии. Кроме того, аскорбиновая кислота не демонстрирует какую-либо конкретную токсичность даже при введении в тело человека в избытке (50 г или более), и ее глюкозоподобная структура может конкурентно ингибировать добавление глюкозы у раковых клеток. Между тем, чрезмерная доза аскорбиновой кислоты может индуцировать некроз раковых клеток путем сброса глутатиона или НАДФН в раковых клетках и генерирования реактивных форм кислорода (ROS). Кроме того, аскорбиновая кислота индуцирует дифференциацию раковых клеток в нормальные клетки и ингибирует распространение раковых клеток в пери-раковые ткани через синтез коллагена и блокирование ферментов, которые способствуют метастазу рака. Кроме того, она может разрушать клеточные мембраны и снижать раковую боль за счет попадания в раковые клетки, повышать иммунитет путем детоксикации важных органов пациентов с раком, а также ингибировать неоваскуляризацию рака. Кроме того, она может играть важную роль в профилактике и лечении рака путем повышения эффективности других способов лечения рака лекарственными средствами и лучевой терапией, а также снижении побочных эффектов.

Между тем, при низких концентрациях аскорбиновой кислоты не наблюдается апоптоз раковых клеток, однако на стадии G1 раковых клеток ингибируется полный рост, повышается уровень p53, ингибируется активность CDK2, а также может быть снижена активация p38MARK и экспрессия COX-2.

При высоких концентрациях аскорбиновой кислоты представляется возможным индуцирование апоптоза в раковых клетках путем снижения потенциала митохондриальной мембраны, снижения экспрессии Tf-транспортеров, снижения поглощения железа и повышения реактивных форм кислорода (ROS) в раковых клетках.

При комбинации аскорбиновой кислоты с ионом подходящего металла, ее стабильность в теле увеличивается, а также повышается ее поглощение раковыми клетками. Таким образом, она является более эффективной чем противораковый эффект имеющейся аскорбиновой кислоты и может индуцировать апоптоз раковых клеток даже при относительно низких концентрациях.

В целом, в состоянии гипоксии, в раковых клетках активируется гипоксия-индуцируемый фактор-1 (HIF-1) для экспрессии киназы пируватдегидрогеназы, и комплекс пируватдегидрогеназы ингибируется экспрессированной пируваткиназой. В результате, пируват не преобразуется в ацетил-КоА, что приводит к накоплению пирувата и снижению энергентического синтеза митохондрий. Таким образом, при накоплении пирувата в избытке, пируват преобразуется в лактат, вызывая накопление лактата вокруг раковых клеток. Вкратце, когда раковые клетки становятся гипоксическими, накопление лактата начинается с экспрессии пируваткиназы.

Дихлоруксусная кислота не является токсичной и может блокировать путь аэробного гликолиза, описанный выше. Кроме того, накопление лактата может быть подавлено путем ингибирования экспрессии пируваткиназы. Кроме того, реконституция цикла трикарбоновых кислот (цикла ЦТК) может индуцировать перепрограммирование метаболизма глюкозы (т.е. нормализацию митохондриального метаболизма) путем ускорения митохондриального дыхания.

С другой стороны, за счет комбинации с ионом подходящего металла, дихлоруксусная кислота может убить раковые клетки путем улучешния противоракового эффекта имеющейся дихлоруксусной кислоты, а также индуцирования нормализации митохондриального метаболизма и реактивных форм кислорода (ROS).

Кроме того, за счет комбинации с ионом подходящего металла, дихлоруксусная кислота может ингибировать ацидоз опухоли путем снижения накопления лактата.

Лактат индуцирует молочную кислоту, D-лактат и L-лактат, и этом означает, что он включает D-молочную кислоту и L-молочную кислоту.

За счет комбинации лактата с ионом подходящего металла, лактат в раковых клетках может быть избыточно накоплен для активации L-лактатдегидрогеназы B (LDHB; фермента, который преобразует лактат или молочную кислоту в пируват, и, в то же время, фермента, который преобразует НАД+ в НАДН) или для ингибирования L-лактатдегидрогеназы A (LDHA; фермента обратной реакции LDHB), тем самым ингибируя экспрессию монокарбоксилатных транспортеров (MCT).

В настоящем документе «ингибирование LDHA» или «активация LDHB» относится к преобразованию лактата в пируват. Кроме того, «ингибирование экспрессии MCT» означает ингибирование экспрессии MCT, вовлеченного в приток и сброс лактата, тем самым активируя экспрессию NKp46 и активируя апоптоз раковых клеток.

Кроме того, за счет комбинации лактата с ионом подходящего металла, она может быть введена в раковые клетки для окисления внутри с целью индуцирования апоптоза.

Ион металла может быть одним, выбранным из Ca, Zn, Mg и Fe. Предпочтительно, ион металла представляет собой Ca, Mg или Fe, и более предпочтительно, ион Ca²⁺, но не ограничиваясь этим.

В этом случае, ион Ca²⁺ (ион кальция) воздействует на гомеостаз кальция в раковых клетках. Он может генерировать избыточный реактивный кислород в раковых клетках путем индуцирования накопления кальция в митохондриях, а также может вызвать апоптоз раковых клеток посредством сгенерированного реактивного кислорода.

Более конкретно, в митохондриях, которые ответственны за продуцирование энергии раковых клеток, кальций связывается непосредственно с дегидрогеназой альфа-кетоглутарата и является важным фактором для нормальной работы цикла ЦТК. Известно, что потеря гомеостаза кальция особенно важна для уменьшения раковых клеток. Когда концентрация кальция избыточно повышается в раковых клетках, происходит активация эндонуклеазы и многих протеаз. Это приводит к нарушению митохондриального метаболизма, высвобождению цитохрома С, активации каспазы 9 и последующей активации каспазы 3 и каспазы 7. Это приводит к апоптозу.

Здесь, «ионное соединение» относится к соединению, в котором ионы с противоположными зарядами вследствие электростатических сил формируются через ионные связи, и это соединение в целом проявляет электрическую нейтральность.

Ионное соединение, содержащееся в фармацевтической композиции, в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно, может представлять собой любую одну из кальциевых солей аскорбиновой кислоты и дихлоруксусной кислоты, кальциевых солей аскорбиновой кислоты и лактата, кальциевых солей дихлоруксусной кислоты и лактата, магниевых солей аскорбиновой кислоты и дихлоруксусной кислоты, магниевых солей аскорбиновой кислоты и лактата, магниевых солей дихлоруксусной кислоты и лактата, железистых солей аскорбиновой кислоты и дихлоруксусной кислоты, железистых солей аскорбиновой кислоты и лактата, и железистых солей дихлоруксусной кислоты и лактата. Более предпочтительно, оно может представлять собой любую одну из кальциевых солей аскорбиновой кислоты и дихлоруксусной кислоты, кальциевых солей аскорбиновой кислоты и лактата, кальциевых солей дихлоруксусной кислоты и лактата, но не ограничиваясь этим.

Здесь, «кальциевые соли» относятся к ионным соединениям, полученным или синтезированным в форме соединений, скомбинированных с ионами кальция, «магниевые соли» относятся к ионным соединениям, полученным или синтезированным в форме соединений, скомбинированных с ионами магния, а «железистые соли» относятся к ионным соединениям, полученным или синтезированным в форме соединений, скомбинированных с ионами железа.

Фармацевтическая композиция, в соответствии с настоящим изобретением, может быть использована для лечения в комбинации с лучевой терапией или лекарственным средством против рака. В целом, она снижает экспрессию PARP, HIF-1α и VEGF, которые придают раковой клетке устойчивость к облучению в случае лучевой терапии. Таким образом, в случае введения композиции в комбинации с лучевой терапией, она улучшает противораковую активность облучения. Таким образом, представляется возможным получение эквивалентного противоракового эффекта при пониженном количестве облучения по сравнению с традиционным способом. В этом случае, доза облучения, которая может быть использована, не ограничивается конкретным образом, но может составлять от 2 до 10 Гр в сутки. Облучение может излучаться один раз в сутки или в течение нескольких суток путем разделения дозы.

Фармацевтическая композиция, в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит ионное соединение, в котором два соединения, выбранные из аскорбиновой кислоты, дихлоруксусной кислоты и лактата, скомбинированы с одним ионом металла, выбранного из Ca, Zn, Mg и Fe, может одновременно поглощаться в раковых клетках для обеспечения ее эффективности одновременно без снижения действия соответствующих противораковых эффектов двух соединений. Эти эффекты могут превосходить комбинационную терапию с традиционными лекарственными средствами против рака.

С другой стороны, при совместном введении фармацевтической композиции, в соответствии с настоящим изобретением, и лекарственного средства против рака, противораковый эффект может превосходить таковой при введении отдельно лекарственного средства против рака.

В этом случае, лекарственное средство против рака, которое может вводиться в комбинации с фармацевтической композицией, в соответствии с настоящим изобретением, не ограничивается конкретным образом до тех пор, пока оно не вовлечено непосредственно в общий метаболизм раковой клетки. Например, лекарственное средство против рака может представлять собой известные лекарственные средства против рака, такие как Иматиниб, 5-Фторурацил (5-FU), Иринотекан, Сунитиниб, Оксалиплатин, Паклитаксел, Лапатиниб, Трастузумаб (Герцептин), Гефитиниб, Эрлотиниб, Метотрексат, Карбоплатин, Доцетаксел, Эверолимус, Сорафениб, ингибитор карбоангидразы, ингибитор монокарбоксилатного транспортера, Пембролизумаб, Атезолизумаб, лекарственное средство против рака семейства PD-1, Ниволумаб, ингибитор поли(АДФ-рибоза)-полимеразы 1 (PARP-1), ингибитор поли(АДФ-рибоза)-полимеразы 2 (PARP-2), Олапариб, Рукапариб, Нирапариб, Бевацизумаб и ингибитор VEGF, а также другие лекарственные средства против рака, которые обладают известной противораковой активностью.

В настоящем изобретении рак может представлять собой рак, пролиферация, инфильтрация, метастаз и т.п. которого может быть подавлено путем нарушения его метаболизма. Например, он может представлять собой рак легких, рак молочной железы, рак толстой и прямой кишки, рак желудка, рак головного мозга, рак поджелудочной железы, рак щитовидной железы, рак кожи, рак костного мозга, лимфому, рак матки, рак шейки матки, рак почки и меланому.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в форме фармацевтической композиции для лечения рака, которая дополнительно содержит подходящие носители, вспомогательные вещества или разбавители, которые в целом используются при приготовлении фармацевтической композиции. В частности, фармацевтическая композиция может быть составлена в соответствии с традиционным способом в пероральные дозированные формы, такие как порошок, гранула, таблетка, капсула, суспензия, эмульсия, сироп, аэрозоль и накладка для перорального приема, наружный препарат, пластырь для наружного применения, суппозиторий и стерильные растворы для инъекций.

В настоящем изобретении, носители, вспомогательные вещества и разбавители, которые могут содержаться в фармацевтической композиции, могут представлять собой лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбитол, маннитол, ксилитол, эритритол, мальтитол, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, аморфную целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и т.п. При составлении, она может быть приготовлена с использованием разбавителей или вспомогательных веществ, таких как наполнители, объемообразующие вещества, связующие, смачивающие вещества, разрыхлители и поверхностно-активные вещества, находящиеся в широком применении. Твердые составы для перорального приема могут включать в себя таблетки, средства пролонгированного действия, пилюли, порошки, гранулы, капсулы, накладки для перорального приема и т.п. Твердые составы могут быть приготовлены путем смешивания по меньшей мере одного вспомогательного вещества, например, крахмала, карбоната кальция, сахарозы или лактозы, желатина и т.п. с его экстрактами и фракциями. Кроме того, в дополнение к таким общим вспомогательным веществам, также могут быть использованы лубриканты, такие как стеарат магния или тальк. Жидкие составы для перорального приема могут включать в себя суспензии, растворы для внутреннего применения, эмульсии, сиропы и т.п. В дополнение к общим разбавителям, таким как вода и жидкий парафин, также могут быть включены различные вспомогательные вещества, такие как смачивающие вещества, вкусовые добавки, ароматические добавки, консерванты и т.п. Составы для парентерального введения могут включать в себя стерильные водные растворы, неводные растворители, суспензии, эмульсии, лиофилизированные препараты, накладки для наружного применения или суппозитории. Неводные растворители и суспензии могут включать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, инъецируемый сложный эфир, такой как этилолеат, и т.д. и т.п. Основа для суппозиториев может включать в себя витепсол, макрогол, твин 61, какао-масло, лауриновое масло, глицерожелатин и т.п.

Количество ионного соединения, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, не ограничивается конкретным образом, однако оно может составлять от 0,0001 вес.% до 50 вес.%, и более предпочтительно, от 0,01 вес.% до 20 вес.%, из расчета на общий вес готовой композиции. Концентрация иона металла, содержащегося в одной дозе фармацевтической композиции, может составлять от 0,1 мМ до 300 мМ.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться в фармацевтически эффективном количестве, при этом используемое в настоящем документе выражение «фармацевтически эффективное количество» относится к количеству, достаточному для лечения или профилактики заболеваний, в целесообразном соотношении пользы/риска, применимом к любому медицинскому лечению или профилактике. Эффективный уровень дозировки может быть определен в зависимости от степени тяжести заболевания, активности лекарственного средства, возраста пациента, массы тела, состояния здоровья и пола, чувствительности к лекарственному препарату, времени введения, пути введения и интенсивности экскреции композиции по настоящему изобретению, длительности лечения, лекарственных препаратов, применяемых одновременно или в комбинации с композицией по настоящему изобретению, а также других факторов, известных в области медицины. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться отдельно или в комбинации с другими известными лекарственными средствами против рака или компонентами, в отношении которых известно, что они обладают противораковой активностью. Важно вводить композицию в минимальном количестве, которое может обеспечить максимальный эффект, не вызывая побочные эффекты, с учетом всех указанных выше факторов.

Дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть определена специалистом в данной области техники с учетом цели применения, степени тяжести заболевания, возраста пациента, массы тела, пола, анамнеза, типа материала, используемого в качестве активного ингредиента, и т.п. Например, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться в дозировке от приблизительно 1 нг до приблизительно 2000 мг/кг на одного взрослого или, предпочтительно, от 1 мг до приблизительно 400 мг/кг на одного взрослого. Частота введения композиции по настоящему изобретению не ограничивается конкретным образом, однако она может равняться одной или нескольким разделенным дозам в сутки. Дозировка или частота введения не ограничивает объем настоящего изобретения каким-либо образом.

В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ лечения рака, включающий этап введения фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции субъекту, у которого рак.

Используемый в настоящем документе термин «субъект» включает в себя всех млекопитающих, включая, без ограничения, мышей, домашний скот и людей, а также фермерскую рыбу, страдающих от рака.

Используемый в настоящем документе термин «лечение» относится ко всем действиям, направленным на смягчения или облегчение симптомов рака, путем введения фармацевтической композиции, содержащей ионное соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, субъекту, у которого рак.

Типы рака, подлежащие лечению в способе лечения рака по настоящему изобретению, являются такими же, как было описано выше.

Композиция может вводиться в однократной или многократной дозированной форме. В этом случае, композиция может быть составлена в форме жидкости, порошка, аэрозоля, инъекции, жидкости для переливания (внутривенного вливания), капсулы, пилюли, таблетки, суппозитория или накладки.

Фармацевтическая композиция для лечения рака по настоящему изобретению может вводиться через любой из общих путей до тех пор, пока она будет способна достигнуть целевую ткань.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться интраперитонеально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, в форме трансдермального пластыря, перорально, интраназально, внутрилегочно или ректально в зависимости от цели, но без конкретного ограничения. Однако фармацевтическая композиция может вводиться в несоставленной форме для перорального приема, и поскольку естественные свойства лактатных солей металла могут быть изменены желудочным соком после перорального приема, активный ингредиент композиции для перорального приема должен быть покрыт или составлен для защиты от расщепления в желудке или принят перорально в форме накладки для перорального приема. Кроме того, композиция может вводиться в форме инъекции длительного действия для максимизации эффективности при введении инъекцией. Кроме того, композиция может вводиться с использованием определенного устройства, выполненного с возможностью транспортировки активного ингредиента в клетку-мишень.

Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть составлена в виде состава с замедленным высвобождением для эффективного поддержания концентрации лекарственного средства, т.е. ионного соединения, в теле. Например, скорость, с которой лекарственное средство высвобождается в теле, можно контролировать путем введения один раз в сутки или один раз в неделю, при этом сохраняя эффективность. В этом случае, состав с замедленным высвобождением может содержать носители, вспомогательные вещества или разбавители, как было описано выше.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция для подавления метастаза рака, которая содержит ионное соединение, в котором два соединения, выбранные из аскорбиновой кислоты, дихлоруксусной кислоты и лактата, скомбинированы с одним ионом металла, выбранного из Ca, Zn, Mg и Fe.

Ионное соединение, представленное в настоящем изобретении, может ингибировать различные свойства, которые могут индуцировать метастаз раковых клеток, такой как метастаз раковых клеток, развитие, неоваскуляризация, колониеобразующая способность. Таким образом, оно может быть использовано в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции для подавления метастаза рака.

Кроме того, ионное соединение и ион металла являются такими же, как было описано выше.

В этом случае, целевой рак с подавленным метастазом является таким же, как было определено выше. Например, фармацевтическая композиция для подавления метастаза рака может применяться для подавления возникновения по меньшей мере одного метастатического рака, выбранного из группы, состоящей из метастатического рака легких, рака молочной железы, рака толстой и прямой кишки, рака желудка, рака головного мозга, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака кожи, рака костного мозга, лимфомы и меланомы.

В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ подавления метастаза рака, включающий этап введения фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции субъекту, у которого ожидается метастаз рака.

В настоящем изобретении, термин «метастаз» относится к состоянию, при котором рак или злокачественная опухоль распространился/распространилась на другие ткани от органа, в котором происходит развитие рака или злокачественной опухоли.

Метастаз может быть подавлен при введении ионного соединения, представленного в настоящем изобретении.

В способе подавления метастаза рака по настоящему изобретению типы рака, подлежащие нацеливанию для подавления метастаза, форма лекарственного средства, подлежащего введению, и путь введения лекарственного средства являются такими же, как было описано выше.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена профилактика или ослабление усталости, связанной с раком, включающая ионное соединение в качестве активного ингредиента.

Здесь, усталость, связанная с раком, является одним из наиболее частых побочных эффектов в ходе или после лечения рака, и, например, она может включать усталость при раке (CRF). Здесь, усталость при раке относится к симптомам, которые являются болезненными, устойчивыми, не зависят от недавней активности, а также мешают повседневной жизни с субъективным ощущением утомления и истощения от рака и его лечения.

В целом, известно, что отсутствие аскорбиновой кислоты у пациентов с раком повышает проницаемость барьера головной мозг-кровь, приводя к легкому проникновению нейротоксических веществ или вирусов в головной мозг, вызывая различные симптомы усталости. Кроме того, отсутствие аскорбиновой кислоты повышает нейротоксические вещества, такие как адренохром и норадренохром, вызывая повреждения органов.

Следовательно, ионное соединение, в соответствии с настоящим изобретением, получено путем комбинации двух или более соединений, содержащих аскорбиновую кислоту с ионом металла. При применении соединения к пациентам с раком, оно оказывает эффект восстановления иммунной функции, снижения мышечной боли и снижения усталости, вызванной стрессом, тем самым предотвращая или снижая синдром усталости при раке. Этот эффект также может повысить уровень выживаемости пациентов с раком.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена пищевая композиция для ослабления рака, содержащая ионное соединение в качестве активного ингредиента.

В этом случае, ионное соединение является таким же, как было описано выше.

Ионное соединение может быть взято в форме пищевого продукта, который может ежедневно употребляться в пищу и может способствовать ослаблению рака. В этом случае, количество кальциевых солей, содержащихся в пищевом продукте, может составлять от 0,001 вес.% до 10 вес.% или от 0,1 вес.% до 1 вес.% из расчета на общий вес пищевой композиции, но не ограничиваясь конкретно этим. Если пищевой продукт представляет собой напиток, то кальциевые соли могут содержаться в соотношении от 1 г до 10 г или от 2 г до 20 г на 100 мл.

Кроме того, композиция может дополнительно содержать дополнительные компоненты, которые традиционно использовались в пищевой композиции для улучшения запаха, вкуса, внешнего вида и т.п. Например, компонентами могут быть витамины A, D, E, B1, B2, B6, B12, ниацин, биотин, фолат, пантотеновая кислота и т.п. Кроме того, композиция может дополнительно содержать минералы, такие как Zn, Fe, Ca, Cr, Mg, Mn, Cu и т.п. Более того, композиция может дополнительно содержать аминокислоты, такие как лизин, триптофан, цистеин, валин и т.п. Кроме того, композиция может дополнительно содержать пищевые добавки, такие как консерванты (сорбат калия, бензоат натрия, салициловая кислота, дегидроацетат натрия и т.д.), дезинфицирующие вещества (белильный порошок, белильный порошок повышенного действия, гипохлорит натрия и т.д.), антиоксиданты (бутилгидроксианизол (BHA), бутилгидрокситолуол (BHT) и т.д.), красящие вещества (анилиновый краситель и т.д.), проявители цвета (нитрит натрия, ацетат натрия и т.д.), белильные вещества (сульфит натрия), заправки (глутамат мононатрия (MSG) и т.д.), подсластители (дульцин, цикламат, сахарин, натрий и т.д.), ароматизаторы (ванилин, лактоны и т.д.), способствующие набуханию вещества (квасцы, D-битартрат калия и т.д.), обогатители, эмульгаторы, загустители (клейкие пасты), пленкообразующие агенты, гуммиосновы, пеногасители, растворители, улучшители и т.д. Пищевые добавки могут быть выбраны в соответствии с типами пищевого продукта и использованы в подходящем количестве.

Между тем, с использованием пищевой композиции для ослабления рака, содержащей ионное соединение, могут быть произведены функциональные пищевые продукты для ослабления рака.

В частности, с использованием пищевой композиции могут быть произведены полуфабрикаты, способные ослаблять рак. Примеры полуфабрикатов могут быть произведены в виде функциональных пищевых продуктов в форме мучных изделий, напитков, алкогольных напитков, ферментированных пищевых продуктов, консерв, продуктов переработки молока, продуктов переработки мяса или лапши. В этом случае, примеры мучных изделий включают в себя бисквиты, пироги, торты, хлеб, конфеты, желе, леденцы, изделия из зерновых продуктов (заменители еды, такие как зерновые хлопья). Примеры напитков включают в себя питьевую воду, газированные безалкогольные напитки, функциональные изотонические напитки, соки (например, яблочные, грушевые, виноградные, мандариновые, персиковые, морковные, томатные соки и соки алоэ), сладкие рисовые напитки и т.п. Примеры алкогольных напитков включают в себя рафинированное рисовое вино, виски, соджу (Корейский крепкий спиртной напиток), пиво, ликеры, фруктовое вино и т.п. Примеры ферментированных пищевых продуктов включают в себя соевый соус, бобовую пасту, пасту из красного перца и т.п. Примеры консерв включают в себя консервированные морепродукты (например, консервированный тунец, макрель, щуку, моллюск и т.д.), консервированные продукты из домашнего скота (консервированная говядина, свинина, курица, индюшка и т.д.) и консервированные сельскохозяйственные продукты (консервированная кукуруза, персик, ананас и т.д.). Примеры пищевых продуктов из переработанного молока включают в себя сыр, масло, йогурт и т.п. Примеры пищевых продуктов из переработанного мяса включают в себя свиные котлеты, говяжьи котлеты, куриные котлеты, сосиски, свинину в томатном соусе, наггетсы, необиани и т.п. Примеры лапши включают в себя высушенную лапшу, простую лапшу, рамен, лапшу удон, корейскую холодную лапшу, герметично закрытую и упакованную свежую лапшу и т.п. Кроме того, композиция может быть использована для производства пищевых продуктов в герметическом термостойком пакете, супов и т.п.

Используемый в настоящем документе термин «функциональный пищевой продукт», который имеет такое же значение, что и термин «пищевой продукт для оздоровления (FoSHU)», относится к пищевому продукту, обладающему высокими эффектами в лекарственном и медицинском лечении, который обработан для того, чтобы эффективно проявлять функцию модуляции тела, а также обеспечивать питательные элементы. Функциональный пищевой продукт может быть произведен в различных формах, в том числе в форме таблеток, капсул, порошков, гранул, жидкостей, пилюль и т.п., для получения полезных эффектов для ослабления рака.

Настоящее раскрытие будет описано более подробно далее со ссылкой на следующие примеры. Однако эти примеры представлены исключительно в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего раскрытия.

Пример приготовления 1-1: Приготовление кальциевых солей дихлоруксусной кислоты и аскорбиновой кислоты

129 мг дихлоруксусной кислоты разводили в 125 мл дистиллированной воды для приготовления раствора дихлоруксусной кислоты, а 176 мг аскорбиновой кислоты разводили в 125 мл дистиллированной воды для приготовления раствора аскорбиновой кислоты. Раствор аскорбиновой кислоты медленно добавляли в раствор дихлоруксусной кислоты, при этом перемешивая. Затем, 105 мг карбоната кальция (CaCO₃) медленно добавляли к ним при перемешивании при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем подвергали реакции до тех пор, пока более не вырабатывался CO₂, при этом повышая температуру реакции медленно до 60˚C. Полученный в результате продукт сушили с помощью роторного испарителя и вакуумной печи, а непрореагировавшие вещества удаляли посредством диэтилового эфира с последующей фильтрацией, сушкой и пульверизацией для получения порошкообразных кальциевых солей дихлоруксусной кислоты и аскорбиновой кислоты. Все реакции проводили в присутствии азота.

Пример приготовления 1-2: Приготовление кальциевых солей аскорбиновой кислоты и лактата

90 мг L-молочной кислоты разводили в 125 мл дистиллированной воды для приготовления раствора молочной кислоты, а 176 мг аскорбиновой кислоты разводили в 125 мл дистиллированной воды для приготовления раствора аскорбиновой кислоты. Раствор аскорбиновой кислоты медленно добавляли в раствор молочной кислоты, при этом перемешивая. Затем, 105 мг карбоната кальция (CaCO₃) медленно добавляли к ним при перемешивании при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем подвергали реакции до тех пор, пока более не вырабатывался CO₂, при этом повышая температуру реакции медленно до 60˚C. Полученный в результате продукт сушили с помощью роторного испарителя и вакуумной печи, а непрореагировавшие вещества удаляли посредством диэтилового эфира с последующей фильтрацией, сушкой и пульверизацией для получения порошкообразных кальциевых солей аскорбиновой кислоты и лактата. Все реакции проводили в присутствии азота.

Пример приготовления 1-3: Приготовление кальциевых солей дихлоруксусной кислоты и лактата

640 мг дихлоруксусной кислоты и 450 мг L-молочной кислоты разводили в 10 мл дистиллированной воды при перемешивании, а затем к ним добавляли 500 мг карбоната кальция (CaCO₃) при перемешивании при комнатной температуре в течение 30 мин. Полученный в результате продукт сушили с помощью роторного испарителя и вакуумной печи, а непрореагировавшие вещества удаляли посредством диэтилового эфира с последующей фильтрацией, сушкой и пульверизацией для получения порошкообразных кальциевых солей дихлоруксусной кислоты и лактата.

Пример 1

Кальциевые соли, приготовленные в соответствии с Примером приготовления 1-1, в котором дихлоруксусная кислота и аскорбиновая кислота скомбинированы с ионами кальция.

Пример 2

Кальциевые соли, приготовленные в соответствии с Примером приготовления 1-2, в котором аскорбиновая кислота и лактат скомбинированы с ионами кальция.

Пример 3

Кальциевые соли, приготовленные в соответствии с Примером приготовления 1-3, в котором дихлоруксусная кислота и лактат скомбинированы с ионами кальция.

Испытательный пример 1:Эффект кальциевых солей на поглощение и изменение pH в раковых клетках

После обработки раковых клеток кальциевыми солями из Примеров 1-3, соответственно, анализировали изменения внутриклеточной концентрации кальция, концентрации лактата, концентрации аскорбиновой кислоты и pH для прогнозирования уровня притока каждой кальциевой соли.

Испытательный пример 1-1: Изменение уровня кальция

1 мМ кальциевых солей из Примеров 1-3 обрабатывали линию клеток рака толстой и прямой кишки человека (HCT-116) из 5 x 10⁶ клеток, которую культивировали в среде для культивирования раковых клеток (среде RPMI1640, содержащей 10% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина) в условиях 37˚C и 5% CO₂, соответственно, а затем культивировали в течение 24 часов. Культивированные раковые клетки пульверизовали с помощью гомогенизатора и центрифугировали, а концентрацию кальция, содержащегося в лизате, измеряли с использованием набора для анализа кальция (Biovision, Сан-Франциско, штат Калифорния). Результаты показаны на ФИГ. 1a. В этом случае, раковые клетки, которые не были обработаны кальциевыми солями, использовали в качестве контроля.

Кроме того, для наблюдения за изменением уровня кальция путем построения флуоресцентных изображений, линию клеток рака толстой и прямой кишки человека (HCT-116) из 3 x 10⁴ клеток распределяли по 6-луночному планшету и культивировали в течение 24 часов. Их обрабатывали кальциевыми солями из Примеров 1-3 в концентрации 1 мМ, соответственно, культивировали в течение 4 часов, промывали дважды с помощью ФСБД и культивировали с помощью Fluo 4-AM в течение 40 мин. Для оценки внутриклеточной концентрации кальция измеряли флуоресценцию для внутриклеточной концентрации кальция с использованием проточного цитометра FACSCanto^TM II (Becton-Dickinson, Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси, США), первичного аргонового лазера, и результаты показаны на ФИГ. 1b. В этом случае, раковые клетки, которые не были обработаны кальциевыми солями, использовали в качестве контроля.

Как показано на ФИГ. 1a и ФИГ. 1b, концентрация кальция была повышена в раковых клетках, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3. Следовательно, было подтверждено, что композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит ионное соединение, скомбинированное с ионом металла, может проникать в раковые клетки.

Испытательный пример 1-2: Изменение уровня лактата

1 мМ кальциевых солей из Примеров 1-3 обрабатывали линии клеток рака толстой и прямой кишки человека (HCT-116 и HT-29) из 5 x 10⁶ клеток, которые культивировали в среде для культивирования раковых клеток (среде RPMI1640, содержащей 10% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина) в условиях 37˚C и 5% CO₂, соответственно, а затем культивировали в течение 24 часов. Культивированные раковые клетки пульверизовали с помощью гомогенизатора и центрифугировали, а концентрацию лактата, содержащегося в лизате, измеряли с использованием набора для анализа лактата (Biovision, Сан-Франциско, штат Калифорния). Результаты показаны на ФИГ. 2. В этом случае, раковые клетки без какой-либо обработки использовали в качестве контроля.

Как показано на ФИГ. 2, концентрация лактата была повышена в раковых клетках, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3. Следовательно, было подтверждено, что композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит ионное соединение, скомбинированное с ионом металла, может проникать в раковые клетки и повышать концентрацию лактата.

Испытательный пример 1-3: Изменение уровня внеклеточного лактата, высвобожденного раковыми клетками

Линии клеток рака толстой и прямой кишки человека (HCT-116 и HT-29) из 5 x 10⁵ клеток, которые культивировали в среде для культивирования раковых клеток (среде RPMI1640, содержащей 10% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина) в условиях 37˚C и 5% CO₂, распределяли по 6-луночному планшету, а затем культивировали в течение 24 часов. Их обрабатывали кальциевыми солями из Примеров 1-3 в концентрации 0,05 мМ, 0,1 мМ и 0,3 мМ, соответственно, а затем культивировали в течение 20 часов. После культивирования среду заменяли на среду для культивирования, свободную от фенола красного, а затем культивировали в течение дополнительных 4 часов. После этого оценивали внеклеточный лактат в среде для культивирования, который был высвобожден из клеток в течение 4 часов, с использованием набора для анализа (Biovision, Сан-Франциско, штат Калифорния), и результаты показаны на ФИГ. 3. В этом случае, раковые клетки без какой-либо обработки использовали в качестве контроля.

Как показано на ФИГ. 3, было подтверждено, что концентрация лактата, высвобожденного из раковых клеток, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3, в основном была снижена. Следовательно, было подтверждено, что композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит ионное соединение, скомбинированное с ионом металла, может снизить концентрацию внеклеточного лактата, высвобожденного из раковых клеток.

Испытательный пример 1-4: Изменение уровня аскорбиновой кислоты

1 мМ кальциевых солей из Примеров 1 и 2 обрабатывали линии клеток рака толстой и прямой кишки человека (HCT-116 и HT-29) из 5 x 10⁶ клеток, которые культивировали в среде для культивирования раковых клеток (среде RPMI1640, содержащей 10% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина) в условиях 37˚C и 5% CO₂, соответственно, а затем культивировали в течение 24 часов. После культивирования, культивированные раковые клетки пульверизовали с помощью гомогенизатора и центрифугировали, а концентрацию аскорбиновой кислоты, содержащейся в лизате, измеряли с использованием набора для анализа аскорбиновой кислоты (Biovision, Сан-Франциско, штат Калифорния). Результаты показаны на ФИГ. 4. В этом случае, раковые клетки без какой-либо обработки использовали в качестве контроля, раковые клетки, обработанные аскорбиновой кислотой (1 мМ), использовали в качестве Сравнительного примера 1, а раковые клетки, обработанные аскорбатом кальция (1 мМ), использовали в качестве Сравнительного примера 2.

Как показано на ФИГ. 4, концентрация аскорбиновой кислоты была повышена в раковых клетках, обработанных Примерами 1 и 2, тогда как раковые клетки, обработанные Сравнительными примерами 1 и 2, имели более низкий уровень повышенной концентрации аскорбиновой кислоты чем раковые клетки, обработанные Примерами 1 и 2. Следовательно, было подтверждено, что композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит ионное соединение, скомбинированное с ионом металла, может легко проникать в раковые клетки.

Испытательный пример 1-5: Изменение pH в раковой клетке

1 мМ кальциевых солей из Примеров 1-3 обрабатывали линии клеток рака толстой и прямой кишки человека (HCT-116 и HT-29) из 5 x 10⁶ клеток, которые культивировали в среде для культивирования раковых клеток (среде RPMI1640, содержащей 10% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина) в условиях 37˚C и 5% CO₂, соответственно, а затем культивировали в течение 24 часов. В среде культивированных клеток pH измеряли с использованием набора для определения pH (Life technologies, штат Калифорния), и результаты показаны на ФИГ. 5. В этом случае, раковые клетки без какой-либо обработки использовали в качестве контроля.

Как показано на ФИГ. 5, было подтверждено, что при обработке кальциевыми солями из Примеров 1-3 внутриклеточный pH был понижен, т.е. имело место окисление. Иными словами, было обнаружено, что среда в раковых клетках изменилась на кислую вследствие притока кальциевых солей. Это означает, что кальциевые соли являются восприимчивыми к апоптозу.

Испытательный пример 2: Эффект кальциевых солей на метаболизм в раковых клетках

Раковые клетки обрабатывали кальциевыми солями из Примеров 1-3, соответственно, для определения их эффектов на метаболизм раковой клетки.

Испытательный пример 2-1: Эффект кальциевых солей на уровень пирувата

Кальциевыми солями из Примера 1 (1 мМ), Примера 2 (1 мМ) и Примера 3 (1 мМ) обрабатывали линии клеток рака толстой и прямой кишки человека (HCT-116 и HT-29) из 5 x 10⁶ клеток, которые культивировали в среде для культивирования раковых клеток (среде RPMI1640, содержащей 10% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина) в условиях 37˚C и 5% CO₂, соответственно, а затем культивировали в течение 24 часов. Культивированные раковые клетки пульверизовали с помощью гомогенизатора и центрифугировали, а концентрацию пирувата, содержащегося в лизате, измеряли с использованием набора для анализа пирувата (Biovision, Сан-Франциско, штат Калифорния). Результаты показаны на ФИГ. 6. В этом случае, раковые клетки без какой-либо обработки использовали в качестве контроля.

Как показано на ФИГ. 6, концентрация пирувата была повышена в раковых клетках, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3. Следовательно, было подтверждено, что композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит ионное соединение, скомбинированное с ионом металла, может проникать в раковые клетки и повышать концентрацию пирувата.

Испытательный пример 2-2: Эффект кальциевых солей на уровень α-кетоглутарата (α-KG)

Кальциевыми солями из Примера 1 (1 мМ), Примера 2 (1 мМ) и Примера 3 (1 мМ) обрабатывали линии клеток рака толстой и прямой кишки человека (HCT-116 и HT-29) из 5 x 10⁶ клеток, которые культивировали в среде для культивирования раковых клеток (среде RPMI1640, содержащей 10% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина) в условиях 37˚C и 5% CO₂, соответственно, а затем культивировали в течение 24 часов. Культивированные раковые клетки пульверизовали с помощью гомогенизатора и центрифугировали, а концентрацию α-кетоглутарата, содержащегося в лизате, измеряли с использованием набора для анализа α-кетоглутарата (Biovision, Сан-Франциско, штат Калифорния). Результаты показаны на ФИГ. 7. В этом случае, раковые клетки без какой-либо обработки использовали в качестве контроля.

Как показано на ФИГ. 7, концентрация α-кетоглутарата была повышена в раковых клетках, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3. Следовательно, было подтверждено, что композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит ионное соединение, скомбинированное с ионом металла, может проникать в раковые клетки и индуцировать процесс окислительного фосфорилирования в митохондриях, тем самым повышая концентрацию α-кетоглутарата.

Испытательный пример 2-3: Изменение уровня экспрессии белков PARP-1, β-катенина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) и β-актина

Различными концентрациями кальциевых солей из Примера 1, Примера 2 и Примера 3 обрабатывали линию клеток рака толстой и прямой кишки человека (HCT-116) из 5 x 10⁶ клеток, которые культивировали в среде для культивирования раковых клеток (среде RPMI1640, содержащей 10% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина) в условиях 37˚C и 5% CO₂, соответственно, а затем культивировали в течение 24 часов. Культивированные раковые клетки пульверизовали с помощью гомогенизатора и центрифугировали, а уровни экспрессии белков поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы 1 (PARP-1), β-катенина, VEGF и β-актина, содержащихся в лизате, измеряли с использованием вестерн-блоттинга. Результаты показаны на ФИГ. 8.

Как показано на ФИГ. 8, уровень экспрессии PARP-1 была снижен в раковых клетках, обработанных кальциевыми солями из Примеров 1-3. В целом, PARP-1 используется в качестве маркера апоптоза, поскольку расщепление осуществляется каспазой-3, которая активируется, когда клетки претерпевают программируемую клеточную гибель, т.е. апоптоз. Уровень экспрессии PARP-1 полной длины снизился больше всего при концентрации 0,18 мг/мл (Пример 1), 0,34 мг/мл (Пример 2) и 0,3 мг/мл (Пример 3). Таким образом, было подтверждено, что PARP-1 может индуцировать апоптоз раковых клеток зависимым от концентрации образом. Следовательно, было подтверждено, что композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит ионное соединение, скомбинированное с ионом металла, может снизить экспрессию PARP-1 полной длины, тем самым индуцируя апоптоз раковых клеток.

Кроме того, было подтверждено, что раковые клетки, обработанные кальциевыми солями из Примеров 1-3, понизили уровень белка β-катенина зависимым от концентрации образом. β-катенин представляет собой фактор транскрипции, который мутирует или сверхэкспрессируется в различных карциномах, таких как рак толстой и прямой кишки, рак легких, рак молочной железы и рак яичников, и известно, что он регулирует экспрессию белков, которые играют важную роль в клеточном росте, метастазе рака и выживаемости, таких как c-myc, циклин D1, MMP7 и сурвинин. Следовательно, было подтверждено, что композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит ионное соединение, скомбинированное с ионом металла, может подавлять рост раковых клеток путем уменьшения белка β-катенина.

Кроме того, было подтверждено, что раковые клетки, обработанные кальциевыми солями из Примеров 1-3, снижали экспрессию VEGF зависимым от концентрации образом. С другой стороны, система сигналинга VEGF играет важную роль в клеточном росте, инвазии и метастазе путем регулирования нижней системы сигналинга MARK и системы сигналинга PI3K/Akt. В частности, она промотирует метастаз раковой клетки путем повышения генной экспрессии у матриксных металлопротеиназ (MMP), что важно для метастаза раковой клетки. Следовательно, было подтверждено, что композиция для лечения рака, в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит ионное соединение, скомбинированное с ионом металла, демонстрирует эффект подавления метастаза раковой клетки путем ингибирования действия факторов, которые индуцируют неоваскуляризацию.

Испытательный пример 2-4: Изменение уровня экспрессии реактивного кислорода

Для измерения изменения концентрации реактивного кислорода в раковых клетках, обработанных ионным соединением, скомбинированным с ионом металла, в соответствии с настоящим изобретением, использовали диацетат дихлорфлуоресцина (DCF-DA; Sigma, США) в качестве флуоресцентного зонда. DCF-DA окисляется ROS в присутствии пероксидов, связанных с внутриклеточным пероксидом водорода, и преобразуется в флуоресцентный DCF, в результате становясь флуоресцентным зеленым. Таким образом, измерение ROS подтверждали посредством DCF-DA. Сперва, линию клеток рака толстой и прямой кишки человека (HT-116) из 5 x 10⁶ клеток культивировали в среде для культивирования раковых клеток (среде RPMI1640, содержащей 10% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина) в условиях 37˚C и 5% CO₂, а затем культивировали в течение 24 часов. После культивирования клетки промывали один раз с помощью DPBS и культурировали с DCF-DA 10 мМ при 37˚C в течение 30 мин. Клетки промывали снова с помощью DPBS. Обработку выполняли различными концентрациями кальциевых солей из Примера 1, Примера 2 и Примера 3 в течение 6 часов, соответственно, а также измеряли и анализировали флуоресценцию внутриклеточного ROS. Результаты показаны на ФИГ. 9.

Как показано на ФИГ. 9, раковые клетки, обработанные кальциевыми солями из Примеров 1-3, имели больше реактивного кислорода, предполагая возможность индуцирования апоптоза, по сравнению с необработанным контролем.

Испытательный пример 2-5: Изменение уровня апоптоза

Для измерения изменения концентрации реактивного кислорода в раковых клетках, обработанных ионным соединением, скомбинированным с ионом металла, в соответствии с настоящим изобретением, линию клеток рака толстой и прямой кишки человека (HCT-116) из 3 х 10⁴ клеток распределяли по 6-луночному планшету и культивировали в течение 24 часов. Затем, их обрабатывали различными концентрациями кальциевых солей из Примера 1 (1 мМ), Примера 2 (1 мМ) и Примера 3 (1 мМ) в течение 24 часов и промывали дважды с помощью DPBS. Клетки отделяли с помощью трипсина-EDTA и окрашивали в соответствии с протоколом Annexin-V/PI. Апоптоз измеряли и анализировали с использованием проточного цитометра FACSCanto^TM II (Becton-Dickinson, Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси, США), первичного аргонового лазера, и результаты показаны на ФИГ. 10.

В нормальных живых клетках фосфатидилсерин (PS) находится внутри клеточной мембраны. Однако при апоптозе PS подвергается выходу за пределы клеточной мембраны, а аннексин V связывается с PS с высокой аффинностью, в результате давая флуоресцентное свечение. Пропидиум иодид (PI) попадает в клетку и окрашивает ядро. Клетки на ранней стадии апоптоза окрашиваются только аннексином-V, а не PI, тогда как клетки на поздней стадии апоптоза или клетки, претерпевающие некроз, окрашиваются одновременно аннексином-V и PI, поскольку целостность клеточной мембраны нарушена и живые клетки не окрашиваются вовсе. Как показано на ФИГ. 10, раковые клетки, обработанные кальциевыми солями из Примеров 1-3, более вероятно индуцировали апоптоз по сравнению с необработанным контролем.

Испытательный пример 3: Оценка эффекта на способность линий раковых клеток к пролиферации

Цель данного испытания заключалась в исследовании ингибирующего эффекта на жизнеспособность клеток рака толстой и прямой кишки, рака молочной железы и рака головного мозга, в соответствии с обработкой кальциевыми солями из Примеров 1-3.

Испытательный пример 3-1: Оценка эффекта на способность линий раковых клеток к пролиферации (анализ MTT)

В каждой лунке 96-луночного планшета линию клеток рака толстой и прямой кишки (DLD-1), линию клеток рака молочной железы (MDA-MB-231) и линию клеток рака головного мозга (U87MG) разделяли на аликвоты 5 x 10⁶ клеток, соответственно. Кальциевые соли из Примеров 1-3 добавляли в каждую лунку по концентрации (20 мг/мл, 4 мг/мл, 0,8 мг/мл, 0,16 мг/мл, 0,032 мг/мл, 0,0064 мг/мл, 0,00128 мг/мл, 0,000256 мг/мл). Для относительного сравнения, также разводили и таким же образом добавляли в лунки аскорбиновую кислоту и дихлоруксусную кислоту. Клетки культивировали в инкубаторе (37˚C, 5% CO₂) в течение 72 часов, и к ним добавляли 2 мг/мл реагента MTT 50 мл, а затем оставляли в инкубаторе при 37˚C на 4 часа. Супернатант удаляли с использованием центрифуги, в каждую лунку добавляли DMSO 200 мл для растворения осадка, окрашенного MTT, и измеряли значение OD₅₄₀ при 540 нм с помощью аппарата для чтения ELISA. Ингибирующую концентрацию 50% (IC₅₀) определяли, как концентрацию лекарственного средства, которое давало коэффициент выживаемости 50%, и значение IC₅₀ использовали в качестве индекса противоракового эффекта, и оно показано в Таблице 1 ниже.

Таблица 1

Как показано в Таблице 1, в обеих кальциевых солях из Примеров 1 и 2 значения IC₅₀ для линий клеток рака толстой и прямой кишки, рака молочной железы и рака головного мозга были ниже чем таковые у аскорбиновой кислоты и дихлоруксусной кислоты. Таким образом, было подтверждено, что они обладали улучшенным цитотоксическим эффектом в отношении раковой клетки чем аскорбиновая кислота и дихлоруксусная кислота.

В кальциевых солях из Примера 3 значения IC₅₀ для линий клеток рака толстой и прямой кишки, рака молочной железы и рака головного мозга были ниже чем таковые у дихлоруксусной кислоты. Таким образом, было подтверждено, что она обладала улучшенным цитотоксическим эффектом в отношении раковой клетки чем дихлоруксусная кислота.

С другой стороны, кальциевые соли из Примера 3 продемонстрировали повышенное значение IC₅₀ для линии клеток рака толстой и прямой кишки чем аскорбиновая кислота, но пониженные значения IC₅₀ для линии клеток рака молочной железы и рака головного мозга чем аскорбиновая кислота. Таким образом, было подтверждено, что она обладала улучшенным цитотоксическим эффектом в отношении раковой клетки рака молочной железы и рака головного мозга чем аскорбиновая кислота.

Испытательный пример 3-2: Оценка эффекта на способность линий раковых клеток к пролиферации (анализ MTT)

Ингибирующую способность раковой клетки к пролиферации из Примера 1 и Примера 2 оценивали для 7 линий раковых клеток, включающих 2 линии клеток рака толстой и прямой кишки (линию клеток рака толстой и прямой кишки (HCT-116, HT-29), линию клеток рака легких (A-549), линию клеток рака печени (HepG2), линию клеток рака поджелудочной железы (PANC-1), линию клеток рака желудка (SNU-638) и линию клеток рака яичников (A2780)).

7 линий клеток разделяли на аликвоты для каждой лунки 96-луночного планшета с 5 x 10³ клеток и культивировали в течение 24 часов. Затем, их обрабатывали Примером 1 и Примером 2 по концентрации (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,313, 0,156, 0,078 мМ). Для относительного сравнения, также разводили и таким же образом проводили обработку аскорбиновой кислотой и дихлоруксусной кислотой. Обработанные лекарственным средством клетки культивировали в инкубаторе (37˚C, 5% CO₂) в течение 48 часов, и в каждую лунку добавляли 5 мг/мл реагента MTT 10 мл и культивировали в течение дополнительных 4 часов. Затем, среду для культивирования удаляли и проводили обработку DMSO 100 мл для растворения осадка, окрашенного MTT, а также измеряли поглощаемость при 540 нм с помощью устройства для чтения микропланшетов. Ингибирующую концентрацию 50% (IC₅₀) определяли, как концентрацию лекарственного средства, которое давало коэффициент выживаемости 50%, и значение IC₅₀ использовали в качестве индекса противоракового эффекта, и оно показано в Таблице 2 ниже.

Таблица 2

Как показано в Таблице 2, в дополнение к раку толстой и прямой кишки, кальциевые соли из Примеров 1 и 2 продемонстрировали противораковую эффективность при раке легких, раке печени, раке поджелудочной железы, раке желудка и раке яичников. Кроме того, было подтверждено, что они обладали улучшенным цитотоксическим эффектом в отношении раковых клеток по сравнению с дихлоруксусной кислотой, поскольку они продемонстрировали пониженное значение IC₅₀ по сравнению с дихлоруксусной кислотой.

Кальциевые соли из Примера 1 продемонстрировали повышенные значения IC₅₀ для линий клеток рака толстой и прямой кишки (HCT-116), рака поджелудочной железы и рака яичников по сравнению с таковыми у аскорбиновой кислоты, но пониженные значения IC₅₀ для линий клеток рака толстой и прямой кишки (HT-29), рака легких, рака печени и рака желудка по сравнению с таковыми у аскорбиновой кислоты. Таким образом, было подтверждено, что они имели улучшенный цитотоксический эффект в отношении клеток рака толстой и прямой кишки (HT-29), рака легких, рака печени и рака желудка по сравнению с аскорбиновой кислотой.

Кальциевые соли из Примера 2 продемонстрировали повышенные значения IC₅₀ для линий клеток рака толстой и прямой кишки (HCT-116) и рака поджелудочной железы по сравнению с таковыми у аскорбиновой кислоты, но пониженные значения IC₅₀ для линий клеток рака толстой и прямой кишки (HT-29), рака легких, рака печени, рака желудка и рака яичников по сравнению с таковыми у аскорбиновой кислоты. Таким образом, было подтверждено, что они имели улучшенный цитотоксический эффект в отношении клеток рака толстой и прямой кишки (HT-29), рака легких, рака печени, рака желудка и рака яичников по сравнению с аскорбиновой кислотой.

Испытательный пример 3-3: Оценка эффекта на колониеобразующую способность линии раковых клеток

Линии клеток рака толстой и прямой кишки человека (HCT-116) инокулировали в плотную среду, содержащую каждое из аскорбиновой кислоты (0 мМ, 0,2 мМ, 0,5 мМ), кальциевых солей из Примеров 1 и 2 (0 мМ, 0,2 мМ, 0,5 мМ), дихлоруксусной кислоты (0 мМ, 2 мМ, 5 мM) и кальциевых солей из Примера 3 (0 мМ, 2 мМ, 5 мМ), и культивировали в течение 72 часов. После завершения культивирования, клетки фиксировали и затем окрашивали гематоксином для наблюдения за раковыми клетками, в которых были образованы колонии. Результаты показаны на ФИГ. 11.

Как показано на ФИГ. 11, все линии клеток рака толстой и прямой кишки, которые не были обработаны кальциевыми солями из Примеров 1-3, образовали сотни колоний, однако по мере повышения концентрации каждой из кальциевых солей из Примеров 1-3 количество колоний уменьшалось. Кроме того, кальциевые соли из Примеров 1-3 были более эффективными при ингибировании колониеобразующей способности рака толстой и прямой кишки по сравнению с обработкой аскорбиновой кислотой и дихлоруксусной кислотой. В целом, было подтверждено, что кальциевые соли из Примеров 1-3 продемонстрировали ингибирующий эффект на колониеобразующую способность рака толстой и прямой кишки.

Таким образом, подытоживая результаты Испытательного примера 3, композиция для лечения рака, которая содержит ионное соединение, скомбинированное с ионом металла, в соответствии с настоящим изобретением, может снижать коэффициент выживаемости раковых клеток, например, клеток рака толстой и прямой кишки, рака молочной железы и рака головного мозга.

Испытательный пример 4: Совместная обработка известным лекарственным средством против рака и кальциевыми солями из Примеров 1-3

Проводили совместную обработку известным лекарственным средством против рака в комбинации с кальциевыми солями из Примеров 1-3 для демонстрации терапевтического эффект на различные линии раковых клеток.

Испытательный пример 4-1: Эффект совместной обработки 5-FU (5-Фторурацилом) и Примером

Линии клеток рака толстой и прямой кишки (HCT-116) разделяли на аликвоты в каждой лунке 6-луночного планшета, содержащей среду RPMI1640, с 1 X 10³ клеток, и по прошествии одних суток среду заменяли на свежую среду. Затем, каждую лунку обрабатывали по отдельности кальциевыми солями из Примера 1 (0,2 мМ), кальциевыми слоями из Примера 2 (0,2 мМ), кальциевыми солями из Примера 3 (2 мМ) и 5 мкМ 5-FU, а также проводили совместную обработку 5 мкМ 5-FU и кальциевыми солями из Примера 1 (0,2 мМ), 5 мкМ 5-FU и кальциевыми солями из Примера 2 (0,2 мМ) и 5-FU и кальциевыми солями из Примера 3 (2 мМ), соответственно. Колониеобразующие способности сравнивали, и результаты показаны на ФИГ. 12. Линию клеток рака толстой и прямой кишки человека (HCT-116), которая не была обработана каким-либо лекарственным средством, использовали в качестве контроля.

Как показано на ФИГ. 12, наблюдалось, что необработанная линия клеток рака толстой и прямой кишки образовала сотни колоний, однако вариант с совместной обработкой 5-FU и кальциевыми солями из Примеров 1-3 был более эффективен при ингибировании колониеобразующей способности рака толстой и прямой кишки по сравнению с 5-FU отдельно.

Испытательный пример 4-2: Эффект совместной обработки клетки рака толстой и прямой кишки существующим лекарственным средством против рака и Примером

Клетки HCT-116 с 2 X 10³ клеток разделяли на аликвоты в каждой лунке 96-луночного планшета и культивировали в течение 24 часов. Затем их по отдельности обрабатывали различными концентрациями Примера или химических лекарственных препаратов против рака (Фторурацила (5-FU), SN-38, Паклитаксела (PTX)). В Таблице 3 показано значение IC₅₀через 48 часов после обработки по отдельности каждым лекарственным средством против рака.

Таблица 3

Б.И. (без испытания)

Клетки HCT-116 с 2 X 10³ клеток разделяли на аликвоты в каждой лунке 96-луночного планшета и культивировали в течение 24 часов. Затем проводили обработку Примером 1 или Примером 2 в комбинации с химическим лекарственным средством против рака, Фторурацилом (5-FU), SN-38 или Паклитакселем (PTX) в различных концентрациях. После 48-часового воздействия оценивали степень ингибирования клеточного роста (%) и эффект совместной доставки комбинации лекарственного средства против рака для совместной обработки с использованием комбинационного индекса (CI). В качестве эффекта совместной доставки, синергетический эффект составил CI ≤ 0,85, аддитивный эффект составил 0,85 < CI ≤ 1,15, а антагонистический эффект составил CI > 1,15. Было подтверждено, что в большинстве концентраций совместная обработка Примером 1 или Примером 2 и химическим лекарственным средством против рака, Фторурацилом (5-FU), SN-38 и Паклитакселем (PTX), продемонстрировала синергетический эффект.

Испытательный пример 4-2-1: Эффект совместной обработки Примером 1 или Примером 2 и Фторурацилом (5-FU)

В Таблице 4 и Таблице 5, соответственно, показаны степень ингибирования клеточного роста (%) и значения CI после обработки клеток HCT-116 Примером 1 и 5-FU или Примером 2 и 5-FU в течение 48 часов. Значение CI разделяли на синергетический, аддитивный или антагонистический эффект, и они показаны на ФИГ. 13 и ФИГ. 14, соответственно.

При обработке Примером 1 или Примером 2 с 5-FU в концентрации, которая равна или ниже чем значение IC₅₀ из Примера 1 или Примера 2, они продемонстрировали некоторый антагонистический эффект, однако при совместной обработке в концентрации выше 1000 мкМ, которая выше чем значение IC₅₀ из Примера 1 или Примера 2, они продемонстрировали в основном синергетический эффект при различных концентрациях.

Таблица 4

Таблица 5

Испытательный пример 4-2-2: Эффект совместной обработки Примером 1 или Примером 2 и SN-38

Клетки HCT-116 совместно обрабатывали Примером 1 и SN-38 или Примером 2 и SN-48 в течение 48 часов. Степень ингибирования клеточного роста (%) и значение CI показаны в Таблице 6 и Таблице 7, соответственно, при этом значение CI разделяли на синергетический, аддитивный или антагонистический эффект, и они показаны на ФИГ. 15 и ФИГ. 16, соответственно. Когда проводили обработку концентрацией, которая была выше чем значение IC₅₀ из Примера 1 (311 мкМ), совместно с различными концентрациями SN-38, наблюдался антагонистический эффект, однако, когда проводили обработку концентрацией, которая была близка к значению IC₅₀ из Примера 1 или ниже его, совместно с различными концентрациями SN-38, наблюдался синергетический эффект. В случае Примера 2, синергетический эффект с SN-38 наблюдался в большинстве комбинаций концентраций, и, в частности, синергетический эффект также наблюдался при комбинации концентрации ниже значения IC₅₀ из Примера 2 (430 мкМ) с концентрацией ниже значения IC₅₀ у SN-38 (0,25 мкМ).

Таблица 6

Таблица 7

Испытательный пример 4-2-3: Эффект совместной обработки Примером 1 или Примером 2 и Паклитакселем

В Таблице 8 и Таблице 9, соответственно, показаны степень ингибирования клеточного роста (%) и значения CI после обработки клеток HCT-116 Примером 1 и Паклитакселем или Примером 2 и Паклитакселем в течение 48 часов. Значение CI разделяли на синергетический, аддитивный или антагонистический эффект, и они показаны на ФИГ. 17 и ФИГ. 18, соответственно. При проведении совместной обработки концентрацией, которая ниже значения IC₅₀ из Примера 1 (311 мкМ), или концентрацией, которая ниже значения IC₅₀ из Примера 2 (430 мкМ), и Паклитакселем ниже 0,1 мкМ (100 нМ), синергетический эффект наблюдался в большинстве комбинаций концентраций. При проведении совместной обработки концентрацией, которая ниже значения IC₅₀ из Примера 1 или Примера 2, и концентрацией, которая ниже значения IC₅₀ у Паклитаксела (7,8 нМ), синергетический эффект наблюдался в большинстве комбинаций концентраций.

Таблица 8

Таблица 9

Испытательный пример 5: Проверка противоракового эффекта кальциевых солей из Примера с использованием животной модели

Испытательный пример 5-1: Конструирование животной модели с карциномой с использованием животной модели (ортотропной модели)

Для конструирования животной модели с ортотропной ксенотрансплантацией (ортотропного ксенографта) и общей животной модели (ортотропного ксенографта), субкультивировали клетки A549/LUC и клетки DLD-1, а затем раковые клетки инъецировали в легкие и толстую кишку мышей, соответственно.

Поскольку раковые клетки инъецировали непосредственно модели в орган мыши, рост рака не подтверждался путем наблюдения за внешним видом мыши. Таким образом, в животной модели, которой инъецировали клетки A549/LUC, проводили инъекцию D-люциферина интраперитонеально каждые 7 дней для определения насыщения роста рака посредством измерения путем построения люминесцентных изображений с использованием устройства-системы для формирования изображений IVIS (Xenogen). С другой стороны, в животной модели, которой инъецировали клетки DLD-1, через 7 дней экспериментальных субъектов умерщвляли для определения насыщения роста рака. В животной модели, которой инъецировали клетки A549/LUC, через приблизительно 4 недели, когда было определено, что интенсивность люминесценции составляет приблизительно 10⁷ фотонов/с/см²/ср, ей инъецировали кальциевые соли из Примеров 1-3 и ее использовали для формирования изображений in vivo. В животной модели, которой инъецировали клетки DLD-1, через приблизительно 7 недель после введения кальциевых солей из Примера 1 наблюдали противораковый эффект в конце стадии экспрессии рака толстой и прямой кишки.

Иными словами, общие клетки DLD-1 трансплантировали в прямую кишку для конструирования мышиной модели рака толстой и прямой кишки (ортотопической модели DLD-1), и в легких проводили ортотопическую ксенотрансплантацию для конструирования мышиной модели рака легких (ортотопической модели A549/LUC). Затем каждой мышиной модели вводили лекарственные средства, как показано в Таблице 10 ниже.

Таблица 10

Испытательный пример 5-2: Изменение противоракового эффекта и метастаза рака в животной модели, которой были инъецированы кальциевые соли (1)

Кальциевые соли из Примера 1 вводили той же мышиной модели, сконструированной в Испытательном Примере 5-1 (ортотопической модели DLD-1), и проводили вскрытие через 1 неделю для наблюдения за состоянием роста раковых клеток. Результаты показаны на ФИГ. 19a. Кроме того, измеряли вес раковой ткани для подтверждения противораковой эффективности вещества по изобретению in vivo, и результаты показаны на ФИГ. 19b.

Как показано на ФИГ. 19a и ФИГ. 19b, все мышиные модели, которые не были обработаны кальциевыми солями из Примера 1 (ортотопическая модель DLD-1), продемонстрировали быстрый рост раковых клеток, однако все мышиные модели, которые были обработаны кальциевыми солями из Примера 1 (ортотопическая модель DLD-1), продемонстрировали значительно подавленный рост раковых клеток.

Испытательный пример 5-3: Изменение противоракового эффекта и метастаза рака в животной модели, которой были инъецированы кальциевые соли (2)

Кальциевые соли из Примеров 1-3 вводили той же мышиной модели, сконструированной в Испытательном Примере 5-1 (ортотопическая модель A549/LUC), соответственно. Затем, подтверждали распределение ткани, метастаз и противораковую эффективность вещества по изобретению in vivo, и их изображения показаны на ФИГ. Кроме того, для более точной количественной оценки каждого результата формирования изображений, изображения in vivo получали путем измерения ROI (изучаемой области), что представляет собой программу «IVIS spectrum» (Xenogen), и результаты показаны на ФИГ. 21. Измеряли коэффициент выживаемости мышиной модели (ортотопической модели A549/LUC), и результаты показаны на ФИГ. 22.

Как показано на Фиг. 20, 21 и 22, было подтверждено, что кальциевые соли из Примеров 1-3 обладали превосходной противораковой эффективностью, способностью к подавлению метастаза и превосходным коэффициентом выживаемости по сравнению с контролем. В частности, в Примере 1 рост и метастаз раковых тканей не были продемонстрированы вовсе в ходе введения лекарственного средства и даже после прекращения введения лекарственного средства. Этим предполагается то, что митохондрии в раковых клетках были реформированы.

Таким образом, через экспериментальные результаты, описанные выше, было подтверждено, что ионное соединение, скомбинированное с ионом металла, в соответствии с настоящим изобретением, может повышать поглощение у раковых клеток. Кроме того, было подтверждено, что оно может окислять раковые клетки путем снижения pH в раковых клетках, и ионное соединение, в котором два соединения были скомбинированы с ионом металла, было более эффективно в апоптозе раковых клеток по сравнению с ионным соединением, в котором одно соединение (аскорбиновая кислота или дихлоруксусная кислота) было скомбинировано с ионом металла.

Кроме того, было подтверждено, что ионное соединение может ингибировать аэробный гликолиз раковых клеток путем повышения пирувата и α-кетоглутарата, а также может снижать пролиферацию и метастаз раковых клеток путем изменения уровня экспрессии β-катенина, PARP и VEGF. Кроме того, через эксперимент способности к пролиферации линий раковых клеток было подтверждено, что лекарственное средство против рака может демонстрировать улучшенный противораковый эффект при использовании в комбинации с традиционными лекарственными средствами против рака.

Реферат

Группа изобретений относится к области фармацевтики и может быть использована при лечении рака. Фармацевтическая композиция для лечения рака содержит ионное соединение, в котором два соединения, выбранные из аскорбиновой кислоты, дихлоруксусной кислоты и лактата, скомбинированы с Ca²⁺ в качестве активного ингредиента. Предложены также пищевая композиция, содержащая указанное ионное соединение и фармацевтические композиции, содержащие указанное ионное соединение, для подавления метастаза рака и для профилактики или ослабления усталости, связанной с раком. Композиции обеспечивают улучшенный терапевтический эффект за счет нарушений метаболизма раковых клеток, эффективно ингибируют пролиферацию, инвазию и метастаз раковых клеток. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 22 ил., 10 табл., 5 пр.

Формула