Афукозилированные антитела к рецептору фактора роста фибробластов fgfr2iiib - RU2698061C2

Чертежи

Показать все 24 чертежа(ей)

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[01] Представлены афукозилированные антитела к рецептору фактора роста фибробластов (FGFR, fibroblast growth factor receptor) FGFR2IIIb.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[02] Члены семейства фактора роста фибробластов (FGF, fibroblast growth factor) связываются с четырьмя известными тирозинкиназными рецепторами, рецепторами фактора роста фибробластов 1-4 (FGFR1 4, fibroblast growth factor receptors 1-4) и с их изоформами, при этом разные FGF в разной степени связываются с разными FGFR (Zhang et al., J. Biol. Chem. 281:15694, 2006). Белковая последовательность человеческого FGFR2 представлена, напр., в GenBank локус AF487553. Каждый FGFR состоит из внеклеточного домена, содержащего три иммуноглобулиновых (Ig) домена (D1, D2 и D3), одну трансмембранную спираль и внутриклеточный каталитический киназный домен (Mohammadi et al., Cytokine Growth Factor Revs, 16:107, 2005). В линкерной области расположен отрезок кислых аминокислот, называемый «кислотным боксом» (AB, acid box). Считается, что область, содержащая D1 и AB, участвует в аутоингибировании рецептора, которое нейтрализуется при связывании с лигандом. FGF связываются с рецепторами в первую очередь через D2 и D3 области рецепторов. Для FGFR характерен множественный альтернативный сплайсинг мРНК, приводящий к образованию ряда изоформ (Ornitz et al., J. Biol. Chem. 271:15292, 1996; последовательности FGFR2 и его изоформ см. также в Swiss-Prot: P21802 и изоформы с P21802-1 по -20). Следует отметить, что существуют формы, содержащие все три Ig домена (изоформа α) или только два Ig домена: домены D2 и D3 без D1 (изоформа β). У FGFR1 - FGFR3 все формы содержат первую половину D3, обозначаемую как IIIa, но вторая половина D3 может кодироваться двумя альтернативными экзонами, что приводит к образованию форм IIIb и IIIc. У FGFR2 эти формы обозначают, соответственно, FGFR2IIIb и FGFR2IIIc (или просто FGFR2b и FGFR2c); соответствующие бета-формы обозначают FGFR2(beta)IIIb и FGFR2(beta)IIIc. FGFR2IIIb форма FGFR2 (также обозначаемая K-sam-II) является высокоаффинным рецептором как FGF1, так и членов семейства фактора роста кератиноцитов (KGF, keratinocyte growth factor) (FGF7, FGF10 и FGF22), в то время как FGFR2IIIc (также обозначаемый K-sam-I) хорошо связывает как FGF1, так и FGF2, но не связывает членов семейства KGF (Miki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:246, 1992). Действительно, FGFR2IIIb является единственным рецептором членов семейства KGF (Ornitz et al., 1996, op. cit.), и поэтому также называется рецептором фактора роста кератиноцитов (KGFR, keratinocyte growth factor receptor).

[03] FGFR и их изоформы по-разному экспрессируются в разных тканях. FGFR2IIIb (и форма IIIb FGFR1 и FGFR3) экспрессируется в эпителиальных тканях, в то время как FGFRIIIc экспрессируется в мезенхимальных тканях (Duan et al., J. Biol. Chem. 267:16076, 1992; Ornitz et al., 1996, в цитируемой работе). Определенные FGF лиганды данных рецепторов имеют противоположный профиль экспрессии. Так, члены подсемейства KGF, включая FGF7 (KGF), FGF10 и FGF22, связываются только с FGFRIIIb (Zhang et al., в цитируемой работе) и экспрессируются в мезенхимальных тканях и могут, таким образом, быть паракринными эффекторами эпителиальных клеток (Ornitz et al., 1996, в цитируемой работе). Напротив, члены подсемейства FGF4, FGF4-6, связываются с FGFR2IIIc и экспрессируются как в эпителиальных, так и в мезенхимальных линиях и могут, таким образом, выполнять либо аутокринные, либо паракринные функции. Профили экспрессии изоформ FGFR2 и их лигандов обеспечивают участие FGFR2 в эпителиально-мезенхимальных взаимодействиях (Finch et al., Dev. Dyn. 203:223, 1995), поэтому неудивительно, что нокаут FGFR2IIIb в мышах приводит к развитию тяжелых эмбриональных нарушений и летальности (De Moerlooze et al., Development 127:483, 2000).

[04] KGF (FGF7) и KGFR (FGFR2IIIb) сверхэкспрессируются при многих видах рака поджелудочной железы (Ishiwata et al., Am. J. Pathol. 153: 213, 1998), а их коэкспрессия коррелирует с плохим прогнозом (Cho et al., Am. J. Pathol. 170:1964, 2007). Некоторые мутации гена FGFR2 были обнаружены в 12% большой панели карцином эндометрия (матки), и в нескольких исследуемых случаях они обеспечивали выживание опухолевых клеток (Dutt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:8713, 2008). В двух опухолях обнаружили, что мутация FGFR2 была такой же заменой S252W, как и связанная с синдромом Аперта. Амплификация и сверхэкспрессия FGFR2 ассоциированы с недифференцированным, диффузным типом рака желудка, имеющим особенно плохой прогноз, а ингибирование активности FGFR2 низкомолекулярными соединениями потенциально ингибировало пролиферацию таких раковых клеток (Kunii et al., Cancer Res. 68:2340, 2008; Nakamura et al., Gastroenterol. 131:1530, 2006).

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[05] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлено антитело к FGFR2IIIb, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит: (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и вариабельная область легкой цепи содержит: (iv) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (v) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (vi) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; где антитело афукозилировано. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело лишено фукозы в положении Asn297. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены композиции, содержащие множество антител к FGFR2IIIb, где вариабельная область тяжелой цепи каждого антитела к FGFR2IIIb в композиции содержит: (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; а вариабельная область легкой цепи каждого антитела к FGFR2IIIb в композиции содержит: (iv) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (v) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (vi) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; где по меньшей мере 95% антител в композиции афукозилированы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция может быть супернатантом образующей антитела клеточной линии. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция может быть буферной композицией. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлена композиция, содержащая множество афукозилированных антител к FGFR2IIIb, где антитела конкурируют за связывание с FGFR2IIIb с антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

[06] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела являются моноклональными антителами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела являются химерными антителами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела являются гуманизированными антителами. В любом из описанных в данной заявке вариантов осуществления настоящего изобретения антитела могут содержать константную область легкой цепи κ. В любом из описанных в данной заявке вариантов осуществления настоящего изобретения антитела могут содержать константную область тяжелой цепи IgG1.

[07] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела обладают повышенной активностью ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity, антителозависимая клеточная цитотоксичность) in vitro по сравнению с фукозилированными антителами к FGFR2IIIb, имеющими такую же аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb вызывают специфичный лизис, который по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 15, по меньшей мере на 20, по меньшей мере на 25, по меньшей мере на 30, по меньшей мере на 35, по меньшей мере на 40, по меньшей мере на 45, по меньшей мере на 50, по меньшей мере на 60, по меньшей мере на 65, по меньшей мере на 70 или по меньшей мере на 75 процентных пунктов выше, чем специфичный лизис, вызванный фукозилированными антителами к FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активность ADCC определяют, применяя в качестве клеток-мишеней клетки Ba/F3, экспрессирующие FGFR2IIIb, и выделенные человеческие PBMC (peripheral blood mononuclear cells, мононуклеарные клетки периферической крови) в качестве эффекторных клеток.

[08] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела обладают повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA по сравнению с фукозилированными антителами к FGFR2IIIb, имеющими такую же аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb связывают Fc гамма RIIIA с аффинностью, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 12 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 17 раз или по меньшей мере в 20 раз превышающей аффинность фукозилированных антител к FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аффинность к Fc гамма RIIIA определяют с помощью поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Fc гамма RIIIA выбирают из Fc гамма RIIIA(V158) и Fc гамма RIIIA(F158). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Fc гамма RIIIA является Fc гамма RIIIA(V158).

[09] В любом из описанных в данной заявке вариантов осуществления настоящего изобретения антитела могут связываться с FGFR2IIIb, но не с FGFR2IIIc.

[010] В любом из описанных в данной заявке вариантов осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая множество афукозилированных антител к FGFR2IIIb, содержит по меньшей мере 95% афукозилированных антител. В любом из описанных в данной заявке вариантов осуществления настоящего изобретения фукозилирование композиции, содержащей множество афукозилированных антител к FGFR2IIIb, может быть не определяемым. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения наличие фукозы можно определить способом, включающим высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), капиллярный электрофорез или времяпролетную МАЛДИ масс-спектрометрию.

[011] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело к FGFR2IIIb, описанное в данной заявке, где клетки-хозяева лишены функционального гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы (FUT8). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки-хозяева являются клетками CHO.

[012] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены способы создания афукозилированных антител к FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело к FGFR2IIIb, где клетки-хозяева лишены функционального гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы (FUT8). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ создания афукозилированных антител к FGFR2IIIb включает культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для получения афукозилированного антитела к FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ далее включает получение антитела к FGFR2IIIb, образованного клетками-хозяевами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения менее 5% антител к FGFR2IIIb, образованных клетками-хозяевами, содержат фукозу. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере 95% антител к FGFR2IIIb, образованных клетками-хозяевами, лишены фукозы (т.е. афукозилированы). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фукоза не определяется в антителах к FGFR2IIIb, образованных клетками-хозяевами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения наличие фукозы определяют способом, включающим ВЭЖХ, капиллярный электрофорез или времяпролетную МАЛДИ масс-спектрометрию.

[013] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены фармацевтические композиции, где фармацевтическая композиция содержит афукозилированные антитела к FGFR2IIIb, описанные в данной заявке, и фармацевтически приемлемый носитель.

[014] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены способы лечения рака. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей афукозилированные антитела к FGFR2IIIb, описанные в данной заявке, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рак выбирают из рака желудка, рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака поджелудочной железы и рака пищевода. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рак является раком желудка. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке происходит амплификация гена FGFR2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при амплификации FGFR2 соотношение FGFR2:CEN10 (центромера хромосомы 10) составляет >3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке FGFR2IIIb сверхэкспрессируется. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на повышенном уровне, превышающем уровень FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на нормализованном уровне, который более чем в 2 раза, 3 раза, 5 раз или 10 раз превышает нормализованный уровень экспрессии FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения уровни экспрессии нормализуют к GUSB. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке FGFR2IIIb сверхэкспрессируется, но амплификации гена FGFR2 не происходит. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессию или сверхэкспрессию FGFR2IIIb определяют с помощью иммуногистохимии. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения 1+, 2+ или 3+ иммуногистохимическое окрашивание опухолевых клеток указывает на сверхэкспрессию FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения 2+ или 3+ иммуногистохимическое окрашивание опухолевых клеток указывает на сверхэкспрессию FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногистохимическое окрашивание оценивают, как описано в Примере 6.

[015] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ лечения рака далее включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, выбираемого из препарата платины, паклитаксела, ABRAXANE®, доцетаксела, гемцитабина, капецитабина, иринотекана, эпирубицина, FOLFOX, FOLFIRI, лейковорина, фторурацила, митомицина C и доксорубицина гидрохлорида. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения препарат платины выбирают из цисплатина, оксалиплатина и карбоплатина. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ лечения рака далее включает введение паклитаксела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ лечения рака далее включает введение цисплатина и/или 5-FU.

[016] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены применения фармацевтической композиции, содержащей афукозилированные антитела к FGFR2IIIb, описанные в данной заявке, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения такое применение нацелено на лечение рака у индивидуума с раком. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рак выбирают из рака желудка, рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака поджелудочной железы или рака пищевода. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рак является раком желудка. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке происходит амплификация гена FGFR2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при амплификации FGFR2 соотношение FGFR2:CEN10 (центромера хромосомы 10) составляет >3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке FGFR2IIIb сверхэкспрессируется. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на повышенном уровне, превышающем уровень FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на нормализованном уровне, который более чем в 2 раза, 3 раза, 5 раз или 10 раз превышает нормализованный уровень экспрессии FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения уровни экспрессии нормализуют к GUSB. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке FGFR2IIIb сверхэкспрессируется, но амплификации гена FGFR2 не происходит. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессию или сверхэкспрессию FGFR2IIIb определяют с помощью иммуногистохимии. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения 1+, 2+ или 3+ иммуногистохимическое окрашивание опухолевых клеток указывает на сверхэкспрессию FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения 2+ или 3+ иммуногистохимическое окрашивание опухолевых клеток указывает на сверхэкспрессию FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногистохимическое окрашивание оценивают, как описано в Примере 6.

[017] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены фармацевтические композиции для лечения рака, где фармацевтическая композиция содержит афукозилированные антитела к FGFR2IIIb, описанные в данной заявке, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рак выбирают из рака желудка, рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака поджелудочной железы или рака пищевода. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рак является раком желудка. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке происходит амплификация гена FGFR2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при амплификации FGFR2 соотношение FGFR2:CEN10 (центромера хромосомы 10) составляет >3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке FGFR2IIIb сверхэкспрессируется. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на повышенном уровне, превышающем уровень FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на нормализованном уровне, который более чем в 2 раза, 3 раза, 5 раз или 10 раз превышает нормализованный уровень экспрессии FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения уровни экспрессии нормализуют к GUSB. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке FGFR2IIIb сверхэкспрессируется, но амплификации гена FGFR2 не происходит. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессию или сверхэкспрессию FGFR2IIIb определяют с помощью иммуногистохимии. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения 1+, 2+ или 3+ иммуногистохимическое окрашивание опухолевых клеток указывает на сверхэкспрессию FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения 2+ или 3+ иммуногистохимическое окрашивание опухолевых клеток указывает на сверхэкспрессию FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногистохимическое окрашивание оценивают, как описано в Примере 6.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[018] На фигурах с 1A по 1C показана активность ADCC афукозилированных αFGFR2bA и фукозилированных αFGFR2bF в отношении экспрессирующих FGFR2IIIb клеток Ba/F3, как обсуждают в Примере 3. В подписях «αFGFR2bF/FGFR2b» указывает на то, что фукозилированное антитело αFGFR2bF тестировали в отношении экспрессирующих FGFR2IIIb клеток-мишеней Ba/F3.

[019] На фигурах с 2A по 2D показана эффективность афукозилированных αFGFR2bA и фукозилированных αFGFR2bF в ксенотрансплантатной модели рака желудка OCUM-2M, при (A и B) 10 мг/кг и (C и D) 3 мг/кг, как обсуждают в Примере 4.

[020] На фигурах 3A и 3B показана дозозависимая эффективность афукозилированных αFGFR2bA в ксенотрансплантатной модели рака желудка OCUM-2M, как обсуждают в Примере 4.

[021] На фигурах 4A и 4B показана эффективность комбинированной терапии афукозилированными αFGFR2bA и паклитакселом в ксенотрансплантатной модели рака желудка OCUM-2M, как обсуждают в Примере 4.

[022] На фигурах 5A и 5B показана эффективность комбинированной терапии афукозилированными αFGFR2bA и 5-FU/цисплатином в ксенотрансплантатной модели рака желудка OCUM-2M, как обсуждают в Примере 4.

[023] На фигурах 6A и 6B показана эффективность афукозилированных αFGFR2bA в ксенотрансплантатной модели рака груди MFM-223, как обсуждают в Примере 4.

[024] На фигуре 7 показан гликановый профиль антитела αFGFR2b, полученного в (A) клетках Potelligent® CHOK1SV и (B) клетках CHOK1SV, как обсуждают в Примере 1.

[025] На фигуре 8 показаны схематические диаграммы N-связанных гликанов, обычно обнаруживаемых в антителах.

[026] На фигуре 9 показана ADCC клеток Ba/F3 FGF2b при повышении концентрации αFGFR2bA или αFGFR2bF. Исследования проводили с нормальными человеческими PBMC при соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней (E:T, effector: target) равном 25:1, как описано в Примере 5. Данные отмечены как уровень высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH, lactate dehydrogenase).

[027] На фигуре 10 показана ADCC клеток OCUM-2M при повышении концентрации αFGFR2bA или αFGFR2bF. Исследования проводили с нормальными человеческими PBMC при соотношении E:T, равном 25:1. Как описано в Примере 5. Данные отмечены как процент специфичного лизиса.

[028] На фигурах с 11A по 11F показано определение FGFR2IIIb в образцах опухолевой ткани с помощью иммуногистохимии, как описано в Примере 6.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[029] Представлены афукозилированные антитела, которые связывают FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также представлены тяжелые цепи и легкие цепи афукозилированных антител, которые способны формировать антитела, которые связывают FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены афукозилированные антитела, тяжелые цепи и легкие цепи, содержащие один или несколько гипервариабельных участков (HVR, hypervariable region). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb обладают повышенной активностью ADCC относительно фукозилированных антител к FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb обладают повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA относительно фукозилированных антител к FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb обладают повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA(V158) относительно фукозилированных антител к FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb обладают повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA(F158) относительно фукозилированных антител к FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb не связывают FGFR2IIIc.

[030] Представлены полинуклеотиды, кодирующие антитела, которые связывают FGFR2IIIb. Также представлены полинуклеотиды, кодирующие тяжелые цепи и легкие цепи антител. Представлены клетки-хозяева, которые экспрессируют афукозилированные антитела к FGFR2IIIb. Представлены способы лечения с применением афукозилированных антител к FGFR2IIIb. Такие способы включают, но не ограничиваются способами лечения рака, такого как рак желудка, рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак поджелудочной железы и рака пищевода.

[031] Заголовки разделов, применяемые в данной заявке, приведены в организационных целях и не должны быть истолкованы как ограничивающие описанный предмет изобретения.

[032] Все ссылки, процитированные в данной заявке, включая патентные заявки, патентные публикации и учетные номера Genbank, включены в настоящую заявку посредством ссылки так, как была бы специально и отдельно указана каждая отдельная ссылка для включения в полном объеме посредством ссылки.

[033] Техники и процедуры, описанные или процитированные в данной заявке, как правило, понятны и обычно осуществляются с помощью традиционной методологии специалистами в данной области техники, такие как, например, широко применимые методологии, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3^rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al.eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993); и их обновленных версиях.

I. Определения

[034] Если иное не определено, научные и технические термины, применяемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области техники. Более того, если иное не определено контекстом или не указано точно, термины в единственном числе должны включать множественное число, и термины во множественном числе должны включать единственное число.

[035] Следует понимать, что аспект и варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в данной заявке, включают «состоящие из» и/или «состоящие в основном из» аспектов и вариантов осуществления. Как применяют в данной заявке, форма единственного числа включают ссылки на множественное число, если иное не оговорено.

[036] В данной заявке применение «или» означает «и/или», если иное четко не определено или не очевидно специалистам в данной области. В контексте пункта патентной формулы, зависящего от другого зависимого пункта «или» относится к нескольким предыдущим независимым или зависимым пунктам.

[037] Как понимают специалисты в данной области техники, указание на «приблизительное» значение или параметр в данной заявке включает (и описывает) варианты осуществления изобретения, которые направлены на данное значение или параметр в чистом виде. Например, описание, указывающее на «приблизительно Х» включает описание «Х»

[038] Термины «молекула нуклеиновой кислоты», «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» могут применяться взаимозаменяемо и относятся к полимеру нуклеотидов. Такие полимеры нуклеотидов могут содержать природные и/или искусственные нуклеотиды и включать, но не ограничиваться ДНК, РНК и ПНК. «Последовательность нуклеиновой кислоты» относится к линейной последовательности нуклеотидов, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты или полинуклеотид.

[039] Термины «полипептид» и «белок» применяют взаимозаменяемо для обозначения полимера аминокислотных остатков, без ограничения минимальной длины. Такие полимеры аминокислотных остатков могут содержать природные или искусственные аминокислотные остатки и включать, но не ограничиваться пептидами, олигопептидами, димерами, триммерами и мультимерами аминокислотных остатков. Определение включает как полноразмерные белки, так и их фрагменты. Термины также включают постэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилирование, сиалирование, ацетилирование, фосфорилирование и подобное. Более того, в целях настоящего изобретения «полипептид» относится к белку, который включает модификации, такие как делеции, добавления и замены (как правило, консервативные в природе) исходной последовательности, если белок при этом сохраняет желаемую активность. Данные модификации могут быть направленными, такими как полученные посредством сайт-направленного мутагенеза, или случайными, такими как полученные посредством мутаций хозяев, которые образуют белки, или ошибками в результате ПЦР-амплификации.

[040] «FGFR2IIIb» или «FGFR2b» применяют взаимозаменяемо для обозначения сплайс-формы рецептора фактора роста фибробластов 2 IIIb. Пример человеческого FGFR2IIIb показан в GenBank с учетным номером NP_075259.4, от 7 июля 2013 г. Не ограничивающий пример аминокислотной последовательности зрелого человеческого FGFR2IIIb показан в SEQ ID NO: 1.

[041] «FGFR2IIIc» или «FGFR2c» применяют взаимозаменяемо для обозначения сплайс-формы рецептора фактора роста фибробластов 2 IIIc. Пример человеческого FGFR2IIIc показан в GenBank с учетным номером NP_000132.3 от 7 июля 2013 г. Не ограничивающий пример аминокислотной последовательности зрелого FGFR2IIIc показан в SEQ ID NO: 12.

[042] Термин «эпитоп» относится к сайту целевой молекулы (напр., антигена, такого как белок, нуклеиновая кислота, углевод или липид), с которым связывается антигенсвязывающая молекула (напр., антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, содержащий связывающие области антитела). Эпитоп часто состоит из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты, полипептиды или боковые цепи сахаров, и обладает характеристиками трехмерной структуры, а также специфичными характеристиками заряда. Эпитопы могут быть образованы как смежными, так и сближенными несмежными остатками (напр., остатками аминокислот, нуклеотидов, сахаров, липидов) целевой молекулы. Эпитопы, образованные смежными остатками (напр., остатками аминокислот, нуклеотидов, сахаров, липидов), как правило, сохраняются при обработке денатурирующими растворителями, в то время как эпитопы, образованные при формировании третичной структуры, как правило, теряются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп может включать, но не ограничиваться по меньшей мере 3, по меньшей мере 5 или 8-10 остатками (напр., аминокислот или нуклеотидов). В некоторых примерах эпитоп меньше 20 остатков (напр., аминокислот или нуклеотидов) в длину, меньше 15 остатков или меньше 12 остатков. Два антитела могут связываться с одним и тем же эпитопом внутри антигена, если они конкурируют за связывание с антигеном.

[043] «Нелинейный эпитоп» или «конформационный эпитоп» содержит несмежные полипептиды, аминокислоты и/или сахара антигенного белка, с которыми специфично связывается антитело к данному эпитопу.

[044] «Линейный эпитоп» содержит смежные полипептиды, аминокислоты и/или сахара антигенного белка, с которыми специфично связывается антитело к данному эпитопу.

[045] Термин «антитело» в данной заявке применяется в широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая, но не ограничиваясь моноклональными антителами, поликлональными антителами, полиспецифичными антителами (напр., биспецифичными антителами) и фрагментами антител, если они обладают желаемой антигенсвязывающей активностью.

[046] Термин антитело включает, но не ограничивается фрагментами, способными связывать антиген, такими как Fv, одноцепочечный Fv (scFv), Fab, Fab’ и (Fab’)₂. Расщепление антител папаином приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, называемых «Fab»-фрагментами, каждый с одним сайтом связывания антигена, и остаточного «Fc»-фрагмента, название которого отражает способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином приводит к образованию F(ab’)₂ -фрагмента, обладающего двумя антигенсвязывающими сайтами и еще способного перекрестно связывать антиген. Термин антитело также включает, но не ограничивается химерными антителами, гуманизированными антителами и антителами из разных видов, таких как мышь, человек, яванский макак и т.п.

[047] Термин «вариабельная область тяжелой цепи» относится к области, содержащей HVR1, каркасный (FR) 2, HVR2, FR3 и HVR3 тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариабельная область тяжелой цепи также включает по меньшей мере часть FR1 и/или по меньшей мере часть FR4.

[048] Термин «константная область тяжелой цепи» относится к области, содержащей по меньшей мере три константных домена тяжелой цепи, C_H1, C_H2 и C_H3. Не ограничивающие примеры константных областей тяжелой цепи включают γ, δ и α. Не ограничивающие примеры константных областей тяжелой цепи также включают ε и μ. Каждая константная область тяжелой цепи соответствует изотипу антитела. Например, антитело, содержащее константную область γ, является антителом IgG, антитело, содержащее константную область δ, является антителом IgD, а антитело, содержащее константную область α, является антителом IgA. Далее, антитело, содержащее константную область μ, является антителом IgM, а антитело, содержащее константную область ε, является антителом IgE. Конкретные изотипы можно далее подразделить на подклассы. Например, антитела IgG включают, но не ограничиваются антителами IgG1 (содержащими константную область γ₁), IgG2 (содержащими константную область γ₂), IgG3 (содержащими константную область γ₃) и IgG4 (содержащими константную область γ₄); антитела IgA включают, но не ограничиваются антителами IgA1 (содержащими константную область α₁) и IgA2 (содержащими константную область α₂); и антитела IgM включают, но не ограничиваются IgM1 и IgM2.

[049] Термин «тяжелая цепь» относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере вариабельную область тяжелой цепи с лидерной последовательностью или без нее. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь содержит по меньшей мере часть константной области тяжелой цепи. Термин «полноразмерная тяжелая цепь» относится к полипептиду, содержащему вариабельную область тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи с лидерной последовательностью или без нее.

[050] Термин «вариабельная область легкой цепи» относится к области, содержащей HVR1, каркасный (FR) 2, HVR2, FR3 и HVR3 легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариабельная область легкой цепи также включает FR1 и/или FR4.

[051] Термин «константная область легкой цепи» относится к области, содержащей константный домен легкой цепи, C_L. Не ограничивающие примеры константной области легкой цепи включают λ и κ.

[052] Термин «легкая цепь» относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере вариабельную область легкой цепи с лидерной последовательностью или без нее. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения легкая цепь содержит по меньшей мере часть константной области легкой цепи. Термин «полноразмерная легкая цепь» относится к полипептиду, содержащему вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи с лидерной последовательностью или без нее.

[053] Термин «гипервариабельный участок» или «HVR» (hypervariable region) относится к каждому участку вариабельного домена антитела с гипервариабельностью последовательности и/или образующему структурно обособленные петли («гипервариабельные петли»). Как правило, нативные четырехцепочечные антитела содержат шесть HVR; три в V_H (H1, H2, H3) и три в V_L (L1, L2, L3). HVR, как правило, содержат аминокислотные остатки гипервариабельных петель и/или «определяющих комплементарность участков» (CDR, complementarity determining regions), которые обладают наибольшей вариабельностью последовательности и/или принимают участие в узнавании антигена. Примеры гипервариабельных петель встречаются в аминокислотных остатках 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3). (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Примеры CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) встречаются в аминокислотных остатках 24-34 L1, 50-56 L2, 89-97 L3, 31-35B H1, 50-65 H2 и 95-102 H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Термины «гипервариабельные участки» (HVR) и «определяющие комплементарность участки» (CDR) применяют в данной заявке взаимозаменяемо в отношении частей вариабельной области, образующих антигенсвязывающие области.

[054] «Акцепторная каркасная область человека» для целей настоящей заявки представляет собой каркасную область, содержащую аминокислотную последовательность каркасной области вариабельного домена легкой цепи (V_L) или каркасной области вариабельного домена тяжелой цепи (V_H), происходящую из каркасной области иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасной области человека, как определено ниже. Акцепторная каркасная область человека, происходящая из каркасной области иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасной области человека, может содержать такую же как у них аминокислотную последовательность, или она может содержать аминокислотные замены. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения количество аминокислотных замен составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность акцепторной каркасной области человека V_L идентична последовательности каркасной области иммуноглобулина человека V_L или консенсусной последовательности каркасной области человека.

[055] «Аффинность» относится к силе всех суммарных нековалентных взаимодействий между отдельным участком связывания молекулы (напр., антитела) и его связывающим партнером (напр., антигеном). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения «аффинность связывания» относится к присущей аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (напр., антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y обычно можно представить константой диссоциации (K_d). Аффинность можно измерить обычными способами, известными в данной области техники, включая описанные в данной заявке.

[056] «Аффинно зрелое» антитело относится к антителу с одним или несколькими изменениями одного или нескольких гипервариабельных участков (HVR) и/или определяющих комплементарность участков (CDR) по сравнению с родительским антителом, не имеющим этих изменений, изменений, которые улучшают аффинность антитела к антигену.

[057] «Химерное антитело» относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из определенного источника или вида, в то время как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или вида. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химерное антитело относится к антителу, содержащему по меньшей мере одну вариабельную область из первого вида (такого как мышь, крыса, яванский макак и пр.) и по меньшей мере одну константную область из второго вида (такого как человек, яванский макак и пр.). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химерное антитело содержит по меньшей мере одну вариабельную область мыши и по меньшей мере одну константную область человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химерное антитело содержит по меньшей мере одну вариабельную область яванского макака и по меньшей мере одну константную область человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения все вариабельные области химерного антитела происходят из первого вида, а все константные области химерного антитела происходят из второго вида.

[058] «Гуманизированное антитело» относится к антителу, в котором по меньшей мере одна аминокислота в каркасной области нечеловеческой вариабельной области заменена соответствующей аминокислотой человеческой вариабельной области. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированное антитело содержит по меньшей мере одну человеческую константную область или ее фрагмент. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированное антитело является Fab, scFv, (Fab')₂ и пр.

[059] «HVR-привитое антитело» относится к гуманизированному антителу, в котором один или несколько гипервариабельных участков (HVR) из первого (нечеловеческого) вида пересажены на каркасные участки (FR) второго (человеческого) вида.

[060] «Функциональная Fc-область» выполняет «эффекторную функцию» нативной последовательности Fc-области. Примеры «эффекторных функций» включают связывание с Fc-рецептором; связывание с C1q; опосредованную комплементом цитотоксичность (CDC, complement-dependent cellular toxicity); ADCC; фагоцитоз; ингибирование поверхностных клеточных рецепторов (напр., B-клеточного рецептора; BCR, B-cell receptor), напр. Для таких эффекторных функций, которые можно оценить с помощью разных исследований, как правило, необходимо комбинировать Fc-область с доменом связывания (напр., с вариабельным доменом антитела).

[061] «Fc-область с нативной последовательностью» содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, обнаруживаемой в природе. Fc-областей человека с нативной последовательностью включает нативную последовательность Fc-области человеческих IgG1 (не-A и A аллотипов); нативную последовательность Fc-области человеческих IgG2; нативную последовательность Fc-области человеческих IgG3; и нативную последовательность Fc-области человеческих IgG4, а также их встречающиеся в природе варианты.

[062] «Вариантная Fc-область» включает аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Fc-области по меньшей мере на одну аминокислотную модификацию.

[063] «Fc-рецептор» или «FcR» описывает рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения FcγR является нативным человеческим FcR. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения FcR является тем рецептором, который связывает антитело IgG (гамма рецептором) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и формы этих рецепторов, образованные в результате альтернативного сплайсинга. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), имеющие схожие аминокислотные последовательности, которые различаются прежде всего своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM, immunoreceptor tyrosine-based activation motif) в цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM, immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) в цитоплазматическом домене (см., напр., Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Обзор FcR приведен, например, в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Другие FcR, включая рецепторы, которые будут идентифицированы в будущем, попадают под значение термина «FcR» в настоящей заявке.

[064] Термин «Fc-рецептор» или «FcR» также включают неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG в плод (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) и регулирование гомеостаза иммуноглобулинов. Известны способы измерения связывания с FcRn (см., напр., Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).

[065] «Эффекторные функции» относятся к биологическим активностям, присущим Fc-области антитела, варьирующим в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание Clq и опосредованную комплементом цитотоксичность (CDC, complement dependent cytotoxicity); связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; ингибирование поверхностных клеточных рецепторов (напр., B-клеточного рецептора); и активацию В-клеток.

[066] «Человеческие эффекторные клетки» являются лейкоцитами, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют эффекторную функцию (функции) ADCC. Примеры человеческих лейкоцитов, опосредующих ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC, peripheral blood mononuclear cells), натуральные киллеры (НК), моноциты, макрофаги, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы. Эффекторные клетки можно выделить из нативного источника, напр., из крови.

[067] «Антителозависимая клеточная цитотоксичность» или «ADCC» относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемые Ig, связанные с Fc-рецепторами (FcR), присутствуют на определенных цитотоксических клетках (напр., NK (natural killers, натуральные киллеры), нейтрофилах и макрофагах), обеспечивая связывание этих цитотоксических эффекторных клеток с несущей антиген клеткой-мишенью и последующее уничтожение клетки-мишени цитотоксинами. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Обзор экспрессии FcR на гематопоэтических клетках приведен в Таблице 3 на стр. 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оценки активности ADCC интересующей молекулы можно провести исследование ADCC in vitro, такое как описанное в патентах США № 5500362 или 5821337 или в патенте США № 6737056 (Presta). Применяемые в таких исследованиях эффекторные клетки включают PBMC и NK-клетки. В качестве альтернативы или дополнительно активность ADCC интересующей молекулы можно оценить in vivo, напр., в животной модели, такой как раскрытая в Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 95:652-656 (1998). Дополнительные антитела с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области и повышенной или пониженной активностью ADCC описаны, напр., в патенте США № 7923538 и в патенте США № 7994290.

[068] Антитело, обладающее «усиленной активностью ADCC» относится к антителу, которое обладает большей эффективностью опосредования ADCC in vitro или in vivo по сравнению с родительским антителом, где антитело и родительское антитело отличаются по меньшей мере в одном структурном аспекте, а количество такого антитела и родительского антитела, применяемое в исследовании, практически одинаковое. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело и родительское антитело имеют одинаковую аминокислотную последовательность, но антитело является афукозилированным, в то время как родительское антитело фукозилировано. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активность ADCC будут определять в in vitro исследовании ADCC, как раскрыто в настоящей заявке, но предполагают и другие исследования или способы определения активности ADCC, напр., в животной модели и пр. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело с повышенной активностью ADCC обладает повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело с повышенной активностью ADCC обладает повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA (V158). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело с повышенной активностью ADCC обладает повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA (F158).

[069] Антитело с «измененной» аффинностью связывания FcR или активностью ADCC является антителом либо с повышенной, либо с пониженной активностью связывания FcR и/или активностью ADCC по сравнению с родительским антителом, где антитело и родительское антитело отличаются по меньшей мере в одном структурном аспекте. Антитело, «демонстрирующее усиленное связывание» с FcR, связывает по меньшей мере один FcR с большей аффинностью, чем родительское антитело. Антитело, «демонстрирующее пониженное связывание» с FcR, связывает по меньшей мере один FcR с меньшей аффинностью, чем родительское антитело. Такие антитела, демонстрирующие более слабо связывание с FcR, могут обладать малым или незаметным связыванием с FcR, напр., 0-20% связыванием с FcR по сравнению с нативной последовательностью Fc-области IgG.

[070] «повышенная аффинность к Fc гамма RIIIA» относится к антителу, обладающему большей аффинностью к Fc гамма RIIIA (также называемому в некоторых случаях CD16a), чем родительское антитело, где антитело и родительское антитело отличаются по меньшей мере в одном структурном аспекте. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело и родительское антитело имеют одинаковую аминокислотную последовательность, но антитело является афукозилированным, в то время как родительское антитело фукозилировано. Можно применять любой подходящий способ определения аффинности к Fc гамма RIIIA. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аффинность к Fc гамма RIIIA определяют способом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело с повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA обладает повышенной активностью ADCC. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело с повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA обладает повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA(V158). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело с повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA обладает повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA(F158).

[071] «Афукозилированное» антитело или «лишенное фукозы» антитело относится к антителам изотипов IgG1 или IgG3, лишенных фукозы в константной области гликозилирования. Гликозилирование человеческих IgG1 или IgG3 происходит по Asn297 в виде корового фукозилированного биантенного комплексного олигосахарида, и завершается гликозилирование добавлением до 2 остатков Gal. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антител лишено фукозы в положении Asn297. Такие структуры обозначают G0, G1 (α1,6 или α1,3) или G2 гликановыми остатками в зависимости от количества терминальных остатков Gal. См., напр., Raju, T. S., BioProcess Int. 1: 44-53 (2003). Тип гликозилирования Fc-области антител в CHO описан, напр., в Routier, F. H., Glycoconjugate J. 14: 201-207 (1997). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере 85% партии антител, рекомбинантно экспрессирующихся в клетках-хозяевах CHO с немодифицированным аппаратом гликозилирования, фукозилированы по Asn297. В случае композиции, содержащей множество антител, антитела считают афукозилированными, если <5% антител в композиции содержат фукозы в положении Asn297. Способы определения фукозы включают любые способы, известные в данной области техники, включая способы, описанные в данной заявке. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фукозу определяют способом, описанным в Примере 1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фукоза не определяется в композиции, содержащей множество афукозилированных антител. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело обладает повышенной активностью ADCC. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело обладает повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело обладает повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA(V158). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело обладает повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA(F158).

[072] «Опосредуемая комплементом цитотоксичность» или «CDC» относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента начинается со связывания первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны со своим узнаваемым антигеном. Для оценки активации комплемента можно провести исследование CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Антитела с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области и повышенной или пониженной способностью связываться с C1q описаны, напр., в патенте США № 6194551 B1, в патенте США № 7923538, в патенте США № 7994290 и WO 1999/51642. См. также, напр., Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

[073] Термин «в основном схожий» или «в основном такой же», как применяют в данной заявке, указывает на достаточно высокую степень сходства между двумя или более численными значениями, такую, что специалисты в данной области техники будут считать различие между двумя или более значениями малозначимым или не имеющим биологического и/или статистического значения в контексте биологической характеристики, измеряемой указанным значением. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения два или более в основном схожих значения отличаются не более чем приблизительно на любое из 5%, 10%, 15%, 20%, 25% или 50%.

[074] Фраза «в основном сниженное» или «в основном разное», как применяют в данной заявке, указывает на достаточно высокую степень различия двух числовых значений, такую, что специалисты в данной области техники будут считать различие двух значений статистически значимым в контексте биологической характеристики, измеряемой указанными значениями. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения два в основном разных числовых значения отличаются на более чем приблизительно любое из 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%.

[075] Термины «лидерная последовательность» и «сигнальная последовательность» применяют взаимозаменяемо для обозначения последовательности аминокислотных остатков, расположенной на N-конце полипептида, которая способствует секреции полипептида из клеток млекопитающих. Лидерную последовательность можно отрезать при экспорте полипептида из клеток млекопитающих с образованием зрелого белка. Лидерные последовательности могут быть природными или синтетическими и могут быть гетерологичными или гомологичными белку, к которому они присоединены.

[076] Полипептид с «нативной последовательностью» содержит полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, как и полипептид, обнаруживаемый в природе. Таким образом, полипептид с нативной последовательностью может иметь аминокислотную последовательность встречающегося в природе полипептида из любого млекопитающего. Такой полипептид с нативной последовательностью можно выделить из природного источника или получить рекомбинантными или синтетическими способами. Термин полипептид с «нативной последовательностью» при этом включает встречающиеся в природе укороченные или секретируемые формы полипептида (напр., последовательность внеклеточного домена), встречающиеся в природе варианты форм (напр., форм, образованных в результате альтернативного сплайсинга) и встречающиеся в природе аллельных вариантов полипептида.

[077] Полипептидный «вариант» обозначает биологически активный полипептид, имеющий по меньшей мере 80% идентичность аминокислотной последовательности с нативной последовательностью полипептида после выравнивания последовательностей и введения промежутков при необходимости для достижения максимального процента идентичности последовательности, и при этом любые консервативные замены не учитывают при расчете идентичности последовательности. Такие варианты включают, например, полипептиды, в которых добавлены или делетированы один или несколько аминокислотных остатков на N- или C-конце полипептида. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариант будет иметь по меньшей мере приблизительно 80% идентичность аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариант будет иметь по меньшей мере приблизительно 90% идентичность аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариант будет иметь по меньшей мере приблизительно 95% идентичность аминокислотной последовательности с последовательностью нативного полипептида.

[078] Как применяют в данной заявке, «процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» и «гомологию» в отношении последовательности пептида, полипептида или антитела определяют как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в конкретной последовательности пептида или полипептида после выравнивания последовательности и вставления пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и при этом любые консервативные замены не учитываются при расчете идентичности последовательности. Выравнивание с целью определить процент идентичности аминокислотных последовательностей можно выполнить различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или MEGALIGNTM (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, которые необходимы для того, чтобы получить максимальное выравнивание на всем протяжении последовательности, которая подлежит сравнению.

[079] Аминокислотная замена может включать, но не ограничиваться замещением одной аминокислоты в полипептиде другой аминокислотой. Консервативные замены показаны в Таблице 1 под заголовком «Предпочтительные замены». Более значимые замены представлены в Таблице 1 под заголовком «Примеры замен» и описаны ниже со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Можно ввести аминокислотные замены в заданное антитело и провести скрининг продуктов в отношении желаемой активности, напр., сохранения/улучшения связывания антигена, снижения иммуногенности или улучшения ADCC или CDC.

[080] Аминокислоты можно группировать в соответствии с общими свойствами боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

[081] Неконсервативные замены повлекут за собой замену члена одного из этих классов на другой класс.

[082] Термин «вектор» применяют для описания полинуклеотида, который можно сконструировать так, чтобы он содержал клонированный полинуклеотид или полинуклеотиды, которые можно нарабатывать в клетке-хозяине. Вектор может включать один или несколько из следующих элементов: точку начала репликации, одну или несколько регуляторных последовательностей (таких как, например, промоторы и/или энхансеры), которые регулируют экспрессию заданного полипептида, и/или один или несколько генов селективных маркеров (таких как, например, гены устойчивости к антибиотикам и гены, которые можно применять в колориметрических исследованиях, напр., ген β-галактозидазы). Термин «экспрессионный вектор» относится к вектору, который применяют для экспрессии заданного полипептида в клетке-хозяине.

[083] «Клетка-хозяин» относится к клетке, которая может быть или была реципиентом вектора или выделенного полинуклеотида. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими клетками или эукариотическими клетками. Примеры эукариотических клеток включают клетки млекопитающих, такие как клетки приматов или животных, не относящихся к приматам; клетки грибов, таких как дрожжи; клетки растений и клетки насекомых. Не ограничивающие примеры клеток млекопитающих включают, но не ограничиваются клетками NSO, клетками PER.C6^® (Crucell) и клетками 293 и CHO и их производными, такими как клетки 293-6E и DG44, соответственно.

[084] Термин «выделенная» относится к молекуле, которая была отделена по меньшей мере от нескольких компонентов, с которыми ее обычно обнаруживают в природе или получают. Например, полипептид относят к «выделенным», когда его отделяют по меньшей мере от нескольких компонентов клетки, из которой он был получен. В случае секреции полипептида клеткой после экспрессии физическое отделение супернатанта, содержащего полипептид, от образовавших его клеток считают «выделением» полипептида. Аналогично полинуклеотид считают «выделенным», когда он не является частью более длинного полинуклеотида (такого как, например, геномная ДНК или митохондриальная ДНК в случае ДНК-полинуклеотида), в котором его обычно обнаруживают в природе, или когда его отделяют от по меньшей мере нескольких компонентов клетки, в которой он был образован, напр., в случае РНК-полинуклеотида. Таким образом, ДНК-полинуклеотид, входящий в состав вектора внутри клетки-хозяина, можно отнести к «выделенным».

[085] Термины «индивидуум» или «субъект» применяют взаимозаменяемо в данной заявке для обозначения животного; например, млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены способы лечения млекопитающих, включая, но не ограничиваясь людьми, грызунами, обезьянами, кошками, собаками, лошадьми, коровами, свиньями, овцами, козами, лабораторными млекопитающими, сельскохозяйственными млекопитающими, млекопитающими, применяемыми в спорте и домашними млекопитающими. В некоторых примерах «индивидуум» или «субъект» относят к индивидууму или субъекту, нуждающемуся в лечении заболевания или нарушения.

[086] «Заболевание» или «нарушение» относят к состоянию, которое требует лечения.

[087] Термины «рак» указывает на злокачественное пролиферативное нарушение, ассоциированное с нерегулируемой пролиферацией клеток, неограниченным ростом клеток и пониженной гибелью клеток путем апоптоза. Не ограничивающие примеры рака включают рак желудка, рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак поджелудочной железы и рак пищевода. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке происходит амплификация гена FGFR2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при амплификации FGFR2 соотношение FGFR2:CEN10 (центромера хромосомы 10) составляет >3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb сверхэкспрессируется. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на повышенном уровне, превышающем уровень FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на нормализованном уровне, который более чем в 2 раза, 3 раза, 5 раз или 10 раз превышает нормализованный уровень экспрессии FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения уровни экспрессии нормализуют к GUSB. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке FGFR2IIIb сверхэкспрессируется, но амплификации гена FGFR2 не происходит. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке желудка происходит амплификация гена FGFR2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке желудка с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb сверхэкспрессируется. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке желудка с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на повышенном уровне, превышающем уровень FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке желудка с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на нормализованном уровне, который более чем в 2 раза, 3 раза, 5 раз или 10 раз превышает нормализованный уровень экспрессии FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения уровни экспрессии нормализуют к GUSB. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке желудка FGFR2IIIb сверхэкспрессируется, но амплификации гена FGFR2 не происходит. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сверхэкспрессия является сверхэкспрессией мРНК. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сверхэкспрессия является сверхэкспрессией белка.

[088] Термин «опухоль» применяют в данной заявке для обозначения группы клеток, демонстрирующих аномальные уровни пролиферации и роста. Опухоль может быть доброкачественной, предраковой или злокачественной; клетки злокачественной опухоли являются раковыми. Опухолевые клетки могут быть клетками солидной опухоли или лейкозными опухолевыми клетками. Термин «рост опухоли» применяют в данной заявке для обозначения пролиферации или роста клетки или составляющих опухоль клеток, приводящих к соответствующему увеличению размера опухоли.

[089] Как применяют в данной заявке, «лечение» является подходом для достижения благоприятных или желаемых клинических результатов. «Лечение», как применяют в данной заявке, охватывает любое введение или применение лекарственного средства для лечения заболевания у млекопитающего, включая человека. Для целей настоящего изобретения благоприятные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются любым или несколькими из следующих: уменьшение одного ли нескольких симптомов, уменьшение продолжительности заболевания, предотвращение или задержка распространения заболевания (напр., метастазирования, например, метастазирования в легкие или лимфатический узел), предотвращение или задержка рецидива заболевании, задержка или замедление прогрессии заболевания, уменьшение интенсивности болезненного состояния, ингибирование заболевания или прогрессии заболевания, ингибирование или замедление заболевания или его прогрессии, остановка развития заболевания и ремиссия (как частичную, так и полную). «Лечение» также охватывает один или несколько данных аспектов лечения.

[090] В контексте рака термин «лечение» включает любое или все из следующего: ингибирование роста опухолевых клеток или раковых клеток, ингибирование репликации опухолевых клеток или раковых клеток, уменьшение общей массы опухоли и уменьшение одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием.

[091] Термины «ингибирование» или «ингибировать» обозначают снижение или прекращение развития любых фенотипических характеристик или снижение или уменьшение до нуля частоты, уровня или вероятности развития данной характеристики. «Понизить» или «ингибировать» означает уменьшить, понизить или прекратить активность, функцию и/или количество по сравнению с контролем. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения «понизить» или «ингибировать» обозначает способность вызвать общее уменьшение на 20% или более. В другом варианте осуществления настоящего изобретения «понизить» или «ингибировать» обозначает способность вызвать общее уменьшение на 50% или более. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения «понизить» или «ингибировать» обозначает способность вызвать общее уменьшение на 75%, 85%, 90%, 95% или более.

[092] «Стандарт», как применяют в данной заявке, относится к любому образцу, стандарту или уровню, которые применяют в целях сравнения. Стандарт можно получить из здорового и/или не пораженного болезнью образца. В некоторых примерах стандарт можно получить из необработанного образца. В некоторых примерах стандарт получают из не пораженного болезнью или необработанного образца индивидуума, являющегося субъектом изобретения. В некоторых примерах стандарт получают из одного или нескольких здоровых индивидуумов, не являющихся субъектами изобретения или пациентами.

[093] Как применяют в данной заявке, «задерживание развития заболевания» обозначает отсрочку, задержку, замедление, торможение, стабилизацию, подавление и/или откладывание развития заболевания (такого как рак). Такая задержка может быть разной длины в зависимости от истории заболевания и/или индивидуума, проходящего лечение. Как очевидно специалисту в данной области техники, достаточная или значительная задержка может в действительности вызывать предотвращение заболевания, при котором заболевание индивидуума не развивается. Например, можно задержать позднюю стадию рака, такую как развитие метастазов.

[094] «Предотвращение», как применяют в данной заявке, включает профилактику в отношении возникновения или рецидива заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого заболевание еще не было диагностировано.

[095] Как применяют в данной заявке, «подавить» функцию или активность означает понизить функцию или активность по сравнению с теми же условиями, за исключением исследуемого состояния или параметра, или в качестве альтернативы, по сравнению с другим состоянием. Например, антитело, которое подавляет рост опухоли, снижает скорость роста опухоли по сравнению со скоростью роста опухоли в отсутствии антитела.

[096] «Эффективное количество» агента относится к количеству, эффективному в необходимых дозах и в течение необходимых периодов времени для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата.

[097] «Терапевтически эффективное количество» вещества/молекулы изобретения, агониста или антагониста может варьировать в соответствии с факторами, такими как состояние заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, и способности вещества/молекулы, агониста или антагониста вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также является количеством, при котором терапевтические благоприятные эффекты превосходят любые токсические или вредные эффекты вещества/молекулы, агониста или антагониста. Терапевтически эффективное количество можно доставить посредством одного или нескольких введений.

[098] «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в необходимых дозах и в течение необходимых периодов времени для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, но не всегда, поскольку профилактическую дозу применяют у субъектов до или во время ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше терапевтически эффективного количества.

[099] Термины «фармацевтический состав» и «фармацевтическая композиция» относятся к препарату в такой форме, которая обеспечивает эффективность биологической активности активного ингредиента (ингредиентов) и не содержит дополнительные компоненты, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, для введения которому предназначен состав. Такие составы могут быть стерильными.

[0100] «Фармацевтически приемлемый носитель» относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, растворителю, энкапсулирующему материалу, вспомогательному составу или носителю, удобному для применения в данной области техники вместе с терапевтическим агентом, вместе с которым он образует «фармацевтическую композицию» для введения субъекту. Фармацевтически приемлемый носитель является нетоксичным для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и совместимым с другими ингредиентами состава. Фармацевтически приемлемый носитель подходит для применяемого состава.

[0101] «Стерильный» состав является асептическим или в основном свободным от живых микроорганизмов и их спор.

[0102] Введение «в комбинации с» одним или несколькими другими терапевтическими агентами включает одновременное (параллельное) и последовательное или поочередное введение в любом порядке.

[0103] Термин «параллельное», как применяют в данной заявке, относится к введению двух или более терапевтических агентов, где по меньшей мере часть введения перекрывается во времени или где введение одного терапевтического агента происходит в течение короткого периода времени относительно введения другого терапевтического агента. Например, два или более терапевтических агентов вводят с временным интервалом, не превышающим приблизительно 60 минут, таким как интервал, не превышающий приблизительно 30, 15, 10, 5 или 1 минуту.

[0104] Термин «последовательное» применяют в данной заявке для обозначения введения двух или более терапевтических агентов, где введение одного или нескольких агентов продолжают после прекращения введения одного или нескольких других агентов. Например, введение двух или более терапевтических агентов проводят с временным интервалом, превышающим приблизительно 15 минут, таким как любой из приблизительно 20, 30, 40, 50 или 60 минут, 1 дня, 2 дней, 3 дней, 1 недели, 2 недель или 1 месяца или более.

[0105] Как применяют в данной заявке, «в сочетании с» относится к введению одного способа лечения в дополнение к другому способу лечения. По существу, «в сочетании с» относится к введению одного способа лечения до, во время или после ведению другого способа лечения у индивидуума.

[0106] Термин «листок-вкладыш» относится к инструкциям, которые обычно включают в коммерческую упаковку терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях к применению, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.

[0107] «Готовое изделие» является любым изделием (напр., упаковкой или контейнером) или набором, содержащим по меньшей мере один реагент, напр., лекарственное средство для лечения заболевания или нарушения (напр., рака), или пробу для специфичного детектирования биомаркера, описанного в данной заявке. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения изделие или набор продвигают, распределяют или продают как единое целое для осуществления способов, описанных в данной заявке.

II. Антитела к FGFR2IIIb

[0108] В некоторых аспектах настоящее изобретение представляет афукозилированное антитело, направленное против FGFR2IIIb. Афукозилированные антитела к FGFR2IIIb включают, но не ограничиваются гуманизированными антителами, химерными антителами, мышиными антителами и антителами, содержащими HVR тяжелой цепи и/или легкой цепи (напр., CDR), которые обсуждают в данной заявке. В одном аспекте настоящее изобретение представляет выделенные афукозилированные антитела, которые связывают FGFR2IIIb. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb модулирует активность FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb обладает повышенной активностью ADCC. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb обладает повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb обладает повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA(V158). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb обладает повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA(F158).

[0109] Предполагают, что антитело к FGFR2IIIb, называемое «αFGFR2b», описанное в настоящей заявке в Примерах и в списке последовательностей, имеет такую же аминокислотную последовательность, что и антитело HuGAL-FR21 в патенте США № 8101723 B2, выпущенном 24 января 2012 г., патент США № 8101723 B2 специально включен в настоящую заявку посредством ссылки с любыми целями, и в частности, Фигуры 13 и 14 из патента США № 8101723 B2, которые показывают аминокислотные последовательности вариабельных областей и цепей полноразмерного зрелого антитела HuGAL-FR21, включены в настоящую заявку посредством ссылки с любыми целями. Дополнительно последовательности HVR антитела HuGAL-FR21, подчеркнутые на Фигуре 13 патента США № 8101723 B2, специально включены в настоящую заявку посредством ссылки с любыми целями.

[0110] В одном аспекте настоящее изобретение представляет афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, содержащее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR (напр., CDR), выбираемых из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; (d) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (f) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

[0111] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере часть константной области тяжелой цепи, и по меньшей мере одну легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи и по меньшей мере часть константной области легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит две тяжелые цепи, каждая из которых содержит вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере часть константной области тяжелой цепи, и две легкие цепи, каждая из которых содержит вариабельную область легкой цепи и по меньшей мере часть константной области легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

[0112] В одном аспекте настоящее изобретение представляет афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, содержащее шесть HVR, содержащих (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит шесть HVR, как описано выше, и связывает FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит шесть HVR, как описано выше, связывает FGFR2IIIb и обладает по меньшей мере одной активностью, выбираемой из усиленной активности ADCC и усиленной аффинности к Fc гамма RIIIA (такому как Fc гамма RIIIA(V158) и/или Fc гамма RIIIA(F158)). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb не связывает FGFR2IIIc.

[0113] В одном аспекте настоящее изобретение представляет афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, которое конкурирует с антителом к FGFR2IIIb, содержащим шесть HVR, содержащих (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

[0114] В одном аспекте настоящее изобретение представляет афукозилированное антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR V_H, выбираемые из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

[0115] В другом аспекте настоящее изобретение представляет афукозилированное антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR V_L, выбираемые из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (c) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

[0116] В другом аспекте настоящее изобретение афукозилированное антитело настоящего изобретения содержит (a) V_H домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR V_H, выбираемые из (i) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, (ii) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и (iii) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность, выбираемую из SEQ ID NO: 8; и (b) V_L домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR V_L, выбираемые из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (c) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

[0117] В другом аспекте афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (V_H), имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность V_H, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (напр., консервативные замены), вставки или делеции относительно стандартной последовательности, но антитело к FGFR2IIIb, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связывать FGFR2IIIb. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения такое антитело к FGFR2IIIb сохраняет способность селективно связывать FGFR2IIIb без связывания FGFR2IIIc. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения всего от 1 до 10 аминокислот заменены, введены и/или делетированы в SEQ ID NO: 4. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения замены, вставки или делеции происходят в участках вне HVR (т.е. в FR). При желании, афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит последовательность V_H в SEQ ID NO: 5, включая посттрансляционные модификации последовательности. В частном варианте осуществления настоящего изобретения V_H содержит один, два или три HVR, выбираемые из: (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

[0118] В другом аспекте представлено афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, где антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (V_L), имеющий по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность V_L, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (напр., консервативные замены), вставки или делеции относительно стандартной последовательности, но антитело к FGFR2IIIb, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связывать FGFR2IIIb. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения такое антитело к FGFR2IIIb сохраняет способность селективно связывать FGFR2IIIb без связывания FGFR2IIIc. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения всего от 1 до 10 аминокислот заменены, введены и/или делетированы в SEQ ID NO: 5. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения замены, вставки или делеции происходят в участках вне HVR (т.е. в FR). При желании, афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит последовательность V_Lв SEQ ID NO: 4, включая посттрансляционные модификации последовательности. В частном варианте осуществления настоящего изобретения V_L содержит один, два или три HVR, выбираемые из: (a) HVR- L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (c) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

[0119] В другом аспекте афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (V_H), имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, и вариабельный домен легкой цепи (V_L), имеющий по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность V_H, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (напр., консервативные замены), вставки или делеции относительно стандартной последовательности, и последовательность V_L, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (напр., консервативные замены), вставки или делеции относительно стандартной последовательности, но антитело к FGFR2IIIb, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связывать FGFR2IIIb. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения такое антитело к FGFR2IIIb сохраняет способность селективно связывать FGFR2IIIb без связывания FGFR2IIIc. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения всего от 1 до 10 аминокислот заменены, введены и/или делетированы в SEQ ID NO: 4. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения всего от 1 до 10 аминокислот заменены, введены и/или делетированы в SEQ ID NO: 5. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения замены, вставки или делеции происходят в участках вне HVR (т.е. в FR). При желании, афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит последовательность V_Hв SEQ ID NO: 4 и последовательность V_LSEQ ID NO: 5, включая посттрансляционные модификации одной или обеих последовательностей. В частном варианте осуществления настоящего изобретения V_H содержит один, два или три HVR, выбираемые из: (a) HVR- H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и V_L содержит один, два или три HVR, выбираемые из: (a) HVR- L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (c) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

[0120] В другом аспекте представлено афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, где антитело содержит V_H, как в любом из вариантов осуществления настоящего изобретения, представленном выше, и V_L, как в любом из вариантов осуществления настоящего изобретения, представленном выше. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит последовательности V_H и V_L в SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, соответственно, включая посттрансляционные модификации этих последовательностей.

[0121] В другом аспекте афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит последовательность тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность тяжелой цепи, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (напр., консервативные замены), вставки или делеции относительно стандартной последовательности, но афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связывать FGFR2IIIb. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения такое антитело к FGFR2IIIb сохраняет способность селективно связывать FGFR2IIIb без связывания FGFR2IIIc. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения всего от 1 до 10 аминокислот заменены, введены и/или делетированы в SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения замены, вставки или делеции происходят в участках вне HVR (т.е. в FR). При желании, тяжелая цепь афукозилированного антитела к FGFR2IIIb содержит последовательность V_Hв SEQ ID NO: 2, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. В частном варианте осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь содержит один, два или три HVR, выбираемые из: (a) HVR- H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

[0122] В другом аспекте настоящего изобретения представлено афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, где антитело содержит легкую цепь, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность легкой цепи, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (напр., консервативные замены), вставки или делеции относительно стандартной последовательности, но антитело к FGFR2IIIb, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связывать FGFR2IIIb. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения такое антитело к FGFR2IIIb сохраняет способность селективно связывать FGFR2IIIb без связывания FGFR2IIIc. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения всего от 1 до 10 аминокислот заменены, введены и/или делетированы в SEQ ID NO: 3. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения замены, вставки или делеции происходят в участках вне HVR (т.е. в FR). При желании, легкая цепь афукозилированного антитела к FGFR2IIIb содержит последовательность V_Lв SEQ ID NO: 3, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. В частном варианте осуществления настоящего изобретения легкая цепь содержит один, два или три HVR, выбираемые из: (a) HVR- L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (b) HVR- L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (c) HVR- L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

[0123] В другом аспекте настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb содержит последовательность тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, и последовательность легкой цепи, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность тяжелой цепи, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (напр., консервативные замены), вставки или делеции относительно стандартной последовательности, но антитело к FGFR2IIIb, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связывать FGFR2IIIb. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения такое антитело к FGFR2IIIb сохраняет способность селективно связывать FGFR2IIIb без связывания FGFR2IIIc. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность легкой цепи, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (напр., консервативные замены), вставки или делеции относительно стандартной последовательности, но антитело к FGFR2IIIb, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связывать FGFR2IIIb. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения такое антитело к FGFR2IIIb сохраняет способность селективно связывать FGFR2IIIb без связывания FGFR2IIIc. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения всего от 1 до 10 аминокислот заменены, введены и/или делетированы в SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения всего от 1 до 10 аминокислот заменены, введены и/или делетированы в SEQ ID NO: 3. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения замены, вставки или делеции происходят в участках вне HVR (т.е. в FR). При желании, тяжелая цепь афукозилированного антитела к FGFR2IIIb содержит последовательность V_Hв SEQ ID NO: 2, включая посттрансляционные модификации этой последовательности, и легкая цепь афукозилированного антитела к FGFR2IIIb содержит последовательность V_Lв SEQ ID NO: 3, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. В частном варианте осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь содержит один, два или три HVR, выбираемые из: (a) HVR- H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и легкая цепь содержит один, два или три HVR, выбираемые из: (a) HVR- L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (b) HVR- L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (c) HVR- L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

Примеры химерных антител

[0124] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения антитело, такое как афукозилированное антитело, представленной в данной заявке, являются химерным антителом. Определенные химерные антитела описаны, напр., в патенте США № 4816567; и Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). В одном примере химерное антитело содержит нечеловеческую вариабельную область (напр., вариабельную область, происходящую из мыши, крысы, хомяка, кролика или не относящегося к людям примата, такого как обезьяна) и человеческую константную область. В другом примере химерное антитело является антителом «переключенного класса», в котором был изменен класс или подкласс по сравнению с родительским антителом. Химерные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.

[0125] Не ограничивающие примеры афукозилированных химерных антител включают химерные антитела, содержащие последовательности HVR1, HVR2 и HVR3 тяжелой цепи и/или HVR1, HVR2 и HVR3 легкой цепи, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное химерное антитело к FGFR2IIIb содержит вариабельные области, описанные выше, и связывает FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное химерное антитело к FGFR2IIIb содержит вариабельные области, описанные выше, связывает FGFR2IIIb и обладает по меньшей мере одной активностью, выбираемой из усиленной активности ADCC и усиленной аффинности к Fc гамма RIIIA (такому как Fc гамма RIIIA(V158) и/или Fc гамма RIIIA(F158)). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное химерное антитело к FGFRIIIb не связывает FGFR2IIIc.

[0126] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное химерное антитело к FGFR2IIIb содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO:4, где антитело связывает FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное химерное антитело к FGFR2IIIb содержит легкую цепь, содержащую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO:5, где антитело связывает FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное химерное антитело к FGFR2IIIb содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO:4, и легкую цепь, содержащую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO:5, где антитело связывает FGFR2IIIb.

[0127] Примеры афукозилированных химерных антител к FGFR2IIIb также включают химерные антитела, которые конкурируют за связывание FGFR2IIIb с антителом или его фрагментом, описанными в настоящей заявке. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлено химерное афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, которое конкурируют за связывание FGFR2IIIb с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело конкурируют за связывание FGFR2IIIb, но не связывает FGFR2IIIc.

[0128] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химерное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит одну или несколько человеческих константных областей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения человеческая константная область тяжелой цепи относится к изотипу, выбираемому из IgA, IgG и IgD. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения человеческая константная область легкой цепи относится к изотипу, выбираемому из κ и λ. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химерное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит константную область человеческого IgG. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химерное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG4. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химерное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит константную область человеческого IgG4 и человеческую легкую цепь κ.

[0129] Как отмечено выше, эффекторная функция является желаемой или нет в зависимости от конкретного способа лечения, предназначенного для антитела. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, когда эффекторная функция является желаемой, выбирают химерное антитело к FGFR2IIIb, содержащее константную область тяжелой цепи человеческого IgG1 или константную область тяжелой цепи человеческого IgG3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, когда эффекторная функция является нежелательной, выбирают химерное антитело к FGFR2IIIb, содержащее константную область тяжелой цепи человеческого IgG4 или IgG2.

Примеры гуманизированных антител

[0130] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены афукозилированные гуманизированные антитела, которые связывают FGFR2IIIb. Гуманизированные антитела применимы в качестве терапевтических молекул, поскольку гуманизированные антитела снижают или устраняет иммунный ответ человека на нечеловеческие антитела (такой как ответ человеческих антител к антителам мыши), который может привести к иммунному ответу на лечебные антитела и снизить эффективность лечения.

[0131] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения химерное антитело является гуманизированным антителом. Как правило, нечеловеческое антитело гуманизируют для снижения иммуногенности по отношению к людям при сохранении специфичности и аффинности родительского нечеловеческого антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, в которых HVR, напр., CDR (или их части) происходят из нечеловеческого антитела, и FR (или их части) происходят из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело, при желании, будет включать по меньшей мере часть константной области человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками из нечеловеческого антитела (напр., антитела, из которого происходят остатки HVR), напр., для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

[0132] Обзор гуманизированных антител и способов их получения приведен, напр., в Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633, и далее описан, напр., в Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329; Queen et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; в патентах США №№ 5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34 (описывающие пересадку определяющих специфичность остатков (a-CDR)); Padlan, (1991) Mol. Immunol. 28:489-498 (описывающие «изменение поверхности»); Dall'Acqua et al., (2005) Methods 36:43-60 (описывающие «перестановку FR»); и Osbourn et al., (2005) Methods 36:61-68 и Klimka et al., (2000) Br. J. Cancer, 83:252-260 (описывающие «направленную селекцию» для перестановки FR).

[0133] Человеческие каркасные области, которые можно применять для гуманизации, включают, но не ограничиваются каркасными областями, выбираемыми способом максимального соответствия (см., напр., Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296); каркасными областями, происходящими из консенсусной последовательности человеческих антител определенной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепей (см., напр., Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; и Presta et al. (1993) J. Immunol, 151:2623); зрелыми человеческими каркасными областями (соматически мутированными) или каркасными областями зародышевой линии человека (см., напр., Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633); и каркасными областями, происходящими из библиотек скрининга FR (см., напр., Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 и Rosok et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618).

[0134] Не ограничивающие примеры гуманизированных антител включают αFGFR2b, описанные в настоящей заявке. Не ограничивающие примеры афукозилированных гуманизированных антител включают αFGFR2bA, описанные в настоящей заявке, которые имеют такие же аминокислотные последовательности, что и αFGFR2b, содержащие фукозу (также называемые αFGFR2bF). Не ограничивающие примеры афукозилированных гуманизированных антител также включают антитела, содержащие вариабельную область тяжелой цепи αFGFR2b и/или a вариабельную область легкой цепи αFGFR2b. Не ограничивающие примеры афукозилированных гуманизированных антител включают антитела, содержащие вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 4 и/или a вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 5. Примеры афукозилированных гуманизированных антител также включают, но не ограничиваются гуманизированными антителами, содержащими HVR1, HVR2 и HVR3 тяжелой цепи и/или HVR1, HVR2 и HVR3 легкой цепи αFGFR2b. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированное антитело к FGFR2IIIb содержит HVR, описанные выше (т.е. (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11), и связывает FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированное антитело к FGFR2IIIb содержит HVR, описанные выше, связывает FGFR2IIIb и обладает по меньшей мере одной активностью, выбираемой из усиленной активности ADCC и усиленной аффинности к Fc гамма RIIIA (такому как Fc гамма RIIIA(V158) и/или Fc гамма RIIIA(F158)). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело к FGFR2IIIb не связывает FGFR2IIIc.

[0135] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело к FGFR2IIIb содержит HVR1, HVR2 и HVR3 тяжелой цепи и/или HVR1, HVR2 и HVR3 легкой цепи αFGFR2b. Не ограничивающие примеры афукозилированных гуманизированных антител к FGFR2IIIb включают антитела, содержащие наборы HVR1, HVR2 и HVR3 тяжелой цепи, предусмотренные SEQ ID NOs: 6, 7 и 8. Не ограничивающие примеры афукозилированных гуманизированных антител к FGFR2IIIb также включают антитела, содержащие наборы HVR1, HVR2 и HVR3 легкой цепи, предусмотренные SEQ ID NOs: 9, 10 и 11.

[0136] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело к FGFR2IIIb содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 4, и где антитело связывает FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело к FGFR2IIIb содержит легкую цепь, содержащую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 5, и где антитело связывает FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело к FGFR2IIIb содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, содержащую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 5, и где антитело связывает FGFR2IIIb.

[0137] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело к FGFR2IIIb содержит по меньшей мере один из HVR, обсуждаемых в данной заявке. То есть в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело к FGFR2IIIb содержит по меньшей мере один HVR, выбираемый из HVR1 тяжелой цепи, обсуждаемый в данной заявке, HVR2 тяжелой цепи, обсуждаемый в данной заявке, HVR3 тяжелой цепи, обсуждаемый в данной заявке, HVR1 легкой цепи, обсуждаемый в данной заявке, HVR2 легкой цепи, обсуждаемый в данной заявке, и HVR3 легкой цепи, обсуждаемый в данной заявке. Далее, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело к FGFR2IIIb содержит по меньшей мере один мутированный HVR на основе HVR, обсуждаемого в данной заявке, где мутированный HVR содержит 1, 2, 3 или 4 аминокислотные замены относительно HVR обсуждаемого в данной заявке. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения одна или несколько аминокислотных замен являются консервативными аминокислотными заменами. Специалист в данной области техники может выбрать одну или несколько подходящих консервативных аминокислотных замен для конкретной последовательности HVR, где, согласно прогнозам, подходящие аминокислотные замены не изменяют в значительной степени свойства связывания антитела, содержащего мутированный HVR.

[0138] Примеры афукозилированных гуманизированных антител к FGFR2IIIb также включают, которые конкурируют за связывание FGFR2IIIb с антителами или их фрагментами, описанными в настоящей заявке. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлено гуманизированное антитело к FGFR2IIIb, которое конкурирует за связывание FGFR2IIIb с αFGFR2b. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлено афукозилированное гуманизированное антитело к FGFR2IIIb, которое конкурирует за связывание FGFR2IIIb с αFGFR2b и обладает по меньшей мере одной активностью, выбираемой из усиленной активности ADCC и усиленной аффинности к Fc гамма RIIIA (такому как Fc гамма RIIIA(V158) и/или Fc гамма RIIIA(F158)). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb не связывает FGFR2IIIc.

[0139] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело к FGFR2IIIb содержит одну или несколько константных областей человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения константная область тяжелой цепи человека относится к изотипу, выбираемому из IgA, IgG и IgD. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения константная область легкой цепи человека относится к изотипу, выбираемому из κ и λ.

[0140] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит константную область IgG человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, когда эффекторная функция является желаемой, выбирают афукозилированное гуманизированное антитело к FGFR2IIIb, содержащее константную область тяжелой цепи человеческого IgG1 или константную область тяжелой цепи человеческого IgG3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит константную область человеческого IgG1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит константную область человеческого IgG1, где N297 нефукозилирован. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит константную область человеческого IgG1 и человеческую легкую цепь κ.

[0141] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное гуманизированное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и любые посттрансляционные модификации, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и любые посттрансляционные модификации.

Примеры константных областей антител

[0142] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит одну или несколько константных областей человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения константная область тяжелой цепи человека относится к изотипу, выбираемому из IgA, IgG и IgD. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения константная область легкой цепи человека относится к изотипу, выбираемому из κ и λ.

[0143] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит константную область IgG человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, когда эффекторная функция является желаемой, выбирают афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, содержащее константную область тяжелой цепи человеческого IgG1 или константную область тяжелой цепи человеческого IgG3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит константную область человеческого IgG1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит константную область человеческого IgG1, где N297 нефукозилирован. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело, описанное в настоящей заявке, содержит константную область человеческого IgG1 и человеческую легкую цепь κ.

[0144] На протяжении настоящего описания изобретения и формулы изобретения, если иное четко не оговорено или не известно специалистам в данной области техники, нумерация остатков тяжелой цепи иммуноглобулина является нумерацией по индексу EU, как в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), которые явным образом полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки. «Индекс EU как в Kabat» относится к нумерации остатков человеческого IgG1 EU антитела.

[0145] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело настоящего изобретения содержит вариант Fc-области, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с Fc-областью IgG дикого типа или антитела дикого типа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вариант Fc-области сдержит две или более аминокислотные замены в Fc-области антитела дикого типа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вариант Fc-области сдержит три или более аминокислотные замены в Fc-области антитела дикого типа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вариант Fc-области содержит по меньшей мере одну, две, три или более аминокислотных замен в Fc-области, описанных в настоящей заявке. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вариант Fc-области в данной заявке будет иметь по меньшей мере 80% гомологию с нативной последовательностью Fc-области и/или с Fc-областью родительского антитела. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вариант Fc-области в данной заявке будет иметь по меньшей мере приблизительно 90% гомологию с нативной последовательностью Fc-области и/или с Fc-областью родительского антитела. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вариант Fc-области в данной заявке будет иметь по меньшей мере приблизительно 95% гомологию с нативной последовательностью Fc-области и/или с Fc-областью родительского антитела.

[0146] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения антитело, представленное в настоящей заявке, изменено для увеличения или уменьшения уровня гликозилирования антитела. Добавление или удаление сайтов гликозилирования антитела можно удобно провести, изменяя аминокислотную последовательность так, чтобы создать или удалить один или несколько сайтов гликозилирования.

[0147] В тех случаях, когда антитело содержит Fc-область, можно изменить присоединенные к ней углеводы. Нативные антитела, образованные клетками млекопитающих, как правило, содержат разветвленный, биантенный олигосахарид, который обычно присоединен N-связью к Asn297 домена CH2 Fc-области. См., напр., Wright et al.TIBTECH 15:26-32 (1997). Олигосахарид может включать разные углеводы, напр., маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc на «стебле» биантенной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно внести модификации олигосахарида в антителе настоящего изобретения с целью создания антител с определенными улучшенными свойствами.

[0148] В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлены антитела, имеющие углеводную структуру, которая лишена фукозы (напрямую или косвенно), присоединенной к Fc-области (т.е. афукозилированные антитела). Например, количество фукозы в композиции, содержащей множество таких антител, может составлять от 0% до приблизительно 5%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая множество таких антител, содержит по меньшей мере 95% афукозилированных антител. Количество фукозы определяют, рассчитывая среднее количество фукозы в цепи сахаров на Asn297 относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn297 (напр., комплексных, гибридных структур или структур с высоким содержанием маннозы). Не ограничивающие примеры способов определения фукозы в антителе включают времяпролетную МАЛДИ масс-спектрометрию (см., напр., WO 2008/077546), измерение высвобожденных флуоресцентно меченых олигосахаридов с помощью ВЭЖХ (см., напр., Schneider et al., “N-Glycan analysis of monoclonal antibodies and other glycoproteins using UHPLC with fluorescence detection,” Agilent Technologies, Inc. (2012); Lines, J. Pharm. Biomed. Analysis, 14: 601-608 (1996); Takahasi, J. Chrom., 720: 217-225 (1996)), измерение высвобожденных флуоресцентно меченых олигосахаридов с помощью капиллярного электрофореза (см., напр., Ma et al., Anal. Chem., 71: 5185-5192 (1999)) и ВЭЖХ с импульсной амперометрическим определением для измерения композиции моносахаридов (см., напр., Hardy, et al., Analytical Biochem., 170: 54-62 (1988)). Asn297 относится к остатку аспарагина, расположенному приблизительно в положении 297в Fc-области (EU нумерация остатков Fc-области); однако, Asn297 также может быть расположен приблизительно на ± 3 аминокислоты до или после положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, за счет небольших вариаций последовательности антител. В антителе αFGFR2b, описанном в настоящей заявке, Asn297 обнаруживают в последовательности QYNST, и отмечают жирным шрифтом и подчеркиванием в Таблице последовательностей, показанной ниже, SEQ ID NO: 2. Варианты фукозилирования могут обладать улучшенной функцией ADCC. См., напр., публикации патентов США № US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примеры публикаций, относящихся к «афукозилированным» или «не содержащим фукозу» антителам, включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Примеры клеточных линий, способных производить афукозилированные антитела, включают клетки Lec13 CHO с нарушением фукозилирования белков (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); заявка на патент США № US 2003/0157108 A1, Presta, L; и WO 2004/056312 A1, Adams et al., особенно в Примере 11) и нокаутные клеточные линии, такие как клеточные линии, лишенные функционального гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, напр., нокаутные клетки CHO (см., напр., Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); и WO2003/085107).

[0149] Далее представлены антитела с разветвленными олигосахаридами, напр., в которых биантенный олигосахарид, присоединенный к Fc-области антитела, содержит GlcNAc в точке ветвления. Такие антитела могут обладать пониженным фукозилированием и/или улучшенной функцией ADCC. Примеры таких антител описаны, напр., в WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); в патенте США № 6602684 (Umana et al.); и US 2005/0123546 (Umana et al.). Также представлены антитела по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc-области. Такие антитела могут обладать улучшенной функцией CDC. Такие антитела описаны, напр., в WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); и WO 1999/22764 (Raju, S.).

[0150] Также представлены антитела с лидерными последовательностями на аминоконце. Например, один или несколько аминокислотных остатков лидерной последовательности на аминоконце присутствуют на аминоконце любой одной или нескольких тяжелых или легких цепей антитела. Примеры аминоконцевых лидерных последовательностей содержат или состоят из трех аминокислотных остатков, VHS, присутствующих на одной или на обеих легких цепях антитела.

[0151] Время полужизни высокоаффинных полипептидов, связывающихся с человеческим FcRn, in vivo или в сыворотке можно исследовать, напр., в трансгенных мышах, в людях или в не относящихся к людям приматах, в которых вводят полипептиды с вариантом Fc-области. См. также, напр., Petkova et al. International Immunology 18(12):1759-1769 (2006).

[0152] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело опосредует ADCC в присутствии человеческих эффекторных клеток эффективнее, чем родительское антитело, содержащее фукозу. Как правило, активность ADCC можно определить с помощью in vitro исследования ADCC, как раскрыто в настоящей заявке, но включены и другие исследования или способы определения активности ADCC, напр., в животной модели и пр.

[0153] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения «K_D», «K_d», «Kd» или «значение Kd» антитела измеряют с помощью исследований поверхностного плазмонного резонанса, применяя BIACORE^®-2000 или BIACORE^®-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, штат Нью-Джерси) при 25°C с чипам с иммобилизованным антигеном CM5 при ~10 единиц ответа (RU, response unit). Кратко, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIACORE, Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)- карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят в 10 мМ растворе ацетата натрия, рН 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ) перед инъекцией при скорости потока 5 мкл/минута до достижения около 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После инъекции антигена инъецируют 1 М этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений серийные разведения полипептида, напр., полноразмерного антитела, инъецируют в фосфатно-солевом буфере с сурфактантом 0,05% TWEEN-20^TM (PBST, phosphate-buffered saline+TWEEN) при 25°С при скорости потока около 25 мкл/мин. Константы ассоциации (k_on) и константы диссоциации (k_off) рассчитывают, используя простую модель Лэнгмюра для связывания в соотношении один к одному (программа BIACORE^® Evaluation Software версия 3.2), одновременно строя участки ассоциации и диссоциации на сенсограммах. Константу равновесной диссоциации (Kd) рассчитывают как соотношение k_on/k_off. См., напр., Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Если константа ассоциации превышает 10⁶ М^-1сек^-1 в анализе методом поверхностного плазмонного резонанса, описанном выше, тогда константу ассоциации можно определять способом тушения флуоресценции, который измеряет повышение или снижение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение=295 нм; испускание=340 нм, полоса пропускания 16 нм) 20 нМ раствором антитела против антигена в фосфатно-солевом буфере, рН 7.2, при 25°С в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, измеряемое на спектрометре, таком как спектрофотометр с остановкой потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр серии 8000 SLM-AMINCO^TM (ThermoSpectronic) в кювете с перемешиванием.

[0154] Величину «скорости прямой реакции», «константы ассоциации» или «k_on» антитела также можно определять так же, как описано выше, используя систему BIACORE^®-2000 или BIACORE^®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).

[0155] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения разница между двумя указанными значениями (напр., значениями Kd) практически такая же, например, составляет приблизительно менее 50%, приблизительно менее 40%, приблизительно менее 30%, приблизительно менее 20% и/или приблизительно менее 10% от значения величины стандарта/сравнения.

[0156] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения разница между двумя указанными значениями (напр., значениями Kd) значительно отличается, например, составляет приблизительно более 10%, приблизительно более 20%, приблизительно более 30%, приблизительно более 40% и/или приблизительно более 50% от значения величины молекулы стандарта/сравнения.

Примеры лидерных последовательностей

[0157] Чтобы экспрессировать или секретировать некоторые секретируемые белки в большом количестве желательно применять лидерную последовательность из гетерологичного белка. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения применение гетерологичных лидерных последовательностей может давать преимущества, поскольку образующийся в результате зрелый полипептид может оставаться неизменным, так как лидерная последовательность удаляется в ЭР во время процесса секреции. Добавление гетерологичной лидерной последовательности может требоваться для экспрессии и секреции некоторых белков.

[0158] Определенные примеры лидерных последовательностей описаны, напр., в онлайн базе данных лидерных последовательностей Leader sequence Database, поддерживаемой Department of Biochemistry, National University of Singapore. См. Choo et al., BMC Bioinformatics, 6: 249 (2005); и в публикации PCT № WO 2006/081430.

III. Свойства афукозилированных антител к FGFR2IIIb

[0159] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb обладают повышенной активностью ADCC in vitro и/или in vivo. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb обладают повышенной активностью ADCC in vitro. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активность ADCC in vitro определяют способом, описанным в настоящей заявке, напр., в Примере 3. Кратко, экспрессирующие FGFR2IIIb клетки приводят в контакт с выделенными человеческими PBMC в соотношении 25:1 эффекторных (PBMC) клеток и клеток-мишеней в присутствии фукозилированного антитела или афукозилированного антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки Ba/F3, которые экспрессируют FGFR2IIIb, применяют в качестве клеток-мишеней. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения цитотоксичность определяют посредством количественного определения высвобождения LDH в нерадиоактивном исследовании цитотоксичности CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, Мэдисон, штат Висконсин). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения максимальный уровень лизиса определяют с помощью 5% Triton X-100, а спонтанное высвобождение определяют в отсутствие антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения процент специфичного лизиса можно определить с помощью формулы: (экспериментальное–спонтанное высвобождение)/(максимально–спонтанное высвобождение)×100=% специфичного лизиса. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитело к FGFR2IIIb, обладающее повышенной активностью ADCC, вызывает специфичный лизис, который по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 15, по меньшей мере на 20, по меньшей мере на 25, по меньшей мере на 30, по меньшей мере на 35, по меньшей мере на 40, по меньшей мере на 45, по меньшей мере на 50, по меньшей мере на 60, по меньшей мере на 65, по меньшей мере на 70 или по меньшей мере на 75 процентных пунктов выше, чем специфичный лизис, вызванный таким же количеством фукозилированного антитела, если исследовали по меньшей мере одну концентрацию антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, обладающее повышенной активностью ADCC, вызывает специфичный лизис, который по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 15, по меньшей мере на 20, по меньшей мере на 25, по меньшей мере на 30, по меньшей мере на 35, по меньшей мере на 40, по меньшей мере на 45, по меньшей мере на 50, по меньшей мере на 60, по меньшей мере на 65, по меньшей мере на 70 или по меньшей мере на 75 процентных пунктов выше, чем специфичный лизис, вызванный фукозилированным антителом, где концентрация каждого антитела составляет от 0,01 до 1 мкг/мл, а клетки-мишени являются клетками Ba/F3, экспрессирующими FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела исследуют в концентрации 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл или 1 мкг/мл.

[0160] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb обладают повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb обладают повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA(V158). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb обладают повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA(F158). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аффинность антитела к Fc гамма RIIIA определяют с помощью поверхностного плазмонного резонанса, напр., как описано в данной заявке в Примере 2, и/или как описано ниже в отношении Fc гамма RIIIA(V158), но подходит также для определения аффинности Fc гамма RIIIA(F158). Кратко, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, фукозилированное или афукозилированное антитело к FGFR2IIIb сажают на покрытый протеином А декстрановый чип. Fc гамма RIIIA (V158) (имеющийся в R&D Systems) инъецируют в разных концентрациях. Константу ассоциации, константу диссоциации, аффинность к Fc гамма RIIIA (V158) фукозилированного или афукозилированного антитела к FGFR2IIIb можно определить, напр., с помощью программного обеспечения для системы поверхностного плазмонного резонанса (например, программы Biacore T200 Evaluation Software модели связывания 1:1). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb, обладающие повышенной аффинностью к Fc гамма RIIIA (такому как Fc гамма RIIIA(V158) или Fc гамма RIIIA(F158)), связывают Fc гамма RIIIA с аффинностью, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 12 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 17 раз или по меньшей мере в 20 раз выше, чем фукозилированное антитело к FGFR2IIIb. Например, если афукозилированное антитело к FGFR2IIIb связывает Fc гамма RIIIA (V158) с аффинностью (K_D) равной 9,2 нМ, а фукозилированное антитело к FGFR2IIIb связывает Fc гамма RIIIA (V158) с аффинностью (K_D) равной 207 нМ, тогда афукозилированное антитело к FGFR2IIIb связывает Fc гамма RIIIA (V158) с аффинностью, в 207/9,2=22,5 раз большей, чем фукозилированное антитело к FGFR2IIIb.

IV. Экспрессия и получение антитела к FGFR2IIIb

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела к FGFR2IIIb

[0161] Представлены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие полинуклеотиды, кодирующие одну или несколько цепей антител к FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотид, который кодирует тяжелую цепь или легкую цепь антитела к FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит как полинуклеотид, который кодирует тяжелую цепь, так и полинуклеотид, который кодирует легкую цепь антитела к FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первая молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотид, который кодирует тяжелую цепь, а вторая молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотид, который кодирует легкую цепь.

[0162] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь и легкая цепь экспрессируются с одной молекулы нуклеиновой кислоты или с двух отдельных молекул нуклеиновой кислоты в виде двух отдельных полипептидов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, когда антитело является scFv, единый полинуклеотид кодирует единый полипептид, содержащий как тяжелую цепь, так и легкую цепь, связанные вместе.

[0163] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь или легкую цепь антитела к FGFR2IIIb, содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует лидерную последовательность, которая при трансляции располагается на N-конце тяжелой цепи или легкой цепи. Как обсуждали выше, лидерная последовательность может быть нативной лидерной последовательностью тяжелой или легкой цепи или может быть гетерологичной лидерной последовательностью.

[0164] Молекулы нуклеиновой кислоты можно конструировать с помощью техник рекомбинантной ДНК, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты является экспрессионным вектором, подходящим для экспрессии в выбранной клетке-хозяине.

Векторы

[0165] Представлены векторы, содержащие полинуклеотиды, которые кодируют тяжелые цепи антител к FGFR2IIIb и/или легкие цепи антител к FGFR2IIIb. Также представлены векторы, содержащие полинуклеотиды, которые кодируют тяжелые цепи антител к FGFR2IIIb и/или легкие цепи антител к FGFR2IIIb. Такие векторы включают, но не ограничиваются ДНК векторами, фаговыми векторами, вирусными векторами, ретровирусными векторами и пр. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вектор содержит первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, и вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь и легкая цепь экспрессируются с вектора в виде двух отдельных полипептидов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь и легкая цепь экспрессируются как части единого полипептида, как, например, когда антитело является scFv.

[0166] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый вектор содержит полинуклеотид, который кодирует тяжелую цепь, а второй вектор содержит полинуклеотид, который кодирует легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первым вектором и вторым вектором трансфицируют клетки-хозяева в схожих количествах (таких как схожие молярные количества или схожие весовые количества). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки-хозяева трансфицируют при соотношении молярного или весового количества первого вектора и второго вектора, составляющем между 5:1 и 1:5. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения применяют массовое отношение от 1:1 до 1:5 для вектора, кодирующего тяжелую цепь, и вектора, кодирующего легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения применяют массовое отношение 1:2 для вектора, кодирующего тяжелую цепь, и вектора, кодирующего легкую цепь.

[0167] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения выбирают вектор, оптимизированный для экспрессии полипептидов в клетках CHO или происходящих из CHO клетках или в клетках NSO. Примеры таких векторов описаны, напр., в Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004).

Клетки-хозяева

[0168] В разных вариантах осуществления настоящего изобретения тяжелые цепи антител к FGFR2IIIb и/или легкие цепи антител к FGFR2IIIb можно экспрессировать в прокариотических клетках, таких как бактериальные клетки; или в эукариотических клетках, таких как клетки грибков (таких как дрожжи), клетки растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Такую экспрессию можно провести, например, в соответствии с процедурами, известными в данной области техники. Примеры эукариотических клеток, которые можно применять для экспрессии полипептидов, включают, но не ограничиваются клетками COS, включая клетки COS 7; клетками 293, включая клетки 293-6E; клетками CHO, включая клетки CHO-S, клетки DG44. Lec13 CHO и клетки FUT8 CHO; клетками PER.C6^® (Crucell); и клетками NSO. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения тяжелые цепи антител к FGFR2IIIb и/или легкие цепи антител к FGFR2IIIb можно экспрессировать в дрожжах. См., напр., публикацию патента США № US 2006/0270045 A1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конкретные эукариотические клетки-хозяева выбирают на основании их способности вносить желаемые посттрансляционные модификации в тяжелые цепи антител к FGFR2IIIb и/или легкие цепи антител к FGFR2IIIb. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки CHO образуют полипептиды, обладающие более высоким уровнем сиалирования, чем такие же полипептиды, образованные в клетках 293.

[0169] Введение одной или нескольких нуклеиновых кислот в желаемую клетку-хозяина можно осуществить любым способом, включая, но не ограничиваясь трансфекцией фосфатом кальция, ДЭАЭ-декстран-опосредованной трансфекцией, трансфекцией, опосредованной катионными липидами, электропорацией, трансдукцией, инфекцией и пр. не ограничивающие примеры способов описаны, напр., в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Нуклеиновые кислоты можно временно или стабильно трансфицировать в желаемые клетки-хозяева в соответствии с любым подходящим способом.

[0170] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb получают в клетках, способных производить афукозилированные антитела, таких как клетки Lec13 CHO с нарушенным фукозилированием белков (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); заявка на патент США № US 2003/0157108 A1, Presta, L; и WO 2004/056312 A1, Adams et al., особенно в Примере 11), и нокаутные клеточные линии, такие как клеточные линии, лишенные функционального гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, напр., нокаутные клетки CHO (см., напр., Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); и WO2003/085107). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb получают в клетках CHO, лишенных функционального гена FUT8. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb получают в клетках Potelligent® CHOK1SV (BioWa/Lonza, Allendale, NJ).

Очистка антител к FGFR2IIIb

[0171] Антитела к FGFR2IIIb можно очистить любым подходящим способом. Такие способы включают, но не ограничиваются применением аффинных матриц или хроматографии с гидрофобными взаимодействиями. Подходящие аффинные лиганды включают внеклеточный домен FGFR2IIIb и лиганды, которые связываются с константными областями антитела. Например, можно применять аффинную колонку с протеином A, протеином G, протеином A/G или антителом для связывания константной области и очистки антитела к FGFR2IIIb. Также для очистки некоторых полипептидов может подойти хроматографиия с гидрофобными взаимодействиями, например, бутиловая или фениловая колонка. Многие способы очистки полипептидов хорошо известны в данной области техники.

Образование антител к FGFR2IIIb в бесклеточной системе

[0172] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к FGFR2IIIb получают в бесклеточной системе. Не ограничивающие примеры бесклеточных систем описаны, напр., в Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003).

V. Терапевтические композиции и способы

Способы лечения заболеваний с помощью антител к FGFR2IIIb

[0173] Антитела настоящего изобретения и композиции, содержащие антитела настоящего изобретения представлены для применения в способах лечения людей или животных. Также представлены способы лечения заболевания, включающие введение афукозилированных антител к FGFR2IIIb. Не ограничивающие примеры заболеваний, которые можно лечить афукозилированными антителами к FGFR2IIIb, включают, но не ограничиваются раком. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены способы лечения рака, включающие введение афукозилированного антитела к FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рак выбирают из рака желудка, рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака поджелудочной железы или рака пищевода. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены способы лечения рака желудка, включающие введение афукозилированного антитела к FGFR2IIIb.

[0174] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке происходит амплификация гена FGFR2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb сверхэкспрессируется. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на повышенном уровне, превышающем уровень FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на нормализованном уровне, который более чем в 2 раза, 3 раза, 5 раз или 10 раз превышает нормализованный уровень экспрессии FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения уровни экспрессии нормализуют к GUSB. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке FGFR2IIIb сверхэкспрессируется, но амплификации гена FGFR2 не происходит. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке желудка происходит амплификация гена FGFR2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке желудка с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb сверхэкспрессируется. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке желудка с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на повышенном уровне, превышающем уровень FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке желудка с амплификацией FGFR2 FGFR2IIIb экспрессируется на нормализованном уровне, который более чем в 2 раза, 3 раза, 5 раз или 10 раз превышает нормализованный уровень экспрессии FGFR2IIIc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения уровни экспрессии нормализуют к GUSB. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при раке желудка FGFR2IIIb сверхэкспрессируется, но амплификации гена FGFR2 не происходит. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сверхэкспрессия является сверхэкспрессией мРНК. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сверхэкспрессия является сверхэкспрессией белка.

[0175] Амплификацию гена FGFR2IIIb можно определить любым подходящим способом, известным в данной области техники, включая, но не ограничиваясь гибридизацией in situ. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при амплификации FGFR2 соотношение FGFR2:CEN10 (центромера хромосомы 10) составляет >3.

[0176] Сверхэкспрессию мРНК FGFR2IIIb можно определить любым подходящим способом, известным в данной области техники, включая, но не ограничиваясь способами, включающими количественную ПЦР. Термин «сверхэкспрессии мРНК FGFR2IIIb» обозначает повышенные уровни мРНК FGFR2IIIb, вне зависимости от причины такого повышения уровней (т.е. от того, являются ли повышенные уровни результатом усиленной транскрипции и/или пониженной деградации мРНК, другого механизма или комбинации механизмов).

[0177] Сверхэкспрессию белка FGFR2IIIb можно определить любым подходящим способом, известным в данной области техники, включая, но не ограничиваясь способами на основе антител, такими как иммуногистохимия. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногистохимическое окрашивание оценивают в соответствии со способами, известными в данной области техники. Термин «сверхэкспрессии белка FGFR2IIIb» обозначает повышенные уровни белка FGFR2IIIb, вне зависимости от причины такого повышения уровней (т.е. от того, являются ли повышенные уровни результатом усиленной транскрипции и/или пониженной деградации белка, другого механизма или комбинации механизмов). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения 1+, 2+ или 3+ иммуногистохимическое окрашивание опухолевых клеток указывает на сверхэкспрессию FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения 2+ или 3+ иммуногистохимическое окрашивание опухолевых клеток указывает на сверхэкспрессию FGFR2IIIb. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногистохимическое окрашивание оценивают, как описано в Примере 6.

Фармацевтические композиции

[0178] В разных вариантах осуществления настоящего изобретения представлены композиции, содержащие афукозилированные антитела к FGFR2IIIb, в составах с широким рядом фармацевтически приемлемых носителей (см., напр., Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd ed., Pharmaceutical Press (2000)). Доступны разные фармацевтически приемлемые носители, которые включают инертные носители, адъюванты и растворители. Более того, также доступны вспомогательные фармацевтически приемлемые вещества, такие как регуляторы pH и буферные агенты, регулирующие тоничность агенты, стабилизаторы, увлажняющие агенты и подобные. Не ограничивающие примеры носителей включают физиологический раствор, буферный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации.

[0179] В разных вариантах осуществления настоящего изобретения композиции, содержащие афукозилированные антитела к FGFR2IIIb, можно составлять в форме для инъекции, включая подкожное введение, посредством их растворения, суспендирования или эмульгирования в водном или неводном растворителе, таком как растительные или иные масла, синтетические алифатические кислые триглицериды, сложные эфиры высших алифатических кислот или пропиленгликоль; при желании, с подходящими добавками, такими как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, стабилизаторы и консерванты. В разных вариантах осуществления настоящего изобретения композиции можно составлять в форме для ингаляции, например, применяя подачу под давлением подходящих летучих веществ, таких как дихлордифторметана, пропана, азота и подобных. Композицию, в разных вариантах осуществления настоящего изобретения, можно также составлять в форме микрокапсул с отсроченным высвобождением, таких как содержащие биоразлагаемые или небиоразлагаемые полимеры. Не ограничивающий пример биоразлагаемых форм включает полимер полимолочной кислоты и гликолевой кислоты. Не ограничивающий пример биоразлагаемых форм включает сложный эфир жирных кислот полиглицерина. Конкретные способы получения таких составов описаны, например, в EP 1 125 584 A1.

Способы введения

[0180] В разных вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb можно вводить in vivo разными способами, включая, но не ограничиваясь пероральным, внутриартериальным, парентеральным, интраназальным, внутримышечным, внутрисердечным, интравентрикулярным, интратрахеальным, трансбуккальным, ректальным, внутрибрюшинным, внутридермальным, местным, трансдермальным и интратекальным способом или иначе посредством имплантации или ингаляции. Композиции, являющиеся предметом изобретения, можно составлять в форме препаратов в твердой, полутвердой, жидкой или газообразной форме; включая, но не ограничиваясь таблетками, капсулами, порошками, гранулами, мазями, растворами, суппозиториями, клизмами, инъекциями, средств для ингаляции и аэрозолей. Подходящую форму и способ введения можно выбрать в соответствии с целевым применением.

[0181] Фармацевтические композиции вводят в количестве, эффективном для лечения или профилактики рака, такого как рак желудка, рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак поджелудочной железы или рак пищевода. Терапевтически эффективное количество, как правило, зависит от веса субъекта, который проходит лечение, от его или ее физического состояния или состояния здоровья, распространенности состояния, подлежащего лечению или от возраста субъекта, подлежащего лечению. Как правило, афукозилированные антитела к FGFR2IIIb можно вводить в количестве в диапазоне приблизительно от 10 мкг/кг веса тела приблизительно до 100 мг/кг веса тела в дозе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb можно вводить в количестве в диапазоне приблизительно от 50 мкг/кг веса тела приблизительно до 5 мг/кг веса тела в дозе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb можно вводить в количестве в интервале приблизительно от 100 мкг/кг веса тела приблизительно до 10 мг/кг веса тела в дозе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb можно вводить в количестве в интервале приблизительно от 100 мкг/кг веса тела приблизительно до 20 мг/кг веса тела в дозе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированные антитела к FGFR2IIIb можно вводить в количестве в интервале приблизительно от 0,5 мг/кг веса тела приблизительно до 20 мг/кг веса тела в дозе.

[0182] Афукозилированное антитело к FGFR2IIIb можно вводить так, как это требуется субъекту. Определить частоту введения могут специалисты в данной области техники, такие как наблюдающий терапевт, на основании заключения о состоянии, подлежащего лечению, возраста субъекта, проходящего лечение, тяжести состояния, подлежащего лечению, общего состояния здоровья субъекта, проходящего лечение, и подобного. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективную дозу афукозилированных антител к FGFR2IIIb вводят субъекту один или несколько раз. В разных вариантах осуществления настоящего изобретения эффективную дозу афукозилированных антител к FGFR2IIIb вводят субъекту один раз в месяц, реже одного раза в месяц, например, каждые два месяца или каждые три месяца. В других вариантах осуществления настоящего изобретения эффективную дозу афукозилированных антител к FGFR2IIIb вводят чаще одного раза в месяц, например, каждые две недели или каждую неделю. Эффективную дозу афукозилированного антитела к FGFR2IIIb вводят субъекту по меньшей мере один раз. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективную дозу афукозилированного антитела к FGFR2IIIb можно вводить много раз, в том числе в течение периодов времени, равных по меньшей мере месяцу, по меньшей мере шести месяцам или по меньшей мере году.

Комбинированная терапия

[0183] Афукозилированные антитела к FGFR2IIIb можно вводить отдельно или с другими способами лечения. Их можно вводить перед, почти одновременно с или после других способов лечения, например, хирургическим вмешательством, с химиотерапией или с лучевой терапией. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb вводят параллельно с противоопухолевым агентом. Не ограничивающие примеры противоопухолевых агентов, которые можно вводить с афукозилированным антителом к FGFR2IIIb включают препараты платины (такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин), паклитаксел (TAXOL®), нанодисперсные паклитаксел, стабилизированный альбумином (ABRAXANE®), доцетаксел (TAXOTERE®), гемцитабин (GEMZAR®), капецитабин (XELODA®), иринотекан (CAMPTOSAR®), эпирубицин (ELLENCE®, PHARMORUBICIN®), FOLFOX (оксалиплатин, комбинированный с 5-FU и лейковорином), FOLFIRI (комбинация лейковорина, 5-FU и иринотекана), лейковорин, фторурацил (5-FU, EFUDEX®), митомицин C (MITOZYTREX™, MUTAMYCIN®) и доксорубицина гидрохлорид (Adriamycin PFS, Adriamycin RDF, RUBEX®). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb вводят параллельно с паклитакселом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb вводят параллельно с цисплатином и/или 5-FU. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb вводят параллельно с цисплатином и 5-FU. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения афукозилированное антитело к FGFR2IIIb вводят параллельно с FOLFOX (оксалиплатин, 5-FU и лейковорин).

Наборы/готовые изделия

[0184] Настоящее изобретение также представляет наборы, лекарственные средства, композиции и дозированные лекарственные формы для применения в любом из способов, описанных в данной заявке.

[0185] Наборы настоящего изобретения включают один или несколько контейнеров, содержащих афукозилированное антитело к FGFR2IIIb (или дозированные лекарственные формы и/или готовые изделия). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлена дозированная лекарственная форма, где доза содержит заранее определенное количество композиции, содержащей афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, с одним или несколькими дополнительными агентами или без них. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения такую дозированную лекарственную форму поставляют в одноразовом заранее наполненном шприце для инъекции. В разных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция, содержащаяся в дозированной лекарственной форме, может содержать физиологический раствор, сахарозу или подобные; буфер, такой как фосфат или подобный; и/или может быть в форме со стабильным и эффективным интервалом pH. В качестве альтернативы в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция может быть представлена в виде лиофилизированного порошка, который можно растворить при добавлении подходящей жидкости, например, стерильной воды. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют агрегацию белка, включая, но не ограничиваясь сахарозой и аргинином. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция настоящего изобретения содержит гепарин и/или протеогликан.

[0186] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения наборы настоящего изобретения далее включают инструкции по применению для лечения, напр., рака (такого как рака желудка, рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака поджелудочной железы или рака пищевода) в соответствии с любым из описанных в настоящей заявке способов. Набор может далее включать описание выбора подходящего индивидуума или лечения. Инструкции, поставляемые в наборах настоящего изобретения, как правило, являются письменными инструкциями на этикетке или в листке-вкладыше (напр., бумажном листке, включенном в набор), но инструкции для машинного распознавания (напр., инструкции на магнитных или оптических дисках) также являются приемлемыми. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор далее включает другой терапевтический агент.

[0187] Наборы настоящего изобретения находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, но не ограничивается флаконами, бутылями, сосудами, мягкими упаковками (напр., запаянные майларовые (Mylar) или пластиковые пакеты) и подобное. В наборах могут быть, при желании, дополнительные компоненты, такие как буферы и пояснительная информация. Таким образом, настоящее изобретение также представляет готовые изделия, которые включают флаконы (такие как запаянные флаконы), бутыли, сосуды, мягкую упаковку и подобное.

ПРИМЕРЫ

[0188] Примеры, обсуждаемые ниже, приведены исключительно в качестве примеров настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие настоящее изобретение. Примеры не предназначены для иллюстрации того, что приведенные ниже эксперименты являются всеми или единственными проведенными экспериментами. Была проведена работа по обеспечению точности в отношении применяемых чисел (например, количеств, температуры и пр.), но следует иметь в виду возможность существования экспериментальных ошибок и отклонений. Если иное не оговорено, части являются частями по весу, молекулярный вес является средним молекулярным весом, температура выражена в градусах Цельсия, а давление является равным или приблизительно равным атмосферному.

Пример 1: Образование афукозилированного антитела к FGFR2IIIb.

[0189] Конструирование экспрессионного вектора. Нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь (HC, heavy chain) и легкую цепь (LC, light chain) моноклонального антитела αFGFR2b клонировали в экспрессионную систему GS Gene Expression System (Lonza, Базель, Швейцария) в соответствии с инструкциями производителя. Система генерирует вектор с двумя генами (DGV, double gene vector), содержащий экспрессионные кассеты как для легкой цепи, так и для тяжелой цепи.

[0190] Выбор хозяйской клеточной линии. Для получения афукозилированного моноклонального антитела к αFGFR2bA (обозначение «А» после αFGFR2b относится к «афукозилированному») в качестве хозяйской клеточной линии выбрали клетки Potelligent® CHOK1SV (BioWa/Lonza, Аллендейл, штат Нью-Джерси). Клетки Potelligent® CHOK1SV лишены гена FUT8 (α1,6-фукозилтрансферазы) и поэтому производят не содержащие фукозу антитела (афукозилированные антитела).

[0191] Конструирование стабильной клеточной линии для получения афукозилированного антитела αFGR2bA: Экспрессионным вектором, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь антитела αFGFR2b, описанные выше, трансфицировали клетки Potelligent® CHOK1SV с помощью электропорации в соответствии с инструкциями производителя. Электропорированные клетки рассаживали в 96-луночный планшет в количестве приблизительно равном 10000 клеток/50 мкл/лунка в среде CD CHO без L-глутамина. На следующий день добавляли селективную среду CD CHO, содержащую 67 мкМ L-метионинсульфоксимина (MSX, SIGMA каталожный номер M5379, Сент-Луис, штат Миссури), в количестве, равном 150 мкл/лунка. За ростом клеток и образованием клонов наблюдали с помощью IN Cell Analyzer 2000 (GE Healthcare, Пискатауэй, штат Нью-Джерси).

[0192] Через 4-6 недель проводили скрининг выживших колоний в отношении экспрессии антитела αFGFR2bA с помощью исследования на основе гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF, Homogenous Time Resolved Fluorescence) против стандартных кривых, полученных с помощью очищенного антитела αFGFR2b, с помощью конъюгированного с XL665 протеина A и конъюгированного с криптатом кроличьего поликлонального антитела IgG (Cisbio, Бедфорд, штат Массачусетс). Клоны с наибольшей экспрессией наращивали с помощью процессов серийного наращивания с увеличением масштаба, включающих 24-луночные планшеты, центрифужные пробирки, качалочные колбы, лабораторные биореакторы, и в конце с помощью платформенного процесса производства. На каждой стадии для следующего процесса отбирали только часть, содержащую клоны с наибольшей экспрессией. Клоны для конечной продукции выбирали на основании титров белковых продуктов, характеристик клеточного роста, качества продукта, стабильности, а также возможности увеличения в масштабе в биореакторах. Конечная производственная линия обладала уровнем экспрессии равным приблизительно 3,5 г/л αFGFR2bA. Отсутствие фукозилирования αFGFR2bA, образованного в конечной производственной клеточной линии, подтверждали с помощью нормально-фазовой ВЭЖХ хроматографии.

[0193] Антитело αFGFR2bA очищали с помощью колоночной хроматографии и ультрафильтрации для концентрирования очищенного материала, затем диафильтрации для обмена на рецептурный буфер (20 мМ гистидина, 150 мМ L-аргинина, 0,01% полисорбата 20, pH 6,0). Антитело хранили при температуре ниже -70ºC.

[0194] Анализ гликанов αFGFR2bA проводят посредством высвобождения гликанов из белка, мечения гликанов аминобензойной кислотой (2-AA), а затем очистки меченных гликанов. Нормально-фазовую ВЭЖХ с детектированием флуоресценции применяют для разделения гликанов и измерения относительного количества каждого гликана в антителе. Фигура 7 показывает, что антитело αFGFR2b, полученное из клеточной лини Potelligent® CHOK1SV, и антитело αFGFR2b, полученное из CHOK1SV, обладают двумя разными гликановыми профилями. (A) Гликановый профиль αFGFR2b, полученного из клеточной линии Potelligent® CHOK1SV, показывает, что антитело лишено фукозы («G0»). (B) Гликановый профиль αFGFR2b, полученного из клеточной линии CHOK1SV, показывает, что антитело содержит фукозу (“G0F”).

[0195] Гликановые пики разделения с помощью нормальнофазовой ВЭЖХ идентифицировали с помощью двух ортогональных способов. Сначала образованные в Potelligent® CHOK1SV αFGFR2b метили и разделяли способом нормальнофазовой ВЭЖХ. После детекции флуоресценции гликаны пропускали через масс-спектрометр QTrap. Определяли массу каждого пика, показанную в Таблице 2, и применяли для положительной идентификации каждого гликана.

[0196] Также искали массу каждой фукозилированной формы гликанов (G0F, G1F и G2F) в αFGFR2b, образованных в Potelligent® CHOK1SV, и не находили. Фигура 8 показывает схематические диаграммы G0, G1, G2, G0F, G1F, G2F и манноза-5 (или Man-5) гликановых структур, обычно наблюдаемых в антителах.

[0197] Определение пиков в исследовании ВЭЖХ также подтверждали с помощью гликановых стандартов, приобретенных в Prozyme, и сопоставления времени удержания профилей стандартов и αFGFR2, полученных как из клеточной линии Potelligent® CHOK1SV, так и из клеточной линии CHOK1SV. С помощью этих стандартов можно было идентифицировали G0, G0F, Man5, G1, G1F и G2F.

[0198] Результаты исследования ВЭЖХ, а также характеристики, подтвердили отсутствие фукозилирования αFGFR2, полученных из клеточной линии Potelligent® CHOK1SV.

Пример 2: Аффинность связывания афукозилированного антитела к FGFR2b.

[0199] Аффинность связывания αFGFR2bA и αFGFR2bF (обозначение «F» после αFGFR2b относится к «фукозилированному» (fucosylated)) с Fc гамма RIIIA(V158) определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса. Кратко, протеин А ковалентно присоединяли к декстрановому чипу с помощью набора Amine Coupling Kit (GE Healthcare Life Sciences, Пискатауэй, штат Нью-Джерси) и 100 мМ этилендиамина (Sigma) в 100 мМ натрийборатного буфера, pH 8,0 (Sigma, Сент-Луис, штат Миссури), в качестве блокирующего агента. Приблизительно 600-800RU αFGFR2bA и αFGFR2bF наносили в отдельные проточные кюветы, а проточные кюветы на основе протеина A (Pierce) служили в качестве стандарта сравнения. Fc гамма RIIIA (V158) (R&D Systems, Миннеаполис, штат Миннесота) растворяли в HBS-P+ подвижном буфере (Biacore, GE Healthcare, Пискатауэй, штат Нью-Джерси) и инъецировали в 5 концентрациях (0 нМ, 12,3 нМ, 37 нМ, 111 нМ, 333 нМ и 1000 нМ) в двух повторах. Константу ассоциации, константу диссоциации и аффинность αFGFR2bA рассчитывали с помощью программы Biacore T200 Evaluation Software модели связывания 1:1. Константу аффинности связывания αFGFR2bF определяли с помощью программы Biacore T200 Evaluation Software модели аффинности в равновесном состоянии. Результаты показаны в Таблице 3.

[0200] Как показано в Таблице 3, Fc gamma RIIIA(V158) связывался с αFGFR2bA с аффинностью, более чем в 20 раз большей, чем при связывании с αFGFR2bF.

Пример 3: ADCC активность афукозилированного антитела к FGFR2b.

[0201] Проводили in vitro исследования для определения активности ADCC антитела αFGFR2bA по сравнению с антителом αFGFR2bF. Экспрессирующие FGFR2IIIb клетки-мишени Ba/F3 получали следующим образом. Клетки Ba/F3, полученные из Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, каталожный номер ACC300, Брауншвейг, Германия) растили в среде RPMI (Mediatech, каталожный номер 10-041-CV, Манассас, штат Вирджиния) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Mediatech, каталожный номер 35-010-CV), 1нг/мл мышиного IL-3 (Peprotech, каталожный номер 213-13, Роки Хилл, штат Нью-Джерси), 1X BME (Invitrogen, каталожный номер 1047574, Гранд Айленд, штат Нью-Йорк) и 1X пенициллин-стрептомицина (Mediatech каталожный номер 30-002-Cl). Клетки The Ba/F3 трансфицировали экспрессионным вектором, который экспрессирует FGFR2IIIb, pBNew-hFGFR2b, с помощью набора Cell Line Nucleofector® Kit V (Lonza, каталожный номер VCA-1003), следуя протоколу производителя. Вектор pBNew содержит промотор CAG с интроном гена β-актина курицы и генами ампициллина и пуромицина для селекции роста. Трансфицированные клетки инкубировали в полной ростовой среде в течение 3 дней, затем обрабатывали 2 мкг/мл пуромицина (InVivoGen, каталожный номер ant-pr-1, Сан-Диего, штат Калифорния). Пуромициновую селекцию проводили на всем протяжении культивирования. Для получения отдельных стабильных клонов клетки рассаживали при плотности 1 клетка на 3 лунки. Сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS, fluorescent activated cell sorting) с антителом к FGFR2IIIb применяли для отбора клонов с наибольшим уровнем экспрессии FGFR2IIIb.

[0202] Клетки MFM-223 получали из Health Protection Agency, Великобритания; клетки OCUM-2M получали из Osaka City University, Осака, Япония; а клетки KATO III получали из ATCC, Роквилл, штат Мэриленд. Все клетки культивировали с помощью стандартных способов. Свежевыделенные PBMC здоровых доноров получали из AllCells, Эмеривилл, штат Калифорния.

[0203] Исследования ADCC проводили, применяя эффекторные клетки, полученные от 3 независимых доноров в 3 разных дня. Исследование ADCC проводили, применяя свежевыделенные человеческие PBMC в качестве эффекторных клеток при соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней (E/T) равном 25:1. Клетки-мишени инкубировали в течение 16 часов в присутствии эффекторов и возрастающих концентраций антитела. Исследование ADCC оценивали с помощью 2 антител положительного контроля, HERCEPTIN® на клетках-мишенях SKOV-3 и RITUXIN® на клетках-мишенях Raji. Полностью человеческое антитело IgG1 (Eureka Therapeutics, Catalog ET901, Эмеривилл, штат Калифорния) применяли в качестве отрицательного контроля неспецифичной клеточной цитотоксичности. Цитотоксичность определяли посредством количественного определения высвобождения LDH согласно инструкциям производителя (CytoTox Non Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, Мэдисон, штат Висконсин).

[0204] Максимальный лизис определяли в присутствии 5% Triton X-100, а спонтанное высвобождение определяли в отсутствие антитела. Процент специфичного лизиса рассчитывали следующим образом как процент максимального лизиса минус спонтанное высвобождение:

(экспериментальное–спонтанное высвобождение)/(максимально–спонтанное высвобождение)×100=% специфичного лизиса

[0205] Результаты для клеток Ba/F3 показаны на Фигуре 1. Афукозилированное антитело αFGFR2bA индуцировало более специфичный лизис, чем фукозилированное антитело αFGFR2bF в экспрессирующих FGFR2IIIb клетках Ba/F3. В клетках OCUM-2M, MFM 223 и KATO III αFGFR2bA демонстрировало большую активность ADCC при меньших концентрациях, чем αFGFR2bF, хотя максимальный специфичный лизис антител был сравнимым в клетках OCUM-2M и MFM 223 (данные не показаны). Далее αFGFR2b демонстрировало малую активность ADCC или ее отсутствие в экспрессирующих FGFR2IIIc клетках Ba/F3. См. Фигуру 1A.

Пример 4: Активность афукозилированного антитела к FGFR2b в ксенотрансплантатных моделях рака желудка и рака груди.

[0206] Самок мышей CB17 SCID в возрасте шести недель покупали в Charles River Laboratories (Уилмингтон, штат Массачусетс) и адаптировали в течение 1 недели перед началом исследования. Клеточную линию карциномы желудка человека OCUM-2M или клеточную линию карциномы груди MFM-223 применяли в качестве моделей опухоли. OCUM-2M покупали в Public University Corporation Osaka City University (OCU, Осака, Япония), а MFM-223 покупали в Culture Collections, Public Health England (98050130, HPA Culture Collections, Солсбери, Великобритания). Клетки культивировали до трех пассажей в полной ростовой среде, чтобы нарастить их для имплантации. Клетки OCUM-2M и MFM-223 культивировали в минимальной питательной среде Дульбекко (DMEM, Dulbecco’s Minimum Essential Medium) и в минимальной питательной среде (MEM Minimum Essential Medium), соответственно. Вся среда была с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и раствора пенициллин-стрептомицина. Клетки растили при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO₂.

[0207] Когда культивируемые клетки достигали 85-90% конфлуентности, клетки собирали и ресуспендировали в холодном фосфатно-солевом буфере без Ca²⁺ и Mg²⁺, содержащем 50% Matrigel (BD BioSciences, Сан-Хосе, штат Калифорния). Клетки OCUM-2M имплантировали подкожно в правый бок мыши в количестве 5×10⁵ клеток/100 мкл/мышь. Клетки MFM-223 имплантировали подкожно в правый бок мыши в количестве 5×10⁵ клеток/100 мкл/мышь, и 0,72 мг таблеток эстрадиола с 90-дневным сроком высвобождения(Innovative Research of America, Сарасота, штат Флорида) инокулировали подкожно в правый бок. За ростом опухоли у мышей наблюдали дважды в неделю. Размер опухоли измеряли в соответствии с формулой: размер опухоли (мм³)=(ширина (мм) x длина (мм)²)/2. Когда опухоли MFM-223 достигали 80 мм³, мышей сортировали и рандомизировали (n=10), и начинали лечение. В случае опухолей OCUM-2M начинали монотерапию антителами к FGFR2b, как только опухоли достигали среднего размера 100 мм³, а комбинированную терапию начинали, как только опухоли достигали среднего размера 250 мм³.

[0208] Гуманизированное антитело к FGFR2IIIb (афукозилированное, αFGFR2bA; фукозилированное, αFGFR2bF) или альбумин в качестве отрицательного контроля вводили в дозах, варьирующих от 1 до 10 мг/кг посредством внутрибрюшинной инъекции дважды в неделю, как указано в подписях к фигурам. Химиотерапевтические агенты вводили посредством внутрибрюшинной инъекции дважды в неделю в количестве 12 мкг паклитаксела, 2,3 мг/кг фторурацила (5-FU) и 33 мг/кг цисплатина. После начала терапии измеряли размеры опухолей у каждой мыши дважды в неделю. Длину и ширину каждой опухоли измеряли циркулем, а размер опухоли рассчитывали в соответствии с формулой, приведенной выше. Мышей умерщвляли, когда объем подкожных опухолей превышал 2000 мм³ или когда опухоли становились слишком некротическими.

[0209] Сравнение объемов образовавшейся в результате опухоли определяли как статистически достоверное при P<0,05. Значения P рассчитывали с помощью непарного двухстороннего критерия Стьюдента для рассчитанных объемов опухоли в последний день, когда проводили измерение опухолей.

[0210] Фигура 2 показывает эффективность αFGFR2bA и αFGFR2bF при (A и B) 10 мг/кг и (C и D) 3 мг/кг в ксенотрансплантатной модели рака желудка человека OCUM-2M с амплификацией FGFR2. (A) При 10 мг/кг как фукозилированное, так и афукозилированное антитело вызывало немедленное уменьшение опухоли. Однако афукозилированное антитело вызывало более продолжительный ответ, чем фукозилированное αFGFR2bF. (B) Афукозилированное αFGFR2bA значительно снижало конечный размер опухоли OCUM-2M по сравнению с фукозилированным антителом αFGFR2bF (p=0,0153). Статистическую достоверность определяли с помощью двухстороннего непарного критерия Стьюдента. (C) В дозе 3 мг/кг афукозилированное αFGFR2bA снижало рост опухоли по сравнению с фукозилированным αFGFR2bF. Действительно, афукозилированное αFGFR2bA вызывало более выраженную регрессию опухоли и более продолжительный ответ по сравнению с фукозилированным αFGFR2bF (примечание: одно животное удалили из группы αFGFR2bF приблизительно в день 42, что привело к сдвигу кривой). (D) Афукозилированное αFGFR2bA при 3 мг/кг по сравнению с фукозилированным αFGFR2bF заметно снижало конечный размер опухоли OCUM-2M (p=0,0767). Статистическую достоверность определяли с помощью двухстороннего непарного критерия Стьюдента.

[0211] Фигура 3 показывает дозозависимое ингибирование опухоли αFGFR2bA. (A) Мышей SCID, имеющих подкожные ксенотрансплантаты OCUM-2M, обрабатывали 1, 1,5, 2, 3 или 5 мг/кг афукозилированных αFGFR2bA, когда средний размер опухоли достигал приблизительно 100 мм³. Хотя все дозы афукозилированных αFGFR2bA ингибировали рост опухоли, наибольшее подавление и наиболее продолжительный ответ наблюдали при 3 и 5 мг/кг, а пониженное подавление опухоли наблюдали при 2, 1,5 и 1 мг/кг αFGFR2bA. (B) Афукозилированное αFGFR2bA снижало конечный размер опухоли OCUM-2M, при этом более высокие дозы демонстрировали более сильное подавление роста. Подавление роста опухоли было статистически достоверным при всех дозах (5 мг/кг, p<0,0001; 3 мг/кг, p<0,0001; 2 мг/кг, p<0,0001; 1,5 мг/кг, p=0,0003; 1 мг/кг, p=0,0013). Статистическую достоверность определяли с помощью двухстороннего непарного критерия Стьюдента.

[0212] Фигура 4 показывает усиление противоопухолевой активности паклитаксела в ксенотрансплантатной модели рака желудка OCUM-2M при введении афукозилированных αFGFR2bA. (A) Мышей SCID, имеющих подкожные ксенотрансплантаты OCUM-2M, обрабатывали афукозилированными αFGFR2bA (5 мг/кг), паклитакселом (12 мг/кг) или комбинацией двух средств, когда среднего размер опухоли достигал приблизительно 285 мм³. Комбинация афукозилированных αFGFR2bA с паклитакселом снижала размер опухоли по сравнению с αFGFR2bA или паклитакселом в отдельности. (B) Комбинированная терапия αFGFR2bA/паклитакселом снижала конечный размер опухоли OCUM-2M по сравнению с паклитакселом (p=0,0005) или αFGFR2bA (p=0,0009) в отдельности. Статистическую достоверность определяли с помощью двухстороннего непарного критерия Стьюдента.

[0213] Фигура 5 показывает усиление противоопухолевой активности цисплатин/5-FU в ксенотрансплантатной модели рака желудка OCUM-2M при введении афукозилированных αFGFR2bA. (A) Мышей SCID, имеющих подкожные ксенотрансплантаты OCUM-2M, обрабатывали афукозилированными αFGFR2bA (5 мг/кг), фторурацилом (5-FU) плюс цисплатином (2,3 и 33 мг/кг, соответственно) или комбинацией трех средств, когда средний размер опухоли достигал приблизительно 260 мм³. Комбинация афукозилированных αFGFR2bA с 5-FU/цисплатином снижала размер опухоли по сравнению с αFGFR2bA или 5-FU/цисплатином в отдельности. (B) Комбинированная терапия αFGFR2bA/5-FU/цисплатином значительно снижала конечный размер опухоли OCUM-2M по сравнению с 5-FU/цисплатином (p=0,0003). Более выраженное снижение размера опухоли комбинированной терапией αFGFR2bA/5-FU/ цисплатином по сравнению с αFGFR2bA в отдельности было заметным, но не было статистически достоверным. Статистическую достоверность определяли с помощью двухстороннего непарного критерия Стьюдента.

[0214] Фигура 6 показывает эффективность αFGFR2bA в ксенотрансплантатной модели рака груди человека MFM-223. (A) MFM-223, клеточную линию карциномы груди человека с амплификацией FGFR2, имплантировали подкожно мышам SCID, и начинали терапию афукозилированными αFGFR2bA, когда средний размер опухоли достигал приблизительно 80 мм³. Афукозилированные αFGFR2bA (5 мг/кг) значительно снижали рост опухолей MFM-223 по сравнению с альбуминовым контролем (5 мг/кг). (B) Афукозилированные αFGFR2bA значительно снижали конечный размер опухолей MFM-223 по сравнению с альбуминовым контролем (p=0,0008). Статистическую достоверность определяли с помощью двухстороннего непарного критерия Стьюдента.

Пример 5: Афукозилированное антитело к FGFR2b опосредует более выраженную ADCC, чем фукозилированное антитело к FGFR2b.

[0215] Проводили in vitro исследования для определения активности ADCC антитела αFGFR2bA по сравнению с антителом αFGFR2bF. Экспрессирующие FGFR2IIIb клетки-мишени Ba/F3 получали, как описано выше. Клетки OCUM-2M получали из Osaka City University, Осака, Япония. Все клетки культивировали с помощью стандартных способов. Свежевыделенные PBMC здоровых доноров получали из AllCells, Эмеривилл, штат Калифорния.

[0216] Исследования ADCC проводили, применяя свежевыделенные PBMC человека в качестве эффекторных клеток при соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней (E:T), равном 25:1. Клетки-мишени инкубировали в течение 16 часов в присутствии эффекторов и возрастающих концентраций антитела. Все условия тестировали в трех повторах. Цитотоксичность определяли посредством количественного определения высвобождения LDH согласно инструкциям производителя (CytoTox Non Radioactive Cytotoxicity Assay). Для клеток OCUM-2M максимальный лизис определяли в присутствии 5% Triton X-100, а спонтанное высвобождение определяли в отсутствие антитела. Процент специфичного лизиса рассчитывали как процент максимального лизиса минус спонтанное высвобождение, как описано далее: (экспериментальное–спонтанное высвобождение)/(максимально–спонтанное высвобождение)×100=% специфичного лизиса. Для получения значений EC50 применяли способ аппроксимации кривой в программе GraphPad.

[0217] Результаты для клеток Ba/F3 показаны на Фигуре 9. Афукозилированное антитело αFGFR2bA демонстрировало более выраженную силу (более выраженную активность ADCC при более низких концентрациях), чем фукозилированное антитело αFGFR2bF в экспрессирующих FGFR2IIIb клетках Ba/F3. Похожие результаты показаны для клеток OCUM-2M на Фигуре 10. В Таблице 4 показана кратность увеличения активности афукозилированного антитела к FGFRb по сравнению с фукозилированным антителом к FGFR2b в двух разных клеточных линиях, показанных на Фигурах 9 и 10.

Пример 6: иммуногистохимическое детектирование белка FGFR2IIIb в опухолевой ткани.

[0218] Мышиное антитело αFGFR2b, содержащее вариабельные области мышиного GAL-FR21 (см., патент США № 8101723 B2) и константную область мышиного IgG2a применяли для детектирования белка FGFR2IIIb в зафиксированной формалином и залитой в парафин ткани рака желудка. Зафиксированную формалином и залитую в парафин ткань рака желудка депарафинизировали последовательными промывками ксилолом и возрастающими концентрациями этанола и регидратировали водой в течение пяти минут. Прикрепленные к предметным стеклам срезы ткани погружали в 0,1 мМ цитратный буфер (pH 6,0), нагретый до 95-99ºC, на 15 минут. Срезы ткани охлаждали и инкубировали с 3% H₂O₂ в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем промывали дважды TBST (0,05M Tris, 0,15M NaCl, 0,05% Tween 20) и блокировали в блокирующем буфере (2,5% нормальной лошадиной сыворотки в TBST) в течение 30 минут при комнатной температуре. Срезы ткани затем инкубировали с 5 мкг/мл антитела αFGFR2b в блокирующем буфере в течение 30 минут при комнатной температуре. Схожую интенсивность окрашивания получали при инкубациях в течение от 30 минут до 2 часов. После трех промывок в буфере TBST срезы ткани инкубировали с готовыми к применению биотинилированными вторичными лошадиными антимышиными антителами (10 мкл/мл, растворенные в блокирующем буфере (Vector Laboratories, Берлингейм, штат Калифорния; каталожный номер PK-7200) в течение 30 минут при комнатной температуре. Срезы ткани дважды промывали TBST буфером и инкубировали с готовой к применению конъюгированной со стрептавидином пероксидазой хрена (HRP, horse radish peroxidase; Vector Laboratories, каталожный номер PK-7200) в течение 30 минут при комнатной температуре. Детектирование проводили, применяя 3’,3’- диаминобензидиновый субстрат (DAB, 3’,3’-diaminobenzidine) (Vector Laboratories, каталожный номер PK-4105) в течение десяти минут при комнатной температуре согласно инструкциям производителя. Затем срезы ткани докрашивали гематоксилином (Dako North America, Карпинтерия, штат Калифорния, каталожный номер K-8008) согласно инструкциям производителя. Срезы ткани дегидратировали последовательными промывками возрастающими концентрациями этанола и ксилолов, а затем покрывали покровным стеклом.

[0219] При окрашивании было показано, что концентрации антитела αFGFR2b равные от 0,1 до 5 мг/мл были особенно эффективны в детектировании белка.

[0220] Окрашивание оценивали следующим образом:

0 Не наблюдают окрашивание антителом αFGFR2b

1+ Наблюдают слабое окрашивание в образцах, окрашенных антителом αFGFR2b. Окрашивание отсутствует в соответствующих срезах, окрашенных антителом отрицательного контроля.

2+ На срезах преобладает мембранно-цитоплазматическое окрашивание, специфичнее для антитела αFGFR2b.

3+ Сильное специфичное окрашивание антителом αFGFR2b с четкой мембранной локализацией по меньшей мере в части окрашенных опухолевых клеток.

[0221] На фигуре 11 показаны примеры 0 (A), 1+ (B, C), 2+ (D) и 3+ (E, F) окрашивания опухолевых тканей. На фигуре 11A протоковые и рассеянные опухолевые клетки демонстрируют отсутствие окрашивания антителом αFGFR2b. На фигуре 11B, которая показывает образец рака желудка интерстициального типа, опухолевые клетки (стрелки) демонстрируют некоторое окрашивание антителом αFGFR2b, в то время как окружающие протоковые клетки не окрашены. На фигуре 11C, которая показывает образец рака желудка диффузного типа, опухолевые клетки (стрелки) демонстрируют некоторое окрашивание антителом αFGFR2b, в то время как окружающие стромальные клетки (острие стрелки) не окрашены. На фигуре 11D опухолевые клетки (стрелки) демонстрируют промежуточное окрашивание антителом αFGFR2b, в то время как окружающие стромальные клетки (острие стрелки) не окрашены.На фигуре 11E опухолевые клетки (стрелки) демонстрируют сильное локализованное в мембране окрашивание антителом αFGFR2b, в то время как окружающие стромальные клетки (острие стрелки) не окрашены. На фигуре 11F опухолевые клетки (стрелки) демонстрируют сильное мембранное/цитоплазматическое окрашивание антителом αFGFR2b, в то время как окружающие стромальные клетки (острие стрелки) не окрашены.

Реферат

Изобретение относится к области биохимии, в частности к композиции для лечения рака, где рак включает солидную опухоль, которая сверхэкспрессирует FGFR2IIIb. Также раскрыты афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, клетка-хозяин, для экспрессии указанного антитела. Раскрыты способ получения указанного антитела, способ лечения рака с помощью указанного антитела. Изобретение обладает способностью эффективно лечить рак, ассоциированный с сверхэкспрессией FGFR2IIIb. 7 н. и 70 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 табл., 6 пр.

Формула