Противораковое лекарственное средство в форме cape-нагруженных микровезикул направленного действия и способ его разработки - RU2785400C2

Чертежи

Описание

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к получению лекарственного средства, которое является специфическим в отношении нейробластомы SH-SY5Y, путем загрузки CAPE в микровезикулы, которые специализированная клетка кожи оставляет в среде.

Уровень техники изобретения

CAPE (фенетиловый эфир кофеиновой кислоты) является одним из наиболее широко изученных активных компонентов тополиного прополиса. CAPE обладает антиоксидантным, антинеопластическим, противоопухолевым и цитопротекторным действием. CAPE ингибирует канцерогенез, клеточный цикл и метастазирование и вызывает апоптоз [1]. Одним из интересных и важных эффектов CAPE является то, что при использовании с различными антибиотиками (стрептомицин, ванкомицин, изониазид, этамбутол) и противоопухолевыми лекарственными средствами (митомицин, доксорубицин, цисплатин, метотрексат); снижает токсичность, возникающую в зависимости от указанных лекарственных средств [2].

Было показано, что CAPE (40 мкМ) дозозависимо останавливает пролиферацию клеток, индуцирует остановку клеточного цикла и апоптоз и подавляет ангиогенез в эстроген-рецептор-положительной ER+) MCF-7, эстроген-рецептор-отрицательной (ER-) MDA-MB-231 и трижды негативной (ER-, PR-, HER2-) TNBC клеточных линий рака молочной железы [3]. Кроме того, было также установлено, что CAPE (40 мкМ) ингибирует пролиферацию стволовых клеток рака молочной железы [4]. Было показано, что CAPE дозозависимо ингибирует пролиферацию клеток в клеточных линиях рака простаты LNCaP, DU-145 и PC-3 и сигнальном пути Akt [5]. Было продемонстрировано, что CAPE (50 мкМ) предотвращает пролиферацию, индуцируя остановку клеточного цикла фазы S и G2/M, и индуцирует апоптоз в клетках клеточных линий рака шейки матки ME180 [6]. Было установлено, что лечение CAPE (100 мкМ) уменьшало клеточную популяцию в фазе G1, увеличивало популяцию клеток в фазе G2/M и индуцировало апоптоз в клетках путем ингибирования сигнального пути Akt в клеточной линии плоскоклеточного рака полости рта TW2.6 [7]. Было установлено, что в клеточной линии рака печени SK-1 Hep1, к которой применялось комбинированное лечение CAPE (30 мкг/мл) и TRAIL, активация каспазы увеличивалась, рецепторы гибели клеток активировались посредством сигнальных путей JNK и p38, и индуцировался апоптоз в клетках [8]. В экспериментальных исследованиях было отмечено, что CAPE ингибирует токсичность, возникающую во время химиотерапии и лучевой терапии. Сообщается, что профилактическое введение CAPE предотвратило повреждение, вызванное доксорубицином, в тканях почки [9], сердца [10] и мозга [11], а также повреждение печени в зависимости от введения цисплатина [12] и тамоксифена [13] у крыс. Также было показано, что лечение CAPE снижает радиационно-индуцированное повреждение легких у крыс [14]. В исследовании, проведенном с CAPE на линии клеток нейробластомы SH-SY5Y, CAPE применяли в диапазоне 4-20 мкМ, но никакого эффекта не наблюдалось в клетках SH-SY5Y [15].

В другом исследовании CAPE (100 мкг/мл) загружали в метокси поли(этиленгликоль)-b-поли(ε-капролактон) (CE) сополимер и применяи в клеточной линии рака толстой кишки CT26. Когда результаты сравнивали с применением CAPE отдельно, не было обнаружено никакой разницы, что касается его эффектов на пролиферацию и гибель клеток [16].

Можно перечислить следующие проблемы, с которыми сталкивались при применениях, известных из уровня техники:

- Не являются специфичными для клетки и ткани.

- Требование к использованию в высоких концентрациях.

- Активация системы мононуклеарных фагоцитов.

- Раковые ткани, проявляющие химическую устойчивость при применении лекарственных препаратов.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является обеспечение разработки клеточноспецифической везикулы направленного действия, путем загрузки CAPE в микровезикулы, полученные в результате культивирования и последующей специализации (дифференцировки) клеток ткани.

Еще одной целью изобретения является применение CAPE в более низких концентрациях по сравнению с применениями, известными из уровня техники, для минимизации его токсичности как для клеток, кроме клеток-мишеней, так и для организма.

Подробное описание изобретения

«Разработка противоракового лекарственного средства в форме микровезикул, нагруженных CAPE, целенаправленно действующего на нейробластому SH-SY5Y», разработанного для достижения целей настоящего изобретения, проиллюстрирована на прилагаемых фигурах, на которых:

Фиг.1 представляет собой графическое представление комбинаций, образованных путем загрузки CAPE в микровезикулы, полученные из клеток SH-SY5Y, PC3 и PNT-1, на жизнеспособность клеток клеток SH-SY5Y при применении 48 часов. (CAPE: фенетиловый эфир кофеиновой кислоты, MV: микровезикула, *: P<0,05).

Фиг.2 представляет собой графическое представление эффекта комбинаций, полученных путем загрузки различных доз CAPE (фенетиловый эфир кофеиновой кислоты) в микровезикулы, полученные из клеток, которые дифференцируются из стволовых клеток в здоровые нервные клетки, на жизнеспособность клеток клеток SH-SY5Y при применении 48 часов. (CAPE: фенетиловый эфир кофеиновой кислоты, MV: микровезикула, *: P <0,05).

Изобретение представляет собой противоопухолевое лекарственное средство, полученное путем загрузки лекарственного средства (CAPE) в микровезикулы, продуцируемые дифференцированными стволовыми клетками кожи, и его применение обусловлено цитотоксическим действием этих клеточных везикул на раковые клетки. Лекарственное средство загружают в везикулы клеток, которые специализируются на лечении факторами роста, применяемыми для обеспечения свойств нервных клеток. В пределах объема настоящего изобретения, клетки; которые дифференцируются путем введения нейробазального раствора, предпочтительно содержащего 10 нг/мл bFGF, 10 нг/мл EGF, 1% добавку B7, 1% ITS (инсулин, трансферрин и селен), 10% глютамин и 1% PSA в течение 12-14 дней; приобретают новые свойства с помощью этого способа, что делает везикулы нацеленными на раковые клетки SHSY5Y. Методом изобретения клеточные везикулы нагружают CAPE, таким образом придавая свойство специфического распознавания раковых клеток SHSY5Y.

Существуют два варианта осуществления в пределах объема изобретения. В первом варианте осуществления; посредством нагрузки лекарственным средством (CAPE (фенетиловый эфир кофеиновой кислоты), обеспечивается цитотоксическое свойство клеточным везикулам, которые образуются путем изменения таких факторов, как температура 37°C, pH, 5% диоксида углерода и среда DMEM, F12, RPMI, которые обеспечивают рост клеток, в дополнение к условиям роста клеток (стволовые клетки, клеточные линии, праймерные клетки, раковые клетки, клетки, полученные из тканей). Во втором варианте осуществления; посредством нагрузки лекарственным средством (CAPE (фенетиловый эфир кофеиновой кислоты) обеспечивается цитотоксическое свойство клеточным везикулам, которые образуются путем обработки клеток (стволовые клетки, клеточные линии, праймерные клетки, раковые клетки, клетки, полученные из тканей) другими химическими веществами (факторы роста, такие как bFGF, EGF, NGF; гормоны, такие как мелатонин, инсулин, лактоферрин; витамины, такие как аскорбиновая кислота, фолиевая кислота и минералы, такие как кальций, магний, бор) в дополнение к собственным условиям роста клеток. Было замечено, что эти везикулы, собранные из стволовых клеток, дифференцированных в нервные клетки, демонстрируя особенность распознавания нервных клеток, также проявляют цитотоксичность, специфичную для SHSY5Y, после обработки в течение 12-14 дней, как показано на фиг.1. Термин «специализированный» дан в результате сравнения клетки SHSY5Y с другими клетками, как показано на фиг. 1.

В одном варианте осуществления изобретения, используют микровезикулы, которые продуцируются клетками, специфичными для определенного типа рака, посредством дифференциации клеток в клетки ткани, где наблюдается указанное образование опухоли, которые получены на 12-14-е сутки, а не на 25-30 сутки. Соответственно, используются микровезикулы, которые продуцируются клетками, поскольку специфические характеристики клеток SHSY5Y, которые приобретаются путем дифференцировки стволовых клеток, подвергаемых дифференцировке нервных клеток, передаются на ранней стадии дифференцировки нервов путем дифференцировки в течение 12-14 дней, а не 25-30 дней.

В одном варианте осуществления изобретения, с целью разработки противоракового лекарственного средства в форме микровезикул, нагруженных CAPE, целенаправленно действующего на нейробластому SH-SY5Y, загрузку CAPE в концентрации от 5 мкМ до 100 мкМ осуществляют на клеточные микровезикулы, продуцируемые с помощью нервных клеток; и эти значения намного более выгодны по сравнению с высокими токсическими количествами ≥100 мкМ, применявшимися в предшествующих отдельных применениях CAPE, известными из литературы.

Противораковое лекарственное средство, которое получают с помощью специализированных клеточных микровезикул, нагруженных CAPE, полученных в объеме изобретения, не оказывает токсического действия на здоровые клетки и другие клеточные линии, проявляя токсическое действие только на определенный вид рака. Как показано на фиг. 1, и, как уже упоминалось выше, специализированные микровезикулы проявляют цитотоксическое действие только на клетки SHSY5Y.

Изобретательская разработка микровезикулярного противоракового лекарственного средства, нагруженного CAPE, целенаправленно действующего на нейробластому SH-SY5Y, включает стадии:

- Посев (культивирование) стволовых клеток кожи в среду,

- Осуществление протокола специализации, который предусматривает, что клетки в культуральной среде, которые достигли достаточной конфлюентности (70-80%), высевают в 6-луночные планшеты для культуры клеток, придавая таким образом клеткам свойство распознавания нейробластомы, обеспечивая для них возможность стать нацеливаемыми,

- Растворение CAPE (фенетиловый эфир кофеиновой кислоты) в DMSO (диметилсульфоксид) с получением исходного раствора (таким образом, из более концентрированного исходного раствора могут быть получены различные концентрации),

- Осуществление выделения микровезикул из специализированных клеток кожи,

- Добавление CAPE в микровезикулы,

- Отделение микровезикул, нагруженных CAPE, от CAPE, который присутствует в растворе в свободном состоянии и не загружен в микровезикулу,

- Получение противоракового лекарственного средства в форме микровезикул, нагруженных CAPE, целенаправленно действующего на нейробластому SH-SY5Y, которое является конечным продуктом.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, на стадии проведения культивирования стволовых клеток кожи; стволовые клетки кожи, клетки SH-SY5Y, PNT-1A, PC-3 предпочтительно культивируют в среде DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко), содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку и 1% PSA, в инкубаторах клеточных культур, предпочтительно при 37°С и 5% CO₂.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения во время стадии специализации клеток в культуральной среде, получают нейробазальный раствор, предпочтительно содержащий 10 нг/мл bFGF, 10 нг/мл EGF, 1% добавку B7, 1% ITS (инсулин, трансферрин и селен), 10% глютамин и 1% PSA, а затем применяют протокол специализации путем введения этого специализированного раствора в клетки, посеянные в 6-луночные планшеты для культивирования клеток, один раз в два дня в течение 12-14 дней.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения на стадии получения исходного раствора 45,75 мг CAPE предпочтительно растворяют в 3,22 мл DMSO (диметилсульфоксид). Конечная полученная концентрация составляет приблизительно 50000 мкМ.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения на стадии выделения микровезикул из специализированных клеток кожи раствор, собранный из культуральной среды, центрифугируют при 300 g в течение 10 минут для удаления ненужных клеток. Супернатант, оставшийся в верхней части пробирки после центрифугирования, переносят в новую пробирку и центрифугируют при 14000 g в течение 30 минут для удаления возможных компонентов клетки. Супернатант, оставшийся в верхней части пробирки после центрифугирования, переносят в новую пробирку и добавляют 1/2 объема раствора A и инкубируют в течение одного дня при +4 градусах. На следующий день после центрифугирования при 16000 g в течение 1 часа осадок в пробирке растворяют в дистиллированной воде (dH₂O).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения загрузку CAPE в микровезикулярную структуру осуществляют путем инкубации при комнатной температуре. Раствор микровезикул добавляют к 50 мкМ раствору CAPE, предпочтительно полученному в 2 мл PBS, так что конечная концентрация составляет 100 мкг/мл, и смесь инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре (25°C). Затем осуществляют процесс осаждения с использованием набора для выделения, для получения везикул, нагруженных веществом. Полученный в результате осадок, нагруженный веществом, растворяют в дистиллированной воде (dH₂O).

В «противораковом лекарственном средстве в форме микровезикул, нагруженных CAPE, целенаправленно действующем на нейробластому SHSY5Y (Micro-CAPE)» по настоящему изобретению, используют стволовые клетки кожи, клетки PNT-1A, PC-3 и SH-SY5Y. Наблюдалась токсичность целевых микровезикул, полученных путем специализации стволовых клеток, к клеткам SH-SY5Y. При загрузке CAPE в микровезикулы, полученные в этом исследовании, образуется клеточноспецифическая везикула направленного действия, в то время как токсичность как для других клеток, так и для организма сводится к минимуму благодаря использованию гораздо более низких концентраций CAPE по сравнению с концентрациями, ранее использовавшимися, известными из литературы.

В пределах объема настоящего изобретения, прежде всего, стволовые клетки кожи, клетки SH-SY5Y, PNT-1A и PC-3 культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку (Invitrogen) и 1% PSA (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) при температуре 37°С в инкубаторах клеточных культур с 5% CO₂. Клетки в культуральном растворе, которые достигли достаточной конфлюентности (70-80%), высевали в 6-луночные планшеты для культуры клеток и применяли протокол специализации в течение 13 дней с нейробазальным раствором, содержащим 10 нг/мл bFGF, 10 нг/мл EGF, 1% B7 добавка, 11% ITS (инсулин, трансферрин и селен), 10% глютамин и 1% PSA путем смены среды через день. В то же время, начинают процесс получения исходного раствора. Для этой цели 45,75 мг CAPE растворяют в 3,22 мл DMSO (диметилсульфоксид). Конечная полученная концентрация составляет 50,000 мкМ.

Микровезикулы выделяют из клеток кожи, к которым применяют протокол специализации. Набор EX01 Exo-spin™ использовали для выделения микровезикул из специализированных клеток кожи в рамках изобретения. Среду, собранную из культуральной среды, центрифугируют при 300 g в течение 10 минут, для удаления ненужных клеток. Супернатант переносят в новую пробирку и центрифугируют при 14000 g в течение 30 минут для удаления возможных компонентов клетки. Супернатант, полученный этим центрифугированием, переносят в новую пробирку и добавляют 1/2 объема раствора А, и его инкубируют в течение одного дня при +4 градусах. На следующий день после центрифугирования при 16000 g в течение 1 часа осадок в пробирке растворяют в дистиллированной воде (dH₂O).

Загрузка CAPE, который получают в виде отдельного раствора, в микровезикулы, осуществляют при комнатной температуре. К раствору 50 мкМ CAPE, полученному в 2 мл PBS, добавляют раствор микровезикул, так что конечная концентрация будет 100 мкг/мл. Смесь инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре (25°C) и затем осуществляют процесс осаждения с использованием набора для выделения, для получения везикул, нагруженных CAPE. Полученный в результате осадок, нагруженный веществом, растворяют в дистиллированной воде (dH₂O).

С помощью изобретения «разработка противоракового лекарственного средства в форме микровезикул, нагруженных CAPE, целенаправленно действующего на нейробластому SH-SY5Y (Micro-CAPE)», лекарственное средство обеспечивает возможность

- использования в гораздо более низких концентрациях (5 мкМ),

- быть специфичным для типа клеток,

- пройти гематоэнцефалический барьер,

- не вызывать воспаление,

- не иметь никакой токсичности для организма,

- предотвращения резистентности формы рака,

- метаболизироваться в клетке после использования,

- оставаться в кровотоке в течение длительного времени.

Экспериментальные исследования

Измерение количества загруженного CAPE

После процесса загрузки измеряли количество CAPE, перенесенного в структуру микровезикулы, на основе метода спектрофотометрического измерения. При измерении количества нагруженного CAPE использовали собственное излучение молекулы при длине волны 323 нм. Различные концентрации (1-100 мкМ) CAPE измеряли при длине волны 323 нм для формирования стандартной кривой. Количество нагруженного CAPE определяли двумя взаимосвязанными методами. Во-первых, количество нагруженного CAPE определяли путем измерения количества, оставшегося в супернатанте после осаждения CAPE-нагруженных микровезикул. Во-вторых, это определяли путем фракционирования мембранных структур микровезикул, нагруженных осажденным веществом, и измерения количества CAPE, введенного в везикулярную структуру.

Определение токсичности

После того, как клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты (Corning Glasswork, Corning, NY) при 5000 клеток/лунку в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Invitrogen) и 1% PSA (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) в культуральном растворе, уровни жизнеспособности клеток измеряли в день 1, 2 и 3. Жизнеспособность клеток определяли с помощью 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенетил)-2-(4-сульфо-фенетил)-2Н-тетразолия (MTS)-тест (CellTiter96 AqueousOne Solution; Promega, Southampton, UK). 10 мкл раствора MTS добавляли на клетки в 100 мкл среды и инкубировали при 37°С в темноте в течение 2 часов. После процесса инкубации жизнеспособность клеток определяли, путем осуществления измерение оптической плотности с помощью устройства для считывания планшетов ELISA (Biotek, Winooski, VT) при длине волны 490 нм.

ССЫЛКИ

[1] Lin, H.P., Lin, C.Y., Liu, C.C., Su, L.C., Huo, C., Kuo, Y.Y., Tseng, J.C., Hsu, J.M., Chen, C.K., Chuu, C.P. 2013. “Caffeic Acid phenethyl ester as a potential treatment for advanced prostate cancer targeting akt signaling”, Int J Mol Sci., 6;14(3):5264-83. doi: 10.3390/ijms14035264.

[2] Tolba, M.F., Omar, H.A., Azab, S.S., Khalifa, A.E., Abdel-Naim, A.B., Abdel-Rahman, S.Z. 2014. “Caffeic acid phenethyl ester: A review of its antioxidant activity, protective effects against ischemia-reperfusion injury and drug adverse reactions”, Crit Rev Food Sci Nutr.,DOI: 10.1080/10408398.2013.821967.

[3] Wu, J., Omene, C., Karkoszka, J., Bosland, M., Eckard, J., Klein, C.B., Frenkel, K. 2011. “Caffeic acid phenethyl ester (CAPE), derived from a honeybee product propolis, exhibits a diversity of anti-tumor effects in pre-clinical models of human breast cancer”, Cancer Lett.,1;308(1):43-53. doi: 10.1016/j.canlet.2011.04.012.

[4] Omene, C.O., Wu, J., Frenkel, K. 2012. “Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE) derived from propolis, a honeybee product, inhibits growth of breast cancer stem cells”, Invest New Drugs, 30(4):1279-88. doi: 10.1007/s10637-011-9667-8.

[5] Chuu, C.P., Lin, H.P., Ciaccio, M.F., Kokontis, J.M., Hause, R.J. Jr, Hiipakka, R.A., Liao, S., Jones, R.B. 2012. “Caffeic acid phenethyl ester suppresses the proliferation of human prostate cancer cells through inhibition of p70S6K and Akt signaling networks”, Cancer Prev Res (Phila), 5(5):788-97. doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-12-0004-T.

[6] Hsu, T.H., Chu, C.C., Hung, M.W., Lee, H.J., Hsu, H.J., Chang, T.C. 2013. “Caffeic acid phenethyl ester induces E2F-1-mediated growth inhibition and cell-cycle arrest in human cervical cancer cells” FEBS J., 280(11):2581-93. doi: 10.1111/febs.12242.

[7] Kuo, Y.Y., Lin, H.P., Huo, C., Su, L.C., Yang, J., Hsiao, P.H., Chiang, H.C., Chung, C.J., Wang, H.D., Chang, J.Y., Chen, Y.W., Chuu, C.P. 2013. “Caffeic Acid Phenethyl Ester Suppresses Proliferation and Survival of TW2.6 Human Oral Cancer Cells via Inhibition of Akt Signaling”, Int J Mol Sci., 24;14(5):8801-17. doi: 10.3390/ijms14058801.

[8] Kim, E.Y., Ryu, J.H., Kim, A.K. 2013. “CAPE promotes TRAIL-induced apoptosis through the upregulation of TRAIL receptors via activation of p38 and suppression of JNK in SK-Hep1 hepatocellular carcinoma cells”, Int J Oncol., 43(4):1291-300. doi: 10.3892/ijo.2013.2018.

[9] Yagmurca, M., Erdogan, H., Iraz, M., Songur, A., Ucar, M., Fadillioglu, E. 2004. “Caffeic acid phenethyl ester as a protective agent against doxorubicin nephrotoxicity in rats”, Clin Chim Acta, 348:27-34.

[10] Fadillioglu,E., Oztas, E., Erdogan, H., Yagmurca, M., Sogut, S., Ucar, M., et al. 2004. “Protective effects of caffeic acid phenethyl ester on doxorubicin-induced cardiotoxicity in rats”, J Appl Toxicol, 24:47-52.

[11] Irmak, M.K., Fadillioglu, E., Sogut, S., Erdogan, H., Gulec, M., Ozer, M., et al. 2003. “Effects of caffeic acid phenethyl ester and alpha-tocopherol on reperfusion injury in rat brain”, Cell Biochem Funct., 21:283-9.

[12] Iraz, M., Ozerol, E., Gulec, M., Tasdemir, S., Idiz, N., Fadillioglu, E., et al. 2006. “Protective effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) administration on cisplatin-induced oxidative damage to liver in rat”, Cell Biochem Funct, 24:357-61.

[13] Akyol, S., Ginis, Z., Armutcu, F., Ozturk, G., Yigitoglu, M.R., Akyol, O. 2012. “The potential usage of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) against chemotherapy-induced and radiotherapy-induced toxicity”, Cell Biochem Funct., 30(5):438-43. doi: 10.1002/cbf.2817.

[14] Yildiz, O.G., Soyuer, S., Saraymen, R., Eroglu, C. 2008. “Protective effects of caffeic acid phenethyl ester on radiation induced lung injury in rats”, Clin Invest Med, 31: E242-7.

[15] Izuta, H., Shimazawa, M., Tazawa, S., Araki, Y., Mishima, S., & Hara, H. 2008. “Protective effects of Chinese propolis and its component, chrysin, against neuronal cell death via inhibition of mitochondrial apoptosis pathway in SH-SY5Y cells”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(19), 8944-8953.

[16] Lee, H. Y., Jeong, Y. I., Kim, E. J., Lee, K. D., Choi, S. H., Kim, Y. J., ... & Choi, K. C. 2015. “Preparation of Caffeic Acid Phenethyl Ester‐Incorporated Nanoparticles and Their Biological Activity”. Journal of pharmaceutical sciences, 104(1), 144-154.

Реферат

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, а именно к лекарственному средству, целенаправленно действующему на нейробластому SH-SY5Y, и к способу получения противоракового лекарственного средства в форме микровезикул, нагруженных CAPE, целенаправленно действующего на нейробластому SH-SY5Y. Лекарственное средство, целенаправленно действующее на нейробластому SH-SY5Y, полученное посредством нагрузки лекарственным средством CAPE (фенетиловый эфир кофеиновой кислоты) клеточных микровезикул, которые образуются путем культивирования стволовых клеток кожи в среде DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко), содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку и 1% PSA при температуре 37°С и 5% диоксида углерода с последующей специализацией путем введения нейробазального раствора, содержащего 10 нг/мл bFGF, 10 нг/мл EGF, 1% добавку B7, 1% ITS (инсулин, трансферрин и селен), 10% глютамин и 1% PSA, один раз в два дня в течение 12-14 дней. Способ получения противоракового лекарственного средства в форме микровезикул, нагруженных CAPE, целенаправленно действующего на нейробластому SH-SY5Y, включающий стадии: культивирование стволовых клеток кожи в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку и 1% PSA, при температуре 37°С и 5% диоксида углерода; осуществление протокола специализации, который предусматривает, что клетки в культуральной среде, которые достигли достаточной конфлюентности, составляющей 70-80%, высевают в планшеты для культуры клеток, вводят нейробазальный раствор, содержащий 10 нг/мл bFGF, 10 нг/мл EGF, 1% добавку B7, 1% ITS (инсулин, трансферрин и селен), 10% глютамин и 1% PSA, один раз в два дня в течение 12-14 дней; получение исходного раствора путем растворения CAPE в DMSO (диметилсульфоксид); осуществление выделения микровезикул из специализированных клеток кожи; добавление CAPE в микровезикулы; отделение микровезикул, нагруженных CAPE, от CAPE, который присутствует в растворе в свободном состоянии и не загружен в микровезикулу; получение противоракового лекарственного средства в форме микровезикул, нагруженных CAPE, целенаправленно действующего на нейробластому SH-SY5Y, которое является конечным продуктом. Вышеуказанная группа изобретений позволяет использовать лекарственное средство в форме микровезикул, нагруженных CAPE, целенаправленно действующее на нейробластому SH-SY5Y, специфичное для данного типа клеток, в гораздо более низких концентрациях, а также минимизировать воспаление и токсичность для организма. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 2 ил.

Формула