Генетические маркеры для прогнозирования восприимчивости к терапии - RU2707533C2

Код документа: RU2707533C2

Чертежи

Показать все 15 чертежа(ей)

Описание

Область данного изобретения относится к лечению или профилактике у субъекта сердечно-сосудистого нарушения.

20 лет назад использовался один подход к лечению, который подходил всем, что привело к появлению грозных "блокбастерных" лекарственны препаратов (лидеров продаж). Сегодня с секвенированием генома человека и достижениями в области технологий молекулярного профилирования подходы к разработке лекарственных препаратов являются более стратифицированными или персонализированными. Эти достижения все больше позволяют классифицировать людей на субпопуляции, которые подвергаются риску развития конкретного заболевания, отвечают на конкретное лечение, не отвечают на конкретное лечение или имеют высокий риск неблагоприятного события при лечении. Такие генетические тесты могут быть использованы для постановки диагноза, определения прогноза и выбора лечения. Многочисленные исследования показали взаимосвязь между генотипом и ответом на фармацевтические способы лечения. Этот подход был широко охвачен в последние годы, особенно в онкологии, где были успешно разработаны многочисленные персонализированные медицинские подходы, которые обеспечили значительное улучшение клинических исходов.

При сердечно-сосудистых нарушениях стратификация (расслоение) населения по генотипу для специфического терапевтического вмешательства была ограниченной. Одной из целей данного изобретения является демонстрация того, что население, страдающее от сердечно-сосудистых заболеваний, может вести себя по-разному, и вследствие этого может по-разному реагировать на конкретное лечение. Снижение уровня LDL является важной терапевтической стратегией в контроле за сердечно-сосудистыми заболеваниями. Действительно, лекарственные препараты статины, которые снижают уровни LDL, такие как крестор, липитор, правахол и зокор, широко используются и входят в число наиболее часто выписываемых лекарственных препаратов. В течение некоторого времени также было общепринятым мнение, что повышение уровня HDL также может быть терапевтическим подходом в лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Были разработаны некоторые лекарственные препараты, повышающие уровень HDL (HDL - липопротеиды высокой плотности), в том числе ниацин и ингибиторы СЕТР, такие как торцетрапиб, анацетрапиб, эвацетрапиб и далцетрапиб.

Белок переноса холестерилового эфира (cholesterylester transfer protein, СЕТР), также называемый белком переноса липидов плазмы, представляет собой гидрофобный гликопротеин, который синтезируется в некоторых тканях, но главным образом в печени. СЕТР способствует двунаправленному переносу сложных эфиров холестерина и триглицеридов между всеми липопротеиновыми частицами плазмы. Первые доказательства влияния СЕТР на липопротеины плазмы были получены при наблюдении за людьми с генетическим дефицитом СЕТР. Первая мутация СЕТР была выявлена в Японии в 1989 году в качестве причины заметно повышенного уровня HDL-C. С тех пор было выявлено десять мутаций, связанных с дефицитом СЕТР, у азиатов и одна у европеоидов. В Японии было обнаружено, что 57% субъектов с уровнем HDL-C > 100 мг/дл имеют мутации гена СЕТР. Кроме того, 37% японцев с уровнем HDL-C 75-100 мг/дл имеют мутации гена СЕТР. Впоследствии исследования на животных, получавших анти-СЕТР-антитело, показали, что ингибирование СЕТР приводит к существенному увеличению концентрации HDL-C. В соответствии с этими наблюдениями у СЕТР-дефицитных пациентов и у кроликов, получавших анти-СЕТР-антитело, было обнаружено, что лечение людей лекарственными препаратами - ингибиторами СЕТР - повышает концентрацию холестерина-HDL и апоА-l (основного аполипопротеина в HDL). Корреляция измененной активности СЕТР и риска ишемической болезни сердца была показана в многочисленных эпидемиологических исследованиях, включая исследования человеческих мутаций (Hirano, K.I. Yamishita, S. and Matsuzawa Y. (2000) Curr. Opin. Lipido. 11(4), 389-396).

Атеросклероз и его клинические последствия, включая ишемическую болезнь сердца (coronary heart disease, CHD), инсульт и заболевания периферических сосудов, являются тяжелым бременем системы здравоохранения на международном уровне. Лекарственные препараты, которые ингибируют СЕТР (ингибиторы СЕТР), в течение некоторого времени находились в стадии разработки, и ожидалось, что их можно будет использовать для лечения или профилактики атеросклероза. Было показано, что ряд классов препаратов-ингибиторов СЕТР повышают уровень HDL, понижают уровень LDL в организме человека и имеют терапевтические эффекты для лечения атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе далцетрапиб, торцетрапиб, анацетрапиб, эвацетрапиб, BAY 60-5521 и другие (таблица 1).

Тем не менее, есть свидетельства того, что эти лекарственные препараты могут не быть безопасными и эффективными для всех пациентов. Клиническое испытание торцетрапиба было прекращено на III фазе в связи с частотой смертельных случаев у пациентов, которым одновременно вводили торцетрапиб и аторвастатин, в сравнении с пациентами, получавшими только аторвастатин. Клиническое испытание далцетрапиба также было остановлено на III этапе из-за отсутствия эффективности по сравнению с пациентами, получавшими только статины. Другие ингибиторы СЕТР по-прежнему находятся в клинических испытаниях и на более ранних этапах разработки. В общих стратегиях лечения с использованием ингибиторов СЕТР, которые обеспечивают более высокую эффективность, сниженные эффекты "мимо мишени" будут клинически полезными. Существует потребность в биомаркерах, способах и подходах к прогнозированию реакции на ингибиторы СЕТР и риска побочных эффектов, связанных с введением ингибиторов СЕТР.

Ингибиторы СЕТР могут быть использованы для лечения и/или профилактики атеросклероза, заболеваний периферических сосудов, дислипидемии, гипербеталипопротеинемии, гипоальфалипопротеинемии, гиперхолестеринемии, гипертриглицеридемии, семейной гиперхолестеринемии, сердечно-сосудистых заболеваний, стенокардии, ишемии, ишемии сердца, инсульта, инфаркта миокарда, реперфузионного повреждения, рестеноза после ангиопластики, гипертензии и сосудистых осложнений сахарного диабета, ожирения или эндотоксемии.

Клинические испытания показали, что реакции пациентов на лечение фармацевтическими препаратами часто неоднородны. Существует настоятельная необходимость в улучшении разработки лекарственных препаратов, клинических разработок и терапевтического влияния лекарственных препаратов для отдельных лиц или субпопуляций пациентов. SNP могут быть использованы для выявления пациентов, наиболее подходящих для лечения конкретными фармацевтическими агентами (этот подход часто называется "фармакогеномикой"). Аналогично, SNP можно использовать для исключения пациентов из определенного лечения из-за повышенной вероятности развития у таких пациентов токсических побочных эффектов или из-за повышенной вероятности того, что они не ответят на лечение. Фармакогеномика также может быть использована в фармацевтических исследованиях для того, чтобы способствовать разработке лекарственных препаратов и процессу отбора. Under et al, Clinical Chemistry 43: 254 (1997); Marshall, Nature Biotechnology 15: 1249 (1997); International Patent Application WO 97/40462, Spectra Biomedical; и Schafer et al, Nature Biotechnology 16: 3 (1998).

Исследование смертности и заболеваемости при приеме далцетрапиба (dal-OUTCOMES) представляло собой дважды слепое, рандомизированное, плацебо-контролируемое, многоцентровое исследование в параллельных группах на пациентах со стабильной CHD, недавно госпитализированных по причине острого коронарного синдрома (acute coronary syndrome, ACS). Исследование было проведено с целью проверить гипотезу о том, снижает ли ингибирование СЕТР риск повторных сердечно-сосудистых событий у пациентов с недавним ACS за счет повышения уровня HDL-C. Подходящие пациенты вошли в простое слепое плацебо-контролируемое пробное испытание примерно на 4-6 недель для стабилизации пациентов и завершения запланированных процедур реваскуляризации. В конце пробного периода подходящие пациенты в стабильном состоянии были рандомизированы в соотношении 1:1 для получения 600 мг далцетрапиба или плацебо согласно принципам доказательной медицины для ACS. Далцетрапиб является ингибитором белка переноса холестерилового эфира (СЕТР). Было показано, что у некоторых видов животных и у человека он индуцирует дозозависимое уменьшение активности СЕТР и снижение уровней HDL-C. Снижение активности СЕТР при различных подходах показало противоатеросклеротические эффекты на нескольких животных моделях. Испытание было прервано в мае 2012 года комитетом DSMB на основании бесполезности. Исследование dal-OUTCOMES привело к неожиданным наблюдениям, связанным с прогрессированием сердечно-сосудистых заболеваний. Несмотря на заметное повышение уровня HDL-C пациенты на лечении не демонстрировали значительного уменьшения сердечно-сосудистых событий, и исследование было прекращено.

После прекращения исследования dal-OUTCOMES было высказано предположение, что субпопуляция пациентов в исследовании отвечала на далцетрапиб по-разному, и далцетрапиб мог бы иметь значительный терапевтический эффект в некоторой субпопуляции пациентов. Фармакогеномное изучение популяции, исследуемой в dal-OUTCOMES, было проведено с целью изучения индивидуальных различий между людьми в их чувствительности на далцетрапиб и определения генетических маркеров для прогнозирования терапевтического ответа на далцетрапиб или другие ингибиторы СЕТР, для стратификации пациентов и для выбора лечения.

Данное изобретение предусматривает способы генотипирования, реагенты и композиции для выбора лиц, которые могут получить пользу от лечения HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом, в частности, ингибитором/модулятором СЕТР, в частности, у людей с сердечно-сосудистыми нарушениями. Изобретение также предусматривает способы лечения пациентов с сердечно-сосудистыми нарушениями, включающие генотипирование и выбор пациентов, которые получат пользу от лечения HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом, в частности, ингибитором/модулятором СЕТР. Неожиданно фармакогеномное исследование когорты пациентов dal-OUTCOMES выявило одиночные нуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphism, SNP), генетические маркеры, связанные с ответом индивидуума на далцетрапиб, которые можно использовать для прогнозирования терапевтического ответа на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент (в частности, ингибитор/модулятор СЕТР) и для лечения пациентов HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом (в частности, ингибитором/модулятором СЕТР).

Генетические маркеры, обнаруженные генотипирующими способами согласно данному изобретению, включают: 15 SNP, которые возникают в гене аденилатциклазы типа 9 (ADCY9) на хромосоме 16, rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119 и rs13337675, в частности rs1967309, который сильно ассоциирован (Р=4,11×10^-8) с ответом на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности, ингибитор/модулятор СЕТР.

Другие генные маркеры изобретения включают SNP в гене ADCY9, который находится либо в неравновесном сцеплении с rs1967309, либо дает сигнал ассоциации с Р<0,05 и может предоставить полезные суррогатные биомаркеры rs1967309. В одном воплощении обнаруживается суррогатный биомаркер, состоящий из SNP, который наследуется в неравновесном сцеплении с rs1967309, и выводится генотип rs1967309.

Данное изобретение относится к способам генотипирования и лечения пациентов HDL-повышающими лекарственными препаратами, в частности, ингибитором СЕТР. Ответ индивидуума на HDL-повышающий лекарственный препарат, в частности, на ингибитор СЕТР, прогнозируют три генотипа в rs1967309: АА, AG и GG. Из них генотип АА ассоциирован с улучшенным терапевтическим ответом у пациентов, получавших HDL-повышающий лекарственный препарат, генотип AG ассоциирован с частичным ответом, а генотип GG ассоциирован с отсутствием ответа. Для целей данного изобретения: пациенты, которые несут генотип АА, могут получить пользу от лечения HDL-повышающим лекарственным препаратом; пациенты, которые несут генотип AG, могут получить пользу от лечения HDL-повышающим лекарственным препаратом, а пациенты, которые несут генотип GG, не могут получить пользу от лечения HDL-повышающим лекарственным препаратом. Два генотипа в rs1967309, АА и AG, указывают на терапевтическую реакцию на ингибитор СЕТР, в частности, на далцетрапиб, у пациентов с сердечно-сосудистыми нарушениями. В частности, генотип АА в rs1967309 свидетельствует о лучшей терапевтической реакции на ингибитор СЕТР, в частности, на далцетрапиб, у пациентов с сердечно-сосудистыми нарушениями.

Данное изобретение относится к нуклеиновокислотным молекулам, содержащим полиморфизмы или варианты гена, к вариантным белкам, кодируемым этими нуклеиновокислотными молекулами, к реагентам для обнаружения полиморфных нуклеиновокислотных молекул и к способам применения нуклеиновокислотных молекул и белков, а также к способам применения реагентов для их обнаружения (например, праймеров и зондов для использования в способах генотипирования данного изобретения).

В одном воплощении данное изобретение предусматривает: способы обнаружения вариантов гена согласно изобретению и реагенты для обнаружения, такие как зонды или праймеры, для применения в этих способах.

Изобретение конкретно предусматривает генетические маркеры, ассоциированные с терапевтическим ответом на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности, на ингибитор/модулятор СЕТР, и синтетические нуклеиновокислотные молекулы (в том числе молекулы ДНК и РНК), содержащие варианты гена согласно изобретению. Данное изобретение также предусматривает вариантные белки, кодируемые нуклеиновокислотными молекулами, содержащими такие варианты гена, антитела к закодированным вариантным белкам, компьютерные системы хранения данных, содержащие новый вариант гена или информацию о SNP, способы обнаружения этих SNP в анализируемом образце, способы выявления индивидуумов, которые терапевтически отвечают на введение HDL-повышающего или HDL-имитирующего агента, в частности, ингибитора/модулятора СЕТР, на основе наличия или отсутствия одного или более чем одного варианта гена согласно изобретению или обнаружения одного или более чем одного закодированного вариантного продукта (например, вариантных транскриптов мРНК или вариантных белков), и способы лечения людей с сердечно-сосудистыми заболеваниями, которые несут один или более чем один вариант гена согласно изобретению.

Иллюстративные воплощения данного изобретения также предусматривают способы выбора или составления схемы лечения (например, способы определения того, следует ли вводить индивидууму HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности ингибитор/модулятор СЕТР).

Различные воплощения данного изобретения также предусматривают способы выбора индивидуумов, для которых введение HDL-повышающего или HDL-имитирующего агента (в частности, ингибитора/модулятора СЕТР) может быть терапевтически полезным, на основе генотипа индивидуума, и способы выбора индивидуумов для участия в клинических испытаниях HDL-повышающего или HDL-имитирующего агента (в частности, ингибитора/модулятора СЕТР) на основе генотипов индивидуумов (например, выбор для участия в испытаниях тех индивидуумов, которые наиболее вероятно ответят положительно, и/или исключение из испытания тех индивидуумов, которые вряд ли положительно ответят на лечение, на основании их генотипа(ов), в частности, их генотипа АА в rs1967309, или выбор тех индивидуумом, которые вряд ли ответят положительно, для участия в клиническом испытании альтернативного препарата, который может принести им пользу).

Нуклеиновокислотные молекулы согласно изобретению могут быть вставлены в экспрессионный вектор для получения вариантного белка в клетке-хозяине. Таким образом, данное изобретение также предусматривает вектор, содержащий SNP-содержащую нуклеиновокислотную молекулу согласно изобретению, генно-инженерные клетки-хозяева, содержащие этот вектор, и способы экспрессии рекомбинантного вариантного белка с использованием таких клеток-хозяев. В другом конкретном воплощении клетки-хозяева, SNP-содержащие нуклеиновокислотные молекулы и/или вариантные белки могут быть использованы в качестве мишеней для скрининга или идентификации терапевтических агентов, которые являются HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом (в частности, ингибитором/модулятором СЕТР).

Иллюстративными SNP в ADCY9, которые могут быть определены/оценены с помощью предусмотренного в данном документе способа выявления улучшенного ответа на далцетрапиб, являются те, в которых мутация приводит к изменению нуклеотидной последовательности в позиции 4062592 и 4065583 (сборка генома GRCh37.p5), также известные как однонуклеотидные полиморфизмы с идентификаторами rs12595857 и rs1967309, соответственно, показанные в SEQ №№1 и 2.

Данное изобретение основано на определении генетических полиморфизмов, которые прогнозируют повышенную вероятность того, что лечение HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом, в частности, ингибитором/модулятором СЕТР, будет полезным для пациентов с сердечнососудистыми нарушениями.

Фиг. 1: SNP rs1967309 и rs12595857 согласно изобретению тесно ассоциированы со снижением числа сердечно-сосудистых событий (первичный составной исход или непредвиденная коронарная реваскуляризация) у пациентов, получавших СЕТР-ингибитор далцетрапиб. Графические материалы показывают результаты полногеномного исследования (genome-wide association study, GWAS) с образцами из группы, получавшей лечение, в исследовании dal-OUTCOMES. На панели А показан манхеттенский график для логистической регрессии с сильным сигналом в области гена ADCY9 на хромосоме 16. Каждая точка представляет собой значение Р для сравнения участников, которые испытали сердечно-сосудистые события во время лечения, с теми, кто не испытал, с поправкой на пол и 5 главных компонент генетического происхождения. Панель В показывает значения Р для однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в области ADCY9. Существует тесная связь между сердечно-сосудистыми событиями во время лечения и SNP rs1967309 и соседним SNP rs12595857, который находится в неравновесном сцеплении с rs1967309. Ось X показывает позицию SNP на хромосоме 16 (Национальный центр биотехнологической информации, сборка GRCh37.p5). Левая ось Y показывает отрицательный log₁₀ значений Р для сравнения сердечно-сосудистых событий с отсутствием событий, как описано на панели А. Правая ось Y показывает скорость рекомбинации на хромосоме 16. Ромбы показывают степень неравновесного сцепления (linkage disequilibrium, LD) в образцах по оценкам референсных образцов CEU из НарМар.

Фиг. 2: Частота сердечно-сосудистых событий (первичный составной исход или непредвиденная коронарная реваскуляризация в dal-OUTCOMES) по окончании исследования в группах, получавших далцетрапиб и плацебо, отдельно и по генотипам rs1967309 в гене ADCY9. Проценты событий приведены с 95% ДИ.

Фиг. 3: Кумулятивная частота сердечно-сосудистых событий (первичный составной исход или непредвиденная коронарная реваскуляризация в dal-OUTCOMES) в группах, получавших далцетрапиб и плацебо, отдельно и со стратификацией по трем генотипам SNP rs1967309 в гене ADCY9 (GG, AG, АА).

Фиг. 4: Показаны изменения в уровнях липидов в соответствии с генотипом в течение 24 месяцев лечения. Панель А. Среднее значение ± SE (мг/дл) изменения уровней липидов от исходного уровня за 1 месяц по группам генотипов SNP rs1967309 в ADCY9 для группы, получавшей далцетрапиб. Значения Р приведены для одномерной статистики между изменением уровня липидов и генотипом. Панель В. Среднее значение ± 95% ДИ для абсолютных значений LDL-холестерина в течение последующего периода испытания dal-OUTCOMES для пациентов в группе, получавшей лечение. Значение Р приведено для многомерной смешанной регрессионной модели.

Фиг. 5: MDS-график, показывающий первые два измерения (С1, С2) для 76854 SNP у 6297 индивидуумов из генетического исследования dal-OUTCOMES и 83 CEU, 186 JPT-CHB и 88 YRI из базы "1000 геномов".

Фиг. 6: График кумулятивной дисперсии, объясняемой первыми десятью компонентами из анализа главных компонент, для 76854 SNP у 6297 индивидуумов из генетического исследования dal-OUTCOMES и 83 CEU, 186 JPT-СНВ и 88 YRI из базы "1000 геномов".

Фиг. 7: График квантиль-квантиль (QQ) наблюдаемых -log₁₀ Р-значений против ожидаемых при нуле для полногеномной ассоциации SNP с MAF≥0,05. Заштрихованная область представляет собой группу с концентрацией 95%, образованную путем расчета 2,5 и 97,5 процентилей распределения при нулевой гипотезе. Точки представляют ранжированные значения Р из логистической регрессии в PLINK для сравнения участников dal-OUTCOMES из группы, получавшей лечение, которые испытали сердечно-сосудистые события во время лечения, с теми, которые не испытали, с поправкой на пол и 5 главных компонент генетического происхождения.

Фиг. 8: Тепловая карта, показывающая неравновесное сцепление (r²) гена ADCY9 вокруг сильно ассоциированного SNP rs1967309. Блоки 6, 7, 8 и 9 показывают область, которая находится в сильном неравновесном сцеплении с rs1967309, охватывая позиции с chr16: 4049365 до chr16: 4077178 (сборка GRCh37/hg19) с SNP rs12935810 до SNP rs13337675.

В данном документе описаны различные детали и воплощения данного изобретения, тем не менее, специалистам в данной области будут очевидны другие детали изобретения, модификации и эквиваленты на основе предложенных учений. Описанное изобретение не ограничивается примерами и предусмотренными воплощениями, и специалисты в данной области смогут оценить различные альтернативы и эквиваленты. Используемые в данном документе понятия в единственном числе включают множественное число, если из контекста явно не следует иное. Например, понятие "клетка" также будет включать понятие "клетки".

Термин "аллель" определяется в данном документе как любая одна или более чем одна альтернативная форма данного гена. В диплоидной клетке или в организме члены аллельной пары (т.е. две аллели данного гена) занимают соответствующие позиции (локусы) на паре гомологичных хромосом, и если эти аллели генетически идентичны, то клетку или организм называют "гомозиготным", а если они генетически различны, то клетку или организм называют "гетерозиготным" по отношению к конкретному гену.

"Ген" представляет собой упорядоченную последовательность нуклеотидов, расположенных в определенном положении на определенной хромосоме, которая кодирует определенный функциональный продукт и может включать нетранслируемые и нетранскрибируемые последовательности в непосредственной близости от кодирующих областей. Такие некодирующие последовательности могут содержать регуляторные последовательности, необходимые для транскрипции и трансляции последовательности, или интроны и т.п., или могут еще иметь любую функцию, свойственную им из-за возникновения SNP, представляющего интерес.

Понятие "генотипирование" относится к определению генетической информации, которую несет индивидуум в одной или более чем одной позиции в геноме. Например, генотипирование может содержать определение того, какую аллель или аллели индивидуум несет на одном SNP, или определение того, какую аллель или аллели индивидуум несет на множестве SNP. Например, в rs1967309 нуклеотиды могут представлять собой А у некоторых лиц и G у других лиц. Те лица, которые несут А в данной позиции, имеют аллель А, а те, кто несет G, имеют аллель G. В диплоидном организме индивидуум будет иметь две копии последовательности, содержащей полиморфную позицию, так что индивидуум может иметь аллель А и аллель G или, альтернативно, две копии аллели А или две копии аллели G. Те индивидуумы, которые имеют две копии аллели G, являются гомозиготными по аллели G, те индивидуумы, которые имеют две копии аллели А, являются гомозиготных по аллели А, а те индивидуумы, которые имеют одну копию каждой аллели, являются гетерозиготными. Часто аллель, которую называют аллелью А, является основной аллелью, а аллель В часто является минорной аллелью. Генотипы могут быть АА (гомозиготный по А), ВВ (гомозиготный по В) или АВ (гетерозиготный). Способы генотипирования, как правило, обеспечивают идентификацию образцов как АА, ВВ или АВ.

Термин "содержащий" означает, что композиции и способы включают перечисленные элементы, но не исключают другие.

Понятие "HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент" относится к соединениям, которые повышают уровень HDL одним из следующих механизмов: ингибирование/модуляция СЕТР, PPAR-агонизм, LXR-агонизм, НМ74-агонизм (ниациновый рецептор), агонизм к рецептору тиреотропного гормона, к ингибиторам липаз и индукторам HDL-катаболизма АроА1, к соединениям, которые обеспечивают по меньшей мере одну из атеропротективных активностей HDL, например, соединениям, которые повышают клеточный отток (эффлюкс) липидов (холестерина и/или фосфолипидов), обладают антиоксидантным и противовоспалительным действием. В частности, HDL-имитирующими агентами являются АроА1 и производные АроА1 (такие как АроА1 Milano, АроА1 Paris) и другие аналоги, воссоздающие HDL-содержащий АроА1 и/или ApoAII и соответствующие липиды, такие как фосфолипиды. АроЕ, производные, аналоги и пептидомиметики амфипатических липопротеинов. Примерами "HDL-повышающих или HDL-имитирующих агентов" являются ниацин, фибраты, глитазон, далцетрапиб, анацетрапиб, эвацетрапиб, DEZ-001 (ранее известный как ТА-8995) (Mitsubishi Tanabe Pharma), АТН-03 (Affris), DRL-17822 (Dr. Reddy's), DLBS-1449 (Dexa Medica), RVX-208 (Resverlogix), CSL-112 (CIs Behring), CER-001 (Cerenis), ApoA1 Milano (Medicine Company). Конкретными примерами "HDL-повышающих или HDL-имитирующих агентов" являются ниацин, фибраты, глитазон, далцетрапиб, анацетрапиб, эвацетрапиб, торцетрапиб, предпочтительно ниацин, фибраты, глитазон, далцетрапиб, анацетрапиб и эвацетрапиб. Более конкретно, HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент выбран среди ингибиторов/модуляторов СЕТР. Примеры ингибиторов/модуляторов СЕТР включают далцетрапиб, анацетрапиб, эвацетрапиб, DEZ-001 (ранее известный как ТА-8995) (Mitsubishi Tanabe Pharma), АТН-03 (Affris), DRL-17822 (Dr. Reddy's), DLBS-1449 (Dexa Medica). Более конкретными примерами ингибиторов/модуляторов СЕТР являются далцетрапиб, анацетрапиб, эвацетрапиб и торцетрапиб, предпочтительно далцетрапиб, анацетрапиб и эвацетрапиб. Наиболее конкретно, HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент в соответствии с изобретением будет относиться к ингибиторам/модуляторам СЕТР, особенно когда ингибитор/модулятор СЕТР представляет собой далцетрапиб.

Понятие "ингибитор/модулятор СЕТР" относится к соединению, которое снижает активность СЕТР (оцененную в стандартных анализах переноса) путем ингибирования СЕТР и/или индукции конформационных изменений полипептида СЕТР при связывании с полипептидом СЕТР. Конформационные изменения полипептида СЕТР обеспечивают продолжение активности СЕТР в отношении HDL-частиц и повышение их рециркуляции/оборота с повышением формирования возникающих пре-бета-HDL. Предпочтительно, термин "ингибитор/модулятор СЕТР" относится ко всем соединениям, которые связываются с цистеином 13 полипептида СЕТР. Более предпочтительно, "ингибитор/модулятор СЕТР" выбран среди S-[2-[1-(2-этилбутил)циклогексилкарбониламино]фенил]-2-метилтиопропионата, 1-(2-этилбутил)циклогексанкарбоновой кислоты (2-меркапто-фенил)амида и/или бис[2-[1-(2-этилбутилциклогексилкарбониламино]фенил]дисульфида. Наиболее предпочтительно, "ингибитор/модулятор СЕТР" представляет собой S-[2-[1-(2-этилбутил)циклогексилкарбониламино]фенил]-2-метилтиопропионат в качестве пролекарства или 1-(2-этилбутил)циклогексанкарбоновой кислоты (2-меркапто-фенил)амид в качестве его активного метаболита.

Понятие "анацетрапиб" относится к ((4S,5R)-5-[3,5-бис(трифторметил)фенил]-3-{[4'-фтор-2'-метокси-5'-(пропан-2-ил)-4-(трифторметил)[1,1'-бифенил]-2-ил]метил}-4-метил-1,3-оксазолидин-2-ону), также известному как МК 0859, CAS 875446-37-0 или соединение формулы (Х_А).

Анацетрапиб, а также способы получения и применения соединения описаны в WO 2006/014413, WO 2006/014357, WO 2007005572.

Понятие "эвацетрапиб" относится к транс-4-({(5S)-5-[{[3,5-бис(трифторметил)фенил]метил}(2-метил-2Н-тетразол-5-ил)амино]-7,9-диметил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-бензазепин-1-ил}метил)циклогексанкарбоновой кислоте, также известной как LY 2484595, CAS 1186486-62-3 или соединение формулы (X_B).

Эвацетрапиб, а также способы получения и применения соединения описаны в WO 2011002696.

Понятие "торцетрапиб" относится к (2R,4S)-4-[(3,5-бистрифторметилбензил)метоксикарбониламино]-2-этил-6-трифторметил-3,4-дигидро-2Н-хинолин-1-карбоновой кислоты этиловому эфиру, также известному как СР-529,414, CAS 262352-17-0 или соединение формулы (X_C).

Торцетрапиб, а также способы получения и применения соединения описаны в WO 0017164 или WO 0140190.

Понятие "BAY 60-5521" относится к (5S)-5-хинолинол-4-циклогексил-2-циклопентил-3-[(S)-фтор[4-(трифторметил)фенил]метил]-5,6,7,8-тетрагидро-7,7-диметилу, также известному как CAS 893409-49-9 или соединение формулы (X_D).

BAY 60-5521, а также способы получения и применения соединения описаны в WO 2006063828.

Понятие "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже имеет нарушение, а также тех, у кого нарушение нужно предотвратить или задержать.

Термины "полиморфизм", "сайт полиморфизма", "полиморфный сайт", "сайт однонуклеотидного полиморфизма" (сайт SNP) или "однонуклеотидный полиморфизм" относятся к расположению в последовательности гена, который изменяется в пределах популяции. Полиморфизм является возникновением двух или более форм гена или позиции в пределах "аллели" гена в популяции в таких частотах, что присутствие редких форм не может быть объяснено только мутацией. Предпочтительные полиморфные сайты имеют по меньшей мере две аллели. Подразумевается, что полиморфные аллели придают хозяину некоторую изменчивость фенотипа. Полиморфизм может возникать как в кодирующих областях, так и в некодирующих областях генов. Полиморфизм может возникать на месте отдельных нуклеотидов или может включать вставку или делецию. Расположение такого полиморфизма можно идентифицировать по позиции его нуклеотида в гене, на хромосоме или на транскрипторе по аминокислотам, которые изменены из-за нуклеотидного полиморфизма. Отдельным полиморфизмам также присвоены уникальные идентификаторы ("референсный SNP", "refSNP" или "rs №"), известные специалистам в данной области и используемые, например, в базе данных однонуклеотидных полиморфизмов (Single Nucleotide Polymorphism Database, dbSNP) вариаций нуклеотидной последовательности, доступной на сайте NCBI.

Термины "неравновесное сцепление" или "в неравновесном сцеплении" или "LD" относятся к неслучайной ассоциации аллелей у группы лиц, другими словами это предпочтительное расхождение конкретной полиморфной формы с другой полиморфной формой в другой хромосомной позиции, которое происходит чаще, чем ожидалось бы при случайном распределении. В обратном случае про аллели, которые оказываются вместе с ожидаемыми частотами, говорят, что они находятся в "равновесном сцеплении".

Приставка "rs" относится к SNP, найденному в базе данных NCB1 SNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term. Номера "rs" являются формой ID rsSNP в NCBI.

Термин "образец" включает любой биологический образец, взятый у пациента или индивидуума, включая клетки, образец ткани или биологическую жидкость. Например, образец может включать образец кожи, образец клеток щеки, слюну или клетки крови. Образец может включать, но не ограничиваясь ими, отдельную клетку, множество клеток, фрагменты клеток, аликвоту биологической жидкости, цельную кровь, тромбоциты, сыворотку, плазму, эритроциты, лейкоциты, эндотелиальные клетки, биоптаты ткани, синовиальную жидкость и лимфатическую жидкость. В частности, понятие "образец" относится к клеткам крови.

Термин "терапевтические агенты" относится к агентам, способным к лечению или профилактике сердечно-сосудистого нарушения. Используемый в данном документе агент, "способный к лечению или профилактике сердечнососудистого нарушения", относится к молекуле, которая способна к лечению и/или профилактике сердечно-сосудистого нарушения у людей и/или на клеточной или животной модели указанного сердечно-сосудистого нарушения.

Понятия "полиморфизм улучшенного ответа", "генотип улучшенного ответа" или "отвечающий генотип", используемые в данном документе, относятся к аллельному варианту или генотипу в одном или более чем одном из полиморфных сайтов в гене ADCY9, описанных в данном документе (например, rs1967309/АА), который предсказывает, что субъект будет терапевтически реагировать и получать пользу от лечения HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом (что может быть измерено в уменьшении числа сердечнососудистых событий) по сравнению с аллельным вариантом или генотипом или полиморфизмом (например, rs1967309/AG или rs1967309/GG), который предсказывает, что субъект будет в меньшей степени реагировать на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент."Сниженный ответ", "частичный ответ", "отсутствие ответа" или "отсутствие терапевтической эффективности" может быть измерено через относительное увеличение числа сердечнососудистых событий по сравнению с субъектами, имеющими "генотип улучшенного ответа". Альтернативно, "улучшенный ответ" или "терапевтическая эффективность" могут быть измерены с помощью относительного уменьшения числа сердечно-сосудистых событий по сравнению с субъектами, которые несут полиморфизмы, связанные с "отсутствием ответа" или "частичным ответом" на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент. В частности, rs12595857/GG, rs1967309/АА, rs111590482/AG, rs111590482/GG, rs11647828/GG, rs12935810/GG, rs17136707/GG, rs2239310/GG, rs2283497/AA, rs2531967/AA, rs3730119/AA, rs4786454/AA, rs74702385/GA, rs74702385/AA, rs8049452/GG, rs8061182/AA являются генотипами улучшенного ответа. Более конкретно, rs1967309/АА является генотипом улучшенного ответа.

Понятие "сердечно-сосудистые события", используемое в данном документе, относится к сердечно-сосудистой смерти, нефатальному инфаркту миокарда (myocardial infarction, MI), нефатальному инсульту ишемического происхождения, госпитализации по поводу нестабильной стенокардии и коронарной реваскуляризации.

"Олигонуклеотиды", используемые в данном документе, являются нуклеиновыми кислотами или полинуклеотидами различной длины. Такие олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве зондов, праймеров и в производстве микрочипов (массивов) для обнаружения и/или амплификации специфических нуклеиновых кислот. Такие ДНК- или РНК-нити могут быть синтезированы последовательным добавлением (в направлении 5-3' или 3'-5') активированных мономеров к растущей цепи, которая может быть связана с нерастворимым субстратом. В данной области известны многочисленные способы синтеза олигонуклеотидов для последующего использования отдельно или в качестве части нерастворимого субстрата, например в массивах (BERNFIELD MR. and ROTTMAN FM. J. Biol. Chem. (1967) 242(18): 4134-43; SULSTON J. et al. PNAS (1968) 60(2): 409-415; GILLAM S. et al. NucleicAcidRes. (1975) 2(5): 613-624; BONORA GM. et al. NucleicAcidRes. (1990) 18(11): 3155-9; LASHKARI DA. et al. PNAS (1995) 92(17): 7912-5; MCGALL G. et al. PNAS (1996) 93(24): 13555-60; ALBERT TJ. et al. Nucleic Acid Res. (2003) 31(7): e35; GAO X. et al. Biopolymers (2004) 73(5): 579-96; и MOORCROFT MJ. et al. Nucleic Acid Res. (2005) 33(8): e75). Как правило, олигонуклеотиды синтезируют путем ступенчатого добавления активированных и защищенных мономеров в различных условиях в зависимости от используемого способа. Впоследствии специфические защитные группы могут быть удалены, чтобы позволить дальнейшее удлинение, а затем, когда синтез завершен, все защитные группы могут быть удалены, и олигонуклеотиды удаляются с их твердых субстратов для очистки полных цепей, если это необходимо.

Термин "генотип" относится к генетической конституции организма, как правило, в отношении одного гена или нескольких генов или области гена, имеющей отношение к конкретному контексту (т.е. генетических локусов, ответственных за конкретный фенотип). В частности, конкретное сочетание аллелей в данной позиции в гене, например, генотипы АА, AG или GG, которые являются возможными генотипами SNP rs1967309.

"Фенотип" определяется как наблюдаемые признаки организма. Таблица 1 показывает корреляцию генотипа SNP в ADCY9 со значениями, указывающими на восприимчивость к лечению сердечно-сосудистых заболеваний HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом.

Термин "биологический маркер", используемый в данном документе, относится к последовательности, характерной для конкретной вариантной аллели (полиморфного сайта, такого как SNP) или аллели дикого типа. Биомаркер также относится к пептиду или эпитопу, кодируемому конкретной вариантной аллелью или аллелью дикого типа.

Термин "суррогатный маркер", используемый в данном документе, относится к генетическому варианту, включая SNP, который присутствует в неравновесном сцеплении с генотипом улучшенного ответа согласно изобретению, в частности, к rs1967309 АА.

Термин "генетический маркер", используемый в данном документе, относится к вариантам полиморфных сайтов конкретного гена, которые ассоциированы с ответом на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности, на ингибитор/модулятор СЕТР. В частности, "генетический маркер", используемый в данном документе, относится к вариантам полиморфных сайтов в гене ADCY9, которые связаны с ответом на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности, на ингибитор/модулятор СЕТР.

В некоторых способах, описанных в данном документе, один или более чем один биомаркер используется для выявления или выбора индивидуумов, которые получать пользу от лечения HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом, в частности, ингибитором/модулятором СЕТР. Биомаркер SNP для применения в данном изобретении может предсказывать либо терапевтический ответ (response, R) на лечение, либо отсутствие ответа на лечение (non-response, NR). Таблица 2 показывает генотипы, наблюдаемые в когорте dal-OUTCOMES, присутствующие в полиморфном сайте rs1967309, которые могут быть использованы в качестве биомаркеров для предсказания ответа на далцетрапиб или HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности, на другой ингибитор/модулятор СЕТР. Каждый генотип, показанный в таблице 2 или 3, один или в комбинации с другими генотипами на других полиморфных сайтах, может быть использован в качестве биомаркера для предсказания ответа на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности, на ингибитор/модулятор СЕТР.

rs1967309 и rs12595857 расположены в интронной (некодирующей) области гена ADCY9 в области, которая конкордантна по наличию регуляторной активности на экспрессию гена ADCY9.

В некоторых способах, описанных в данном документе, лиц, которые будут терапевтически реагировать на лечение HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом, в частности, на ингибитор/модулятор СЕТР, определяют и выбирают для лечения с помощью способов генотипирования согласно данному изобретению. В частности для лечения способами согласно данному изобретению выбирают пациентов, которые несут один или более чем один из следующих генотипов улучшенного ответа: rs12595857/GG, rs1967309/АА, rs111590482/AG, rs111590482/GG, rs11647828/GG, rs12935810/GG, rs17136707/GG, rs2239310/GG, rs2283497/AA, rs2531967/AA, rs3730119/AA, rs4786454/AA, rs74702385/GA, rs74702385/AA, rs8049452/GG, rs8061182/AA. Более конкретно, для лечения способами согласно данному изобретению выбирают пациентов, которые несут генотипы rs12595857/GG или rs1967309/АА. Более конкретно, для лечения способами согласно данному изобретению выбирают пациентов, которые несут генотип rs1967309/АА.

В другом воплощении данное изобретение предусматривает способ выявления субъекта, который получит пользу от лечения HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом, где указанный способ включающий определение генотипа указанного субъекта (например, генотипирования) в одном или более чем одном полиморфном сайте в гене ADCY9.

В другом воплощении данное изобретение предусматривает способ определения восприимчивости индивидуума на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности, на ингибитор СЕТР, где указанный способ включает определение генотипа указанного субъекта (например, генотипирование) в одном или более из rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119, rs13337675, rs12920508, rs12599911, rs2531971 или rs2238448, с помощью одного или более чем одного праймера или зонда из описанных в данном документе.

В другом воплощении данное изобретение предусматривает способ определения восприимчивости индивидуума на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности, на ингибитор СЕТР, где указанный способ включает определение генотипа указанного субъекта (например, генотипирование) в одном или более из rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967 или rs3730119, rs13337675, с помощью одного или более чем одного праймера или зонда из описанных в данном документе.

В конкретном воплощении изобретение предусматривает описанный способ, где полиморфные сайты включают один или более чем один из следующих сайтов, выбранных из группы, состоящей из: rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119, rs13337675, rs12920508, rs12599911, rs2531971 или rs2238448, более конкретно, где полиморфный сайт выбран из группы, состоящей из rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119 и rs13337675, более конкретно, где полиморфный сайт представляет собой rs1967309 или rs12595857, более конкретно, где полиморфный сайт представляет собой rs1967309, более конкретно, где соответствующий генотип содержит АА.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает способы генотипирования одного или более чем одного полиморфного сайта, выбранного из группы, состоящей из: rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119, rs13337675, rs12920508, rs12599911, rs2531971 или rs2238448, в частности, где полиморфный сайт выбран из группы, состоящей из rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119 и rs13337675, более конкретно, где полиморфный сайт представляет собой rs1967309 или rs12595857, более конкретно, где полиморфный сайт представляет собой rs1967309.

В конкретном воплощении изобретение предусматривает способ, где субъект, несущий один или более чем один из rs12595857/GG, rs1967309/АА, rs111590482/AG, rs111590482/GG, rs11647828/GG, rs12935810/GG, rs17136707/GG, rs2239310/GG, rs2283497/AA, rs2531967/AA, rs3730119/AA, rs4786454/AA, rs74702385/GA, rs74702385/AA, rs8049452/GG, rs8061182/AA, получает пользу от лечения HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом, в частности, где HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент представляет собой ингибитор/модулятор СЕТР, и, более конкретно, где HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент представляет собой S-(2-{[1-(2-этилбутил)-циклогексанкарбонил]амино}фенил)эфир. В конкретном воплощении изобретение предусматривает способ, в котором HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент вводят указанному субъекту.

В конкретном воплощении изобретение предусматривает способ, где субъекта, несущего один или более чем один из rs12595857/GG, rs1967309/AA,rs111590482/AG, rs111590482/GG, rs11647828/GG, rs12935810/GG, rs17136707/GG, rs2239310/GG, rs2283497/AA, rs2531967/AA, rs3730119/AA, rs4786454/AA, rs74702385/GA, rs74702385/AA, rs8049452/GG, rs8061182/AA, лечат HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом, в частности, где HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент представляет собой ингибитор/модулятор СЕТР, а более конкретно, где HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент представляет собой S-(2-{[1-(2-этилбутил)циклогексанкарбонил]амино}фенил)эфир.

В конкретных воплощениях данное изобретение предусматривает способ, в котором субъект имеет сердечно-сосудистое нарушение, в частности, где сердечно-сосудистое нарушение выбрано из группы, состоящей из атеросклероза, болезни периферических сосудов, дислипидемии, гипербеталипопротеинемии, гипоальфалипопротеинемии, гиперхолестеринемии, гипертриглицеридемии, семейной гиперхолестеринемии, стенокардии, ишемии, ишемии сердца, инсульта, инфаркта миокарда, реперфузионного повреждения, рестеноза после ангиопластики, гипертензии и сосудистых осложнений сахарного диабета, ожирения или эндотоксемии у млекопитающего, более конкретно, где сердечно-сосудистое нарушение выбрано из группы, состоящей из сердечнососудистого заболевания, ишемической болезни сердца, заболевания коронарных сосудов, гипоальфалипопротеинемии, гипербеталипопротеинемии, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, атеросклероза, гипертензии, гипертриглицеридемии, гиперлипопротеинемии, болезни периферических сосудов, стенокардии, ишемии и инфаркта миокарда.

В другом воплощении данное изобретение относится к способу лечения сердечно-сосудистого нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, где указанный способ включает:

(a) выбор субъекта, имеющего генотип улучшенного ответа в одном или более чем одном из следующих сайтов: rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119, rs13337675, rs12920508, rs12599911, rs2531971 или rs2238448;

(b) введение указанному субъекту HDL-повышающего или HDL-имитирующего агента, в частности, ингибитора/модулятора СЕТР.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает способ лечения сердечно-сосудистого нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, где указанный способ включает:

(a) выбор субъекта, имеющего генотип улучшенного ответа в rs1967309, в частности, где субъект имеет генотип АА в rs1967309;

В другом воплощении данное изобретение предусматривает способ лечения сердечно-сосудистого нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, где указанный способ включает:

(a) генотипирование субъекта в одном или более чем одном из следующих сайтов: rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119, rs13337675, rs12920508, rs12599911, rs2531971 или rs2238448;

(c) генотипирование субъекта в одном или более чем одном из следующих сайтов: rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119, rs13337675;

(d) введение указанному субъекту HDL-повышающего или HDL-имитирующего агента, в частности, ингибитора/модулятора СЕТР.

Данное изобретение также предусматривает способ лечения пациента, включающий:

a. анализ образца от пациента на наличие одного или более чем одного генетического маркера, выбранного из группы, состоящей из rs12595857/GG, rs1967309/АА, rs111590482/AG, rs111590482/GG, rs11647828/GG, rs12935810/GG, rs17136707/GG, rs2239310/GG, rs2283497/AA, rs2531967/AA, rs3730119/AA;, rs4786454/AA, rs74702385/GA, rs74702385/AA, rs8049452/GG и rs8061182/AA, и

b. лечение пациентов, которые несут один или более чем один из указанных генетических маркеров, HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом, в частности, ингибитором/модулятором СЕТР.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает способ, в котором генотип определяется в одном или более чем одном сайте, выбранном среди: rs1967309, rs12595857.

В частности, способ определения индивидуумов, восприимчивых к HDL-повышающему лекарственному препарату, включает:

a. получение от индивидуума образца, содержащего генетический материал;

b. контактирование образца с реагентом с получением комплекса между реагентом и генетическим маркером, выбранным из таблицы 7;

c. определение комплекса для получения набора данных, связанных с образцом; и

d. анализ набора данных для определения наличия или отсутствия генетического маркера.

Комплекс между реагентом и генетическим маркером, образующийся в предусмотренных способах генотипирования, может быть получен либо путем полимеразной цепной реакции (ПЦР), либо путем секвенирования ДНК.

Изобретение предусматривает реагенты для генотипирования генетического маркера, выбранного из группы, состоящей из rs12595857/GG; rs1967309/AA; rs111590482/AG; rs111590482/GG; rs11647828/GG; rs12935810/GG; rs17136707/GG; rs2239310/GG; rs2283497/AA; rs2531967/AA; rs3730119/AA; rs4786454/AA; rs74702385/GA; rs74702385/AA; rs8049452/GG; rs8061182/AA; rs1967309/GA, rs12595857/AG, rs13337675/AG, rs13337675/GG, rs17136707/AG, rs2239310/AG, rs2283497/CA, rs2531967/GA, rs3730119/GA, rs4786454/GA, rs8049452/GA, rs8061182/AG, rs12595857/GG, rs1967309/AA, rs111590482/AG, rs111590482/GG, rs11647828/GG, rs12935810/GG, rs17136707/GG, rs2239310/GG, rs2283497/AA, rs2531967/AA, rs3730119/AA, rs4786454/AA, rs74702385/GA, rs74702385/AA, rs8049452/GG, rs8061182/AA, rs12935810/GA, rs12935810/AA, rs11647828/AA, rs2531967/GG, rs3730119/GG, rs2239310/AA, rs12595857/AA, rs111590482/AA, rs74702385/GG, rs1967309/GG, rs2283497/CC, rs8061182/GG, rs17136707/AA, rs8049452/AA, rs4786454/GG, rs13337675/AA и rs11647828/AG, в частности, праймер или зонд.

В конкретном воплощении праймер содержит нить ДНК, которая имеет от 15 до 30 нуклеотидов в длину и гибридизуется в условиях высокой жесткости с областью хромосомы 16, смежной с rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119, rs13337675, rs12920508, rs12599911, rs2531971 или rs2238448.

В другом воплощении реагент представляет собой праймер, содержащий нить ДНК, которая имеет от 15 до 30 нуклеотидов в длину и гибридизуется в условиях высокой жесткости с областью хромосомы 16, перекрывающейся с rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119, rs13337675, rs12920508, rs12599911, rs2531971 или rs2238448.

В другом воплощении зонд содержит от 15 до 30 нуклеотидов в длину и гибридизуется в условиях высокой жесткости с областью хромосомы 16, перекрывающейся с rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119, rs13337675, rs12920508, rs12599911, rs2531971 или rs2238448.

В другом воплощении зонд содержит от 15 до 30 нуклеотидов в длину и гибридизуется в условиях высокой жесткости с олигонуклеотидом, выбранным среди SEQ ID №№1-15.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает способ, в котором HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент представляет собой ингибитор/модулятор СЕТР, в частности, в котором HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент представляет собой S-(2-{[1-(2-этилбутил)циклогексанкарбонил]амино}фенил)эфир.

В еще одном воплощении данное изобретение предусматривает применение HDL-повышающего или HDL-имитирующего агента, в частности, ингибитора/модулятора СЕТР, в изготовлении лекарственного средства для лечения сердечно-сосудистого нарушения, где получающие лечение субъекты имеют генотип улучшенного ответа в одном или более чем одном из следующих сайтов: rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119 или rs13337675.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает применение, описанное в данном документе, где получающий лечение субъект имеет генотип улучшенного ответа в rs1967309.

В другом воплощении данное изобретение предусматривает HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности, ингибитор/модулятор СЕТР, для применения в лечения сердечно-сосудистого нарушения, где получающие лечение субъекты несут один или более чем один генетический маркер, выбранный среди: rs12595857/GG; rs1967309/AA; rs111590482/AG; rs111590482/GG; rs11647828/GG; rs12935810/GG; rs17136707/GG; rs2239310/GG; rs2283497/AA; rs2531967/AA; rs3730119/AA; rs4786454/AA; rs74702385/GA; rs74702385/AA; rs8049452/GG; rs8061182/AA; rs1967309/GA, rs12595857/AG, rs13337675/AG, rs13337675/GG, rs17136707/AG, rs2239310/AG, rs2283497/CA, rs2531967/GA, rs3730119/GA, rs4786454/GA, rs8049452/GA, rs8061182/AG, rs12595857/GG, rs1967309/AA, rs111590482/AG, rs111590482/GG, rs11647828/GG, rs12935810/GG, rs17136707/GG, rs2239310/GG, rs2283497/AA, rs2531967/AA, rs3730119/AA, rs4786454/AA, rs74702385/GA, rs74702385/AA, rs8049452/GG, rs8061182/AA, rs12935810/GA, rs12935810/AA, rs11647828/AA, rs2531967/GG, rs3730119/GG, rs2239310/AA, rs12595857/AA, rs111590482/AA, rs74702385/GG, rs1967309/GG, rs2283497/CC, rs8061182/GG, rs17136707/AA, rs8049452/AA, rs4786454/GG, rs13337675/AA и rs11647828/AG.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности, ингибитор/модулятор СЕТР, для применения в лечения сердечно-сосудистого нарушения, где получающий лечение субъект несет генотип улучшенного ответа rs1967309. В конкретном воплощении изобретение предусматривает HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, описанный в данном документе, где генотип представляет собой АА.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, описанный в данном документе, где сердечно-сосудистое нарушение выбрано из группы, состоящей из атеросклероза, болезни периферических сосудов, дислипидемии, гипербеталипопротеинемии, гипоальфалипопротеинемии, гиперхолестеринемии, гипертриглицеридемии, семейной гиперхолестеринемии, стенокардии, ишемии, ишемии сердца, инсульта, инфаркта миокарда, реперфузионного повреждения, рестеноза после ангиопластики, гипертензии и сосудистых осложнений сахарного диабета, ожирения или эндотоксемии у млекопитающего.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, описанный в данном документе, где сердечно-сосудистое нарушение выбрано из группы, состоящей из сердечнососудистого заболевания, ишемической болезни сердца, болезни коронарных артерий, гипоальфалипопротеинемии, гипербеталипопротеинемии, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, атеросклероза, гипертензии, гипертриглицеридемии, гиперлипопротеинемии, заболеваний периферических сосудов, стенокардии, ишемии и инфаркта миокарда.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, описанный в данном документе, где HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент представляет собой HDL-повышающий агент, в частности, ингибитор/модулятор СЕТР, в частности, S-(2-{[1-(2-этилбутил)циклогексанкарбонил]амино}фенил)эфир.

В другом воплощении данное изобретение предусматривает S-(2-{[1-(2-этилбутил)циклогексанкарбонил]амино}фенил)эфир для лечения пациента с сердечно-сосудистым нарушением, который несет генотип улучшенного ответа, в частности, где генотип представляет собой rs12595857/GG, rs1967309/АА, rs111590482/AG, rs111590482/GG, rs11647828/GG, rs12935810/GG, rs17136707/GG, rs2239310/GG, rs2283497/AA, rs2531967/AA, rs3730119/AA, rs4786454/AA, rs74702385/GA, rs74702385/AA, rs8049452/GG или rs8061182/AA, более конкретно, где генотип представляет собой rs1967309/АА.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает S-(2-{[1-(2-этилбутил)циклогексанкарбонил]амино}фенил)эфир для лечения пациента с сердечно-сосудистым нарушением, который несет генотип улучшенного ответа, где сердечно-сосудистое нарушение выбрано из группы, состоящей из атеросклероза, болезни периферических сосудов, дислипидемии, гипербеталипопротеинемии, гипоальфалипопротеинемии, гиперхолестеринемии, гипертриглицеридемии, наследственной гиперхолестеринемии, стенокардии, ишемии, ишемии сердца, инсульта, инфаркта миокарда, реперфузионного повреждения, рестеноза после ангиопластики, гипертензии и сосудистых осложнений сахарного диабета, ожирения или эндотоксемии у млекопитающих.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает S-(2-{[1-(2-этилбутил)циклогексанкарбонил]амино}фенил)эфир для лечения пациента с сердечно-сосудистым нарушением, который несет генотип улучшенного ответа, где сердечно-сосудистое нарушение выбрано из группы, состоящей из сердечнососудистого заболевания, ишемической болезни сердца, болезни коронарных сосудов, гипоальфалипопротеинемии, гипербеталипопротеинемии, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, атеросклероза, гипертензии, гипертриглицеридемии, гиперлипопротеинемии, заболеваний периферических сосудов, стенокардии, ишемии и инфаркта миокарда.

В другом воплощении данное изобретение предусматривает способ прогнозирования того, имеет ли пациент с сердечно-сосудистым нарушением повышенную вероятность получить пользу от лечения HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом, в частности, ингибитором/модулятором СЕТР, где указанный способ включает скрининг образца, полученного от указанного пациента, на генетический маркер в гене аденилатциклазы типа 9 (ADCY9), выбранный среди rs12595857/GG, rs1967309/АА, rs111590482/AG, rs111590482/GG, rs11647828/GG, rs12935810/GG, rs17136707/GG, rs2239310/GG, rs2283497/AA, rs2531967/AA, rs3730119/AA, rs4786454/AA, rs74702385/GA, rs74702385/AA, rs8049452/GG, rs8061182/AA, где пациент имеет повышенную вероятность получить пользу от лечения HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом. В конкретном воплощении генетический маркер для скрининга выбран среди rs12595857/GG; rs1967309/АА. Более конкретно, генетический маркер для скрининга представляет собой rs1967309/АА.

В другом воплощении данное изобретение относится к способу выбора пациента с сердечно-сосудистым нарушением, который более вероятно ответит на терапию, включающую HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, при этом способ включает:

(a) обнаружение генотипа АА в rs1967309 в образце от пациента,

(b) выбор пациента, который более вероятно ответит на терапию, включающую HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, если в образце от пациента обнаруживается rs1967309 с генотипом АА.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает способ, описанный в данном документе, где наличие генотипа АА в rs1967309 в референсном образце указывает на то, что пациент более вероятно ответит на терапию HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает способ, описанный в данном документе, который также включает с) выбор терапии, включающей HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает способ, описанный в данном документе, где обнаружение rs1967309 проводят в образце от пациента путем контактирования образца с реагентом, который связывается с rs1967309, тем самым формируют комплекс между реагентом и rs1967309, обнаруживают образованный комплекс и, тем самым, обнаруживают rs1967309.

В другом воплощении данное изобретение предусматривает способ определения прогноза клинического ответа у человека на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, где определяется присутствие в гене ADCY9 этого пациента по меньшей мере одного полиморфизма, который связан с отложенным, частично субоптимальным или отсутствующим клиническим ответом на указанный HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, где определяется по меньшей мере один первый полиморфизм rs 1967309.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает описанный в данном документе способ, в котором полиморфизм определяется путем генотипирования.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает описанный в данном документе способ, в котором генотипирующий анализ включает анализ с микрочипами или масс-спектрометрический анализ или применение специфических к полиморфизму праймеров и/или зондов, в частности, праймеров для реакции удлинения.

В конкретном воплощении данное изобретение предусматривает описанный в данном документе способ, в котором HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент представляет собой HDL-повышающий агент, в частности, ингибитор/модулятор СЕТР, в частности, S-(2-{[1-(2-этилбутил)циклогексанкарбонил]амино}фенил)эфир.

В конкретном воплощении "ингибитор/модулятор СЕТР" представляет собой тиоизомасляной кислоты S-(2-{[1-(2-этилбутил)-циклогексанкарбонил]амино}фенил)эфир, также известный как S-[2-([[1-(2-этилбутил)циклогексил]карбонил]амино)фенил]-2-метилпропантиоат, далцетрапиб или соединение формулы I.

Было показано, что S-[2-([[1-(2-этилбутил)циклогексил]карбонил]амино)фенил]-2-метилпропантиоат является ингибитором активности СЕТР у людей (de Grooth et al., Circulation, 105, 2159-2165 (2002)) и кроликов (Shinkai et al., J. Med. Chem., 43, 3566-3572 (2000); Kobayashi et al., Atherosclerosis, 162, 131-135 (2002); и Okamoto et al., Nature, 406 (13), 203-207 (2000)). Было показано, что S-[2-([[1-(2-этилбутил)циклогексил]карбонил]амино)фенил]-2-метилпропантиоат повышает плазменный уровень HDL-холестерина у людей (de Grooth et al., см. выше) и у кроликов (Shinkai et al., см. выше; Kobayashi et al., см. выше; Okamoto et al., см. выше). Кроме того, было показано, что S-[2-([[1-(2-этилбутил)циклогексил]карбонил]амино)фенил]-2-метилпропантиоат снижает уровень LDL-холестерина у людей (de Grooth et al., см. выше) и кроликов (Okamoto et al., см. выше). S-[2-([[1-(2-этилбутил)циклогексил]карбонил]амино)фенил]-2-метилпропантиоат, а также способы получения и применения этого соединения описаны в ЕР 1020439, Shinkai et al., J. Med. Chem. 43: 3566-3572 (2000) или в WO 2007/051714, WO 2008/074677 или WO 2011/000793.

В предпочтительном воплощении ингибитор/модулятор СЕТР (например, соединение формулы I) является твердым веществом в кристаллической или аморфной форме, более предпочтительно в кристаллической форме. В конкретном воплощении S-[2-([[1-(2-этилбутил)циклогексил]карбонил]амино)фенил]-2-метилпропантиоат находится в кристаллической форме А, как описано в WO 2012/069087. Форма А при порошковой дифракции в рентгеновских лучах характеризуется картиной с пиками примерно 7,9°, 8,5°, 11,7°, 12,7°, 17,1°, 18,0°, 18,5°, 20,2°, 22,1°, 24,7° ± 0,2°, в частности, с XRPD-пиками, наблюдаемыми при угле дифракции 2 тета 7,9°, 11,7°, 17,1°, 18,5° (± 0,2°).

Другие ингибиторы СЕТР, известные в данной области и используемые в данном изобретении, включают: эвацетрапиб, анацетрапиб и торцетрапиб, особенно эвацетрапиб и анацетрапиб.

Соответственно, изобретение предусматривает способ лечения или профилактики у млекопитающего сердечно-сосудистого нарушения, при этом указанный способ включает введение млекопитающему (предпочтительно млекопитающему, нуждающемуся в этом) терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции. Млекопитающее предпочтительно является человеком (т.е. мужчиной или женщиной). Человек может быть любой расы (например, европейской или ориентальной).

Сердечно-сосудистое нарушение предпочтительно выбрано из группы, состоящей из атеросклероза, болезни периферических сосудов, дислипидемии, гипербеталипопротеинемии, гипоальфалипопротеинемии, гиперхолестеринемии, гипертриглицеридемии, наследственной гиперхолестеринемии, стенокардии, ишемии, ишемии сердца, инсульта, инфаркта миокарда, реперфузионного повреждения, рестеноза после ангиопластики, гипертензии и сосудистых осложнений сахарного диабета, ожирения или эндотоксемии у млекопитающих. Более предпочтительно, сердечно-сосудистое нарушение выбрано из группы, состоящей из сердечно-сосудистого заболевания, ишемической болезни сердца, болезни коронарных сосудов, гипоальфалипопротеинемии, гипербеталипопротеинемии, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, атеросклероза, гипертензии, гипертриглицеридемии, гиперлипопротеинемии, заболевания периферических сосудов, стенокардии, ишемии и инфаркта миокарда.

В некоторых воплощениях данного изобретения субъекту вводят от 100 мг до 600 мг S-[2-([[1-(2-этилбутил)циклогексил]карбонил]амино)фенил]-2-метилпропантиоата. В частности, субъекту вводят от 150 мг до 450 мг S-[2-([[1-(2-этилбутил)циклогексил]карбонил]амино)фенил]-2-метилпропантиоата. Более конкретно, субъекту вводят от 250 мг до 350 мг S-[2-([[1-(2-этилбутил)циклогексил]карбонил]амино)фенил]-2-метилпропантиоата. Более конкретно, субъекту вводят от 250 мг до 350 мг S-[2-([[1-(2-этилбутил)циклогексил]карбонил]амино)фенил]-2-метилпропантиоата.

В другом воплощении данного изобретения субъекту для педиатрического применения вводят от 25 мг до 300 мг S-[2-([[1-(2-этилбутил)циклогексил]карбонил]амино)фенил]-2-метилпропантиоата. В частности, субъекту для педиатрического применения вводят от 75 мг до 150 мг S-[2-([[1-(2-этилбутил)циклогексил]карбонил]амино)фенил]-2-метилпропантиоата.

Ингибитор СЕТР можно вводить млекопитающему в любой подходящей дозе (например, для достижения терапевтически эффективного количества). Например, подходящая доза терапевтически эффективного количества соединения I для введения пациенту будет составлять от примерно 100 мг до примерно 1800 мг в день. Желательный доза предпочтительно составляет от примерно 300 мг до примерно 900 мг в день. Предпочтительная доза составляет примерно 600 мг в день.

Способы генотипирования

Идентификация конкретного генотипа в образце может быть осуществлена любым из ряда способов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, обнаружение полиморфизма может быть проведено путем клонирования аллели и секвенирования с использованием методик, хорошо известных в данной области. Альтернативно, последовательности гена могут быть амплифицированы из геномной ДНК, например, с помощью ПЦР, и продукт может быть секвенирован. В данной области для выделения ДНК субъекта и анализа ее на данный генетический маркер известны многочисленные способы, в том числе полимеразная цепная реакция (ПЦР, polymerase chain reaction, PCR), лигазная цепная реакция (ligation chain reaction, LCR) или лигазная амплификация и способы амплификации, такие как самоподдерживающаяся репликация последовательностей. Ниже описано несколько неограничивающих способов анализа ДНК пациента на наличие мутаций в данном генетическом локусе.

Может быть использована технология ДНК-микрочипов, например, устройства ДНК-чипы и микрочипы высокой плотности для высокопроизводительного скрининга и микрочипы низкой плотности. Способы изготовления микрочипов известны в данной области и включают различные методики и процессы струйного и микроструйного нанесения или формирования точек, процессы фотолитографного синтеза олигонуклеотидов in situ или на чипе и процессы электронной адресации ДНК-зондов. Гибридизация с ДНК-микрочипами успешно применяется в таких областях как анализ экспрессии генов и генотипирование точечных мутаций, однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и коротких тандемных повторов (short tandem repeat, STR). Дополнительные способы включают интерференцию РНК в формате микрочипов и комбинацию микрочипов с другими способами, такими как лазерная захватывающая микродиссекция (laser capture micro-dissection, LCM), сравнительная геномная гибридизация (comparative genomic hybridization, CGH) и иммунопреципитация хроматина (ChiP). См., например, Не et al. (2007) Adv. Exp. Med. Biol. 593: 117-133, и Heller (2002) Annu. Rev. Biomed. Eng. 4: 129-153. Другие способы включают ПЦР, хМАР, анализ Invader^®, масс-спектрометрию и пиросеквенирование (Wang et al. (2007) Microarray Technology and Cancer Gene Profiling Vol 593 of book series Advances in Experimental Medicine and Biology, pub. Springer New York).

Другим способом обнаружения является аллель-специфическая гибридизация с использованием зондов, перекрывающих полиморфный сайт и имеющих примерно 5, альтернативно 10, альтернативно 20, альтернативно 25 или, альтернативно, 30 нуклеотидов вокруг полиморфной области. Например, несколько зондов, способных специфически гибридизоваться с аллельным вариантом или генетическим маркером, представляющим интерес, прикрепляются к твердофазному носителю, например, "чипу". Олигонуклеотидные зонды могут быть связаны с твердой подложкой с помощью различных процессов, включая литографию. Анализ обнаружения мутаций с помощью этих чипов, содержащих олигонуклеотиды, которые также называют "матрицами с ДНК-зондами", описан, например, в Cronin et al. (1996) Human Mutation 7': 244.

В других способах обнаружения необходимо сначала амплифицировать по меньшей мере часть гена перед идентификацией аллельного варианта. Амплификация может быть выполнена, например, с помощью PCR и/или LCR или других способов, хорошо известных в данной области.

В некоторых случаях наличие специфической аллели в ДНК от субъекта может быть показано в анализе с помощью фермента рестрикции. Например, конкретный нуклеотидный полиморфизм может давать нуклеотидную последовательность, содержащую сайт рестрикции, который отсутствует в нуклеотидной последовательности другого аллельного варианта.

В дополнительном воплощении защита от расщепляющих агентов (таких как нуклеаза, гидроксиламин или осмия тетроксид и пиперидин) может быть использована для обнаружения неспаренных оснований в РНК/РНК, ДНК/ДНК или гетеродуплексах РНК/ДНК (см., например, Myers et al. (1985) Science 230: 1242). В целом, методика "расщепления неспаренных оснований" начинается с получения дуплексов, образованных путем гибридизации зонда, например, РНК или ДНК, который, возможно, является меченым и содержит нуклеотидную последовательность аллельного варианта гена, с анализируемой нуклеиновой кислотой, полученной из образца ткани. Двухцепочечные дуплексы обрабатывают агентом, который расщепляет одноцепочечные области дуплекса, такие как дуплексы, образованные на основе парных несоответствий между контрольной и анализируемой нитями. Например, дуплексы РНК/ДНК можно обработать РНКазой, а гибриды ДНК/ДНК обработать Sl-нуклеазой для ферментативного расщепления неспаренных областей. Альтернативно, либо ДНК/ДНК-, либо РНК/ДНК-дуплексы можно обработать гидроксиламином или осмия тетроксидом и пиперидином, чтобы расщепить неспаренные области. После расщепления неспаренных областей полученный материал разделяют по размеру в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, чтобы определить, имеют ли контрольная и анализируемая нуклеиновые кислоты одинаковую нуклеотидную последовательность, или в каких нуклеотидах они различаются. См., например, патент США №6455249; Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397; Saleeba et al. (1992) Meth. Enzymol. 217: 286-295.

Изменения в электрофоретической подвижности также могут быть использованы для обнаружения конкретного аллельного варианта. Например, одноцепочечный конформационный полиморфизм (single strand conformation polymorphism, SSCP) может быть использован для определения различий в электрофоретической подвижности между мутантой нуклеиновой кислотой и нуклеиновой кислотой дикого типа (Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86: 2766; Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125-144 and Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79). Одноцепочечные ДНК-фрагменты анализируемой и контрольной нуклеиновых кислот подвергают денатурации и ренатурации. Вторичная структура одноцепочечных нуклеиновых кислот изменяется в соответствии с последовательностью; полученное изменение в электрофоретической подвижности позволяет обнаруживать даже изменения одного основания. Фрагменты ДНК могут быть помечены или обнаружены с помощью меченых зондов. Чувствительность анализа может быть повышена с помощью РНК (вместо ДНК), вторичная структура которой является более чувствительной к изменению последовательности. В другом предпочтительном воплощении рассматриваемый способ использует гетеродуплексный анализ для разделения двухцепочечных гетеродуплексных молекул на основании изменений в электрофоретической подвижности (Keen et al. (1991) Trends Genet. 7: 5).

Идентичность аллельного варианта или генетического маркера может быть также получена путем анализа движения нуклеиновой кислоты, содержащей полиморфную область, в полиакриламидном геле, содержащем градиент денатурирующего агента, который анализировали с использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313: 495). Когда в качестве способа анализа используют DGGE, ДНК модифицируют, чтобы гарантировать, что она не полностью денатурирует, например, путем добавления GC-зажима длиной примерно 40 п.н. тугоплавкой GC-богатой ДНК с помощью ПЦР. В другом воплощении вместо градиента денатурирующего агента используется температурный градиент, чтобы определить различия в подвижности контрольной и анализируемой ДНК (Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265: 1275).

Примеры методик для обнаружения отличия по меньшей мере одного нуклеотида между двумя нуклеиновыми кислотами включают, но не ограничиваясь ими, селективную гибридизацию олигонуклеотидов, селективную амплификацию или селективное удлинение праймера. Например, могут быть получены олигонуклеотидные зонды, в которых известный полиморфный нуклеотид находится в центре (аллель-специфические зонды), а затем они гибридизуются с ДНК-мишенью в условиях, позволяющих гибридизацию только тогда, когда найдено идеальное совпадение (Saiki et al. (1986) Nature 324: 163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230). Такие методики аллель-специфической гибридизации олигонуклеотидов используются для обнаружения изменений нуклеотидов в полиморфной области гена. Например, олигонуклеотидные зонды, имеющие нуклеотидную последовательность специфического аллельного варианта, прикрепляют к гибридизующейся мембране, и эта мембрана затем гибридизуется с меченой анализируемой нуклеиновой кислотой. Анализ сигнала гибридизации будет раскрывать идентичность нуклеотидов анализируемой нуклеиновой кислоты.

Альтернативно, в сочетании с данным изобретением может быть использована методика аллель-специфической амплификации, которая зависит от селективной ПЦР-амплификации. Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров для специфической амплификации, могут нести аллельный вариант, представляющий интерес, в центре молекулы (так что амплификация зависит от дифференциальной гибридизации) (Gibbs et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448) или на 3'-конце одного праймера, где в соответствующих условиях несовпадение может предотвратить или уменьшить полимеразное удлинение (Prossner (1993) Tibtechl 1: 238 and Newton et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 2503). Эта методика также называется "PROBE", что расшифровывается как PRobeOligo Base Extension. Кроме того, может быть желательным введение в область мутации нового сайта рестрикции, чтобы создать сайт расщепления (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell. Probes 6: 1).

В другом воплощении идентификация аллельного варианта или генетического маркера осуществляется с использованием олигонуклеотид-лигазного анализа (oligonucleotide ligation assay, OLA), описанного, например, в патенте США №4998617 и в Laridegren, U. et al. Science 241: 1077-1080 (1988). Протокол OLA использует два олигонуклеотидных зонда, которые разработаны так, чтобы быть способными гибридизоваться с примыкающими последовательностями одноцепочечной мишени. Один из олигонуклеотидов связан с маркером разделения, например, биотинилирован, а другой мечен обнаруживаемой меткой. Если в молекуле-мишени найдена точная комплементарная последовательность, олигонуклеотиды будут гибридизоваться так, что их концы смыкаются и создают лигазный субстрат. Затем лигирование позволяет меченому олигонуклеотиду быть восстановленным с помощью авидина или другого биотинового лиганда. Nickerson, D.A. et al. описали анализ обнаружения нуклеиновой кислоты, который сочетает признаки ПЦР и OLA (Nickerson, D.A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8923-8927). В этом способе ПЦР используют для экспоненциальной амплификации ДНК-мишени, которую затем обнаруживают с помощью OLA. В Tobe et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 3728 описана разновидность способа OLA, в которой каждый аллель-специфический праймер помечен уникальным гаптеном, т.е. дигоксигенином и флуоресцеином, и каждая реакция OLA обнаруживается с использованием гаптен-специфических антител, меченных репортерными ферментами.

Данное изобретение предусматривает способы обнаружения однонуклеотидного полиморфизма (SNP) в ADCY9. Поскольку однонуклеотидные полиморфизмы фланкированы областями с инвариантной последовательностью, их анализ требует не более чем определения идентичности одного вариантного нуклеотида, и нет необходимости определять полную последовательность гена для каждого пациента. Для облегчения анализа SNP было разработано несколько способов.

Однонуклеотидный полиморфизм может быть обнаружен с помощью специализированного устойчивого к экзонуклеазе нуклеотида, описанного, например, в патенте США №4656127. В соответствии с данным способом праймер, комплементарный аллельной последовательности, прилегающей непосредственно к 3'-концу полиморфного сайта, может гибридизоваться с молекулой-мишенью, полученной от конкретного животного или человека. Если полиморфный сайт на молекуле-мишени содержит нуклеотид, который комплементарен конкретному присутствующему нуклеотидному производному, устойчивому к экзонуклеазе, то это производное будет включено в конец гибридизующегося праймера. Такое встраивание вызывает устойчивость праймера к экзонуклеазе, тем самым, позволяя его обнаружение. Поскольку идентичность анализируемого производного, устойчивого к экзонуклеазе, известна, обнаружение того факта, что праймер стал устойчивым к экзонуклеазе, показывает, что нуклеотид, присутствующий в полиморфном сайте молекулы-мишени, комплементарен нуклеотидному производному, используемому в реакции. Этот способ имеет то преимущество, что он не требует определения большого количества данных о посторонних последовательностях.

Для определения идентичности нуклеотида в полиморфном сайте также может быть использован способ на основе раствора (WO 91/02087). Как и раньше, используется праймер, который комплементарен аллельным последовательностям, находящимся сразу у 3'-конца полиморфного сайта. Данный способ определяет идентичность нуклеотида в этом сайте с помощью меченых дидеоксинуклеотидных производных, которые будут встраиваться на конце праймера при комплементарности нуклеотиду в полиморфном сайте.

Альтернативный способ описан в WO 92/15712. Этот способ использует смеси меченых терминаторов и праймера, комплементарного последовательности, находящейся на 3'-конце от полиморфного сайта. Меченый терминатор, который встраивается, таким образом, определяется и является комплементарным нуклеотиду, присутствующему в полиморфном сайте оцениваемой молекулы-мишени. Способ, как правило, является анализом в гетерогенной системе, в которой праймер или молекула-мишень иммобилизированы на твердой фазе.

Были описаны многие другие процедуры нуклеотидного встраивания, направляемого праймерами, для анализа полиморфных сайтов в ДНК (Komher, J.S. et al. (1989) Nucl. Acids. Res. 17: 7779-7784; Sokolov, B.P. (1990) Nucl. AcidsRes. 18: 3671; Syvanen, A.-C., et al. (1990) Genomics 8: 684-692; Kuppuswamy, M.N. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1143-1147; Prezant, T.R. et al. (1992) Hum. Mutat. 1: 159-164; Ugozzoli, L. et al. (1992) GATA 9: 107-112; Nyren, P. et al. (1993) Anal.Biochem. 208: 171-175). Все эти способы основаны на встраивании меченых дезоксинуклеотидов для различения оснований в полиморфном сайте.

Кроме того, следует понимать, что любой из указанных выше способов обнаружения изменений в гене или генном продукте или полиморфных вариантах может быть использован для контроля за курсом лечения или терапии.

Описанные в данном документе способы могут быть выполнены, например, с использованием предварительно упакованных диагностических наборов, таких как те, которые описаны ниже, содержащих по меньшей мере один зонд, нуклеиновокислотный праймер или реагент, который может быть удобно использован для генотипирования, например, для анализа генетического маркера, присутствующего в гене ADCY9, чтобы определить, имеет ли человек повышенную вероятность получить пользу от лечения HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом, в частности, ингибитором/модулятором СЕТР. В частности, эти генетические маркеры описаны в данном документе.

Праймеры или зонды согласно данному изобретению для применения в качестве реагентов для генотипирования генетических маркеров, присутствующих в гене ADCY9, включают синтетическую нуклеотидную последовательность, которая комплементарна и гибридизуется с непрерывной последовательностью в гене ADCY9, предпочтительно длиной от 12 до 30 нуклеотидов, прилегающей или охватывающей один или более чем один SNP, выбранный среди rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119 и rs13337675, предпочтительно rs1967309. В других аспектах праймер содержит 100 или меньше 100 нуклеотидов, в некоторых аспектах от 12 до 50 нуклеотидов или от 12 до 30 нуклеотидов. Праймер по меньшей мере на 70% идентичен смежной последовательности или комплементу смежной нуклеотидной последовательности, предпочтительно, идентичен по меньшей мере на 80%, а более предпочтительно, идентичен по меньшей мере на 90%. Праймер или зонд согласно изобретению имеет предпочтительно 15-50 нуклеотидов в длину, включая участок длиной от 15 до 20 нуклеотидов, который комплементарен последовательности, выбранной среди SEQ ID №№1-15, в частности, комплементарен последовательности SEQ ID №1. Степень комплементарности между зондом или праймером и SEQ ID №№1-15 может составлять 100%, 95%, 90%, 85%, 80% или 75%.

Олигонуклеотиды, в том числе зонды и праймеры, "специфичные для" генетической аллели или генетического маркера, либо связываются с полиморфной областью гена, либо примыкают к полиморфной области гена. Для олигонуклеотидов, которые должны быть использованы в качестве праймеров для амплификации, праймеры являются смежными, если они достаточно близко располагаются, чтобы быть использованными для получения полинуклеотида, содержащего полиморфную область. В одном воплощении олигонуклеотиды являются смежными, если они связываются в пределах примерно 1-2 кб, например, менее 1 кб от полиморфизма. Конкретные олигонуклеотиды способны гибридизоваться с конкретной последовательностью и в подходящих условиях не будут связываться с последовательностью, отличающейся на один нуклеотид.

Олигонуклеотиды согласно изобретению, используемые в качестве зондов или праймеров, могут быть помечены обнаруживаемой меткой. Метки могут быть обнаружены непосредственно, например, флуоресцентные метки, либо косвенно. Косвенное обнаружение может включать любой способ обнаружения, известный специалистам в данной области, включая взаимодействие биотина и авидина, связывание антитела и т.п. Олигонуклеотиды, меченные флуоресцентными метками, также могут содержать молекулу гасителя. Олигонуклеотиды могут быть связаны с поверхностью. В некоторых воплощениях поверхность является кремниевой или стеклянной. В некоторых воплощениях поверхность является металлическим электродом.

Зонды могут быть использованы для непосредственного определения генотипа образца или могут быть использованы одновременно или последовательно с амплификацией. Термин "зонды" включает природные или рекомбинантные одно- или двухцепочечные нуклеиновые кислоты или химически синтезированные нуклеиновые кислоты. Они могут быть помечены путем ник-трансляции, реакции заполнения фрагментом Кленова, ПЦР или другими способами, известными в данной области. Зонды согласно данному изобретению, их получение и/или мечение описаны в Sambrook et al. (1989), см. выше. Зонд может быть полинуклеотидом любой длины, подходящим для селективной гибридизации с нуклеиновой кислотой, содержащей полиморфную область согласно изобретению. Длина используемого зонда будет зависеть, в частности, от природы используемого анализа и используемых условий гибридизации.

Меченые зонды также можно использовать в сочетании с амплификацией полиморфизма (Holland et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280). В патенте США №5210015 описаны подходы на основе флуоресценции для измерения в реальном времени продуктов амплификации в ходе ПЦР. Такие подходы либо используют интеркалирующие метки (например, этидия бромид), чтобы показать количество присутствующей двухцепочечной ДНК, либо они используют зонды, содержащие пару флуоресцентной метки и гасителя (этот подход также называется "TaqMan®"), где зонд расщепляется в процессе амплификации, высвобождая флуоресцентную молекулу, концентрация которой пропорциональна количеству присутствующей двухцепочечной ДНК. Во время амплификации зонд расщепляется благодаря нуклеазной активности полимеразы при гибридизации с последовательностью-мишенью, что приводит к отделению флуоресцентной молекулы от молекулы гасителя, вызывая тем самым появление флуоресценции из репортерной молекулы. В подходе TaqMan® используется зонд, содержащий пару "репортерная молекула - молекула гасителя", которая специфически гибридизуется с областью полинуклеотида-мишени, содержащей полиморфизм.

Зонды могут быть прикреплены к поверхностям для применения в виде "генных чипов". Такие генные чипы могут быть использованы для обнаружения генетических вариаций с помощью ряда методик, известных специалистам в данной области. По одной из методик олигонуклеотиды выстроены на генном чипе для определения последовательности ДНК путем секвенирования в подходе гибридизации, например, как описано в патентах США №№6025136 и 6018041. Зонды согласно изобретению также могут быть использованы для флуоресцентного обнаружения генетической последовательности. Такие методики описаны, например, в патентах США №№… Зонды согласно изобретению также могут быть использованы для флуоресцентного обнаружения генетической последовательности. Такие методики описаны, например, в патентах США №№5968740 и 5858659. Зонд также может быть прикреплен к поверхности электрода для электрохимического обнаружения нуклеиновокислотных последовательностей, например, как описано в патенте США №5952172 и в Kelley, S.О. et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27: 4830-4837. Один или более чем один зонд для обнаружения SNP согласно изобретению (таблица 2, 3, 4 или 5, в частности, таблица 2) может быть прикреплен к чипу, и такое устройство используется для прогнозирования ответа на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности, на ингибитор/модулятор СЕТР, и для выбора эффективного лечения человека с сердечно-сосудистым заболеванием. Вполне возможно, что зонды для обнаружения SNP согласно изобретению могут быть помещены на чип с множеством других зондов для других применений, отличных от предсказания ответа на HDL-повышающий или HDL-имитирующий агент, в частности, на ингибитор/модулятор СЕТР.

Кроме того, синтетические олигонуклеотиды, используемые в качестве зондов или праймеров, могут быть изменены для большей стабильности. Примеры нуклеиновокислотных молекул, которые являются модифицированными, включают незаряженные связи, например, фосфорамидатные, фосфотиоатные и метилфосфонатные аналоги ДНК (см. также патенты США №№5176996, 5264564 и 5256775). Праймеры и зонды согласно изобретению могут включать, например, метки метилирования, межнуклеотидные модификации, такие как подвешенные группировки (например, полипептиды), интеркаляторы (например, акридин, псорален), хелаторы, алкилирующие агенты и модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты). Также включены синтетические молекулы, которые имитируют нуклеиновокислотные молекулы в способности связываться с обозначенной последовательностью посредством водородных связей и других химических взаимодействий, включая пептидные связи взамен фосфатных связей в нуклеотидной цепи.

Изобретение относится к синтетическим олигонуклеотидным молекулам, праймерам и зондам, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с природными олигонуклеотидами, описанными в данном документе, генными маркерами гена ADCY9. Олигонуклеотиды могут быть обнаружены и/или выделены путем специфической гибридизации в условиях высокой жесткости. "Условия высокой жесткости" известны в данной области и обеспечивают специфическую гибридизацию первого олигонуклеотида со вторым олигонуклеотидом, где между первым и вторым олигонуклеотидом имеется высокая степень комплементарности. Для способов генотипирования, раскрытых в данном документе, эта степень комплементарности составляет от 80% до 100%, предпочтительно от 90% до 100%

SNP согласно изобретению также может быть обнаружен с уже существующими данными, такими как данные о последовательностях всего генома, присутствующие в базе данных. Данное изобретение предусматривает реализованный на компьютере запрос геномных данных для определения генотипа для прогнозирования реакции пациента на ингибитор СЕТР и для лечения указанного пациента соответствующим образом, т.е. для лечения пациента, отвечающего на ингибитор СЕТР.

Образец нуклеиновой кислоты согласно изобретению для применения в способах генотипирования, выбора лечения или способов лечения может быть получен из любого типа клеток или ткани субъекта. Например, может быть получен образец биологической жидкости (например, кровь) от субъекта с помощью известных методик. Альтернативно, анализ нуклеиновых кислот может быть выполнен на сухих образцах (например, волосах или коже). Более конкретно, в способах генотипирования, выборе лечения или способах лечения используются клетки крови.

Изобретение, описанное в данном документе, относится к способам и реагентам для определения и выявления аллели, присутствующей в гене ADCY9 в rs1967309 или rs12595857, или любого другого генетического варианта в неравновесном сцеплении с этими двумя SNP, показанными на фиг. 8, охватывающими позиции с chr16: 4049365 до chr16: 4077178 (сборка GRCh37/hg19). В частности, изобретение относится также к способам и реагентам для определения и выявления аллели, присутствующей в гене ADCY9 в rs1967309, rs12595857, rs2239310, rs11647828, rs8049452, rs12935810, rs74702385, rs17136707, rs8061182, rs111590482, rs4786454, rs2283497, rs2531967, rs3730119, rs13337675, в частности, в rs1967309 или rs12595857, и в особенности в rs1967309.

Как указано в данном описании, изобретение также предусматривает способы выбора лечения, включающие обнаружение одного или более чем одного генетического маркера, присутствующего в гене ADCY9. В некоторых воплощениях данные способы используют зонды или праймеры, содержащие нуклеотидные последовательности, которые комплементарны полиморфной области ADCY9. Соответственно, данное изобретение предусматривает наборы, содержащие зонды и праймеры для выполнения генотипирования согласно способам данного изобретения.

В некоторых воплощениях изобретение предусматривает набор для определения того, имеет ли пациент с сердечно-сосудистым нарушением повышенную вероятность получить пользу от лечения HDL-повышающим или HDL-имитирующим агентом, в частности, ингибитором/модулятором СЕТР. Такие наборы содержат один или более чем один реагент, в частности, праймеры или зонды из описанных в данном документе, а также инструкции по применению. Исключительно в качестве примера, изобретение также предусматривает наборы для определения того, имеет ли пациент с сердечно-сосудистым нарушением повышенную вероятность получить пользу от лечения S-(2-{[1-(2-этилбутил)-циклогексанкарбонил]амино}фенил)эфиром тиоизомасляной кислоты, и эти наборы содержат первый олигонуклеотид и второй олигонуклеотид, специфические для полиморфизма АА в SNP rs1967309 в гене ADCY9.

Набор может включать по меньшей мере один зонд или праймер, способный к специфической гибридизации с полиморфной областью ADCY9, а также инструкции по применению. Наборы обычно содержат по меньшей мере одну из описанных выше нуклеиновых кислот. Наборы для амплификации по меньшей мере части ADCY9 обычно содержат два праймера, по меньшей мере один из которых способен к гибридизации с аллельной вариантной последовательностью. Такие наборы подходят для обнаружения генотипа, например, посредством флуоресцентного обнаружения, путем электрохимического обнаружения или с помощью других способов обнаружения.

Также другие наборы согласно изобретению содержат по меньшей мере один реагент, необходимый для выполнения анализа. Например, набор может содержать фермент. Альтернативно, набор может содержать буфер или любой другой необходимый реагент.

Наборы могут включать все или некоторые из положительных контролей, отрицательных контролей, реагентов, праймеров, маркеров секвенирования, зондов и антител, описанных в данном документе, для определения генотипа субъекта в полиморфной области ADCY9.

Следующий пример предназначен только для иллюстрации воплощения данного изобретения на практики и не предусмотрен в качестве ограничения.

Данное изобретение относится к следующим нуклеотидным и аминокислотным последовательностям:

Последовательности, представленные в данном документе, доступны в базе данных NCBI и могут быть получены из www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene. Эти последовательности также относятся к аннотированным и модифицированным последовательностям. Данное изобретение также предусматривает методики и способы, в которых используются гомологичные последовательности и варианты кратких последовательностей, представленные в данном документе. Предпочтительно такие "варианты" являются генетическими вариантами. В базе данных NCBI доступна нуклеотидная последовательность, кодирующая аденилатциклазу типа 9 Homo Sapiens (ACDY9).

Человеческая аденилатциклаза типа 9 (ADCY9), RefSeqGene на хромосоме 16

Номер последовательности в NCBI: per. номер NCBI NG_011434.1

Человеческая хромосома 16 геномный контиг, GRCh37.p10 Первичная сборка

Номер последовательности в NCBI: per. номер NCBI NT_010393.16

Интронные последовательности SNP человеческого гена ACDY9, имеющие обозначение "rs", аллели и соответствующие номера SEQ ID приведены в таблице 2. Полиморфизмы выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.

Пример 1

Испытание Dal-OUTCOMES (NC20971) было двойным слепым, рандомизированным, плацебо-контролируемым, многоцентровым исследованием в III фазе в параллельных группах для оценки безопасности и эффективности ингибитора СЕТР далцетрапиба у пациентов, недавно госпитализированных по причине острого коронарного синдрома (ACS). Во время промежуточного анализа исследование включало 15871 рандомиизированных пациентов, распределенных на две группы: получавшие плацебо (7933 пациентов) и получавшие далцетрапиб (600 мг в день; 7938 пациентов). Исследование не дало никаких доказательств снижения частоты событий в первичной конечной точке эффективности в группе с далцетрапибом по сравнению с плацебо. Детали испытания Dal-OUTCOMES можно найти в G. Schwartz et al., N. Engl. J. Med. 367; 22, 2012. Genotyping.

Полногеномный анализ проводили в среде согласно GLP в центре фармакогеномики Beaulieu-Saucier Pharmacogenomics Centre. Чип Infinium HumanOmni25Exome-8v1_A BeadChip (Illumina, Сан-Диего, Калифорния), включающий 2567845 геномных маркеров, использовали и обрабатывали в соответствии с указаниями изготовителя. Примерно 200 нг геномной ДНК подвергали полногеномной амплификации, фрагментировали и гибридизировали с локус-специфическими зондами, связанными с поверхностью каждого чипа BeadChip.ДНК подвергали генотипированию с использованием удлинения на одно основание, меченное флуоресцентной меткой. Чипы BeadChip сканировали и анализировали с помощью ридера Illumina iScan Reader. Процесс Infinium проверяли с помощью контролей, и все результаты были в пределах указаний производителя. Отсканированные изображения анализировали с использованием Illumina's GenomeStudio версии 2011.1 с кластерным алгоритмом GenTrain 2.0, используя порог No-Call 0,15, без ручной регулировки кластера и с помощью кластерного файла Illumina HumanOmni25Exome-8v1_A от производителя. Файлы с данными о генотипе получали в трех частях сопоставимого размера, как только данные становились доступными. Три файла с данными генотипирования в формате PLINK, созданном GenomeStudio, были объединены и преобразованы в двоичный формат PLINK.

Показатель завершения генотипирования для образцов и SNP был установлен на 98%. SNP со стандартной ошибкой в планшете для генотипирования (на основе 96-луночных планшетов, используемых для разведения образцов ДНК) были помечены, но не удалялись, поскольку нельзя было исключить влияние генетического происхождения. Парные IBD использовали для проведения проверок близких родственных отношений. Мы пометили и удалили всех членов соответствующих пар, кроме одной пары, и дубликаты образцов (коэффициент IBS2*>0,80) на основании выбора некоррелирующих SNP (r²<0,1). Парную IBS матрицу использовали в качестве показателя расстояния, чтобы определить скрытую связанность между образцами и выбросы при многомерном масштабировании (multi-dimensional scaling, MDS). Первые две компоненты MDS каждого субъекта наносили на графики, в том числе генотипы НарМар CEU, JPT-CHB и данные YRI (сохраняя только основателей). Выбросы из главного кластера европейцев помечали и удаляли способом к ближайших соседей (дополнительный график 1). График каменистой осыпи и совокупную объясненную дисперсию вычисляли с использованием программы smartpca системы EIGENSOFT (версия 3.0). Используемыми опциями были "numoutlieriter" (максимальное число итераций удаления выброса) на 0 (выключен) и "altnormstyle" (формула нормализации) на "НЕТ" (дополнительный график 2).

Статистические методы

План статистического анализа был разработан в центре фармакогеномики Beaulieu-Saucier Pharmacogenomics Centre, и окончательный вариант был утвержден до завершения генотипирования в октябре 2012 года. Статистические испытания, выполненные на генетических данных, были двусторонними и скорректированными с учетом многократного анализа SNP. Полногеномный порог значимости р<5×10^-8 был использован в качестве допустимого порога для значимых результатов. Результаты с р<1×10^-6 рассматривались в качестве потенциальных кандидатов. Многомерные модели включали пол как ковариату и первые 5 главных компонент (principal components, PC) структуры популяции, чтобы избежать смешения структуры населения. Анализируемая группа была определена как участники группы лечения далцетрапибом с валидацией в группе плацебо, чтобы подтвердить отсутствие эффекта и проанализирововать взаимодействие "ген - лечение" в объединенной группе.

Полногеномные анализы ассоциаций с частыми генетическими вариантами (MAF≥0,05) проводили с использованием программного обеспечения PLINK версии 1.07. Все результаты со значением Р≤10^-6 подтверждали в программном обеспечении SAS. Для анализа аддитивного действия генов использовали одну степень свободы. Генотипы были закодированы как 0, 1 или 2 в соответствии с числом минорных аллелей. В присутствии ковариат значение Р для анализа аддитивного действия генов корректируется для ковариаты, например,

или

и нулевой (Н₀) в анализе аддитивного действия представляет собой b₁=0. Полногеномный анализ впервые был проведен с использованием модели логистической регрессии с помощью программного обеспечения PLINK для наступления событий в сравнении с ненаступлением. Все результаты логистического регрессионного анализа, которые дали значение P≤10^-6, были подтверждены в программном обеспечении SAS v.9.3 (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США) и проанализированы с использованием пропорциональных рисков в регрессии Кокса. Результаты регрессии Кокса были определены заранее, чтобы быть более подходящим для целей исследования, чем таковые из логистической регрессии, и планировалось, что они будут первичными результатами. Модель пропорциональных рисков в регрессии Кокса также была использована для анализа взаимодействия "ген - лечение" в соответствии с формулой: log(частота события) ~ генотип + группа лечения + генотип * группа лечения + пол + PC, с использованием образцов и группы, получавшей лечение, и группы, получавшей плацебо.

Интронный вариант rs1967309 в гене аденилатциклазы типа 9, ADCY9, значительно связан с событиями (пропорциональные риски Кокса р=2,4×10^-8). Генетический вариант в этой позиции имеет частоту минорной аллели 0,45, и аддитивный генетический эффект одной аллели имеет HR=0,65 (95% ДИ 0,55, 0,76) для событий в группе лечения dal-Outcomes. Р-значение взаимодействия "ген - лечение" составляет 0,0013, и не было обнаружено никакого генетического влияния варианта в группе с плацебо (р=0,25). Анализ чувствительности с регулировкой для статинов является состоятельным (р=5,4×10^-8). Соседний SNP в неравновесном сцеплении (r²=0,86), rs12595857, имеет коррелирующие результаты. Стратификация по генотипу показывает, что гомозиготы АА в rs1967309 имеют HR=0,40 (95% ДИ 0,28, 0,57) для событий в группе dal-Outcomes, получавшей лечение, по сравнению с референсными гомозиготами GG и гетерозиготами AG, которые имеют HR=0,68 (95% ДИ 0,55, 0,84). В подгруппе гомозигот АА в rs1967309 лечение далцетрапибом по сравнению с плацебо имело HR=0,61 (95% ДИ 0,41, 0,92).

Реферат

Данное изобретение относится к медицине. Предложены способы и применение ингибитора СЕТР, а именно дальцетрапиба, для лечения субъекта с острым коронарным синдромом, где субъект имеет нуклеотидные полиморфизмы в гене аденилатциклазы типа 9 (ADCY9) в хромосоме 16. Также представлены способы и применения дальцетрапиба при изготовлении лекарственного средства для лечения субъекта с острым коронарным синдромом и для снижения риска сердечно-сосудистого события. Генотипирование субъекта согласно настоящему изобретению может найти дальнейшее применение в лечении сердечно-сосудистых заболеваний и в предсказании ответа на такое лечение. 6 н. и 24 з.п. ф-лы, 8 ил., 8 табл., 1 пр.

Формула

1. Применение далцетрапиба для лечения субъекта с острым коронарным синдромом и идентифицированного как имеющий генотип улучшенного ответа, где генотип улучшенного ответа представляет собой АА при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 1 на хромосоме 16.

2. Применение далцетрапиба при изготовлении лекарственного средства для лечения субъекта с острым коронарным синдромом и идентифицированного как имеющий генотип улучшенного ответа, где генотип улучшенного ответа представляет собой АА при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 1 на хромосоме 16.

3. Способ лечения субъекта с острым коронарным синдромом, включающий введение эффективного количества далцетрапиба указанному субъекту, нуждающемуся в этом и идентифицированному как имеющий генотип улучшенного ответа, где генотип улучшенного ответа представляет собой АА при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 1 на хромосоме 16.

4. Применение далцетрапиба для снижения риска сердечно-сосудистого события у субъекта, который был идентифицирован как имеющий генотип улучшенного ответа, где генотип улучшенного ответа представляет собой один или более из

АА при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 1 на хромосоме 16;

AG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 1 на хромосоме 16;

GG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 2 на хромосоме 16;

AG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 2 на хромосоме 16;

GG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 3 на хромосоме 16;

AG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 3 на хромосоме 16;

GG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 4 на хромосоме 16;

AG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 4 на хромосоме 16;

GG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 5 на хромосоме 16;

GA при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 5 на хромосоме 16;

GG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 6 на хромосоме 16;

GA при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 7 на хромосоме 16;

АА при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 7 на хромосоме 16;

GG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 8 на хромосоме 16;

AG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 8 на хромосоме 16;

АА при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 9 на хромосоме 16;

AG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 9 на хромосоме 16;

AG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 10 на хромосоме 16;

GG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 10 на хромосоме 16;

АА при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 11 на хромосоме 16;

GA при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 11 на хромосоме 16;

АА при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 12 на хромосоме 16;

СА при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 12 на хромосоме 16;

АА при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 13 на хромосоме 16;

GA при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 13 на хромосоме 16;

АА при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 14 на хромосоме 16;

GA при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 14 на хромосоме 16; и

AG при одиночном нуклеотидном полиморфизме в последовательности SEQ ID NO: 15 на хромосоме 16.

5. Применение по п. 4, где генотип улучшенного ответа представляет собой один или более из