Композиции и способы получения (r)-ретикулина и его предшественников - RU2729065C2

Код документа: RU2729065C2

Чертежи

Показать все 13 чертежа(ей)

Описание

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка, поданная согласно договору о патентной кооперации заявляет приоритет в соответствии со статьей 35 USC §119(е) по предварительной заявке на выдачу патента США №61/911759, поданной 04 декабря 2013 года и предварительной заявке на выдачу патента США №62/050399, поданной 15 сентября 2014 года, обе из которых включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте.

ОБЛАСТЬ РАСКРЫТИЯ

[0002] Композиции и способы, раскрытые в настоящем документе, относятся ко вторичным метаболитам и процессам их изготовления. Более конкретно, настоящее раскрытие относится к (R)-ретикулину и некоторым его предшественникам, а также к способам и композициям для изготовления (R)-ретикулина и таких предшественников.

ПРЕДПОСЫЛКИ РАСКРЫТИЯ

[0003] Следующие абзацы представлены в качестве описания предпосылок настоящего раскрытия. Однако это не является признанием того, что что-либо рассматриваемое в них является известным уровнем техники или часть сведений, известных специалистам в данной области.

[0004] Биохимические пути живых организмов обычно классифицируют как являющиеся либо частью первичного метаболизма, либо частью вторичного метаболизма. Пути, которые являются частью первичного метаболизма живых клеток, вовлекаются в катаболизм для продуцирования энергии или в анаболизм для продуцирования строительных блоков для клетки. Вторичные метаболиты, с другой стороны, продуцируются живыми клетками без какой-либо явной анаболической или катаболической функции. Однако давно установлено, что многие вторичные метаболиты являются применимыми во многих отношениях, в том в том числе, например, в качестве терапевтических средств или природных замедлителей реакций.

[0005] Вторичный метаболит (R)-ретикулин продуцируется маком снотворным (Papaver somniferum) и другими представителями семейств растений Papaveraceae, Lauraceae, Annonaceae, Euphorbiaceae и Moraceae, и может быть использован в качестве исходного материала для получения фармацевтически активных соединений, в том числе морфина и кодеина.

[0006] Известно, что (R)-ретикулин in planta продуцируется из (S)-ретикулина. Однако не ясно, какие гены и полипептиды вовлечены в катализ конверсионной реакции(ий).

[0007] В настоящее время (R)-ретикулин может быть собран из природных источников, таких как мак снотворный. В качестве альтернативы, (R)-ретикулин может быть получен синтетически. Однако существующие способы изготовления (R)-ретикулин имеют низкий выход (R)-ретикулина и/или требуют больших затрат. Не существует способов биосинтетического получения (R)-ретикулина из (S)-ретикулина. Таким образом в данной области существует потребность в улучшенных способах синтеза (R)-ретикулина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РАСКРЫТИЯ

[0008] Следующие абзацы предназначены для введения читателя в следующее далее более подробное описание и не предназначены для определения или ограничения заявляемого в настоящем раскрытии объекта.

[0009] Настоящее раскрытие относится ко вторичному метаболиту (R)-ретикулину и некоторым его предшественникам, а также к способам получения (R)-ретикулина и некоторых его предшественников.

[0010] Следовательно, настоящее раскрытие представляет, по меньшей мере в одном аспекте, по меньшей м ере один вариант осуществления способа получения (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина, предусматривающего

(а) обеспечение бензилизохинолинового производного;

(b) введение в контакт бензилизохинолинового производного со смесью ферментов, способных превращать бензилизохинолиновое производное в (R)-ретикулин или предшественник (R)-ретикулина, при условиях, позволяющих превращение бензилизохинолинового производного в (R)-ретикулин или предшественник (R)-ретикулина.

[0011] Настоящее раскрытие, кроме того, обеспечивает, по меньшей мере в одном аспекте, по меньшей мере один вариант осуществления способа получения (R)-ретикулина или его предшественника, предусматривающего

(a) обеспечение бензилизохинолинового производного;

где бензилизохинолиновое производное характеризуется химической формулой (I):

где каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или метоксигруппу;

и где R₅ представляет собой атом водорода или метильную группу; и

где предшественник (R)-ретикулина характеризуется химической формулой (II):

где каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или метоксигруппу;

и где R₅ представляет собой атом водорода или метильную группу, при условии, что химическая формула (II) исключает (R)-ретикулин.

[0012] Согласно предпочтительным вариантам осуществления в бензилизохинолиновом производном R₁ представляет собой метоксигруппу; R₂ представляет собой гидроксильную группу; R₃ представляет собой гидроксильную группу; R₄ представляет собой метоксигруппу, a R₅ представляет собой метильную группу, представляя химическую формулу:

также известную как (S)-ретикулин.

[0013] Согласно следующим предпочтительным вариантам осуществления смесь ферментов содержит первый полипептид, способный окислять бензилизохинолиновое производное с образованием окисленного бензилизохинолинового производного, характеризующегося химической формулой (IV):

где каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ представляет собой атом водорода, гидроксильную или метоксигруппу;

и где R₅ представляет собой атом водорода или метильную группу; и

второй полипептид, способный восстанавливать окисленное бензилизохинолиновое производное (IV) с образованием (R)-ретикулина или (R)-ретикулинового предшественника, характеризующегося химической формулой (II):

где каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или метоксигруппу;

[0014] Согласно следующим предпочтительным вариантам осуществления смесь ферментов содержит первый полипептид, способный окислять (S)-ретикулин с образованием 1,2-дегидроретикулина, и второй полипептид, способный восстанавливать 1,2-дегидроретикулин с образованием (R)-ретикулина.

[0015] Согласно следующим предпочтительным вариантам осуществления первый полипептид, способный окислять бензилизохинолиновое производное с образованием окисленного бензилизохинолинового производного, представляет собой цитохром Р450, а второй полипептид, способный восстанавливать окисленное бензилизохинолиновое производное с образованием (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина, представляет собой альдокеторедуктазу (AKR).

[0016] В соответствии с настоящим раскрытием способы могут быть выполнены in vitro или in vivo, в том числе без ограничения в растениях, культурах растительных клеток, микроорганизмах и бесклеточных системах.

[0017] Кроме того, в настоящем документе представлен способ получения фермента, выбранного из группы, состоящей из CYP450 и AKR или их смеси, предусматривающий

(a) обеспечение химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей в качестве функционально связанных компонентов:

(i) одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих один или несколько полипептидов, выбранных из группы, состоящей из CYP450 и AKR; и

(ii) одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, способных контролировать экспрессию в клетке-хозяине;

(b) введение химерной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и выращивание клетки-хозяина для продуцирования полипептида, выбранного из группы, состоящей из CYP450 и AKR; и

[0018] Кроме того, в настоящем документе еще представлен способ получения (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина, характеризующегося химической формулой (II), предусматривающий

(i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид CYP450;

(ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид AKR; и

(iii) одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, способных контролировать экспрессию в клетке-хозяине;

(b) введение химерной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и выращивание клетки-хозяина для продуцирования CYP450 и AKR и для продуцирования (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина, характеризующегося химической формулой (II); и

[0019] Согласно предпочтительным вариантам осуществления первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты функционально связаны для продуцирования полипептида слияния, содержащего CYP450 и AKR.

[0020] Кроме того, в настоящем документе представлен способ получения (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина, характеризующегося химической формулой (II), предусматривающий

(а) обеспечение первой химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей в качестве функционально связанных компонентов - первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид CYP450, и первую последовательность нуклеиновой кислоты, контролирующую экспрессию первой последовательности нуклеиновой кислоты в клетке;

(b) обеспечение второй химерной последовательности, нуклеиновой кислоты, содержащей в качестве функционально связанных компонентов - вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид AKR, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, контролирующую экспрессию второй последовательности нуклеиновой кислоты в клетке;

(c) введение первой и второй химерных последовательностей нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и выращивание клетки-хозяина для продуцирования CYP450 и AKR, а также для продуцирования (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина, характеризующегося химической формулой (II); и

(d) извлечение (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина, характеризующегося химической формулой (II).

[0021] Настоящее раскрытие, кроме того, относится к композициям для получения (R)-ретикулина, включающим в себя смесь ферментов, содержащую первый полипептид, способный окислять (S)-ретикулин с образованием 1,2-дегидроретикулина, и второй полипептид, способный восстанавливать 1,2-дегидроретикулин с образованием (R)-ретикулина.

[0022] Согласно предпочтительным вариантам осуществления смесь ферментов содержит первый полипептид, способный окислять (S)-ретикулин с образованием 1,2-дегидроретикулина, и второй полипептид, способный восстанавливать 1,2-дегидроретикулин с образованием (R)-ретикулина.

[0023] Согласно следующим предпочтительным вариантам осуществления первый полипептид, способный окислять (S)-ретикулин с образованием 1,2-дегидроретикулина, представляет собой цитохром Р450, а второй полипептид, способный восстанавливать 1,2-дегидроретикулин с образованием (R)-ретикулина, представляет собой альдокеторедуктазу (AKR).

[0024] Настоящее изобретение кроме того, относится к композициям, содержащим последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие первый полипептид, способный окислять (S)-ретикулин с образованием 1,2-дегидроретикулина, и второй полипептид, способный восстанавливать 1,2-дегидроретикулин с образованием (R)-ретикулина. Согласно предпочтительным вариантам осуществления последовательностями нуклеиновой кислоты являются последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая цитохром Р450 и альдокеторедуктазу, вместе способные окислять (S)-ретикулин с образованием 1,2-дегидроретикулина, и второй полипептид, способный восстанавливать 1,2-дегидроретикулин с образованием (R)-ретикулина.

[0025] Кроме того, настоящее раскрытие относится к способам применения последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих AKR и/или CYP450, для выявления присутствия и отсутствия их в образцах, например, в образцах, содержащих растительные клетки, для модуляции экспрессии AKR и/или CYP450 в растительных клетках и других клетках, и в качестве маркера для оценивания сегрегации гена, генетически связанного с AKR и/или CYP450 в растительной популяции.

[0026] Согласно следующему варианту осуществления настоящее раскрытие относится к способу выявления присутствия или отсутствия последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей AKR и/или CYP450, предусматривающему

(a) обеспечение образца, предположительно содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую AKR и/или CYP450; и

(b) анализ образца на предмет присутствия нуклеотидной последовательности, кодирующей AKR и/или CYP450.

[0027] Согласно следующему варианту осуществления настоящее раскрытие относится к способу модуляции экспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты в клетке, в естественных условиях экспрессирующей AKR и/или CYP450, предусматривающему

(a) обеспечение клетки, в естественных условиях экспрессирующей AKR и/или CYP450;

(b) обеспечение мутагенеза клетки;

(d) определение того, содержит ли множество клеток клетку, содержащую модулированные уровни AKR и/или CYP450.

[0028] Согласно еще одному дополнительному варианту осуществления настоящее раскрытие относится к способу снижения экспрессии AKR и/или CYP450 в клетке, предусматривающему

(a) обеспечение клетки, экспрессирующей AKR и/или CYP450; и

(b) сайленсинг экспрессии AKR и/или CYP450 в клетке.

[0029] Другие признаки и преимущества настоящего раскрытия станут очевидны из следующего подробного описания. Следует понимать, однако, что подробное описание, хотя и представляет предпочтительные воплощения настоящего раскрытия, приводится исключительно в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах сущности и объема настоящего раскрытия станут очевидными специалистам в данной области из подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0030] Настоящее раскрытие представлено в следующих абзацах с помощью графических материалов. Представленные в настоящем документе графические материалы приводятся с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего раскрытия.

[0031] На фигуре 1 изображен путь синтеза различных бензилизохинолиновых предшественников (R)-ретикулина, предшественников (R)-ретикулина, морфина и салютаридина. Включены химические структуры представленных соединений.

[0032] На фигуре 2 изображен путь синтеза для получения (R)-ретикулина из (S)-ретикулина и их промежуточных соединений синтеза. Включены химические структуры промежуточных соединений синтеза и ферментов, способных катализировать химическое превращение промежуточных соединений синтеза.

[0033] На фигуре 3 изображена серия HPLC следов варианта осуществления настоящего раскрытия, представляющего превращение (S)-ретикулина в (R)-ретикулин, как описано далее в примере 1.

[0034] На фигуре 4 изображена серия HPLC следов варианта осуществления настоящего раскрытия, представляющего превращение (S)-ретикулина в 1,2-дегидроретикулин, как описано далее в примере 2.

[0035] На фигуре 5 изображена серия HPLC следов варианта осуществления настоящего раскрытия, представляющего превращение 1,2-дегидроретикулина в (R)-ретикулин, как описано далее в примере 3.

[0036] На фигуре 6 изображена серия HPLC следов варианта осуществления настоящего раскрытия, представляющего превращение (S)-N-метилкоклаурина в (R)-N-метилкоклаурин, как описано далее в примере 4.

[0037] На фигуре 7 изображены результаты, полученные в эксперименте с сайленсингом генов, как описано далее в примере 5. Целью были две разных области в гене REPI (фиг. 7А; фиг. 7С) и одна область гена COR1.3 (фиг. 7В). На каждой из фиг. 7А - 7С различные панели представляют следующее: (Панель А) Фрагмент (серая рамка) кДНК REPI или COR1.3, используемый для сборки конструкции pTRV2. Черная рамка представляет кодирующую область, тогда как черные линии представляют фланкирующие нетранслируемые области. Стрелки показывают сайты отжига праймеров, используемых для анализа qRT-PCR. (Панель В) Окрашенные бромидом этидия агарозные гели, демонстрирующие выявление pTRV2 вектора с помощью RT-PCR с использованием общей РНК, экстрагированной из отдельных растений, инфильтрованных Agrobacterium tumefaciens, содержащими конструкции pTRV2-REPI-a, pTRV2-REPI-5' или pTRV2-COR1.3, или контроль в виде пустого вектора pTRV2. PCR праймеры (TRV2-MCS) разрабатывали для отжига областей, фланкирующих сайт множественного клонирования (MCS) в pTRV2. (Панель С) Относительные уровни REPI или COR1.3 транскрипта в побегах и корнях REPI-молчащих (pTRV2-REPI-a; pRTV2-REPI-5') или COR1.3-молчащих (pRTV2-COR1.3) растений по сравнению с контролями (pTRV2). (Панель D) Полные ионные хроматограммы, показывающие профили основных алкалоидов REPI-молчащих (pTRV2-REPI-а; pRTV2-REPI-5') или COR1.3 молчащих (pRTV2-COR1.3) растений по сравнению с контролями (pTRV2). (Панель Е) Относительная представленность основных алкалоидов млечного сока и других алкалоидов, демонстрирующая пониженные уровни в REPI-молчащих (pTRV2-REPI-a; pRTV2-REPI-5') растениях или COR1.3-молчащих (pRTV2-COR1.3) растениях по сравнению с контролями (pTRV2). (Панель F) Отношение (S)-ретикулина к (R)-ретикулину в REPI-молчащих (pTRV2-REPI-a; pRTV2-REPI-5') растениях или COR1.3-молчащих (pRTV2-COR1.3) растениях по сравнению с контролями (pTRV2). Звездочки указывают на существенные различия, выявляемые с использованием двухстороннего t-критерия Стьюдента для одной выборки (р<0,05). Столбики представляют среднее ± стандартное отклонение значений, полученных в 3 технических повторностях для каждого из 6 отдельных инфильтрованных растений.

[0038] На фигуре 8 показаны результаты, полученные при оценивании активности полипептида AKR в присутствии восстанавливающих и окисляющих средств, как описано далее в примере 6. На фиг. 8А показана активность компонента 1,2-дегидроретикулинредуктазы (PsDRR) ретикулинэпимераза (REPI) Papaver somniferum. В присутствии NADH или NADPH PsDRR превращает 1,2-дегидроретикулин [1] в (R)-ретикулин [2] (фиг. 8А, панель А). В присутствии NAD⁺или NADP⁺ PsDRR превращает (R)-ретикулин [2] в 1,2-дегидроретикулин [1] (фиг. 8А, панель В). На фиг. 8В показана активность 1,2-дегидроретикулинредуктазы (PrDRR) из Papaver rhoeas. В присутствии NADH или NADPH PrDRR превращает 1,2-дегидроретикулин [1] в (R)-ретикулин [2] (фиг. 8В, панель А). В присутствии NAD⁺ или NADP⁺ PrDRR превращает (R)-ретикулин [2] в 1,2-дегидроретикулин [1] (фиг. 8В, панель В).

[0039] На фигуре 9 показаны результаты, полученные при оценивании зависимости от рН CYP450 и полипептида AKR, как описано далее в примере 7. Показаны результаты, полученные с использованием CYP450 (PsDRS) и AKR из Papaver somniferum в присутствии NADPH (прямой PsDRS) и в присутствии NADP⁺ (обратный PsDRS) (панель А). Кроме того, показаны результаты, полученные с использованием CYP450 (PrDRS) и AKR Papaver rhoeas в присутствии NADPH (прямая PrDRS) и в присутствии NADP⁺ (обратная PrDRS) (панель В].

[0040] На фигуре 10 показана косупрессия уровней REPI и COR транскрипта в растениях мака снотворного, подвергнутых индуцированному вирусом сайленсингу генов (VIGS), как описано далее в примере 8. Растения, в которых мишенью является сайленсинг COR (pTRV2-COR1.3), демонстрировали существенную супрессию COR (фиг. 10 - нижняя панель) и, кроме того, демонстрировали супрессию REPI (фиг. 10 - верхняя панель). Растения, в которых мишенью является сайленсинг REPI при использовании консервативной области, находящейся как в REPI, так и в COR (pTRV2-REPIa), также демонстрировали существенную супрессию COR (фиг. 10 - нижняя панель) и REPI (фиг. 10 - верхняя панель). Растения, в которых мишенью является сайленсинг REPI при использовании уникальной области REPI (pTRV2-REPIb), области не находящейся в COR, не показывали совместный сайленсинг COR (фиг. 10 - нижняя панель). pTRV2 представляет собой контроль в виде пустого вектора. Звездочки указывают значения, которые существенно отличаются от контролей, при использовании и t-критерия Стьюдента для одной выборки (Р<0,05). "Усы" представляют среднее ± стандартное отклонение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО РАСКРЫТИЯ

[0041] Различные композиции и способы будут описаны ниже с целью представления примера варианта осуществления каждого заявляемого объекта. Ни один вариант осуществления, описанный ниже, не ограничивает какой-либо заявляемый объект, и какой-либо заявляемый объект может охватывать способы, процессы, композиции или системы, которые отличаются от описанных ниже. Заявляемый объект не ограничивается композициями или способами, имеющими все из признаков какого-либо одного из композиции, способа, системы или процесса, описанных ниже, или признаков, общих для нескольких или всех из композиций, систем или способов, описанных ниже. Возможно, что композиция, система, способ или процесс, описанные ниже, не являются вариантом осуществления какого-либо заявляемого объекта. Каким-либо объектом, раскрытым в композиции, системе, способе или процессе, описанных ниже, которые не заявляются в настоящем документе, может быть объект другого инструмента защиты, например, продолжающейся заявки на выдачу патента, и заявители, авторы изобретения или собственники не намерены отказываться, не признавать или передавать в общественное пользование любой такой объект путем его раскрытия в настоящем документе.

[0042] Следует отметить, что термины степени, такие как "значительно", "в основном", "приблизительно" и "около", используемые в настоящем документе, означают приемлемое количественное отклонение модифицированного термина так, что конечный результат изменяется не значительно. Эти термины степени должны быть истолкованы как включающие в себя отклонение модифицированного термина, если это отклонение не будет отрицать значение термина, которое он модифицирует.

[0043] Используемое в настоящем документе выражение "и/или" представляет включающее "или". То есть "X и/или Y" означает, например, X или Y, или и то, и другое. В качестве дополнительного примера, "X, Y и/или Z" означает X, или Y, или Z, или любую их комбинацию.

[0044] Все публикации, патенты и заявки на выдачу патентов включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте в той же степени, как если бы была включена каждая отдельная публикация.

[0045] Как упомянуто выше, настоящее раскрытие относится ко вторичному метаболиту (R)-ретикулину и его предшественникам, а также к способам получения (R)-ретикулина и его предшественников. Настоящее раскрытие, кроме того, относится к некоторым ферментам, способным катализировать реакциям, приводящим к превращению (S)-ретикулина с образованием (R)-ретикулина. В настоящем документе представлены способы, представляющие новые и эффективные средства для изготовления (R)-ретикулина и его предшественников. Способы, представленные в настоящем документе, не основываются на химическом синтезе и могут быть проведены в коммерческом масштабе. Насколько известно авторам настоящего изобретения, настоящее раскрытие относится к первому методу изготовления (R)-ретикулина и его предшественников с использованием живых клеток, обычно не способных синтезировать (R)-ретикулин и его предшественников. Такие клетки могут быть использованы в качестве источника, откуда (R)-ретикулин и его предшественники могут быть экономически выгодно экстрагированы. (R)-Ретикулин и его предшественники, полученные в соответствии с настоящим раскрытием, применимы inter alia в изготовлении фармацевтических композиций, включающих в себя морфин и кодеин.

[0046] Следовательно, настоящее раскрытие представляет, по меньшей мере в одном аспекте, по меньшей мере один вариант осуществления способа получения (R)-ретикулина или его предшественника, предусматривающего

(a) обеспечение бензилизохинолинового производного;

[0047] Настоящее раскрытие, кроме того, обеспечивает, по меньшей мере в одном аспекте, по меньшей мере один вариант осуществления способа получения (R)-ретикулина или предшественника, (R)-ретикулина, предусматривающего

(a) обеспечение бензилизохинолинового производного;

где бензилизохинолиновое производное характеризуется химической формулой (I):

где каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или метоксигруппу;

и где R₅ представляет собой атом водорода или метильную группу; и где предшественник (R)-ретикулина характеризуется химической формулой:

где каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или метоксигруппу;

и где R₅ представляет собой атом водорода или метильную группу.

Определения

[0048] Термин "бензилизохинолиновое производное", используемый в настоящем документе, относится к соединениям, характеризующимся химической формулой (VII):

где каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ независимо или одновременно представляет собой атом водорода, гидроксильную группу, алкильную группу (например, C₁-C₁₀-алкил) или алкоксигруппу (например, C₁-С₁₀-алкокси), и где R₅ представляет собой атом водорода или алкильную группу (например, C₁-C₁₀-алкил).

[0049] Термин "предшественник (R)-ретикулина", используемый в настоящем документе, относится к соединению, характеризующемуся химической формулой (VIII):

где каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ независимо или одновременно представляет собой атом водорода, гидроксильную группу, алкильную группу (например, C₁-С₁₀-алкил) или алкоксигруппу (например, C₁-С₁₀-алкокси), и где R₅ представляет собой атом водорода или алкильную группу (например, C₁-С₁₀-алкил), и где согласно предпочтительным вариантам осуществления R₅ представляет собой атом водорода или алкильную группу, при условии, что химическая формула (VIII) исключает (R)-ретикулин, т.е. специально исключенным из термина "предшественник (R)-ретикулина", используемого в настоящем документе, является химические соединение, где R₁ представляет собой метоксигруппу; R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой гидроксильную группу, R₄ представляет собой метоксигруппу, и R₅ представляет собой метильную группу.

[0050] Термин "(S)-ретикулин", используемый в настоящем документе, относится к (S)-энантиомеру ретикулина и химическому соединению с химической структурой (III):

[0051] Термин "окисленное бензилизохинолиновое производное" относится к соединению, характеризующемуся химической формулой (IX):

где каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ независимо или одновременно представляет собой атом водорода, гидроксильную группу, алкильную группу (например, С₁-С₁₀-алкил) или алкоксигруппу (например, C₁-C₁₀-алкокси), и где R₅ представляет собой атом водорода или алкильную группу (например, C₁-С₁₀-алкил).

[0052] Термин "(R)-ретикулин", используемый в настоящем документе, относится к (R)-энантиомеру ретикулина и химическому соединению с химической структурой (V):

[0053] Термин "1,2-дегидроретикулин", используемый в настоящем документе, относится к химическому соединение с химической структурой (VI):

[0054] Термины "путь (R)-ретикулина" или "путь синтеза (R)-ретикулина", как может быть использовано взаимозаменяемо в настоящем документе, относятся к метаболическому пути синтеза (R)-ретикулина, изображенному на фиг. 1. Если первое химическое соединение в пути (R)-ретикулина называют "вторым химическим соединением в пути", это означает в настоящем документе, что синтез первого химического соединения предшествует синтезу второго химического соединения. Наоборот, если первое химическое соединение называют "последующим" от второго химического соединения в пути (R)-ретикулина, это означает в настоящем документе, что синтез второго химического соединения предшествует синтезу первого химического соединения.

[0055] Термин "смесь ферментов", используемый в настоящем документе, относится к смеси, содержащей один, или два, или более ферментов. Следует отметить, что в смесях, содержащих два или более ферментов, ферменты могут быть независимо биологически активными без взаимодействия или взаимосвязи для образования смеси. Согласно одному варианту осуществления ферменты, содержащиеся в смеси ферментов, могут ассоциироваться или взаимодействовать как независимые неперекрывающиеся полипептидные цепи. Согласно другому варианту осуществления смесь ферментов может быть получена как полипептид слияния двух полипептидов.

[0056] Термины "цитохром Р450", "CYP450" или "Р450", которые могут быть использованы взаимозаменяемо в настоящем документе, относятся к любому и всем ферментам, содержащим последовательность аминокислотных остатков, которые (i) в значительной степени идентичны аминокислотным последовательностям, составляющим любой полипептид CYP450, изложенный в настоящем документе, в том числе, например, в SEQ. ID NO: 219 - SEQ. ID NO: 321; SEQ. ID NO: 325; и SEQ. ID NO: 338, или (ii) кодируются последовательностью нуклеиновой кислоты, способной к гибридизации по меньшей мере при умеренно жестких условиях с любой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей любой полипептид CYP450, изложенный в настоящем документе, но для применения синонимичных кодонов.

[0057] Термины "альдокеторедуктаза" или "AKR", которые могут быть использованы взаимозаменяемо в настоящем документе в отношении любого и всех ферментов, содержащих последовательность аминокислотных остатков, которые (i) в значительной степени идентичны аминокислотным последовательностям, составляющим любой полипептид AKR, изложенный в настоящем документе, в том числе, например, в SEQ. ID NO: 59 - SEQ. ID NO: 115; SEQ. ID NO: 327; SEQ. ID NO: 329; SEQ. ID NO: 330; и SEQ. ID NO: 340, или (ii) кодируются последовательностью нуклеиновой кислоты, способной к гибридизации по меньшей мере при умеренно жестких условиях с любой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей любой полипептид AKR, изложенный в настоящем документе, но для применения синонимичных кодонов.

[0058] Термин "последовательность нуклеиновой кислоты", используемый в настоящем документе, относится к последовательности нуклеозидных или нуклеотидных мономеров, состоящих из оснований природного происхождения, Сахаров и связей между сахарами (скелетных). Термин также включает в себя модифицированные или замещенные последовательности, содержащие мономеры или их части природного происхождения. Последовательностями нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим раскрытием могут быть последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или последовательности рибонуклеиновой кислоты (РНК) и могут включать в себя основания природного происхождения, в том числе аденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил. Последовательности также могут содержать модифицированные основания. Примеры таких модифицированных оснований включают в себя аза- и деазааденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил, а также ксантин и гипоксантин.

[0059] Используемые в настоящем документе взаймозаменяемо термины "последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CYP450" и "последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид CYP450" относятся к любым и всем последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептид CYP450, в том числе, например, SEQ. ID NO: 116 - SEQ. ID NO: 218; SEQ. ID NO: 324 и SEQ. ID NO: 337. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид CYP450, дополнительно включают в себя любые и все последовательности нуклеиновой кислоты, которые (i) кодируют полипептиды, которые в значительной степени идентичны последовательностям полипептида CYP450, изложенным в настоящем документе; или (ii) гибридизируются с любыми последовательностями нуклеиновой кислоты CYP450, изложенными в настоящем документе, по меньшей мере при умеренно жестких условиях гибридизации, или которые будут гибридизироваться с ними по меньшей мере при умеренно жестких условиях, но для применения синонимичных кодонов.

[0060] Используемые в настоящем документе взаимозаменяемо термины "последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая AKR" и "последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид AKR" относятся к любым и всем последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептид AKR, в том числе, например, SEQ. ID NO: 1 - SEQ. ID NO: 58; SEQ. ID NO: 326; SEQ. ID NO: 328; и SEQ. ID NO: 339. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид AKR, дополнительно включают в себя любые и все последовательности нуклеиновой кислоты, которые (i) кодируют полипептиды, которые в значительной степени идентичные последовательностям полипептида AKR, изложенным в настоящем документе; или (ii) гибридизируются с любыми последовательностями нуклеиновой кислоты AKR, изложенными в настоящем документе, по меньшей мере при умеренно жестких условиях гибридизации, или которые будут гибридизироваться с ними по меньшей мере при умеренно жестких условиях, но для применения синонимичных кодонов.

[0061] Термин "в значительной степени идентичные" означает, что две полипептидные последовательности предпочтительно по меньшей мере идентичны на 70%, более предпочтительно идентичны по меньшей мере на 85% и наиболее предпочтительно идентичны по меньшей мере на 95%, например, идентичны на 96%, 97%, 98% или 99%. Для определения процентного отношения идентичности двух полипептидных последовательностей выравнивают аминокислотные последовательности таких двух последовательностей с использованием, например, способа выравнивания Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443] с поправками Smith и Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482), так, что наивысший порядок совпадения достигается для двух последовательностей и число одинаковых аминокислот определяют для двух последовательностей. В уровне техники широко известны способы вычисления процентного отношения идентичности двух аминокислотных последовательностей, и они включают, например, способы, которые описаны Carillo и Lipton (SIAM J. Applied Math., 1988, 48: 1073) и которые описаны в Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects. Как правило, для таких вычислений используют компьютерные программы. Компьютерные программы, которые можно использовать с этой целью, включают в себя без ограничения GCG (Devereux et al., Nucleic Acids Res., 1984, 12: 387) BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul et al., J. Molec. Biol., 1990: 215: 403). Особенно предпочтительный способ определения процентного отношения идентичности двух полипептидов предусматривает алгоритм Clustal W (Thompson, J D, Higgines, D G and Gibson T J, 1994, Nucleic Acid Res 22(22): 4673-4680, вместе с матрицей для количественного подсчета BLOSUM 62 (Henikoff S & Henikoff, J G, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, с использованием штрафа для создания разрыва, составляющего 10, и штрафа для удлинения разрыва, составляющего 0,1, так, что наивысший порядок совпадения достигается для двух последовательностей при включении в выравнивание по меньшей мере 50% общей длины одной из двух последовательностей.

[0062] Под "по меньшей мере умеренно жесткими условиями гибридизации" подразумевают, что выбраны условия, которые способствуют избирательной гибридизации двух комплементарных молекул нуклеиновых кислот в растворе. Гибридизация может происходить с полноразмерной или с частичной последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты. Как правило, длина гибридизующегося участка составляет по меньшей мере 15 (например, 20, 25, 30, 40 или 50) нуклеотидов. Специалисты в данной области понимают, что стабильность дуплекса нуклеиновых кислот, или гибридов, определяется величиной Тm, которая в содержащих натрий буферах является функцией концентрации ионов натрия и температуры (Tm=81,5°С-16,6(Log10[Na+])+0,41(%(G+C)-600/л), или сходное уравнение). Соответственно, параметры для условий отмывки, определяющие стабильность гибрида, представляют собой концентрацию ионов натрия и температуру. При выявлении сходных, но не идентичных молекул в случае известной молекулы нуклеиновой кислоты можно допустить, что несоответствие величиной 1% приводит приблизительно к снижению Tm на 1°С, например, если ищут молекулы нуклеиновых кислот, совпадающие на >95%, температуру конечной промывки снижают приблизительно на 5°С. На основе этих расчетов специалисты в данной области смогут легко выбрать надлежащие условия гибридизации. Согласно предпочтительным вариантам осуществления выбирают жесткие условия гибридизации. Например, для достижения строгой гибридизации можно использовать следующие условия: гибридизация в 5× хлорид натрия/цитрат натрия (SSC)/5× раствор Денхардта/1,0% SDS при Tm - 5°С на основе указанного выше уравнения, с последующей промывкой в 0,2× SSC/0,1% SDS при 60°С. Умеренно жесткие условия гибридизации предусматривают стадию промывки в 3 × SSC при 42°С. Однако следует понимать, что эквивалентную жесткость условий можно достигать с применением альтернативных буферов, солей и температур. Дополнительное руководство относительно условий гибридизации можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1.-6.3.6, и в Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol. 3.

[0063] Термин "химерный", используемый в настоящем документе в контексте последовательностей нуклеиновой кислоты, относится по меньшей мере к двум связанным последовательностям нуклеиновой кислоты, которые в естественных условиях не связываются. Химерные последовательности нуклеиновой кислоты включают в себя связанные последовательности нуклеиновой кислоты различных природных источников. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, составляющая дрожжевой промотор, связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей COR белок, считают химерной. Химерные последовательности нуклеиновой кислоты также могут содержать последовательности нуклеиновой кислоты одного и того же природного источника, при условии, что они не связываются естественным образом. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, составляющая промотор, полученный из конкретного типа клеток, может быть связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, полученный из того же типа клеток, но обычно не связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, составляющей промотор. Химерные последовательности нуклеиновой кислоты также включают в себя последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие любую встречающуюся в природе последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с любой не встречающейся в природе последовательностью нуклеиновой кислоты.

[0064] Термины "в значительной степени чистый" и "выделенный", которые могут быть использованы взаимозаменяемо в настоящем документе, описывают соединение, например, промежуточное соединение пути синтеза или полипептид, которые были отделены от компонентов, сопровождающих их естественным образом. Как правило, соединение является в значительной степени чистым, если по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97% или 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% всего материала (по объему, по влажной или сухой массе, или по мольному проценту или мольной доли) в образце составляет представляющее интерес соединение. Чистота может быть измерена любым приемлемым способом, например, в случае полипептидов, анализом с помощью хроматографии, гель-электрофореза или HPLC.

[0065] Термин "извлеченный", используемый в настоящем документе в связи с ферментом или белком, относится к более или менее чистой форме фермента или белка.

[0066] Термин "in vivo", используемый в настоящем документе для описания способов получения (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина, относится к введению в контакт бензилизохинолинового производного с ферментом, способным катализировать превращение бензилизохинолинового производного в живой клетке, в том числе, например, в микробной клетке или растительной клетке, с образованием (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина.

[0067] Термин "in vitro", используемый в настоящем документе для описания способов получения (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина, относится к введению в контакт бензилизохинолинового производного с ферментом, способным катализировать превращение бензилизохинолинового производного в окружающей среде вне живой клетки, в том числе без ограничения, например, в микролуночном планшете, пробирке, колбе, стакане, емкости, реакторе и т.п., с образованием (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина.

Общее осуществление

Синтез (R)-ретикулина и предшественников (R)-ретикулина

[0068] Настоящее раскрытие относится по меньшей мере в одном аспекте по меньшей мере к одному варианту осуществления получения (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина, предусматривающему

(a) обеспечение бензилизохинолинового производного;

где бензилизохинолиновое производное характеризуется химической формулой (I):

где каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ представляет собой атом водорода,

гидроксильную группу или метоксигруппу;

и где R₅ представляет собой атом водорода или метильную группу; и

где предшественник (R)-ретикулина характеризуется химической формулой (II):

где каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или метоксигруппу;

[0069] Согласно предпочтительному варианту осуществления бензилизохинолиновым производным (I) является производное, где R₁ представляет собой метоксигруппу, R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой атом водорода или гидроксильную группу, R₄ представляет собой гидроксильную группу или метоксигруппу, и R₅ представляет собой атом водорода или метильную группу.

[0070] Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления бензилизохинолиновым производным (I) является производное, где R₁ представляет собой метоксигруппу, R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой атом водорода, R₄ представляет собой гидроксильную группу, и R₅ представляет собой атом водорода. Это соединение также известно как (S)-коклаурин (см. фиг. 1).

[0071] Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления бензилизохинолиновым производным (I) является производное, где R₁ представляет собой метоксигруппу, R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой атом водорода, R₄ представляет собой гидроксильную группу, и R₅ представляет собой метильную группу. Это соединение также известно как (S)-N-метил-коклаурин (см. фиг. 1).

[0072] Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления бензилизохинолиновым производным (I) является производное, где R₁ представляет собой метоксигруппу, R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой гидроксильную группу, R₄ представляет собой гидроксильную группу, и R₅ представляет собой метильную группу. Это соединение также известно как (S)-3'-гидрокси-N-метилкоклаурин (см. фиг. 1).

[0073] Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления бензилизохинолиновым производным (I) является производное, где R₁ представляет собой метоксигруппу, R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой гидроксильную группу, R₄ представляет собой метоксигруппу, и R₅ представляет собой метильную группу. Это соединение также известно как (S)-ретикулин (см. фиг. 1; соединение (III)).

[0074] Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления производным (R)-ретикулина (II) является производное, где R₁ представляет собой метоксигруппу, R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой атом водорода или гидроксильную группу, R₄ представляет собой гидроксильную группу, и R₅ представляет собой метильную группу.

[0075] Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления производным (R)-ретикулина (II) является производное, где R₁ представляет собой метоксигруппу, R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой атом водорода, R₄ представляет собой гидроксильную группу, и R₅ представляет собой метильную группу. Это соединение также известно как (R)-N-метилкоклаурин (см. фиг. 1).

[0076] Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления производным (R)-ретикулина (II) является производное, где R₁ представляет собой метоксигруппу, R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой гидроксильную группу, R₄ представляет собой гидроксильную группу, и R₅ представляет собой метильную группу. Это соединение также известно как (R)-3'-гидрокси-N-метилкоклаурин (см. фиг. 1).

[0077] Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления бензилизохинолиновым производным (I) является производное, где R₁ представляет собой метоксигруппу, R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой атом водорода, R₄ представляет собой гидроксильную группу, и R₅ представляет собой метильную группу; а производным (R)-ретикулина (II) является производное, где R₁ представляет собой метоксигруппу, R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой атом водорода, R₄ представляет собой гидроксильную группу, и R₅ представляет собой метильную группу.

[0078] Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления бензилизохинолиновым производным (I) является производное, где R₁ представляет собой метоксигруппу, R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой гидроксильную группу, R₄ представляет собой гидроксильную группу, и R₅ представляет собой метильную группу; а производным (R)-ретикулина (II) является производное, где R₁ представляет собой метоксигруппу, R₂ представляет собой гидроксильную группу, R₃ представляет собой гидроксильную группу, R₄ представляет собой гидроксильную группу, и R₅ представляет собой метильную группу.

[0079] Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего раскрытия представлен способ получения (R)-ретикулина, предусматривающий

(a) обеспечение (S)-ретикулина и

(b) введение в контакт (S)-ретикулина со смесью ферментов, способных превращать (S)-ретикулин в (R)-ретикулин при условиях, которые допускают превращение (S)-ретикулина в (R)-ретикулин.

[0080] Согласно предпочтительным вариантам осуществления смесь ферментов содержит первый полипептид, способный окислять (S)-ретикулин с образованием 1,2-дегидроретикулина, и второй полипептид, способный восстанавливать 1,2-дегидроретикулин с образованием (R)-ретикулина (см. фиг. 2).

[0081] Согласно предпочтительным вариантам осуществления смесь ферментов содержит первый полипептид, способный окислять бензилизохинолиновое производное (I) с образованием окисленного бензилизохинолинового производного, характеризующегося химической формулой (IV):

где согласно предпочтительным вариантам осуществления каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или метоксигруппу; и где согласно предпочтительным вариантам осуществления R₅ представляет собой атом водорода или метильную группу; и второй полипептид, способный восстанавливать окисленное бензилизохинолиновое производное, характеризующееся химической формулой (IV), с образованием (R)-ретикулина или производного (R)-ретикулина, характеризующегося химической формулой (II), где каждый R₁, R₂, R₃ и R₄ представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или метоксигруппу; и где R₅ представляет собой атом водорода или метильную группу, при условии, что химическая формула (II) исключает (R)-ретикулин.

[0082] Согласно предпочтительным вариантам осуществления первый полипептид, способный окислять бензилизохинолиновое производное (I) с образованием окисленного бензилизохинолинового производного (IV), представляет собой цитохром Р450, а второй полипептид, способный восстанавливать окисленное бензилизохинолиновое производное с образованием (R)-ретикулина или производного (R)-ретикулина представляет собой альдокеторедуктазу (AKR). Согласно особенно предпочтительным вариантам осуществления полипептиды AKR являются полученными или получаемыми из P. somniferum, P. bracteatum и P. rhoeas.

[0083] Согласно некоторым вариантам осуществления первый и второй полипептиды представлены в форме двух отдельных полипептидов, т.е. полипептидов, которые не соединены ковалентными химическими связями. Согласно некоторым предпочтительным вариантам осуществления первый и второй полипептиды получают как полипептид слияния, содержащий первую часть, кодирующую полипептид CYP450, и вторую часть, кодирующую полипептид AKR. Такой полипептид слияния может быть получен рекомбинантно, или он может быть встречающимся в природе полипептидом слияния, который может быть использован, таким как полипептид Papaver somniferum, изложенный в SEQ. ID NO: 323.

[0084] Примеры полипептида CYP450, который может быть использован в соответствии с настоящим раскрытием, включают в себя полипептиды, изложенные в SEQ. ID NO: 219 - SEQ. ID NO: 321; SEQ. ID NO: 325; и SEQ. ID NO: 338. Примеры полипептидов AKR, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим раскрытием, включают в себя полипептиды, изложенные в SEQ. ID NO: 59 - SEQ. ID NO: 115; SEQ. ID NO: 327; SEQ. ID NO: 329; SEQ. ID NO: 330 и SEQ. ID NO: 340.

[0085] Вышеупомянутые реакции выполняют при условиях, допускающих превращение бензилизохинолинового предшественника в (R)-ретикулин или предшественник (R)-ретикулина. Условия включают в себя in vivo или in vitro условия, как далее описывается с дополнительными подробностями. Как правило, условия дополнительно включают в себя присутствие воды и буферных средств. Как правило, дополнительно предусматривается восстановитель для обеспечения реакции восстановления, приводящей к превращению окисленного бензилизохинолинового предшественника в (R)-ретикулин или в предшественник (R)-ретикулина. Восстановителем может быть никотинамидадениндинуклеотид (NADH), и согласно другим вариантам осуществления восстановителем является никотинамидадениндинуклеотид фосфат (NADPH). Как правило, дополнительно включены в реакцию редуктаза, способная восстанавливать фермент, превращающий бензилизохинолиновое производное в окисленный бензилизохинолин, и восстановитель. Согласно предпочтительным вариантам осуществления редуктазой является редуктаза цитохрома Р450, такая как, например, редуктаза цитохрома Р450 мака снотворного, способная восстанавливать CYP450, а восстановителем является NADH или более предпочтительно NADPH. Кроме того, следует отметить, что реакции могут быть выполнены при различных рН, например, при приблизительно рН 3, рН 4, рН 5, рН 6, рН 7, рН 8, рН 9 или рН 10. Специалисту в данной области будет очевидно, что оптимальный рН может быть идентифицирован для реакции путем проведения реакции с диапазоном различных рН и оценивания скорости реакции, как показано в примере 7 в настоящем документе. Оптимальный рН может варьировать, например, в зависимости от субстрата и фермента, выбранных в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, исключительно в качестве примера, в примере 7 подтверждают оптимальный рН приблизительно рН 8 для превращения (S)-ретикулина в 1,2-дегидроретикулин, оптимальный рН приблизительно рН 7 для "превращения 1,2-дегидроретикулина в (R)-ретикулин и оптимальный рН приблизительно рН 9 для превращения (R)-ретикулина в 1,2-дегидроретикулин.

[0086] Следует отметить, что в соответствии с настоящим, в зависимости от выбранных условий реакции реакция, предусматривающая превращение 1,2-дегидроретикулина в (R)-ретикулин, может быть обратимой или частично обратимой. Таким образом, как подтверждено в примере 6, (R)-ретикулин может быть превращен в 1,2-дегидроретикулин. Следовательно, настоящее раскрытие, кроме того, относится к способу получения 1,2-дегидроретикулина, предусматривающему

(a) обеспечение (R)-ретикулина и

(b) введение в контакт (R)-ретикулина с полипептидом AKR, способным превращать (R)-ретикулин в 1,2-дегидроретикулин, при условиях, которые допускают превращение (R)-ретикулина в 1,2-дегидроретикулин. Полипептиды AKR, которые могут быть использованы для проведения вышеупомянутой реакции, включают в себя любой полипептид, изложенный в SEQ. ID NO: 59 - SEQ. ID NO: 115; SEQ. ID NO: 327; SEQ. ID NO: 329; SEQ. ID NO: 330 и SEQ. ID NO: 340. Условия реакции, допускающие превращение, включают в себя присутствие в реакционной смеси окислителя, предпочтительно NAD⁺ или NADP⁺. Как отмечено выше, рН для реакции может быть оптимизирован. Обратимость вышеупомянутой реакции далее иллюстрируется на фиг. 2.

[0087] Согласно предпочтительным вариантам осуществления первый полипептид способный, окислять бензилизохинолиновое производное с образованием окисленного бензилизохинолинового производного, представляет собой цитохром Р450, а второй полипептид, способный восстанавливать окисленное бензилизохинолиновое производное с образованием (R)-ретикулина или производного (R)-ретикулина представляет собой альдокеторедуктазу (AKR). Согласно особенно предпочтительным вариантам осуществления AKR является полученной или получаемой из P. somniferum, P. bracteatum и P. rhoeas.

[0088] Согласно некоторым вариантам осуществления первый и второй полипептиды представлены в форме двух отдельных полипептидов, т.е. полипептидов, которые не соединены ковалентными химическими связями. Согласно некоторым предпочтительным вариантам осуществления первый и второй полипептиды получают как полипептид слияния, содержащий первую часть, кодирующую полипептид CYP450, и вторую часть, кодирующую полипептид AKR. Такой полипептид слияния может быть получен рекомбинантно, или он может быть встречающимся в природе полипептидом слияния, который может быть использован, таким как полипептид Papaver somniferum, изложенный в SEQ. ID NO: 323.

[0089] Примеры полипептида CYP450, который может быть использован в соответствии с настоящим раскрытием, включают в себя полипептиды CYP450, получаемые из различных видов Papaver, в том числе Papaver somniferum, Papaver rhoeas и Papaver bracteatum; видов Argemone, в том числе Argemone mexicana; видов Berberis, в том числе Berberis thunbergii; видов Corydalis, в том числе Corydalis chelantifolia; видов Chelidonium, в том числе, Chelidonium majus; видов Cissampelos, в том числе Cissampelos mucronata; видов Cocculus, в том числе Cocculus trilobus; видов Corydalis, в том числе Corydalis chelantifolia; видов Glaucium, в том числе Glaucium flavum; видов Hydrastis, в том числе Hydrastis canadensis; видов Jeffersonia, в том числе Jeffersonia diphylla; видов Mahonia, в том числе Mahonia aquifolium; видов Menispermum, в том числе Menispermum canadense; видов Nandina, в том числе Nandina domestica; видов Nigella, в том числе Nigella sativa; видов Sanguinaria, в том числе Sanguinaria canadensis; видов Styplophorum, Stylophorum diphyllum, видов Thalictrum, в том числе Thalictrum flavum; видов Tinospora, в том числе Tinospora cordifolia; и видов Xanthoriza, в том числе Xanthoriza simplicissima. Вышеупомянутые специально включают в себя полипептиды из вышеупомянутых видов, изложенные в настоящем документе в SEQ. ID NO: 219 - SEQ. ID NO: 321; SEQ. ID NO: 325 и SEQ. ID NO: 338. Примеры полипептида AKR, который может быть использован в соответствии с настоящим раскрытием, включают в себя полипептиды AKR, получаемые из различных видов Papaver, в том числе Papaver somniferum, Papaver rhoeas и Papaver bracteatum; видов Argemone, в том числе Argemone mexicana; видов Berberis, в том числе Berberis thunbergii; видов Corydalis, в том числе Corydalis chelantifolia; видов Chelidonium, в том числе, Chelidonium majus; видов Cissampelos, в том числе Cissampelos mucronata; видов Cocculus, в том числе Cocculus trilobus; видов Corydalis, в том числе Corydalis chelantifolia; видов Glaucium, в том числе Glaucium flavum; видов Hydrastis, в том числе Hydrastis canadensis; видов Jeffersonia, в том числе Jeffersonia diphylla; видов Mahonia, в том числе Mahonia aquifolium; видов Menispermum, в том числе Menispermum canadense; видов Nandina, в том числе Nandina domestica; видов Nigella, в том числе Nigella sativa; видов Sanguinaria, в том числе Sanguinaria canadensis; видов Styplophorum, Stylophorum diphyllum, видов Thalictrum, в том числе Thalictrum flavum; видов Tinospora, в том числе Tinospora cordifolia; и видов Xanthoriza, в том числе Xanthoriza simplicissima. Вышеупомянутые специально включают в себя полипептиды из вышеупомянутых видов, изложенные в настоящем документе в SEQ. ID NO: 59 - SEQ. ID NO: 115; SEQ. ID NO: 327; SEQ. ID NO: 329; SEQ. ID NO: 330 и SEQ. ID NO: 340.

[0090] Вышеупомянутые реакции выполняют при условиях, допускающих превращение бензилизохинолинового предшественника в (R)-ретикулин или предшественник (R)-ретикулина. Условия включают в себя условия in vivo или in vitro, как далее описывается с дополнительными подробностями. Как правило, условия дополнительно включают в себя присутствие воду и буферных средств. Как правило, дополнительно предусматривается восстановитель для обеспечения реакции восстановления, приводящей к превращению окисленного бензилизохинолинового предшественника в (R)-ретикулин или в предшественник (R)-ретикулина. Восстановителем может быть никотинамидадениндинуклеотид (NADH), и согласно другим вариантам осуществления восстановителем является никотинамидадениндинуклеотид фосфат (NADPH). Как правило, дополнительно включены в реакцию редуктаза, способная восстанавливать фермент, превращающий бензилизохинолиновое производное в окисленный бензилизохинолин, и восстановитель. Согласно предпочтительным вариантам осуществления редуктазой является редуктаза цитохрома Р450, способная восстанавливать CYP450, а восстановителем является NADH или более предпочтительно NADPH.

In vitro синтез (R)-ретикулина или производных (R)-ретикулина

[0091] В соответствии с некоторыми аспектами настоящего раскрытия бензилизохинолиновое производное приводят в контакт с каталитическими количествами ферментов CYP450 и AKR при условиях реакции, допускающих ферментативный катализ химического превращения бензилизохинолинового производного при условиях in vitro реакции. При таких условиях in vitro реакции исходные составляющие реакции представляют в более или менее чистой форме и смешивают при условиях, которые допускают протекание нужных химических реакций в значительной степени. В значительной степени чистые формы исходного бензилизохинолинового производного могут быть приобретены. (S)-Ретикулин при необходимости, например, может быть приобретен (например, у Santa Cruz Biotechnology Inc.) в виде в значительной степени чистого химического соединения, химическим путем синтезированного из соединений предшественников, или выделенного из природных источников, в том числе из Papaver somniferum и других представителей семейств растений Papaveraceae, Lauraceae, Annonaceae, Euphorbiaceae или Moraceae, содержащих такие соединения. Приемлемые представители Papaveraceae включают в себя без ограничения виды, принадлежащие к родам Papaver, Corydalis; Chelidonium и Romeria. Такие виды могут быть способны продуцировать (S)-ретикулин, в том числе без ограничения виды растений, выбранные из видов Chelidonium majus; Corydalis bulbosa; Corydalis cava; Corydalis ochotenis; Corydalis ophiocarpa; Corydalis platycarpa; Corydalis tuberosa; Papaver armeniacum; Papaver Bracteatum; Papaver cylindricum; Papaver decaisnei; Papaver fugax; Papaver oreophyllum; Papaver orientale; Papaver paeonifolium; Papaver persicum; Papaver pseudo-orientale; Papaver rhoeas; Papaver rhopalothece; Papaver setigerum; Papaver somniferum; Papaver tauricolum; Papaver triniaefolium и Romeria carica. Химический синтез (S)-ретикулина может быть осуществлен с использованием стандартных способов, описанных, например, в S. Teitel and A. Bross, Journal of Heterocyclic Chemistry 5,825-829, 1968.

[0092] В соответствии с настоящим изобретением более или менее чистые формы ферментов могут быть выделены из природных Источников, в том числе без ограничения из Papaver somniferum, Papaver bracteatum и Papaver rhoeas, или они могут быть получены рекомбинантно или синтетически. Таким образом, в настоящем документе, кроме того, представлен способ получения фермента, выбранного из группы, состоящей из CYP450 и AKR или их смеси, предусматривающий

(i) одну или обе последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие один или несколько полипептидов, выбранных из группы, состоящей из CYP450 и AKR; и

[0093] Последовательность нуклеиновой кислоты может быть получена из любого природного источника, например, растительного источника, содержащего такие последовательности. Предпочтительные растительные источники включают в себя виды Papaver, в том числе, Papaver somniferum, Papaver rhoeas и Papaver bracteatum; виды Argemone, в том числе Argemone mexicana; виды Berberis, в том числе Berberis thunbergii; виды Corydalis, в том числе Corydalis chelantifolia; виды Chelidonium, в том числе, Chelidonium majus; виды Cissampelos, в том числе Cissampelos mucronata; виды Cocculus, в том числе Cocculus trilobus; виды Corydalis, в том числе Corydalis chelantifolia; виды Glaucium, в том числе Glaucium flavum; виды Hydrastis, в том числе Hydrastis canadensis; виды Jeffersonia, в том числе Jeffersonia diphylla; виды Mahonia, в том числе Mahonia aquifolium; виды Menispermum, в том числе Menispermum canadense; виды Nandina, в том числе Nandina domestica; виды Nigella, в том числе Nigella sativa; виды Sanguinaria, в том числе Sanguinaria canadensis; виды Styplophorum, Stylophorum diphyllum, виды Thalictrum, в том числе Thalictrum flavum; виды Tinospora, в том числе Tinospora cordifolia; и виды Xanthoriza, в том числе Xanthoriza simplicissima. В отношении CYP450 последовательности нуклеиновой кислоты, получаемые или полученные из вышеупомянутых видов растений, включают в себя последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в SEQ. ID NO: 116 - SEQ. ID NO: 218; SEQ. ID NO: 324 и SEQ. ID NO: 337. В отношении AKR последовательности нуклеиновой кислоты, получаемые или полученные из вышеупомянутых видов растений, включают в себя последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в SEQ. ID NO: 1 - SEQ. ID NO: 58; SEQ. ID NO: 326; SEQ. ID NO: 328 и SEQ. ID NO: 339. Согласно следующим предпочтительным вариантам осуществления может быть использована последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая натуральный полипептид слияния из CYP450 и AKR, в том числе последовательность нуклеиновой кислоты, изложенная в настоящем документе в SEQ. ID NO: 322.

[0094] Выращивание клеток-хозяев приводит к продуцированию полипептидов CYP450 и/или AKR. Затем полипептиды могут быть извлечены, выделены и отделены от других компонентов клетки-хозяина рядом различных методик очистки белка, в том числе, например, ионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография, аффинная хроматография, хроматография с гидрофобным взаимодействием, обращенно-фазовая хроматография, гель-фильтрация и т.п. Дополнительное общее руководство в отношении очистки белков можно найти, например, в Cutler, P. Protein Purification Protocols, Humana Press, 2004, Second Ed. Таким образом, могут быть получены в значительной степени чистые препараты полипептидов CYP450 и/или AKR.

[0095] В соответствии с настоящим изобретением бензилизохинолиновое производное приводят в контакт с каталитическими количествами одного или нескольких ферментов CYP450 и AKR при условиях реакции, допускающих ферментативный катализ химического превращения бензилизохинолинового производного. Согласно предпочтительным вариантам осуществления средства приводят в контакт друг с другом и смешивают с образованием смеси. Согласно предпочтительным вариантам осуществления смесью является водная смесь, содержащая воду и, кроме того, необязательно дополнительные средства для облегчения ферментативного катализа, в том числе буферные средства, соли, рН-модифицирующие средства. Как упомянуто выше, особенно предпочтительным является то, что реакционная смесь содержит NADPH и редуктазу. Реакция может быть осуществлена в диапазоне различных температур. Согласно предпочтительным вариантам осуществления реакцию выполняют при температуре от около 18°С до около 37°С. По завершении in vitro реакции (R)-ретикулин или предшественник (R)-ретикулина может быть получен в более или менее чистой форме.

In vivo синтез (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина

[0096] В соответствии с некоторыми аспектами настоящего раскрытия бензилизохинолиновое производное приводят в контакт с каталитическими количествами одного или нескольких из ферментов CYP450 и AKR при условиях реакции, допускающих ферментативный катализ химического превращения бензилизохинолинового производного при условиях in vivo реакции. При таких условиях in vivo реакции живые клетки модифицируют так, что они продуцируют (R)-ретикулин или предшественник (R)-ретикулина. Согласно некоторым вариантам осуществления живыми клетками являются микроорганизмы, в том числе бактериальные клетки и грибковые клетки. Согласно другим вариантам осуществления живыми клетками являются клетки многоклеточных организмов, в том числе клетки растений, и культур растительных клеток.

[0097] Согласно одному варианту осуществления, чтобы быть выбранными в качестве клеток-хозяев, живые клетки должны быть неспособными в естественных условиях продуцировать бензилизохинолиновое производное, (S)-ретикулин, предшественник (R)-ретикулина или (R)-ретикулин. Согласно другому варианту осуществления клетки-хозяева в естественных условиях способны продуцировать (S)-ретикулин или бензилизохинолиновое производное, но не (R)-ретикулин или предшественник (R)-ретикулина, т.е. клетки в естественных условиях не способны выполнять реакцию эпимеризации (S)-энантиомера в (R)-энантиомер. Согласно другому варианту осуществления клетки способны продуцировать бензилизохинолиновое производное или (S)-ретикулин и (R)-ретикулин или предшественник (R)-ретикулина, но уровни (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина ниже желаемых, а уровни (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина модулированы относительно уровней в немодифицированных клетках. Такие клетки включают в себя без ограничения клетки бактерий, дрожжей, других грибков, клетки растений или клетки животных.

[0098] Для продуцирования (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина дополнительно в настоящем документе представлен способ получения (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина, предусматривающий

(i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид CYP450;

(ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид AKR; и

(b) введение химерной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и выращивание клетки-хозяина для продуцирования CYP450 и AKR, а также для продуцирования (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина; и

[0099] Согласно предпочтительным вариантам осуществления первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты функционально связаны для продуцирования полипептида слияния, содержащего CYP450 и AKR.

[0100] Кроме того, представлен способ получения (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина, предусматривающий

(b) обеспечение первой химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей в качестве функционально связанных компонентов - первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид CYP450, и первую последовательность нуклеиновой кислоты, контролирующую экспрессию первой последовательности нуклеиновой кислоты в клетке;

(с) обеспечение второй химерной последовательности, нуклеиновой кислоты, содержащей в качестве функционально связанных компонентов - вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид AKR, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, контролирующую экспрессию второй последовательности нуклеиновой кислоты в клетке;

(с) введение первой и второй химерных последовательностей нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и выращивание клетки-хозяина для продуцирования CYP450 и AKR, а также для продуцирования (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина; и

(d) извлечение (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина.

[0101] Согласно предпочтительным вариантам осуществления последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CYP450 и AKR, выбраны из последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих CYP450 и AKR, получаемых или полученных из Papaver somniferum и других представителей семейства растений Papaveraceae, Lauraceae, Annonaceae, Euphorbiaceae или Moraceae, содержащих такие соединения, при необходимости. Приемлемые представители Papaveraceae включают в себя без ограничения виды, принадлежащие к родам Papaver; Corydalis; Chelidonium и Romeria. Такие виды могут быть способны продуцировать (R)-ретикулин, в том числе без ограничения виды растений, выбранные из видов Chelidonium majus; Corydalis bulbosa; Corydalis cava; Corydalis ochotenis; Corydalis ophiocarpa; Corydalis platycarpa; Corydalis tuberosa; Papaver armeniacum; Papaver Bracteatum; Papaver cylindricum; Papaver decaisnei; Papaver fugax; Papaver oreophyllum; Papaver orientale; Papaver paeonifolium; Papaver persicum; Papaver pseudo-orientale; Papaver rhoeas; Papaver rhopalothece; Papaver setigerum; Papaver somniferum; Papaver tauricolum; Papaver triniaefolium и Romeria carica. Согласно особенно предпочтительным вариантам осуществления последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CYP450 и AKR, являются последовательностями нуклеиновой кислоты, выбранными из последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих CYP450 и AKR, получаемых или полученных из Papaver somniferum, Papaver bracteatum и Papaver rhoeas. Согласно следующим предпочтительным вариантам осуществления одна из последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих CYP450, изложенный в настоящем документе в SEQ. ID NO: 116 - SEQ. ID NO: 218; SEQ. ID NO: 324 и SEQ. ID NO: 337. Согласно предпочтительным вариантам осуществления последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей AKR, является одна из последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующая AKR, изложенную в настоящем документе в SEQ. ID NO: 1 - SEQ. ID NO: 58; SEQ. ID NO: 326; SEQ. ID NO: 328 и SEQ. ID NO: 339. Согласно следующим особенно предпочтительным вариантам осуществления последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими CYP450 и AKR, являются последовательности нуклеиновой кислоты, способные продуцировать полипептид слияния CYP450-AKR, в том числе без ограничения последовательность, изложенная в SEQ. ID NO: 322.

[0102] В соответствии с настоящим изобретением последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CYP450 и AKR, связывается с последовательностью нуклеиновой кислоты, способной контролировать экспрессию CYP450 и AKR в клетке-хозяине. Следовательно, настоящее раскрытие также относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей CYP450 и AKR, связанной с промотором, способным контролировать экспрессию в клетке-хозяине. Последовательности нуклеиновой кислоты, способные контролировать экспрессию в клетках-хозяевах, которые могут быть использованы в настоящем документе, включают в себя любой транскрипционный промотор, способный контролировать экспрессию полипептидов в клетках-хозяевах. Как правило, промоторы, полученные из бактериальных клеток, используют при отборе бактерии-хозяина в соответствии с настоящим изобретением, тогда как грибковый промотор будут использовать при отборе грибкового хозяина, растительный промотор будут использовать при отборе растительной клетки, и т.д. Дополнительные элементы нуклеиновой кислоты, способные быть элементами, контролирующими экспрессию в клетке-хозяине, включают в себя транскрипционные терминаторы, энхансеры и т.п., все из которых могут быть включены в химерные последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим раскрытием. Специалистам в данной области будет понятно, что функциональное связывание последовательностей нуклеиновой кислоты включает в себя связывание промоторов и последовательностей, способных контролировать экспрессию, для кодирования последовательностей в 5'-3' направлении транскрипции.

[0103] В соответствии с настоящим раскрытием химерные последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие промотор, способный контролировать экспрессию в клетке-хозяине, связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей CYP450 и AKR, могут быть встроены в рекомбинантный вектор экспрессии, который обеспечивает хорошую экспрессию в клетке-хозяине. Следовательно, настоящее раскрытие включает в себя рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий в качестве функционально связанных компонентов:

(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетке-хозяине; и

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CYP450, где вектор экспрессии приемлем для экспрессии в клетке-хозяине.

[0104] Настоящее раскрытие включает в себя рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий в качестве функционально связанных компонентов:

(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетке-хозяине; и

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую AKR, где вектор экспрессии приемлем для экспрессии в клетке-хозяине.

[0105] Кроме того, настоящее раскрытие включает в себя рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий в качестве функционально связанных компонентов:

(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетке-хозяине; и

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CYP450 и AKR,

где вектор экспрессии приемлем для экспрессии в клетке-хозяине. Термин "приемлемый для экспрессии в клетке-хозяине" означает, что рекомбинантный вектор экспрессии содержит химерную последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим раскрытием, связанную с генетическими элементами, необходимыми для достижения экспрессии в клетке-хозяине. Генетические элементы, которые могут быть включены в вектор экспрессии в этом отношении, включают в себя область транскрипционной терминации, одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих маркерные гены, одну или несколько точек начала репликации и т.п. Согласно предпочтительным вариантам осуществления вектор экспрессии дополнительно содержит генетические элементы, необходимые для встраивания вектора или его части в геном клетки-хозяина, например, если используют растительную клетку-хозяина, последовательности левого и правого пограничных участков T-DNA, которые облегчают встраивание в ядерный геном растения.

[0106] В соответствии с настоящим раскрытием вектор экспрессии может дополнительно содержать маркерный ген. Маркерные гены, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим раскрытием, включают в себя все гены, которые позволяют отличить трансформированные клетки от нетрансформированных клеток, в том числе все селектируемые и отбираемые маркерные гены. Маркерным геном может быть маркер устойчивости, такой как маркер устойчивости к антибиотикам, например, к канамицину или ампициллину. Отбираемые маркеры, которые могут быть использованы для идентификации трансформантов путем визуального осмотра, включают в себя β-глюкуронидазу (GUS) (патенты США №№5268463 и 5599670) и зеленый флуоресцентный белок (GFP) (Niedz et al., 1995, Plant Cell Rep., 14: 403).

[0107] Одной клеткой-хозяином, которую особенно удобно можно использовать, является Escherichia coli. Получение векторов Е.coli может быть выполнено с использованием широко известных методик, таких как расщепление рестриктазами, лигирование, гель-электрофорез, секвенирование ДНК, полимеразная цепная реакция (PCR) и другие методы. Доступен широкий ряд клонирующих векторов для выполнения необходимых стадий, требуемых для получения рекомбинантного вектора экспрессии. Среди векторов с репликационной системой, функционирующей в Е. coli, имеются векторы, такие как pBR322, серии pUC векторов, серии М13 mp векторов, pBluescript и т.д. Как правило, эти клонирующие векторы содержат маркер, позволяющий отбор трансформированных клеток. Последовательности нуклеиновой кислоты могут быть введены в эти векторы, а векторы могут быть введены в Е. coli путем получения компетентных клеток, электропорации или с использованием других методов, хорошо известных специалисту в данной области. Е. coli может быть выращена в приемлемой среде, в том числе без ограничения среде Луриа-Бертани, и собрана. Рекомбинантные векторы экспрессии могут быть легко извлечены из клеток при сборе и лизировании клеток. Дополнительное общее руководство в отношении получения рекомбинантных векторов и выращивания рекомбинантных организмов можно найти, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, Third Ed.

[0108] Дополнительно включена в настоящее раскрытие клетка-хозяин, где клетка-хозяин содержит химерную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую в качестве функционально связанных компонентов, одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих один или несколько полипептидов, выбранных из группы, состоящей из CYP450 и AKR. Как упомянуто выше, клеткой-хозяином предпочтительно является клетка-хозяин, неспособная в естественных условиях продуцировать бензилизохинолиновое производное, (S)-ретикулин или (R)-ретикулин или предшественник (R)-ретикулина. Согласно другому варианту осуществления клетка-хозяин в естественных условиях способна продуцировать (S)-ретикулин и бензилизохинолиновое производное, но не (R)-ретикулин или предшественник (R)-ретикулина. Согласно другому варианту осуществления клетка-хозяин способна продуцировать бензилизохинолиновое производное, (S)-ретикулин, или (R)-ретикулин, или предшественник (R)-ретикулина, но уровни (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина ниже желаемых, а уровни (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина модулированы относительно уровней (R)-ретикулина или предшественника (R)-ретикулина в нативных немодифицированных клетках. Согласно вариантам осуществления, где клетки не способны в естественных условиях продуцировать (S)-ретикулин или бензилизохинолиновое производное, (S)-ретикулин или бензилизохинолиновое производное могут быть обеспечены клеткам как часть клеточной ростовой среды. Согласно другим вариантам осуществления, где клетки не способны в естественных условиях продуцировать (S)-ретикулин или бензилизохинолиновое производное, может быть обеспечено соединение предшественник (S)-ретикулина или бензилизохинолинового производного, которое может быть превращено клетками в (S)-ретикулин или бензилизохинолиновое производное, соответственно. Альтернативные субстраты, которые могут быть обеспечены клеткам как часть клеточной ростовой среды, включают в себя без ограничения (S)-норкоклаурин, (S)-N-метилноркоклаурин, (S)-норлауданозолин, (S)-N-метилнорлауданозолин, (S)-коклаурин, (S)-N-метилкоклаурин, (S)-3'-гидроксикоклаурин, (S)-3'-гидрокси-N-метилкоклаурин), (S)-хигенамин, (S)-N-метилхигенамин, (S)-лауданозолин, (S)-норретикулин, (S)-коллетин и (S)-ориенталин. Клетки, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим, включают в себя без ограничения клетки бактерий, дрожжей или других грибков, клетки растений или клетки животных или синтетические клетки.

[0109] Кроме того, включены в настоящее раскрытие композиции для эпимеризации (S)-энантиомера в (R)-энантиомер, включающие в себя смесь ферментов, содержащую первый полипептид, способный окислять бензилизохинолиновое производное в окисленное бензилизохинолиновое производное, и второй полипептид, способный восстанавливать окисленное бензилизохинолиновое производное в предшественник (R)-ретикулина, и дополнительно включающие смесь ферментов, содержащую первый полипептид, способный окислять (S)-ретикулин с образованием 1,2-дегидроретикулина, и второй полипептид, способный восстанавливать 1,2-дегидроретикулин с образованием (R)-ретикулина. Согласно предпочтительным вариантам осуществления первым полипептидом является цитохром Р450, а вторым полипептидом является AKR.

[0110] Согласно некоторым вариантам осуществления полипептиды AKR и CYP450 функционально связываются с образованием полипептида слияния. Следовательно, в настоящее раскрытие дополнительно включен полипептид, содержащий или состоящий из SEQ. ID NO: 323.

[0111] Настоящее изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, способные к эпимеризации (S)-энантиомера в (R)-энантиомера. Согласно предпочтительным вариантам осуществления последовательностями нуклеиновой кислоты являются последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CYP450 и AKR, вместе способные к эпимеризации (S)-энантиомера в (R)-энантиомер, предпочтительно способные окислять бензилизохинолиновое производное в окисленное бензилизохинолиновое производное и восстанавливать бензилизохинолиновое производное в предшественник (R)-ретикулина и более предпочтительно способные окислять (S)-ретикулин с образованием 1,2-дегидроретикулина и восстанавливать 1,2-дегидроретикулин с образованием (R)-ретикулина. Согласно предпочтительным вариантам осуществления последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие AKR и CYP450, функционально связаны для продуцирования полипептида слияния CYP450-AKR. Следовательно, дополнительно включена в настоящее раскрытие SEQ. ID NO: 322.

[0112] Количества (R)-ретикулина, который накапливается в клетке-хозяине, могут варьировать. Согласно вариантам осуществления в соответствии с настоящим раскрытием, где клетка-хозяин в естественных условиях продуцирует (R)-ретикулин и (S)-ретикулин (например, клетки Papaver somniferum), отношение (R)-ретикулина к (S)-ретикулину, синтезируемому in vivo такими клетками, полученными с содержанием химерных последовательностей нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим раскрытием, превышает отношение (R)-ретикулина к (S)-ретикулину, присутствующему в натуральных клетках-хозяевах (т.е. клетках, не содержащих химерные последовательности нуклеиновой кислоты) или в экстрактах клеток-хозяев. Предпочтительно отношение (R)-ретикулина к (S)-ретикулину в клетках-хозяевах или экстрактах клеток-хозяев, составляет более 21:79, например, по меньшей мере 0,3:1, по меньшей мере 0,4:1, по меньшей мере 0,5:1, по меньшей мере 1:1, по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 3:1 или по меньшей мере 4:1.

Применение (R)-ретикулина и предшественников (R)-ретикулина

[0113] (R)-Ретикулин, полученный в соответствии с настоящим раскрытием, может быть составлен для применения в качестве фармацевтического средства, терапевтического средства или медицинского средства. Таким образом, настоящее раскрытие дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей (R)-ретикулин, полученный согласно способам в соответствии с настоящим раскрытием. Препараты фармацевтических средств, содержащие (R)-ретикулин в соответствии с настоящим раскрытием, предпочтительно дополнительно содержат носители, вспомогательные средства, разбавители и вспомогательные вещества, такие как увлажнители или эмульгаторы, рН буферные вещества и т.п. Такие носители, вспомогательные средства и вспомогательные вещества, как правило, являются фармацевтическими средствами, которые могут быть введены без излишней токсичности. Фармацевтически приемлемые вспомогательное средства включают в себя без ограничения жидкости, такие как вода, солевой раствор, полиэтиленгликоль, гиалуроновая кислота, глицерин и этанол. Также в них могут быть включены фармацевтически приемлемые соли, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, фосфаты, сульфаты и т.п.; а также соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, бензоаты и т.п. Также предпочтительным, хотя не обязательным, является то, что препарат будет содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное средство, которое служит стабилизатором. Примеры приемлемых носителей, которые также действуют как стабилизаторы для пептидов, включают в себя без ограничения фармацевтические сорта декстрозы, сахарозы, лактозы, сорбита, инозита, декстрана и т.п. Другие приемлемые носители включают в себя, опять-таки, без ограничения крахмал, целлюлозу, натрия или кальция фосфаты, лимонную кислоту, глицин, полиэтиленгликоли (PEG) и их комбинации. Фармацевтическая композиция может быть составлена для перорального и внутривенного введения и для других желаемых путей введения. Дозировка может варьировать и может быть оптимизирована с использованием рутинного эксперимента. Фармацевтическая композиция, содержащая (R)-ретикулин, может быть использована для лечения облысения или напряжения мышц.

[0114] Согласно следующим вариантам осуществления настоящее раскрытие относится к способам лечения пациента фармацевтической композицией, содержащей (R)-ретикулин, полученный в соответствии с настоящим раскрытием. Следовательно, настоящее раскрытие, кроме того, относится к способу лечения пациента (R)-ретикулином, полученным согласно способам в соответствии с настоящим раскрытием, при этом указанный способ предусматривает введение пациенту композиции, содержащей (R)-ретикулин, где (R)-ретикулин вводят в количестве, достаточном для облегчения медицинского состояния у пациента. Согласно предпочтительным вариантам осуществления медицинское состояние выбрано из группы, состоящей из облысения и ослабление напряжения мышц.

[0115] Кроме того, (R)-ретикулин, представленный в настоящем документе, применим в качестве средства для изготовления других вторичных метаболитов или медицинских композиций, включающих в себя без ограничения салютаридин, кодеин и морфин, а также дополнительно включающих в себя тебаин, папаверин, носкапин, кодамин, лаудин и лауданозин (+)-паллидин, (-)-изоболдин и (-)-коритуберин.

[0116] Предшественники (R)-ретикулина, представленные в настоящем документе, применимы в качестве средства для изготовления других вторичных метаболитов, а именно (R)-ретикулина. Как показано на фиг. 1, (R)-N-метилкоклаурин может быть использован в качестве средства для изготовления (R)-3'-гидрокси-N-метилкоклаурина. (R)-3'-Гидрокси-N-метилкоклаурин может быть использован в качестве средства для изготовления (R)-ретикулина.

Альтернативные применения нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды AKR и CYP450

[0117] В следующем аспекте последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие AKR и/или CYP450, могут быть применены для выявления присутствия или отсутствия генов в образце. Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящего раскрытия представлен способ выявления присутствия или отсутствия последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей AKR и/или CYP450, предусматривающий

(b) анализ образца на предмет присутствия нуклеотидной последовательности, кодирующей AKR и/или CYP450.

[0118] Согласно предпочтительному варианту осуществления образец содержит клетки, содержащие геномную ДНК. Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления представлен способ выявления присутствия или отсутствия последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей AKR и/или CYP450, в клетке, предусматривающий

(а) обеспечение клетки;

(b) экстрагирование геномной ДНК из клетки и

[0119] Способы анализа геномной ДНК, как правило, известны в уровне техники и включают в себя, например, применение полимеразной цепной реакции (PCR) и специфичных полинуклеотидных праймеров для амплификации специфичных частей нуклеотидной последовательности, кодирующей AKR и/или CYP450. Кроме того, могут быть использованы анализы расщепления рестриктазами и саузерн-блоттинга. Кроме того, анализ может быть направлен на интроны, экзоны или области в 3'-5' направлении или в 5'-3' направлении последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей AKR и/или CYP450. Кроме того, анализ может быть направлен на идентификацию геномного локуса, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую AKR и/или CYP450, где такой локус связывается с модулированными уровнями экспрессии AKR и/или CYP450.

[0120] Согласно предпочтительным вариантам осуществления клеткой является растительная клетка. Согласно следующим предпочтительным вариантам осуществления клеткой является растительная клетка, полученная из растения, принадлежащего к семействам растений Papaveraceae, Lauraceae, Annonaceae, Euphorbiaceae или Moraceae, и более предпочтительно из растения, принадлежащего к видам Papaver somniferum, Papaver bracteatum или Papaver rhoeas.

[0121] Согласно предпочтительным вариантам осуществления последовательностью CYP450 и/или AKR, используемой для выполнения вышеупомянутого анализа, является изложенная в SEQ. ID NO: 116 - SEQ. ID NO: 218; SEQ. ID NO: 324 и SEQ. ID NO: 337; или изложенная в SEQ. ID NO: 1 - SEQ. ID NO: 58; SEQ. ID NO: 326; SEQ. ID NO: 328 и SEQ. ID NO: 339; или последовательность, изложенная в SEQ. ID NO: 322.

[0122] В следующих аспектах последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие AKR и/или CYP450, могут быть использованы для получения клетки, которая характеризуется модулированными уровнями экспрессии AKR и/или CYP450. Такой клеткой предпочтительно является растительная клетка, нативно экспрессирующая AKR и/или CYP450, более предпочтительно растительная клетка, полученная из растения, принадлежащего к семействам растений Papaveraceae, Lauraceae, Annonaceae, Euphorbiaceae или Moraceae, и наиболее предпочтительно из растения, принадлежащего к видам Papaver somniferum, Papaver bracteatum или Papaver rhoeas. Таким образом, настоящее раскрытие, кроме того, относится к способу модуляции экспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты в клетке, в естественных условиях экспрессирующей AKR и/или CYP450, предусматривающему

(а) обеспечение клетки, в естественных условиях экспрессирующей AKR и/или CYP450;

(b) обеспечение мутагенеза клетки;

(d) определение того, содержит ли множество клеток клетку, содержащую модулированные уровни AKR и/или CYP450.

[0123] Согласно предпочтительным вариантам осуществления способ дополнительно предусматривает следующую стадию (е):

(e) осуществление отбора клетки, содержащей модулированные уровни AKR и/или CYP450, и выращивание такой клетки с получением множества клеток.

[0124] Согласно следующим предпочтительным вариантам осуществления клетки семян растений используют для осуществления мутагенеза. Мутагенными средствами, которые могут быть использованы, являются химические средства, в том числе без ограничения аналоги оснований, деаминирующие средства, алкилирующие средства, интеркалирующие средства, транспозоны, бром, натрия азид, этилметансульфонат (EMS), а также физические средства, в том числе без ограничения облучение, такое как ионизирующее облучение и UV облучение. Таким образом настоящее раскрытие, кроме того, относится к способу получения растения с завязывающимися семенами, предусматривающего модулированную экспрессию последовательностей нуклеиновой кислоты в клетке, в естественных условиях экспрессирующей AKR и/или CYP450, при этом способ предусматривает

(a) обеспечение растения с завязывающимися семенами, в естественных условиях экспрессирующего AKR и/или CYP450;

(b) обеспечение мутагенеза семени растения с получением мутировавшего семени;

(c) выращивание из мутировавшего семени мутировавших растений следующего поколения, способных к завязыванию семян следующего поколения; и

(d) получение семян следующего поколения или другой части мутировавших растений и анализ на предмет проявления растениями следующего поколения или семенем следующего поколения модулированной экспрессии AKR и/или CYP450.

[0125] Согласно предпочтительным вариантам осуществления может быть получено множество поколений растений и/или семян, и могут быть проанализированы части растений и/или семя в любых или всех таких поколениях. Анализ, как правило, выполняют путем сравнения уровней экспрессии (например, уровней РНК или уровней белка) в немутировавших (дикого типа) растениях или семени с экспрессией в мутировавших растениях или семени. Согласно следующим предпочтительным вариантам осуществления анализ на стадии (d) может быть выполнен путем анализирования образования гетеродуплекса между ДНК дикого типа и мутантной ДНК. Таким образом, согласно предпочтительным вариантам осуществления, анализирование на стадии (d) предусматривает

i. экстрагирование ДНК из мутантных растений;

ii. амплифицирование части ДНК, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую AKR и/или CYP450, с получением амплифицированной мутантной ДНК;

iii. экстрагирование ДНК из растений дикого типа;

iv. смешивание ДНК из растений дикого типа с амплифицированной мутантной ДНК и образование гетеродуплексного полинуклеотида;

v. инкубацию гетеродуплексного полинуклеотида с однонитевой нуклеазой рестрикции, способной к рестрикции в области гетеродуплексного полинуклеотида, который является ошибочно спаренным; и

vi. определение сайта ошибочного спаривания в гетеродуплексном полинуклеотиде.

[0126] Согласно предпочтительным вариантам осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая AKR и/или CYP450, которую используют, является изложенной в SEQ. ID NO: 116 - SEQ. ID NO: 218; SEQ. ID NO: 324 и SEQ. ID NO: 337; или изложенной в SEQ. ID NO: 1 - SEQ. ID NO: 58; SEQ. ID NO: 326; SEQ. ID NO: 328 и SEQ. ID NO: 339; или последовательность, изложенная в SEQ. ID NO: 322.

[0127] В следующих аспектах последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие AKR и/или CYP450, могут быть использованы для продуцирования клетки, которая характеризуется модулированными уровнями экспрессии AKR и/или CYP450, путем сайленсинга генов. Таким образом, настоящее раскрытие, кроме того, относится к способу снижения экспрессии AKR и/или CYP450 в клетке, предусматривающему

(a) обеспечение клетки, экспрессирующей AKR и/или CYP450; и

(b) сайленсинг экспрессии AKR и/или CYP450 в клетке.

[0128] Согласно предпочтительным вариантам осуществления клеткой является растительная клетка. Предпочтительно растением является представитель, принадлежащий к семействам растений Papaveraceae, Lauraceae, Annonaceae, Euphorbiaceae или Moraceae, и более предпочтительно, растением, принадлежащим к видам Papaver somniferum, Papaver bracteatum или Papaver rhoeas. Предпочтительным методом сайленсинга AKR и/или CYP450, который используют, является индуцированный вирусом сайленсинг генов (известный в уровне техники как VIGS). В целом, в растениях, инфицированных немодифицированными вирусами, мишенью является вирусный геном. Однако, если вирусные векторы были модифицированы с содержанием вставок, полученных из генов хозяина (например, из частей последовательностей, кодирующих AKR и/или CYP450), то процесс дополнительно нацеливается на соответствующие mRNA. Таким образом, настоящее раскрытие, кроме того, относится к способу получения растения, экспрессирующего пониженные уровни AKR и/или CYP450, при этом способ предусматривает

(a) обеспечение растения, экспрессирующего AKR и/или CYP450; и

(b) снижение экспрессии AKR и/или CYP450 в растении с использованием индуцированного вирусом сайленсинга генов.

[0129] Этот аспект настоящего раскрытия описывается в дополнительных деталях в примере 5.

[0130] Вышеупомянутые способы модуляции уровней экспрессии AKR и/или CYP450 могут давать в результате модуляции уровней растительных алкалоидов в растениях, в том числе без ограничения морфина, кодеина, тебаина, папаверина, носкапина, (S)-ретикулина, (R)-ретикулина, кодамина, лауданина и лауданозина. Кроме того, способы могут давать в результате модуляцию отношения (S)-ретикулина к (R)-ретикулину. Предпочтительно такая модуляция дает в результате отношение (R)-ретикулина к (S)-ретикулину в растительных клетках или в экстрактах растительных клеток менее 21:79, более предпочтительно менее 0,1, более предпочтительно менее 0,05, более предпочтительно менее 0,025 и более предпочтительно менее 0,01. Такая модуляция показана в примере 5. Таким образом настоящее раскрытие включает в себя применение методов модификации уровней растительных алкалоидов в растении, в естественных условиях, способном продуцировать растительные алкалоиды. Предпочтительно такие растения принадлежат семействам растений Papaveraceae, Lauraceae, Annonaceae, Euphorbiaceae или Moraceae, и более предпочтительно, растение принадлежит видам Papaver somniferum, Papaver bracteatum или Papaver rhoeas.

[0131] В следующих аспектах настоящего раскрытия последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие AKR и/или CYP450, могут быть использованы для определения генотипа растений. Предпочтительно растением является представитель, принадлежащий к семействам растений Papaveraceae, Lauraceae, Annonaceae, Euphorbiaceae или Moraceae, и более предпочтительно, растением, принадлежащим к видам Papaver somniferum, Papaver bracteatum или Papaver rhoeas. В целом, определение генотипа обеспечивает средства для различия гомологов пар хромосом и может быть использовано для идентификации сегрегантов в последовательных поколениях растительной популяции. Методы с молекулярными маркерами могут быть использованы при филогенетических исследованиях, характеризующих генетические взаимосвязи среди разновидностей растений, идентифицирующих кроссы или соматические гибриды, локализацию хромосомных сегментов, влияющих на моногенные признаки, клонирование на основе карты, а также при исследовании количественной наследственности. См., например, Plant Molecular Biology: А Laboratory Manual, Chapter 7, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997). В отношении методов с молекулярными маркерами см., как правило, The DNA Revolution by Andrew H. Paterson 1996 (Chapter 2), в Genome Mapping in Plants (ed. Andrew H. Paterson) by Academic Press / R.G. Landis Company, Austin, Tex., pp. 7-21. Конкретный способ определения генотипа в соответствии с настоящим раскрытием может предусматривать применение любой аналитической методики с молекулярными маркерами, в том числе без ограничения полиморфизмы длины фрагментов рестрикции (RFLP). RFLP отражают аллельные различия между ДНК фрагментами рестрикции, обусловленные вариабельностью нуклеотидных последовательностей. Как известно специалистам в данной области, RFLP, как правило, выявляют путем экстракции геномной ДНК растений и расщепления геномной ДНК одним или несколькими ферментами рестрикции. Как правило, полученные в результате фрагменты разделяют по размеру и гибридизируют с зондом нуклеиновой кислоты. Выявляют фрагменты рестрикции из гомологичных хромосом. Различия в размере фрагментов среди аллелей представляют RFLP. Таким образом, настоящее раскрытие, кроме того, относится к средству последующей сегрегации части или геномной ДНК, кодирующей AKR и/или CYP450, а также хромосомных последовательностей нуклеиновой кислоты, генетически связанных с таковыми кодирующими AKR и/или CYP450 последовательностями нуклеиновой кислоты с использованием таких методик в качестве анализа RFLP. Связанные хромосомные ядерные последовательности находятся в пределах 50 сантиморган (сМ), зачастую в пределах 40 или 30 сМ, предпочтительно в пределах 20 или 10 сМ, более предпочтительно в пределах 5, 3, 2, или 1 сМ геномной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей AKR и/или CYP450. Таким образом, в соответствии с настоящим раскрытием кодирующие AKR и/или CYP450 последовательности в соответствии с настоящим раскрытием могут быть использованы в качестве маркеров для оценивания в растительной популяции сегрегации последовательностей нуклеиновой кислоты, генетически связанных с ними. Предпочтительно популяция растений содержит или состоит из растений, принадлежащих к семействам растений Papaveraceae, Lauraceae, Annonaceae, Euphorbiaceae или Moraceae, и более предпочтительно, популяция растений содержит или состоит из растений, принадлежащих к видам Papaver somniferum, Papaver bracteatum или Papaver rhoeas.

[0132] В соответствии с настоящим раскрытием зонды нуклеиновой кислоты, используемые для картирования с молекулярными маркерами растительных ядерных геномов, селективно гибридизируются при условиях селективной гибридизации с геномной последовательностью, кодирующей AKR и/или CYP450. Согласно предпочтительным вариантам осуществления зонды выбирают из последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих AKR и/или CYP450, представленных в настоящем раскрытии. Как правило, такие зонды являются кДНК зондами. Как правило, такие зонды в длину составляют по меньшей мере 15 оснований, более предпочтительно по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40 или 50 оснований. Как правило, однако, зонды в длину составляют менее около 1 тысячи пар нуклеотидов. Предпочтительно зондами являются однокопийные зонды, которые гибридизируются с уникальным локусом в гаплоидном наборе хромосом растений. Некоторыми типичными ферментами рестрикции, используемыми при картировании RFLP, являются EcoRI, EcoRv и SstI. Используемый в настоящем документе термин "фермент рестрикции" включает в себя ссылку на композицию, которая распознает и отдельно или вместе с другой композицией расщепляет полинуклеотид в специфичной нуклеотидной последовательности.

[0133] Другие способы дифференциации полиморфных (аллельных) вариантов последовательностей нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим раскрытием могут быть использованы путем применения методик с молекулярными маркерами, хорошо известных специалистам в данной области, в том числе без ограничения: 1) анализ однонитевой конформации (SSCP); 2) денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE); 3) испытания защиты от РНКазы; 4) аллель-специфичные олигонуклеотиды (ASO); 5) применение белков, которые распознают ошибочные спаривания нуклеотидов, таких как белок mutS Е. coli; и 6) аллель-специфичная PCR. Другие подходы, основанные на выявлении ошибочных спариваний между двумя комплементраными нитями ДНК, включают в себя без ограничения денатурирующий гель-электрофорез с фиксацией (CDGE); гетеродуплексный анализ (НА) и химическое расщепление ошибочного спаривания (CMC). Таким образом, настоящее раскрытие, кроме того, относится к способу определения генотипа, предусматривающему стадии введения в контакт при жестких условиях гибридизации образца, предположительно содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующих AKR и CYP450, с зондом нуклеиновой кислоты, способным гибридизироваться с ним. Как правило, образцом является растительный образец, предпочтительно образец, предположительно содержащий последовательность нуклеиновой кислоты Papaver somniferum, кодирующую AKR и/или CYP450 (например, ген, mRNA). Зонд нуклеиновой кислоты селективно гибридизируется при жестких условиях с субпоследовательностью последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей AKR и/или CYP450, содержащей полиморфный маркер. Селективная гибридизация зонда нуклеиновой кислоты с полиморфной маркерной последовательностью нуклеиновой кислоты дает комплекс гибридизации. Выявление комплекса гибридизации указывает на присутствие этого полиморфного маркера в образце. Согласно предпочтительным вариантам осуществления зонд нуклеиновой кислоты содержит часть последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей AKR и/или CYP450.

ПРИМЕРЫ

[0134] Далее представлены примеры конкретных вариантов осуществления для выполнения способов в соответствии с настоящим раскрытием, а также вариантов осуществления, представляющих собой композиции в соответствии с настоящим раскрытием. Примеры представлены исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего раскрытия каким-либо путем.

Пример 1. Превращение (S)-ретикулина в (R)-ретикулин

[0135] Данный пример демонстрирует in vitro превращение (S)-ретикулина в (R)-ретикулин с использованием смеси ферментов в форме полипептида слияния Papaver somniferum, состоящего из фрагментов CYP450 и AKR (SEQ. ID: №323).

[0136] Выращивали штамм Saccharomyces cerevisiae YPH499, содержащий pESC-Ieu2d::PsCPR/PsREPI, и микросомы очищали, как описано ниже. Вкратце, штамм дрожжей выращивали в синтетической полной (SC) среде без лейцина, дополненной 2% глюкозы, в течение 16 часов при 30°С и 250 rpm. Один миллилитр культуры добавляли в 50 мл SC среды без лейцина, дополненной 1,8% галактозы, 0,2% глюкозы и 1% рафинозы, и выращивали в течение 72 часов при 30°С и 250 rpm. Затем культуры центрифугировали при 4000 g в течение 5 минут и промывали с помощью 5 мл буфера ТЕК (50 мМ Tris-HCl, рН 8, 1 мМ EDTA, 100 мМ KCl). Осадки повторно суспендировали в 1 мл буфера TESB (50 мМ Tris-HCl, рН 8, 1 мМ EDTA, 0,6 М сорбит) и добавляли равный объем 0,5 мм стеклянных гранул. Пробирки встряхивали рукой при 10°С в течение 4 минут. Гранулы промывали с помощью TESB, а смывы собирали и центрифугировали при 14000 g в течение 10 мин. Супернатант ультрацентрифугировали в течение 1 часа при 125000 g и супернатант отбрасывали. Затем микросомы повторно суспендировали в 50 мМ HEPES, рН 7,5.

[0137] Аналитические образцы ферментов содержали 500 мкМ NADPH и 50 мкМ (S)-ретикулина в буфере HEPES (рН 7,5) и микросомы, полученные, как описано выше. Аналитические образцы инкубировали в течение ночи при 30°С. После осуществления реакции аналитические образцы прогоняли на HLPC Agilent 1260 при скорости потока 0,2 мл/мин. и соединения отделяли с использованием хиральной колонки LUX cellulose-1 (150 мм × 2,1 мм внутренний диаметр; Phenomenex) с 75% аммония бикарбоната, дополненного 0,1% диэтиламина (растворитель А) и 25% ацетонитрила с 0,1% диэтиламина (растворитель В). (R)-Ретикулин и (S)-ретикулин контролировали при длине волны 284 нм.

[0138] Результаты показаны на фиг. 3. Как можно видеть на фиг. 3, время удерживания аутентичных стандартных контролей (R)-ретикулина и (S)-ретикулина в хиральной колонке составляет приблизительно 13,5 минуты (верхняя панель) и 15 минут (вторая панель сверху), соответственно. На нижней панели показаны результаты аналитического образца, в котором фермент не присутствует в смеси, и демонстрируется, что при данных условиях реакции (S)-ретикулин не эпимеризуется в (R)-ретикулин. На третей панели сверху показано, что в присутствии смеси ферментов (S)-ретикулин эпимеризуется в (R)-ретикулин (см. на стрелку и появление пика на момент времени удерживания приблизительно 15 мин.).

Пример 2. Превращение (S)-ретикулина в 1,2-дегидроретикулин

[0139] Данный пример демонстрирует in vitro превращение в дрожжах (S)-ретикулина в 1,2-дегидроретикулин с использованием CYP450 из Papaver rhoeas (SEQ. ID: №325). Выращивали штамм Saccharomyces cerevisiae YPH499, содержащий pESC-leu2d::PsCPR/PrDRS, и микросомы очищали, как описано ниже. Вкратце, штамм дрожжей выращивали в синтетической полной (SC) среде без лейцина, дополненной 2% глюкозы, в течение 16 часов при 30°С и 250 rpm. Один миллилитр данной культуры добавляли в 50 мл SC среды без лейцина, дополненной 1,8% галактозы, 0,2% глюкозы и 1% рафинозы, и выращивали в течение 72 часов при 30°С и 250 rpm. Затем культуры центрифугировали при 4000 g в течение 5 минут и промывали с помощью 5 мл буфера ТЕК (50 мМ Tris-HCl, рН 8,1 мМ EDTA, 100 мМ KCl). Осадки повторно суспендировали в 1 мл буфера TESB (50 мМ Tris-HCl, рН 8, 1 мМ EDTA, 0,6 М сорбит) и добавляли равный объем 0,5 мм стеклянных гранул. Пробирки встряхивали рукой при 10°С в течение 4 минут. Гранулы промывали с помощью TESB, а смывы собирали и центрифугировали при 14000 g в течение 10 мин. Супернатант ультрацентрифугировали в течение 1 часа при 125000 g и супернатант отбрасывали. Затем микросомы повторно суспендировали в 50 мМ HEPES, рН 7,5.

[0140] Аналитические образцы ферментов содержали 500 мкМ NADPH и 50 мкМ (S)-ретикулина в буфере HEPES (рН 7,5) и микросомы, полученные, как описано выше. Аналитические образцы инкубировали в течение ночи при 30°С. После осуществления реакции аналитические образцы прогоняли на HLPC Agilent 1260, соединенной с масс-спектрометром 6400 В с источником ионизации распылением электронов, функционирующим в режиме определения положительных ионов. Масс-спектрометр сканировал от 200-400 масса/заряд. Соединения разделяли с использованием способа HLPC для ферментного аналитического образца, описанного ранее (Farrow SC and Facchini, PJ, (2013), J. Biol. Chem. (288) pp 28,997-29,012; диоксигеназы катализируют О-деметилирование и O,O-деметилирование с широко распространенными функциями в метаболизме бензилизохинолиновых алкалоидов в маке снотворном).

[0141] Результаты показаны на фиг. 4. Как можно видеть на фиг. 4 (верхняя панель), пик с периодом времени удерживания приблизительно 3,1 минуты наблюдается на HPLC колонке в контрольном образце, не содержащем фермент. Этот пик соответствует прогнозируемому времени удерживания 3,13 минуты для наибольшего фрагмента спектра индуцированной столкновениями диссоциации для (S)-ретикулина при масса/заряд 330 (см. таблицу 1). На второй панели сверху показано, что не наблюдаются пики при масса/заряд 328 в том же контрольном образце, что, таким образом, указывает на отсутствие в контрольном образце 1,2-дегидроретикулина. На третьей панели сверху показано, что пик наблюдается на момент времени удерживания приблизительно 3,1 минуты при масса/заряд 330 в образце, содержащем фермент, что, таким образом, указывает на присутствие (S)-ретикулина в аналитическом образце. На нижней панели показано, что пик с периодом времени удерживания приблизительно 3,0 наблюдается при масса/заряд 328 в аналитическом образце. Этот пик соответствует прогнозируемому времени удерживания 3,02 минуты наибольшего фрагмента спектра индуцированной столкновениями диссоциации для 1,2-дегидроретикулина при масса/заряд 328 (см. таблицу 1), что указывает на присутствие в аналитическом образце 1,2-дегидроретикулина в присутствии фермента.

Пример 3. Превращение 1,2-дегидроретикулина в (R)-ретикулин

[0142] Данный пример демонстрирует in vitro превращение в дрожжах 1,2-дегидроретикулина в (R)-ретикулин с использованием AKR из Papaver rhoeas (SEQ. ID: №327).

[0143] 16-часовую культуру в 50 мл LB, дополненном 50 мкг/мл канамицина моносульфата и 35 мкг/мл хлорамфеникола, штамма Rosetta Escherichia coli (DE3), содержащего pET47b::PrDRR, добавляли в 1 л той же среды и выращивали при 37°С, 180 rpm, до OD600 0,6. Затем добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ, обеспечивали выращивание при 25°С, 180 rpm, в течение 4 часов и клеточный осадок собирали центрифугированием. Клетки лизировали в буфере А (100 мМ буфер на основе натрия фосфата, рН 7,0, 300 мМ NaCl, 10% (объем/объем) глицерина), дополненном 2 мМ фенилметансульфонилфторида (PMSF), с французским прессом. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 14000 g в течение 15 минут. Экстракт общего растворимого белка объединяли с уравновешенной буфером А смолой TALON (Clonetech) в течение 45 минут при 4°С, 65 rpm. Смолу дважды промывали буфером А и белок элюировали поэтапно с использованием градиента имидазола в буфере А (2,5, 10, 100, 200 мМ). Очищенный белок элюировали в 100 мМ имидазола.

[0144] Аналитические образцы ферментов содержали 500 мкМ NADPH, 50 мкМ 1,2-дегидроретикулина в буфере на основе натрия фосфата (рН 7,0) и белок получали, как описано выше. Аналитические образцы оставляли в течение ночи при 30°С. После осуществления реакции аналитические образцы прогоняли на HLPC Agilent 1260, соединенной с масс-спектрометром 6400 В с источником ионизации распылением электронов, функционирующим в режиме определения положительных ионов. Масс-спектрометр сканировал от 200-400 масса/заряд. Соединения разделяли с использованием способа HLPC для ферментного аналитического образца, описанного ранее (Farrow SC and Facchini, PJ, (2013), J. Biol. Chem. (288) pp 28,997-29,012; диоксигеназы катализируют О-деметилирование и O,O-деметилирование с широко распространенными функциями в метаболизме бензилизохинолиновых алкалоидов в маке снотворном).

[0145] Результаты показаны на фиг. 5. Как можно видеть на фиг. 5 (верхняя панель), пик с периодом времени удерживания приблизительно 3,0 минуты наблюдается на HPLC колонке в контрольном образце, не содержащем фермент. Этот пик соответствует прогнозируемому времени удерживания 3,02 минуты наибольшего фрагмента спектра индуцированной столкновениями диссоциации для 1,2-дегидроретикулина при масса/заряд 328 (см. таблицу 1). На второй панели сверху показано, что не наблюдается никакого пика на момент времени удерживания приблизительно 3,1 минуты, таким образом, (R)-ретикулин отсутствует в образце. Небольшой пик наблюдается при приблизительно 3,0 минуты в том же контрольном образце. Этот пик представляет изотопную форму субстратного 1,2-дегидроретикулина. На третьей панели сверху показано, что пик наблюдается с периодом времени удерживания приблизительно 3,0 минуты при масса/заряд 328 в образце, содержащем фермент, что, таким образом, указывает на присутствие небольшого количества неизрасходованного 1,2-дегидроретикулина в аналитическом образце. На нижней панели показано, что пик с периодом времени удерживания приблизительно 3,1 наблюдается при масса/заряд 330 в аналитическом образце. Этот пик соответствует прогнозируемому времени удерживания 3,13 минуты для наибольшего фрагмента спектра индуцированной столкновениями диссоциации для (R)-ретикулина при масса/заряд 330 (см. таблицу 1), что указывает на присутствие в аналитическом образце (R)-ретикулина в присутствии фермента.

Пример 4. Превращение (S)-N-метилкоклаурина в (R)-N-метилкоклаурин

[0146] Данный пример демонстрирует in vitro превращение в дрожжах (S)-N-метилкоклаурина в (R)-N-метилкоклаурин с использованием в смеси ферментов в форме полипептида слияния из Papaver somniferum, состоящего из фрагментов CYP450 и AKR (SEQ. ID NO 2).

[0147] Выращивали штамм Saccharomyces cerevisiae YPH499, содержащий pESC-leu2d::PsCPR/PsREPI, и микросомы очищали, как описано ниже. Вкратце, штамм дрожжей выращивали в синтетической полной (SC) среде без лейцина, дополненной 2% глюкозы, в течение 16 часов при 30°С и 250 rpm. Один миллилитр культуры добавляли в 50 мл SC среды без лейцина, дополненной 1,8% галактозы, 0,2% глюкозы и 1% рафинозы, и выращивали в течение 72 часов при 30°С и 250 rpm. Затем культуры центрифугировали при 4000g в течение 5 минут и промывали с помощью 5 мл буфера ТЕK (50 мМ Tris-HCl, рН 8, 1 мМ EDTA, 100 мМ KG). Осадки повторно суспендировали в 1 мл буфера TESB (50 мМ Tris-HCl, рН 8, 1 мМ EDTA, 0,6 М сорбит) и добавляли равный объем 0,5 Мм стеклянных гранул. Пробирки встряхивали рукой при 10°С в течение 4 минут. Гранулы промывали с помощью TESB, а смывы собирали и центрифугировали при 14000 g в течение 10 мин. Супернатант ультрацентрифугировали в течение 1 часа при 125000 g и супернатант отбрасывали. Затем микросомы повторно суспендировали в 50 мМ HEPES, рН 7,5.

[0148] Аналитические образцы ферментов содержали 500 мкМ NADPH и 50 мкМ (S)-N-метилкоклаурина в буфере HEPES (рН 7,5) и микросомы, полученные, как описано выше. Аналитические образцы инкубировали в течение ночи при 30°С. После осуществления реакции аналитические образцы прогоняли на HLPC Agilent 1260 при скорости потока 0,2 мл/мин и соединения отделяли с использованием хиральной колонки LUX cellulose-1 (150 мм × 2,1 мм внутренний диаметр; Phenomenex) с 75% аммония бикарбоната, дополненного 0,1% диэтиламина (растворитель А) и 25% ацетонитрила с 0,1% диэтиламина (растворитель В). (R)- и (S)-N-метилкоклаурин контролировали при длине волны 230 нм.

[0149] Результаты показаны на фиг. 6. Как можно видеть на фиг. 6, время удерживания аутентичного стандартного контроля (S)-N-метилкоклаурина в хиральной колонке составляет приблизительно 13,9 минуты (верхняя панель). На нижней панели показаны результаты аналитического образца, в котором фермент не присутствует в смеси, и демонстрируется, что при данных условиях реакции (S)-N-метилкоклаурин не эпимеризуется в (R)-N-метилкоклаурин. На средней панели показано, что в присутствии смеси ферментов (S)-N-метилкоклаурин эпимеризуется в (R)-N-метилкоклаурин. (см. на стрелку и появление пика с временем удерживания приблизительно 16,3 мин.)

Пример 5. Генный сайленсинг гена слияния AKR и AKR-CYP450

[0150] Данный пример демонстрирует сайленсинг генов, кодирующих AKR и/или CYP450 с использованием индуцированного вирусом сайленсинга генов (VIGS).

[0151] Уровни транскрипта REPI и/или COR1.3 (кодирующего кодеинонредуктазу) мака снотворного [Papaver somniferum) (транскрибированного SEQ. ID NO: 322 и SEQ. ID NO: 328, соответственно) в хемотипе Bea's Choice мака снотворного (Papaver somniferum) подавляли с использованием векторной системы вируса погремковости табака (TRV). Две области (REPI-a (фиг. 7А; панель А) и REPI-5' (фиг. 7С; панель А)) кДНК REPI и одну область кДНК COR1.3 (фиг. 7В; панель А) амплифицировали с использованием следующих пар праймеров:

pTRV2-COR1.3

COR 1.3 - F, ggatccCАТСAGTTCСATGCTCTGGT

COR 1.3 - R, ggtaccGGGCTCATCTCCACTTGATT

pTRV2-REPI-a

REPI-a-F, ggatccCATCACTTCCAAGCTCTGGT

REPI-a-R, ggtaccGGGCTCATCTCCACTTGAT

pTRV2-REPI-5'

REPI-5'-F, gaattcCCTACATACTGTATTGGGTTGAATCATG

REPI-5'-R, ggtaccTAACGGGATAGGACGGTTT

[0152] Область REPI-a и область COR1.3 область демонстрируют значительное подобие в результате реципрокного совместного сайленсинга REPI и COR1.3 в каждом случае. Наоборот, область REPI-5' является уникальной и приводит только к сайленсингу REPI, но не COR1.3.

[0153] Ампликоны отдельно клонировали в pTRV2, и векторы мобилизовали в Agrobacterium tumefaciens, как описано ранее. Апикальные меристемы двух - трехнедельных проростков инфильтровали 1:1 смесью А. tumefaciens, содержащей pTRV1 и сконструированный pTRV2, содержащий ген-специфичные фрагменты. Пустой pTRV2 использовали в качестве отрицательного контроля, а конструкцию pTRV2-PDS, кодирующую фитоендесатуразу, использовали в качестве положительного контроля инфильтрации. Инфильтрованные растения культивировали в теплице в течение 8-10 недель. Инфильтрацию с помощью A. tumefaciens, а также сбор и обработку образцов млечного сока, побега и корня для анализов алкалоидов и транскрипта выполняли, как описано ранее. Как правило, 20-30 растений инфильтровали с помощью A. tumefaciens, содержащей pTRV1 и одну конструкцию pTRV2. Приблизительно в 70-80% инфильтрованных растений выявляли мобилизованный фрагмент конструкции pTRV2 с помощью RT-PCR (фиг. 7А (панель В); фиг. 7В (панель В); фиг. 7С, панель В), что показывает успешное инфицирование этих растений. Алкалоиды экстрагировали из лиофилизированного млечного сока с использованием метанола. Относительную представленность транскрипта определяли с помощью qRT-PCR (фиг. 7А (панель С); фиг. 7В (панель С); фиг. 7С, панель С). Получали данные о содержании алкалоидов и относительной представленности транскрипта от 6 отдельных инфильтрованных растений и выполняли три технических повторности на каждом образце. Анализировали образцы млечного сока для инфильтрованных растений с помощью LC-MS/MS. Эффекты на содержание алкалоидов в растениях мака снотворного, инфильтрованных с помощью A. tumefaciens, содержащей pTRV1 и каждую из 2 областей REPI или COR1.3 в отдельных конструкциях pTRV2, оценивали с использованием полных ионных хроматограмм (фиг. 7А (панель D); фиг. 7В (панель D); фиг. 7С, панель D) и путем определения относительной представленности 9 различных алкалоидов (морфина, кодеина, тебаина, папаверина, носкапина, кодамина, лаудина и лауданозина) в млечном соке и корнях (фиг. 7А (панель Е); фиг. 7В (панель Е); фиг. 7С, панель Е). В дополнение к более низкому содержанию морфина сайленсинг REPI или COR1.3, вызывал существенное снижение уровней кодеина и тебаина. Сайленсинг REPI (т.е. гена AKR-CYP450), а также сайленсинг COR1.3 (т.е. гена AKR) приводил к существенному повышению накопления ретикулина, кодамина, лауданина, лауданозина и, не совсем постоянно, папаверина и носкапина. Отношение (R)-ретикулина к (S)-ретикулину- составляло приблизительно 21:79 во млечном соке контрольных (pTRV2) растений, но отношение (R)-ретикулина к (S)-ретикулину снижалось до приблизительно 2:98 во млечном соке растений с pTRV2-REPI-a (фиг. 7А (панель F) и растений pTRV2-COR1.3; фиг. 7В (панель F) и до приблизительно 5:95 в млечном соке растений с pTRV2-REPI-5', в млечном соке и корнях (фиг. 7С, панель F).

Пример 6. Каталитическая активность AKR в присутствии NADPH/NADH и NADP⁺/NAD⁺

[0154] Данный пример демонстрирует превращение 1,2-дегидроретикулина в (R)-ретикулин, катализируемое полипептидом AKR в присутствии восстановителей NADH или NADPH. Данный пример, кроме того, демонстрирует обратимость вышеупомянутой реакция в присутствии окислителей NAD⁺ или NADP⁺.

[0155] Эксперименты выполняли в основном, как описано в примере 3 выше, за исключением того, что реакции выполняли с использованием AKR, полученной из Papaver somniferum и из Papaver rhoeas, и что в обратной реакции (R)-ретикулин обеспечивали как субстрат и либо NAD⁺, либо NADP⁺ использовали в качестве окислителя для осуществления ферментативной реакции. Последнюю упомянутую реакцию проводили при рН 9. Как показано на фиг. 8, в присутствии как NADH, так и NADPH 1,2-дегидроретикулин с использованием каталитических количеств полипептида AKR как из Papaver somniferum (PsDRR) (фиг. 8А, панель А), так и из Papaver rhoeas (PrDRR) (фиг. 8В, панель А) превращали в (R)-ретикулин. Как далее показано на фиг. 8, с использованием как полипептида AKR PsDRR из Papaver somniferum (фиг. 8А, панель В), так и полипептида PrDRR из Papaver rhoeas (фиг. 8В, панель В) реакция может быть обратимой, и в присутствии NAD⁺ или NADP⁺ (R)-ретикулин превращается в 1,2-дегидроретикулин.

Пример 7. рН-зависимая активность AKR

[0156] Данный пример демонстрирует рН-зависимость полипептида AKR в присутствии как восстановителя, так и окислителя.

[0157] Проверяли рН-зависимость полипептидов CYP450 и AKR как из Papaver somniferum, таки из Papaver rhoeas. Ферментативные реакции выполняли в основном, как описано в примере 3 и в примере 6, за исключением того, что рН в каждой реакции постепенно повышали от рН 3,5 до рН 10. Активность ферментов при каждом оцениваемом рН количественно определяли анализом образцов с помощью HLPC Agilent 1260, соединенной с масс-спектрометром 6400 В с источником ионизации распылением электронов, функционирующим в режиме определения положительных ионов. Масс-спектрометр сканировал от 200-400 масса/заряд. Соединения разделяли с использованием способа HLPC для ферментного аналитического образца, описанного ранее (Farrow SC and Facchini, PJ, (2013), J. Biol. Chem. (288) pp 28,997-29,012; диоксигеназы катализируют О-деметилирование и О,O-деметилирование с широко распространенными функциями в метаболизме бензилизохинолиновых алкалоидов в маке снотворном).

[0158] Результаты представлены на фиг. 9. На панели А показаны графики, демонстрирующие активность ферментов как функцию рН с использованием CYP450 (PsDRS) и AKR из Papaver somniferum в присутствии NADPH (прямой PsDRS) и в присутствии NADP⁺ (обратный PsDRS). На панели В показаны графики, демонстрирующие активность ферментов как функцию рН с использованием CYP450 (PrDRS) и AKR из Papaver rhoeas в присутствии NADPH (прямой PrDRS) и в присутствии NADP⁺ (обратный PrDRS). Как можно видеть на фиг. 9, PsDRS и PrDRS превращают (S)-ретикулин в 1,2-дегидроретикулин оптимально при приблизительно рН 8. В присутствии NADPH PsDRR и PrDRR превращает 1,2-дегидроретикулин в (R)-ретикулин оптимально при приблизительно рН 7. В присутствии NADP⁺ PsDRR и PrDRR превращает (R)-ретикулин в 1,2-дегидроретикулин оптимально при приблизительно рН 9.

Пример 8. Генный сайленсинг гена слияния AKR и AKR-CYP450

[0159] Данный пример демонстрирует дополнительный сайленсинг генов, кодирующих AKR и/или CYP450 с использованием индуцированного вирусом сайленсинга генов (VIGS).

[0160] Эксперименты с сайленсингом генов выполняли в основном, как описано в примере 5, за исключением того, что нацеливались на гены COR (AKR) и REPI (CYP450) с использованием следующих конструкций: REPIa, REPIb и COR1.3. REPIa представляет собой конструкцию, которая нацеливается на консервативную последовательность как в гене COR, так и в гене REPI. Напротив, REPIb нацеливается на область, которая является уникальной для REPI. COR1.3 нацеливается на область, которая является уникальной для СОR. Уровни транскриптов REPI и COR определяли, как описано в примере 5. Пустой вектор использовали в качестве контроля (PTRV2). Как можно видеть на фиг. 10, растения, в которых REPI является уникальной мишенью для REPIb, демонстрируют пониженные уровни транскрипта REPI относительно контроля (фиг. 10 - верхняя панель), тогда как уровни транскрипта COR остаются главным образом такими же (фиг. 10 - нижняя панель). Растениях, в которых и REPI, и COR являются мишенями для REPIa, демонстрируют пониженные уровни транскрипта REPI (фиг. 10 - верхняя панель) и COR (фиг. 10 - нижняя панель). Если нацеливались на COR с использованием COR1.3, то уровни транскрипта COR понижались (фиг. 10 - нижняя панель). Кроме того, уровни транскрипта REPI также снижались относительная контроля (фиг. 10 - верхняя панель) в ответ на сайленсинг уровней транскрипта COR с помощью COR1.3.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Facchini, Peter J.

Farrow, Scott C.

Beaudoin, Guillaume A.W.

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ (R)-РЕТИКУЛИНА И ЕГО ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ

<130> 21806-P45160PC00

<150> US 61/911,759

<151> 2013-12-04

<150> US 62/050,399

<151> 2014-09-15

<160> 340

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 966

<212> ДНК

<213> Papaver somniferum

<400> 1

atggagagta atggtgtacc tatgatcact ctcagttccg gcattcggat gcctgcttta 60

ggtatgggaa cagctgaaac aatggtaaaa ggaacagaaa gagagaaatt ggcgtttttg 120

aaagcgatag aggtcggtta cagacacttc gatacagctg ctgcatacca aactgaagag 180

tgtcttggtg aagctatagc tgaagcactt caacttggtc taataaaatc tcgagatgaa 240

ctcttcatca cttccaagct ctggtgcgct gatgctcacg ctgatcttgt cctccctgct 300

cttcagaatt ctctgaggaa tcttaaattg gactatcttg atctatattt gatacaccat 360

ccggtaagct tgaagccagg gaagtttgtt aacgaaatac caaaggatca tatccttcca 420

atggactaca aatctgtatg ggcagccatg gaagagtgtc agacccttgg cttcactagg 480

gcaatcgggg tctgtaattt ctcatgcaaa aggcttcaag agttgatgga aacagccaac 540

agccctccag ttgtgaatca agtggagatg agcccgactt tacatcaaaa aaatctgagg 600

gaatattgca aggccaataa tatcatgatc accgcacact cagttttggg agccgtaggt 660

gccgcctggg gcaccaatgc agttatgcat tctaaggtgc ttcaccagat tgctgtggcc 720

agaggaaaat ctgttgccca ggttagtatg agatgggttt accagcaagg cgcgagtctt 780

gtggtgaaaa gtttcaatga agcgaggatg aaggaaaacc ttaagatatt tgattgggaa 840

ctaacggcag aagacatgga aaagatcagt gagattccac aatctagaac aagctctgct 900

gctttcttgt tatcaccgac tggacctttc aaaactgaag aagagttctg ggatgagaag 960

gattga 966

<210> 2

<211> 978

<212> ДНК

<213> Argmenone mexicana

<400> 2

atggaggaag ttattggctt ggaaactgtg gttccaaaag taaccctaag tagtagttca 60

ggtgacaatt ccatgccagt aataggtttt gggacagctg catctccaat ggctgatcat 120

gaaattacga aagctgctgt tctcgttggg atcgaaaatg gttatcgtca cttcgatact 180

gccgctgctt atggaacgga aaaggctgtt ggtgaagcca tagctgaagc cctacgtctc 240

ggtttgatca aatctcgagc tgaagttttt attactacta aactttggtg tagaagttgc 300

gaacgtgacc ttgttgtccc ctcactcaag aatagcctcc aggatttaca aacggattac 360

gtagatcttt tcctcataca ttggccagtg agactacgtc atgacgcagg acgacctcct 420

atttcgagag accaaatcct aacttttgat acaaaatcag tttgggaagg aatggaagaa 480

tgtcatgaat tagggctcgc aaaaaatatc ggagttagta acttttctat caagaagctc 540

gaagaattac tagccacggc aaagattccc ccggtgctcg atcaagtgga actgagccca 600

acttggcacc agaagaatct gatcgagtat tgtaaggaaa agggtattca tgtaacggct 660

tattcagctt taggagccaa taacacacat tggggaaaca atcgagtcgt ggagagtgat 720

gtgttaggtg agatagctaa ggctcgggga aaaactacag ctcagatcgc attgagatgg 780

gtatatgagc aaggtgtgag tatggtggtc aagagtttta accaagaaag gatgaaacaa 840

aaccttcaga tcttcgattt tgagttaact gaagaagagt caaataaaat cagtcaattt 900

ccacagcaca aaggagtaag cctgtctgca gtttatggtg atcatgatat actcaaggag 960

atggaagctg aactttga 978

<210> 3

<211> 969

<212> ДНК

<213> Argmenone mexicana

<400> 3

atggagaatg taattcctag agtgacattg agctctggaa gtgtgatgcc tatattaggt 60

atgggtacag catcataccc atttgttagt tcagaagaag ggaaattggc aatactgaat 120

gcaatcaaag taggttatag acactttgat acagcttcta cttacatgtt tgaggagttt 180

cttggtgaag ctatagctga agcaattcaa cttggactga tcaaatcccg taaagaactg 240

ttcattactt ccaaattatg gtgctgcgat gctcatcctg atcttgtcgt tccttctctt 300

cgaaactcat tacggaatct taagttggag taccttgatt tatatctgat acactttcca 360

gtaagcttga aggcagggag gtatgagtat ccacccctaa aggaagcttt agttctgatg 420

gattacaagt ctgtatgggc agccatggaa gagtgccaaa atcttggcct taccaagtca 480

attggtgtaa gcaacttctc ttgcaagaag cttcaaacta ttttggacta tgccaaaatc 540

cctccctcag ttaatcaagt ggagatgaat ccagtttggc aacagaagaa actgagagaa 600

ttttgcaagg ccaacgatat tgttatcact gcttactcac ctttaggagc tagtggaacc 660

ccgtggggat cgagcagagt acttgatgca caagttctgc atgaaattgc tagggctaaa 720

gggaaaactc atgctcaggt ttgtttgaga tgggtatacg aacaaggagt gagtttgctt 780

gtaaagacct tcaatgaaga gaggatgaag gaaaacctaa ggatatttga ctgggaactg 840

actgaagaag ataagcaaaa gatcagtaaa ataccacagc atagaggact gactggtgat 900

gcttttgtct cagaacatga aggggcaccc ttcaagactg cagaagagtt atgggatgga 960

gaagtttga 969

<210> 4

<211> 969

<212> ДНК

<213> Argmenone mexicana

<400> 4

atggatatga ataaacatgc ggttgtttat gttccaacaa aagtcatcat ggggattcca 60

gtgattggct ttggtacatc agctgatccc cctgtcgact ttgatacgac taggctggca 120

attatgcaag ctattgaaaa tggttacagg cattttgata cagctgctct ttataactcg 180

gaacagcctc ttggtgaagc tattaacgaa gccattagtc gtggattgat taaatctcga 240

gatgaacttt tcatcacttc caaattatgg tgcagcgata cccatccaca acatattctt 300

cctgccatac aaaagactct cagaaatctg aatatggagt atcttgatct gtatcttatc 360

cactggccag tgagttcgag gcacgaaaat tttgaatatc cgataaagaa agaagatttt 420

cttcctatgg attttaagaa agtgtgggcc gcaatggaag aatgtcataa acaggggctc 480

gcaaagttta ttggagtcag caatttctct tgcaagaaac ttgacaatat catggcctct 540

gcaacaattt ccccttcagt tcttcaagtg gaagtaaatc catgttggca acaaaaaagg 600

ttgatagatt tttgcaaagc taatggaata tttgtagttg cttatgctcc tttaggagca 660

gtggggacaa tttatggaac taatagagtt atggaatctg atgttctcaa gcaaattgcc 720

aagaaaagag gaaaaagtgt tgcacaggtt tgtttgagat gggcatatga gcaaggcatt 780

ggtgtggtgg tgaaaagctt taacaaggag aggatgaagc agaaccttga aatattcgat 840

tggaaactga gtgaagagga tacgaagaaa attagtgaaa ttcaacaaga tcgagcttgt 900

cttggaatgg attatacatc accatatgga ccttacaaga caataaaaca actatgggat 960

gaagagtaa 969

<210> 5

<211> 969

<212> ДНК

<213> Berberis thunbergii

<400> 5

atggaaattg ttcctaaagt gacattgaat tctggctatc aaatgcctct tttaggcttc 60

ggaacagccg aaaattggcc gtttaccaaa tctgaagcag ccaaacgggc aatactgtgt 120

gcaatcaaga atggctacag acactttgac acagcttcca tgtaccaatc agaggagtca 180

cttggtgaag ctatagtcga agcgcttcac cttggcctta tcaaatctcg gaatgaactc 240

ttcatcactt ccaagctatg gtgtagtgat tgtcaccaag atcgcgttct ccctgccctt 300

agggagactc tcaagaatct tcacttggat taccttgatc tttacctcat acattggccg 360

ctaagcgcaa agccagggaa gcatgagtac ccaatactaa aagataagct tcttcctatg 420

gactatgaat ccgtatgggg agcaatggaa gaatgccaga ggcttggcct ctctaagtcc 480

attggagtca gcaacttctc tagcaagaag ctggaacagc tactcaaaac tgcaaagatt 540

attcctgcag ttaatgaagt ggaagtgaac cctgtttggc atcaaaataa gctaatagag 600

ttctgtaagg ccaaaggtat tgttgtgact ggttactctc ctttaggtgc caaaggaaca 660

acttggggaa ccaataaagt catggacagt gaggtcctga aagagattgc taagactaga 720

ggaaagacac atgctcaggt ttgtctgaga tggatatacg agcaaggagt tggcctggtg 780

gcgaagagct ttaatgaaga gaggatgaag gagaatttgg agatatttga ttgggcattg 840

actgaagaag agtccaaaca gatcagccag ttaccacaat ataaagggca aaatggagaa 900

acgtttctct cagctgaagg gcctttcaag accttagagg agctatggga tgaagaggta 960

gcagcttga 969

<210> 6

<211> 963

<212> ДНК

<213> Berberis thunbergii

<400> 6

atggaaattg ttcctaaagt gacattgaat tctggctatc aaatgcctct tttaggcttc 60

ggaacagccg aaaattggcc gtttaccaaa tctgaagcag ccaaacgggc aatactgtgt 120

gcaatcaaga atggctacag acactttgac acagcttcca tgtaccaatc agaggagtca 180

cttggtgaag ctatagtcga agcgcttcac cttggcctta tcaaatctcg gaatgaactc 240

ttcatcactt ccaagctatg gtgtagtgat tgtcaccaag atcgcgttct ccctgccctt 300

aagaacacac tccagaatct tcaactggat taccttgatc tttaccttat tcattttccg 360

ctgagttcaa agcgaggtaa acttgagtat ccactacagg aagacgagac ctatcccatg 420

gatttcggat ctgtatggga agagatggaa aagtgccaaa gggttggtct caccaaatcc 480

attggagtca gcaatttctc tgctaagaag attgaacacc tactcacgac cgcaaagatt 540

atccccgccg ttgatcaagt tgagatgaat ccattgtggc aacaaaggac tctgagagag 600

tattgtaaga ccaaaggtat cgttgtgaca gcttactcac ctttaggtgc caaaggtgca 660

atttggggat ccaatatcgt tatggagaat gaggtgctag cagagattgc taaggctaaa 720

ggaaagaccc atgctcaggt atgtctgaga tcagtgtacg aaaaaggcgt tgcattggta 780

acgagaagct acaatgaaga aaggatgaag cagaatctaa acatatttga ttggaacttg 840

agcaaagaag agaccaaacg tatcgacaac ttgccacaaa aaagagtctt ccttggagaa 900

ggatttctgt ctcccctagg acccttcaag tctccagagg aactatggga tggagagatg 960

tga 963

<210> 7

<211> 975

<212> ДНК

<213> Corydalis chelantifolia

<400> 7

atgatggtga gtgttcctga ggtgacactg cagagtagtt ccagtgataa aaagatgcct 60

attatgggca tgggcactgc agcctatcct ttcgccgaat cagatgaagc aaaggctgca 120

ctcttaactt caatcaagct tggttacaga cattttgata cagcttcact gtaccacaat 180

gagaagtctg taggtaaagc tatatctgag gctcttaaac tcggactcgt caaatctcga 240

gatgaattct acatcaactc caagctatgg tgctctgatt ctcacccaga ccgagtcatc 300

cctgcccttc aagagtcact caagaagctt gggttggagt accttgatat gtatcttatt 360

cattggccat tgagcttgaa gaaagggagt tatgagttcc ctataccaac ggacgaggaa 420

atactaccta tggacttcaa ggcagtatgg gcagccatgg aggagtgcca aaagcttggc 480

ctcactaagt ccattggtgt cagcaacttt tcttgtaaga agcttgaaac aattctctct 540

acggccaaga tacctcctgt tgttaatcag gtggagttga acacactttg gcaacagacg 600

aaactaaaca aattttgtaa ggacaatggt atcgttctta tggcattttc ccctttggga 660

gctcacggaa gtccttgggg aacaaaccgt gttatggaat gcgagttact tcatgagatt 720

gcaaaggcaa aaggaaagac tcttgctcag gtttgtctga gatggatata tgagcaaggt 780

gctggtatat tagtaaagag ctacaatgaa gtgcggatga aggaaaacct ggagatattc 840

gattgggaat tgagtgcaga agagttgaaa agtatcagtg aacttccaca gcatagaggc 900

ttcccagctg attctctcct ctcagctaaa gggccattta gaactgaaga agagctctgg 960

gatggagaga tctga 975

<210> 8

<211> 1020

<212> ДНК

<213> Corydalis chelantifolia

<400> 8

atggagagtg ttgcttgtga gcctggagta atcgagcagc agcagtactt tattcccgag 60

gtgacctgcg gtggaggcag cagcaccacc aggatgagga tgcctgttgt aggcatgggt 120

acagcctcgt acccgtttgc tggatcagaa ggtgtaaagc aagctctctt acatgcaatc 180

aagcttggtt actggcattt tgatacagct tctttttacc agaccgagca atctctgggt 240

gaagctatct ctgaggcaat ccaacttggg ctgatcaaat ctagagatga actcttcatc 300

acttctaagc tgtggtgcac tgatgcacac aaagatcttg tcctccctgc ccttcaaaac 360

accctcagga atcttcaatt ggagtacctt gacctttacc ttatacattt tccgataagc 420

ttgaagccag ggagatatga tttccctgta caatcaaagg aggacctcct tccaatggac 480

tttaaatcta tatgggcaaa aatggaagag tgtcagggac ttgggctcac taaatccatt 540

ggtgtcagca atttttcatg caagaaactt gaaaatttac ttgccacagc caagattcct 600

cctgctgtta atcaggtaga gatgaatcca ctttggcaac aaaagaaact aagggagttc 660

tgtaaagcta atggtatcac tattacggcc cactcccctt taggagccaa aggaactaat 720

tggggaacca accgtgtagt agaatgtgaa gtgttgcacc agattgccaa ggctaaagga 780

aaatctcatg ctcaggtttg tttgagatgg gtatatgagc aaggagtgag tctgttggtg 840

aagagcttca acaaagaaag gatgaaagag aacctgggga tatttgactg ggaattgaat 900

gctgaagatt taaagaagat cagtgagatt ccacagggta gaggactacc tgttgatggt 960

tttctttcac caaatggtcc tttcaagtct gaagaagaat tttgggatgg agagatttga 1020

<210> 9

<211> 906

<212> ДНК

<213> Corydalis chelantifolia

<400> 9

atgcctgtag taggctttgg cacggctaaa tttccctttg gtgatgatga agcgattaaa 60

ttggcagttc ttgaaggaat caagcttggt tacagacact tcgacactgc tactaaatat 120

aaatcagaga agcctctcgg tgaaaccatt gttgaagcta ttaaccttgg tttaatcaaa 180

tctcgtgatg aattattcat cacgtccaaa ttatggtgtg gaagcactga gcgcagcctc 240

atcgtacctt cactcaagac gagtttacag aatctccaat tggactacct agatctttat 300

ctcatacatt ggcccctgag gtttagcacc gacgaaactc caacaccagt cccaaaggaa 360

caacttcttc cctttgacac caagtcagtt tggcaagcaa tggaagaatg ccaaaatctc 420

gggctcacga aatcgattgg tgtgagtaat ttctcatgca aaaaacttga agaattacta 480

tccactgcga agatcactcc ggcagttaat caagtggagt tgaacacatc ttggcaacag 540

acgaagatga gagagttctg taaaggaaaa ggtatacata taactggtta ttcacctcta 600

ggttcctatg gaacaaaatg gggagacaac agagttgttg agaatcaagt gttggaggag 660

attggcaagc ctagaggaaa aactgctgtt caggtttgct tgagatggat atatgagcag 720

ggagcaagta tggttgtcaa aagctttaac aaagagagga tgaaggctaa ccttgacatt 780

tttgattgga agttaactga ggaagagttg aagaggatca gtcagcttcc acagcataaa 840

gcatccctac ctactgcctc ctttggcgac catgatgaag ttagggagct tgactatgag 900

atctga 906

<210> 10

<211> 984

<212> ДНК

<213> Chelidonium majus

<400> 10

atggagagtg atagtgcagc agcagcagta gtagttccag taacgactct gagctcaggc 60

attgagatgc cgatgttagg tatgggaact gttgaaaact ttcttccagg ttccgaaaca 120

gtgaagttgg ctcttctgaa tgcaataaaa ttagggtaca ggcacttcga cacagctgct 180

atataccaaa ctgaggagtg tcttggtgaa gctgtagctg aagcacttca acttggtctg 240

atcaaatcta gagaccaact cttcatcact tccaagcttt ggtgttctga cgctcatcct 300

gatcttgtca tccctgctct tcagaactct ctcaggaagc tgaagttgga gtatcttgat 360

ttatatctgg tacattggcc gttaagctca aagccaggga actgtgtttt tccaatactc 420

aaggaggacc tccttccttt ggacttcaag tctgtgtggg cagccatgga agaatgtcaa 480

aagcttggcc tcacaaagtc aattggtgtt agcaacttct cttgtaagaa gcttcaagat 540

ttattgactt cggctatcat ccctcccgtt gttaatcaag tggagatgaa cccacgttgg 600

caacaaaaga aactgagaga gttttgtaag gccagagata ttgtggttac cgcctactcg 660

cctctgggag ccaaaggcac cgtgtatgga tccggtgcag ttatggactg cgaggtgttg 720

caccagattg ccaagattag agggaagtct gttgctcagg tttctctaag atgggtatac 780

cagcaaggtg tgacaccgtt agtgaagagt ttcaatgaag aaaggatgaa ggagaacatg 840

aagatattcg attgggaatt gtacgaagaa gacttaaaaa tgatcgacga gatcccacaa 900

agtagagtca acccttgtta ttttttcctc tcagaaaacg gacccttcaa gactgtagaa 960

gaattctggg atggagaagt ctaa 984

<210> 11

<211> 984

<212> ДНК

<213> Chelidonium majus

<400> 11

atggagagta gtaataatgc agtattagtt ccagtaataa ctctgaactc aggcagggag 60

atgccaattg ttggtatggg aacagctgaa aacctttttc aaggttcaga aagagtgaag 120

ttggctcttt tgactgcaat aaaggtgggt tatagacact ttgatacagc tgctgtttac 180

cagactgagg agtctcttgg tgaagctata gctgaagcac ttcaacttgg actgatcaaa 240

tctagagatg aactcttcat cacttccaag ctgtggttgc ctgattgtca ccatgatctt 300

gtcctccctg ctcttcagaa ttctctcagg aagcttaagt tggagtacct tgacctatat 360

ttgatacatt ggccggtaag ctcgaagcca ggagagatca agcatgttat accaaaggaa 420

gagctcctcc caatggattt caagtctgtg tgggcagcca tggaagaatg tcacaagctt 480

ggcctcgcca agtcaattgg agtcagcaac ttctcttgca agaagcttca agatttatta 540

gtcactgcca acatccctcc tgatgttaac caagtggaga tgaacccact ttggcagcag 600

acgaaactga gggaattttg taaggctcac ggcatcctcg ttgcagctta ctcgccttta 660

ggagccaaag gcactgcatg gggaagaacc aacggagtta tggactctga ggtgctacaa 720

cagattgcca aggctagagg aaagtctatt gcgcaggttt ctctacgatg ggtatatgaa 780

caaggggtgg ttttgttggt gaagagtttc aacgaggaaa ggatgaagga aaacctgaag 840

atattcgatt gggaattaag tggagaagac ttgaaaaaga tcagcgagat cctcccacag 900

cgtagaggac tccctagtca tgtttttgtc tccgatgacg ggccattcaa gtctgaggaa 960

gaactctggg atggagaagt gtga 984

<210> 12

<211> 984

<212> ДНК

<213> Chelidonium majus

<400> 12

atggagagta gtaataatgc agtattagtt ccagtaataa ctctgaactc aggcagggag 60

atgccaattg ttggtatggg aacagctgaa aacctttttc aaggttcaga aagagtgaag 120

ttggctcttt tgactgcaat aaaggtgggt tatagacact ttgatacagc tgctgtttac 180

cagactgagg agtctcttgg tgaagctata gctgaagcac ttcaacttgg actgatcaaa 240

tccagagatg aactcttcgt cacttccaag ttgtggattc ctgattgtca ccatgatctt 300

gtcctccctg ctcttcaaaa ttctctcagg aagcttaagt tggagtacct tgacctctat 360

ttgatacatt ggccagtaag ctctaagcca ggggagctca ggtcacttat accaaaggag 420

gagctccttc caatggattt caagtctgtg tgggtggcca tggaagaatg tcacaagctt 480

ggcctcacaa agtcaattgg tgttagcaac ttctcttgca agaagcttcg agatttattg 540

ctcactgcca acatccctcc tgctgttaac caagtggaga tgaacccgct ttggcaacag 600

aagaaactga gggagttttg taaggccaac ggtatcgtca ttgcagctta ctcgccttta 660

ggagccaaag gcactgcatg gggaagaacc aacgacggag ttatggactc tgagttgcta 720

caaaagattg ccaaggctag aggaaagtct acggcgcagg tttctctacg atggggatat 780

gaacaagggg tgattttgtt ggtgaagagt ttcaatgaag agaggatgaa ggaaaacctg 840

aagacattcg attgggaatt aagtggagaa gacttgaaac agatcaacga gatcctccca 900

cagcgtagag gacatagcca tgaatttatc tcagataacg ggccattcaa gtctgaggaa 960

gagctatggg atggagaagt gtga 984

<210> 13

<211> 987

<212> ДНК

<213> Chelidonium majus

<400> 13

atgggtgagg aaatgatcaa gacgagtagt gttgaaattc cagtagcgac tctaagcact 60

gggaggacga tgccgttgtt aggtatgggg acagcagcat acccatttgt ggggtcagat 120

ggagtggtga aagcgattct gcacgcgatt aagctagggt acaggcactt tgatacagct 180

gctctatact ttacagagga atgtcttggt gatgctgtag ctgaagcact tcgccttgga 240

ttgatcaaat ctcgagatga actcttcatc acctcaaagt tatattgctg tgatgctcat 300

cctgatcgcg tcgtccctgc tcttcagaac tctctcagga agctgaaaat ggagtacctt 360

gatctatatt tgatacattg gccggcaagc acacacgaag ggaacttcga atttccttta 420

caaaagcagg atatccttcc tttggatttc aagtctgtgt gggcagctat ggaagaatgt 480

caaaagcttg gcctcaccaa gtcaattggt gtcagcaact tctcttgcaa gaaacttcaa 540

gatttactag cctcggctaa gatccctccc gctgttaatc aagtggagat gaacccaatt 600

tggcaacaga ataaattgag ggaattctgc aaggcaaatg atatccacat tacagcgtac 660

tcgcctttgg gggccaatgg aactccttgg ggctctagtg gagttgccga aactcaagtg 720

ctgcacgaca ttgctaaggc tagagggaag actcatgctc aggtttgttt gcgatgggta 780

tatgagcaag gtgtgagtgt gttggttaag agttacaatg aagagaggat gaaggagaat 840

ctggctgtat tggattggga attgagcgaa gagaacttga agaagattag tgaaatccca 900

caacgtagag gacttcctgg tgatatcttc gtctcagata acgggccttt caaaactgta 960

gaagagctct gggatggaga agtatga 987

<210> 14

<211> 921

<212> ДНК

<213> Cocculus trilobus

<400> 14

atgccagtgg tggggatggg gttggcagcc tatccatttc aagaatcaga ggtagtgaag 60

ttggcaatgc taagggccat tgagatgggt tacaggcatt tcgacacggc tgcgctgtac 120

cagacagagc agtcacttgg tctagccatt gcagaagcgc ttgagcttgg cttgatcaag 180

tcccgtgatg agctcttcat cacttccaag ctctggtgca gtgatgctca tcctcacctt 240

gtcattcctg ctcttcaaag gactctcaag aatcttgggt tggactatgt tgatctctat 300

ctcatacact ggccagtgag ctcaaacaaa ccaggaaagt atgattttcc agtaccaaag 360

gaagaactag ttcaaatgga ttatgaatct gtatgggcag ccatggaaga gggacatagg 420

cttggcctca caaagtccat tggtgtaagc aacttttctt gtaagaagct tgagaattta 480

ctcacaatag caaaggtccc tcctactgtc aatcaagtgg agatgaaccc cttttggcga 540

caatataaac tgaaagagtt ctgcaaggaa aagggaatta ttatcactgc ttactcacca 600

ttgggagcca aaggaactat ttggggcacc aacaaagtta tggaatctaa agtgcttgaa 660

gacattggaa ttgctagtgg aaagactctt gctcaggtct gtctgagatg ggtgtatgag 720

caaggagtga ctcttttggt aaaaagcttc aatgaggaga ggatgaaggg gaacctagac 780

atatttgatt gggaattaag tgagaaagag ctgaaaaaga tcaatgagat tccacagagc 840

agaggactcc ctggtgacat ctttgtgtca gatgatggac ccttcaagtc tgaagcagag 900

ctctgggatg gagaagtttg a 921

<210> 15

<211> 966

<212> ДНК

<213> Eschscholzia californica

<400> 15

atggggagtt gtagtatacc agtgaagagt ctgagctcag gaagggagat gcctgtaata 60

ggtatgggaa ctgctgacag caatctagca ggctctgatg cttcaaggat agcactagtg 120

aaagctatag aggttggtta tagacacttt gatacagctt caatttacca gagtgagcaa 180

aaccttggag atgccattgc tcaagcactt gaacttggtc tcatcaaatc tagagatgaa 240

ctattcatta cttccaagct atggtcttca gattctcacc ccgatcgtgt cgtccctgct 300

cttcaagaat ccctcaggaa gcttaaattg gagtatcttg atctatatct aatacattgg 360

ccggcaagtt cgacaccagg gatttatgag ttccctatac caaaagatga gatctttcca 420

ttggagtatg agactatttg ggcagccatg gaagaatgtc agaggcttgg gcttacaaaa 480

tctattggtg ttagcaactt ttcttccaag aagctccaaa ctatattgaa caccgccacc 540

atccctccgg ctgccaatca agtggagatg aacccagttt ggcaacagaa gaaattgaaa 600

gagttttgtg acgccaacaa tatcctgctt actgcatatt cgcctttggg tgctaaagga 660

acctcgtggg gaagcaataa agttatggag tctgaggttc tgaaacaaat tgctatggcg 720

aacgggaagt ctgttgctca ggttagtctg agatggttat accaaatagg tgcaactatg 780

gtagtgaaaa gttacaatgc agaaaggatg aaggagaacc tgaagatatt cgattgggag 840

ttgagtgatg aagacatgaa agcaatcagc gagattcctc agcgtcgaaa ttttgctggt 900

gatattctga tttcaagtaa cgggcccttc aaatccgaag acgaactctg ggatggagaa 960

gtatga 966

<210> 16

<211> 972

<212> ДНК

<213> Eschscholzia californica

<400> 16

atgagtagtt atggtagtgt accaatgaag tcactaaact caggaagtaa aattcatgtt 60

ttagggtttg gaacagctgc ttacccattt gtgggatcag atggtgtgaa gaatgccatt 120

cttaatgcta taaagttagg ttataggcat tttgacacag ctgctctcta cttcactgag 180

gagtctcttg gtgaagctgt ttctgaagca cttcaacttg gtctcatcaa atctagagat 240

gaactcttca tcacttccaa gctttggatt tctgatgctt atcctgatcg tgtcctcccc 300

gccattcaaa aaacacttcg gaaccttaaa atggagtacc ttgatctata cctgatacac 360

tggcccatta gtgggaaaga ggggaatttt gatcttcctg tacctaaaga ttgtctccag 420

gaattggact acaagccagt gtgggcagcc atggaagaat gtcaaaagct tggactcact 480

aaatccattg gtgttagcaa tttctcttgt aagaaacttc aaatcattct ctcctcagct 540

accatccctc ctgctgttaa tcaggtggag atgaacccaa tttggcacca gaagaagttg 600

agagaatttt gtaaggccaa taatatcatg attgctgctt attcgccgtt aggagctgct 660

gggaccccat ggggatcctc cggtgtcgtc gagaccgaag tgctacacga gatagccaga 720

agtagaggca aaactcatgc tcaggtttgt ttgagatggg tatatgagca aggggtgatt 780

gtgttggtga agagctttaa tgaagagagg atgaaggaaa acctatctgt gtttgactgg 840

gagttgacgg acgaagactt gaagaaaatc agtcaaattc ctcaacgtag aggacttcct 900

agtggtgata tttgggtctc gacagaagga cctttcagat ctgaagaaga gctttgggat 960

ggagaaatct aa 972

<210> 17

<211> 975

<212> ДНК

<213> Glaucium Flavum

<400> 17

atggagatga gtagtgcaca agtagttcca ctaatgactc taaactcagg caaggagata 60

cctgtattgg gcatgggtac tgctgaaaac catttccaag ggtctgatgg aacaaaagat 120

gcacttgtta atgcaataaa aattggttac agacactttg acacagctgc tatatataac 180

gttgaggagt gtcttggtga tgctatagct gaagcacttc aacatggtct catcaaatcc 240

cgtgacgaac ttttcatcac ttcaaagcta tggatatctg attcccaccc tgaccgtgtc 300

ctctttgctc ttcaaaattc tctccggaag cttaagttgg agtaccttga tctatatctg 360

atacattggc cgttaagctc aacgccaggg aaatcggtgt ttccggtacc caaggaggac 420

ttcctacctt tggacttcaa atctgtgtgg gcagccatgg aagaatgcca aaaacttggc 480

ctcaccaagt caattggtgt cagcaacttc tcttgcaaga agctccaaga tttattggac 540

attgccaaca tccctcctgc agttaatcaa gtggagatga gcccactttg gcaacagaag 600

aaacttaggg agttttgtaa ggtcaatggt atacttgtta cagcttactc gcctttagga 660

gccaaaggca ccttctgggg ctctaatgaa attatggact ctcatgtgtt acaagagatt 720

gctaaggcta gagggaagtc tgttgctcag gttactctca gatgggtata tgagcaagga 780

gtgattttgt tggtgaagag ttttaatgaa aatagaatga aggagaatat ggcgatattt 840

gattgggatt tgagcatcga cgacttgaaa aaattcgatg agatctcaca gcgcagagga 900

aaccttggcg atttttttgt ttcagaaaac gggcccttca agtctgtaga catggtttgg 960

gatggagagg tctaa 975

<210> 18

<211> 981

<212> ДНК

<213> Glaucium Flavum

<400> 18

atggagagta gtagtagtag tgcagtagta gttccagtaa tgactctgaa ctcaggcaag 60

gagatgcctg tattaggtat gggaactgct gaaaacaatc ttcaagggtc tgagaaaaca 120

aaattggctc ttttgactgc tataaaagcc ggttacagac actttgacac agcttctgca 180

tacaatactg aggaggcact aggtgaggct gtggctgaag cacttcaact tggtctcatt 240

aaatctcgag acgaactctt catcacttcc aagctatggt gctctgatgc tcaccctgga 300

cttgttgtcc ctgctcttca aaattcacta cggaatctaa agttggagta tcttgatcta 360

tatctgatac attggccagt aagtttaaag ccgggaaaat tcgtgattcc tttttccaag 420

gaggacatcc ttcctttgga cttcaaaaat gtctgggcag ctatggaaga atgtcaaaag 480

cttggccttg ccaagtcaat tggtgtcagc aacttctctt gcaagaaact ccaagactta 540

ttggcaattg ccaacatccc tcctgctgtt aatcaagtgg agatgagccc actttggcaa 600

cagaagaaac tgagggagtt ttgtaaggtc aatggtatac ttgttacagc ttactcgcct 660

ttaggagcca aaggcacctt ctggggctct aatgaaatta tggactctga tgtgctaaac 720

caaattgcta aggctagagg aaagtctgtt gctcaggttt ctctcagatg ggtacacgag 780

caaggggtga ttttgttagt gaagagtttt aatgaaaata gaatgaagga gaatatggcc 840

atatttgact gggaattgag caacgacgac ttgaaaaaga tggatgagat ctcacagcgt 900

agaggacccc ttgctgatat ttttgtttca gaaaacgggc ccttcaagtc tgtagacatg 960

ctttgggatg gagggttctg a 981

<210> 19

<211> 981

<212> ДНК

<213> Glaucium Flavum

<400> 19

atggggagta gtgatgcagt agtagttcca gtaaagactt tgagctcggg gaggaagatg 60

cctgtaatag gcatgggaac tgctgaaatc cttcttgtgg acgggtccga aaaagtgaag 120

ttggctcttc taaatgctat taaaattggt tacagacact ttgatacagc tgctgtgtac 180

cgaactgaag aggctttggg tgaggttgtg gctgaagcaa ttcaacttgg tctcatcaaa 240

tctagagacg aactattcat cacttcaaag ttatggttat ctgattctca ccctgatctt 300

gttctccctg ctcttcagaa ctctctaagg aagcttaagt tcgagtatct tgacctatat 360

ttgatacatt ggccattaag ctcaaagcca ggggagctga aggttcttat accgaaggag 420

gaactccttc ctttggactt caaatctgtg tgggcagcca tggaagaatg tcaaaaactt 480

ggtctgacaa agtcaattgg agtcagcaac ttctcttgca agaagcttca agatttattg 540

gacattgcca acatcccacc cgcggttaac caagtggaga tgaacccact ttggcaacag 600

aaaaaattga atgagttttg taaagccaat gatatcgtca ttacagctta ctcgcctttg 660

ggagccaaag gcaccccttg gggatccaat agagttatgg actctgaggt attaaaccag 720

attgccaagg ctagaggaaa gtctgttgca caggttgctc ttagatgggt atatgaacaa 780

ggtgtgagtc tagtggtaaa aagttttaac gaagagcgga tgaaggaaaa cgtgacgaag 840

atatttgatt gggaattaag cgcagaagac ttgaaaaaga tcgaggaaat cccacaatgt 900

agaggagtcc ctagccatgt ttttgtctca gttaacgggc ctttcaaatc tgaagaagag 960

ctgtgggatg gtgaaatcta a 981

<210> 20

<211> 984

<212> ДНК

<213> Glaucium Flavum

<400> 20

atgggtgagg aaatgaagat caagagtgtt gaaattccag tagtgacact aagctctgga 60

aggaccatgc ctgtgtttgg tatgggtacc gcagcattcc catttgtagg gtcagatgga 120

gtggtgaaag ccattactca tgctataaag cttgggtata ggcactttga tacggctgca 180

ctctacttca ctgaggagtc tcttggtgat gctatagctg aagcacttcg acttggactg 240

atcaaatctc gagatgaact attcatcact tctaagctat ggtgctgtga tgctcatcct 300

gatcgtgtcc tccctgctct gcgcaactct ttgaggaatc tgaaaataga gtatctagat 360

ctatacttga tacattggcc ggcaagcaca cacgaaggga acttggaatt tccaatacaa 420

aagcaggaca tccatccttt ggattacaat tctgtatggg cagccatgga ggagtgtcaa 480

acgcttggcc tcaccaagtc aattggagtc agcaacttct cttgcaagaa gcttcaacat 540

atattagcca ttgccaagat ccctcctgct gttaatcaag tggagatgaa cccaatttgg 600

caacagaaga aattaagaga attctgcaag gccaatgata tccatattac agcttactcg 660

cctttaggag ctaatgggac cccttggggg tctagtggag ttgttgagac tcaagtacta 720

catgacattg ctaaggctag agggaagact catgctcagg tttgtctaag atgggtatac 780

gagcaagggg tgattgtatt ggtgaagagc tacaatgaag aaaggatgaa agagaatctg 840

actgtattcg attgggaatt gagcgcagag gactcgatga agatcagtga gatcccacag 900

catagaggac ttcctggtga tattttcgtt tcagacagtg ggcctttcaa gtctgaagag 960

gagctttggg atggagaagt ctga 984

<210> 21

<211> 960

<212> ДНК

<213> Hydrastis canadensis

<400> 21

atgggtagtg ttcctaatgt aattcttagc tctggtcatc caatgcctct tgttggcttt 60

ggcactgcgg gttttccatt tggaacatca gaaggtataa agtcagcaat actctgtggg 120

atcaagaatg gttacagaca cttcgatacg gcttccgtgt accaaacaga acagatactt 180

ggtgaagcta tagctgaagc acttgagcta ggcctcatta aatctagaga tgaactcttt 240

ttaacctcca agctatggtg cagtgatgct catcaacaac atgttctccc tgcccttcag 300

aagactctaa ggactcttca gctggattat cttgatcttt atctagtaca ctggccactg 360

agctcaaaac cagggaagta tgagtaccca ataccaaagg aagagcttct tcccatggat 420

ttcaaatctg tctgggctgc aatggaagag tgccaggctc ttggcctcac aaagtccatt 480

ggggtcagca atttctcttg taagaaactt gaacaattac tctccacttc aaacatccct 540

cctgctgtca atcaagtgga ggtcaaccca atttggcaac aaaataagct gagagagttt 600

tgtaaggcca aaggtataat tgttgctgct ttttctcctt tgggtgctaa aggaacatct 660

tggggaacta ataaagttat ggattctgag gtgctgaatg agattgccca ggctagagga 720

aagactactg ctcagaattg tcttagatgg ttacatgagc aaggtgtgtg tgtggtggtg 780

aagagcttca atgaggagag gatgaagggg aacctgaaat tatttgattg ggaattgagt 840

aaggaagagt ctaagaagat cagccagtta ccgcagagta aaggacatac cggagatgac 900

atggtctcgg ccaatgggcc atttaagtct ttagaggagc tatgggatgg agagatttga 960

<210> 22

<211> 960

<212> ДНК

<213> Hydrastis canadensis

<400> 22

atgacaagaa ttccagagat tgtgttgaac tcaggatgga ggatgccagt tttggggatg 60

ggaacagcaa cctttcctat ccaatcccca gaagtcattg agtcttccat tgttaacgcc 120

atcgaattgg gttatcgaca cttcgacaca gctagtgtat atcagtctga gtcacctcta 180

ggccgtgcca tatcagaagc tatacgtcga ggcctcattg agagtcgaaa agaggtcttc 240

atcacctcga agctatggtg cactgatgca caccatgacc ttgttatccc agctctccac 300

aaaactctcc agaatctggg gttggagtac ttggacttgt acctgattca tttcccagtg 360

agactgaaag gagacatatc ctttgacatt aagaaggcag accttatacc ctttgatgta 420

aagggtacat gggaggccat ggagaagtgt caagagctgg gacttaccag atctattggt 480

gttagcaact tttcatctaa gaagctttcc gagcttttaa cccatgctac catttctccc 540

gctgtgaatc aggtggaaat gcacccattt tggcaacaga aggaattgag agctttctgt 600

gcagacaaag gtatacatgt aagtgcttat tctcctttgg gaggaaaggg tgctttatgg 660

ggctccgaca tattactcaa ctccaaagag atcgaacgga tcgctcaagc taaaggaaag 720

agcatcgcgc aggtatgctt gagatgggca tatgaacaag gggtgagtta cttaccaaaa 780

agctacaata agggaaggat gaaagagaac atggaaattt ttgactggca attgagtgaa 840

gatgagttac aaaagatcag tcacctgcca caaggaaaga tatacacagg acatcatttt 900

atatcagatg atggggaata taaatctcct attgatttat gggattgtga gatatgttag 960

<210> 23

<211> 963

<212> ДНК

<213> Hydrastis canadensis

<400> 23

atgggtatag ttcgtgaggt agtgttgaat tctggggaaa gaatgccatt gctaggaatg 60

ggaacagcaa catacccagt tgctccattt gaactagttg agtcttcagt aattgctgcc 120

attgaacttg gttataggca ttttgacaca gcaagtgtgt atgagacaga gcaacctcta 180

ggcctagcca tatctgaagc cgtccggcaa ggccttatcg ctagtcgtga tgaaatcttc 240

ataaccacta agctttggtg tggtcatgca cattatgatc ttgttctacc agctcttcgg 300

gactcactag aaacgatggg gttggattat gttgatctgt acttgattca ttttcctgca 360

agattcaaca tgaaagagaa gagcttaaat gtgaataaga aagatcttct tcctttggat 420

ataagaggga catggaaagc tatggaggaa tgttatgaac ttggcttagc aaagtcaatt 480

ggtgtcagca acttcagttg caaaaagcta tctcaacttt tgtctgttgc taacattccg 540

cctgcagtga atcaggtgga gatgcatcct ctttggcaac aacagaagtt gagagagttt 600

tgtgaagaaa aaggtataca tgtgagtgct tattctcctt taggaggaaa agggaccata 660

tggggctcca acgcagtttt ggactcagat caaatcaaac aaatagctaa ggctaaaggg 720

aagagtattg ctcagatttg tttgagatgg ggatttgaac atggagtgag cattttacca 780

aagagcttca acaaagaaag gttgaaagaa aatatggaga tatttgattg ggagctaagc 840

aaggaagagt tacaaaagat gaataccttt cctcaaaata gaatttttca agctgagcat 900

ttagtctcac ctgatgaggg actgtttaaa tctgttgctg atttgtggga tggtgaaatc 960

taa 963

<210> 24

<211> 954

<212> ДНК

<213> Jeffersonia diphylla

<400> 24

atggggattg ttcctgaggt gacattgaac tctggccatc agatgcctct tgtaggcttt 60

ggaacagcac agtttccttt tccagagggg gatgaagcaa aacaaattat agctccaata 120

ctatgtggaa tcaagagtgg ttacagacac ttcgacacag cttccctgta caaaactgag 180

gaagcacttg gagaagctat aaaagaggca cttcgtcttg gccttatcaa atctcgagac 240

gagctattca ttacctcgaa gctttggtgt actgattctc atcaagatct tgttcttcct 300

gcccttaaga agactctcca gaatcttcag atggactacc ttgatctata ccttgtacat 360

tttccagtaa gctcaaagcc gggaaagcca gagttcccac cacagaaaga ggaccttctt 420

cctatggatt ttggatcggt atgggcagca atggaagagt gccagaggct cggtctaacc 480

aaatcaattg gagtcagtaa tttctcttgc aaaaagttag agcaactact cacaacagca 540

aagattattc ccgcggttaa cgaagtggag atgagcccag tttgccaaca gaataagctg 600

agagagtttt gtaaggtaaa aaacattgtt gtgactgctt actctcctct aggtggagga 660

agcaatgcag ttaaggacaa taaggtgctg aaagaaattg ccaaggctaa aggaaaaaca 720

tgtgctcagg tcactctgag atgggtatac gagcaaggtg ttgctctggt gcctaagagc 780

ttcaatgagg ggaggatgaa ggaaaacctg gatatattta attggacaat aagtgaagaa 840

gagttcaaac agatcagcca gttaccacag ggtagagtgg caactggaga atggtttgtg 900

tcggttgaag ggccattcaa gtctctagag gaactatggg atgaagtgat ctga 954

<210> 25

<211> 966

<212> ДНК

<213> Mahonia aquifolium

<400> 25

atgggtgttg tacctgtggt aaccctgaac tctggtcatg agatgccact agtaggcttt 60

ggaacagcag tgcctgcctt cgggggatca gacgccataa agcaagcaat actatgtgga 120

atcaagaatg gttacagaca cttcgacact gcttctgtat accaaacaga gaagtcgctt 180

ggagaagcta tagtggaagc gcttcgcctt ggcctcatca aatctcgaga tgaactcttc 240

attacctcca agttatggtg tacagatgct catcaagatg gcgttctccc tgcccttagg 300

gagactctca agaatcttca gttggattac cttgatcttt accttataca ttggccgcta 360

agcgcaaagc cagggaagca tgagtaccaa ataccaaagg atgagcttct tcctatggac 420

tatgaatccg tatggggagc aatggaagaa tgccagaggc ttgacctctc taagtccatt 480

ggagtcagca acttctctat caagaagctt gaagagctac tcaaaactgc aaagattatt 540

cctgcagtta atgaagtgga agtgaaccct gtttggcatc aaaataagct aatagagttc 600

tgtaaggcca aaggtattgt tgtgactggt tactctcctt taggtgccaa aggaacaact 660

tggggaacca atagagtcat ggacaatgag gtcctgaaag agattgctaa gactagagga 720

aagacccatg ctcaggtttg tctgagatgg atatacgagc aaggagttgg cctggtggcg 780

aagagcttta atgaagagag gatgaaggag aatttagaga tatttgattg ggcattgact 840

gaagaagagt ctaaacagat cagccagtta ccacaatata aagggcaaaa tggagaaacg 900

tttctctcag ctgaagggcc tttcaagacc ttagaggagc tatgggatga agagatagca 960

gcttga 966

<210> 26

<211> 963

<212> ДНК

<213> Menispermum canadense

<400> 26

atggcgagtg ttccagaggt gacactgagc tctggccatc caatgcctct ctttggcttc 60

ggcaccgcag cctggccttt tgtgtcttca gaaggagcta agtctgcaat attgtgtggg 120

atggagctcg gttacagaca cttcgacact gcttccattt acggcacaga gagctctctc 180

ggcgaagcca tagccgaagc tcttaagctc ggcatcatca agtctcgcga cgagctcttc 240

atcacctcta agctctggtg ctgcgacggg caccatgacc gagtcttgcc tgcccttcaa 300

atgactctaa agaatcttca attggactac attgatctgt atctcgaaca ctggccattg 360

agctcagtcc ctaaaggtga gcttgagtac ccaataccaa aagaaaaact gtttcctatg 420

gatttgaagg ctgtgtggga agccatggaa gagtgccaga ggcttggcct caccaagtcc 480

attggagtca gcaacttctc ttgcaagaag cttgaagatt tactcgcctt cgcgaagatc 540

cctccggccg tcaatgaagt ggagatgaac ccagtttggc aacagaagaa actgagggac 600

ttctgtaagg ctaaaggtat tgttttgacg gcttactcag tgttaggagc caaaggaacc 660

ctttggggca ctaacaaagt tatggactct gaggtgctag gaaagattgc caaggcaaga 720

ggcaagactg ttggtcaggt ttgtttgaga tgggcatatg agcaaggtgc gtgtgtgttg 780

gtgaagagct tcaatgagga aagaatgaaa gagaacttag agacatttaa ctgggagtta 840

ggagaggaag acttgaagat gattagtgaa ataccacaat ataaaggact tcgtggtgag 900

gatatggtgg ctcctaatgg gccttacaag actttagagg aactttggga tggagagata 960

tga 963

<210> 27

<211> 1026

<212> ДНК

<213> Menispermum canadense

<400> 27

atgggagttg ataagacaaa cgagttctct aatggcaacg cagcgagccc agtactgatc 60

aaagaggcta acctctttaa gattgccgag gtgacgttga actccggtca ccatatgccg 120

gttctgggaa ctgggacggc ttcgtttccg tttcctccgt tgaaggagct gaagaaggcg 180

atcgtggaag ccatggaagt gggctatcgc cacttcgact cggccgcgct gtaccagagc 240

gaggaagggc tcggtgcagc catagctgag gctttggaga agggacttgt gaagaagaga 300

gaagaactat tcatcaccac caagctatgg tgcaataatg cccactctga tcgtgtcctg 360

cccgccattc gtgaatctct caggaaacta agactagact atgtagattt gtatttgatt 420

catttcccag taaggctgaa ggaagattta ttggatatga attgtaagaa gggtgggatt 480

tttgaacttg acctcaaatc agtatgggca gcaatggagc agatacaaca cctaggtctt 540

gcaaagtcaa ttggagtcag caacttcact tgtaagaagc ttactgacct tctttcttat 600

gcaaagatcc ctcctgcagt taatcaggta gaaatgcatc cagtgtggca acaaaagaag 660

cttagagact tctgcaagga gaaaggcatc catgttagtg catattctcc tctaggagca 720

aagcaatggg gatttgatgt tgttctcggt aacaaaatct tgaaagagat tgcacaagac 780

aaaggaaaga caattgctca gattgcttta agatggggat atgagcaagg agtgattttg 840

atcccaaaga gctttaacaa gggaaggttg actgaaaatc ttcgcatatt tgactggaag 900

ctaactgaag atgaattaaa gaagatttca tcaattcaac agagccgagt agctataatg 960

cctgaatttg tgtttcctga aagtccattc aagacctttg aagatttctg ggatggggaa 1020

atgtga 1026

<210> 28

<211> 969

<212> ДНК

<213> Menispermum canadense

<400> 28

atggaaggag gaggagttcc taagatactc ttgaattcag ggcataggat gcctgtgctt 60

ggaatgggca cagcttcctt cccaatctca ccacaacacc tcgtcaagtc ttccatacta 120

accgctatcg aacttggcta cacccacttc gacaccgcaa gcgtctatga gactgagcct 180

acactcagcc gggctatccg ccaagccctc gagggtagac acattgcgag ccgagaccag 240

ctcttcatca ccaccaagct ctggtgcggc caagcacaaa gcgatctcgt cgtcccagct 300

cttcgcgaat cacttcagga acttgggttg gactatgttg atctgtactt gattcatttt 360

ccagctagat ttaagtgtgt ggagaagaca tttaatgtca ccaaagagga tcttcttcct 420

ttggacatga aggggacatg gcaggccatg gaggagtgtt gtaaacttgg cctggccaag 480

tccattggtg tcagcaactt cagctgcaag aagctctctc agattctcac ctttgccacc 540

atccctcctg cagtcaatca ggtggaaatg cacccattat ggcagcaaag gaaactgaga 600

gagttctgta aggagaaagg catccatgtg agtgcctact ctcctttagg tgggaaaggt 660

gccaagtggg gttccaatgc agtgtttgaa tgtgaagaaa tcaaacagat tgctgaagct 720

aaagggaaga gtttggctca gatttgtctg aggtgggctt ttgagcaagg tgtgagtttt 780

gtgccaaaga gctttaacaa ggaaaggttg aaagagaaca tggagatata tggttgggag 840

ctgagcaagg aggaattgca aaagttaagt gttctgccac agtgcaggat cttcaaagga 900

gaatggctag tgtcagctga tcatggagtg ttcaaatcag ttgaagattt gtgggatgga 960

gaaatataa 969

<210> 29

<211> 960

<212> ДНК

<213> Nandina domestica

<400> 29

atggtgagtg ttccagaggt aaccctgaac tccggtcacc ggatgcctct tgtgggtatg 60

ggcacggcat gctttcctct tccaggatca gaagtggtga agtcggcgat ggtaacggca 120

atcaagcttg gttatcgcca cttcgatacc gctgcgcttt accagagcga gcagcctcta 180

ggtgaagcta tagctgaagc acttcacctt ggcctcataa tatctaggga tgaacttttt 240

atcacctcca agctatggtg tactgatgct caccaagatc ttgttctccc tgctcttaag 300

acaagtctcc gaaatcttca gttggattac cttgatcttt accttataca ttttccggtg 360

agtttgaagc cagggaagat acagctgccg gtaccaaagg aagagcttct tccaatggat 420

ttcaagtctg tgtgggcagc catggaggaa tgtcagaagc ttggcctcac aaagtccatt 480

ggagtaagca atttctcttg caagaaactc gaacacatac tttcattggc aaagattcct 540

cctgcagtta atcaagtgga gctgaaccca atttggcgac aaaaaaagct catcgagttt 600

tgtaaggcca aaggtattgt tgttacggca tattctcctt tgggagctgt agcacccggt 660

caaggcagca atagagtcat ggaatgtgaa gtgctgagcg agattgcaaa agctcgagga 720

aaaactcatg cgcaggtttg tcttagatgg ataattgagc aaggggtcag tttagttgtg 780

aaaagcttca atgaggacag gaagaagaag aacttggaga tattcgactg ggaattgagc 840

gaagaagatt ccaaaaaaat cagccagata ccagagacta gaggaaaccc cggagatttt 900

gtcatctctg ttgatggtcc ttataagtct agagaggagc tttgggatgg agaaatctga 960

<210> 30

<211> 960

<212> ДНК

<213> Nandina domestica

<400> 30

atgggaagag ttcctgagac taccttgagt tctgggcata acatgccatt gttggggatg 60

ggaacagcaa ccttccctct ccctccatct gaattgatag aatcttatat tcttgctgcc 120

attgaaatgg ggtatagaca ctttgacact gctagtgttt acgacacaga agtacccctt 180

ggtcgagcca tatctgaagc cctccggaga ggtcttgtgg caaatcgtga tgaactcttc 240

attaccacca aactctggtg tggtcatgca catccagatc tcgttgttcc agctcttcac 300

caatctctca tggaaatggg attggaatat gtggatttgt atttgattca ttttccagct 360

aggtttaaca aaaaggaaaa gaactttgat gtgaagaaag aggaagtcat tcccttggac 420

atgaagggaa catgggaagc catggaagag tgtagcaaac ttggacttgc aaagtccatt 480

ggtgtaagca acttcagctg caaaaagctc tctcaactcc tcacctatgc cactatccct 540

cctgcagtga atcaggtaga aatgcaccct ctttggcaac aatggaaatt gagagaattt 600

tgcgtagcaa atgatataca tgtgactgcc tattctcctc taggggggaa aggagcattg 660

tggggttcga attcagtgct cgattcaaaa gaaatccaac aaatggctga agcaaaagga 720

aagagtatcg ctcagatatg tttgagatgg gcatttgaac aaggagtaag cttcataccg 780

aaaagcttca atgtcgaaag gctaaaagaa aatatggaaa tatttgattg ggaaatgaac 840

aagaatgagt tgttgaaaat gagtttgctt ccacaaaaaa ggactttcac tgcagaatat 900

ttggtatcac ctgatggggc gtttaaatcg gttgacgatt tatgggatgg ggagatataa 960

<210> 31

<211> 960

<212> ДНК

<213> Nigella sativa

<400> 31

atggcaagag tacctgagat aaccttaaac tccggccacc ggatgcctct cttgggtatg 60

ggaactgcag tagttccctt taaagaacca gaaccagtga agtcagcaat actcactgca 120

atcaagaatg gttacaggca cttcgataca gcttctctgt accgaactga gccagccctt 180

ggagatgcta tagctgaagc acttcaactt ggcctcatca actccaggga cgaccttttc 240

atcacctcca agctctggtg cactgacaac caccctgatc tggtcctccc tgcactgcac 300

acaacacttc gaaatctgaa gttggactac cttgatctat atctaataca ttggccagta 360

agcatgactc cagggagaat tcggttccct gggccggatg agaagatact tccaatggat 420

tacaagtctg tatgggcagc catggaagag tgtcaaaagc ttggcctcac aaaatcaatt 480

ggagtcagca attttacctg caagaagctt gaattgttac tggcatcagc tactatccct 540

cctgctgtta atcaagtgga ggtgaaccct atgtggcaac aggaaaagct gatagagttt 600

tgtaggacta aaggtattgt tgtaacagct tacgctccct tggggactgt tggaacattt 660

ataggtaaca acgatattat gaactgtgag ttactgaaag aaattgccca agctaaagga 720

aagacaaatg gtcagatttg tctcagatgg gtacatgaac aaggagtggg tctgctagta 780

aagagcttca ctgaggtgag aatgaaacag aatcttgaga tatttgattg ggaactaagt 840

gaagaagaat caatgaaaat taaacaactg ccacaaagaa agagtcatca agggaagggc 900

tttgttactg ctgatggacc attcaaatcg ttgacagagc tttgggatgg agagatgtga 960

<210> 32

<211> 954

<212> ДНК

<213> Nigella sativa

<400> 32

atggtttatg agatcatgtt gaactctgga tacagaattc cattgctggg aatgggaaca 60

gcagcctatc cagtgcctcc accagagcta gtggagtctt ctgttcttgc tgcaattgaa 120

ctcggttata ggcactttga cactgcccat atttatggaa cggaagcacc tttgggaaga 180

gccatatcag aagccttgag gaagggattg atcaaaagtc gagatgaact cttcataact 240

actaagctct ggcctggcca tgcacgccct gatcttgttc tacaagcttt gcatcaatct 300

ttagaagctt tgaggattga ttacgttgat ctgttcctaa ttcattttcc agcacggtac 360

aacacaacag aaataagaat ggatataaag aaggaagaca tccttccttt ggatatcaag 420

ggaacatggc aggccatgga agagtgttgt aaacttggct tggccaagtc catcggtgtc 480

agcaacttcg gttgcaagaa gctatcccaa ctattggatt cagccactat cccacctgca 540

gttaatcagg tggaaatgca tcctctctgg caacaagcaa aactgagaga gttttgtgca 600

gaaaggggta tccatgtcag tgcctattct cctttaggag gaaaggggac tctctgggga 660

tccaatgcag tgcttgattc tgagcaaatc aaacagattg cacttgctaa ggggaagagt 720

gtagcgcaga tatgcttgag atggggtttt caacaaggag taagcatcat agcaaagagc 780

ttcaacagag aaagactcaa agaaaatatg gaaatatttg attgggaatt gaacaaggaa 840

gaactataca agctaagcat ccttcctcaa aataggattt caacccttga atatttagtg 900

tcaccggatg cagttttcaa atcaattaac gatttgtggg atgaagaagt ttga 954

<210> 33

<211> 957

<212> ДНК

<213> Nigella sativa

<400> 33

atggataaca gtgtagtagt gctgaattct ggacatagaa tgccattgtt agggatggga 60

acagcagcca ctcctttacc tcccaatgaa gttgtccagt cttcagttct tgctgcaatc 120

gaactgggtt acaggcattt tgatacagca agtgtgtatg gctcagaagt gattttaggt 180

agagccatat ctgaagcttt aaggagaggt ttggttgcta gtagagatga gcttttcata 240

actactaagc tttggtgtgg taatggacac cctgatcttg ttcttggtgc tcttcaagaa 300

tctttaagaa ttatggagct ggattatgtg gacttgtact tgattcattt tcctgtgaga 360

ttcaatataa cagagaagct cttaaatatg aagaatgttc ctcttcttcc ttttgacatg 420

gaagggacat ggcaagctat ggaggagtgt tgtagactgg gtttagccaa gtccattggt 480

gttagcaatt ttagttgcaa aaggctatct gaacttctac tttccgcttc catccctcct 540

gctgtgaatc aggtggaaat gcatccgctt tggcagcaaa gaaatatgag agagttttgt 600

agaaaagaag gaattcatgt gagtgcttat tctcctttag gaggaaaagg agcagcttgg 660

gggtcgaatg cagtgctaga ttctgaagat atccaacaaa tagctcaaca taaagaaaag 720

agtgttgctc aggtatgctt gagatgggcg tttgagcaag gagtgagcat tatagtaaag 780

agtttcaata aagaaaggct taaagaaaat acacaaattt tcgactggga gctcaacaaa 840

caagagttgc agagaatcaa tactcttcca caaaataaga tttttaaagc ttcaaatttg 900

atttcagcag atggaccata taaaacattt gaggaattgt gggatggaga ggtatga 957

<210> 34

<211> 960

<212> ДНК

<213> Papaver Bracteatum

<400> 34

atggagagta atggtgtacc tatgatcact ctcagttccg gcattcggat gcctgcttta 60

ggtatgggaa cagttgaaac aatggaaaag ggaacagaaa gagagaaatt ggcgtttttg 120

aaagcgatag aggtcggtta cagacacttc gatgcagctg ctgcatatca aactgaagag 180

tgtcttggtg aagctatagc tgaagcactt caacttggtc taattaaatc tcgagatgaa 240

ctcttcatca cttccaagct ctggtgcact gatgctcacg ctgatctcgt cctccctgct 300

cttcagaatt ctctgaggaa tcttaaattg gagtatctgg atctatattt gatacacttt 360

ccgctaagct tgaaaccagg gaagattgtt aacgaaatac caaaggatca aatgcttcca 420

atggactaca aatctgtgtg ggcagccatg gaagagtgtc agacccttgg cttcactagg 480

gcaatcggtg tcagcaattt ctcatgcaaa aagcttcaag agttgatggc gacagccaac 540

agccctccag ttgtaaatga agtggagatg agcccgattt tccaacaaaa aaaattgaga 600

gcatattgca aggccaataa tatcatgatc actgcatact cggttttggg atccagagga 660

gccgcatggg gcagcaatgc agttatggat tctaaggtgc ttcacgagat tgctgtgtcc 720

agaggaaaat ctgttgctca ggttagtatg agatgggttt accagcaagg cgcgtgtctt 780

gtggtgaaaa gtttcaatga agagagaatg aaggaaaacc ttaagatatt cgattgggag 840

ctatcggcag aagacatgga aaagatcagt gagattccgc aatgtagaac aagctctgtt 900

gatttcttgt tatcaccgac tgggcctttc aaaactgaag aagagttctg ggatgagtag 960

<210> 35

<211> 966

<212> ДНК

<213> Papaver Bracteatum

<400> 35

atggagatta atggtgtacc agtgatcagt ctaagctcgg gcgttcggat gcctgcttta 60

ggtatgggaa cagctgaaac aatggaaaaa ggaaccgaca gagagagatc agcgtttttg 120

aaagcgattg aggtcggtta caggcacttc gatacagctg ctgcttatca aactgaagag 180

tgtcttggtg aagctatagc tgaagcactt caacttggtc taattaaatc tcgagatgaa 240

ctcttcatca cttccaagct ctggtgcact gatgctcacg ctgatctcgt cctccctgct 300

cttcagaatt ctctgaggaa tctcaaattg gagtatcttg atctatattt gatacacgct 360

ccggtaagct tgaagccagg gaagattctt aacgaaatac caaaggatca aatgcttcca 420

atggactaca aatctgtgtg ggcagccatg gaagagtgtc agacccttgg cttcactagg 480

gcaatcggtg tcagcaattt ctcatgcaaa aagcttcaag agttgatggc gacagctaat 540

agccctccag tggtaaatga agtggagatg agccccactt tacatcaaaa aaatctgaga 600

gaatattgca aggccaataa tatcatgatc attgcatact cggttttggg agccagagga 660

accggatggg gcagcaacgc agttatggat tctaaggtgc ttcaccagat tgctgtggcc 720

agaggaaaat ctgttgctca ggttagcatg agatgggttt accagcaagg tgcgtgtctt 780

gtggtaaaaa gtttcaatga agagaggatg aaggaaaacc ttaaaatatt cgattgggaa 840

ctaacggaag aagacatgga taagatcagt gagattccgc aatccagaac actatctgct 900

gatttcttgt tatcaccgac tggacctttc aaaactgaag aagagttctg ggatgaaatg 960

gtttga 966

<210> 36

<211> 972

<212> ДНК

<213> Papaver Bracteatum

<400> 36

atgaggaata ctggtgtacc tgtaatcact ctgagctcgg ggaaggggat acctgtttta 60

ggtatgggaa catttgaaac agttggtaaa gggggtgaac gagagaggtt ggcgtttttg 120

aaagcgatag aggtgggtta cagacacttc gatactgctg cgtgctacca aactgaagag 180

tgtcttggtg aagctataga ggaagcactt caacttggcc taatcaaatc tcgagatgaa 240

ctctttatca cttctaagct ctggtgcacc gacgctcacc ctgaccgtgt cctgttggct 300

cttcagaatt ctctgaggaa tcttaagttg gagtatctgg atctatacct gatacacttt 360

ccagtaagct tgaagccagg gaatgaggtt actatggatg cagcaggggg cgaaattttt 420

ctaatggact acaagtctgt atgggcagcc atggaagagt gtcagaacct tggcttcact 480

aagtcaatcg gtgtcagcaa tttctcctgc aaaaagcttc aggaattatt ggcgacagca 540

aacatccctc cagttgtaaa tcaagtggag atgagcccag ttttccacca aaagaatctg 600

agagagtatt gcaaggccaa taatatactg gtggctgcat actcgatttt gggaggcaag 660

ggaaccgcat ggggctccaa ttcagttttg ggttccgagg ggcttaacca gattgctatc 720

gccagaggaa agtctattgc tcaggttagc atgagatggg tatacgagca aggcgcgatt 780

cttgtggtga aaagtttcag tgaaaagaat atgagggaaa acttgaacat attcgattgg 840

gaactgacta aggaagacct ggaaaggatt ggtgagattc ctcagcgcag attaataatt 900

caggaattta tggtatcatc taatggacct ttcaaatctc tagaagagtt ctgggatgaa 960

aaagctgatt ga 972

<210> 37

<211> 966

<212> ДНК

<213> Papaver Bracteatum

<400> 37

atggagaatg taatacctgc agtgacatta agttctggaa gtgtgatgcc tatattaggt 60

atgggcactg ctgcataccc attagttgaa ccagaagaag cgaaattggc gtttttgaat 120

gctatcaaga ttggttacag acattttgat acagctgctt cttaccattg tgaaggattt 180

cttggtgaag ctatagctga agcacttcaa cttggtttga taaaatctcg agacgaactg 240

tttatcactt ctaagctctg gccctgtgat gctcaccctg accttgtcat ccccgcaatt 300

cagaactctc taaggaatct aaagttggag taccttgatc tatatctgat acattttcca 360

ataagcacga aaccagctgc agggcttgtt tttccgccac caaaggatgc tttgcttcca 420

atggattaca agtctgtatg ggcagctatg gaagagtgtc aaaaacttgg tcttacaaag 480

tcaattggtg tcagcaactt ctcttgtaag aagcttcaaa ccattttgga cattgctaac 540

atccctccag ctgttaacca agtggagatg aacccagttt ggcagaactt gaaattgagg 600

gacttctgca aggctaacaa tatcgttctc actgcctact cacctttagg agccagggga 660

accccgtggg ggtctaatgc agtctatgag gagcgagttc tgcatgaaat tgctgaggct 720

aaagggaaaa ctcatgcaca ggtgtgtcta agatgggtat acgagcaagg agtgagtctt 780

atagtcaaga gcttcaatga gttgaggatg aaggagaata tgatgatttt cgactgggaa 840

ctgactgaag atgaactgca aaagataggc aaaatcccac agaggagagg actcccaggt 900

gatttttttg tctcggaagc agcgcctttc aagactgtcg aagaattttg ggacggagaa 960

atttga 966

<210> 38

<211> 969

<212> ДНК

<213> Papaver Bracteatum

<400> 38

atggaggttg taatccctaa agtggcactg agttctggta gagtgatgcc tgtgctagga 60

atgggcacat catcattccc gccagttggt ccggaagatg gaaaagccgc cattttgaat 120

gctatcaaga ttggttatag acactttgat acagcttctg tttacaagtc tgaagacttc 180

ctcggtgaag ctatagctga agcacttcta cttggattga tccaatctcg agaccagctt 240

ttcattactt ccaagttata ttgcaatgat gctcaccctg atcttgttgt ccctgcttta 300

cagaactctc tcaggaatct gaggctggag taccttgatc tatatctgat acactttccg 360

gtaagctcaa agccagtcaa gtacgagtat catctaaaaa aggagcatct cctccctatg 420

gactacgaat ctgtgtgggc agccatggaa aagtgtcaaa agcttggact tacaaagtca 480

attggagtca gcaatttctc ttgcaagaag cttcaaacta ttttggacac tgctaacatc 540

tctcctgctg ttaatcaagt ggagatgaat ccagtttggc aaaacttgaa actgagggat 600

ttctgcaaag ctaaaggtat cgttgtcact gcctactcac ctttgggagc cagcggaacc 660

ccctggggat ctaatgcagt caaagaagca caggaattgc acgaaatcgc aaaagctaga 720

gggaaaactc atgctcaggt ttgtcttaga tgggtatacg agcaaggagt gagcttgcta 780

gtcaagagct tcaaagaaga acggatgaaa gagaacctaa tgatctttga ttgggagttg 840

actaaagatg atttgttcaa aatcagcaaa attacacaac gcagaggact accaggttat 900

aggttcatct cgaaacttga agggtcaccc ttcaagacgg tcgaagaatt ctgggatgga 960

gaagtttaa 969

<210> 39

<211> 966

<212> ДНК

<213> Papaver Bracteatum

<400> 39

atggagagta gtggtgtacc agtaatcact ctgagatcgg gcaaggtgat gcctgtttta 60

ggcatgggaa catttgagaa agctggtaaa gggtctgaaa gagagaggtt ggcgatatta 120

aaagcgatag aggtgggtta cagatacttc gacacagctg ctgcatacga aactgaagag 180

gttcttggag aagctattgc tgaagcactt caacttggcc taatcaaatc tcgagatgaa 240

cttttcatca gttccatgct ctggtgcact gatgctcacc ctgatcgtgt cctcctcgct 300

cttcagaatt ctctgaggaa tcttaaattg gagtatgtgg atctatatat gttacccttc 360

ccggcaagct tgaagccagg gaagataacg atggacatac cagaggaaga tatttgtcca 420

atggactaca ggtctgtatg gtcagccatg gaagagtgtc aaaaccttgg cctcactaaa 480

tcaatcggtg ttagcaattt ctcctgcaaa aaacttgagg aattgatggc gaccgccaac 540

atccctccag ccgtgaatca agtggagatg agcccggctt tccaacaaaa gaagctgaga 600

gagtattgca acgcaaataa tatattagtc agcgcagtct ctatactggg atcaaacgga 660

accccatggg gctccaatgc agttttgggt tctgaggtgc ttaagaaaat tgctatggcc 720

aaaggaaaat ctgttgctca ggttagtatg agatgggttt acgagcaagg cgcgagtctt 780

gtggtaaaaa gtttcagtga agagagattg agggaaaact tgaacatatt cgactggcaa 840

ctcaccaagg aagacaatga aaagatcggt gagattccac agtgcagaat cttgagtgct 900

tattttttgg tctcacctaa agggcctttc aaatctcaag aagagttgtg ggatgacaaa 960

gcttga 966

<210> 40

<211> 972

<212> ДНК

<213> Papaver Bracteatum

<400> 40

atgggaagta gttgtattcc tgttctcact ttgaactcgg gcaataagat gcctgtttta 60

ggtatgggaa catttgaaac atttgctaaa gggggtgaaa gagaaagatt ggcgtatttg 120

aaagcgatta aagtgggtta cagatacttc gatacaggcg ctgcatacgg aacggaagag 180

gttcttggcc aagctatagc tgaagcactt caacttggcc taataaaatc tcgagatgaa 240

ctcttcatca gtaccatgat ctgggccact gatgctcacc ctgatggtgt cctccccgct 300

gttcagagat ctttaaggaa tcttaaattg gactatgtgg atctctacct gataccattt 360

ccggcaagct tgaacccaga aggggagata cctaattaca taccagagaa cgaaactttt 420

ttaaaaatgg actacaagtc tgtatgggca gctatggaag agtgtcaaac ccttggcttt 480

accaagtcta tcggtgtcag caatttctcc tgcaaaaagc ttcaggaagt gatggagacc 540

gcaaatatcc ctccggctgt caacatggtg gaaatgaacc ctactttcca acaaaaatat 600

ctgagagagt actgcaaggc caataatata ttagtcaatg cgtactctgt tttgggatcc 660

acgggaactt catggggctc caatgcagtt atgggttctg aggtgcttaa gcaaattgct 720

acggacatag gaaaatctat tgctcaggtt agtatgagat gggtttacga gcaaggtgcg 780

ggttttgtgg taaaaagttt cagtgaagag aggatgaggg aaaacttgaa catattcgac 840

tgggagctga ctaaggaaga cttggagaag atcagtcaga ttccacaatg cagagtacta 900

cctatggatt ttttggtatc atctgatgga gctttcaaat ctttggaaga cttgtgggat 960

ggtgaagctt ga 972

<210> 41

<211> 912

<212> ДНК

<213> Papaver Bracteatum

<400> 41

atgccgatct taggttttgg aacagctgaa aacctttttg aagggggtga taaagtgaag 60

ttggcgattt tgaaagcgat agaggtgggt tacagataca ttgatacagc tgccgtgtac 120

cgaactgaag agtctgttgg tgaagctgta gcagaagcac ttcaacttgg cttgataaaa 180

tctcgagacg agctattcat aacctccaag ctatggggtg tcgatgctca tcctgatctt 240

gtcctcccag ctcttcagaa ctcattgagg aaacttaaat tggagtattt ggatctgtat 300

ctgatacact atccggtaag cttgaagcca ggggagatgg tcgatgatat accgaaggac 360

gaaatatttc cactggacta caagtctgta tgggcagcca tggaagagtg tcagaagctt 420

ggctacacta agtcaatcgg ggtcagtaat ttctcttgca aaaagcttca acagcttatg 480

gccacagcta acatacctcc agctgtaaat caagtggaga tgaacccaac ttggcaacaa 540

aagaatctaa gggaatactg taaggccaac aatatcttca ttacagcata ctcgactttg 600

ggagctaaag accttttatg gggctccaat gcagttttag gctctaaagt gttgaaccag 660

attgccgtgg ccagaggaaa atcagttgcc caggttagtc tgagatgggt ttacgaacaa 720

ggtgtgagtc ttgtggtgaa aagttttaac gaggagagga tgaaggagaa cttgaagata 780

tttgattggg aactgaccac agaagacttg aaaatgatca gtgagatccc tcaacgcaga 840

gtagcaactg cggatttttt tgtgtcagat attggaccct tcaaatcttt agaagagctg 900

tgggatgaat aa 912

<210> 42

<211> 921

<212> ДНК

<213> Papaver Bracteatum

<400> 42

atgccggttt taggactggg aacagctgaa aaccttacta aaggttctga aagagagatg 60

ctggcgattt tgaaggcgat agaggtgggt tacagacact ttgatacagc tttcatatac 120

caaactcaag agtgtgttgg tgaagctata gctgaagcac ttcaactagg tatcatcaaa 180

tctcgggatg aactctttat cacttccaag ctctggggtt ctgatgctca ccctgattgc 240

gtcctcctgg ctcttcagaa ttctctaagg aatcttaaac tgcagtatct ggatctatat 300

ctgatacact atccagtaag cttgaagcca gggacaactt tgaaagattt ggggaataag 360

gacaacttcc ttccaatgga ctacaagtct gtatgggcag ctatggaaga gtgtcagaag 420

cttggcctca ctaagtcgat aggtgtcagc aacttctcct ccaaaaagat tcaagagcta 480

atgagcacag acagcatccc tcctgccgta aatcaagtag agatgaaccc cacatggcaa 540

caaaagaaac tgagagaata ttgtcaggcc aacaatatct tagttactgc atactctcct 600

ttgggagcta aaggaaccac atggggatcc aatgcggtta tgggatctga ggtactgaac 660

cagattgccc ttgccagagg gaaatctgtt gctcagatta gtctaagatg ggtttacgag 720

caaggtgtga gtctcgtggt gaaaagcttc aatgaagaga ggatgaggga gaacctgaaa 780

atatttgact gggagctaac tgccgaagac ttgaaaaaga tagatgagct tccacagagc 840

agagtggcaa ctgctgaatt tgttgtatca gagaatgggc ccttcaagtc tttagaagaa 900

ttttgggatg acgagtcctg a 921

<210> 43

<211> 966

<212> ДНК

<213> Papaver Bracteatum

<400> 43

atggagaatg caatacccgc ggtaacattg aattctggaa gtgtgatgcc tgtattaggt 60

atgggaactg ctgcataccc atttgtcgaa tcagaagaag cgaaattggc gattttgaat 120

gctatcaaga ctggttacag acatttagat actgctgctc tttaccagtc tgaagaatca 180

cttggtgaag ctgtatctga agcaattcaa cttggtttga taaaatctcg agacgaactg 240

tttatcactt ctaagctctg gccctgtgat gctcaccctg accttgtcat ccccgcaatt 300

cagaactctc taaggaatct aaagttggag taccttgatc tatatctgat acattttcca 360

ataagcacga aaccagctgc agggcttgtt tttccgccac caaaggatgc tttgcttcca 420

atggattaca agtctgtatg ggcagctatg gaagagtgtc aaaaacttgg tcttacaaag 480

tcaattggtg tcagcaactt ctcttgtaag aagcttcaaa ccattttgga cattgctaac 540

atccctccag ctgttaacca agtggagatg aacccagttt ggcagaactt gcaattgagg 600

gacttctgca aggataagag tatcattctc actgcctact caccattaga agggaaggga 660

accccgtggg ggtctaatgc agtctacgga gcacaagttt tgcatgaaat tgctgaggct 720

aaaggcaaaa ctcacgcaca ggtttgtctg agatgggtat atgagcaagg agtgagtctg 780

ctagtgaaga gcttcaatga tcagaggatg aaggaaaaca tgatgatttt cgattgggaa 840

ctgaccgagg atgaactgga aaagataagc agaatcccac agaggagagg actcccaggt 900

gatttttttg tctcggaagc agcgcctttc aagactgtcg aagaattttg ggacggagaa 960

atttga 966

<210> 44

<211> 966

<212> ДНК

<213> Papaver Bracteatum

<400> 44

atggagaatg caatacccgc ggtaacattg aattctggaa gtgtgatgcc tgtattaggt 60

atgggaactg ctgcataccc atttgtcgaa tcagaagaag cgaaattggc gattttgaat 120

gctatcaaga ctggttacag acatttagat actgctgctc tttaccagtc tgaagaatca 180

cttggtgaag ctgtagctga agcaattcaa cttggtttaa taaaatctcg agacgaactt 240

tttatcactt ctaagctatg gccttgtgat gcacaccctg accgtgtcgt ccctactctt 300

cagaactctc taaggaagtt aaagttggag taccttgatc tatatctaat acattggcca 360

gtaagctcga acccagtggc agggcatgtg ttatcgctgc caaaggattc tttggttaca 420

atggattacg agtctgtatg ggcagctatg gaagagtgtc aaaaacttgg tcttacaaag 480