Способ улучшения функции иммунных клеток и оценки мультифункциональности иммунных клеток - RU2731098C2
Код документа: RU2731098C2
Чертежи
Описание
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу улучшения функции иммунных клеток; к иммунным клеткам с улучшенной функцией; и к средству для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанное средство содержит в качестве активного ингредиента иммунные клетки с улучшенной функцией. Настоящее изобретение также относится к способу оценки мультифункциональности иммунных клеток.
Предшествующий уровень техники
T-клетки служат в качестве иммунных клеток и составляют от 70 до 80% от всех лимфоцитов периферической крови. T-клетки присутствуют в селезенке или в лимфоузлах, распределенных по всему организму, и вносят свой вклад в биологическую защиту. T-клетки подразделяются на цитотоксические T-клетки (CD8+-T-клетки), которые непосредственно воздействуют на вирус-инфицированные клетки или раковые клетки, и на хелперные T-клетки (CD4+-Т-клетки), которые способствуют улучшению функции иммунокомпетентных клеток, таких как цитотоксические T-клетки. T-клетки имеют T-клеточные рецепторы (TCR), экспрессирующиеся на поверхности T-клеток и распознающие антигены. Одна T-клетка экспрессирует TCR, который специфически распознает антиген конкретного типа. Такое свойство называется специфичностью T-клеток к антигену. T-клетки играют важную роль в развитии различных иммуноассоциированных клинических состояний, включая инфекции; опухоли; заболевания, вызываемые трансплантацией органов; и аллергии.
В последние годы был выявлен механизм иммунного истощения и появились сообщения о том, что ингибирование связывания молекул, ответственных за иммунное истощение, с их лигандами, играет важную роль в лечении рака. У некоторых раковых пациентов наблюдается значительное снижение иммунного ответа (иммунное истощение). Иммунное истощение вызывается экспрессией маркеров истощения, таких как PD-1, Tim-3, Lag3 и т.п., под действием CD8+-T-клеток, и эти маркерные молекулы истощения (молекулы, ответственные за истощение), связывающиеся с их лигандами, вызывают потерю способности к одновременному продуцированию IL-2, TNFα и IFNγ (мультифункциональности), а также клеточноую гибель в результате апоптоза (Непатентные документы 1-6). Для предотвращения такого апоптоза и иммунного истощения CD8+-T-клеток необходимо подавлять экспрессию самих молекул, ответственных за иммунное истощение. Однако, в настоящее время такой технологии не существует, а поэтому единственным способом улучшения функций CD8+-T-клеток и предупреждения апоптоза является ингибирование связывания молекул, ответственных за иммунное истощение, с их лигандами. При этом известно, что определенные виды (определенное число) молекул истощения ответственны за увеличение продуцирования цитокинов, а поэтому в настоящее время проводятся исследования по поиску соответствующего числа молекул и лигандов, связывание которых необходимо ингибировать. Кроме того, поскольку очевидно, что такой способ может вызывать побочные эффекты, желательно разработать способ, дающий меньшее число побочных эффектов.
Для мониторинга иммунного статуса при патологическом состоянии или для оценки эффективности вакцины важную роль играют методы количественной и качественной оценки специфичности T-клеток к антигену, где указанные методы применяются для оценки мультифункциональности иммунных клеток. Для пациентов, подвергаемых иммунотерапии, такой как противораковая вакцинная терапия, необходимо осуществлять антигенную стимуляцию клеток in vitro в течение 1 или 2 недель для оценки терапевтического эффекта. Примерами методов оценки T-клеточной функции являются анализы на цитотоксичность; методы ELISA для детектирования продуцирования цитокинов; методы детектирования молекул, секретируемых клетками всех групп, с помощью иммуноанализа на флуоресцентных сферах; анализ на внутриклеточные цитокины (анализ на окрашивание внутриклеточных цитокинов: метод ICS) на проточном цитометре (FCM, FACS); и методы детектирования секреции молекул на отдельной клеточной основе методом ELISPOT (с помощью иммуноферментного спот-анализа).
Хотя уже известные методы оценки функции T-клеток позволяют провести точный анализ отдельных Т-клеточных функций, однако, результаты такого анализа необязательно будут коррелировать с прогнозом. Более конкретно, достаточно трудно точно определить иммунную кинетику у здоровых индивидуумов или у пациентов, например, с инфекциями, трудно поддающимися лечению, или раковыми заболеваниями, и сделать прогноз результатов лечения с помощью иммунного активатора. Известные методы улучшения функции T-клеток имеют тот недостаток, что они не позволяют значительно повысить необходимый иммунитет у пациентов, страдающих, например, инфекциями, трудно поддающимися лечению, или раковыми заболеваниями, или у здоровых пациентов, и тем самым, выявлять какие-либо симптомы. В первом случае, условия оценки иммунной кинетики для точного подтверждения или предсказания терапевтических эффектов являются недостаточно хорошими, и кроме того, пока не существуют способы объективной оценки и анализа эффективности методов и технологий улучшения различных функций T-клеток (способов оценки мультифункциональности иммунных клеток, используемых для прогноза результатов лечения).
Так, например, при введении вакцин почти всегда необходимо вводить адъювант вместе с антигеном, однако, адъювант может вызывать серьезные побочные эффекты. До сих пор еще не получен адъювант, который был бы безопасным, эффективным и применимым для всех вакцин. Кроме того, при многих инфекционных или раковых заболеваниях, достаточный протективный иммунитет не может быть достигнут путем введения вакцины, несмотря на увеличение числа CD8-позитивных T-клеток-киллеров в периферической крови в ответ на введение вакцины. Чаще всего, такое отсутствие эффекта при применении вакцины, вероятно, обусловлено иммунным истощением. Исходя из вышесказанного очевидно, что пока еще не существуют какие-либо методы объективной оценки иммунной кинетики и не выявлены агенты, улучшающие функцию T-клеток, а также не разработана комбинированная технология, которая включала бы в себя метод повышения мультифункциональности клеток посредством устранения иммунного истощения различных иммунных клеток и метод точного и простого предсказания и оценки конечных эффектов.
В Патентном документе 1 указывается, что метформин служит для усиления эффектов химиотерапевтических лекарственных средств, однако, в примерах Патентного документа 1 указывается, что сам метформин не дает желаемого эффекта при лечении опухоли. В Непатентном документе 7 описан механизм действия метформина как терапевтического средства для лечения диабета типа II.
Список цитируемых документов
Патентные документы
Патентный документ 1: JP2013-503171A
Непатентные документы
Непатентный документ 1: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99:12293-7
Непатентный документ 2: Cancer Res. 2004; 64: 1140-5
Непатентный документ 3: J. Exp. Med. 2010; 207: 2187-94
Непатентный документ 4: Trends Immunol. 2011; 32: 345-9
Непатентный документ 5: Cancer Res. 2011; 71: 3540-51
Непатентный документ 6: Nat. Rev Cancer. 2012; 12: 252-64
Непатентный документ 7: Nature 2006; 439: 682-687
Описание сущности изобретения
Технические проблемы
Целью настоящего изобретения является активация иммунных клеток ex vivo и разработка способа улучшения функции иммунных клеток, а также получения иммунных клеток с улучшенной функцией. Другой целью настоящего изобретения является разработка способа оценки мультифункциональности иммуноассоциированных клеток.
Способы решения указанных проблем
Для достижения вышеуказанных целей, авторы настоящего изобретения сосредоточили свое внимание на цитокинах, продуцируемых CD8+-T-клетками, и на функциях иммунных клеток, а также провели крупномасштабное исследование. В результате, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, способствует увеличению числа CD8+-T-клеток, обладающих способностью продуцировать IL-2, TNFα и IFNγ на высоком уровне, и, тем самым, улучшению функций этих клеток; и на основании этих данных, авторами было разработано настоящее изобретение. Мультифункциональность иммунных клеток оценивают путем сравнения мультифункциональности иммунных клеток, обработанных антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом, выбранным из метформина, фенформина и буформина, с мультифункциональностью контрольных иммунных клеток, которые не были обработаны антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом. Если было подтверждено, что иммунные клетки, обработанные антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом, выбранным из метформина, фенформина и буформина, имели значительно более высокую мультифункциональность по сравнению с контролем, то можно предположить, что чувствительность иммунных клеток повышается после добавления терапевтического средства. Иммунные клетки, которые, как было определено данным способом оценки, имеют повышенную чувствительность к терапевтическому средству, могут давать хороший терапевтический эффект после введения антидиабетического лекарственного средства бигуанида, выбранного из метформина, фенформина и буформина.
Настоящее изобретение включает следующие отличительные признаки:
1. Способ улучшения функции иммунных клеток, включающий in vitro обработку выделенных иммунных клеток терапевтическим средством, содержащим в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина.
2. Способ улучшения функции иммунных клеток по п. 1, где иммунные клетки выбраны из CD8+-T-клеток, CD4+-Т-клеток, NK-клеток, γδT-клеток, NKT-клеток, B-клеток и клеток костного мозга.
3. Иммунные клетки, функция которых была улучшена способом по п.п. 1 или 2.
4. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанное средство содержит в качестве активного ингредиента иммунные клетки с функцией, улучшенной способом по любому из п.п. 1-3.
5. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п. 4, где заболевания, ассоциированные с иммунными патологиями, выбраны из раковых, инфекционных и аутоиммуннных заболеваний.
6. Способ оценки мультифункциональности взятых иммунных клеток, где указанный способ включает in vitro обработку выделенных иммунных клеток терапевтическим средством, содержащим в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина; определения способности обработанных иммунных клеток продуцировать цитокины трех видов, а именно IL-2, TNFα и IFNγ, и оценку индекса позитивности клеток, который представляет собой отношение клеток, являющихся позитивными по способности продуцировать цитокины трех видов.
7. Способ оценки мультифункциональности по п. 6, где указанный способ включает стадию оценки уровня экспрессии Tim-3 и/или PD-1 в выделенных иммунных клетках.
8. Способ оценки мультифункциональности по п.п. 6 или 7, где иммунные клетки выбраны из CD8+-T-клеток, CD4+-Т-клеток, NK-клеток, γδT-клеток, NKT-клеток, B-клеток и клеток костного мозга.
9. Способ диагностики заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанный способ включает способ оценки мультифункциональности по любому из п.п. 6-8.
10. Способ диагностики по п. 9, где способ диагностики заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, представляет собой способ диагностики, который дополнительно применяется для предсказания эффективности лечения заболевания терапевтическим средством, оценки тяжести заболевания, прогноза течения заболевания или предсказания начала развития заболевания.
11. Способ диагностики по п. 10, где терапевтическим средством для лечения заболевания является терапевтическое средство, содержащее в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина.
12. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанное средство содержит в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, и где указанное средство вводят после проведения теста способом диагностики по любому из п.п. 9-11.
13. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п. 12, где заболевания, ассоциированные с иммунными патологиями, выбраны из раковых, инфекционных и аутоиммуннных заболеваний.
14. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанное средство содержит в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, и где указанное средство вводят в комбинации по меньшей мере с одним терапевтическим средством, выбранным из агента, блокирующего иммуносупрессорный фактор, и агониста костимулирующего рецептора.
15. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанное средство содержит в качестве активного ингредиента по меньшей мере одно терапевтическое средство, выбранное из агента, блокирующего иммуносупрессорный фактор, и агониста костимулирующего рецептора, и где указанное средство вводят в комбинации с антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом, выбранным из метформина, фенформина и буформина.
16. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п.п. 14 или 15, где агентом, блокирующим иммуносупрессорный фактор, является одно из антител или слитых белков, выбранных из анти-CTLA-4 антитела, анти-PD-1 антитела, анти-PD-L1 антитела, анти-PD-L2 антитела, слитого белка PD-L1, слитого белка PD-L2, анти-Tim-3 антитела, анти-LAG-3 антитела, анти-BTLA антитела и анти-VISTA антитела.
17. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п. 16, где анти-CTLA-4 антителом является ипилимумаб или тремелимумаб; анти-PD-1 антителом является ниволубам, пембролизумаб, PDR-001, REGN-2810, BGB-A317 или AMP-514, анти-PD-L1 антителом является атезолизумаб, авелумаб, дурвалумаб или BMS-936559, а слитым белком PD-L2 является AMP-224.
18. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п.п. 14 или 15, где агонистом костимулирующего рецептора является антитело или любая комбинация антител, выбранных из анти-CD137 антитела, анти-OX40 антитела, анти-HVEM антитела, анти-CD27 антитела, анти-GITR антитела и анти-CD28 антитела.
19. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанное средство содержит в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, и где указанное средство вводят в комбинации с противораковой вакциной.
20. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п. 19, где противораковой вакциной является противораковая пептидная вакцина (такая как MAGE-3, MUC-1, пептид WT1, P53 или NY-ESO1), противораковая белковая вакцина, вакцина на основе дендритных клеток или вакцина против рака, который, как было подтверждено, развивается в результате вирусной инфекции.
21. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по любому из п.п. 13-20, где заболевания, ассоциированные с иммунными патологиями, выбраны из раковых, инфекционных и аутоиммуннных заболеваний.
22. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п. 21, где раковым заболеванием является по меньшей мере одно раковое заболевание, выбранное из рака головы и шеи, рака пищевода, рака желудка, рака прямой и ободочной кишки, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака печени, рака желчного пузыря, холангиокарциномы, рака желчных путей, рака поджелудочной железы, рака легких, рака молочной железы, рака яичника, рака шейки матки, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, рака почек, рака мочеполовых путей, рака предстательной железы, рака яичек, остеосаркомы, саркомы мягких тканей, лейкоза, миелодиспластического синдрома, злокачественной лимфомы, Т-клеточного лейкоза взрослых, множественной миеломы, рака кожи, опухоли головного мозга, мезотелиомы плевры и первичного рака неизвестной этиологии.
23. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п.п. 21 или 22, где лечение рака представляет собой подавление прогрессирования рака, а предупреждение рака представляет собой предупреждение рецидивов рака.
24. Средство для подавления прогрессирования рака, лечения рака, предупреждения рака и/или предупреждения рецидивов рака, где указанное средство включает в качестве активного ингредиента анти-PD-1 антитело, и где указанное средство вводят в комбинации с метформином, где раковым заболеванием является по меньшей мере одно раковое заболевание, выбранное из рака головы и шеи, рака пищевода, рака желудка, рака прямой и ободочной кишки, гепатоцеллюлярного рака, рака поджелудочной железы, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, рака молочной железы, рака яичника, рака шейки матки, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, почечноклеточного рака, рака мочеполовых путей, лимфомы Ходжкина, фолликулярной лимфомы, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, множественной миеломы, злокачественной меланомы, глиобластомы и мезотелиомы плевры.
25. Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по любому из п.п. 14-24, где указанное средство вводят после проведения теста способом диагностики по любому из п.п. 9-11.
A. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанный способ включает использование терапевтического средства, содержащего в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, и где указанное средство вводят после проведения теста способом диагностики по любому из п.п. 9-11.
В. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по пункту А, где заболевания, ассоциированные с иммунными патологиями, выбраны из раковых, инфекционных и аутоиммуннных заболеваний.
С. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанный способ включает введение терапевтического средства, содержащего в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, и где указанное средство вводят в комбинации по меньшей мере с одним терапевтическим средством, выбранным из агента, блокирующего иммуносупрессорный фактор, и агониста костимулирующего рецептора.
D. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанный способ включает введение терапевтического средства, содержащего в качестве активного ингредиента по меньшей мере одно терапевтическое средство, выбранное из агента, блокирующего иммуносупрессорный фактор, и агониста костимулирующего рецептора, и где указанное средство вводят в комбинации с антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом, выбранным из метформина, фенформина и буформина.
E. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п.п. C или D, где агентом, блокирующим иммуносупрессорный фактор, является одно из антител или слитых белков, выбранных из анти-CTLA-4 антитела, анти-PD-1 антитела, анти-PD-L1 антитела, анти-PD-L2 антитела, слитого белка PD-L1, слитого белка PD-L2, анти-Tim-3 антитела, анти-LAG-3 антитела, анти-BTLA антитела и анти-VISTA антитела.
F. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п. E, где анти-CTLA-4 антителом является ипилимумаб или тремелимумаб; анти-PD-1 антителом является ниволубам, пембролизумаб, PDR-001, REGN-2810, BGB-A317 или AMP-514, анти-PD-L1 антителом является атезолизумаб, авелумаб, дурвалумаб или BMS-936559, а слитым белком PD-L2 является AMP-224.
G. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п.п. C или D, где агонистом костимулирующего рецептора является антитело или любая комбинация антител, выбранных из анти-CD137 антитела, анти-OX40 антитела, анти-HVEM антитела, анти-CD27 антитела, анти-GITR антитела, и анти-CD28 антитела.
H. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанный способ включает введение терапевтического средства, содержащего в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, и где указанное средство вводят в комбинации с противораковой вакциной.
I. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п. H, где противораковой вакциной является противораковая пептидная вакцина (такая как MAGE-3, MUC-1, пептид WT1, P53 или NY-ESO1), противораковая белковая вакцина, вакцина на основе дендритных клеток или вакцина против рака, который, как было подтверждено, вызывается вирусной инфекцией.
J. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанный способ включает введение иммунных клеток, функция которых была улучшена способом по любому из п.п. 1-3.
K. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по любому из п.п. B-J, где заболевания, ассоциированные с иммунными патологиями, выбраны из раковых, инфекционных и аутоиммуннных заболеваний.
L. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п. K, где раковым заболеванием является по меньшей мере одно раковое заболевание, выбранное из рака головы и шеи, рака пищевода, рака желудка, рака прямой и ободочной кишки, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака печени (такого как гепатоцеллюлярный рак), рака желчного пузыря, холангиокарциномы, рака желчных путей, рака поджелудочной железы, рака легких (такого как немелкоклеточный рак легких (плоскоклеточный немелкоклеточный рак легких, неплоскоклеточный немелкоклеточный рак легких) или мелкоклеточный рак легких), рака молочной железы, рака яичника, рака шейки матки, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, рака почек (такого как почечноклеточный рак), рака мочеполовых путей (такого как рак мочевого пузыря или рак верхних мочевых путей), рака предстательной железы, опухоли яичек (такой как новообразование зародышевых клеток), остеосаркомы, саркомы мягких тканей, лейкоза, миелодиспластического синдрома, злокачественной лимфомы (такой как лимфома Ходжкина, фолликулярная лимфома или диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома), Т-клеточного лейкоза взрослых, множественной миеломы, рака кожи (такого как злокачественная меланома или карцинома клеток Меркеля), опухоли головного мозга (такой как глиобластома), мезотелиомы плевры и первичного рака неизвестной этиологии.
М. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по п.п. K или L, где лечение рака представляет собой подавление прогрессирования рака, а предупреждение рака представляет собой предупреждение рецидивов рака.
N. Способ подавления прогрессирования рака, лечения рака, предупреждения рака и/или предупреждения рецидивов рака, где указанный способ включает введение терапевтического средства, содержащего в качестве активного ингредиента анти-PD-1 антитело (например, ниволубам, пембролизумаб), и где указанное средство вводят в комбинации с метформином, где раковым заболеванием является по меньшей мере одно раковое заболевание, выбранное из рака головы и шеи, рака пищевода, рака желудка, рака прямой и ободочной кишки, гепатоцеллюлярного рака, рака поджелудочной железы, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, рака молочной железы, рака яичника, рака шейки матки, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, почечноклеточного рака, рака мочеполовых путей, лимфомы Ходжкина, фолликулярной лимфомы, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, множественной миеломы, злокачественной меланомы, глиобластомы и мезотелиомы плевры.
O. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, по любому из п.п. C-N, где указанный способ осуществляют после проведения теста способом по любому из п.п. 9-11.
Преимущественные эффекты настоящего изобретения
Средство согласно изобретению, применяемое для лечения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, обладает способностью повышать иммунитет. Так, например, при лечении рака, средство согласно изобретению, если оно используется в комбинации с хирургической операцией, лучевой терапией или химиотерапией, является более эффективным, а поэтому, предположительно, улучшает прогноз. Кроме того, предполагается, что средство согласно изобретению является более эффективным, если оно используется в предоперационной химиотерапии. Кроме того, предполагается, что средство согласно изобретению будет способствовать подавлению рецидивов после лечения.
Кроме того, нижеследующие эффекты могут быть достигнуты посредством обработки клеток с применением способа улучшения функции иммунных клеток согласно изобретению. Путем обработки ex vivo самообновляющихся клеток антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом, выбранным из метформина, фенформина и буформина, способом согласно изобретению с последующим возвращением этих клеток в организм пациента, у которого были взяты эти клетки, может быть достигнута высокая степень биологической защиты против рака или патогенных микробов. Обработка клеток способом улучшения функции иммунных клеток согласно изобретению с последующим возвращением этих клеток в организм пациента, у которого были взяты эти клетки, может обеспечивать эффективное предупреждение рака или инфекций.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлены результаты анализа на мультифункциональность CD8+-T-клеток, проводимого на проточном цитометре. При обработке мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) PMA (форбол-12-миристат-13-ацетатом)/иономицином, CD8+-T-клетки подвергали гейтированию, и клетки в таблетированной форме выделяли с помощью FSC-A и FSC-H. Затем, лимфоцитарные области жизнеспособных клеток гейтировали с использованием параметров FSC-A и SSC-A, и анализировали экспрессию PD-1 и Tim-3. Кроме того, внутриклеточные цитокины IFNγ, TNFα и IL-2 были окрашенными, что позволяло детектировать мультифункциональность (Пример 1).
На фиг. 2 представлены результаты детектирования CD8+-T-клеток, способных одновременно продуцировать IFNγ, TNFα и IL-2, из всех клеток, полученных путем культивирования МКПК, взятых у здоровых индивидуумов, в течение одного часа в присутствии или в отсутствии метформина, с последующей обработкой этих клеток PMA/иономицином после удаления метформина (Пример 1).
На фиг. 3 представлены результаты анализа, проводимого с использованием мононуклеарных клеток периферической крови, взятых у раковых пациентов, методом, аналогичным методу, описанному на фиг. 2 (Пример 1).
На фиг. 4 представлены результаты подтверждения частоты встречаемости экспрессии истощающих молекул PD-1 и Tim-3 в CD8+-T-клетках, взятых у здоровых индивидуумов (N=5) и у раковых пациентов (N=5) (Пример 2).
На фиг. 5 проиллюстрированы процедуры подтверждения эффектов обработки клеток метформином ex vivo у мышей (C57BL/6) (Пример 5).
На фиг. 6 представлены результаты, полученные на проточном цитометре, где данные результаты указывали на способность Т-клеток, инфильтрированных в опухолевые клетки, продуцировать цитокины в анализе, в котором CD8+-T-клетки, происходящие от клеток селезенки донорных мышей OT-I (TCR-трансгенных мышей: TCR распознает H-2Kb+OVA257-264, Cell vol.76, 17-27, 1994), обработанных метформином ex vivo, были введены реципиенту C57BL/6 через семь дней после трансплантации опухолевых клеток (Пример 5).
На фиг. 7 приводятся результаты анализа, полученные на проточном цитометре, которые представляют собой индекс позитивности по аннексину V (степень апоптоза) для Т-клеток, инфильтрированных в опухолевые клетки, где CD8+-T-клетки донорных мышей OT-I, обработанных метформином ex vivo, были введены реципиенту C57BL/6 через семь дней после трансплантации опухолевых клеток (Пример 5).
На фиг. 8 представлены результаты измерения размера опухоли в анализе, где CD8+-T-клетки донорных мышей OT-I, обработанных метформином ex vivo, были введены реципиенту C57BL/6 через семь дней после трансплантации опухолевых клеток (Пример 5).
На фиг. 9 представлены результаты мониторинга кривой роста опухоли в анализе, где CD8+-T-клетки донорных мышей OT-I, обработанных метформином (0, 10, 100 M) ex vivo, были введены реципиенту C57BL/6 через семь дней после трансплантации опухолевых клеток (Пример 6).
На фиг. 10 представлены результаты мониторинга кривой роста опухоли после введения метформина мышам, имеющим свободный доступ к питьевой воде, и/или введения вакцины OVA (слитого белка, полученного путем присоединения OVA257-264 к C-концу мышиного hsc70: Int. Immunol. 13, 1233-1242, 2001) реципиенту C57BL/6 через семь дней после трансплантации опухолевых клеток (Пример 7).
На фиг. 11 представлены результаты мониторинга кривой роста опухоли после введения метформина мышам, имеющим свободный доступ к питьевой воде, и/или введения анти-PD-1 антитела (клона 4H2, мышиного химерного антитела, имеющего вариабельную область крысиного антитела против мышиного PD-1 и константную область мышиного IgGκ1, где указанное антитело было предоставлено компанией Ono Pharmaceutical Co., Ltd.) мышам-реципиентам C57BL/6 или BALB/c через пять дней после трансплантации опухолевых клеток (MO5→C57BL/6, Meth A→BALB/c) (Пример 8).
На фиг. 12 представлен график, на котором отложены диаметры опухолей отдельных мышей C57BL/6 (Пример 8).
На фиг. 13 представлен график, на котором отложены диаметры опухолей отдельных мышей BALB/c (Пример 8).
Описание вариантов осуществления изобретения
Один из вариантов осуществления изобретения относится к способу улучшения функции иммунных клеток, где указанный способ включает in vitro обработку выделенных иммунных клеток терапевтическим средством, содержащим в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина; к иммунным клеткам с повышенным иммунитетом; и к средству для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанное средство содержит в качестве активного ингредиента иммунные клетки с повышенным иммунитетом.
Другой вариант настоящего изобретения относится к мультифункциональности выделенных иммунных клеток и к способу оценки мультифункциональности иммунных клеток, которые являются позитивными по их способности продуцировать цитокины трех видов, а именно IL-2, TNFα и IFNγ, и которые были обработаны антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом, выбранным из метформина, фенформина и буформина. Еще один вариант настоящего изобретения относится к способу оценки чувствительности иммунных клеток к терапевтическому средству, где указанный способ отличается тем, что он включает метод оценки мультифункциональности иммунных клеток. Если было определено, что мультифункциональность иммунных клеток, обработанных антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом, выбранным из метформина, фенформина и буформина, значительно повышалась по сравнению с контролем, то это означает, что чувствительность иммунных клеток к терапевтическому средству является более высокой.
В настоящем описании, термин «иммунные клетки» означает эффекторные клетки, способные уничтожать клетки-мишени. Предпочтительными иммунными клетками являются, в частности, CD8+-T-клетки, и такие иммунные клетки могут быть также выбраны, например, из CD4+-Т-клеток, NK-клеток, γδT-клеток, NKT-клеток, B-клеток и клеток костного мозга. Этот термин охватывает генетически модифицированные клетки, такие как клетки iPS, полученные из CD8+-T-клеток, специфичных к вирусу или к раковым клеткам, или, полученные путем введения в «необученные» CD8+-T-клетки гена антигенного рецептора (T-клеточного рецептора антигена: TCR) или гена химерного антитела (рецептора химерного антигена: CAR), который распознает молекулы, экспрессирующиеся на поверхности раковых клеток.
1. Способ улучшения функции иммунных клеток
В настоящем описании, термин «иммунные клетки с улучшенной иммунной функцией» означает иммунные клетки, которые содержат большое количество клеток, являющихся позитивными по их способности продуцировать цитокины трех видов, а именно IL-2, TNFα и IFNγ.
Настоящее изобретение относится к способу улучшения функции иммунных клеток. Более конкретно, указанный способ осуществляют путем обработки иммунных клеток терапевтическим средством, содержащим в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина. Кроме того, настоящее изобретение также включает клетки, обработанные способом, применяемым для улучшения функции иммунных клеток.
В настоящем описанн, иммунные клетки с повышенным иммунитетом, сообщаемым путем их обработки терапевтическим средством, содержащим в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, могут также называться «иммунными клетками, индуцированными метформином» (клетками MTi). Как объяснялось выше, обрабатываемыми иммунными клетками являются все эффекторные клетки, способные уничтожать клетки-мишени. Так, например, обрабатываемые иммунные клетки могут быть выбраны из CD8+-T-клеток, CD4+-Т-клеток, NK-клеток, γδT-клеток, NKT-клеток, B-клеток и клеток костного мозга. Примерами вышеупомянутых клеток также являются генетически модифицированные клетки, такие как клетки iPS, полученные из CD8+-T-клеток, специфичных к вирусу или к раковым клеткам, и клетки, полученные путем введения в «необученные» CD8+-T-клетки гена антигенного рецептора (T-клеточного рецептора антигена: TCR) или гена химерного антитела (рецептора химерного антигена: CAR), который распознает молекулы, экспрессирующиеся на поверхности раковых клеток. Особенно предпочтительными клетками являются CD8+-T-клетки. Обрабатываемые иммунные клетки могут быть собраны методами, известными per se, или любыми методами, которые будут разработаны в будущем. Кроме того, иммунные клетки, например, CD8+-T-клетки, необязательно должны быть подвергнуты непосредственной обработке. Если в группу иммунных клеток входят, например, CD8+-T-клетки, то мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), выделенные из периферической крови, могут быть обработаны обычным методом.
МКПК могут быть получены методами, известными per se. Так, например, МКПК могут быть получены путем добавления пробы цельной крови, взятой у донора, к раствору Фиколла и центрифугирования этой смеси с последующим разделением под действием силы тяжести.
Функция иммунных клеток может быть улучшена путем культивирования среды, в которой антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, было добавлено к МКПК для продуцирования клеток MTi.
Более конкретно, функция CD8+-T-клеток может быть улучшена путем культивирования клеток, включающих CD8+-T-клетки, такие как МКПК, при 37±0,5°C, 5% CO2, в течение 3-12 часов, предпочтительно, от 4 до 10 часов, а наиболее предпочтительно, 6 часов, в среде, содержащей антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, в количестве приблизительно от 1 до 500 мкM, предпочтительно, от 1 до 100 мкM, более предпочтительно, приблизительно от 5 до 100 мкM, а особенно предпочтительно, от 10 до 100 мкM на 10×106/2 мл CD8+-T-клеток. Выбор среды не имеет конкретных ограничений; при этом, может быть использована любая среда, подходящая для культивирования CD8+-T-клеток. Особенно предпочтительной является среда AIM-V(R) (Invitrogen).
Настоящее изобретение также охватывает иммунные клетки, функция которых была улучшена путем проведения вышеописанной обработки. Термин «иммунные клетки с улучшенной иммунной функцией» означает группу иммунных клеток с повышенным содержанием клеток, которые являются позитивными по их способности продуцировать цитокины трех видов, а именно IL-2, TNFα и IFNγ. Полученные иммунные клетки с улучшенной иммунной функцией включают большое количество CD8+-T-клеток, а поэтому они являются позитивными по их способности продуцировать цитокины трех видов после введения клеток в организм. Иммунные клетки с улучшенной функцией могут быть использованы в качестве средства для лечения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями.
Кроме того, считается, что обработка клеток с применением способа улучшения функции иммунных клеток согласно изобретению будет давать эффекты, указанные ниже. Путем обработки ex vivo самообновляющихся клеток антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом, выбранным из метформина, фенформина и буформина, способом согласно изобретению с последующим возвращением этих клеток в организм пациента, у которого были взяты эти клетки, может быть достигнута высокая степень биологической защиты против рака или патогенных микробов. Терапевтическое средство, содержащее в качестве активного ингредиента, антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, противопоказано для пациентов с дисфункцией печени или почек, для пожилых людей, для пациентов, имеющих в анамнезе молочный ацидоз и т.п. Однако, путем ex vivo обработки самообновляющихся клеток способом, применяемым для улучшения функции иммунных клеток согласно изобретению, можно решить проблемы, связанные с побочными эффектами или с необходимостью обеспечения безопасности в случае введения антидиабетического лекарственного средства бигуанида. Кроме того, при проведении противораковой иммунотерапии, обработка иммунных клеток с повышенным иммунитетом способом согласно изобретению, проводимая путем повторного введения этих клеток пациенту, будет приводить к улучшению доставки клеток, вводимых в область опухоли-мишени, по сравнению с ситуацией, когда вводят терапевтическое средство, содержащее в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, и, тем самым, повышать терапевтический эффект. Способ согласно изобретению может быть применен, например, для предупреждения начала развития рака у здоровых индивидуумов. Пролиферация лимфоцитов, выделенных из периферической крови здорового индивидуума методом, известным per se, с последующей криоконсервацией и частичным оттаиванием полученных клеток, а также их обработки способом, применяемым для улучшения функции иммунных клеток согласно изобретению, и возвращением этих клеток в организм индивидуума будут вносить определенный вклад в предупреждение заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, таких как рак или инфекции.
Такая группа клеток с повышенным иммунитетом может быть сохранена методом, аналогичным методу хранения всех известных клеток, используемых в иммунотерапии. Настоящее изобретение также охватывает средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, где указанное средство содержит в качестве активного ингредиента иммунные клетки с повышенным иммунитетом (клетки MTi), полученные вышеописанным методом. Дозу, частоту и интервал введения доз средства для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммунными патологиями, определяют, например, в зависимости от возраста, пола, массы тела и симптомов пациента.
При заболеваниях, ассоциированных с иммунными патологиями, функция Т-клеток, предположительно, истощается, а поэтому иммунитет, предположительно снижается или аномально увеличивается. Примерами таких заболеваний являются раковые заболевания, заболевания, связанные с иммунодефицитом, аутоиммунные заболевания, аллергические заболевания и различные инфекции, не поддающиеся лечению.
Если заболеванием является рак, то примерами такого ракового заболевания являются, но не ограничиваются ими, рак головы и шеи, рак пищевода, рак желудка, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак печени, рак желчного пузыря, холангиокарцинома, рак желчных путей, рак поджелудочной железы, рак легких, рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак эндометрия, рак почек, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичек, остеосаркома, саркома мягких тканей, лейкоз, злокачественная лимфома, множественная миелома, рак кожи, опухоль головного мозга и мезотелиома. Другими примерами заболеваний, связанных с иммунодефицитом, являются застойные заболевания, связанные с иммунодефицитом, и заболевания, связанные с приобретенным иммунодефицитом. Примерами застойных заболеваний, связанных с иммунодефицитом, являются, но не ограничиваются ими, тяжелый комбинированный иммунодефицит, синдром Вискотта-Алдрича, заболевание, связанное с дефицитом аденозин-дезаминазы, и заболевание, связанное с дефицитом пуриновых нуклеотидов/фосфорилазы. Другими заболеваниями, связанными с приобретенным иммунодефицитом, являются, но не ограничиваются ими, вторичный иммунодефицит, вызываемый приемом противораковых лекарственных средств, иммунодепрессантов, стероидов и т.п., и СПИД, вызываемый вирусом иммунодефицита человека. Примерами аутоиммунных заболеваний являются, но не ограничиваются ими, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, синдром Сьегрена, тяжелая миастения, пернициозная анемия и тиреоидит Хашимото. Примерами аллергических заболеваний являются, но не ограничиваются ими, бронхиальная астма, хвойный поллиноз и крапивница. Примерами инфекций являются вирусные инфекции и бактериальные инфекции. Примерами вирусных инфекций являются, но не ограничиваются ими, инфекции пищеварительного тракта, вызываемые вирусом (таким как энтеровирус или цитомегаловирус); респираторные вирусные инфекции (инфекции, вызываемые респираторным вирусом, таким как вирус гриппа, риновирус, коронавирус, вирус парагриппа, вирус RS, аденовирус или реовирус); опоясывающий лишай, вызываемый герпесвирусом; диарея, вызываемая ротавирусом; вирусный гепатит и СПИД. Примерами бактериальных инфекций являются, но не ограничиваются ими, инфекции, вызываемые бактериями Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, энтерогеморрагической E. coli, Staphylococcus aureus, MRSA, Salmonella, Botulinus и Candida.
2. Способ оценки мультифункциональности иммунных клеток
В настоящем описании, способ оценки мультифункциональности выделенных иммунных клеток осуществляют путем определения функций клеток, а именно, их способности продуцировать цитокины IL-2, TNFα и IFNγ. Оценку мультифункциональности клеток осуществляют путем in vitro обработки иммунных клеток терапевтическим средством, содержащим в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина. Оценка клеточной функции позволяет предсказать чувствительность клеток к антидиабетическому лекарственному средству бигуаниду, выбранному из метформина, фенформина и буформина, или терапевтический эффект. Если было определено, что мультифункциональность иммунных клеток, обработанных антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом, выбранным из метформина, фенформина и буформина, была значительно повышена по сравнению с контролем, то это означает, что чувствительность иммунных клеток к терапевтическому средству является более высокой. Таким образом, может быть осуществлена оценка чувствительности выделенных иммунных клеток к антидиабетическому лекарственному средству бигуаниду, выбранному из метформина, фенформина и буформина. Функции истощенных CD8+-T-клеток или CD8+-T-клеток, имеющих тенденцию к истощению, могут быть восстановлены с использованием метформина. Нормальные CD8+-T-клетки (то есть, МКПК здоровых индивидуумов) являются менее чувствительными к метформину, что обусловлено их нормальными функциями, а поэтому в данном случае будет чаще наблюдаться снижение мультифункциональности при обработке метформином. В противоположность этому, поскольку у раковых пациентов со множеством истощенных CD8+-T-клеток наблюдается высокая чувствительность к метформину, то в данном случае, при обработке метформином, мультифункциональность будет, предположительно, повышаться, а чаще всего, вообще не будет изменяться.
Для осуществления способа оценки мультифункциональности иммунных клеток согласно изобретению, предпочтительно, стимулировать выделенные иммунные клетки, такие как МКПК, поскольку это необходимо для внутриклеточной активации и облегчения продуцирования цитокинов. Стимуляция клеток может быть осуществлена методами, известными per se, такими как стимуляция с использованием активатора протеинкиназы (в высокой степени активного активатора протеинкиназы С (PKC): PMA) и иономицина. Стимуляцию с использованием PMA и иономицина осуществляют с использованием, например, 20-100 нг/мл, предпочтительно, 30-80 нг/мл, более предпочтительно, 50 нг/мл PMA, и 1-10 мкМ, предпочтительно, 1-5 мкM, а более предпочтительно, 2 мкМ иономицина. Стимуляция с использованием PMA и иономицина может быть осуществлена путем культивирования МКПК при 37 ± 0,5°C в течение 3-12 часов, предпочтительно, 4-10 часов, а наиболее предпочтительно, 6 часов, в среде, содержащей PMA и иономицин к концентрации, выбранной из вышеуказанных значений. В этом случае, для блокирования высвобождения продуцированного цитокина во внешнюю область клеток предпочтительно, использовать терапевтическое средство, блокирующее транспорт белка из аппарата Гольджи в цитоплазму, такое как монензин, брефелдин А или т.п.
Оценка мультифункциональности иммунных клеток согласно изобретению включает подтверждение способности CD8+-T-клеток, входящих в группу иммунных клеток, продуцировать цитокины IL-2, TNFα и IFNγ, и измерение отношения (индекса позитивности клеток) клеток (B), которые являются позитивными по способности продуцировать цитокины трех видов, к популяции клеток (A), то есть, группы CD8+-T-клеток. В настоящем описании, индекс позитивности клеток может быть вычислен по нижеследующей формуле. Индекс позитивности клеток может быть также вычислен по результатам анализа, полученным на измерительном устройстве, таком как проточный цитометр.
Индекс позитивности клеток (%)=(число клеток в B)/(число клеток в A)×100.
В настоящем описании, выражение «клетки (B), которые являются позитивными по своей способности продуцировать цитокины трех видов» означает CD8+-T-клетки, которые, как было определено, являются позитивными по своей способности одновременно продуцировать все три цитокина IL-2, TNFα и IFNγ во время проведения анализа на способность продуцирования каждого из этих цитокинов. Более конкретно, выражение «клетки (B), которые являются позитивными по своей способности продуцировать цитокины трех видов» означает CD8+-T-клетки, которые, как было определено, являются позитивными при гейтировании по одному из трех цитокинов, и которые, как было определено, являются также позитивными по остальным двум цитокинам.
Более конкретно, оценку мультифункциональности иммунных клеток согласно изобретению проводят способом определения функции CD8+-T-клеток, включающим стадии 1) - 4), указанные ниже:
1) стадию обработки выделенных иммунных клеток in vitro терапевтическим средством, содержащим в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина;
2) стадию стимуляции обработанных иммунных клеток с использованием PMA и иономицина после центрифугирования и промывки клеток;
3) стадию гейтирования CD8+-T-клеток, входящих в группу иммунных клеток, стимулированных в стадии 2, с помощью анализа, проводимого на проточном цитометре; и
4) стадию определения способности гейтированнях CD8+-T-клеток продуцировать цитокины трех видов IL-2, TNFα и IFNγ.
В способе оценки функции CD8+-T-клеток согласно изобретению может быть также определен уровень экспрессии Tim-3 и/или PD-1.
Кроме того, более конкретно, измерение может быть осуществлено следующим образом.
У обследуемого индивидуума берут периферическую кровь, а затем выделяют МКПК с использованием лимфоцит-разделяющего реагента, и эти МКПК хранят в тест-пробирке. Полученные МКПК могут быть подвергнуты криоконсервации непосредственно перед проведением теста. Тестируемые клетки (например, МКПК), оттаянные до проведения теста, могут быть культивированы при 37°C ± 0,5°C, 5% CO2, в течение 1-12 часов, предпочтительно, от 4 до 10 часов, а наиболее предпочтительно, 6 часов, в среде, содержащей антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, в количестве приблизительно от 1 до 500 мкM, предпочтительно, от 1 до 100 мкM, более предпочтительно, приблизительно от 5 до 100 мкM, а особенно предпочтительно, от 10 до 100 мкM. Выбор среды не имеет конкретных ограничений, и при этом, может быть использована любая среда, подходящая для культивирования тестируемых клеток. Особенно предпочтительной является среда AIM-V(R) (Invitrogen). При этом, предпочтительно, чтобы клетки были промыты средой или т.п. и культивированы в присутствии реагента для активациии клеток (сильного наномолярного активатора протеинкиназы C (PMA, 50 нг/мл) и иономицина (1 мкM)) для обеспечения неспецифической стимуляции Т-клеток. Кроме того, предпочтительно, чтобы клетки были обработаны ингибитором внутриклеточного транспорта белка для сохранения продуцированных цитокинов внутри клеток. Таким образом, обработанные МКПК выделяют и промывают 1-4 раза буфером для окрашивания клеток, и после добавления окрашивающего буфера, клетки могут быть культивированы при 2-10°C, предпочтительно, при 3-5°C, а наиболее предпочтительно, при 4±1°C. Клетки промывают буфером для промывки клеток и осуществляют окрашивание на цитокины IL-2, TNFα и IFNγ. Затем клетки выделяют, промывают и анализируют с помощью FACS, и величины количеств продуцируемых цитокинов трех видов, а именно, IL-2, TNFα и IFNγ, сравнивают с контролем, который не был обработан антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом, и с клетками, обработанными антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом.
После гейтирования CD8+-T-клеток в анализе, проводимом на проточном цитометре согласно изобретению, таблетированные клетки удаляют с помощью FSC-A и FSC-H в FSC (посредством прямого рассеяния). Затем проводят гейтирование группы лимфоцитов с использованием параметров FSC-A и SSC-A для анализа экспрессии Tim-3 и/или PD-1. Кроме того, для детектирования мультифункциональности может быть осуществлено окрашивание на внутриклеточные цитокины IL-2, TNFα и IFNγ. В настоящем описании, способность иммунных клеток в одновременному продуцированию внутриклеточных цитокинов IL-2, TNFα и IFNγ иногда может называться «мультифункциональностью». С точки зрения мультифункциональности, самыми сильными эффекторными клетками являются клетки, способные одновременно продуцировать цитокины трех видов, а другими самыми сильными эффекторными клетками являются клетки, способные одновременно продуцировать цитокины двух видов. Клетки, продуцирующие цитокин только одного вида, не рассматриваются как мультифункциональные, поскольку эффекторная функция этих клеток является ограниченной.
Настоящее изобретение также охватывает способ диагностики заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями, с применением способа оценки мультифункциональности иммунных клеток согласно изобретению. В настоящем описании, способ диагностики заболевания, ассоциированного с иммуными патологиями, представляет собой способ, который дополнительно применяется для предсказания эффективности лечения заболевания терапевтическим средством, оценки тяжести заболевания, прогноза течения заболевания или предсказания начала развития заболевания. У раковых пациентов, которые не являются восприимчивыми к метформину, может наблюдаться тяжелое иммунное истощение. Оценка мультифункциональности иммунных клеток согласно изобретению может быть дополнительно применена для предсказания эффективности лечения заболевания терапевтическим средством, оценки тяжести заболевания, прогноза течения заболевания или предсказания начала развития заболевания, ассоциированного с иммуными патологиями.
В последние годы был выявлен механизм иммунного истощения, и появились сообщения о том, что ингибирование связывания молекул, ответственных за иммунное истощение, играет важную роль в лечении рака. Аналитический способ согласно изобретению позволяет осуществлять комбинированное детектирование группы клеток, одновременно продуцирующих цитокины трех видов, и детектирование молекул, ответственных за истощение, и тем самым детектирование иммунного статуса иммунных клеток, то есть, CD8+-T-клеток у пациентов. Если клетки экспрессируют молекулы, ответственные за истощение, а именно, PD-1 или Tim-3, то эти клетки определяют как истощенные клетки. Однако, если мультифункциональность группы клеток восстанавливается после их обработки метформином, то это может однозначно указывать на устранение истощения (на восстановление иммунитета).
В уже существующих способах лечения противораковыми вакцинами, пациенты, которые должны быть подвергнуты такому лечению, могут быть выявлены исходя из наличия или отсутствия экспрессии вакцинного антигена в раковых тканях. Однако, способ оценки согласно изобретению позволяет детектировать иммунный статус еще до проведения иммунотерапии и, тем самым, в комбинации с детектированием экспрессии антигена, значительно облегчает выбор курса лечения.
В настоящем описании, термин «терапевтическое средство» в выражении «предсказание эффективности терапевтического средства» означает терапевтическое средство, содержащее в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина. Эффективность лечения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями, является самой высокой у доноров иммунных клеток, которые были обработаны in vitro терапевтическим средством, содержащим в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, и такая эффективность подтверждается с точки зрения мультифункциональности по внутриклеточным цитокинам IL-2, TNFα и IFNγby в анализе, проводимом на проточном цитометре.
При введении здоровым индивидуумам средства для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями, где указанное средство содержит в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, CD8+-T-клеткам может быть сообщена мультифункциональность. В результате этого может наблюдаться эффект облегчения симптомов, ассоциированных с иммунным истощением (у пациентов с хронической инфекцией, не поддающейся лечению, у раковых пациентов, у пациентов с диабетом и т.п.) или, например, состояний, указанных ниже. Так, например, такими состояниями являются: потеря физической силы; снижение физической силы вследствие старения; иммунодефицит, такой как комбинированный иммунодефицит; расстройство, ассоциированное с продуцированием антител, или расстройство, ассоциированное с дефицитом комплемента; гипотериоидит; иммунное истощение, вызываемое облучением; застойное заболевание, ассоциированное с иммунодефицитом; и заболевания, ассоциированные с приобретенным иммунодефицитом (включая СПИД). Было высказано предположение, что при введении средства для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями, иммунитет может повышаться, что будет приводить к улучшению функции общей иммунной системы и, тем самым, к устранению состояний и облегчения их симптомов, или к ремиссии.
Настоящее изобретение также охватывает средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями, где указанное средство содержит в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина. Активный ингредиент, содержащийся в средстве для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями согласно изобретению, обладает способностью восстанавливать функцию иммунных клеток и подавлять апоптоз и, тем самым, повышать иммунитет. В случае CD8+-T-клеток, восстановление функции иммунных клеток означает способность этих клеток одновременно продуцировать цитокины трех видов: IL-2, TNFα и IFNγ. Кроме того, в случае других иммунокомпетентных клеток, восстановление функции иммунных клеток означает восстановление функции, присущей этим клеткам, благодаря подавлению апоптоза. Так, например, восстановление функции иммунных клеток, предположительно, означает повышение способности к продуцированию IFNγ в случае CD4-T-клеток, NK-клеток, NKT-клеток и γδT-клеток; повышение уровня продуцирования антитела в случае B-клеток; и повышение способности индуцировать дифференцировку в случае клеток костного мозга.
Антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, и служащее в качестве активного ингредиента средства для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями согласно изобретению, может быть введено взрослому индивидууму в количестве от 1 до 5000 мг, предпочтительно, от 10 до 4000 мг, более предпочтительно, приблизительно от 50 до 3000 мг, а особенно предпочтительно, приблизительно от 100 до 2500 мг в день. Активный ингредиент может быть введен один раз в день, либо он может быть введен в виде 2-4 доз один раз в день. Кроме того, если это необходимо, активный ингредиент может быть введен в течение нескольких дней. Интервал и частота введения могут быть определены специалистом.
3. Применение в комбинации с другими терапевтическими средствами
При лечении и/или предупреждении заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями согласно изобретению, если антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, вводят пациенту, страдающему такими заболеваниями, то указанное средство может быть объединено с другими терапевтическими средствами. В случае раздельного введения антидиабетического лекарственного средства бигуанида согласно изобретению и других терапевтических средств, сначала вводят антидиабетическое лекарственное средство бигуанид согласно изобретению, а затем вводят другие терапевтические средства, либо сначала вводят другие терапевтические средства, а затем антидиабетическое лекарственное средство бигуанид согласно изобретению. Кроме того, во время введения, все терапевтические средства могут быть введены одновременно в течение ограниченного периода времени. Кроме того, терапевтические средства могут быть введены одним и тем же способом или различными способами. В зависимости от свойства терапевтического средства может быть приготовлен набор, включающий препарат, содержащий антидиабетическое лекарственное средство бигуанид согласно изобретению и другие терапевтические средства. Антидиабетическое лекарственное средство бигуанид согласно изобретению может быть соответствующим образом выбрано в зависимости от вышеупомянутых доз. Дозы других терапевтических средств могут быть также соответствующим образом выбраны в зависимости от клинически используемых доз. Другие терапевтические средства включают уже разработанные средства и средства, которые будут разработаны в будущем. Репрезентативными примерами других терапевтических средств являются средства, блокирующие иммуносупрессорный фактор. В раковых клетках или в раковом микроокружении присутствуют различные иммуносупрессорные факторы, блокирующие иммунный ответ на раковое заболевание. В процессе вырабатывания иммунного ответа имеются различные контрольные точки. В частности, функции негативных костимулирующих молекул, таких как CTLA-4 или PD-1 представляют собой контрольные точки, играющие важную роль в регуляции аутологической реактивности. Примерами таких молекул, ингибирующих иммунные контрольные точки, то есть, агентов, блокирующих иммуносупрессорный фактор, являются анти-CTLA-4 антитело (например, ипилимумаб, тремелимума), анти-PD-1 антитело (например, человеческое моноклональное (нейтрализующее) антитело против человеческого PD-1 (например, ниволумаб, REGN-2810), гуманизованное моноклональное (нейтрализующее) антитело против человеческого PD-1 (например, пембролизумаб, PDR-001, BGB-A317, AMP-514 (MEDI0680))), анти-PD-L1 антитело (например, атезолизумаб (RG7446, MPDL3280A), авелумаб (PF-06834635, MSB0010718C), дурвалумаб (MEDI4736), BMS-936559), анти-PD-L2 антитело, слитый белок PD-L1, слитый белок PD-L2 (например, AMP-224), анти-Tim-3 антитело (например, MBG453), анти-LAG-3 антитело (например, BMS-986016, LAG525), анти-KIR антитело (например, лирилумаб), анти-BTLA антитело и анти-VISTA антитело. Кроме того, примерами других терапевтических средств также являются агонисты костимулирующего рецептора, такие как анти-CD137 антитело (например, урелумаб), анти-OX40 антитело (например, MEDI6469), анти-HVEM антитело, анти-CD27 антитело (например, варлилумаб), анти-GITR антитело (например, MK-4166) и анти-CD28 антитело. Любые одно или более антител или слитых белков, связывающихся с этими агентами, блокирующими иммуносупрессорный фактор, и с агонистами костимулирующего рецептора, могут быть объединены с антидиабетическим лекарственным средством бигуанидом согласно изобретению. Примерами заболеваний, которые, как предполагается, могут быть подвергнуты успешному лечению или предупреждению путем введения комбинации антидиабетического лекарственного средства бигуанида, выбранного из метформина, фенформина и буформина согласно изобретению; агента, блокирующего иммуносупрессорный фактор; и агониста костимулирующего рецептора, являются раковые заболевания (такие как, но не ограничивающиеся ими, рак головы и шеи, рак пищевода, рак желудка, рак прямой и ободочной кишки, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак печени (такой как гепатоцеллюлярный рак), рак желчного пузыря, холангиокарцинома, рак желчных путей, рак поджелудочной железы, рак легких (такой как немелкоклеточный рак легких (плоскоклеточный немелкоклеточный рак легких, неплоскоклеточный немелкоклеточный рак легких) или мелкоклеточный рак легких), рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак эндометрия, рак влагалища, рак вульвы, рак почек (такой как почечноклеточный рак), рак мочеполовых путей (такой как рак мочевого пузыря или рак верхних мочевых путей), рак предстательной железы, опухоль яичек (такая как новообразование зародышевых клеток), остеосаркома, саркома мягких тканей, лейкоз, миелодиспластический синдром, злокачественная лимфома (такая как лимфома Ходжкина, фолликулярная лимфома или диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома), Т-клеточный лейкоз взрослых, множественная миелома, рак кожи (такой как злокачественная меланома или карцинома клеток Меркеля), опухоль головного мозга (такая как глиобластома), мезотелиома плевры и первичный рак неизвестной этиологии. В случае этих раковых заболеваний, достижение максимального противоопухолевого эффекта возможно, в частности, у раковых пациентов, у которых нужные терапевтические эффекты не могли быть достигнуты с использованием только агента, блокирующего иммуносупрессорный фактор, или агониста костимулирующего рецептора.
Средство для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями согласно изобретению, предпочтительно, получают, например, в жидкой форме в случае его внутривенного введения. Жидкий препарат может быть получен, например, с использованием растворителей, таких как очищенная вода, физиологический раствор, спирты, включая этанол, пропиленгликоль, глицерин и полиэтиленгликоль, или триацетин. В препарат могут быть также добавлены адъюванты, такие как антисептики, смачивающие агенты, эмульгаторы, диспергирующие агенты, стабилизаторы и т.п. Кроме того, препарат может быть введен в виде суспензии.
Кроме того, твердые препараты, такие как таблетки, драже, порошкообразные лекарственные средства, гранулы или тонкодисперсные гранулы, могут быть приготовлены стандартными методами путем добавления носителей, таких как бикарбонат натрия, карбонат кальция, крахмал, сахароза, маннит или карбоксиметилцеллюлоза, и добавок, таких как стеарат кальция, стеарат магния или глицерин. Кроме того, лекарственное средство может быть приготовлено в виде препарата с энтеросолюбильным покрытием путем нанесения вещества для энтеросолюбильных покрытий, такого как органический растворитель или водный раствор ацетата-фталата целлюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата поливинилового спирта, сополимера стирола-малеинового ангидрида, сополимера метакриловой кислоты-метилметакрилата или т.п. Примерами фармацевтически приемлемых носителей являются другие общие адъюванты, ароматизаторы и стабилизаторы или антисептики.
Кроме того, настоящее изобретение также охватывает средство и способ, применяемые для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями, путем введения терапевтического средства, содержащего в качестве активного ингредиента антидиабетическое лекарственное средство бигуанид, выбранное из метформина, фенформина и буформина, в комбинации с противораковой вакциной. Термин «противораковая вакцина» включает противораковые пептидные вакцины (MAGE-3, MUC-1, пептид WT1, P53, NY-ESO1 и т.п.), противораковые белковые вакцины, вакцины на основе дендритных клеток, вакцины для генотерапии и т.п. Примерами вакцин на основе дендритных клеток являются вакцины на основе дендритных клеток, в которых раковый пептид или раковый антигенный белок были иммобилизованными; вакцины на основе дендритных клеток, в которые была перенесена мРНК, происходящая от раковых клеток (эта вакцина также служит в качестве вакцины для генотерапии), и вакцины на основе дендритных клеток, культивированных с раковым антигенным белком, таким как простатическая кислая фосфатаза и слитый белок GM-CSF (такой как Provenge). Примерами противораковых вакцин являются вакцины против раковых заболеваний, которые, как было подтверждено развиваются посредством вирусных инфекций, и такими вакцинами являются вакцина на основе гепатита В, вызываемого вирусом гепатита В, или профилактическая вакцина против рака шейки матки, вызываемого вирусом человеческой папилломы. Объединение средства для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями согласно изобретению, с различными вакцинами может приводить к значительному повышению эффективности вакцины. В результате этого могут быть уменьшены дозы противораковых вакцин и т.п., что позволит снизить побочные эффекты, вызываемые вакцинами и адъювантами.
Настоящее изобретение также охватывает способ лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями, где указанный способ включает использование средства для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями.
Примеры
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводятся его более подробное описание со ссылкой на Примеры и Сравнительные примеры. Однако, настоящее изобретение не ограничивается этими примерами. Проведение исследований с использованием описанных ниже клинических образцов было одобрено Комитетом по этике Университета Окайамы. В нижеследующих примерах описаны анализы, проводимые в случае раковых заболеваний на различных стадиях, и в этих анализах использовали периферическую кровь, взятую у пациентов с первичным раком легких стадии I и у пациентов с метастазирующим раком легких (то есть, стадии IV). Стадии ракового заболевания описаны в 7-м издании Реестра классификации заболеваний (легких) по стадиям UICC TNM.
Пример 1: Способ оценки мультифункциональности иммунных клеток
В этом примере описан способ оценки иммунитета иммунных клеток. Сначала проводили анализ на мультифункциональность иммунных клеток на проточном цитометре. Затем подтверждали изменения мультифункциональности иммунных клеток после обработки клеток здоровых индивидуумов и раковых пациентов метформином. Обработку иммунных клеток осуществляли с использованием материалов (1) и с применением описанного ниже способа (2).
(1) Материалы
Лимфоцит-разделяющий реагент: Фиколл-Пак(R) (GE Healthcare)
Жидкость для криоконсервации клеток: Bambang Car (Nippon Genetics)
Среда для человеческих клеток: среда AIM V(R) (Gibco)
Реагент для активации клеток:
Сильный наномолярный активатор протеинкиназы С (Sigma-Aldrich)
Иономицин (Sigma-Aldrich)
Ингибитор внутриклеточного транспорта белка: BD Gorgi StopTM (содержащий монензин)(BD Biosciences)
Окрашивающий буфер: 0,58 г EDTA (Nacalai Tasque), растворенного в 1 л PBS (Gibco), содержащего 2% FCS (Thermo)
Раствор для фиксации клеток/буфер для пенетрации:
BD Cytofix/CytopermTM (BD Biosciences)
BD Perm/WashTM (разведенный 1:10 в дистиллированной H2O перед использованием)(BD Biosciences)
(2) Способ
1. У обследуемого индивидуума брали периферическую кровь, и выделяли МКПК путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием лимфоцит-разделяющего реагента Фиколл-Пак(R) (GE Healthcare). 3 мл Фиколла-Пака(R) закапывали в 15-миллилитровую пробирку. 8 мл периферической крови осторожно наносили на реагент. При этом, следует принять меры предосторожности, то есть, реагент Фиколл-Пак(R) не следует смешивать с периферической кровью. Центрифугирование осуществляли при the 400× g в течение 30 минут, и выделяли МКПК.
2. Выделенные МКПК хранили в холодильнике при -150°C или в жидком азоте с использованием жидкости для консервации клеток Bambang Car путем доведения числа клеток до 2,0×106 клеток/пробирку.
3. В этом анализе, оттаянные МКПК культивировали в течение 1-10 часов в присутствии 10 мкM метформина или в отсутствии метформина. Культивирование осуществляли в 24-луночном планшете, и число клеток доводили приблизительно до 5,0×105 клеток/лунку.
4. Через 1-10 часов клетки собирали, промывали средой и культивировали в присутствии реагента для активации клеток (сильного наномолярного активатора протеинкиназы С (PMA, 50 нг/мл), иономицина (1 мкМ)) в течение 6 часов для неспецифической стимуляции Т-клеток. В это время добавляли реагент BD Gorgi StopTM для сохранения продуцированных цитокинов внутри клеток.
5. Клетки выделяли и два раза промывали буфером для окрашивания клеток. Сначала осуществляли окрашивание молекул, экспрессируемых на поверхности Т-клеток, на присутствие CD8, PD-1, Tim-3. На этой стадии окрашивания, окрашивающий буфер добавляли в количестве 50 мкл на образец. Культивирование осуществляли при 4°C в течение 30 минут.
6. Клетки собирали и два раза промывали буфером для окрашивания клеток. Затем добавляли 500 мкл BD Cytofix/CytopermTM и культивировали при 4°C в течение 30 минут.
7. Клетки собирали и два раза промывали буфером BD Perm/WashTM. Затем осуществляли окрашивание на цитокины IL-2, TNFα и IFNγ. На этой стадии окрашивания, буфер BD Perm/WashTM добавляли в количестве 50 мкл на образец. Культивирование осуществляли при 4°C в течение 30 минут.
8. Клетки собирали и два раза промывали буфером BD Perm/WashTM, а затем добавляли 200 мкл BD Perm/WashTM.
9. Анализ осуществляли на проточном цитометре FACSCantoTM II (Becton, Dickinson и Company).
(3) Анализ на мультифункциональность иммунных клеток, проводимый на проточном цитометре
МКПК, обработанные PMA/иономицином в описанном выше способе (2), сначала подвергали гейтированию на CD8+-T-клетки с использованием проточного цитометра FACSCantoTM II (Becton, Dickinson и Company), а затем таблетированные клетки выделяли с помощью FSC-A и FSC-H. С использованием параметров FSC-A и SSC-A осуществляли гейтирование группы лимфоцитов для анализа на экспрессию PD-1 и Tim-3. Затем внутриклеточные цитокины IFNγ, TNFα и IL-2 окрашивали и проводили анализ на мультифункциональность CD8+-T-клеток, входящих в популяцию МКПК (фиг. 1).
(4) Анализ на мультифункциональность CD8+-T-клеток у здоровых индивидуумов
МКПК, взятые у здоровых индивидуумов (N=10), культивировали в течение одного часа в присутствии или в отсутствии метформина с применением способа, описанного выше в (2). После удаления метформина, МКПК подвергали стимулирующему культивированию с PMA/иономицином в течение 6 часов с применением способа, описанного выше в (3). Из полученных клеток МКПК были детектированы CD8+-T-клетки, способные одновременно продуцировать цитокины трех видов, то есть, IFNγ, TNFα и IL-2. Было определено, что CD8+-T-клетки, не обработанные метформином, составляли 0,11%, а CD8+-T-клетки, обработанные метформином, составляли 0,09% (фиг. 2). В соответствии с этим, было определено, что у здоровых индивидуумов, мультифункциональность CD8+-T-клеток не увеличивалась после обработки метформином.
Для МКПК, взятых у здоровых индивидуумов и обработанных как описано выше, вычисляли отношения CD8+-T-клеток, продуцирующих цитокины трех видов (IFNγ/TNFα/IL-2), CD8+-T-клеток, продуцирующих цитокины двух видов (IFNγ/TNFα или IFNγ/IL-2), и CD8+-T-клеток, продуцирующих цитокин одного вида (IFNγ), ко всем CD8+-T-клеткам, и данные систематизировали в таблице 1. Результаты вычисления сравнивали для группы, не обработанной метформином (контроль), и для группы, обработанной метформином (метформин). Что касается отношений цитокин-продуцирующих CD8+-T-клеток, то увеличение на 10% или более после обработки метформином было обозначено стрелкой острием вверх (↑), снижение на 10% или более после обработки метформином было обозначено стрелкой острием вниз (↓), а другие случаи, то есть, отсутствие каких-либо значимых различий, отмечены стрелкой острием вправо (→).
Таблица 1
(5) Анализ на мультифункциональность CD8+-T-клеток у раковых пациентов
Каждую МКПК, взятую у 31 пациента с первичным раком легких (стадии I), культивировали в течение одного часа способом, описанным в (4) в присутствии или в отсутствии метформина. После удаления метформина анализировали каждую полученную МКПК. В репрезентативном примере было определено, что CD8+-T-клетки, не обработанные метформином, составляли 0,92%, а CD8+-T-клетки, обработанные метформином, составляли 1,44% (фиг. 3). В соответствии с этим, было определено, что по сравнению со здоровыми индивидуумами, у многих раковых пациентов, мультифункциональность CD8+-T-клеток увеличивалась после обработки метформином.
Для раковых пациентов, подвергнутых лечению как описано выше, вычисляли отношения CD8+-T-клеток, продуцирующих цитокины трех видов (IFNγ/TNFα/IL-2), CD8+-T-клеток, продуцирующих цитокины двух видов (IFNγ/TNFα или IFNγ/IL-2), и CD8+-T-клеток, продуцирующих цитокин одного вида (IFNγ) ко всем CD8+-T-клеткам как описано в пункте (4), и данные систематизировали в таблице 2. Результаты вычисления сравнивали для группы, не обработанной метформином (контроль), и для группы, обработанной метформином (метформин). Что касается отношений цитокин-продуцирующих CD8+-T-клеток, то увеличение на 10% или более после обработки метформином было обозначено стрелкой острием вверх (↑), снижение на 10% или более после обработки метформином было обозначено стрелкой острием вниз (↓), а другие случаи, то есть, отсутствие каких-либо значимых различий, отмечены стрелкой острием вправо (→).
Таблица 2
Пример 2: Способ оценки мультифункциональности иммунных клеток
В этом примере описана оценка частоты экспрессии истощающих молекул PD-1 и Tim-3 в CD8+-T-клетках, взятых у пяти здоровых индивидуумов и у пяти пациентов с первичным раком легких (стадия I). Было обнаружено, что уровень экспрессии PD-1 у раковых пациентов был достаточно низким. Кроме того, хотя у раковых пациентов наблюдалась тенденция к увеличению уровня экспрессии Tim-3, однако, какого-либо значимого различия между образцами, взятыми у здоровых индивидуумов и раковых пациентов, не наблюдалось (фиг. 4). Однако, поскольку у здоровых индивидуумов и у раковых пациентов наблюдались явные различия в паттернах экспрессии в CD8+-T-клетках, то помимо анализа всех CD8+-T-клеток, можно было провести более детальный анализ на мультифункциональность путем комбинированного анализа паттернов экспрессии и анализа на мультифункциональность PD-1 и Tim-3.
Пример 3: Результаты анализа на восстановление мультифункциональности после обработки метформином
В этом примере описана оценка результатов анализа на восстановление мультифункциональности CD8+-T-клеток после их обработки метформином у 10 здоровых индивидуумов и у 31 ракового пациента (стадия I) исходя из данных, полученных способом, описанным в Примере 1. Результаты такого анализа представлены ниже в таблице 3. В таблице 3 представлены результаты оценки способности CD8+-T-клеток четырех видов продуцировать цитокины, то есть, PD-1-позитивных, Tim-3-негативных CD8+-T-клеток (PD-1+, Tim-3-), PD-1-позитивных, Tim-3-позитивных CD8+-T-клеток (PD-1+, Tim-3+), PD-1-негативных, Tim-3-позитивных CD8+-T-клеток (PD-1-, Tim-3+) и PD-1-негативных, Tim-3-негативных CD8+-T-клеток (PD-1-, Tim-3-), а также всех CD8+-T-клеток (всех CD8T). Способность продуцировать цитокины может быть выражена как отношение клеток, продуцирующих цитокины (A) трех видов, то есть, IFNγ/TNFα/IL-2, (B) двух видов IFNγ/TNFα, (C) двух видов, IFNγ/IL-2, и (D) одного вида, IFNγ.
Результаты, представленные в таблице 3, показали, что способности всех CD8+-T-клеток, PD-1-негативных, Tim-3-позитивных CD8+-T-клеток, PD-1-негативных и Tim-3-негативных CD8+-T-клеток продуцировать цитокины трех видов у здоровых индивидуумов и у раковых пациентов обнаруживали значимые различия. В частности, для всех CD8+-T-клеток у здоровых индивидуумов, такое увеличение составляло 0/10 (0%), а у раковых пациентов, оно составляло 14/31 (45,2%). Таким образом, очевидно, что повышение мультифункциональности CD8+-T-клеток у раковых пациентов легче достигается после обработки этих клеток метформином. Кроме того, коэффициент снижения мультифункциональности после обработки метформинов у здоровых индивидуумов составлял 7/10 (70%), а у раковых пациентов он составлял 12/31 (38,7%). Это явно указывает на снижение мультифункциональности у здоровых индивидуумов. Что касается способности всех CD8+-T-клеток или PD-1-негативных, Tim-3-позитивных CD8+-T-клеток продуцировать цитокины двух видов, то между этими клетками, взятыми у здоровых индивидуумов и у раковых пациентов, наблюдались явные различия. Что касается способности клеток продуцировать цитокин 1 вида (в этом случае IFNγ), то между здоровыми индивидуумами и раковыми пациентами, какого-либо явного различия не наблюдалось.
Таблица 3. Систематизированные данные анализа на мультифункциональность CD8+-T-клеток, выделенных у здоровых индивидуумов и у пациентов, страдающих раковым заболеванием (стадии I)
Пример 4: Способ оценки мультифункциональности иммунных клеток
В этом примере описана оценка результатов анализа на восстановление мультифункциональности CD8+-T-клеток после их обработки метформином у 10 здоровых индивидуумов и у пяти пациентов с метастазирующим раковм легких (стадия IV) исходя из данных, полученных способом, описанным в Примере 1. Результаты такого анализа представлены ниже в таблице 4. В таблице 4, как и в таблице 3, представлены результаты оценки способности CD8+-T-клеток (всех CD8T) четырех видов продуцировать цитокины, то есть, PD-1-позитивных, Tim-3-негативных CD8+-T-клеток, PD-1-позитивных, Tim-3-позитивных CD8+-T-клеток, PD-1-негативных, Tim-3-позитивных CD8+-T-клеток и PD-1-негативных, Tim-3-негативных CD8+-T-клеток (Таблица 4). Способность продуцировать цитокины может быть выражена как отношение клеток, продуцирующих цитокины (A) трех видов, то есть, IFNγ/TNFα/IL-2, (B) двух видов IFNγ/TNFα, (C) двух видов, IFNγ/IL-2, и (D) одного вида, IFNγ.
Результаты, представленные в таблице 4, показали, что способности всех CD8+-T-клеток, PD-1-негативных, Tim-3-позитивных CD8+-T-клеток, PD-1-негативных и Tim-3-негативных CD8+-T-клеток продуцировать цитокины трех видов у здоровых индивидуумов и у раковых пациентов обнаруживали значимые различия. Более конкретно, у раковых пациентов, обработка метформином приводила к очень незначительному (нулевому) снижению мультифункциональности. У здоровых индивидуумов и у раковых пациентов, способности клеток продуцировать цитокины двух видов почти не отличались. Кроме того, у здоровых индивидуумов и у раковых пациентов, способности клеток продуцировать цитокины одного вида почти не отличались.
Таблица 4. Систематизированные данные анализа на мультифункциональность CD8+-T-клеток, выделенных у здоровых индивидуумов и у пациентов, страдающих раковым заболеванием (стадии IV)
В соответствии с результатами примеров 3 и 4, указывающими на восстановление мультифункциональности под действием метформина у здоровых индивидуумов, у пациентов с раковым заболеванием стадии I и у пациентов с раковым заболеванием стадии IV был проведен анализ для групп, у которых наблюдалось увеличение продуцирования или отсутствие изменений в продуцировании цитокинов трех видов (IFNγ/TNFα/IL-2) всеми CD8+-T-клетками. Продуцирование цитокинов трех видов (IFNγ/TNFα/IL-2) повышалось или не изменялось у 30% здоровых индивидуумов, у 61,3% пациентов с раковым заболеванием стадии I и у 100% пациентов с раковым заболеванием стадии IV, и при этом, у здоровых индивидуумов и у пациентов с раковым заболеванием, наблюдались значимые различия (Таблица 5). Было высказано предположение, что у раковых пациентов наблюдалась тенденция к увеличению числа истощенных CD8+-T-клеток наряду с прогрессированием ракового заболевания на определенной стадии, и такая группа истощенных клеток была детектирована в соответствии со статусом «повышение» или «отсутствие изменения» мультифункциональности после обработки метформином.
Таблица 5
Пример 5: Эффективность обработки клеток метформином ex vivo
У мышей (C57BL/6), T-клетки экстракорпорально обрабатывали метформином, а затем клетки снова вводили в организм и подтверждали наличие или отсутствие противоопухолевого эффекта обработанных клеток. Сначала, в качестве реципиентов использовали 8-9-недельных мышей C57BL/6(CD45.2), и в дорсальные области реципиентов интрадермально трансплантировали 2×105 клеток клеточной линии меланомы (B16-OVA). В качестве доноров использовали 8-9-недельных мышей C57BL/6(CD45.1)×OT-1 (трансгенных мышей, имеющих OVA-антиген-распознающие CD8+-T-клетки, содержащие Т-клеточные рецепторы α,β-цепи). Группу клеток CD45.1 OT-1 CD8+T, выделенных из селезенки, очищали с использованием магнитных сфер. После обработки клеток метформином (±), клетки вводили реципиентам через 7 дней после трансплантации опухолевых клеток (см. фиг. 5). Более конкретно, CD8+-T-клетки культивировали в течение 6 часов в метформине в концентрации 3×106/2 мл 10 мкM, и при 37°C, 5% CO2. После выделения клеток (клеток MTi), клетки два раза промывали PBS, и 3×106 клеток инъецировали в хвостовую вену мышей. Была использована среда, полученная путем добавления пенициллина (50 ед./мл), стрептомицина (50 г/мл, Sigma P0781), пирувата натрия (1 мM, Sigma S8636), L-глутамина (2 мM, Sigma G7513), заменимых аминокислот MEM (100-кратно разведенный раствор, Life Technologies), 2-меркаптоэтанола (5×10-5 M, Sigma M6250) в среду RPMI-1640 (Sigma R0883). Фетальную бычью сыворотку не использовали.
Полученные CD45.1 OT-1 CD8+T-клетки, инфильтрированные в опухоль, подвергали гейтированию на проточном цитометре FACSCantoTM II (Becton, Dickinson и Company) и подтверждали способность этих клеток продуцировать IFNα и IL-2. Высокие индексы позитивности клеток по всем цитокинам подтверждали для группы CD45.1 OT-1 CD8+T-клеток (клеток MTi), стимулированных PMA и иономицином и обработанных метформином (см. фиг. 6). Было подтверждено, что степень апоптоза клеток, инфильтрированных в опухоли реципиентов после введения обработанных метформином CD45.1 OT-1 CD8+T-клеток (клеток MTi), была значительно ниже, чем степень апоптоза клеток, инфильтрированных в опухоли реципиентов после введения не обработанных метформином CD45.1 OT-1 CD8+T-клеток, не обработанных метформином, (клеток MTi) (см. фиг. 7). На второй день после введения клеток наблюдалось значимое различие в размерах опухолей у реципиентов, которым вводили обработанные метформином CD45.1 OT-1 CD8+T-клетки (клетки MTi), и у реципиентов, которым вводили CD45.1 OT-1 CD8+T-клетки, не обработанные метформином (см. фиг. 8). Было подтверждено, что эффективность переноса обработанных метформином CD45.1 OT-1 CD8+T-клеток в опухоли была высокой, и что эти CD8+-T-клетки также имели высокую степень мультифункциональности в опухолях. Полученные результаты подтвердили, что Т-клетки, которые были подвергнуты экстракорпоральной обработке метформином и снова возвращены в организм индивидуума, обладали противоопухолевым действием, что указывает на возможность использования этих клеток в клеточной иммунотерапии.
Пример 6: Эффективность обработки клеток метформином ex vivo
Наличие или отсутствие противоопухолевого эффекта Т-клеток, которые были экстракорпорально обработаны метформином и снова возвращены в организм индивидуума, подтверждали у мышей C57BL/6. Сначала, в качестве реципиентов использовали 8-9-недельных мышей C57BL/6(CD45.2), и в дорсальные области реципиентов интрадермально трансплантировали 2×105 клеток клеточной линии меланомы (B16-OVA). CD8+-T-клетки донорных мышей OT-I (Cell, Vol. 76, pp.17-27, 1994), обработанные метформином (0 мкM, 10 мкM, 100 мкM), вводили реципиентам несколько раз на 5-й, 7-й, 9-й и 11-й дни после трансплантации опухолевых клеток, и проводили мониторинг кривой роста опухоли (см. фиг. 9).
Полученные результаты подтвердили, что очень хорошие эффекты ингибирования опухоли наблюдались у реципиентов, которым вводили CD8+-T-клетки донорных мышей OT-1 (клетки MTi), обработанные 100 мкM метформина (см. фиг. 9).
Пример 7: Эффекты перорального введения метформина в комбинации с противораковой вакциной
Противоопухолевые эффекты подтверждали после введения метформина мышам, имеющим свободный доступ к питьевой воде, и введения вакцины OVA (слитого белка, полученного путем присоединения OVA257-264 к C-концу мышиного hsc70: Int. Immunol. 13, 1233-1242, 2001). На 7-й, 12-й, 17-й и 22-й дни после трансплантации опухолевых клеток, в хвостовую вену реципиентов, имеющих свободный доступ к питьевой воде, вводили метформин и/или вакцину OVA (см. фиг. 10). Противораковая вакцина, используемая в этом примере, принадлежала к категории противораковых белковых вакцин.
Полученные результаты подтвердили, что превосходные эффекты ингибирования опухоли наблюдались у реципиентов, которым вводили метформин в комбинации с противораковой вакциной (см. фиг. 10).
Пример 8: Эффекты введения метформина в комбинации с анти-PD-1 антителом
Опухоли трансплантировали мышам-реципиентам и подтверждали эффекты введения метформина в комбинации с анти-PD-1 антителом. В этом случае были использованы 8-9-недельные мыши C57BL/6(N=10) или BALB/c(N=10). В дорсальные области мышей C57BL/6 интердермально трансплантировали опухолевые клетки MO5, а в дорсальные области мышей BALB/c вводили Meth А, где количество этих клеток и Meth А составляло 2×105. Затем проводили мониторинг кривой роста опухоли после введения метформина мышам, имеющим свободный доступ к питьевой воде, и/или после введения анти-PD-1 антитела αPD-1 (клона 4H2, мышиного химерного антитела, имеющего вариабельную область крысиного антитела против мышиного PD-1 и константную область мышиного IgGκ1 (указанное антитело было получено методом, описанным в Примере 12 заявки WO2006/121168), где указанное антитело было предоставлено компанией Ono Pharmaceutical Co., Ltd.) через пять дней после трансплантации опухолевых клеток. Анти-PD-1 антитело внутрибрюшинно вводили в количестве 200 мкг на 5-й, 11-й, 17-й и 23-й дни после трансплантации опухолевых клеток. В качестве контроля вводили PBS. На фиг. 11 указан средний диаметр опухоли для одной группы из 10 мышей. Полученные результаты со всей очевидностью подтвердили уменьшение размеров опухоли у группы мышей, которым вводили метформин в комбинации с анти-PD-1 антителом.
На фиг. 12 представлены результаты измерений диаметров опухоли у мышей C57BL/6 контрольной группы; группы, которой вводили только метформин; группы, которой вводили только αPD-1, и группы, которой вводили метформин в комбинации с αPD-1. Аналогичнным образом, на фиг. 13 представлены результаты измерений диаметров опухоли у мышей BALB/c. Полученные результаты со всей очевидностью подтвердили уменьшение размеров опухоли у группы мышей, которым вводили метформин в комбинации с анти-PD-1 антителом.
Промышленное применение
Как подробно описано выше, измерение индекса позитивности клеток по цитокинам трех видов позволяет легко определить иммунный статус пациента. Кроме того, способ оценки согласно изобретению позволяет одновременно детектировать молекулы, ответственные за истощение иммунных клеток, и вычислить индекс позитивности клеток по цитокинам трех видов, и тем самым легко и точно определить иммунный статус пациента.
В уже существующих способах лечения пациентов противораковыми вакцинами, пациентов, которые должны быть подвергнуты такому лечению, выявляют исходя из наличия или отсутствия экспрессии вакцинного антигена в раковых тканях, однако, поскольку способ оценки согласно изобретению, помимо данных по экспрессии антигена, позволяет получить информацию об иммунном статусе пациента еще до проведения иммунотерапии, то этот способ позволяет легко выявить пациентов, которым необходимо лечение вакциной. Этот способ вносит значительный вклад в выявление пациентов, нуждающихся в лечении.
Средство для лечения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями согласно изобретению, способствует повышению иммунитета и, например, в случае раковых заболеваний, такое средство, предположительно, будет улучшать прогноз ракового заболевания при введении такого средства в комбинации с хирургической операцией, лучевой терапией или химиотерапией. Кроме того, проведение предоперационной химиотерапии рассматривается как эффективная мера. Кроме того, предполагается, что эта мера будет способствовать подавлению рецидивов после лечения.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу улучшения функции иммунных клеток, а также к иммунным клеткам с улучшенной функцией (клеткам MTi) и к средству для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями, где указанное средство содержит клетки MTi в качестве активного ингредиента. Полученные клетки обладают превосходной иммунной функцией и могут быть использованы в качестве средства для лечения заболеваний, ассоциированных с иммуными патологиями. Так, например, эти клетки могут обладать превосходным действием, если они используются как противоопухолевое средство.
Реферат
Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения саркомы мягких тканей и рака кожи. Для этого используют комбинацию, содержащую метформин и анти-pd-1 антитело. Группа изобретений также относится к способу лечения и/или предупреждения ракового заболевания, включающему введение комбинации. Использование данной комбинации обеспечивает синергетический эффект, повышая чувствительность иммунных клеток к терапевтическому средству при обработке их антидиабетическим лекарственным средством метформином, увеличивая мультифункциональность иммунных клеток в результате увеличения числа cd8-т-клеток, обладающих способностью продуцировать il-2, tnfα и ifnγ. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 8 пр., 5 табл., 13 ил.
