Гидрофильный содержащий фосфатную группу дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости - RU2642250C2

Чертежи

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к предназначенному для замещения кости гидрофильному дегидратированному частично очищенному материалу естественного происхождения, который обладает определенной способностью к всасыванию изотонического раствора и содержит фосфатную группу, пригодную для функционирования в качестве предшественника гидроксиапатита, и к способу получения указанного гидрофильного дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости.

Предпосылки создания изобретения

Область костного дефекта может возникать в результате инфекции, заболевания, травмы, порока развития, злокачественного заболевания, хирургического вмешательства или других факторов. Часто возникает необходимость в создании определенного объема кости, например, для наращивания пораженной заболеванием челюсти. В таких случаях предпочтительно применяют твердый трансплантат, который можно дополнительно стабилизировать. Применение наполнителей в форме частиц ограничено небольшими полостями, поскольку заживление в естественных условиях происходит только в том случае, когда смещение выделенного сегмента относительно окружающей кости отсутствует или очень сильно ограничено.

Известен ряд методов замещения пораженных заболеванием или отсутствующих частей, таких как применение наполнителей или трансплантатов естественного или синтетического происхождения. Вследствие своей естественной структуры кость является очень пористой. Как правило, материал, применяемый для замещения кости, должен имитировать химический состав и микроструктуру человеческой кости. Некоторые физико-химические параметры, такие как кристалличность, растворимость, размер частиц, пористость, структура пор и размер пор материала, имеют решающее значение и могут оказывать сильное влияние на костную совместимость и костную интеграцию. Неудовлетворительная комбинация указанных параметров приводит к неудаче восстановления кости. Известно, что размеры пор влияют на процессы врастания и пролиферации клеток, васкуляризации и/или клеточной адгезии. С учетом этих сведений можно предположить, что материал для замещения кости естественного происхождения имеет определенные важные преимущества по сравнению с синтетическими материалами. Хотя общепризнанным «золотым стандартом» считается аутогенная кость, ее применение имеет ряд недостатков, и как аутогенные, так и аллогенные кости доступны лишь в ограниченных количествах.

В последние годы большое внимание было сфокусировано на сохранении биомеханических свойств кости животных, удовлетворяя при этом параллельно строгим регуляторным биологическим и химико-физическим требованиям, предъявляемым к разработке материалов для замещения кости животного происхождения.

В продажу поступает материал для замещения кости TUTOBONE®, который представляет собой блок бычьей губчатой кости (поставляемый фирмой Tutogen Medical). Он представляет собой дегидратированный частично очищенный костный трансплантат, который в значительной степени сохраняет нативную механическую прочность.

В патенте США №6942961 описан двухстадийный метод дегидратации биологических тканей для получения трансплантатов с сохраненной костной структурой, таких как TUTOBONE®. На первой стадии ткань осуществляют частичную дегидратацию с помощью органического смешивающегося с водой растворителя. На второй стадии ткань подвергают дальнейшей дегидратации путем сушки вымораживанием.

TUTOBONE®, как и другие поступающие в продажу дегидратированные частично очищенные материалы для замещения кости животного происхождения, сохраняющие костную структуру и механическую прочность, не обладают удовлетворительными гидрофильностью и характеристиками костной интеграции. Для того, чтобы преодолеть недостаток, связанный с низкой гидрофильностью поступающих в продажу костных блоков животного происхождения, хирург должен промывать костные блоки физиологическим раствором в процессе или до проведения хирургического вмешательства. Такие костные блоки нужно смачивать, например, помещая их в пустой шприц и промывая несколько раз физиологическим раствором. Это занимает много времени и является непрактичным при проведении хирургического вмешательства или в клинических условиях. Кроме того, нельзя гарантировать, что обработанные таким образом блоки окажутся полностью смоченными и не будут содержать пузырьков воздуха. Такие пузырьки воздуха могут препятствовать быстрой интеграции материала для замещения кости. На поверхности раздела воздух-кровь не может происходить рост или регенерация. Непосредственное структурное и функциональное соединение окружающей живой ткани и материала для замещения кости является недостаточным. Необходимо, чтобы вскоре после имплантации имела место интеграция крови, компонентов крови и клеток пациента с материалом трансплантата.

Таким образом, существует необходимость в создании дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости животного происхождения, сохраняющего костную структуру и механическую прочность, который обладает достаточной гидрофильностью для осуществления быстрого смачивания и регидратации.

В US №6293970 и US 2010/0030340 описан пластифицированный сохраняющий несущую способность костный трансплантат, представляющий собой обработанный с целью очистки (т.е. частично очищенный) недимерализованный сохраняющий несущую способность костный трансплантат, пропитанный одним или несколькими пластификаторами, где пластификаторы представляют собой исключительно сахариды, такие как глюкоза, сахароза и D-галактоза, и С₂-С₇-полиолы, такие как глицерин, адонит, сорбит, рибит, галактит, маннит и ксилит, и костный трансплантат представляет собой «любую кость или ее фрагмент, полученный из организма донора, например, человека или животного и/или из трупа». В данном случае понятие «пластифицированный» означает, что свободные или слабосвязанные гидратационные жидкости, присутствующие в костной ткани, замещены пластификатором без изменения ориентации коллагеновых волокон и ассоциированной минеральной фазы, благодаря чему сохраняются структура и механические свойства естественной кости. Пластификатор применяют с целью стабилизации костного трансплантата и тем самым для предупреждения возникновения или развития трещин или микротрещин в процессе хранения, в процессе имплантации или после имплантации, и для предупреждения риска передачи заболевания: при этом отсутствуют сведения о применении пластификатора в качестве смачивающего агента, в указанных документах вообще не рассмотрен вопрос о гидрофильности костного трансплантата. В патенте US №6293970 описан пластификатор, который следует применять в количестве, составляющем от 3 до 30 мас.% в пересчете на массу кости, и который позволяет осуществлять непосредственную имплантацию костного трансплантата пациенту после лишь кратковременной отмывки в стерильном изотоническом физиологическом растворе для удаления «пластификатора, ассоциированного «непосредственно с поверхностями трансплантата», или после более продолжительной отмывки (в течение примерно одного часа) изотоническим физиологическим раствором для удаления «максимально возможного количества пластификатора» (см., прежде всего, колонку 8, строки 14-62 и колонку 12, строки 10-27). В US 2010/0030340 описан пластификатор, который следует применять в «минимальных количествах», в данном случае это означает минимальное количество, требуемое для замещения гидратационных жидкостей, присутствующих в костной ткани, с использованием пластифицирующей композиции, содержащей более 70 об.% пластификатора, при этом имеется возможность либо имплантировать пластифицированный трансплантат, не осуществляя регидратацию, либо можно быстро отмывать имплантат стерильным изотоническим физиологическим раствором перед осуществлением имплантации (см., прежде всего, параграфы [0035] [0126]), удаляя при этом, как указано в патенте US №6293970, лишь пластификатор, ассоциированный с внешними поверхностями трансплантата.

Согласно процитированным выше патентным документам США пластификатор замещает присутствующую в естественном состоянии гидратационную жидкость, не изменяя ориентацию коллагеновых волокон и ассоциированной минеральной фазы: таким образом, он заключен в структуру костного трансплантата и, следовательно, его трудно элиминировать путем отмывки стерильным изотоническим физиологическим раствором перед осуществлением имплантации. Эффективное количество пластификатора, которое остается в пластифицированном частично очищенном материале после кратковременной отмывки изотоническим физиологическим раствором, трудно оценивать: по-видимому, когда пластификатор применяют не в избыточном количестве по отношению к замещаемой гидратационной жидкости, присутствующей в естественных условиях, то большая часть присутствующего пластификатора остается в пластифицированном очищенном материале. В условиях in vivo должна происходить лишь очень медленная отмывка пластификатора физиологическими жидкостями.

Возможная непереносимость пациентом материала для замещения кости, т.е. чужеродного материала, интродуцированного в его организм, всегда является потенциальной проблемой при осуществлении клинической имплантации, прежде всего в том случае, когда материал для замещения кости содержит в больших количествах добавку, такую как пластификатор или смачивающий агент, который не является физиологической субстанцией.

В основу настоящего изобретения была положена задача создать предназначенный для замещения кости гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал естественного происхождения, пригодный для быстрого смачивания и гидратации, который не имеет недостатков, присущих материалам для замещения кости, известным из существующего уровня техники, прежде всего тех, которые описаны в US №6942961 (TUTOBONE®) и тех, которые описаны в US №6293970 и US 2010/0030340, и который обладает более высокой способностью формирования новой костной ткани в каркасе материала для замещения кости.

Решение задачи, положенной в основу изобретения, представлено в прилагаемой формуле изобретения.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предложен гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости естественного происхождения, обладающий повышенной гидрофильностью и способностью к костной интеграции, из которого удален практически полностью неколлагеновый органический материал, в то время как неорганическая пористая костная структура и коллагеновая структура, присущие естественной кости, практически сохранены, который содержит в количестве 0,05-1,5 мас.% по меньшей мере один сахарид или сахарный спирт и в количестве от 0,7 до 5,6 мас.% фосфатную группу, пригодную для взаимодействия с ионами кальция, присутствующими в физиологических жидкостях, с образованием предшественника гидроксиапатита, где указанная фосфатная группа является компонентом физиологически приемлемой соли.

В настоящем изобретении предложен также способ получения указанного выше гидрофильного дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости естественного происхождения, обладающего повышенной гидрофильностью и способностью к интеграции в костную ткань.

Как продемонстрировано с помощью теста на всасывание изотонического раствора (см., прежде всего, пример 3 и чертежи 1А и 1Б), дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости, предлагаемый в изобретении, является гидрофильным и, таким образом, пригодным к немедленной интеграции в окружающую ткань без риска образования пузырьков воздуха. Благодаря низкому содержанию сахарида или сахарного спирта, т.е. нефизиологической субстанции, он должен минимально нарушать функционирование человеческого организма и, таким образом, должен оптимально переноситься пациентом.

Как продемонстрировано в экспериментах in vitro, в которых осуществляли инкубацию блока дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости, предлагаемого в изобретении, в среде, сходной с физиологическими жидкостями, содержащими ионы кальция (см., прежде всего, пример 4 и фиг. 2), высвободившаяся фосфатная группа вступает во взаимодействие с ионами кальция с образованием белого осадка, представляющего собой фосфаты кальция, на коллагеновых фибриллах блока, указанные фосфаты кальция являются предшественниками гидроксиапатита. Это свидетельствует о том, что в условиях in vivo, как этот имеет место в естественных системах (см. S. Gajjeraman и др., The Journal of Biological Chemistry 282, 2, 2007, cc. 1193-1204 и S. Bodhak и др., Acta Biomaterialia 5, 2009, cc. 2178-2188), должны происходить нуклеация и рост костных минеральных продуктов на коллагеновом матриксе гидрофильного дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости, в таких процессах играет роль фосфатная группа.

Таким образом, фосфатная группа играет важную роль в стимулировании формирования кости. При имплантации различным животным, прежде всего, крысам и собакам, гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости, предлагаемый в изобретении, продемонстрировал очень высокую способность к формированию новой кости, при этом отсутствовали или имели место лишь незначительные нежелательные гистопатологические явления (воспалительные реакции или реакции на чужеродное тело).

Краткое описание чертежей На чертежах показано:

на фиг. 1А - сравнение зависимостей от времени способности к всасыванию изотонического раствора (поглощение жидкости в мг) 8 различных блоков гидрофильного дегидратированного частично очищенного лошадиного материала для замещения кости, который содержал 0,35 мас.% сорбита и 1,4 мас.% (НРО₄^2- и НРО₄^-), предлагаемого в настоящем изобретении, 3 различных блоков дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости естественного происхождения, известного из существующего уровня техники, и поступающего в продажу бычьего материала для замещения кости TUTOBONE® (фирма Tutogen Medical GmbH);

на фиг. 1Б - сравнение зависимостей от времени относительной способности к всасыванию изотонического раствора (отношение масс поглощенной жидкости и дегидратированного блока (выраженное в мас.%) 8 различных блоков гидрофильного дегидратированного частично очищенного лошадиного материала для замещения кости, который содержал 0,35 мас.% сорбита и 1,4 мас.% (НРО₄^2- и НРО₄^-), предлагаемого в настоящем изобретении, 3 различных блоков дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости естественного происхождения, известного из существующего уровня техники, и поступающего в продажу бычьего материала для замещения кости TUTOBONE® (фирма Tutogen Medical GmbH);

на фиг. 2 - полученная с помощью SEM (сканирующая электронная микроскопия) микрофотография поверхности блока гидрофильного дегидратированного частично очищенного лошадиного материала для замещения кости, который содержал 0,35 мас.% сорбита и 1,4 мас.% (НРО₄^2- и НРО₄^-), предлагаемого в настоящем изобретении, после инкубации в среде DMEM (модифицированная по методу Дульбекко среда Игла), содержащей 10% FCS (сыворотка плода коровы);

на фиг. 3 - схематическое изображение костного блока по одному из вариантов осуществления изобретения;

на фиг. 4 - схематическое изображение костного штифта по одному из вариантов осуществления изобретения;

на фиг. 5 - схематическое изображение костной пластинки по одному из вариантов осуществления изобретения;

на фиг. 6 - схематическое изображение костного трапециевидного клина по одному из вариантов осуществления изобретения;

на фиг. 7 - схематическое изображение костного стержня по одному из вариантов осуществления изобретения;

на фиг. 8 - схематическое изображение костных гранул по одному из вариантов осуществления изобретения.

Подробное описание изобретения

В изобретении предложен гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости естественного происхождения, из которого удален практически полностью неколлагеновый органический материал, в то время как неорганическая пористая костная структура и коллагеновая структура, присущие естественной кости, практически сохранены, отличающийся тем, что материал для замещения кости содержит в количестве 0,05-1,5 мас.% по меньшей мере один сахарид или сахарный спирт и в количестве от 0,7 до 5,6 мас.% фосфатную группу, пригодную для взаимодействия с ионами кальция, присутствующими в физиологических жидкостях, с образованием предшественника гидроксиапатита, указанная фосфатная группа является компонентом физиологически приемлемой соли.

В контексте настоящего изобретения понятие «естественное происхождение» относится к любому материалу для замещения кости, т.е. к кости или подобному кости материалу, который получен из организма позвоночных животных, включая (но не ограничиваясь только ими) все виды млекопитающих, таких как человек, корова, лошадь, свинья и т.д., и к любому костному или подобному кости материалу, который получен из организма беспозвоночных животных, таких как кораллы. В конкретных вариантах осуществления изобретения для целей настоящего изобретения применяют бычью, свиную или лошадиную кость.

Понятие «частично очищенный материал для замещения кости» относится к любому материалу для замещения кости, из которого удален практически полностью органический неколлагеновый материал, в то время как неорганическая пористая костная структура и коллагеновая структура, присущие естественной кости, практически сохранены.

Понятие «гидрофильный» означает, что дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости обладает способностью к смачиванию водой, следовательно, он способен легко регидратироваться путем абсорбции изотонического раствора или физиологической жидкости, и, таким образом, при имплантации отсутствует риск образования пузырьков воздуха.

Понятие «сахарид» включает, прежде всего, гексозы, такие как глюкоза, манноза или галактоза; пентозы, такие как рибоза или арабиноза; кетозы, такие как рибулоза или фруктоза; дисахариды, такие как сахароза, лактоза или мальтоза, олигосахариды, типа циклодекстрина. Сахарид может присутствовать в D- или L-форме. В конкретных вариантах осуществления изобретения применяют глюкозу.

Сахарные спирты, применяемые согласно изобретению, представляют собой, прежде всего, сорбит, мальтит, лактит, маннит и ксилит. В конкретных вариантах осуществления изобретения применяют сорбит.

Понятие «фосфатная группа, которая пригодна для взаимодействия с ионами кальция, присутствующими в физиологических жидкостях, с образованием предшественника гидроксиапатита», относится к любой фосфатной группе, которая в организме человека при взаимодействии с ионами кальция, присутствующими в физиологических жидкостях, прежде всего в крови, предпочтительно при значении рН от 6,0 до 8,0 и температуре от 36 до 38°С, имеет тенденцию образовывать предшественник гидроксиапатита Са₁₀(PO₄)₆(ОН)₂, термодинамически более стабильной и менее растворимой соли, т.е. фосфата кальция, которая представляет собой необходимый компонент костей.

Примерами таких фосфатных групп являются РО₄^3-, НРО₄^2- и Н₂РО₄^-.

Фосфатную группу предпочтительно выбирают из группы, состоящей из фосфата HPO₄^2- и H₂PO₄^-.

Физиологически приемлемая соль, которая содержит фосфатную группу, как правило, представляет собой фосфатную соль с физиологически приемлемым катионом, таким, например, как Na⁺, K⁺, Са²⁺, Mg²⁺ и Sr²⁺, которая не приводит к значительному нарушению баланса рН в физиологических жидкостях.

Примерами такой физиологически приемлемой соли являются: Na₂PO₄, Na₂HPO₄, K₂HPO₄, NaH₂PO₄, KH₂PO₄, Са₃(PO₄)₂, CaHPO₄, Са₈(HPO₄)₂(PO₄)₄, их гидраты и смеси.

Как правило, физиологически приемлемая соль, представляющая собой фосфатную соль, содержит катион, выбранный из группы, включающей Na⁺, K⁺, Са²⁺ и Mg²⁺.

В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве физиологически приемлемой соли применяют натрий-фосфатный буфер, в этом случае фосфатными группами, пригодными для взаимодействия с ионами кальция, присутствующими в физиологических жидкостях, которые позволяют получать предшественник гидроксиапатита, являются НРО₄^2- и Н₂РО₄^-.

Фосфатная группа, содержащаяся в таком материале, которая пригодна для взаимодействия с ионами кальция, присутствующими в физиологических жидкостях, с образованием предшественника гидроксиапатита, и которую предпочтительно выбирают из группы, состоящей из фосфата НРО₄^2- и Н₂РО₄^-, играет важную роль в стимулировании формирования кости.

В условиях in vitro продемонстрировано, что после инкубации блока гидрофильного дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости, предлагаемого в изобретении, в течение 72 ч в среде, сходной с физиологическими жидкостями, которые содержат ионы кальция, а именно, в среде DMEM (модифицированная по методу Дульбекко среда Игла), содержащей 10% FCS (сыворотка плода коровы), фосфатная группа вступает во взаимодействие с ионами кальция с образованием белого осадка, состоящего из фосфатов кальция, на коллагеновые фибриллы, которые можно обнаруживать с помощью SEM-анализа (см. фиг. 2). Установлено, что этот осадок содержит два типа фосфатов кальция различной морфологии, при этом их обоих можно рассматривать в качестве предшественников гидроксиапатита.

Результаты указанных экспериментов in vitro (см. пример 4) убедительно продемонстрировали, что in vivo, т.е. в естественных системах (см. S. Gajjeraman и др., The Journal of Biological Chemistry 282, 2, 2007, cc. 1193-1204 и S. Bodhak и др., Acta Biomaterialia 5, 2009, cc. 2178-2188), должны иметь место нуклеация и рост костных минеральных продуктов на коллагеновом матриксе гидрофильного дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости, в таких реакциях играет роль фосфатная группа, содержащаяся в указанном материале, которая высвобождается в физиологические жидкости. Таким образом, поскольку гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости, предлагаемый в изобретении, имеет низкое содержание нефизиологической субстанции, то он должен имитировать естественные системы, при этом фосфат, высвобождаемый из гидрофильного дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости, обеспечивает начальную поддержку формирования кости путем инициации процесса нуклеации и роста костных минеральных продуктов.

Изобретение относится также к гидрофильному дегидратированному частично очищенному материалу для замещения кости, указанному выше, при инкубации которого в среде, сходной с физиологическими жидкостями, содержащими ионы кальция, происходит взаимодействие фосфатной группы с указанными ионами кальция с образованием осадка фосфатов кальция на коллагеновом матриксе, при этом указанные фосфаты кальция обладают характеристиками предшественников гидроксиапатита.

Было установлено, что после имплантации различным животным, прежде всего крысам и собакам, гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости, предлагаемый в изобретении, характеризовался очень высокой способностью к формированию новой кости, при этом отсутствовали или имелись лишь незначительные нежелательные гистопатологические явления (воспаление или реакции на чужеродное тело). Такая новая способность к формированию кости согласуется с данными, представленными, прежде всего, в публикации Chai Y.C. и др., «Probing the osteoinductive effect of calcium phosphate by using an in vitro biomimetic model», Tissue Engineering Part A, 17, 2011, cc. 1083-1097. Указанные авторы убедительно продемонстрировали, что фосфат кальция стимулирует превращение мезенхимальных стволовых клеток в остеобластную линию клеток, тем самым, по-видимому, усиливая формирование кости. Кроме того, у Sogo Y. и др., 2, 2007, cc. 116-123, представлены результаты исследования совместного осаждения фосфата кальция с коллагеном в перенасыщенном растворе фосфата кальция и его влияния на мезенхимальные стволовые клетки, а именно, на усиление остеогенной дифференцировки.

При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что:

Для того, чтобы оказывать стимулирующее влияние на формирование кости, фосфатная группа должна присутствовать в достаточном количестве, как правило, составляющем по меньшей мере 0,7 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 1,0 мас.%, в пересчете на массу гидрофильного дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости.

При высвобождении в избыточном количестве в физиологические жидкости фосфатная группа может вызывать значительное осаждение фосфатов кальция, что может приводить к нежелательному воспалительному ответу. Такой ответ не возникает, если на долю фосфатной группы приходится не более 5,6 мас.%, предпочтительно 2,8 мас.%, в пересчете на массу гидрофильного дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости.

Таким образом, гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости, предлагаемый в изобретении, содержит фосфатную группу, которая требуется для взаимодействия с ионами кальция в физиологических жидкостях с образованием предшественника гидроксиапатита, в количестве, составляющем от 0,7 до 5,6 мас.%, предпочтительно от 1,0 до 2,8 мас.%.

Изобретение относится также к применению в количестве от 0,7 до 5,6 мас.% фосфатной группы, требуемой для взаимодействия с ионами кальция в физиологических жидкостях с образованием предшественника гидроксиапатита, предпочтительно выбранной из группы, состоящей из НРО₄^2- и Н₂РО₄^-, для усиления способности к формированию новой кости предназначенного для замещения кости частично очищенного материала естественного происхождения, из которого практически полностью удален неколлагеновый органический материал, в то время как неорганическая пористая костная структура и коллагеновая структура, присущие естественной кости, практически сохранены, при отсутствии или возникновении лишь незначительных нежелательных гистопатологических явлений (воспалительных реакций или реакций на чужеродное тело).

В конкретных вариантах осуществления изобретения на гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости нанесено покрытие из глюкозы и натрий-фосфатного буфера.

В конкретных вариантах осуществления изобретения на гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости нанесено покрытие из сорбита и натрий-фосфатного буфера.

В конкретных вариантах осуществления изобретения гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости дополнительно содержит одно или несколько фармацевтических действующих веществ.

Примерами пригодных фармацевтических действующих веществ являются тауролидин, вирулициды, микробициды, антибиотики, аминокислоты, пептиды, белки, витамины, кофакторы синтеза белка, гормоны, живые клетки, включая стволовые клетки, ферменты, антигенные агенты, противоопухолевые средства, иммунодепрессанты и факторы роста.

Дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости может иметь любую форму, включая (но не ограничиваясь только ими) блок 10 (фиг. 3), штифт (болт) 12 (фиг. 4), пластину 14 (фиг. 5), трапециевидный клин или полоску 16 (в Великобритании принято название «шплинт», фиг. 6), стержень 18 (фиг. 7) или костные гранулы 20 (фиг. 8) и т.п. В первом варианте осуществления изобретения структура представляет собой блок 10, изображенный на фиг. 3, во втором варианте осуществления изобретения структура представляет собой полоску, изображенную на фиг. 6, а в третьем варианте осуществления изобретения структура представляет собой гранулы, изображенные на фиг. 8.

Изобретение относится также к применению представленного в настоящем описании материала для замещения кости в качестве ремоделирующего имплантата.

Изобретение относится также к применению по меньшей мере одного сахарида или сахарного спирта в количестве, составляющем от 0,05 до 1,5, предпочтительно от 0,05 до 0,8, прежде всего от 0,05 до 0,5 мас.%, для придания гидрофильных свойств предназначенному для замещения кости частично очищенному материалу естественного происхождения, из которого практически полностью удален неколлагеновый органический материал, в то время как неорганическая пористая костная структура и коллагеновая структура, присущие естественной кости, практически сохранены.

Получение гидрофильного дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости

Предлагаемый в изобретении гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости естественного происхождения можно получать с помощью способа, заключающегося в том, что:

(а) получают частично очищенный материал для замещения кости естественного происхождения, осуществляя сначала экстракцию липидов с помощью органических растворителей, обрабатывая делипидированный материал раствором, содержащим хаотропный агент, и осуществляя интенсивную промывку водой,

(б) замачивают частично очищенный материал для замещения кости естественного происхождения в растворе, содержащем по меньшей мере один сахарид или сахарный спирт в количестве 0,05-0,85 мас.%, обеспечивая тем самым гидрофильность частично очищенного материала для замещения кости, и фосфатную группу в концентрации 10-1000 мМ, которая пригодна для взаимодействия с ионами кальция физиологических жидкостей с образованием предшественника гидроксиапатита, где указанная фосфатная группа представляет собой компонент физиологически приемлемой соли, выбранной из группы, состоящей из Na₃PO₄, Na₂HPO₄, K₂HPO₄, NaH₂PO₄, KH₂PO₄, Са₃(PO₄)₂, CaHPO₄, Са₈(HPO₄)₂(PO₄)₄, их гидратов и смесей,

(в) сушат вымораживанием замоченный гидрофильный частично очищенный материал для замещения кости, осуществляя тем самым дегидратацию, и

(г) стерилизуют гидрофильный дегидратированный частично очищенный высушенный вымораживанием материал для замещения кости.

Органические растворители, применяемые для экстракции липидов на стадии (а), могут включать метанол, этанол, пропанол, гексан, циклогексан, ацетон и/или толуол.

Указанные хаотропные агенты, применяемые на стадии (а) представляют собой, например, мочевину, тиомочевину, гуанидин⋅HCl, тиоцианат гуанидина, аминогуанидин⋅HCl, бикарбонат аминогуанидина, карбонат гуанидина, фосфат гуанидина или их смеси.

В одном из вариантов осуществления изобретения гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости естественного происхождения получают с помощью способа, заключающегося в том, что осуществляют стадии, на которых:

(а) получают частично очищенный материал для замещения кости естественного происхождения, осуществляя сначала экстракцию липидов с помощью органических растворителей, обрабатывая делипидированный материал раствором, содержащим хаотропный агент, и осуществляя интенсивную промывку водой,

(б) замачивают дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости естественного происхождения в растворе, содержащем по меньшей мере один сахарид или сахарный спирт в количестве 0,05-0,85 мас.%, обеспечивая тем самым гидрофильность частично очищенного материала для замещения кости, и фосфатную группу в концентрации 10-1000 мМ, выбранную из группы, состоящей из фосфатов НРО₄^2- и H₂PO₄^-, где указанная фосфатная группа представляет собой компонент физиологически приемлемой соли, которая содержит катион, выбранный из группы, состоящей из Na⁺, K⁺, Са²⁺ и Mg²⁺,

(в) сушат вымораживанием замоченный гидрофильный частично очищенный материал для замещения кости, осуществляя тем самым дегидратацию, и

(г) стерилизуют гидрофильный частично очищенный высушенный вымораживанием материал для замещения кости.

В одном из вариантов осуществления изобретения раствор, применяемый на стадии (б), содержит 75-600 мМ, прежде всего 100-200 мМ натрий-фосфатный буфер, имеющий значение рН 7,0.

Описанный выше способ может включать также дополнительную промежуточную стадию дегидратации, которую осуществляют либо для делипидированного материала для замещения кости естественного происхождения, полученного на стадии (а), либо для частично очищенного материала для замещения кости естественного происхождения, полученного по окончании стадии (а), для того, чтобы нарушить коллагеновую структуру и вызвать изменение ориентации коллагеновых волокон.

Указанную промежуточную стадию дегидратации, как правило, осуществляют путем вакуумной сушки при температуре выше 0°С, например, от 5 до 50°С, прежде всего от 10 до 40°С, или при интенсивном продувании материала инертным газом, таким как азот. Сушка вымораживанием не подходит в данном случае, поскольку фиксация мягкой ткани кости при вымораживании приводит к тому, что замкнутая структура естественной кости остается практически такой же, при этом не происходит никакого существенного нарушения коллагеновой структуры.

Получая методом электронной сканирующей микроскопии микрофотографии материала до и после осуществления стадии дегидратации, можно продемонстрировать, что материал, полученный после указанной стадии, по сравнению с материалом, полученным до осуществления указанной стадии, характеризуется более открытой, нарушенной и неупорядоченной структурой коллагена, которая соответствует измененной ориентации коллагеновых волокон. Указанное нарушение коллагеновой структуры становится особенно очевидным в том случае, когда промежуточную стадию дегидратации осуществляют для частично очищенного материала для замещения кости естественного происхождения, полученного по окончании стадии (а).

Предпочтительно еще одну промежуточную стадию дегидратации, представляющую собой стадию вакуумной сушки, осуществляют при температуре выше 0°С для частично очищенного материала для замещения кости естественного происхождения, полученного по окончании стадии (а), например, для того, чтобы нарушить коллагеновую структуру и вызвать изменение ориентации коллагеновых волокон.

Изобретение относится также к дегидратированному частично очищенному материалу для замещения кости, полученному с помощью описанного выше способа.

Гидрофильность и костная интеграция дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости

Костная интеграция, т.е. непосредственное физическое соединение материала имплантата с окружающей живой тканью хозяина может существенно повышать успех восстановления кости.

Гидрофильность является основным фактором, влияющим на костную интеграцию в случае материалов для замещения кости животного происхождения. Чем более гидрофильным является материал, тем лучше и прочнее будет физическое соединение материала имплантата с окружающей тканью. В настоящее время не имеется общепринятого подхода для измерения или количественной оценки гидрофильности и костной интеграции. Косвенный метод измерения костной интеграции заключается в оценке способности трансплантата к всасыванию изотонического раствора.

Способность дегидратированного частично очищенного костного материала к всасыванию изотонического раствора представляет собой присущее данному материалу свойство, заключающееся в способности абсорбировать изотонический раствор в свою внутреннюю структуру. Указанное свойство зависит от структуры пор, смачиваемости и капиллярности костного материала, и оно является хорошим показателем костной интеграции, т.е. непосредственного физического соединения материала имплантата с окружающей живой тканью хозяина, что имеет важное значение для успеха восстановления кости.

Для измерения способности блока твердого материала для замещения кости всасывать изотонический раствор применяли следующий метод: В чашку лабораторных точных весов помещали определенное количество изотонического ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор). Один блок дегидратированного материала для замещения кости определенной массы закрепляли на установленном рядом с весами устройстве, позволяющем регулировать высоту. Затем высоту устройства регулировали таким образом, чтобы блок материала для замещения кости лишь касался поверхности водной жидкости, находящейся в чашке. Высоту устройства фиксировали, так что расстояние до поверхности жидкости оставалось одним и тем же в процессе измерений. Жидкость абсорбировалась в блок гидрофильного материала для замещения кости, и с помощью весов определяли поглощение жидкости в зависимости от времени.

Способность дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости всасывать изотонический раствор оценивали по массе абсорбированного изотонического раствора. Относительную способность к всасыванию изотонического раствора определяли как способность к всасыванию изотонического раствора на единицу массы дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что нанесение на дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости естественного происхождения покрытия, состоящего из по меньшей мере одного сахарида или сахарного спирта и физиологически приемлемой соли, таким образом, чтобы оно содержало по меньшей мере один сахарид или сахарный спирт в количестве, составляющем от 0,05 до 1,5 мас.%, очень сильно повышает способность к всасыванию изотонического раствора.

Относительная способность обработанных таким образом материалов для замещения кости к всасыванию изотонического раствора в течение 5 мин составляет по меньшей мере 50%, но она может составлять по меньшей мере 100% в течение 5 мин или даже по меньшей мере 200% в течение 5 мин.

Было установлено, что в некоторых вариантах осуществления изобретения примерно 50% от общего поглощения жидкости достигается в течение промежутка времени, составляющего менее чем примерно две минуты или даже менее чем примерно 1 минуту.

Было установлено, что в некоторых вариантах осуществления изобретения такую благоприятную способность к всасыванию изотонического раствора можно обеспечивать путем нанесения покрытия из взятого в небольшом количестве по меньшей мере одного сахарида или сахарного спирта на дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости естественного происхождения так, чтобы на долю по меньшей мере одного сахарида или сахарного спирта приходилось от 0,05 до 0,8 мас.% или даже от 0,05 до 0,5 мас.%.

С указанными характеристиками ассоциированы имеющие принципиальное значение преимущества, прежде всего следующие:

- интеграция трансплантата с окружающей тканью начинается практически сразу;

- хирургу не требуется осуществлять предварительную обработку материала для замещения кости перед его применением и, следовательно, за счет этого может быть обеспечено снижение риска загрязнения материала;

- сахарид или сахарный спирт, представляющий собой нефизиологическую субстанцию, которая должна смываться физиологическими жидкостями, остается в минимальном количестве, следовательно, имеет место минимальное нарушение функционирования человеческого организма и имплантированный гидрофильный костный материал должен оптимально переноситься пациентом;

- достигается более эффективное и быстрое заживление, чем при применении подходов, известных из существующего уровня техники.

Приведенные ниже примеры служат для иллюстрации изобретения и не ограничивают его объем.

Пример 1. Получение дегидратированных частично очищенных блоков лошадиной губчатой кости, содержащих 1,5 мас.% глюкозы и 1,4 мас.% HPO₄^2- и H₂PO₄^-

Лошадиную губчатую кость разрезали на блоки размером по 12×12×5 мм.

Осуществляли следующие стадии обработки указанных блоков: стадии избирательной промывки водой и/или органическим растворителем, таким как ацетон или спирт (например, этанол), стадии вирусной дезактивации с использованием гидроксида натрия и/или пероксида водорода, делипидирования с помощью органического растворителя, такого как метанол, этанол, пропанол, гексан, циклогексан, ацетон или толуол, и последующие стадии промывки раствором, содержащим хаотропную соль, такую как мочевина или гидрохлорид гуанидина, при температуре от 4°С до 35°С. Полученные блоки тщательно отмывали водой и в завершение подвергали вакуумной сушке.

Анализ указанных блоков с помощью электронной сканирующей микроскопии позволил установить, что нативная коллагеновая структура практически сохранялась. Анализ указанных блоков с помощью различных методов, включая полуколичественный 2D ДСН-ПААГ, выявил присутствие менее чем 1% экстрагируемых белков, отличных от коллагена.

Затем блоки замачивали в 0,86 мас.% растворе глюкозы, содержащем 200 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,0 (полученный путем растворения NaH₂PO₄ в деминерализованной воде и регулирования значения рН с помощью гидроксида натрия) при комнатной температуре в течение 3 ч, вынимали из водного раствора с помощью пинцета, после чего сушили вымораживанием и стерилизовали с использованием гамма-излучения. Установлено, что полученные блоки содержали примерно 1,5 мас.% глюкозы и 1,87 мас.% НРО₄^2- и H₂PO₄^-.

Пример 2. Получение дегидратированных частично очищенных блоков лошадиной губчатой кости, содержащих 0,35 мас.% сорбита и 1,4 мас.% фосфата НРО₄^2- и H₂PO₄^-

Лошадиную губчатую кость разрезали на блоки размером по 10×10×5 мм.

Осуществляли следующие стадии обработки указанных блоков: стадии избирательной отмывки водой и/или органическим растворителем, таким как ацетон или спирт (например, этанол), стадии вирусной дезактивации с использованием гидроксида натрия и/или пероксида водорода, делипидирования с помощью органического растворителя, такого как метанол, этанол, пропанол, гексан, циклогексан, ацетон или толуол, и последующие стадии промывки раствором, содержащим хаотропную соль, такую как мочевина или гидрохлорид гуанидина, при температуре от 4°С до 35°С. Полученные блоки тщательно отмывали водой и в завершение подвергали вакуумной сушке.

Анализ указанных блоков с помощью электронной сканирующей микроскопии позволил установить, что нативная коллагеновая структура практически сохранялась. Анализ указанных блоков с помощью различных методов, включая полуколичественный 2D-ДСН-ПААГ, выявил присутствие менее чем 1% экстрагируемых белков, отличных от коллагена.

Затем блоки замачивали в 0,2 мас.% водном растворе сорбита, содержащем 150 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,0 (полученный путем растворения NaH₂PO₄ в деминерализованной воде и регулирования значения рН с помощью гидроксида натрия) при комнатной температуре в течение 2 ч, вынимали из водного раствора с помощью пинцета, после чего сушили вымораживанием и стерилизовали с использованием гамма-излучения. Установлено, что полученные блоки содержали примерно 0,35 мас.% сорбита и 1,4 мас.% НРО₄^2- и H₂PO₄^-.

Пример 2бис. Получение «непластифицированных» дегидратированных частично очищенных блоков лошадиной губчатой кости, содержащих 0,35 мас.% сорбита и 1,4 мас.% фосфата НРО₄^2- и Н₂РО₄^-

Лошадиную губчатую кость разрезали на блоки размером по 10×10×5 мм.

Осуществляли следующие стадии обработки указанных блоков: стадии избирательной отмывки водой и/или органическим растворителем, таким как ацетон или спирт (например, этанол), стадии вирусной дезактивации с использованием гидроксида натрия и/или пероксида водорода, делипидирования с помощью органического растворителя, такого как метанол, этанол, пропанол, гексан, циклогексан, ацетон или толуол, и последующие стадии промывки раствором, содержащим хаотропную соль, такую как мочевина или гидрохлорид гуанидина, при температуре от 4°С до 35°С. Полученные блоки тщательно отмывали водой, затем осуществляли стадию вакуумной сушки при комнатной температуре в течение 240 мин и давлении ниже 20000 Па.

Анализ указанных блоков с помощью электронной сканирующей микроскопии до осуществления стадии вакуумной сушки (высушенных вымораживанием) и после указанной стадии выявил существенное различие в коллагеновой структуре: После стадии вакуумной сушки коллагеновая структура была более открытой, нарушенной и переупорядоченной, что соответствовало изменению ориентации коллагеновых волокон.

Таким образом, указанные блоки были «непластифицированными», т.е. они не соответствовали определению «пластифицированный» согласно US №6293970 и US 2010/0030340 (см. выше с. 3, строки 10-139).

Анализ блоков, полученных после стадии вакуумной сушки, с помощью различных методов, включая полуколичественный 2D-ДСН-ПААГ, выявил присутствие менее чем 1% экстрагируемых белков, отличных от коллагена.

Затем блоки замачивали в 0,2 мас.% водном растворе сорбита, содержащем 150 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,0 (полученный путем растворения NaH₂PO₄ в деминерализованной воде и регулирования значения рН с помощью гидроксида натрия) при комнатной температуре в течение 2 ч, вынимали из водного раствора с помощью пинцета, после чего сушили вымораживанием и стерилизовали с использованием гамма-излучения. Установлено, что полученные блоки содержали примерно 0,35 мас.% сорбита и 1,4 мас.% НРО₄^2- и H₂PO₄^-.

Пример 3. Измерение способности дегидратированных частично очищенных костных материалов, предлагаемых в изобретении, к всасыванию изотонического раствора в зависимости от времени

Для измерения способности блока твердого материала для замещения кости к всасыванию изотонического раствора применяли следующий метод:

В чашку лабораторных точных весов помещали определенное количество изотонического раствора ЗФР. Один блок дегидратированного материала для замещения кости определенной массы закрепляли на установленном рядом с весами устройстве, позволяющем регулировать высоту. Затем высоту устройства регулировали таким образом, чтобы блок материала для замещения кости лишь касался поверхности водной жидкости, находящейся в чашке. Высоту устройства фиксировали, так что расстояние до поверхности жидкости оставалось одним и тем же в процессе эксперимента. Жидкость абсорбировалась в блок гидрофильного материала для замещения кости, и с помощью весов определяли поглощение жидкости в зависимости от времени.

Описанный выше метод применяли для измерения способности абсорбировать изотонический раствор:

- 8 различных блоков (с плотностью от 0,230 до 0,500 г/см³) предлагаемого в изобретении гидрофильного дегидратированного частично очищенного лошадиного материала для замещения кости, содержащего 0,35 мас.% сорбита и 1,4 мас.% НРО₄^2- и Н₂РО₄^-, который получали согласно процедуре, описанной в примере 2

- 3 различных блока дегидратированного частично очищенного лошадиного материала для замещения кости, полученного согласно процедуре, описанной во втором параграфе примера 2 (без сорбита или фосфата), и

- поступающего в продажу блока бычьего материала для замещения TUTOBONE® (фирма Tutogen Medical GmbH).

Результаты представлены на фиг. 1А и фиг. 1Б.

На фиг. 1А представлена способность указанных выше блоков к всасыванию изотонического раствора (поглощение жидкости в мг) в зависимости от времени.

На фиг. 1Б представлена относительная способность указанных выше блоков к всасыванию изотонического раствора (отношение масс (поглощенной жидкости и дегидратированного блока, выраженное в мас.%) в зависимости от времени.

Как следует из данных, представленных на фиг. 1А,

- присутствие 0,35 мас.% сорбита и 1,4 мас.% НРО₄^2- и Н₂РО₄^- резко повышает способность к всасыванию изотонического раствора,

- поглощение, составляющее более чем 50% от общего поглощения, достигалось в течение менее чем 2 мин или даже менее чем 1 мин.

Как следует из данных, представленных на фиг. 1Б,

- для всех блоков относительная способность к всасыванию изотонического раствора в течение 5 мин составляла по меньшей мере 100%,

- но она могла составлять и по меньшей мере 150% (5 блоков) или даже по меньшей мере 200% (один блок).

Результаты описанных выше экспериментов свидетельствуют о высокой гидрофильности блоков дегидратированных частично очищенных костных материалов, предлагаемых в изобретении, которые содержали 0,35 мас.% сорбита и 1,4 мас.% НРО₄^2- и Н₂РО₄^-.

В серии сходных экспериментов было продемонстрировано, что блоки дегидратированных частично очищенных костных материалов, предлагаемых в изобретении, которые содержали 0,05, 0,2, 0,46, 1,14 или 1,50 мас.% сорбита и 1,4 мас.% НРО₄^2- и Н₂РО₄^-, обладали такой же высокой гидрофильностью (величины относительной способности к абсорбции изотонического раствора, измеренные для указанных различных содержаний сорбита, не различались значимо друг от друга).

Пример 4 Образующийся в результате взаимодействия с ионами кальция, присутствующими в среде, сходной с физиологическими жидкостями, осадок на поверхности дегидратированных частично очищенных костных материалов, предлагаемых в изобретении, по-видимому, может являться предшественником гидроксиапатита.

Блок предлагаемого в изобретении гидрофильного дегидратированного частично очищенного лошадиного материала для замещения кости массой примерно 150 мг, содержащий 0,35 мас.% сорбита и 1,4 мас.% HPO₄^2- и Н₂РО₄^-, который получали согласно процедуре, описанной в примере 2, и 3 мл 150 мМ натрий-фосфатного буфера (содержащего НРО₄^2- и Н₂РО₄^- в таком же количестве, что и указанный выше блок) без какого-либо блока инкубировали в течение 72 ч при 37°С в 3 мл среды DMEM (модифицированная по методу Дульбекко среда Игла), содержащей 10% FCS (сыворотка плода коровы) (среда, сходная с физиологическими жидкостями, в которой концентрация ионов кальция составляла примерно 65 мг/л).

Среда, полученная при инкубации натрий-фосфатного буфера, становилась мутной и оставалась такой в течение всего времени инкубации, в то время как среда, полученная при инкубации каждого из указанных выше блоков, оставалась прозрачной в течение всего времени инкубации.

Указанный выше блок вынимали из среды для инкубации, фиксировали с помощью 4% ПФА (параформальдегид), сушили и анализировали с помощью SEM (электронная сканирующая микроскопия).

На фиг. 2 представлена микрофотография указанного блока: осадок на поверхности материала изображен белым цветом, коллагеновые фибриллы различимы в виде сероватой сети под осадком.

Для дополнительной характеризации взаимодействия блока с ионами кальция, присутствующими в среде, проводили измерение концентрации Са в среде до и после инкубации в течение 24 ч с блоком. Измеренное после инкубации в течение 24 ч количество ионов кальция оказалось намного меньше (примерно 2,0 мг/мл), чем начальное количество ионов кальция (примерно 50 мг/мл), что свидетельствует о то, что имело место взаимодействие ионов кальция с фосфатными группами.

Поскольку оказалось невозможным удалить осадок с указанных блоков для анализа его состава, то осуществляли промывку осадка, образовавшегося из мутной среды в сходных условиях при инкубации 3 мл 150 мМ натрий-фосфатного буфера без блока, его сушку и анализ с помощью сканирующей электронной микроскопии (с использованием растрового электронного микроскопа (REM)) и энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDX). Было установлено, что осадок содержал кальций, фосфат и кислород и включал два типа фосфатов кальция различной морфологии, одну кристаллическую (остроугольные пластинки), характеризующуюся молярным соотношением кальций : фосфат, равным 1:1, и другую криптокристаллическую или аморфную (мелкие состоящие из частиц агломераты), характеризующуюся молярным соотношением 4:3. Оба структурных типа характеризовались молярным соотношением Са : Р, отличным от того, которое присуще гидроксиапатиту, это свидетельствует о том, что обе фазы можно классифицировать как предшественников гидроксиапатита. Фактически все соли на основе ортофосфата кальция должны трансформироваться в гидроксиапатит, т.е. в термодинамически наиболее стабильную форму всех солей на основе ортофосфата кальция, в водной среде с рН примерно 7 при температуре примерно 37°С, что соответствует нормальным условиям, характерным для организма человека.

Указанные эксперименты продемонстрировали, что в гидрофильном дегидратированном частично очищенном материале для замещения кости, предлагаемом в изобретении, который содержит смачивающий агент в существенно меньшем количестве, чем известные из существующего уровня техники гидрофильные материалы для замещения кости, фосфатные группы НРО₄^2- и Н₂РО₄^- взаимодействуют с ионами кальция, присутствующими в общей воде организма, с образованием осадка на поверхности биоматериала, причем этот осадок обладает характерными признаками, присущими предшественнику гидроксиапатита.

Результат описанных выше экспериментов in vitro убедительно свидетельствуют о том, что in vivo, т.е. в естественных системах, может иметь место нуклеация и рост костных минеральных продуктов на коллагеновом матриксе, при этом в указанных взаимодействиях участвуют фосфатные группы, высвобождаемые в физиологические жидкости.

Реферат

Группа изобретений относится к медицине. Описаны гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости естественного происхождения, из которого практически полностью удален неколлагеновый органический материал, при этом практически сохранены неорганическая пористая костная структура и коллагеновая структура, присущие естественной кости, где материал для замещения кости содержит по меньшей мере один сахарид или сахарный спирт в количестве, составляющем от 0,05 до 1,5 мас.%, и фосфатную группу, выбранную из группы, состоящей из фосфата НРОи НРО, в количестве от 0,7 до 5,6 мас.%, где указанная фосфатная группа является компонентом физиологически приемлемой соли, и способ получения гидрофильного дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости. Материал сохраняет костную структуру и механическую прочность, а также обладает достаточной гидрофильностью для осуществления быстрого смачивания и регидратации. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 пр.

Формула