Иммуногенные композиции, содержащие конъюгированные капсульные сахаридные антигены, и их применение - RU2774075C1

Чертежи

Показать все 16 чертежа(ей)

Описание

Область техники

Настоящее изобретение относится к новым иммуногенным композициям, содержащим конъюгированные капсульные сахаридные антигены (гликоконъюгаты) и их применению. Иммуногенные композиции согласно представленному изобретению, как правило, содержат гликоконъюгаты, в которых сахариды получены из серотипов Streptococcus pneumoniae. Изобретение также относится к вакцинации людей, в частности младенцев и пожилых людей, против пневмококковых инфекций с применением указанных новых иммуногенных композиций.

Уровень техники

Инфекционные заболевания, вызванные пневмококками, являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Пневмония, фебрильная бактериемия и менингит являются наиболее распространенными проявлениями инвазивных пневмококковых инфекций, в то время как распространение бактерий в дыхательных путях может в результате привести к инфекции среднего уха, синуситу или рецидивирующему бронхиту. По сравнению с инвазивным заболеванием, неинвазивные проявления, как правило, являются менее серьезными, но значительно более широко распространенными. В Европе и Соединенных Штатах, пневмококковая пневмония является наиболее распространенной внебольничный бактериальной пневмонией, которая по оценкам затрагивает около 100 на 100000 взрослого населения каждый год. Соответствующие цифры для фебрильной бактериемии и менингита составляют 15-19 на 100000 и 1-2 на 100000, соответственно. Риск одного или нескольких из данных проявлений значительно выше у детей и пожилых людей, а также иммуно-скомпрометированных лиц любого возраста. Даже в экономически развитых регионах, инвазивное пневмококковое заболевание приводит к высокой смертности; для взрослых с пневмококковой пневмонией уровень смертности составляет в среднем 10%-20%, в то время как он может превышать 50% в группах высокого риска. Пневмония, вне всякого сомнения, является наиболее распространенной причиной смерти от заболеваний, вызванных пневмококком во всем мире.

Этиологический агент пневмококковых заболеваний, Streptococcus pneumoniae (пневмококк), представляет собой грамположительные инкапсулированные кокки, окруженные полисахаридной капсулой. Различия в составе данной капсулы обеспечивают серологическую дифференциацию между около 91 капсульным типом пневмококка, некоторые из которых часто являются причиной пневмококкового заболевания, другие реже. Инвазивные пневмококковые инфекции включают пневмонию, менингит и фебрильную бактериемию; распространенными неинвазивными проявлениями являются отит, синусит и бронхит.

Пневмококковые конъюгированные вакцины (PCV) представляют собой пневмококковые вакцины, которые применяют для защиты от заболеваний, вызванных S. pneumoniae (пневмококками). В настоящее время существует три PCV вакцины доступные на мировом рынке: PREVNAR^® (в некоторых странах называемая превенар) (гептавалентная вакцина), SYNFLORIX^® (декавалентная вакцина) и PREVNAR 13^® (тридекавалентная вакцина).

Благодаря резистентности микроорганизмов к основным антибиотикам, повсеместно развившейся в последнее время, и возрастающему количеству иммуно-скомпрометированных лиц требуются пневмококковые вакцины с еще более широкой защитой.

В частности, существует необходимость удовлетворить сохраняющуюся до сих пор потребность медицины в вакцине, которая бы обеспечивала защиту от пневмококковых инфекций, вызванных серотипами, отсутствующими в вакцине PREVNAR 13^®, и которую можно бы было применять в случае замещения серотипов с течением времени. Конкретные болезнетворные серотипы, не относящиеся к 13 серотипам в вакцине PREVNAR 13^®, варьируются в зависимости от региона, населения, и могут изменяться с течением времени из-за приобретения резистентности к антибиотикам, введения пневмококковой вакцины и долговременной тенденции неизвестного происхождения. Существует потребность в иммуногенной композиции, которую можно применять для индуцирования иммунного ответа против дополнительных серотипов Streptococcus pneumoniae у людей и, в частности, у детей в возрасте менее 2 лет. Задача новых иммуногенных композиций согласно представленному изобретению заключается в обеспечении соответствующей защиты против серотипов S. Pneumoniae, отсутствующих в вакцине PREVNAR 13^®. В одном аспекте, задача иммуногенной композиции согласно представленному изобретению заключается в обеспечении соответствующей защиты против серотипов S. Pneumoniae, отсутствующих в вакцинах PREVNAR^® (гептавалентная вакцина), SYNFLORIX^® и/или PREVNAR 13^® при сохранении иммунного ответа против серотипов, покрываемых на данный момент указанными вакцинами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представленное изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один гликоконъюгат, выбранный из группы, состоящей из гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 15В, гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 22F, гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 33F, гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 12F, гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 10А, гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 11А и гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 8.

В одном аспекте, согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 22F, и по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 33F.

В другом аспекте, согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 22F, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 33F, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 10А, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 11А и, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 8.

В одном аспекте указанная выше иммуногенная композиция дополнительно содержит гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F.

В другом аспекте указанная выше иммуногенная композиция дополнительно содержит гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F.

В другом аспекте указанная выше иммуногенная композиция дополнительно содержит гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 6А и 19А.

В другом аспекте указанная выше иммуногенная композиция дополнительно содержит гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 3.

В другом аспекте указанная выше иммуногенная композиция дополнительно содержит гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 2, 9N, 17F, 20 и/или 15С.

В одном аспекте указанная выше иммуногенная композиция не содержит капсульные сахариды S. pneumoniae серотипов 9N, 9А и/или 9L.

В одном аспекте указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном аспекте указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25-валентную пневмококковую конъюгированную композицию.

В одном аспекте гликоконъюгаты получены независимым конъюгированием с белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из DT (дифтерийный анатоксин), ТТ (столбнячный анатоксин), CRM₁₉₇, других DT мутантов, PD (D-протеин Haemophilus influenzae), или их иммунологически функциональных эквивалентов.

В одном аспекте, согласно изобретению предложен контейнер, заполненный любой иммуногенной композицией, определенной в настоящей заявке.

В одном аспекте, согласно изобретению предложена любая иммуногенная композиция, определенная в настоящей заявке, для применения в качестве лекарственного средства, в частности, для применения в качестве вакцины.

В одном аспекте, согласно изобретению предложен способ предупреждения, лечения или ослабления инфекции, заболевания или состояния, обусловленных S. pneumoniae, у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества любой иммуногенной композиции, определенной в настоящей заявке.

Фигуры

Фигура 1 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 8 (Pn-8).

Фигура 2 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 10А (Pn-10А).

Фигура 3 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 11А (Pn-11А).

Фигура 4 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 12F (Pn-12F).

Фигура 5 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 15В (Pn-15В).

Фигура 6 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F (Pn-22F).

Фигура 7 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 33F (Pn-33F).

Фигура 8 показывает блок-схему типичного процесса активации (А) и процессов конъюгации (В), которые можно применять при получении Pn-33F гликоконъюгата. Фигура 9 показывает влияние количества N-хлорсукцинимида (NCS) на степень окисления (DO) в реакции окисления с помощью TEMPO/NCS. Фигура 10 показывает оценку стабильности Pn-12F гликоконъюгатов. Фигура 11 - перекрестно-функциональные ответы, определенные с помощью измерения опсонофагоцитирующей активности (ОФА, ОРА). Проводили анализ подмножества из 59 сывороток от взрослых людей, вакцинированных 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (исследование США 6115А1-004; идентификатор на сайте ClinicalTrials.gov: NCT 00427895) методом ОРА на присутствие функциональных антител против серотипов 9V, 9А, 9L и 9N. Для каждого из указанных серотипов сверху приведен процент образцов с ОРА положительным титром (то есть ≥1:8). По оси х под обозначением серотипа приведены среднегеометрические титры (GMT).

Фигура 12 - перекрестно-функциональные ответы, определенные с помощью измерения ОРА, для шестидесяти шести образцов сыворотки до и после вакцинирования. Проводили анализ подмножества из 66 панелей соответствующих сывороток до- и после-вакцинирования от взрослых людей, вакцинированных 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (исследование 6115А1-3005; идентификатор на сайте ClinicalTrials.gov: NCT00546572), методом ОРА на присутствие функциональных антител против серотипов 9V, 9А, 9L и 9N. Для каждого из указанных серотипов приведен процент образцов с ОРА положительным титром (то есть ≥1:8). По оси х под обозначением серотипа приведены среднегеометрические титры (GMT). Фигура 13 - обратные кумулятивные кривые распределения (RCDC) до и после иммунизации - пневмококковый серотип 9V (Pn9V).

Обратные кумулятивные кривые распределения ОРА титров к серотипу 9V для панели соответствующих сывороток до- и после-вакцинирования (N=66) пациентов, вакцинированных 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (исследование 6115А1-3005; идентификатор на сайте ClinicalTrials.gov: NCT 00546572). На графиках представлен процент сывороток с ОРА положительным титром (то есть,>1:8).

Фигура 14 - обратные кумулятивные кривые распределения (RCDC) до и после иммунизации - пневмококковый серотип 9А (Pn9A).

Обратные кумулятивные кривые распределения ОРА титров к серотипу 9А для соответствующей панели соответствующих сывороток до- и после-вакцинирования (N=66) пациентов, вакцинированных 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (исследование 6115А1-3005; идентификатор на сайте ClinicalTrials.gov: NCT00546572). На графиках представлен процент сывороток с ОРА положительным титром (то есть ≥1:8). Фигура 15 - обратные кумулятивные кривые распределения (RCDC) до и после иммунизации - пневмококковый серотип 9L (Pn9L).

Обратные кумулятивные кривые распределения ОРА титров к серотипу 9L для панели соответствующих сывороток до- и после-вакцинирования (N=66) пациентов, вакцинированных 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (исследование 6115А1-3005; идентификатор на сайте ClinicalTrials.gov: NCT 00546572). На графиках представлен процент сывороток с ОРА положительным титром (то есть ≥1:8).

Фигура 16 - обратные кумулятивные кривые распределения (RCDC) до и после иммунизации - пневмококковый серотип 9N (Pn9N).

Обратные кумулятивные кривые распределения ОРА титров к серотипу 9N для панели соответствующих сывороток до- и после-вакцинирования (N=66) пациентов, вакцинированных 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (исследование 6115А1-3005; идентификатор на сайте ClinicalTrials.gov: NCT00546572). На графиках представлен процент сывороток с ОРА положительным титром (то есть, ≥1:8).

1. Иммуногенная композиция согласно изобретению

Иммуногенная композиция согласно настоящему изобретению, главным образом, будет содержать конъюгированные капсульные сахаридные антигены (также называемые гликоконъюгатами), в которых сахариды получены из серотипов S. pneumoniae.

Предпочтительно, количество капсульных сахаридов S. pneumoniae может находиться в диапазоне от 8 различных серотипов (или "v", валентность) до 20 различных серотипов (20v). В одном варианте осуществления представлено 8 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 9 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 10 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 11 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 12 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 13 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 14 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 15 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 16 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 17 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 18 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 19 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 20 различных серотипов. Капсульные сахариды конъюгированы с белком-носителем с образованием гликоконъюгатов, как описано в данном документе ниже. Если белковый носитель является одинаковым для 2-х или более сахаридов в композиции, сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белка-носителя (молекулы носителя, с которыми конъюгировано 2 или более различных сахаридов) [смотри, например, WO 2004/083251]. Однако в предпочтительном варианте осуществления, каждый сахарид независимо конъюгирован с разными молекулами белка-носителя (каждая молекула белкового носителя конъюгирована с сахаридом только одного типа). В указанном варианте осуществления говорят, что капсульные сахариды независимо конъюгированы с белком-носителем.

Для целей настоящего изобретения термин «гликоконъюгат» означает капсульный сахарид, связанный ковалентно с белком-носителем. В одном варианте осуществления капсульный сахарид связан непосредственно с белком-носителем. Во втором варианте осуществления бактериальной сахарид связан с белком через спейсер/линкер.

1.1. Белок-носитель согласно изобретению

Компонент гликоконъюгата согласно изобретению представляет собой белок-носитель, с которым конъюгирован сахарид. Термины "белковый носитель", или "белок-носитель", или "носитель" могут использоваться взаимозаменяемо в данном документе. Белки-носители должны быть пригодны для стандартных процедур конъюгации.

В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель гликоконъюгатов выбирают из группы, состоящей из: DT (дифтерийный анатоксин), ТТ (столбнячный анатоксин) или С-фрагмента ТТ, CRM₁₉₇ (нетоксичный, но антигенно идентичный вариант дифтерийного токсина), других DT мутантов (таких как CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al. (1973) J. Biol. Chem. 218:3838-3844), CRM9, CRM102, CRM103 или CRM107; и других мутаций, описанных в Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc. (1992); делеции или мутации Glu-148 до Asp, Gin или Ser и/или Ala 158 до Gly и других мутаций, раскрытых в патентах США №№4,709,017 и 4,950,740; мутации по меньшей мере одного или более остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534 и других мутаций, раскрытых в патентах США №№5,917,017 и 6,455,673; или фрагмента, раскрытого в патенте США №5,843,711, пневмококкового пневмолизина (ply) (Kuo et al. (1995) Infect Immun 63:2706-2713), включая ply, детоксифицированный каким-либо образом, например, dPLY-GMBS (WO 2004/081515, WO 2006/032499) или dPLY-формалин, PhtX, включая PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (последовательности PhtA, PhtB, PhtD или PhtE раскрыты в WO 00/37105 и WO 00/39299) и продукты слияния Pht белков, например, PhtDE продукты слияния, PhtBE продукты слияния, Pht АЕ (WO 01/98334, WO 03/054007, WO 2009/000826), ОМРС (белок менингококковой наружной мембраны), который обычно экстрагируют из Neisseria meningitidis серогруппы В (ЕР 0372501), PorB (из N. meningitidis), PD (D-протеин Haemophilus influenzae; см., например, ЕР 0594610 В), или их иммунологически функциональных эквивалентов, синтетических пептидов (ЕР 0378881, ЕР 0427347), белков теплового шока (WO 93/17712, WO 94/03208), коклюшных белков (WO 98/58668, ЕР 0471177), цитокинов, лимфокинов, факторов роста или гормонов (WO 91/01146), искусственных белков, содержащих множественные эпитопы человеческих Т-клеток CD4+от различных патогенных производных антигенов (Falugi et al.(2001) Eur J Immunol 31:3816-3824), таких как N19 белок (Baraldoi et al. (2004) Infect Immun 72:4884-4887), пневмококковый поверхностный белок PspA (WO 02/091998), белки захвата железа (WO 01/72337), токсин А или В Clostridium difficile (WO 00/61761), трансферрин-связывающие белки, пневмококковые белки адгезии (PsaA), рекомбинантный экзотоксин А Pseudomonas aeruginosa (в частности, их нетоксичные мутанты (такие как экзотоксин А несущий замещение в глутаминовой кислоте 553 (Douglas et al.(1987) J. Bacteriol. 169(11): 4967-4971)). В качестве белков-носителей также можно применять другие белки, такие как овальбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA) или очищенное производное белка туберкулина (PPD). Другие подходящие белки-носители включают инактивированные бактериальные токсины, такие как холерный анатоксин (например, как описано в WO 2004/083251), Escherichia coll LT, Е, coli ST, и экзотоксин А P. aeruginosa.

В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель в гликоконъюгатах независимо выбран из группы, состоящей из ТТ, DT, DT мутантов (таких как CRM₁₉₇), D-протеина Н, influenzae, PhtX, PhtD, PhtDE продуктов слияния (в частности, тех, которые описаны в WO 01/98334 и WO 03/054007), детоксифицированного пневмолизина, PorB, N19 белка, PspA, ОМРС, токсина А или В С, Difficile и PsaA.

В одном варианте осуществления, белок-носитель в гликоконъюгатах согласно изобретению представляет собой DT (дифтерийный анатоксин). В другом варианте осуществления, белок-носитель в гликоконъюгатах согласно изобретению представляет собой ТТ (столбнячный анатоксин). В другом варианте осуществления, белок-носитель в гликоконъюгатах согласно изобретению представляет собой PD (D-протеин Н, influenzae; смотри, например, ЕР 0594610 В).

В предпочтительном варианте осуществления, капсульные сахариды согласно изобретению являются конъюгированными с CRM₁₉₇ белком. CRM₁₉₇ белок представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, но является иммунологически неотличимыми от дифтерийного токсина. CRM₁₉₇ продуцируется Corynebacterium diphtheriae, инфицированным нетоксикогенным фагом β197^tox-, созданным путем нитрозогуанидинового мутагенеза токсикогенного коринефага бета (Uchida et al. (1971) Nature New Biology 233:8-11). CRM₁₉₇ белок имеет такую же молекулярную массу, как и дифтерийный токсин, но отличается от него за счет одного изменения основания (гуанина на аденин) в структурном гене. Единственное изменение основания вызывает изменение аминокислоты (глутаминовой кислоты на глицин) в зрелом белке и устраняет токсические свойства дифтерийного токсина. CRM₁₉₇ белок представляет собой безопасный и эффективный Т-клеточный зависимый носитель для сахаридов. Более подробная информация о CRM₁₉₇ и его получении может быть найдена, например, в патенте США №5,614,382.

В одном варианте осуществления, капсульные сахариды согласно изобретению являются конъюгированными с CRM₁₉₇ белком или А-цепью CRM₁₉₇ (смотри CN 103495161). В одном варианте осуществления, капсульные сахариды согласно изобретению являются конъюгированными с А-цепью CRM₁₉₇, полученной за счет экспрессии с помощью генетически рекомбинантной Е. coli (смотри CN 103495161). В одном варианте осуществления, все капсульные сахариды согласно изобретению являются конъюгированными с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, все капсульные сахариды согласно изобретению являются конъюгированными с А-цепью CRM₁₉₇.

Соответственно, в многочисленных вариантах осуществления, гликоконъюгаты согласно изобретению содержат CRM₁₉₇ в качестве белка-носителя, причем капсульный полисахарид ковалентно связан с CRM₁₉₇.

1.2. Капсульный сахарид согласно изобретению

Термин «сахарид» по всему данному описанию может обозначать полисахарид или олигосахарид и включает оба понятия. В многочисленных вариантах осуществления, сахарид представляет собой полисахарид, в частности капсульный полисахарид S. Pneumoniae.

Капсульные полисахариды получают согласно стандартным методикам, известным квалифицированным специалистам в данной области. В представленном изобретении, капсульные полисахариды можно получать, например, из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11 A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F. Как правило, капсульные полисахариды получают путем выращивания каждого серотипа S. pneumoniae в среде (например, в среде на основе сои), полисахариды затем получают из культуры бактерий. Бактериальные штаммы S. Pneumoniae, которые применяют для получения соответствующих полисахаридов, которые применяют в гликоконъюгатах согласно изобретению, могут быть получены из официальных коллекций культур или клинических образцов.

Зачастую популяцию организма (каждый серотип S. pneumoniae) увеличивают от размера виалы для выращивания посевного материала до колб для выращивания посевного материала и пропускают через один или более ферментеров для выращивания посевного материала до достижения объема ферментации промышленного масштаба. В конце цикла роста клетки лизируют, и затем бульон лизата собирают для последующей обработки (очистки) (смотри, например, WO 2006/110381, WO 2008/118752, и публикации заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2008/0102498 и 2008/0286838). Индивидуальные полисахариды, как правило, очищают, применяя центрифугирование, осаждение, ультрафильтрацию и/или колоночную хроматографию (смотри, например, WO 2006/110352 и WO 2008/118752). Очищенные полисахариды могут быть активированы (например, химически активированы) для того, чтобы сделать их способными вступать в реакцию (например, со спейсером еТЕС), и чтобы затем их можно было вводить в состав гликоконъюгатов согласно изобретению, как далее описано в данном документе. Капсульные полисахариды S. pneumoniae содержат повторяющиеся олигосахаридные фрагменты, которые могут содержать вплоть до 8 остатков сахаров.

В одном варианте осуществления, капсульный сахарид согласно изобретению может представлять собой один олигосахаридный фрагмент или он может быть короче, чем длина нативной цепи сахарида из повторяющихся олигосахаридных фргаментов. В одном варианте осуществления, капсульный сахарид согласно изобретению представляет собой один повторяющийся олигосахаридный фрагмент соответствующего серотипа.

В одном варианте осуществления, капсульный сахарид согласно изобретению может представлять собой олигосахарид. Олигосахариды содержат небольшое количество повторяющихся фрагментов (как правило, 5-15 повторяющихся фрагментов) и, как правило, их получают синтетически или путем гидролиза полисахаридов.

Однако, предпочтительно, все капсульные сахариды согласно представленному изобретению и все капсульные сахариды, входящие в состав иммуногенной композиции согласно представленному изобретению, представляют собой полисахариды. Капсульные полисахариды с высокой молекулярной массой способны индуцировать определенные иммунные ответы, осуществляемые посредством антител, благодаря эпитопам, присутствующим на поверхности антигена. Выделение и очистку капсульных полисахаридов с высокой молекулярной массой предпочтительно рассматривают для применения в конъюгатах, композициях и способах согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 4000 кДа. В других таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 4000 кДа. В дополнительных таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 3 500 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа; от 50 кДа до 2 500 кДа; от 50 кДа до 2000 кДа; от 50 кДа до 1 750 кДа; от 50 кДа до 1 500 кДа; от 50 кДа до 1 250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 4000 кДа; от 100 кДа до 3 500 кДа; от 100 кДа до 3000 кДа; от 100 кДа до 2 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1 750 кДа; от 100 кДа до 1 500 кДа; от 100 кДа до 1 250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 4000 кДа; от 200 кДа до 3 500 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1 750 кДа; от 200 кДа до 1 500 кДа; от 200 кДа до 1 250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше.

Полисахарид может немного уменьшиться в размере в ходе общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, перед конъюгированием полисахарид может быть подвергнут процедурам оптимизации размера. Оптимизацию размера можно проводить с помощью механической или химической обработки. Химический гидролиз можно проводить с применением уксусной кислоты. В качестве механической оптимизации размера можно применять фрагментирование за счет гомогенизации под высоким давлением. Диапазоны молекулярных масс, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией). В предпочтительном варианте осуществления очищенные полисахариды представляют собой капсульные полисахариды S. pneumoniae серотипов 1,3,4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F или 33F, где капсульный полисахарид имеет молекулярную массу, которая попадает в пределы одного из диапазонов молекулярных масс, как описано в данном документе выше.

Как использовано в данном документе, термин «молекулярная масса» полисахарида или конъюгата белок-носитель - полисахарид означает молекулярную массу, рассчитанную с применением гель-проникающей хроматографии (SEC) в сочетании с детектором многоуглового рассеяния лазерного излучения (MALLS).

В некоторых вариантах осуществления, пневмококковые сахариды из серотипов 9V, 18С, 11А, 15В, 22F и/или 33F согласно изобретению являются О-ацетилированными. В некоторых вариантах осуществления, пневмококковые сахариды серотипов 9V, 11А, 15В, 22F и/или 33F согласно изобретению являются О-ацетилированными.

Очищенные полисахариды, описанные в данном документе, химически активируют для того, чтобы обеспечить возможность их взаимодействия с белком-носителем. Пневмококковые конъюгаты получают в рамках отдельных процессов и обеспечивают препарат в виде единого дозированного состава, как описано ниже.

1.2.1. Пневмококковые полисахариды S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F

Капсульные сахариды S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F можно получать по стандартным методикам, известным квалифицированным специалистам в данной области (смотри, например, WO 2006/110381). Капсульные полисахариды могут быть получены путем выращивания каждого S. pneumoniae серотипа в среде; в конце цикла роста клетки лизируют и бульон лизата затем собирают для последующей обработки (очистки). Индивидуальные полисахариды, как правило, очищают, применяя центрифугирование, осаждение, ультрафильтрацию, и/или колоночную хроматографию (смотри, например, WO 2006/110352 и WO 2008/118752). Очищенные полисахариды, кроме того, могут дополнительно подвергать обработке, как описано в данном документе, чтобы получить гликоконъюгаты согласно изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и/или 23F перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 4000 кДа. В других таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 4000 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа или от 50 кДа до 2000 кДа. В дополнительных таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 3 500 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа; от 50 кДа до 2 500 кДа; от 50 кДа до 2000 кДа; 50 кДа до 1 750 кДа; от 50 кДа до 1 500 кДа; от 50 кДа до 1 250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 4000 кДа; от 100 кДа до 3 500 кДа; от 100 кДа до 3000 кДа; от 100 кДа до 2 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1 750 кДа; от 100 кДа до 1 500 кДа; от 100 кДа до 1 250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 4000 кДа; от 200 кДа до 3 500 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1 750 кДа; от 200 кДа до 1 500 кДа; от 200 кДа до 1 250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше.

Полисахарид может немного уменьшиться в размере в ходе общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, полисахарид может быть подвергнут процедурам оптимизации размера перед конъюгированием. Диапазоны молекулярных масс, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после необязательной стадии оптимизации размера. В некоторых вариантах осуществления, пневмококковые сахариды серотипов 9V и/или 18С согласно изобретению являются О-ацетилированными. В некоторых вариантах осуществления, пневмококковый сахарид серотипа 9V согласно изобретению является О-ацетилированным, и пневмококковый сахарид серотипа 18С согласно изобретению является де-О-ацетилированным.

1.2.2 Пневмококковый полисахарид серотипа 8

Повторяющийся фрагмент полисахарида серотипа 8 состоит из линейного тетрасахаридного фрагмента, состоящего из одной молекулы глюкуроновой кислоты (Glc_pA), двух молекул глюкопиранозы (Glc_p) и одной молекулы галактопиранозы (Gal_p) (Jones et al., (1957) The Journal of the American Chemical Society. 79(11):2787-2793). Все четыре моносахарида связаны посредством 1,4-связей как показано на Фигуре 1. Сахариды серотипа 8 могут быть получены непосредственно из бактерий с применением процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Кроме того, они могут быть получены с применением синтетических протоколов.

Штаммы S. pneumoniae серотипа 8 могут быть получены из официальных коллекций культур (таких как, например, Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)) или клинических образцов. В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды S. pneumoniae серотипа 8 перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 600; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа; и подобные диапазоны желаемых молекулярных масс. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше.

Полисахарид может немного уменьшиться в размере во время общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, полисахарид может быть подвергнут процедурам оптимизации размера перед конъюгированием. Диапазоны молекулярной массы, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после необязательной стадии оптимизации размера.

1.2.3 Пневмококковый полисахарид серотипа 10А

Повторяющийся фрагмент полисахарида серотипа 10А состоит из разветвленного гексасахаридного повторяющегося фрагмента, состоящего из двух молекул галактофуранозы (Gal_f), трех молекул галактопиранозы (Gal_p), одной молекулы N-ацетил галактоза ми на (Gal_pNAc) и фосфорибитола, входящего в остов полисахарида (Jones, С.(2005) Carbohydrate Research 269(1):175-181). В фрагменте (3-Gal_pNAc находится два разветвленных моносахарида (β-3-Gal_p и β-6-Gal_f), как показано на Фигуре 2.

Сахариды серотипа 10А могут быть получены непосредственно из бактерий с применением процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Кроме того, они могут быть получены с применением синтетических протоколов.

Штаммы S. pneumoniae серотипа 10А могут быть получены из официальных коллекций культур (таких как, например, Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)) или клинических образцов. В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды S. pneumoniae серотипа 10А перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа; и подобные диапазоны желаемых молекулярных масс. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше. Полисахарид может немного уменьшиться в размере в ходе общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, полисахарид может быть подвергнут процедурам оптимизации размера перед конъюгированием. Диапазоны молекулярных масс, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после необязательной стадии оптимизации размера.

1.2.4 Пневмококковый полисахарид серотипа 11А

Повторяющийся фрагмент полисахарида серотипа 11А состоит из линейного тетрасахаридного скелета (двух молекул галактопиранозы (Gal_p) и двух молекул глюкопиранозы (Glc_p)) и бокового фосфоглицерина (Richards et al. (1988) Adv. Exp.Med. Biol. 228:595-597) как показано на Фигуре 3. Полисахарид является О-ацетилированным в нескольких местах и, на основании представленных данных, описанных в литературе (Calix et al., (2011) J Bacteriol. 193(19):5271-5278), общее количество О-ацетилирований в полисахариде серотипа 11А составляет около 2,6 О-ацетильных групп на полисахаридный повторяющийся фрагмент. Сахариды серотипа 11А могут быть получены непосредственно из бактерий с применением процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Кроме того, они могут быть получены с применением синтетических протоколов.

Штаммы S. pneumoniae серотипа 11А могут быть получены из официальных коллекций культур (таких как, например, Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)) или клинических образцов. Выделенный капсульный полисахарид серотипа 11А, полученный путем очистки полисахарида серотипа 11А из лизата S. pneumoniae и необязательно оптимизации размера очищеного полисахарида, может быть охарактеризован с помощью различных параметров, включая, например, молекулярную массу (M_w) и мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 11 А. В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды S. pneumoniae серотипа 11А перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 100 кДа до 200 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 200 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа; и подобные диапазоны желаемых молекулярных масс. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше. Полисахарид может немного уменьшиться в размере в ходе общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, полисахарид может быть подвергнут процедурам оптимизации размера перед конъюгированием. Диапазоны молекулярных масс, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после необязательной стадии оптимизации размера. В одном варианте осуществления, размер очищенного полисахарида серотипа 11А уменьшают при гомогенизации под высоким давлением. Гомогенизация под высоким давлением обеспечивает высокие скорости сдвига за счет прокачивания насосом технологического потока через проточный канал с достаточно малыми размерами. Скорость сдвига увеличивают за счет повышения приложенного давления гомогенизации, и время выдержки может быть увеличено путем рециркуляции потока сырья через гомогенизатор.

Процесс гомогенизации под высоким давлением является особенно подходящим для уменьшения размера очищенного полисахарида серотипа 11А при сохранении структурных особенностей полисахарида, таких как присутствие О-ацетильных групп.

Присутствие О-ацетила в очищенном, выделенном или активированном капсульном полисахариде серотипа 11А или в конъюгате «полисахарид серотипа 11А - белок-носитель» выражают как количество ацетата в мМ на мМ указанного полисахарида, или как количество О-ацетильных групп на повторяющийся фрагмент полисахарида.

В предпочтительном варианте осуществления, очищенные полисахариды S. Pneumoniae серотипа 11А содержат по меньшей мере 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 или 1,6 мкмоль ацетата на мкмоль указанного капсульного полисахарида серотипа 11А.

1.2.5 Пневмококковый полисахарид серотипа 12F

Повторяющийся фрагмент полисахарида серотипа 12F состоит из линейного трисахаридного скелета (одной молекулы N-ацетилфукозамина (FucpNAc), одной молекулы N-ацетил галактозами на (Gal_pNAc), одной молекулы N-ацетилманнуроновой кислоты (ManpNAcA)) с двумя ответвлениями: боковой α-галактопиранозой (Gal_p), связанной с фрагментом FucpNAc в положении СЗ, и а-Glc_p-(1→2)-α-Glc_p дисахаридной ветвью, связанной с фрагментом ManpNAcA в положении СЗ (Leontein et al., (1983) Carbohydrate Researchl 14(2):257-266), как показано на Фигуре 4.

Штаммы Streptococcus pneumoniae серотипа 12F могут быть получены из официальных коллекций культур (таких как, например, Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)) или клинических образцов.

Капсульные сахариды S. pneumoniae серотипа 12F получают по стандартным методикам, известным квалифицированным специалистам в данной области. Как правило, капсульные полисахариды получают путем выращивания каждого серотипа S. pneumoniae в среде (например, в среде на основе сои), затем полисахариды получают из культуры бактерий. Зачастую объем популяции организма (S. pneumoniae серотип 12F) увеличивают от размера виалы для выращивания посевного материала до колб для выращивания посевного материала и пропускают через один или более ферментеров для выращивания посевного материала до достижения объема ферментации промышленного масштаба. В конце цикла роста клетки лизируют, и затем бульон лизата собирают для последующей обработки (очистки) (смотри, например, WO 2006/110381 и WO 2008/118752, публикации заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2008/0102498 и US 2008/0286838). Полисахариды, как правило, очищают с применением центрифугирования, осаждения, ультрафильтрации и/или колоночной хроматографии (смотри, например, WO 2006/110352 и WO 2008/118752).

Очищенные полисахариды серотипа 12F могут быть активированы (например, химически активированы), чтобы сделать их реакцинноспособными, и чтобы затем их можно было вводить в состав гликоконъюгатов согласно изобретению, как далее описано в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды S. pneumoniae серотипа 12F перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 300 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 300 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 90 кДа до 250 кДа; от 90 кДа до 150 кДа; от 90 кДа до 120 кДа; от 80 кДа до 120 кДа; от 70 кДа до 100 кДа; от 70 кДа до 110 кДа; от 70 кДа до 120 кДа; от 70 кДа до 130 кДа; от 70 кДа до 140 кДа; от 70 кДа до 150 кДа; от 70 кДа до 160 кДа; от 80 кДа до 110 кДа; от 80 кДа до 120 кДа; от 80 кДа до 130 кДа; от 80 кДа до 140 кДа; от 80 кДа до 150 кДа; от 80 кДа до 160 кДа; от 90 кДа до 110 кДа; от 90 кДа до 120 кДа; от 90 кДа до 130 кДа; от 90 кДа до 140 кДа; от 90 кДа до 150 кДа; от 90 кДа до 160 кДа; от 100 кДа до 120 кДа; от 100 кДа до 130 кДа; от 100 кДа до 140 кДа; от 100 кДа до 150 кДа; от 100 кДа до 160 кДа; и подобные диапазоны желаемых молекулярных масс.В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше.

Полисахарид может немного уменьшиться в размере в ходе общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, полисахарид может быть подвергнут процедурам оптимизации размера перед конъюгированием. Диапазоны молекулярных масс, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после необязательной стадии оптимизации размера.

1.2.6 Пневмококковый полисахарид серотипа 15В

Как показано на Фигуре 5, повторяющийся фргамент полисахарида серотипа 15В состоит из разветвленного трисахаридного скелета (одной молекулы N-ацетилглюкозамина (Glc_pNAc), одной молекулы галактопиранозы (Gal_p) и одной молекулы глюкопиранозы (Glc_p)) с дисахаридным ответвлением αGal_p-(3Gal_p, связанным с гидроксильной группой Glc_pNAc в положении С4. Фосфоглицерин связан с гидроксильной группой остатка βGal_p в дисахаридной ветви в положении С3 (Jones et al., (2005) Carbohydrate Research 340(3):403-409). Структура основной цепи капсульного полисахарида серотипа 15С идентична структуре основной цепи полисахарида серотипа 15В, но не содержит О-ацетилирование.

Полисахариды серотипа 15В могут быть получены непосредственно из бактерий с применением процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Они также могут быть получены с применением синтетических протоколов, известных квалифицированному специалисту в данной области.

Штаммы S. pneumoniae серотипа 15В могут быть получены из официальных коллекций культур (таких как, например, American Type Culture Collection (АТСС, Manassas, VA USA) (например, депонированный штамм №АТСС10354) или Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA USA)) или из клинических образцов.

Бактериальные клетки выращивают в среде, предпочтительно в среде на основе сои. После ферментации бактериальных клеток, которые продуцируют капсульные полисахариды S. pneumoniae серотипа 15В, бактериальные клетки лизируют, чтобы получить клеточный лизат. Полисахарид серотипа 15В затем можно выделять из клеточного лизата с применением методов очистки, известных в данной области, включая центрифугирование, глубинную фильтрацию, осаждение, ультрафильтрацию, обработку активированным углем, диафильтрацию и/или колоночную хроматографию (смотри, например, публикации заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Очищенный капсульный полисахарид серотипа 15В затем можно применять для получения иммуногенных конъюгатов.

Выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В, полученный путем очистки полисахарида серотипа 15В из лизата S. pneumoniae и, необязательно, оптимизации размера очищенного полисахарида, может быть охарактеризован с помощью различных параметров, включая, например, молекулярную массу (M_w), количество ацетата в мМ на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и количество глицерина в мМ на 1 мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

Предпочтительно, для получения 15В конъюгатов с преимущественными характеристиками фильтруемости и/или выходами, перед конъюгированием с белком-носителем проводят оптимизацию размера полисахарида для получения полисахарида с молекулярной массой в желаемом диапазоне. Преимущественно, размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшают при сохранении значимых структурных особенностей полисахарида, таких как, например, присутствие О-ацетильных групп. Предпочтительно, размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшают с применением механической гомогенизации.

В предпочтительном варианте осуществления, размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшают с применением гомогенизации под высоким давлением. Гомогенизация под высоким давлением обеспечивает высокие скорости сдвига за счет прокачивания насосом технологического потока через проточный канал с достаточно малыми размерами. Скорость сдвига увеличивают за счет повышения приложенного давления гомогенизации, и время выдержки может быть увеличено путем рециркуляции потока сырья через гомогенизатор.

Процесс гомогенизации под высоким давлением является особенно подходящим для уменьшения размера очищенного полисахарида серотипа 15В при сохранении структурных особенностей полисахарида, таких как присутствие О-ацетильных групп.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 5 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 450кДа, от 100 кДа до 400кДа, и от 100 кДа до 350 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350кДа. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 300 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 300 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150кДа до 350кДа. В дополнительных вариантах осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 100 кДа до 200 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 200 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; и подобные диапазоны желаемых молекулярных масс. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше.

Полисахарид серотипа 15В является О-ацетилированным и общее количество О-ацетилирований составляет около 0,8-0,9 О-ацетильных групп на повторяющийся фрагмент полисахарида. Степень О-ацетилирования полисахарида может быть определена с применением любого способа, известного в данной области, например, с применением протонного ЯМР (смотри, например, Lemercinier et al. (1996) Carbohydrate Research 296:83-96; Jones et al. (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30:1233-1247; WO 2005/033148 и WO 00/56357). Другой часто применяемый способ описан в Hestrin, S. (1949) J. Biol. Chem. 180:249-261. Предпочтительно, присутствие О-ацетильных групп определяют с применением анализа методом ионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Присутствие О-ацетила в очищенном, выделенном или активированном капсульном полисахариде серотипа 15В или в конъюгате полисахарид серотипа 15В - белок-носитель выражают как количество мМ ацетата на мМ указанного полисахарида или как количество О-ацетильных групп на повторяющийся фрагмент полисахарида.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. Присутствие глицерофосфатных боковых цепей определяют путем измерения содержания глицерина с применением высокоэффективной анионно-обменной хроматографии с импульсным амперометрическим обнаружением (HPAEC-PAD) после его высвобождения при обработке полисахарида плавиковой кислотой (HF). Присутствие глицерина в очищенном, выделенном или активированном полисахариде серотипа 15В или в конъюгате полисахарид серотипа 15В-белок-носитель выражают как количество глицерина в мМ на мМ полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15 В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,7 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15 В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15 В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15 В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 300 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 300 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 350 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 350 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15 В и по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 300 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 350 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

1.2.7 Пневмококковый полисахарид серотипа 22F

Как показано на Фигуре 6, повторяющийся фрагмент полисахарида серотипа 22F состоит из разветвленного пентасахаридного скелета (одной молекулы глюкуроновой кислоты (Gle_pA), одной молекулы глюкопиранозы (Glc_p), одной молекулы галактофуранозы (Gal_f) и двух молекул рамнопиранозы (Rha_p)) с αGlc_p ветвью, связанной с гидроксильной группой βRha_p в положении С3 (Richards et al. (1989) Canadian Journal of Chemistry 67(6):1038-1050). Около 80% гидроксильных групп остатка βRha_p в положении С2 в повторяющемся фрагменте полисахарида, являются О-ацетилированными.

Полисахариды серотипа 22F могут быть получены непосредственно из бактерий с применением процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Кроме того, они могут быть получены с применением синтетических протоколов.

Штаммы S. pneumoniae серотипа 22F могут быть получены из официальных коллекций культур (таких как, например, Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)) или клинических образцов. Выделенный капсульный полисахарид серотипа 22F, полученный путем очистки полисахарида серотипа 22F из лизата S. pneumoniae и, необязательно, оптимизации размера очищенного полисахарида, может быть охарактеризован с помощью различных параметров, включая, например, молекулярную массу (M_w) и количество ацетата в мМ на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 22F.

Предпочтительно, для получения 22F конъюгатов с преимущественными характеристиками фильтруемости и/или выходами, перед конъюгированием с белком-носителем проводят оптимизацию размера полисахарида для получения полисахарида с молекулярной массой в желаемом диапазоне. Преимущественно, размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшают при сохранении значимых структурных особенностей полисахарида, таких как, например, присутствие O-ацетильных групп. Предпочтительно, размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшают с применением механической гомогенизации.

В предпочтительном варианте осуществления, размер очищенного полисахарида уменьшают с применением гомогенизации под высоким давлением. Гомогенизация под высоким давлением обеспечивает высокие скорости сдвига за счет прокачивания насосом технологического потока через проточный канал с достаточно малыми размерами. Скорость сдвига увеличивают за счет повышения приложенного давления гомогенизации, и время выдержки может быть увеличено путем рециркуляции потока сырья через гомогенизатор.

Процесс гомогенизации под высоким давлением является особенно подходящим для уменьшения размера очищенного полисахарида серотипа 22F при сохранении структурных особенностей полисахарида, таких как присутствие O-ацетильных групп.

В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды S. pneumoniae серотипа 22F перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 200 кДа до 600 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 400 кДа до 700 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 900 кДа; от 100 кДа до 800 кДа; от 100 кДа до 700 кДа; от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 1000 кДа; от 150 кДа до 900 кДа; от 150 кДа до 800 кДа; от 150 кДа до 700 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 900 кДа; от 200 кДа до 800 кДа; от 200 кДа до 700 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 300 кДа; от 250 кДа до 1000 кДа; от 250 кДа до 900 кДа; от 250 кДа до 800 кДа; от 250 кДа до 700 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 1000 кДа; от 300 кДа до 900 кДа; от 300 кДа до 800 кДа; от 300 кДа до 700 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 1000 кДа; от 400 кДа до 900 кДа; от 400 кДа до 800 кДа; от 400 кДа до 700 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа; и подобные диапазоны желаемых молекулярных масс. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше.

Полисахарид может немного уменьшиться в размере в ходе общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано выше в данном документе, полисахарид 22F может быть подвергнут процедурам оптимизации размера перед конъюгированием. Диапазоны молекулярной массы, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после необязательной стадии оптимизации размера.

Степень O-ацетилирования полисахарида можно определить с применением любого способа, известного в данной области, например, с применением протонного ЯМР (Lemercinier et al., (1996) Carbohydrate Research 296:83-96; Jones et al., (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30:1233-1247; WO 2005/033148 и WO 00/56357). Другой часто используемый способ описан в Hestrin, S. (1949) J. Biol. Chem. 180:249-261. Предпочтительно, присутствие O-ацетильных групп определяют с применением анализа методом ионной ВЭЖХ.

Присутствие O-ацетильных групп в очищенном, выделенном или активированном капсульном полисахариде серотипа 22F или в конъюгате полисахарид серотипа 22F - белок-носитель выражают как количество ацетата в мМ на мМ указанного полисахарида или как количество O-ацетильных групп на повторяющийся фрагмент полисахарида.

В предпочтительном варианте осуществления, очищенные полисахариды S. pneumoniae серотипа 22F содержат по меньшей мере 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,2, 1,4 или 1,6, мкмоль ацетата на мкмоль указанного капсульного полисахарида серотипа 22F.

1.2.8 Пневмококковый полисахарид серотипа 33F

Как показано на Фигуре 7, повторяющийся фрагмент полисахарида серотипа 33F состоит из разветвленного пентасахаридного скелета (двух молекул галактопиранозы (Gal_p), двух молекул галактофуранозы (Gal_f) и одной молекулы глюкопиранозы (Glc_p) с терминальной группой αGal_p, связанной с гидроксильной группой остатка αGal_p в положении С2 внутри скелета (Lemercinier et al., (2006) Carbohydrate Research 341(1): 68-74.). В литературе сообщалось, что гидроксильная группа в положении С2 остатка 3-β-Gal_f, входящего в остов полисахарида, является O-ацетилированной.

Полисахариды серотипа 33F могут быть получены непосредственно из бактерий с применением процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Кроме того, они могут быть получены с применением синтетических протоколов.

Штаммы S. pneumoniae серотипа 33F могут быть получены из официальных коллекций культур (таких как, например, Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)) или клинических образцов. Очищенные полисахариды серотипа 33F могут быть активированы (например, химически активированы), чтобы сделать их реакционноспособными, и чтобы затем их можно было вводить в состав гликоконъюгатов согласно изобретению, как далее описано в данном документе.

Выделенный капсульный полисахарид серотипа 33F, полученный путем очистки полисахарида серотипа 33F из лизата S. pneumoniae и, необязательно, оптимизации размера очищенного полисахарида, может быть охарактеризован с помощью различных параметров, включая, например, молекулярную массу и количество ацетата в мМ на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 33F.

В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды S. pneumoniae серотипа 33F перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В дополнительных таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше.

Полисахарид может немного уменьшиться в размере в ходе общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, перед конъюгированием полисахарид может быть подвергнут процедурам оптимизации размера. Диапазоны молекулярных масс, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после необязательной стадии оптимизации размера.

Присутствие O-ацетила в очищенном, выделенном или активированном капсульном полисахариде серотипа 33F или в конъюгате полисахарид серотипа 33F - белок-носитель выражают как количество ацетата в мМ на мМ указанного полисахарида или как количество O-ацетильных групп на повторяющийся фрагмент полисахарида.

В предпочтительном варианте осуществления, очищенные полисахариды S. pneumoniae серотипа 33F содержат по меньшей мере 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 или 1,6, мкмоль ацетата на мкмоль указанного капсульного полисахарида серотипа 33F.

1.3. Гликоконъюгаты согласно изобретению

Очищенные сахариды химически активируют для того, чтобы сделать их (то есть активированные сахариды) способными реагировать с белком-носителем. После активации каждый капсульный сахарид независимо конъюгируют с белком-носителем для того, чтобы получить гликоконъюгат. В одном варианте осуществления, каждый капсульный сахарид является конъюгированным с одним и тем же белком-носителем. Химическая активация сахаридов и последующая конъюгация с белком-носителем могут быть достигнуты с применением способов активации и конъюгирования, раскрытых в данном документе.

1.3.1. Гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F

Капсульные полисахариды S. Pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F получают по стандартным методикам, известным квалифицированным специалистам в данной области (см., например, WO 2006/110381, WO 2008/118752, WO 2006/110352, и публикации заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2008/0102498 и 2008/0286838). В одном варианте осуществления, полисахариды активируют тетра фтор боратом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Затем активированный полисахарид присоединяют непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу к аминогруппе белка-носителя (предпочтительно CRM₁₉₇). Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, давая тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю через тиоэфирную связь, полученную за счет реакции с малеимид-активированным белком-носителем (например, N-[γ-малеимидобутирилокси]сукцинимидным сложным эфиром (GMBS)) или галогенацетилированным белком-носителем (например, йодацетамидом, N-сукцинимидил бромацетатом (SBA; SIB), N-сукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоатом (SIAB), сульфосукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоатом (сульфо-SIAB), N-сукцинимидил йодацетатом (SIA) или сукцинимидил 3-[бромацетамидо]пропионатом (SBAP)). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно, полученный с применением CDAP) соединяют с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) с применением карбодиимида (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы белкового носителя. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других подходящих способах конъюгации применяют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгирование может задействовать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с 1,1'-карбонилдиимидазолом (CDI) (смотри, Bethell et al., (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al., (1981) J. Chromatogr. 218:509-518) с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. При этом может происходить восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой белка.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере один из капсульных полисахаридов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F конъюгируют с белком-носителем посредством восстановительного аминирования (такого как описано в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380,2007/0231340, 2007/0184071 и 2007/0184072, WO 2006/110381, WO 2008/079653, и WO 2008/143709). В предпочтительном варианте осуществления, все капсульные полисахариды S. Pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F являются конъюгированными с белком-носителем посредством восстановительного аминирования.

Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида, (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата. Перед окислением полисахарид необязательно гидролизуют. Можно применять механический или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с применением уксусной кислоты. Стадия окисления может включать реакцию с периодатом. В контексте настоящего изобретения, термин "периодат" включает как периодат, так и йодную кислоту; указанный термин также включает как метаиодат (IO₄^-), так и ортоиодат (IO₆^5-) и различные периодаты (например, натрия периодат и калия периодат).

В одном варианте осуществления капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F или 23F окисляют в присутствии метаиодата, предпочтительно в присутствии натрия периодата (NaIO₄). В другом варианте осуществления капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F окисляют в присутствии ортоиодата, предпочтительно в присутствии йодной кислоты.

После стадии окисления полисахарида, полисахарид считают активированным и в данном документе ниже он назван как «активированный полисахарид». Активированный полисахарид и белок-носитель могут быть лиофилизированными (сублимационная сушка) либо независимо друг от друга (отдельная лиофилизация), либо совместно (совместная лиофилизация). В одном варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель являются совместно лиофилизированными. В другом варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель являются лиофилизированными независимо друг от друга.

В одном варианте осуществления лиофилизация происходит в присутствии невосстанавливающего сахара, пригодные невосстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, рафинозу, стахиозу, мелецитозу, декстран, маннит, лактит и палатинит.

Вторая стадия процесса конъюгации представляет собой восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (так называемое восстановительное аминирование) с применением восстанавливающего агента. Восстанавливающие агенты, которые являются приемлемыми, включают цианоборгидриды, такие как натрия цианоборгидрид, боран-пиридин, или боргидрид-обменная смола. В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид.

В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в водном растворителе, в другом варианте осуществления реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в растворителях ДМСО (диметилсульфоксид) или в ДМФ (диметилформамид). Растворители ДМСО или ДМФ можно применять для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, который был лиофилизирован.

По окончании реакции восстановления в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, которые могут быть блокированы приемлемым блокирующим агентом. В одном варианте осуществления данный блокирующий агент представляет собой натрия боргидрид (NaBH₄). После конъюгирования (реакции восстановления и необязательно блокирования), гликоконъюгаты могут быть очищены. Гликоконъюгаты могут быть очищены посредством диафильтрации и/или ионно-обменной хроматографии и/или гель-проникающей хроматографии. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты очищают с применением диафильтрации, или ионно-обменной хроматографии, или гель-проникающей хроматографии. В одном варианте осуществления гликоконъюгаты подвергают стерильной фильтрации.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипов 9V и/или 18С содержит сахарид, который имеет степень O-ацетилирования от 10% до 100%, от 20% до 100%, от 30% до 100%, от 40% до 100%, от 50% до 100%, от 60% до 100%, от 70% до 100%, от 75% до 100%, от 80% до 100%, от 90% до 100%, от 50% до 90%, от 60% до 90%, от 70% до 90% или от 80% до 90%. В других вариантах осуществления, степень O-ацетилирования составляет >10%, >20%, >30%, >40%, >50%, >60%, >70%, >80%, или >90%, или около 100%.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипов 9V и/или 18С согласно изобретению являются O-ацетилированными. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 9V является O-ацетилированным, и гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 18С является де-O-ацетилированным.

1.3.2. Гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 22F

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 22F получают посредством активирования полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид может быть присоединен к аминогруппе белка-носителя непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, давая тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, образованной за счет реакции с белком-носителем, активированным малеимидом (например, GMBS), или галогенацетилированным белком-носителем (например, йодацетамидом, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с применением CDAP) соединяют с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с применением карбодиимида (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы белкового носителя. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других приемлемых способах применяют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислота, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгация может задействовать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри, Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al., (1981) J. Chromatogr. 218:509-518), с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. При этом может происходить восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения, и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой белка.

В предпочтительных вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 22F согласно изобретению получают применением восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида с образованием альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в индивидуальном гексасахаридном фрагменте, (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя (например, CRM₁₉₇) с образованием конъюгата.

Предпочтительно, перед окислением осуществляют оптимизацию размера полисахарида серотипа 22F для получения полисахарида с молекулярной массой (M_w) в желаемом диапазоне. Преимущественно, размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшают при сохранении значимых структурных особенностей полисахарида, таких как, например, присутствие O-ацетильных групп. Предпочтительно, размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшают, применяя механическую гомогенизацию (смотри раздел 1.2.7 выше).

В одном варианте осуществления, полисахарид серотипа 22F активируют (окисляют) согласно способу, включающему стадии:

(a) взаимодействия выделенного полисахарида серотипа 22F с окислительным агентом;

(b) гашения реакции окисления посредством добавления гасящего агента, что в результате приводит к получению активированного полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном варианте осуществления, окислительный агент представляет собой периодат.Для целей представленного изобретения, термин "периодат" включает как периодат, так и йодную кислоту; указанный термин также включает как метаиодат (IO₄^-), так и ортоиодат (IO₆^5-) и различные периодаты (например, натрия периодат и калия периодат). В предпочтительном варианте осуществления, окислительный агент представляет собой натрия периодат. В предпочтительном варианте осуществления, периодат, который применяют для окисления полисахарида серотипа 22F, представляет собой метаиодат. В предпочтительном варианте осуществления периодат, который применяют для окисления полисахарида серотипа 22F, представляет собой натрия метаиодат. В одном варианте осуществления, гасящий агент выбирают из вицинальных диолов, 1,2-аминоспиртов, аминокислот, глютатиона, сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или фосфористой кислоты.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой 1,2-аминоспирты формулы (I):

где R¹ выбирают из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В одном варианте осуществления, гасящий агент выбирают из солей натрия и калия - сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или солей фосфористой кислоты.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой аминокислоту. В таких вариантах осуществления, указанная аминокислота может быть выбрана из серина, треонина, цистеина, цистина, метионина, пролина, гидроксипролина, триптофана, тирозина и гистидина.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой сульфит, такой как бисульфат, дитионит, метабисульфит, тиосульфат.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой соединение, содержащее две вицинальные гидроксильные группы (вицинальный диол), то есть две гидроксильные группы, ковалентно связанные с двумя соседними атомами углерода.

Предпочтительно, гасящий агент представляет собой соединение формулы (II):

в котором каждый R¹ и R² независимо выбирают из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В предпочтительном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой глицерин, этиленгликоль, пропан-1,2-диол, бутан-1,2-диол, бутан-2,3-диол, или аскорбиновую кислоту. В предпочтительном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой бутан-2,3-диол.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный полисахарид серотипа 22F активируют согласно способу, включающему стадии:

(a) взаимодействия выделенного полисахарида серотипа 22F с периодатом;

(b) гашения реакции окисления посредством добавления бутан-2,3-диола, что в результате приводит к получению активированного полисахарида серотипа 22F.

После стадии окисления полисахарида, полисахарид, как указано ранее, считают активированным и в данном документе ниже он назван как «активированный полисахарид».

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F очищают. Активированный полисахарид серотипа 22F очищают в соответствии со способами, известными квалифицированному специалисту в данной области, такими как гель-проникающая хроматография (GPC), диализ или ультрафильтрация/диафильтрация. Например, активированный полисахарид 22F очищают путем концентрирования и диафильтрации с применением устройства для ультрафильтрации.

В предпочтительном варианте осуществления степень окисления активированного полисахарида серотипа 22F составляет от 2 до 30, от 2 до 25, от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 5, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 5 до 15, от 5 до 10, от 10 до 30, от 10 до 25, от 10 до 20, от 10 до 15, от 15 до 30, от 15 до 25, от 15 до 20, от 20 до 30, или от 20 до 25. В предпочтительном варианте осуществления степень окисления активированного полисахарида серотипа 22F составляет от 2 до 10, от 4 до 8, от 4 до 6, от 6 до 8, от 6 до 12, от 8 до 14, от 9 до 11, от 10 до 16, от 12 до 16, от 14 до 18, от 16 до 20, от 16 до 18, от 18 до 22, или от 18 до 20.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 25 кДа до 1000 кДа, от 100 кДа до 1000 кДа, от 300 кДа до 800 кДа, от 300 кДа до 700 кДа, от 300 кДа до 600 кДа, от 400 кДа до 1000 кДа, от 400 кДа до 800 кДа, от 400 кДа до 700 кДа или от 400 кДа до 600 кДа. В одном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 300 кДа до 800 кДа. В одном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 600 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 600 кДа, и степень окисления от 10 до 25, от 10 до 20, от 12 до 20 или от 14 до 18. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 600 кДа и степень окисления от 10 до 20.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7 или около 0,8 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 800 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 800 кДа, степень окисления от 12 до 20 и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

Активированный полисахарид и/или белок-носитель могут быть лиофилизированными (сублимационная сушка) либо независимо друг от друга (отдельная лиофилизация), либо совместно (совместная лиофилизация). В одном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F лиофилизируют необязательно в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелецитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид представляет собой сахарозу. В одном варианте осуществления, лиофилизированный активированный полисахарид затем смешивают с раствором, содержащим белок-носитель.

В другом варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют совместно. В таких вариантах осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F смешивают с белком-носителем и лиофилизируют необязательно в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелецитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид представляет собой сахарозу. Совместно лиофилизированные полисахарид и белок-носитель затем можно повторно суспендировать в растворе, и подвергать взаимодействию с восстанавливающим агентом.

Вторая стадия процесса конъюгирования представляет собой восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (восстановительное аминирование) с применением восстанавливающего агента. Активированный полисахарид серотипа 22F может быть конъюгированным с белком-носителем согласно способу, включающему стадии:

(c) смешивания активированного полисахарида серотипа 22F с белком-носителем; и

(d) взаимодействия смеси активированного полисахарида серотипа 22F и белка-носителя с восстанавливающим агентом с образованием конъюгата полисахарид серотипа 22F - белок-носитель.

В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в водном растворителе, в другом варианте осуществления реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в растворителях ДМСО (диметилсульфоксид) или в ДМФ (диметилформамид). Растворители ДМСО или ДМФ можно применять для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, который был лиофилизирован.

Конъюгирование активированного полисахарида серотипа 22F с белковым носителем посредством восстановительного аминирования в диметилсульфоксиде (ДМСО) приемлемо для сохранения содержания O-ацетила полисахарида в отличие от, например, восстановительного аминирования в водной фазе, где степень O-ацетилирования полисахарида может быть значительно уменьшена. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления, стадию (с) и стадию (d) осуществляют в ДМСО.

В одном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид, натрия триацетоксиборгидрид, натрия или цинка боргидрид в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, аминоборанов, таких как пиридин-боран, 2-пиколин-боран, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, t-BuMeⁱPrN-ВН₃, бензиламин-ВН₃ или 5-этил-2-метилпиридин-боран (РЕМВ). В предпочтительном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид.

По окончании реакции восстановления, в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, которые могут быть блокированы приемлемым блокирующим агентом. В одном варианте осуществления данный блокирующий агент представляет собой натрия боргидрид (NaBH₄).

После конъюгирования полисахарида серотипа 22F с белком-носителем, гликоконъюгат может быть очищен (обогащен по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок) с применением различных способов, известных квалифицированному специалисту. Данные способы включают диализ, операции концентрирования/диафильтрации, фильтрование тангенциальным потоком, осаждение/элюирование, колоночную хроматографию (DEAE или хроматографию с гидрофобным взаимодействием), и глубинную фильтрацию.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 22F согласно представленному изобретению содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 200 кДа до 600 кДа. В дополнительных таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 900 кДа; от 100 кДа до 800 кДа; от 100 кДа до 700 кДа; от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 1000 кДа; от 150 кДа до 900 кДа; от 150 кДа до 800 кДа; от 150 кДа до 700 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 900 кДа; от 200 кДа до 800 кДа; от 200 кДа до 700 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 300 кДа; от 250 кДа до 1000 кДа; от 250 кДа до 900 кДа; от 250 кДа до 800 кДа; от 250 кДа до 700 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 1000 кДа; от 300 кДа до 900 кДа; от 300 кДа до 800 кДа; от 300 кДа до 700 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 1000 кДа; от 400 кДа до 900 кДа; от 400 кДа до 800 кДа; от 400 кДа до 700 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 22F получают с применением восстановительного аминирования.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 22F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 400 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 3000 кДа до 8000 кДа; или от 3000 кДа до 5000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 22F имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 22F имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 22F имеет молекулярную массу от 2000 кДа до 8000 кДа или от 3000 кДа до 7000 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 22F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750 кДа до 12500 кДа; от 750 кДа до 10000 кДа; от 750 кДа до 7 500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 22F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа; от 3000 кДа до 10000 кДа; от 3000 кДа до 7500 кДа; от 3000 кДа до 5000 кДа; от 4000 кДа до 20000 кДа; от 4000 кДа до 15000 кДа; от 4000 кДа до 12500 кДа; от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа; или от 4000 кДа до 5000 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 22F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа; от 5000 кДа до 15000 кДа; от 5000 кДа до 10000 кДа; от 5000 кДа до 7500 кДа; от 6000 кДа до 20000 кДа; от 6000 кДа до 15000 кДа; от 6000 кДа до 12500 кДа; от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа.

Молекулярную массу гликоконъюгата измеряют, применяя гель-проникающую хроматографию в сочетании с детектором многоуглового рассеяния лазерного излучения (SEC-MALLS). В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 22F согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7 или около 0,8 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к количеству ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к количеству ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к количеству ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к количеству ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к количеству ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к количеству ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9.

Еще одной характеристикой гликоконъюгатов на основе серотипа 22F согласно изобретению является количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), конъюгированных с сахаридом, которое может быть выражено в виде диапазона количества конъюгированных лизиновых остатков (степень конъюгации). Замещение белка-носителя лизином за счет образования ковалентных связей между полисахаридом и лизином можно обнаружить с помощью аминокислотного анализа с применением стандартных способов, известных квалифицированному специалисту в данной области. Конъюгация в результате приводит к уменьшению количества лизиновых остатков по сравнению с их количеством в исходном белке CRM₁₉₇, который применяли для образования конъюгата. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 22F согласно изобретению составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 22F согласно изобретению составляет около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14 или около 15. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 22F согласно изобретению составляет от 4 до 7. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 22F согласно изобретению также могут быть охарактеризованы отношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В некоторых вариантах осуществления, отношение полисахарида серотипа 22F к белку-носителю в гликоконъюгате (масс./масс.) составляет от 0,5 до 3,0 (например, около 0,5, около 0,6, около 0,7, около 0,8, около 0,9, около 1,0, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8, около 1,9, около 2,0, около 2,1, около 2,2, около 2,3, около 2,4, около 2,5, около 2,6, около 2,7, около 2,8, около 2,9, или около 3,0). В других вариантах осуществления, отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,5 до 2,0, от 0,5 до 1,5, от 0,8 до 1,2, от 0,5 до 1,0, от 1,0 до 1,5 или от 1,0 до 2,0. В дополнительных вариантах осуществления, отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,2. В предпочтительном варианте осуществления, отношение капсульного полисахарида серотипа 22F к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,9 до 1,1. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 22F и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть, нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 22F содержит менее чем около 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% или 15% свободного полисахарида серотипа 22F относительно общего количества полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат на основе серотипа 22F содержит менее, чем около 40% свободного полисахарида серотипа 22F относительно общего количества полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат на основе серотипа 22F содержит менее чем около 25% свободного полисахарида серотипа 22F относительно общего количества полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат на основе серотипа 22F содержит менее чем около 20% свободного полисахарида серотипа 22F относительно общего количества полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат на основе серотипа 22F содержит менее чем около 15% свободного полисахарида серотипа 22F относительно общего количества полисахарида серотипа 22F.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 22F также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным размерам (K_d). Среда для гель-проникающей хроматографии (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным массам конъюгата. Для определения профиля распределения конъюгатов по размеру молекул применяют гель-проникающую хроматографию (SEC) в гравитационных колонках. Большие молекулы, не попадающие в поры наполнителя, элюируют быстрее, чем маленькие молекулы. Для сбора элюата из колонки применяют сборники для фракций. Фракции исследуют методом колориметрии с применением сахаридного анализа. Для определения K_d, колонки калибруют, чтобы установить фракцию, в которой молекулы совсем не удерживаются наполнителем (V₀), (K_d=0), и фракцию, в которой достигается максимальное удерживание молекул наполнителем (V_i), (K_d=1). Фракция, в которой достигается удерживание молекул образца (V_e), связана с K_d выражением K_d=(V_e-V₀)/(V_i-V₀).

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 30% гликоконъюгата на основе серотипа 22F имеет K_d , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 40% гликоконъюгата имеет K_d , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгата на основе серотипа 22F имеет K_d, , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 60% гликоконъюгата на основе серотипа 22F имеет K_d, , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 50% до 80% гликоконъюгата на основе серотипа 22F имеет K_d, , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 65% до 80% гликоконъюгата на основе серотипа 22F имеет K_d , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

1.3.3. Гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 33F

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 33F получают посредством активирования полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламино пиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид может быть присоединен непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу к аминогруппе на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, дающий тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, полученной в результате реакции с белком-носителем, активированным малеимидом (например, GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, йодацетамидом, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с применением CDAP) соединен с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с применением карбодиимида (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы белкового носителя. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других приемлемых способах применяют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгирование может задействовать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри Bethell et al., (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218:509-518), с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. При этом может происходить восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой белка.

В определенных вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 33F согласно изобретению получают с применением восстановительного аминирования. В таком варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 33F согласно изобретению могут быть получены с применением восстановительного аминирования в водной фазе (RAC/вода). Восстановительное аминирование в водной фазе успешно применяли для получения пневмококковой конъюгатной вакцины (смотрите, например, WO 2006/110381). Однако, предпочтительно при применении восстановительного аминирования, гликоконъюгаты на основе серотипа 33F получают посредством восстановительного аминирования в ДМСО (RAC/ДМСО). Восстановительное аминирование в ДМСО является предпочтительным с учетом проблемы, связанной с сохранением О-ацетильных функциональных групп при применении процесса RAC/вода. RAC/ДМСО успешно применяли для получения пневмококковой конъюгатной вакцины (смотрите, например, WO 2006/110381).

В предпочтительных вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 33F согласно изобретению получают с применением еТЕС конъюгации (далее в данном документе «еТЕС-связанные гликоконъюгаты на основе серотипа 33F»), как описано в Примерах 1, 2 и 3 и в WO 2014/027302. Указанные 33F гликоконъюгаты содержат сахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем с помощью одного или более еТЕС спейсеров, где сахарид является ковалентно конъюгированным с еТЕС спейсером посредством карбаматной связи, и где белок-носитель является ковалентно конъюгированным с еТЕС спейсером посредством амидной связи. еТЕС-связанные гликоконъюгаты согласно изобретению могут быть представлены общей формулой (III):

где атомы еТЕС спейсера заключены в центральную рамку.

еТЕС спейсер включает семь атомов, расположенных в линию (то есть -C(O)NH(CH₂)₂SCH₂C(O)-), и образует стабильные тиоэфирную и амидную связи с сахаридоми белком-носителем.

Синтез еТЕС-связанного гликоконъюгата включает взаимодействие активированной гидроксильной группы сахарида с аминогруппой тиоалкиламинного реагента, например, цистамина или цистеинамина, или их соли, образуя карбаматную связь с сахаридом, обеспечивая тиолированный сахарид. Образование одной или более свободных сульфгидрильных групп осуществляется в результате реакции с восстанавливающим агентом, обеспечивая активированный тиолированный сахарид. Реакция свободных сульфгидрильных групп активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем, имеющим одну или более α-галогенацетамидных групп на аминосодержащих остатках, формирует тиоэфирную связь с образованием конъюгата, где белок-носитель присоединен к еТЕС спейсеру посредством амидной связи.

В гликоконъюгатах на основе серотипа 33F согласно изобретению, сахарид может представлять собой полисахарид или олигосахарид. Белок-носитель может быть выбран из любого приемлемого носителя, как описано в данном документе, или известного квалифицированному специалисту в данной области. В многочисленных вариантах осуществления, сахарид представляет собой полисахарид. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых таких вариантах осуществления, еТЕС-связанный гликоконъюгат содержит капсульный полисахарид S. Pneumoniae серотипа 33F.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления, еТЕС-связанный гликоконъюгат содержит Pn-33F капсульный полисахарид, который является ковалентно конъюгированным с CRM₁₉₇ через еТЕС спейсер (еТЕС-связанные гликоконъюгаты на основе серотипа 33F).

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 33F согласно настоящему изобретению содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В дополнительных таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1 750 кДа; от 50 кДа до 1 500 кДа; от 50 кДа до 1 250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1 750 кДа; от 100 кДа до 1 500 кДа; от 100 кДа до 1 250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1 750 кДа; от 200 кДа до 1 500 кДа; от 200 кДа до 1 250 кДа; от 200 кДа до 1 000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 33F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 33F имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 33F имеет молекулярную массу от 200 кДа до 10000 кДа. В еще других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 33F имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 3000 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 33F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20 000 кДа; от 200 кДа до 15 000 кДа; от 200 кДа до 10 000 кДа; от 200 кДа до 7 500 кДа; от 200 кДа до 5 000 кДа; от 200 кДа до 3 000 кДа; от 200 кДа до 1 000 кДа; от 500 кДа до 20 000 кДа; от 500 кДа до 15 000 кДа; от 500 кДа до 12 500 кДа; от 500 кДа до 10 000 кДа; от 500 кДа до 7 500 кДа; от 500 кДа до 6 000 кДа; от 500 кДа до 5 000 кДа; от 500 кДа до 4 000 кДа; от 500 кДа до 3 000 кДа; от 500 кДа до 2 000 кДа; от 500 кДа до 1 500 кДа; от 500 кДа до 1 000 кДа; от 750 кДа до 20 000 кДа; от 750 кДа до 15 000 кДа; от 750 кДа до 12 500 кДа; от 750 кДа до 10 000 кДа; от 750 кДа до 7 500 кДа; от 750 кДа до 6 000 кДа; от 750 кДа до 5 000 кДа; от 750 кДа до 4 000 кДа; от 750 кДа до 3 000 кДа; от 750 кДа до 2 000 кДа; от 750 кДа до 1 500 кДа; от 1 000 кДа до 15 000 кДа; от 1 000 кДа до 12 500 кДа; от 1 000 кДа до 10 000 кДа; от 1 000 кДа до 7 500 кДа; от 1 000 кДа до 6 000 кДа; от 1 000 кДа до 5 000 кДа; от 1 000 кДа до 4 000 кДа; от 1 000 кДа до 2 500 кДа; от 2 000 кДа до 15 000 кДа; от 2 000 кДа до 12 500 кДа; от 2 000 кДа до 10 000 кДа; от 2 000 кДа до 7 500 кДа; от 2 000 кДа до 6 000 кДа; от 2 000 кДа до 5 000 кДа; от 2 000 кДа до 4 000 кДа; от 2 000 кДа до 3 000 кДа; от 3 000 кДа до 20 000 кДа; от 3 000 кДа до 15 000 кДа; от 3 000 кДа до 12 500 кДа; от 3 000 кДа до 10 000 кДа; от 3 000 кДа до 9 000 кДа; от 3 000 кДа до 8 000 кДа; от 3 000 кДа до 7 000 кДа; от 3 000 кДа до 6 000 кДа; от 3 000 кДа до 5 000 кДа или от 3 000 кДа до 4 000 кДа. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше.

Еще одной характеристикой гликоконъюгатов на основе серотипа 33F согласно изобретению является количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), конъюгированных с сахаридом, которое может быть выражено в виде диапазона количества конъюгированных лизиновых остатков (степень конъюгации).

В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 33F согласно изобретению составляет от 2 до 20, от 4 до 16, от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 33F согласно изобретению составляет около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19 или около 20. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 33F согласно изобретению составляет от 4 до 16. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇, который содержит 39 лизиновых остатков. В некоторых таких вариантах осуществления, от 4 до 16 лизиновых остатков из 39 лизиновых остатков, содержащихся в CRM₁₉₇, могут быть ковалентно связаны с сахаридом. Другой способ выразить данный параметр состоит в том, что от около 10% до около 41% лизиновых остатков CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом. В другом таком варианте осуществления, от 2 до 20 лизиновых остатков из 39 лизиновых остатков, содержащихся в CRM₁₉₇, могут быть ковалентно связаны с сахаридом. Другой способ выразить данный параметр состоит в том, что от около 5% до около 50% лизиновых остатков CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом. В некоторых вариантах осуществления, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, или около 16 лизиновых остатков из 39 лизиновых остатков, содержащихся в CRM₁₉₇, ковалентно связаны с сахаридом.

В многочисленных вариантах осуществления, белок-носитель является ковалентно конъюгированным с еТЕС спейсером посредством амидной связи с одной или более ε-аминогруппами лизиновых остатков на белке-носителе. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель содержит от 2 до 20 лизиновых остатков, ковалентно конъюгированных с сахаридом. В других таких вариантах осуществления, белок-носитель содержит от 4 до 16 лизиновых остатков, ковалентно конъюгированных с сахаридом.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 33F согласно изобретению также могут быть охарактеризованы с помощью соотношения (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В некоторых вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс/масс.) составляет от 0,2 до 4,0 (например, около 0,2, около 0,3, около 0,4, около 0,5, около 0,6, около 0,7, около 0,8, около 0,9, около 1,0, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8, около 1,9, около 2,0, около 2,1, около 2,2, около 2,3, около 2,4, около 2,5, около 2,6, около 2,7, около 2,8, около 2,9, около 3,0, около 3,1, около 3,2, около 3,3, около 3,4, около 3,5, около 3,6, около 3,7, около 3,8, около 3,9 или около 4,0). В других вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс/масс.) составляет от 1,0 до 2,5. В дополнительных вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс/масс.) составляет от 0,4 до 1,7. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Еще одним параметром для характеристики гликоконъюгатов на основе серотипа 33F согласно изобретению является частота присоединений сахаридной цепи к лизину на белке-носителе. Например, в некоторых вариантах осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 4 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В другом варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 10 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В другом варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 15 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В дополнительном варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 25 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида.

В многочисленных вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇, и присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь через еТЕС спейсер между CRM₁₉₇ и полисахаридом на каждые 4, 10, 15 или 25 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида.

В других вариантах осуществления, конъюгат содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и сахаридом на каждые от 5 до 10 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 2 до 7 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 3 до 8 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 4 до 9 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 6 до 11 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 7 до 12 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 8 до 13 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 9 до 14 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 10 до 15 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 2 до 6 повторяющихся сахаридных фрагментов, на каждые от 3 до 7 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 4 до 8 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 6 до 10 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 7 до 11 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 8 до 12 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 9 до 13 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 10 до 14 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 10 до 20 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 4 до 25 повторяющихся сахаридных фрагментов или на каждые от 2 до 25 повторяющихся сахаридных фрагментов. В многочисленных вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В другом варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна связь между белком-носителем и сахаридом на каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В одном варианте осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше.

Важным фактором в процессе конъюгации является разработка условий, при которых сохраняются потенциально малоустойчивые несахаридные заместительные функциональные группы отдельных компонентов, такие как О-ацильные, фосфатные или глицеринфосфатные боковые цепи, которые могут образовывать часть сахаридных эпитопов.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 33F согласно изобретению содержат сахарид, который имеет степень О-ацетилирования от 10% до 100%. В некоторых таких вариантах осуществления, сахарид имеет степень О-ацетилирования от 50% до 100%. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет степень О-ацетилирования от 75% до 100%. В дополнительных вариантах осуществления, сахарид имеет степень О-ацетилирования более чем или равную 70% (≥70%).

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 33F согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном варианте осуществления, присутствие О-ацетильных групп определяют, применяя ионно-ВЭЖХ анализ.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к количеству ацетата в мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к количеству ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к количеству ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к количеству ацетата в мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к количеству ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к количеству ацетата в мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9. Гликоконъюгаты на основе серотипа 33F и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но тем не менее присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 33F согласно изобретению содержат менее около 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% свободного полисахарида серотипа 33F относительно общего количества полисахарида серотипа 33F. Предпочтительно, гликоконъюгат на основе серотипа 33F содержит менее 15% свободного сахарида, более предпочтительно менее 10% свободного сахарида, и еще более предпочтительно, менее 5% свободного сахарида. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат на основе серотипа 33F содержит менее около 25% свободного полисахарида серотипа 33F относительно общего количества полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат на основе серотипа 33F содержит менее около 20% свободного полисахарида серотипа 33F относительно общего количества полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат на основе серотипа 33F содержит менее около 15% свободного полисахарида серотипа 33F относительно общего количества полисахарида серотипа 33F. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, согласно изобретению предложен гликоконъюгат на основе серотипа 33F, характеризующийся одним или более из следующих свойств, выбранных по-отдельности или в комбинации: полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2 000 кДа; гликоконъюгат имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10 000 кДа; белок-носитель содержит от 2 до 20 лизиновых остатков, ковалентно связанных с сахаридом; соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4,0; гликоконъюгат содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 4, 10, 15 или 25 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида; сахарид имеет степень О-ацетилирования от 75% до 100%; конъюгат содержит менее чем около 15% свободного полисахарида относительно общего количества полисахарида; белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 33F также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным размерам (K_d). Среда для гель-проникающей хроматографии (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным массам конъюгата, как указано выше.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере 15% гликоконъюгатов на основе серотипа 33F согласно изобретению имеют K_d, , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В одном варианте осуществления, по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% гликоконъюгатов на основе серотипа 33F согласно изобретению имеют K_d, , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 35% гликоконъюгатов на основе серотипа 33F согласно изобретению имеют K_d, , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительных вариантах осуществления, по меньшей мере 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгатов на основе серотипа 33F согласно изобретению имеют K_d, , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 60% гликоконъюгатов на основе серотипа 33F согласно изобретению имеют K_d, , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 70% гликоконъюгатов на основе серотипа 33F согласно изобретению имеют K_d, , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

В предпочтительном варианте осуществления, от 40% до 90% гликоконъюгатов на основе серотипа 33F имеют K_d, , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 50% до 90% гликоконъюгатов на основе серотипа 33F имеют K_d, , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 65% до 80% гликоконъюгатов на основе серотипа 33F имеют K_d, , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

1.3.4. Гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 15В

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 15В получают посредством активирования полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламино пиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид может быть присоединен к аминогруппе белка-носителя непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, дающий тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, полученной в результате реакции с белком носителем, активированным малеимидом (например, GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, йодацетамидом, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с применением CDAP) соединен с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с применением карбодиимида (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы белкового носителя. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других приемлемых способах применяют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент №WO 98/42721. Конъюгирование может задействовать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al., (1981) J. Chromatogr, 218:509-518), с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. При этом может происходить восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой белка. В предпочтительных вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 15В согласно изобретению получают с применением восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида с образованием альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в индивидуальном гексасахарид ном фрагменте, (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

Предпочтительно, перед окислением осуществляют оптимизацию размера полисахарида серотипа 15В для получения полисахарида с молекулярной массой (Mw) в желаемом диапазоне. Преимущественно, размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшают при сохранении значимых структурных особенностей полисахарида, таких как, например, присутствие О-ацетильных групп. Предпочтительно, размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшают с применением механической гомогенизации (смотри раздел 1.2.6 выше).

Стадия окисления может включать реакцию с периодатом. Для целей представленного изобретения, термин "периодат" включает как периодат, так и йодную кислоту; термин также включает как метаиодат (IO₄^-), так и ортоиодат (IO₆^5-) и различные периодаты (например, натрия периодат и калия периодат). В предпочтительном варианте осуществления периодат, который применяют для окисления капсульного полисахарида серотипа 15В, представляет собой метаиодат. В предпочтительном варианте осуществления периодат, который применяют для окисления капсульного полисахарида серотипа 15В, представляет собой натрия метаиодат.

В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергают взаимодействию с от 0,01 до 10,0, от 0,05 до 5,0, от 0,1 до 1,0, от 0,5 до 1,0, от 0,7 до 0,8, от 0,05 до 0,5, от 0,1 до 0,3 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергают взаимодействию с около 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергают взаимодействию с около 0,15 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергают взаимодействию с около 0,25 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергают взаимодействию с около 0,5 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергают взаимодействию с около 0,6 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергают взаимодействию с около 0,7 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, продолжительность реакции составляет от 1 часа до 50 часов, от 10 часов до 30 часов, от 15 часов до 20 часов, от 15 часов и до 17 часов или около 16 часов.

В предпочтительном варианте осуществления, температуру реакции поддерживают в интервале от 15°С до 45°С, от 15°С до 30°С, от 20°С до 25°С. В предпочтительном варианте осуществления, температуру реакции поддерживают на уровне около 23°С.

В предпочтительном варианте осуществления, реакцию окисления проводят в буфере, выбранном из натрий-фосфатного, калий-фосфатного, 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) или Bis-Tris. В предпочтительном варианте осуществления, буфер представляет собой калий-фосфатный буфер. В предпочтительном варианте осуществления, буфер имеет концентрацию от 1 мМ до 500 мМ, от 1 мМ до 300 мМ, или от 50 мМ до 200 мМ. В предпочтительном варианте осуществления буфер имеет концентрацию около 100 мМ. В предпочтительном варианте осуществления, реакцию окисления проводят при рН от 4,0 до 8,0, от 5,0 до 7,0, или от 5,5 до 6,5. В предпочтительном варианте осуществления, рН составляет около 6,0.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В получают за счет взаимодействия от 0,5 мг/мл до 5 мг/мл выделенного капсульного полисахарида серотипа 15В с от 0,2 до 0,3 молярными эквивалентами периодата при температуре от 20°С до 25°С. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В очищают. Активированный капсульный полисахарид серотипа 15В очищают в соответствии со способами, известными квалифицированному специалисту в данной области, такими как гель-проникающая хроматография (GPC), диализ или ультрафильтрация/диафильтрация. Например, активированный капсульный полисахарид очищают путем концентрирования и диафильтрации с применением устройства для ультрафильтрации.

В предпочтительном варианте осуществления, степень окисления активированного капсульного полисахарида серотипа 15В составляет от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 5, от 5 до 20, от 5 до 15, от 5 до 10, от 10 до 20, от 10 до 15, или от 15 до 20. В предпочтительном варианте осуществления степень окисления активированного капсульного полисахарида серотипа 15В составляет от 2 до 10, от 4 до 8, от 4 до 6, от 6 до 8, от 6 до 12, от 8 до 12, от 9 до 11, от 10 до 16, от 12 до 16, от 14 до 18, от 16 до 20, от 16 до 18, или от 18 до 20.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 5 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 450 кДа, от 100 кДа до 400 кДа, от 100 кДа до 350 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 300 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 250 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,7 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 250 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 250 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 250 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В одном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В лиофилизируют, необязательно в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелецитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид представляет собой сахарозу. Лиофилизированный активированный капсульный полисахарид затем может быть смешан с раствором, содержащим белок-носитель. В другом варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В смешивают с белком-носителем и лиофилизируют необязательно в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелецитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид представляет собой сахарозу. Совместно лиофилизированный полисахарид и белок-носитель затем могут повторно суспендировать в растворе, и подвергать взаимодействию с восстанавливающим агентом.

Активированный капсульный полисахарид серотипа 15В может быть конъюгированным с белком-носителем согласно способу, включающему стадии:

(a) смешивания активированного капсульного полисахарида серотипа 15В с белком-носителем, и

(b) взаимодействия смеси активированного капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя с восстанавливающим агентом с образованием конъюгата капсульный полисахарид серотипа 15В-белок-носитель.

Конъюгирование активированного капсульного полисахарида серотипа 15В с белковым носителем посредством восстановительного аминирования в диметилсульфоксиде (ДМСО) приемлемо для сохранения содержания О-ацетила в полисахариде в отличие от, например, восстановительного аминирования в водном растворе, где степень О-ацетилирования полисахарида в значительной степени снижается. В предпочтительном варианте осуществления, стадию (а) и стадию (b) осуществляют в ДМСО.

В предпочтительном варианте осуществления, стадия (а) включает растворение лиофилизированного капсульного полисахарида серотипа 15В в растворе, содержащем белок-носитель и ДМСО. В предпочтительном варианте осуществления, стадия (а) включает растворение совместно лиофилизированного капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя в ДМСО. Когда стадии (а) и (b) осуществляют в водном растворе, стадии (а) и (b) осуществляют в буфере, предпочтительно выбранном из PBS, MES, HEPES, Bis-tris, ADA, PIPES, MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Бицин или НЕРВ, при рН от 6,0 до 8,5, от 7,0 до 8,0 или от 7,0 до 7,5. В предпочтительном варианте осуществления буфер представляет собой PBS. В предпочтительном варианте осуществления рН составляет около 7,3. В предпочтительном варианте осуществления, концентрация активированного капсульного полисахарида серотипа 15В на стадии (b) составляет от 0,1 мг/мл до 10 мг/мл, от 0,5 мг/мл до 5 мг/мл, или от 0,5 мг/мл до 2 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления, концентрация активированного капсульного полисахарида серотипа 15В на стадии (b) составляет около 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0 мг/мл.

В предпочтительном варианте осуществления начальное соотношение (масс/масс.) активированного капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю при загрузке составляет от 5:1 до 0,1:1, от 2:1 до 0,1:1, от 2:1 до 1:1, от 1,5:1 до 1:1, от 0,1:1 до 1:1, от 0,3:1 до 1:1, или от 0,6:1 до 1:1. В предпочтительном варианте осуществления начальное соотношение активированного капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю при загрузке составляет от около 0,6:1 до 1:1. В другом предпочтительном варианте осуществления начальное соотношение активированного капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю при загрузке составляет от около 0,6:1 до 1,5:1. Такое начальное соотношение при загрузке особенно приемлемо для получения низких уровней содержания свободного полисахарида в гликоконъюгате.

В предпочтительном варианте осуществления начальное соотношение активированного капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю при загрузке составляет около 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1 или 2:1.

В одном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид, натрия триацетоксиборгидрид, натрия или цинка боргидрид в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, аминобораны, такие как пиридин-боран, 2-пиколин-боран, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, t-BuMeiPrN-ВН₃, бензиламин-ВН₃ или 5-этил-2-метилпиридин боран (РЕМВ). В предпочтительном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид. В предпочтительном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия 2-пиколин-боран.

В предпочтительном варианте осуществления, количество восстанавливающего агента, который применяют на стадии (b), составляет от около 0,1 до 10,0 молярных эквивалентов, от 0,5 до 5,0 молярных эквивалентов, или от 1,0 до 2,0 молярных эквивалентов. В предпочтительном варианте осуществления, количество восстанавливающего агента, который применяют на стадии (b), составляет около 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2,0 молярных эквивалента.

В предпочтительном варианте осуществления, продолжительность стадии (b) составляет от 1 часа до 60 часов, от 10 часов до 50 часов, от 40 часов до 50 часов, или от 42 часов до 46 часов. В предпочтительном варианте осуществления, продолжительность стадии (b) составляет около 44 часов.

В предпочтительном варианте осуществления, температуру реакции на стадии (b) поддерживают от 10°С до 40°С, от 15°С до 30°С или от 20°С до 26°С. В предпочтительном варианте осуществления, температуру реакции на стадии (b) поддерживают на уровне около 23°С.

В предпочтительном варианте осуществления, способ получения гликоконъюгата, содержащего капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, ковалентно связанный с белком-носителем, дополнительно включает стадию (стадию (с)) блокирования (гашения) непрореагировавшего альдегида посредством добавления NaBH₄.

В предпочтительном варианте осуществления, количество NaBH₄, использованного на стадии (с), составляет от 0,1 до 10 молярных эквивалентов, от 0,5 до 5,0 молярных эквивалентов или от 1,0 до 3,0 молярных эквивалентов. В предпочтительном варианте осуществления, количество NaBH₄, которое применяют на стадии (с), составляет около 2 молярных эквивалентов. В предпочтительном варианте осуществления, продолжительность стадии (с) составляет от 0,1 часов до 10 часов, 0,5 часов до 5 часов, или от 2 часов до 4 часов. В предпочтительном варианте осуществления, продолжительность стадии (с) составляет около 3 часов.

В предпочтительном варианте осуществления, температуру реакции на стадии (с) поддерживают от 15°С до 45°С, от 15°С до 30°С или от 20°С до 26°С. В предпочтительном варианте осуществления, температуру реакции на стадии (с) поддерживают на уровне около 23°С.

В предпочтительном варианте осуществления выход на стадии конъюгирования составляет более 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%. В предпочтительном варианте осуществления выход на стадии конъюгирования (стадии b) составляет более 60%. В предпочтительном варианте осуществления выход на стадии конъюгирования (стадии b) составляет более 70%. Выход представляет собой количество полисахарида серотипа 15В в конъюгате × 100) / количество активированного полисахарида, которое применяют на стадии конъюгирования.

В предпочтительном варианте осуществления, способ получения гликоконъюгата, содержащего капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, ковалентно связанный с белком-носителем, включает стадии:

(a) оптимизации размера очищенного полисахарида серотипа 15В с применением гомогенизации под высоким давлением;

(b) взаимодействия полисахарида серотипа 15В требуемого размера с окислительным агентом;

(c) смешивания активированного полисахарида серотипа 15В с белком-носителем;

(d) взаимодействия смеси активированного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя с восстанавливающим агентом с образованием конъюгата полисахарид серотипа 15В-белок-носитель; и

(e) блокирование (гашение) непрореагировавшего альдегида посредством добавления NaBH₄.

В предпочтительном варианте осуществления выход на стадии конъюгирования (стадии d) указанного выше способа составляет более 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%. В предпочтительном варианте осуществления выход на стадии конъюгирования (стадии d) составляет более 60%. В предпочтительном варианте осуществления выход на стадии конъюгирования (стадии d) составляет более 70%. Выход представляет собой количество полисахарида серотипа 15В в конъюгате × 100) / количество активированного полисахарида, которое применяют на стадии конъюгирования.

После конъюгации капсульного полисахарида серотипа 15В с белком-носителем, конъюгат полисахарид-белок может быть очищен (обогащен по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок) с применением различных способов, известных квалифицированному специалисту. Данные способы включают диализ, операции концентрирования/диафильтрации, фильтрование тангенциальным потоком, осаждение/элюирование, колоночную хроматографию (DEAE или хроматографию с гидрофобным взаимодействием), и глубинную фильтрацию. В одном варианте осуществления белок-носитель является таким, как определено в разделе 1.1. В одном варианте осуществления белок-носитель выбирают из группы, состоящей из: DT (дифтерийный анатоксин), ТТ (столбнячный анатоксин), CRM₁₉₇, другие DT мутанты, PD (D-протеин Haemophilus influenzae), или их иммунологически функциональных эквивалентов. В одном варианте осуществления белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 15В согласно представленному изобретению получены конъюгированием с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) и содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 5 кДа до 1 500 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 10 кДа до 1 500 кДа. В дополнительных таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1 500 кДа; от 50 кДа до 1 250 кДа; от 50 кДа до 1 000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 50 кДа до 250 кДа; от 100 кДа до 1 500 кДа; от 100 кДа до 1 250 кДа; от 100 кДа до 1 000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 250 кДа; от 200 кДа до 1 500 кДа; от 200 кДа до 1 250 кДа; от 200 кДа до 1 000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; или от 200 кДа до 400 кДа. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20 000 кДа. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу от 1 000 кДа до 20 000 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу от 3 000 кДа до 20 000 кДа, от 5 000 кДа до 10 000 кДа, от 5 000 кДа до 20 000 кДа, от 8 000 кДа до 20 000 кДа, от 8 000 кДа до 16 000 кДа или от 10 000 кДа до 16 000 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу около 1 000 кДа, около 1 500 кДа, около 2 000 кДа, около 2 500 кДа, около 3 000 кДа, около 3 500 кДа, около 4 000 кДа, около 4 500 кДа, около 5 000 кДа, около 5 500 кДа, около 6 000 кДа, около 6 500 кДа, около 7 000 кДа, около 7 500 кДа, около 8 000 кДа, около 8 500 кДа, около 9 000 кДа, около 9 500 кДа около 10 000 кДа, около 10 500 кДа, около 11 000 кДа, около 11 500 кДа, около 12 000 кДа, около 12 500 кДа, около 13 000 кДа, около 13 500 кДа, около 14 000 кДа, около 14 500 кДа, около 15 000 кДа, около 15 500 кДа, около 16 000 кДа, около 16 500 кДа, около 17 000 кДа, около 17 500 кДа, около 18 000 кДа, около 18 500 кДа около 19 000 кДа, около 19 500 кДа или около 20 000 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу от 1 000 кДа до 20 000 кДа; от 1 000 кДа до 15 000 кДа; от 1 000 кДа до 10 000 кДа; от 1 000 кДа до 7 500 кДа; от 1 000 кДа до 5 000 кДа; от 1 000 кДа до 4 000 кДа; от 1 000 кДа до 3 000 кДа; от 2 000 кДа до 20 000 кДа; от 2 000 кДа до 15 000 кДа; от 2 000 кДа до 12 500 кДа; от 2 000 кДа до 10 000 кДа; от 2 000 кДа до 7 500 кДа; от 2 000 кДа до 6 000 кДа; от 2 000 кДа до 5 000 кДа; от 2 000 кДа до 4 000 кДа; или от 2 000 кДа до 3 000 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу от 3 000 кДа до 20 000 кДа; от 3 000 кДа до 15 000 кДа; от 3 000 кДа до 10 000 кДа; от 3 000 кДа до 7 500 кДа; от 3 000 кДа до 5 000 кДа; от 3 000 кДа до 4 000 кДа; от 4 000 кДа до 20 000 кДа; от 4 000 кДа до 15 000 кДа; от 4 000 кДа до 12 500 кДа; от 4 000 кДа до 10 000 кДа; от 4 000 кДа до 7 500 кДа; от 4 000 кДа до 6 000 кДа или от 4 000 кДа до 5 000 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу от 5 000 кДа до 20 000 кДа; от 5 000 кДа до 15 000 кДа; от 5 000 кДа до 10 000 кДа; от 5 000 кДа до 7 500 кДа; от 6 000 кДа до 20 000 кДа; от 6 000 кДа до 15 000 кДа; от 6 000 кДа до 12 500 кДа; от 6 000 кДа до 10 000 кДа или от 6 000 кДа до 7 500 кДа.

Молекулярную массу гликоконъюгата измеряют с применением SEC-MALLS. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше. В одном варианте осуществления, указанный гликоконъюгат на основе серотипа 15В получают с применением восстановительного аминирования.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 15В согласно изобретению также могут быть охарактеризованы соотношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение (масс/масс.) капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 3,0 (например, около 0,5, около 0,6, около 0,7, около 0,8, около 0,9, около 1,0, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8, около 1,9, около 2,0, около 2,1, около 2,2, около 2,3, около 2,4, около 2,5, около 2,6, около 2,7, около 2,8, около 2,9 или около 3,0). В предпочтительном варианте осуществления, соотношение капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,4 до 2. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 2,0, от 0,5 до 1,5, от 0,5 до 1,0, от 1,0 до 1,5, от 1,0 до 2,0. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,7 до 0,9.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 15В и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но тем не менее присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению содержит менее чем около 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% или 15% свободного капсульного полисахарида серотипа 15В относительно общего количества капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению содержит менее чем около 25% свободного капсульного полисахарида серотипа 15В относительно общего количества капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению содержит менее чем около 20% свободного капсульного полисахарида серотипа 15В относительно общего количества капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгаты на основе серотипа 15В согласно изобретению содержат менее чем около 15% свободного капсульного полисахарида серотипа 15В относительно общего количества капсульного полисахарида серотипа 15В.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 15В также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным размерам (K_d). Среда для гель-проникающей хроматографии (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным массам конъюгата, как указано выше.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 20% гликоконъюгатов на основе серотипа 15В согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 30% иммуногенного конъюгата имеет K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 40% гликоконъюгатов на основе серотипа 15В согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгатов на основе серотипа 15 согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 60% гликоконъюгатов на основе серотипа 15В согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 70% гликоконъюгатов на основе серотипа 15В согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 40% до 90% гликоконъюгатов на основе серотипа 15В имеют K_d , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 50% до 90% гликоконъюгатов на основе серотипа 15В имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 65% до 80% гликоконъюгатов на основе серотипа 15В имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, присутствие О-ацетильных групп определяют с применением ионного ВЭЖХ анализа.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате на основе серотипа 15В к количеству ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате на основе серотипа 15В к количеству ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате на основе серотипа 15В к количеству ацетата в мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9. В предпочтительном варианте осуществления, присутствие О-ацетильных групп определяют с применением ионного ВЭЖХ анализ.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате на основе серотипа 15В к количеству ацетата в мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате на основе серотипа 15В к количеству ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате на основе серотипа 15В к количеству ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9. В предпочтительном варианте осуществления, присутствие О-ацетильных групп определяют с применением ионного ВЭЖХ анализа.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 15В согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,7 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. Еще одной характеристикой гликоконъюгатов на основе серотипа 15В согласно изобретению является количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), конъюгированных с сахаридом, которое может быть выражено в виде диапазона количества конъюгированных лизиновых остатков (степень конъюгации). Замещение белка-носителя лизином за счет образования ковалентных связей между полисахаридом и лизином можно обнаружить с помощью аминокислотного анализа с применением стандартных способов, известных квалифицированному специалисту в данной области. Конъюгация в результате приводит к уменьшению количества лизиновых остатков по сравнению с их количеством в исходном белке CRM₁₉₇, который применяют для образования конъюгата.

В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 15В согласно изобретению составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 15В согласно изобретению составляет около 2, около 3, около 4, около 5,около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14 или около 15. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 15В согласно изобретению составляет от 2 до 5.

1.3.5. Гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 12F

В гликоконъюгатах на основе S. pneumoniae серотипа 12F согласно представленному изобретению сахарид выбран из группы, состоящей из полисахарида и олигосахарида, и белок-носитель выбран из любого приемлемого носителя, как описано в данном документе, или известного квалифицированному специалисту в данной области. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, сахарид представляет собой полисахарид S. pneumoniae серотипа 12F.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 12F получают с применением CDAP. Полисахариды активируют тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламино пиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид затем присоединяют к аминогруппе белка-носителя (предпочтительно CRM₁₉₇) непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, дающий тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, полученной за счет реакции с белком-носителем, активированным малеимидом (например, GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например с применением йодацетамида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с помощью CDAP) соединен с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) с применением карбодиимида (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы белкового носителя.

В других способах конъюгирования применяют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгирование может задействовать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри Bethell et al., (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al., (1981) J. Chromatogr, 218:509-518), с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. При этом может происходить восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой белка.

В одном варианте осуществления, капсульные полисахариды S. pneumoniae серотипа 12F являются конъюгированными с белком-носителем посредством восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида с образованием альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в индивидуальном гексасахаридном фрагменте, (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

Перед окислением, полисахарид серотипа 12F необязательно гидролизуют (оптимизируют размер). Можно применять механический или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с применением уксусной кислоты.

В одном варианте осуществления, окислительный агент представляет собой периодат. Термин "периодат" включает как периодат, так и йодную кислоту (смотри ниже).

В предпочтительном варианте осуществления, окислительный агент представляет собой 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) свободный радикал и N-хлорсукцинимид (NCS) в качестве совместного окислителя. В таком варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 12F получают с применением 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) свободного радикала и N-хлорсукцинимида (NCS) в качестве совместного окислителя (в данном документе далее "TEMPO/NCS окисление"), как описано в Примере 7 и в WO 2014/097099, путем окисления первичных спиртов сахарида до альдегидов. Поэтому в одном аспекте, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 12F могут быть получены по способу, включающему стадии: а) взаимодействия сахарида серотипа 12F с 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) и N-хлорсукцинимидом (NCS) в водном растворителе, с получением активированного сахарида; и b) взаимодействия активированного сахарида с белком-носителем, содержащим одну или более аминогруппы (в данном документе далее "TEMPO/NCS-восстановительное аминирование"). В одном аспекте, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 12F получают согласно указанному способу. В одном варианте осуществления, степень окисления активированного сахарида серотипа 12F находится в диапазоне от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 10, от 1 до 5, от 3 до 40, от 3 до 30, от 3 до 20, от 3 до 10, от 4 до 40, от 4 до 30, от 4 до 20, от 4 до 10, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 5 до 10, от 6 до 50, от 6 до 40, от 6 до 30, от 6 до 20, от 6 до 15, от 6 до 14, от 6 до 13, от 6 до 12, от 6 до 11, от 6 до 10, от 7 до 40, от 7 до 30, от 7 до 20, от 7 до 15, от 7 до 14, от 7 до 13, от 7 до 12, от 7 до 11, от 7 до 10, от 8 до 40, от 8 до 30, от 8 до 20, от 8 до 15, от 8 до 14, от 8 до 13, от 8 до 13, от 8 до 12, от 8 до 11, от 8 до 10, от 9 до 40, от 9 до 30, от 9 до 20, от 9 до 15, от 10 до 40, от 10 до 30, от 10 до 20, или от 10 до 15. В дополнительном аспекте, степень окисления активированного сахарида составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, или 40. Предпочтительно, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В одном варианте осуществления, перед стадией а) сахарид серотипа 12F гидролизуют до молекулярной массы, находящейся в диапазоне от 100 кДа до 400 кДа. Например, в одном аспекте, диапазоны молекулярной массы составляют от 100 кДа до 350 кДа, от 100 кДа до 300 кДа, от 100 кДа до 250 кДа, от 100 кДа до 200 кДа, от 100 кДа до 150 кДа, от 200 кДа до 400 кДа, от 200 кДа до 350 кДа, от 200 кДа до 300 кДа, от 200 кДа до 250 кДа, от 300 кДа до 400 кДа, или от 300 кДа до 350 кДа.

В следующем аспекте, способ дополнительно включает стадию очистки активированного полисахарида перед стадией b). В еще одном аспекте, способы дополнительно включают стадию добавления восстанавливающего агента после стадии b). В одном аспекте восстанавливающий агент представляет собой NaCNBH₃. В дополнительном аспекте, способы дополнительно включают стадию добавления NaBH₄ после добавления NaCNBH₃. В следующем аспекте, способ включает стадию очистки после добавления NaBH₄.

В другом аспекте, согласно представленному изобретению предложен гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F, который получен или может быть получен по любому из способов, раскрытых выше в данном документе. Например, в одном аспекте согласно представленному изобретению предложен гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F, содержащий сахарид, конъюгированный с белком-носителем, который получают или который может быть получен согласно способу, включающему стадии: а) взаимодействия сахарида с 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) и N-хлорсукцинимидом (NCS) в водном растворителе, в результате чего получают активированный сахарид; и b) взаимодействия активированного сахарида с белком-носителем, содержащим одну или более аминных групп. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F согласно представленному изобретению имеет молекулярную массу от около 50 кДа до около 20000 кДа. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат имеет молекулярную массу от около 200 кДа до около 10000 кДа. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F имеет молекулярную массу от около 500 кДа до около 5000 кДа. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F имеет молекулярную массу от около 1000 кДа до около 3000 кДа. В других вариантах осуществления гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F имеет молекулярную массу от около 600 кДа до около 2800 кДа; от около 700 кДа до около 2700 кДа; от около 1000 кДа до около 2000 кДа; от около 1800 кДа до около 2500 кДа; от около 1100 кДа до около 2200 кДа; от около 1900 кДа до около 2700 кДа; от около 1200 кДа до около 2400 кДа; от около 1700 кДа до около 2600 кДа; от около 1300 кДа до около 2600 кДа; от около 1600 кДа до около 3000 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 12F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 20000 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 3000 кДа; от 2000 кДа до 20000 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 12F получен конъюгированием с белком-носителем с применением TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

Еще одной характеристикой гликоконъюгатов на основе серотипа 12F согласно изобретению является количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), конъюгированных с сахаридом, которое может быть выражено в виде диапазона количества конъюгированных лизиновых остатков (степень конъюгации).

В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 12F согласно изобретению составляет от 2 до 20, от 4 до 16, от 4 до 15, от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 12F согласно изобретению составляет около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19 или около 20. Количество лизиновых остатков в белке-носителе, конъюгированном с сахаридом, также может быть выражено с помощью молярного соотношения. Например, в гликоконъюгате, в котором от 4 до 15 лизиновых остатков CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом, молярное соотношение лизиновых остатков, конъюгированных с CRM₁₉₇, в гликоконъюгате составляет от около 10:1 до около 40:1. В иммуногенной композиции, в которой от 2 до 20 лизиновых остатков CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом, молярное соотношение лизинов, конъюгированных с CRM₁₉₇, в гликоконъюгате, составляет от около 5:1 до около 50:1. В одном варианте осуществления, в гликоконъюгате на основе S. pneumoniae серотипа 12F согласно представленному изобретению молярное соотношение лизинов, конъюгированных с белком-носителем, составляет от около 10:1 до около 25:1. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых вариантах осуществления, около 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, или 16 лизиновых остатков из 39 лизиновых остатков, содержащихся в CRM₁₉₇, ковалентно связаны с сахаридом. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 12F получен конъюгированием с белком-носителем с применением TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

В одном варианте осуществления, в гликоконъюгате на основе S. pneumoniae серотипа 12F соотношение сахарида к белку-носителю (масс/масс.) составляет от 0,2 до 4 (например, около 0,2, около 0,3, около 0,4, около 0,5, около 0,6, около 0,7, около 0,8, около 0,9, около 1,0, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8, около 1,9, около 2,0, около 2,1, около 2,2, около 2,3, около 2,4, около 2,5, около 2,6, около 2,7, около 2,8, около 2,9, около 3,0, около 3,1, около 3,2, около 3,3, около 3,4, около 3,5, около 3,6, около 3,7, около 3,8, около 3,9 или около 4,0). В другом варианте осуществления, в гликоконъюгате на основе S. pneumoniae серотипа 12F соотношение сахарида к белку-носителю (масс/масс.) составляет от 1,1 до 1,7. В других вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,8 (например, около 0,8, около 0,9, около 1,0, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7 или около 1,8). В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 12F получен конъюгированием с белком-носителем с применением TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

Еще одним параметром для характеристики гликоконъюгатов на основе серотипа 12F согласно изобретению является частота присоединений сахаридной цепи к лизину на белке-носителе. Например, в одном варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 100 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В одном варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 50 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В одном варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 25 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В другом варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 4 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В другом варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 10 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В дополнительном варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 15 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В многочисленных вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇, и присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между CRM₁₉₇ и полисахаридом на каждые 4, 10, 15 или 25 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В других вариантах осуществления, конъюгат содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и сахаридом на каждые от 5 до 10 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 2 до 7 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 3 до 8 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 4 до 9 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 6 до 11 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 7 до 12 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 8 до 13 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 9 до 14 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 10 до 15 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 2 до 6 повторяющихся сахаридных фрагментов, на каждые от 3 до 7 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 4 до 8 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 6 до 10 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 7 до 11 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 8 до 12 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 9 до 13 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 10 до 14 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 10 до 20 повторяющихся сахаридных фрагментов; на каждые от 4 до 25 повторяющихся сахаридных фрагментов или на каждые от 2 до 25 повторяющихся сахаридных фрагментов. В многочисленных вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В другом варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна связь между CRM₁₉₇ и сахаридом на каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 12F получен конъюгированием с белком-носителем с применением TEMPO/NCS-восстановительного аминирования. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F согласно изобретению содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 25 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В другом варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 4 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В другом варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 10 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В дополнительном варианте осуществления, присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 15 повторяющихся сахаридных фрагментов полисахарида. В некоторых таких вариантах осуществления, полисахарид серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем с применением TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 12F и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но тем не менее присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть, нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 12F согласно изобретению содержат менее чем около 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% свободного полисахарида серотипа 12F относительно общего количества полисахарида серотипа 12F. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F содержит менее чем около 50% свободного полисахарида серотипа 12F относительно общего количества полисахарида серотипа 12F. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F содержит менее чем около 45% свободного полисахарида серотипа 12F относительно общего количества полисахарида серотипа 12F. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат содержит менее чем около 30% свободного полисахарида серотипа 12F относительно общего количества полисахарида серотипа 12F. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F содержит менее чем около 20% свободного полисахарида серотипа 12F относительно общего количества полисахарида серотипа 12F. В дополнительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит менее чем около 10% свободного полисахарида серотипа 12F относительно общего количества полисахарида серотипа 12F. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F содержит менее чем около 5% свободного полисахарида серотипа 12F относительно общего количества полисахарида серотипа 12F. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 12F получен конъюгированием с белком-носителем с применением TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 12F согласно представленному изобретению содержит сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В дополнительных таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1 500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; или от 200 кДа до 400 кДа. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 12F получен конъюгированием с белком-носителем с применением TEMPO/NCS-восстановительного аминирования. Гликоконъюгаты на основе серотипа 12F также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным массам (K_d). Среда для гель-проникающей хроматографии (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным массам конъюгата, как указано выше.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 35% гликоконъюгатов на основе серотипа 12F согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгатов на основе серотипа 12F согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 60% гликоконъюгатов на основе серотипа 12F согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 70% гликоконъюгатов на основе серотипа 12F согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

В предпочтительном варианте осуществления, от 40% до 90% гликоконъюгатов на основе серотипа 12F имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 50% до 90% гликоконъюгатов на основе серотипа 12F имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 65% до 80% гликоконъюгатов на основе серотипа 12F имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

1.3.6. Гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 10А

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 10А получают посредством активирования полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид может быть присоединен к аминогруппе белка-носителя непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, дающий тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, полученной за счет реакции с белком-носителем, активированным малеимидом (например, с применением GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с применением йодацетамида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с применением CDAP) соединен с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с применением карбодиимида (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы белкового носителя. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других приемлемых способах применяют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгирование может задействовать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри Bethell et al., (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al., (1981) J. Chromatogr, 218:509-518), с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. При этом может происходить восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой белка.

В предпочтительных вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 10А согласно изобретению получают с применением восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисления полисахарида с образованием альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в индивидуальном гексасахаридном фрагменте, (2) восстановления активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

Перед окислением, полисахарид серотипа 10А необязательно гидролизуют (оптимизируют размер). Можно применять механический или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с применением уксусной кислоты.

В одном варианте осуществления, полисахарид серотипа 10А активируют (окисляют) согласно способу, включающему стадии:

(a) взаимодействия выделенного полисахарида серотипа 10А с окислительным агентом;

(b) гашения реакции окисления посредством добавления гасящего агента, что в результате приводит к активированному полисахариду серотипа 10A.

В предпочтительном варианте осуществления, окислительный агент представляет собой периодат. Для целей согласно представленному изобретению, термин "периодат" включает как периодат, так и йодную кислоту, термин также включает как метаиодат (IO₄^-), так и ортоиодат (IO₆^5-) и различные периодаты (например, натрия периодат и калия периодат). В предпочтительном варианте осуществления, окислительный агент представляет собой натрия периодат. В предпочтительном варианте осуществления, периодат, который применяют для окисления полисахарида серотипа 10А, представляет собой метаиодат. В предпочтительном варианте осуществления периодат, который применяют для окисления полисахарида серотипа 10А, представляет собой натрия метаиодат.

В одном варианте осуществления, гасящий агент выбирают из вицинальных диолов, 1,2-аминоспиртов, аминокислот, глютатиона, сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или фосфористой кислоты.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой 1,2-аминоспирты формулы (I):

где R¹ выбирают из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В одном варианте осуществления, гасящий агент выбирают из солей натрия и калия сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или солей фосфористой кислоты. В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой аминокислоту. В таких вариантах осуществления, указанная аминокислота может быть выбрана из серина, треонина, цистеина, цистина, метионина, пролина, гидроксипролина, триптофана, тирозина, и гистидина.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой сульфит, такой как бисульфат, дитионит, метабисульфит, тиосульфат. В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой соединение, содержащее две вицинальные гидроксильные группы (вицинальные диолы), то есть две гидроксильные группы, ковалентно связанные с двумя соседними атомами углерода.

Предпочтительно, гасящий агент представляет собой соединение формулы (II):

где R¹ и R² каждый независимо выбирают из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В предпочтительном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой глицерин, этиленгликоль, пропан-1,2-диол, бутан-1,2-диол или бутан-2,3-диол, аскорбиновую кислоту. В предпочтительном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой бутан-2,3-диол.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный полисахарид серотипа 10А активируют согласно способу, включающему стадии:

(a) взаимодействия выделенного полисахарида серотипа 10А с периодатом;

(b) гашения реакции окисления посредством добавления бутан-2,3-диола, что в результате приводит к активированному полисахариду серотипа 10А.

После стадии окисления полисахарида, полисахарид, как указывалось, активируют и в данном документе далее называют как "активированный полисахарид".

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А очищают. Активированный полисахарид серотипа 10А очищают в соответствии со способами, известными квалифицированному специалисту в данной области, такими как гель-проникающая хроматография (GPC), диализ или ультрафильтрация/диафильтрация. Например, активированный полисахарид 10А очищают путем концентрирования и диафильтрация с применением устройства для ультрафильтрации.

В предпочтительном варианте осуществления степень окисления активированного полисахарида серотипа 10А составляет от 2 до 30, от 2 до 25, от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 5, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 5 до 15, от 5 до 10, от 10 до 30, от 10 до 25, от 10 до 20, от 10 до 15, от 15 до 30, от 15 до 25, от 15 до 20, от 20 до 30, или от 20 до 25. В предпочтительном варианте осуществления степень окисления активированного полисахарида серотипа 10А составляет от 2 до 10, от 4 до 8, от 4 до 6, от 6 до 8, от 6 до 12, от 8 до 14, от 9 до 11, от 10 до 16, от 12 до 16, от 14 до 18, от 16 до 20, от 16 до 18, от 18 до 22, или от 18 до 20.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 400 кДа, от 50 кДа до 350 кДа, от 50 кДа до 300 кДа, от 50 кДа до 250 кДа, от 50 кДа до 200 кДа, от 100 кДа до 300 кДа, от 100 кДа до 250 кДа или от 100 кДа до 200 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 300 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 100 кДа до 200 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 100 кДа до 200 кДа и степень окисления от 5 до 20, от 5 до 15, от 8 до 14, от 8 до 12 или от 9 до 11. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 100 кДа до 200 кДа и степень окисления от 9 до 11.

Активированный полисахарид и/или белок-носитель могут быть лиофилизированными (сублимационная сушка) либо независимо друг от друга (отдельная лиофилизация), либо вместе (совместная лиофилизация). В одном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А лиофилизируют, необязательно в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелецитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид представляет собой сахарозу. В одном варианте осуществления, лиофилизированный активированный полисахарид затем смешивают с раствором, содержащим белок-носитель.

В другом варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют совместно. В таких вариантах осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А смешивают с белком-носителем и лиофилизируют необязательно в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелецитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид представляет собой сахарозу. Совместно лиофилизированный полисахарид и белок-носитель затем можно повторно суспендировать в растворе и подвергать взаимодействию с восстанавливающим агентом.

Вторая стадия процесса конъюгирования представляет собой восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (восстановительное аминирование), с использованием восстанавливающего агента.

Активированный полисахарид серотипа 10А может быть конъюгированным с белком-носителем согласно способу, включающему стадии:

(c) смешивания активированного полисахарида серотипа 10А с белком-носителем; и

(d) взаимодействия смеси активированного полисахарида серотипа 10А и белка-носителя с восстанавливающим агентом с образованием конъюгата полисахарид серотипа 10A-белок-носитель.

В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в водном растворителе, в другом варианте осуществления реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в растворителях ДМСО (диметилсульфоксиде) или в ДМФ (диметилформамиде). Растворители ДМСО или ДМФ можно применять для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизированы.

В одном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид, натрия триацетоксиборгидрид, натрия или цинка боргидрид в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, аминобораны, таких как пиридин-боран, 2-пиколин-боран, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, t-BuMeiPrN-ВН₃, бензиламин-ВН3 или 5-этил-2-метилпиридин-боран (РЕМВ). В предпочтительном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид.

По окончании реакции восстановления, в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, они могут быть блокированы приемлемым блокирующим агентом. В одном варианте осуществления данный блокирующий агент представляет собой натрия боргидрид (NaBH₄).

После конъюгирования полисахарида серотипа 10А с белком-носителем, гликоконъюгат может быть очищен (обогащен по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок) с применением различных способов, известных квалифицированному специалисту. Данные способы включают диализ, операции концентрирования/диафильтрации, фильтрование тангенциальным потоком осаждение/элюирование, колоночную хроматографию (DEAE или хроматографию с гидрофобным взаимодействием), и глубинную фильтрацию.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 10А согласно представленному изобретению содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В дополнительных таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1 500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; или от 200 кДа до 400 кДа. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 10А получают с применением восстановительного аминирования.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 10А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 15000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 10А имеет молекулярную массу от 500 кДа до 15000 кДа, от 500 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; или от 3000 кДа до 8,000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 10А имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 10000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 10А имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа. В еще других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 10А имеет молекулярную массу от 2000 кДа до 8000 кДа или от 3000 кДа до 7000 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12 500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7 500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750 кДа до 12500 кДа; от 750 кДа до 10000 кДа; от 750 кДа до 7500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа; от 3000 кДа до 10000 кДа; от 3000 кДа до 7 500 кДа; от 3000 кДа до 5000 кДа; от 4000 кДа до 20000 кДа; от 4000 кДа до 15000 кДа; от 4000 кДа до 12500 кДа; от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа; или от 4000 кДа до 5000 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа; от 5000 кДа до 15000 кДа; от 5000 кДа до 10000 кДа или от 5000 кДа до 7500 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 6000 кДа до 20000 кДа; от 6000 кДа до 15000 кДа; от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 7000 кДа до 20000 кДа; от 7000 кДа до 15000 кДа; от 7000 кДа до 10000 кДа или от 7000 кДа до 8000 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 8000 кДа до 20000 кДа; от 8000 кДа до 15000 кДа; или от 8000 кДа до 10000 кДа.

В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше. Молекулярную массу гликоконъюгата измеряют с применением SEC-MALLS.

Еще одной характеристикой гликоконъюгатов на основе серотипа 10А согласно изобретению является количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), конъюгированных с сахаридом, которое может быть выражено в виде диапазона конъюгированных лизиновых остатков (степень конъюгации). Замещение белка-носителя лизином за счет образования ковалентных связей между полисахаридом и лизином можно обнаружить с помощью аминокислотного анализа с применением стандартных способов, известных квалифицированному специалисту в данной области. Конъюгация в результате приводит к уменьшению количества лизиновых остатков по сравнению с их количеством в исходном белке CRM₁₉₇, который применяли для образования конъюгата.

В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 10А составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 10А составляет от 6 до 8. В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇

Гликоконъюгаты на основе серотипа 10А согласно изобретению также могут быть охарактеризованы соотношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В некоторых вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс/масс.) составляет от 0,5 до 3,0 (например, около 0,5, около 0,6, около 0,7, около 0,8, около 0,9, около 1,0, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8, около 1,9, около 2,0, около 2,1, около 2,2, около 2,3, около 2,4, около 2,5, около 2,6, около 2,7, около 2,8, около 2,9 или около 3,0). В предпочтительном варианте осуществления, отношение сахарида серотипа 10A к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 2,0, от 0,5 до 1,5, от 0,5 до 1,0, от 1,0 до 1,5 или от 1,0 до 2,0. В предпочтительном варианте осуществления, отношение полисахарида серотипа 10А к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,8 до 1,4. В предпочтительном варианте осуществления, отношение капсульного полисахарида серотипа 10А к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,8 до 1,2 (например, около 0,8, около 0,9 около 1,0, около 1,1, или около 1,2). В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 10А и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 10А согласно изобретению содержат менее чем около 50% свободного сахарида, менее чем около 45% свободного сахарида, менее чем около 40% свободного сахарида, менее чем около 35% свободного сахарида, менее чем около 30% свободного сахарида, менее чем около 25% свободного сахарида, менее чем около 20% свободного сахарида, менее чем около 15% свободного сахарида, менее чем около 10% свободного сахарида, или менее чем около 5% свободного сахарида по отношению к общему количеству сахарида серотипа 10А. Предпочтительно, гликоконъюгат на основе серотипа 10А содержит менее чем 15% свободного сахарида, более предпочтительно менее, чем 10% свободного сахарида, еще более предпочтительно, менее чем 5% свободного сахарида. Гликоконъюгаты на основе серотипа 10А также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным массам (K_d). Среда для гель-проникающей хроматографии (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным массам конъюгата, как указано выше.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 30% гликоконъюгатов на основе серотипа 10А согласно изобретению имеют K_d , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 40% гликоконъюгатов на основе серотипа 10А согласно изобретению имеют K_d , меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгатов на основе серотипа 10А согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 60% гликоконъюгатов на основе серотипа 10А имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 50% до 80% гликоконъюгатов на основе серотипа 10А согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

1.3.7. Гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 11А

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 11А получают посредством активирования полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид может быть присоединен к аминогруппе белка-носителя непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, дающий тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, полученной за счет реакции с белком-носителем, активированным малеимидом (например, с применением GMBS), или галогенацетилированным белком-носителем (например, с применением йодацетамида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с применением CDAP) соединен с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с применением карбодиимида (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы белкового носителя. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других приемлемых способах применяют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгирование может задействовать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри Bethell et al., (1979). Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al., (1981) J. Chromatogr, 218:509-518) с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. При этом может происходить восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой белка. В предпочтительных вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 11А согласно изобретению получают с применением восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида с образованием альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в индивидуальном гексасахаридном фрагменте, (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

Перед окислением, полисахарид серотипа 11А необязательно гидролизуют для того, чтобы уменьшить его вязкость. Можно применять механический или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с применением уксусной кислоты. Механическую оптимизацию размера можно проводить с применением фрагментирования за счет гомогенизации под высоким давлением. Стадия окисления может включать реакцию с периодатом. Для целей согласно представленному изобретению, термин "периодат" включает как периодат, так и йодную кислоту; термин также включает как метаиодат (IO₄^-), так и ортоиодат (IO₆^5-) и различные периодаты (например, натрия периодат и калия периодат). В одном варианте осуществления капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 11А окисляют в присутствии метаиодата, предпочтительно в присутствии натрия периодата (NaIO₄). В другом варианте осуществления капсульный полисахарид из серотипа 11А окисляют в присутствии ортоиодата, предпочтительно в присутствии йодной кислоты.

После стадии окисления полисахарида, полисахарид, как указывалось, активируют и в данном документе ниже называют "активированный полисахарид". Активированный полисахарид может быть очищенным и лиофилизированным (сублимационная сушка).

Активированный полисахарид и белок-носитель могут быть лиофилизированными (сублимационная сушка) либо независимо друг от друга (отдельная лиофилизация), либо вместе (совместная лиофилизация). В одном варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель являются совместно лиофилизированными. В другом варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель являются лиофилизированными независимо друг от друга.

В одном варианте осуществления лиофилизация происходит в присутствии невосстанавливающего сахара, приемлемые невосстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, рафинозу, стахиозу, мелецитозу, декстран, маннит, лактит и палатинит.

Вторая стадия процесса конъюгирования представляет собой восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (восстановительное аминирование), с использованием восстанавливающего агента. Восстанавливающие агенты, которые являются приемлемыми, включают цианоборгидриды, такие как натрия цианоборгидрид, боран-пиридин, или боргидрид-обменная смола. В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид. В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в водном растворителе, в другом варианте осуществления реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в растворителях ДМСО (диметилсульфоксиде) или в ДМФ (диметилформамиде). Растворители ДМСО или ДМФ можно применять для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизированы.

В одном варианте осуществления в реакции восстановления применяют от 0,1 до 3,0, от 0,15 до 2,0, от 0,2 до 2,0, или от 0,5 до 1,5 молярных эквивалентов натрия цианоборгидрида. В одном варианте осуществления в реакции восстановления применяют около 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,9 или 3,0 молярных эквивалентов натрия цианоборгидрида.

В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет собой натрия триацетоксиборгидрид, в дополнительном варианте осуществления в реакции восстановления применяют от 1,0 до 6,0 молярных эквивалентов, от 2,0 до 5,0 молярных эквивалентов или около 3,0 молярных эквивалентов натрия триацетоксиборгидрида.

По окончании реакции восстановления, в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, они могут быть блокированы приемлемым блокирующим агентом. В одном варианте осуществления данный блокирующий агент представляет собой натрия боргидрид (NaBH₄). В одном варианте осуществления блокирование достигается за счет добавления в реакцию восстановления от 0,5 до 5,0 молярными эквивалентов NaBH₄, например, около 1, 1,5, 2, 2,5 или 3 молярными эквивалентов NaBH₄.

После конъюгирования (реакция восстановления и необязательно блокирование), гликоконъюгаты могут быть очищены. Гликоконъюгаты могут быть очищены с применением диафильтрации и/или ионно-обменной хроматографии и/или гель-проникающей хроматографии. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты очищают с применением диафильтрации и/или ионно-обменной хроматографии и/или гель-проникающей хроматографии.

В одном варианте осуществления гликоконъюгаты подвергают стерильной фильтрации.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 11А согласно представленному изобретению получены конъюгированием с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) и содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В дополнительных таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 50 кДа до 400 кДа; от 50 кДа до 300 кДа; от 50 кДа до 200 кДа; от 50 кДа до 100 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа от; от 100 кДа до 300 кДа; от 100 кДа до 200 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1 500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа или от 200 кДа до 300 кДа.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 15000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А имеет молекулярную массу от 200 кДа до 10000 кДа. В еще других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа или от 2000 кДа до 8000 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 17 500 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 17500 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12 500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1 500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 700 кДа до 20000 кДа; от 700 кДа до 17500 кДа; от 700 кДа до 15000 кДа; от 700 кДа до 12500 кДа; от 700 кДа до 10000 кДа; от 700 кДа до 7500 кДа; от 700 кДа до 6000 кДа; от 700 кДа до 5000 кДа; от 700 кДа до 4 500 кДа; от 700 кДа до 4000 кДа; от 700 кДа до 3500 кДа; от 700 кДа до 3000 кДа; от 700 кДа до 2000 кДа; от 700 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 20000 кДа; от 1000 кДа до 17 500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 20000 кДа; от 2000 кДа до 17500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В одном варианте осуществления, указанный гликоконъюгат на основе серотипа 11А получают с применением восстановительного аминирования. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,3, 0,5, 0,6, 1,0, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, 3,0, 3,4, 3,8, 4,2, 4,6 или 5 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А содержит по меньшей мере 1,8, 2,2 или 2,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,6, 1, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, 3, 3,4, 3,8, 4,2 или 4,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А и менее, чем около 5 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,6, 1,0, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, или 3,0 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А, и менее, чем около 3,4 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,6, 1, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, или около 3,0 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А, и менее, чем около 3,3 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое из указанных выше количеств.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате на основе серотипа 11А к количеству ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате на основе серотипа 11А к количеству ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате на основе серотипа 11А к количеству ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9. В предпочтительном варианте осуществления, присутствие О-ацетильных групп определяют с применением ионного ВЭЖХ анализа. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате на основе серотипа 11А к количеству ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате на основе серотипа 11А к количеству ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение количества ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате на основе серотипа 11А к количеству ацетата в мМ на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9. В предпочтительном варианте осуществления, присутствие О-ацетильных групп определяют с применением ионного ВЭЖХ анализа.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А содержит по меньшей мере 0,2, 0,3 или 0,4 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 или 0,9 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А и менее, чем около 1,0 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 11А согласно изобретению содержит по меньшей мере 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, или 0,7 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А и менее, чем около 0,8 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое количество из указанных выше.

Еще одной характеристикой гликоконъюгатов на основе серотипа 11А согласно изобретению является количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), конъюгированных с сахаридом, которое может быть выражено в виде диапазона количества конъюгированных лизиновых остатков (степень конъюгации).

Замещение белка-носителя лизином за счет образования ковалентных связей между полисахаридом и лизином можно обнаружить с помощью аминокислотного анализа с применением стандартных способов, известных квалифицированному специалисту в данной области. Конъюгация в результате приводит к уменьшению количества лизиновых остатков по сравнению с их количеством в исходном белке CRM₁₉₇, который применяют для образования конъюгата.

В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 11А согласно изобретению составляет от 1 до 15, от 1 до 13, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 11А согласно изобретению составляет около 1, около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14 или около 15. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 11А согласно изобретению составляет от 1 до 6 или от 2 до 5. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 11А согласно изобретению также могут быть охарактеризованы соотношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В некоторых вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4 (например, около 0,2, около 0,3, около 0,4, около 0,5, около 0,6, около 0,7, около 0,8, около 0,9, около 1,0, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8, около 1,9, около 2,0, около 2,1, около 2,2, около 2,3, около 2,4, около 2,5, около 2,6, около 2,7, около 2,8, около 2,9, около 3,0, около 3,1, около 3,2, около 3,3, около 3,4, около 3,5, около 3,6, около 3,7, около 3,8, около 3,9 или около 4,0). В других вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,7 до 2,5, от 0,8 до 2,0, от 0,7 до 2,0, от 0,8 до 1,5, от 0,7 до 1,5, 0,7 до 1,4, от 0,8 до 1,4, от 0,7 до 1,45 или от 0,8 до 1,45. В дополнительных вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,6 (например, около 0,8, около 0,9 около 1,0, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5 или около 1,6). В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, указанные гликоконъюгаты на основе серотипа 11А получают с применением восстановительного аминирования.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 11А и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но тем не менее присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 11А согласно изобретению содержат менее чем около 50% свободного капсульного полисахарида серотипа 11А относительно общего количества капсульного полисахарида серотипа 11А, менее чем около 45% свободного сахарида, менее чем около 40% свободного сахарида, менее чем около 35% свободного сахарида, менее чем около 30% свободного сахарида, менее чем около 25% свободного сахарида, менее чем около 20% свободного сахарида, менее чем около 15% свободного сахарида, менее чем около 10% свободного сахарида, или менее чем около 5% свободного капсульного полисахарида серотипа 11А относительно общего количества капсульного полисахарида серотипа 11А. Предпочтительно, гликоконъюгат на основе серотипа 11А содержит менее чем 15% свободного сахарида, более предпочтительно менее чем 10% свободного сахарида, и еще более предпочтительно, менее чем 5% свободного сахарида.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 11А также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным массам (K_d). Среда для гель-проникающей хроматографии (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным массам конъюгата, как указано выше.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 30% гликоконъюгатов на основе серотипа 11А согласно изобретению имеет K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгатов на основе серотипа 11А согласно изобретению имеет K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 60% гликоконъюгатов на основе серотипа 11А согласно изобретению имеет K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 65% гликоконъюгатов на основе серотипа 11А согласно изобретению имеет K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

1.3.8. Гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 8

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 8 получают посредством активирования полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид может быть присоединен к аминогруппе белка-носителя непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, дающий тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, полученной за счет реакции с белком-носителем, активированным малеимидом (например, с применением GMBS), или галогенацетилированным белком-носителем (например, с применением йодацетамида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с применением CDAP) соединен с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с применением карбодиимида (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы белкового носителя. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других приемлемых способах применяют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгирование может задействовать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри Bethell et al., (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al., (1981) J. Chromatogr, 218:509-518) с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. При этом может происходить восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой белка.

В предпочтительных вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 8 согласно изобретению получают с применением восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида с образованием альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в индивидуальном гексасахаридном фрагменте, (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

Перед окислением, полисахарид серотипа 8 необязательно гидролизуют для того, чтобы уменьшить его вязкость. Можно применять механический или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с применением уксусной кислоты.

Стадия окисления может включать реакцию с периодатом. Для целей согласно представленному изобретению, термин "периодат" включает как периодат, так и йодную кислоту; термин также включает как метаиодат (IO₄^-), так и ортоиодат (IO₆^5-) и различные периодаты (например, натрия периодат и калия периодат). В одном варианте осуществления капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 8 окисляют в присутствии метаиодата, предпочтительно в присутствии натрия периодата (NalO₄). В другом варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа 8 окисляют в присутствии ортоиодата, предпочтительно в присутствии йодной кислоты.

После стадии окисления полисахарида, полисахарид, как указывалось, активируют и в данном документе ниже называют как "активированный полисахарид". Активированный полисахарид может быть очищенным и лиофилизированным (сублимационная сушка).

Активированный полисахарид и белок-носитель могут быть лиофилизированными (сублимационная сушка) либо независимо друг от друга (отдельная лиофилизация), либо вместе (совместная лиофилизация). В одном варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют совместно. В другом варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют независимо друг от друга.

В одном варианте осуществления лиофилизация происходит в присутствии невосстанавливающего сахара, приемлемые невосстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, рафинозу, стахиозу, мелецитозу, декстран, маннит, лактит и палатинит.

Вторая стадия процесса конъюгирования представляет собой восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (восстановительное аминирование), с применением восстанавливающего агента. Восстанавливающие агенты, которые являются приемлемыми, включают цианоборгидриды, такие как натрия цианоборгидрид, боран-пиридин, или боргидрид-обменная смола. В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид.

В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в водном растворителе, в другом варианте осуществления реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в растворителях ДМСО (диметилсульфоксиде) или в ДМФ (диметилформамиде). Растворители ДМСО или ДМФ можно применять для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизированы.

В одном варианте осуществления в реакции восстановления применяют от 0,1 до 3,0, от 0,15 до 2,0, от 0,2 до 1,0, или от 0,25 до 0,5 молярных эквивалентов натрия цианоборгидрида. В одном варианте осуществления в реакции восстановления применяют около 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,9 или 3,0 молярных эквивалентов натрия цианоборгидрида.

В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет собой натрия триацетоксиборгидрид. В дополнительном варианте осуществления в реакции восстановления применяют от 1,0 до 6,0 молярных эквивалентов, от 2,0 до 5,0 молярных эквивалентов или около 3,0 молярных эквивалентов натрия триацетоксиборгидрида.

По окончании реакции восстановления, в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, они могут быть блокированы приемлемым блокирующим агентом. В одном варианте осуществления данный блокирующий агент представляет собой натрия боргидрид (NaBH₄). В одном варианте осуществления блокирование достигается путем добавления к реакции восстановления от 0,5 до 5,0 молярными эквивалентов NaBH₄, например, около 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 или 3,0 молярных эквивалентов NaBH₄.

После конъюгирования (реакции восстановления и необязательно блокирования), гликоконъюгаты могут быть очищены. Гликоконъюгаты могут быть очищены с применением диафильтрации и/или ионно-обменной хроматографии и/или гель-проникающей хроматографии. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты очищают с применением диафильтрации и/или ионно-обменной хроматографии и/или гель-проникающей хроматографии.

В одном варианте осуществления гликоконъюгаты подвергают стерильной фильтрации.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 8 согласно представленному изобретению получены конъюгированием с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) и содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В дополнительных таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1 250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1 750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1 250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; или от 200 кДа до 400 кДа. В одном варианте осуществления, указанные гликоконъюгаты на основе серотипа 8 получают с применением восстановительного аминирования.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 8 имеет молекулярную массу от 50 кДа до 15000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 8 имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 8 имеет молекулярную массу от 200 кДа до 10000 кДа. В еще других вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 8 имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа или от 2000 кДа до 8000 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3 000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750 кДа до 12 500 кДа; от 750 кДа до 10000 кДа; от 750 кДа до 7500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4 000 кДа; от 750 кДа до 3 000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

8 дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа; от 3000 кДа до 10000 кДа; от 3000 кДа до 7500 кДа; от 3000 кДа до 5000 кДа; от 4000 кДа до 20000 кДа; от 4000 кДа до 15000 кДа; от 4000 кДа до 12500 кДа; от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа; или от 4000 кДа до 5000 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа; от 5000 кДа до 15000 кДа; от 5000 кДа до 10000 кДа или от 5000 кДа до 7500 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 6000 кДа до 20000 кДа; от 6000 кДа до 15000 кДа; от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 7000 кДа до 20000 кДа; от 7000 кДа до 15000 кДа; от 7000 кДа до 10000 кДа или от 7000 кДа до 8000 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат на основе серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 8000 кДа до 20000 кДа; от 8000 кДа до 15000 кДа; или от 8000 кДа до 10000 кДа.

В одном варианте осуществления, указанные гликоконъюгаты на основе серотипа 8 получают с применением восстановительного аминирования.

Еще одной характеристикой гликоконъюгатов на основе серотипа 8 согласно изобретению является количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), конъюгированных с сахаридом, которое может быть выражено в виде диапазона количества конъюгированных лизиновых остатков (степень конъюгации).

Замещение белка-носителя лизином за счет образования ковалентных связей между полисахаридом и лизином можно обнаружить с помощью аминокислотного анализа с применением стандартных способов, известных квалифицированному специалисту в данной области. В многочисленных вариантах осуществления, белок-носитель является ковалентно конъюгированным с активированным полисахаридом посредством аминной связи с одной или более е-аминогрупп лизиновых остатков на белке-носителе. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель содержит от 2 до 20 лизиновых остатков ковалентно конъюгированных с сахаридом. В других таких вариантах осуществления, белок-носитель содержит от 4 до 16 или от 6 до 14 лизиновых остатков ковалентно конъюгированных с сахаридом.

В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 8 согласно изобретению составляет от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 8 согласно изобретению составляет около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14 или около 15. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата на основе серотипа 8 согласно изобретению составляет от 4 до 16 или от 6 до 14. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇, который содержит 39 лизиновых остатков. В некоторых таких вариантах осуществления, от 4 до 16 или от 6 до 14 лизиновых остатков из 39 лизиновых остатков, содержащихся в CRM₁₉₇, могут быть ковалентно связаны с сахаридом. Другой способ выразить данный параметр состоит в том, что от около 10% до около 41% или от около 15% до около 36% лизиновых остатков CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом. В другом таком варианте осуществления, от 2 до 20 лизиновых остатков из 39 лизиновых остатков, содержащихся в CRM₁₉₇, могут быть ковалентно связаны с сахаридом. Другой способ выразить данный параметр состоит в том, что от около 5% до около 50% лизиновых остатков CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом. В некоторых таких вариантах осуществления, около 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, или 16 лизиновых остатков из 39 лизиновых остатков, содержащихся в CRM₁₉₇, ковалентно связаны с сахаридом.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 8 согласно изобретению также могут быть охарактеризованы соотношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В некоторых вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4,0 (например, около 0,2, около 0,3, около 0,4, около 0,5, около 0,6, около 0,7, около 0,8, около 0,9, около 1,0, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8, около 1,9, около 2,0, около 2,1, около 2,2, около 2,3, около 2,4, около 2,5, около 2,6, около 2,7, около 2,8, около 2,9, около 3,0, около 3,1, около 3,2, около 3,3, около 3,4, около 3,5, около 3,6, около 3,7, около 3,8, около 3,9 или около 4,0). В других вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,7 до 2,5. В дополнительных вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,5 (например, около 0,8, около 0,9 около 1,0, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4 или около 1,5). В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, указанные гликоконъюгаты на основе серотипа 8 получают с применением восстановительного аминирования.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 8 и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты на основе серотипа 8 согласно изобретению содержат менее чем около 50% свободного сахарида, менее чем около 45% свободного сахарида, менее чем около 40% свободного сахарида, менее чем около 35% свободного сахарида, менее чем около 30% свободного сахарида, менее чем около 25% свободного сахарида, менее чем около 20% свободного сахарида, менее чем около 15% свободного сахарида, менее чем около 10% свободного сахарида, или менее чем около 5% свободного сахарида по отношению к общему количеству сахарида серотипа 8. Предпочтительно, гликоконъюгат на основе серотипа 8 содержит менее чем 15% свободного сахарида, более предпочтительно менее чем 10% свободного сахарида, и еще более предпочтительно, менее чем 5% свободного сахарида.

Гликоконъюгаты на основе серотипа 8 также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным массам (K_d). Среда для гель-проникающей хроматографии (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным массам конъюгата. Для определения профиля распределения конъюгатов по размеру молекул применяют гель-проникающую хроматографию (SEC) в гравитационных колонках. Большие молекулы, не попадающие в поры наполнителя, элюируют быстрее, чем маленькие молекулы. Для сбора элюата из колонки применяют сборники для фракций. Фракции исследуют методом колориметрии с применением сахаридного анализа. Для определения K_d, колонки калибруют, чтобы установить фракцию, в которой молекулы совсем не удерживаются наполнителем (V₀), (K_d=0), и фракцию, в которой достигается максимальное удерживание молекул наполнителем (V_i), (K_d=1). Фракция, в которой достигается удерживание молекул образца (V_e), связана с K_d выражением K_d=(V_e-V₀)/(V_i-V₀).

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 40% гликоконъюгатов на основе серотипа 8 согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85% гликоконъюгатов на основе серотипа 8 согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 60% гликоконъюгатов на основе серотипа 8 согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 70% гликоконъюгатов на основе серотипа 8 согласно изобретению имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

В предпочтительном варианте осуществления, от 40% до 90% гликоконъюгатов на основе серотипа 8 имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 50% до 90% гликоконъюгатов на основе серотипа 8 имеют K_d, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 65% до 80% гликоконъюгатов на основе серотипа 8 имеют Kd, меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

1.4. Комбинации гликоконъюгатов согласно изобретению

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит любой из гликоконъюгатов, раскрытых в данном документе.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат, выбранный из группы, состоящей из гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 15В (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4 выше), гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 22F (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.2 выше), гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 33F (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.3 выше), гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 12F (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.5 выше), гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 10А (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.6 выше), гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 11А (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.7 выше) и гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 8 (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.8 выше).

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В, такой как гликоконъюгат из раздела 1.3.4 выше. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 22F, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.2 выше. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 33F, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.3 выше. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.5 выше. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 10А, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.6 выше. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 11А, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.7 выше. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 8, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.8 выше.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из двух серотипов S. Pneumoniae, выбранных из группы, состоящей из: 15В и 22F, 15В и 33F, 15В и 12F, 15В и 10А, 15В и 11А, 15В и 8, 22F и 33F, 22F и 12F, 22F и 10А, 22F и 11А, 22F и 8, 33F и 12F, 33F и 10А, 33F и 11А, 33F и 8, 12F и 10А, 12F и 11A, 12FH8, 10А и 11А, 10А и 8, и 11А и 8.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из трех следующих серотипов S. Pneumoniae:

15В и 22F и 33F,

15В и 22F и 12F,

15В и 22F и 10А,

15В и 22F и 11А,

15В и 22F и 8,

15В и 33F и 12F,

15В и 33F и 10А,

15В и 33F и 11А,

15В и 33F и 8,

15В и 12F и 10А,

15В и 12F и 11А,

15В и 12F и 8,

15В и 10А и 11А,

15В и 10A и 8,

15В и 11А и 8,

22F и 33F и 12F,

22F и 33F и 10А,

22F и 33F и 11А,

22F и 33F и 8,

22F и 12F и 10А,

22F и 12F и 11А,

22F и 12F и 8,

22F и 10А и 11А,

22F и 10А и 8,

22F и 11А и 8,

33F и 12F и 10А,

33F и 12F и 11А,

33F и 12F и 8,

33F и 10А и 11А,

33F и 10A и 8,

33F и 11А и 8,

12F и 10А и 11А,

12F и 10А и 8,

12F и 11А и 8, или

10А и 11А и 8.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из четырех следующих серотипов S. Pneumoniae:

15В и 22F и 33F и 12F,

15В и 22F и 33F и 10А,

15В и 22F и 33F и 11А,

15В и 22F и 33F и 8,

15В и 22F и 12F и 10А,

15В и 22F и 12F и 11А,

15В и 22F и 12F и 8,

15В и 22F и 10А и 11А,

15В и 22F и 10А и 8,

15В и 22F и 11А и 8,

15В и 33F и 12F и 10А,

15В и 33F и 12F и 11А,

15В и 33F и 12F и 8,

15В и 33F и 10А и 11А,

15В и 33F и 10А и 8,

15В и 33F и 11А и 8,

15В и 12F и 10А и 11А,

15В и 12F и 10А и 8,

15В и 12F и 11А и 8,

15В и 10А и 11А и 8,

22F и 33F и 12F и 10А,

22F и 33F и 12F и 11А,

22F и 33F и 12F и 8,

22F и 33F и 10А и 11А,

22F и 33F и 10А и 8,

22F и 33F и 11А и 8,

22F и 12F и 10А и 11А,

22F и 12F и 10А и 8,

22F и 12F и 11А и 8,

22F и 10A и 11А и 8,

33F и 12F и 10А и 11А,

33F и 12F и 10А и 8,

33F и 12F и 11А и 8,

33F и 10А и 11А и 8 или

12F и 10А и 11А и 8.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из пяти следующих серотипов S. pneumoniae:

15В и 22F и 33F и 12F и 10А,

15В и 22F и 33F и 12F и 11А,

15В и 22F и 33F и 12F и 8,

15В и 22F и 33F и 10А и 11А,

15В и 22F и 33F и 10А и 8,

15В и 22F и 33F и 11А и 8,

15В и 22F и 12F и 10А и 11А,

15В и 22F и 12F и 10А и 8,

15В и 22F и 12F и 11А и 8,

15B и 22F и 10А и 11А и 8,

15В и 33F и 12F и 10А и 11А,

15В и 33F и 12F и 10А и 8,

15В и 33F и 12F и 11А и 8,

15В и 33F и 10А и 11А и 8,

15В и 12F и 10А и 11А и 8,

22F и 33F и 12F и 10A и 11А,

22F и 33F и 12F и 10А и 8,

22F и 33F и 12F и 11А и 8,

22F и 33F и 10А и 11А и 8,

22F и 12F и 10А и 11А и 8 или

33F и 12F и 10А и 11А и 8.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из шести следующих серотипов S. pneumoniae:

15В и 22F и 33F и 12F и 10А и 11А,

15B и 22F и 33F и 12F и 10A и 8,

15B и 22F и 33F и 12F и 11A и 8,

15B и 22F и 33F и 10А и 11А и 8,

15B и 22F и 12F и 10А и 11А и 8,

15В и 33F и 12F и 10А и 11А и 8 or

22F и 33F и 12F и 10А и 11А и 8.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из семи следующих серотипов S. pneumoniae: 15В и 22F и 33F и 12F и 10А и 11А и 8.

В одном варианте осуществления гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 15В, 22F, 33F, 12F, 10А, 11А и/или 8 любой из иммуногенных композиций, определенных в данном разделе, являются такими, как раскрыто в разделах с 1.3.2 по 1.3.8 выше.

В одном варианте осуществления любая из иммуногенных композиций, указанных выше, дополнительно содержит гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F (такие как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше).

В одном варианте осуществления любая из иммуногенных композиций, указанных выше, дополнительно содержит гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F (такие как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше).

В одном варианте осуществления любая из иммуногенных композиций, указанных выше, дополнительно содержит гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 6А и 19А (таких как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше).

В одном варианте осуществления любая из иммуногенных композиций, указанных выше, дополнительно содержит гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 3 (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше).

Предпочтительно, все гликоконъюгаты из указанной выше иммуногенной композиции, независимо получены конъюгированием с белком-носителем.

В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 22F получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. Pneumoniae серотипа 33F получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 15В получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 12F получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 10А получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 11А получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 8 получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 6А и 19А получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 3 получены конъюгированием с CRM₁₉₇.

В одном варианте осуществления, все гликоконъюгаты любой из указанных выше иммуногенных композиций независимо получены конъюгированием с CRM₁₉₇.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F любой из указанных выше иммуногенных композиций независимо получены конъюгированием с PD.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 18С любой из указанных выше иммуногенных композиций получен конъюгированием с ТТ.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 19F любой из указанных выше иммуногенных композиций получен конъюгированием с DT.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14 и/или 23F любой из указанных выше иммуногенных композиций независимо получены конъюгированием с PD, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 18С получен конъюгированием с ТТ, и гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 19F получен конъюгированием с DT.

В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты на основе от 8 до 20 различных серотипов S. pneumoniae. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты на основе 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 различных серотипов. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты на основе 16 или 20 различных серотипов.

В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 14, 15, 16, 17, 18 или 19-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 16-валентную пневмококковую конъюгированую композицию. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 19-валентную пневмококковую конъюгированную композицию.

1. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В, такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4 выше.

2. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, указанному выше, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 22F, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.2 выше.

3. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1 или 2, указанному выше, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 33F, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.3 выше.

4. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2 или 3, указанному выше, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.5 выше.

5. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3 или 4, указанному выше, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 10А, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.6 выше.

6. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3, 4 или 5, указанному выше, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 11А, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.7 выше.

7. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3, 4, 5 или 6, указанному выше, по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 8, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.8 выше.

8. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, указанному выше, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F, такие как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше.

9. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, указанному выше, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F, такие как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше.

10. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9, указанному выше, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 6А и 19А, такие как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше.

11. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, указанному выше, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипа 3, такие как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит конъюгированные сахариды S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит конъюгированные сахариды S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты иммуногенной композиции согласно изобретению включают гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1,3,4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F. Водном варианте осуществления, гликоконъюгаты иммуногенной композиции согласно изобретению включают гликоконъюгаты на основе серотипов 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты иммуногенной композиции согласно изобретению включают гликоконъюгаты на основе серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты иммуногенной композиции согласно изобретению включают гликоконъюгаты на основе серотипов 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

Предпочтительно, все гликоконъюгаты иммуногенной композиции согласно изобретению (например, по любому из пунктов 1-11, указанных выше) независимо получены конъюгированием с белком-носителем.

В одном варианте осуществления по любому из пунктов 8-11, указанных выше, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F независимо получены конъюгированием с PD.

В одном варианте осуществления по любому из пунктов 8-11, указанных выше, гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 18С получен конъюгированием с ТТ.

В одном варианте осуществления по любому из пунктов 8-11, указанных выше, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 19F получен конъюгированием с DT.

В одном варианте осуществления по любому из пунктов 8-11, указанных выше, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F независимо получены конъюгированием с PD, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 18С получен конъюгированием с ТТ, и гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 19F получен конъюгированием с DT.

В одном варианте осуществления по любому из пунктов 1-11, указанных выше, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 22F получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по любому из пунктов 2-11, указанных выше, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 33F получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по любому из пунктов 3-11, указанных выше, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по любому из пунктов 4-11, указанных выше, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 12F получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по любому из пунктов 5-11, указанных выше, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 10А получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по любому из пунктов 6-11, указанных выше, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 11А получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по любому из пунктов 7-11, указанных выше, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 8 получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по любому из пунктов 8-11, указанных выше, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по любому из пунктов 9-11, указанных выше, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по любому из пунктов 10 или 11, указанных выше, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 6А и 19А получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по пункту 11, указанному выше, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 3 получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по пунктам 1-11, указанным выше, гликоконъюгаты иммуногенной композиции независимо получены конъюгированием с CRM₁₉₇.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит от 12 до 20 различных серотипов S. pneumoniae. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит гликоконъюгаты на основе 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 различных серотипов. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению содержит гликоконъюгаты на основе 16 или 20 различных серотипов. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция по пунктам 1-11, указанным выше, представляет собой 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция по пунктам 1-11, указанным выше, представляет собой 15, 16, 17, 18 или 19-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция по пунктам 1-11, указанным выше, представляет собой 16-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция по пунктам 1-11, указанным выше, представляет собой 19-валентную пневмококковую конъюгированную композицию.

После конъюгирования капсульного полисахарида с белком-носителем, гликоконъюгаты очищают (обогащают по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок) с применением различных способов. Данные способы включают операции концентрирования/диафильтрации, осаждения/элюирования, колоночную хроматографию, и глубинную фильтрацию (смотри, например, публикацию заявки на патент США №2007/0184072 или WO 2008/079653). После того, как выделенные гликоконъюгаты очищают, их смешивают для того, чтобы получить иммуногенную композицию согласно представленному изобретению.

1.5 Дополнительные комбинации гликоконъюгатов согласно изобретению

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 9V.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из двух серотипов S. pneumoniae, выбранных из группы, состоящей из: 9V и 4, 9V и 6В, 9V и 14, 9V и 18С, 9V и 19F, 9V и 23F.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из семи следующих серотипов S. pneumoniae: 9V, 4, 6В, 14, 18С, 19F и 23F.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из восьми следующих серотипов S. pneumoniae:

9V и 1 и 4 и 6В и 14 и 18С и 19F и 23F,

9V и 4 и 5 и 6В и 14 и 18С и 19F и 23F, или

9V и 4 и 6B и 7F и 14 и 18С и 19F и 23F.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из десяти следующих серотипов S. pneumoniae: 9V, 1, 5, 4, 6В, 7F, 14, 18С, 19F и 23F.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из одиннадцати следующих серотипов S. pneumoniae:

9V и 1 и 4 и 5 и 6А и 6В и 7F и 14 и 18С и 19F и 23F или

9V и 1 и 4 и 5 и 6В и 7F и 14 и 18С и 19А и 19F и 23F.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из двенадцати следующих серотипов S. pneumoniae: 9V, 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе каждого из тринадцати следующих серотипов S. pneumoniae: 9V, 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 2.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 17F.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 20.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15С.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 9N.

Предпочтительно, все гликоконъюгаты указанной выше иммуногенной композиции независимо получены конъюгированием с белком-носителем. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 9V получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 14, 18С, 19F и 23F получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 6А и 19А получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 3 получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 2 получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 17F получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 20 получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 15С получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления любой из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 9N получен конъюгированием с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, все гликоконъюгаты указанной выше иммуногенной композиции независимо получены конъюгированием с CRM₁₉₇. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 9V любой из указанных выше иммуногенных композиций независимо получен конъюгированием с PD.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F любой из указанных выше иммуногенных композиций независимо получены конъюгированием с PD.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 18С любой из указанных выше иммуногенных композиций получен конъюгированием с ТТ.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 19F любой из указанных выше иммуногенных композиций получен конъюгированием с DT.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14 и/или 23F любой из указанных выше иммуногенных композиций независимо получены конъюгированием с PD, гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 18С получен конъюгированием с ТТ, и гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 19F получен конъюгированием с DT.

В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция содержит от 7 до 25 различных серотипов S. pneumoniae. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты на основе 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 различных серотипов. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты на основе 16 или 20 различных серотипов.

В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 14, 15, 16, 17, 18 или 19-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 16-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 19-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 20-валентную пневмококковую конъюгированную композицию.

После конъюгирования капсульного полисахарида с белком-носителем, гликоконъюгаты очищают (обогащают по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок) с помощью различных способов. Данные способы включают операции концентрирования/диафильтрации, осаждения/элюирования, колоночную хроматографию, и глубинную фильтрацию (смотри, например, публикации заявок на патент США №2007/0184072 или WO 2008/079653. После того как отдельные гликоконъюгаты очищают, их смешивают для того, чтобы получить иммуногенную композицию согласно представленному изобретению.

1.6 Конкретные комбинации гликоконъюгатов согласно изобретению

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1.5, указанном выше, не содержит капсульный сахарид S. pneumoniae серотипа 9N.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1.5, указанном выше, не содержит капсульный сахарид S. pneumoniae серотипа 9А.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1,5, указанном выше, не содержит капсульный сахарид S. pneumoniae серотипа 9L.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1.5, указанном выше, не содержит капсульные сахариды S. pneumoniae серотипов 9N и 9А.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1.5, указанном выше, не содержит капсульные сахариды S. pneumoniae серотипов 9N и 9L.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1.5, указанном выше, не содержит капсульные сахариды S. pneumoniae серотипов 9А и 9L.

В одном варианте осуществления любая иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1.5, указанном выше, не содержит капсульные сахариды S. pneumoniae серотипов 9N, 9А и 9L.

2 Дозировка иммуногенной композиции

Количество гликоконъюгата(ов) в каждой дозе выбирают как количество, которое индуцирует иммунозащитный ответ без значительных, неблагоприятных побочных эффектов в типичных вакцинах. Такое количество будет варьироваться в зависимости от того, какой конкретный иммуноген применяют, и как он представлен.

2.1 Количество гликоконъюгата

Количество конкретного гликоконъюгата в иммуногенной композиции может быть рассчитано на основе общего содержания полисахарида для этого конъюгата (конъюгированного и неконъюгированного). Например, гликоконъюгат, содержащий 20% свободного полисахарида, содержит около 80 мкг конъюгированного полисахарида и около 20 мкг неконъюгированного полисахарида в 100 мкг дозы полисахарида. Количество гликоконъюгата может варьироваться в зависимости от серотипа пневмококка. Концентрация сахарида может быть определена с помощью анализа уроновой кислотой. "Иммуногенное количество" различных полисахаридных компонентов в иммуногенной композиции может отличаться, и каждая композиция может содержать около 1 мкг, около 2 мкг, около 3 мкг, около 4 мкг, около 5 мкг, около 6 мкг, около 7 мкг, около 8 мкг, около 9 мкг, около 10 мкг, около 15 мкг, около 20 мкг, около 30 мкг, около 40 мкг, около 50 мкг, около 60 мкг, около 70 мкг, около 80 мкг, около 90 мкг, или около 100 мкг любого конкретного полисахаридного антигена. Как правило, каждая доза будет содержать от 0,1 мкг до 100 мкг полисахарида данного серотипа, конкретно от 0,5 мкг до 20 мкг, более конкретно от 1,0 мкг до 10 мкг, и еще более конкретно от 2,0 мкг до 5,0 мкг. В качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах любого из диапазонов, указанных выше.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать около 1,0 мкг, около 1,2 мкг, около 1,4 мкг, около 1,6 мкг, около 1,8 мкг, около 2,0 мкг, около 2,2 мкг, около 2,4 мкг, около 2,6 мкг, около 2,8 мкг, около 3,0 мкг, около 3,2 кг, около 3,4 мкг, около 3,6 мкг, около 3,8 мкг, около 4,0 мкг, около 4,2 мкг, около 4,4 мкг, около 4,6 мкг, около 4,8 мкг, около 5,0 мкг, около 5,2 мкг, около 5,4 мкг, около 5,6 мкг, около 5,8 мкг или около 6,0 мкг полисахарида для каждого конкретного гликоконъюгата.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать около 1,1 мкг, около 1,2 мкг, около 1,3 мкг, около 1,4 мкг, около 1,5 мкг, около 1,6 мкг, около 1,7 мкг, около 1,8 мкг, около 1,9 мкг, около 2,0 мкг, около 2,1 мкг, около 2,2 мкг, около 2,3 мкг, около 2,4 мкг, около 2,5 мкг, около 2,6 мкг, около 2,7 мкг, около 2,8 мкг, около 2,9 мкг, или около 3,0 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15 В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и/или 33F.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать около 1,1 мкг, около 1,2 мкг, около 1,3 мкг, около 1,4 мкг, около 1,5 мкг, около 1,6 мкг, около 1,7 мкг, около 1,8 мкг, около 1,9 мкг, около 2,0 мкг, около 2,1 мкг, около 2,2 мкг, около 2.3 мкг, около 2,4 мкг, около 2,5 мкг, около 2,6 мкг, около 2,7 мкг, около 2,8 мкг, около 2,9 мкг, или около 3,0 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и/или 33F.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать около 2,0 мкг, около 2,2 мкг, около 2,4 мкг, около 2,6 мкг, около 2,8 мкг, около 3,0 мкг, около 3,2 мкг, около 3,4 мкг, около 3,6 мкг, около 3,8 мкг, около 4,0 мкг, около 4,2 мкг, около 4.4 мкг, около 4,6 мкг, около 4,8 мкг, около 5,0 мкг, около 5,2 мкг, около 5,4 мкг, около 5,6 мкг, около 5,8 мкг или около 6,0 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от около 1,5 мкг до около 3,0 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата на основе S. Pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от около 3,0 мкг до около 6,0 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от около 2,0 мкг до около 2,5 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата на основе S. Pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от около 4,0 мкг до около 4,8 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать около 2,2 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата на основе S. Pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и около 4,4 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В. В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от около 1,5 мкг до около 3,0 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата на основе S. Pneumoniae серотипов 1,3,4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от около 3 мкг до около 6 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от около 2,0 мкг до около 2,5 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата на основе S. Pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от около 4,0 мкг до около 4,8 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать около 2,2 мкг полисахарида каждого гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и около 4,4 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В. В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от около 1,5 мкг до около 3,0 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата на основе S. Pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от около 3,0 мкг до около 6,0 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от около 2,0 мкг до около 2,5 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата на основе S. Pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от около 4,0 мкг до около 4,8 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать около 2,2 мкг полисахарида каждого гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и около 4,4 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В. В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от около 1,5 мкг до около 3,0 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата на основе S. Pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от около 3,0 мкг до около 6,0 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от около 2,0 мкг до около 2,5 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата на основе S. Pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от около 4,0 мкг до около 4,8 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать около 2,2 мкг полисахарида каждого гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и около 4,4 мкг полисахарида для гликоконъюгатов на основе S. Pneumoniae серотипа 6В.

2.2 Количество носителя

Как правило, каждая доза будет содержать от 10 мкг до 150 мкг белка-носителя, конкретно от 15 мкг до 100 мкг белка-носителя, более конкретно от 25 мкг до 75 мкг белка-носителя, и еще более конкретно от 40 мкг до 60 мкг белка-носителя. В одном варианте осуществления, указанный белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать около 25 мкг около 26 мкг, около 27 мкг, около 28 мкг, около 29 мкг, около 30 мкг, около 31 мкг около 32 мкг, около 33 мкг, около 34 мкг, около 35 мкг, около 36 мкг, около 37 мкг около 38 мкг, около 39 мкг, около 40 мкг, около 41 мкг, около 42 мкг, около 43 мкг около 44 мкг, около 45 мкг, около 46 мкг, около 47 мкг, около 48 мкг, около 49 мкг около 50 мкг, около 51 мкг, около 52 мкг, около 53 мкг, около 54 мкг, около 55 мкг около 56 мкг, около 57 мкг, около 58 мкг, около 59 мкг, около 60 мкг, около 61 мкг около 62 мкг, около 63 мкг, около 64 мкг, около 65 мкг, около 66 мкг, около 67 мкг около 68 мкг, около 69 мкг, около 70 мкг, около 71 мкг, около 72 мкг, около 73 мкг около 74 мкг или около 75 мкг белка-носителя. В одном варианте осуществления указанный белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

3 Дополнительные антигены

Иммуногенная композиция согласно изобретению содержит конъюгированные S pneumoniae сахаридные антигены (гликоконъюгаты). Они также могут дополнительно включать антигены из других патогенов, конкретно из бактерии и/или вирусов. Предпочтительные дополнительные антигены выбирают из дифтерийного анатоксина (D), столбнячного анатоксина (Т), коклюшного антигене (Р), который, как правило, является бесклеточным (Ра), поверхностного антигене (HBsAg) вируса гепатита В (HBV), антигена вируса гепатита A (HAV) конъюгированного капсульного сахарида Haemophilus influenzae типа b (Hib) инактивированной полиомиелитной вакцины (IPV).

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласие изобретению содержит D-T-Pa. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит D-T-Pa-Hib, D-T-Pa-IPV или D-T-Pa-HBsAg. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласие изобретению содержит D-T-Pa-HBsAg-IPV или D-T-Pa-HBsAg-Hib. В одно№варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib.

Коклюшные антигены: Bordetella pertuss вызывают коклюш. Коклюшные антигены в вакцинах являются либо клеточными (целые клетки, в виде инактивированных клеток В.pertussis) или бесклеточными. Получение клеточных антигенов коклюша хорошо известно (например, он может быть получен путем термической инактивации фазы I культуры B.pertussis). Предпочтительно, однако, в изобретении применяют бесклеточные антигены. В случае применения бесклеточных антигенов, предпочтительно применять один, два или (предпочтительно) три следующих антигенов: (1) детоксифицированный коклюшный токсин (коклюшный анатоксин или РТ); (2) филаментный гемагглютинин (FHA); (3) пертактин (также известный как белок наружной мембраны 69 кДа). В соответствии с данным изобретением перед применением FHA и пертактин могут быть обработаны формальдегидом. РТ предпочтительно детоксифицирован обработкой формальдегидом и/или глутаральдегидом. Бесклеточные коклюшные антигены предпочтительно адсорбируют на одном или более адъювантов из соли алюминия. В качестве альтернативы, они могут быть добавлены в неадсорбированном состоянии. В случае добавления пертактина, предпочтительно, пертактин всегда адсорбирован на адъюванте из гидроксида алюминия. РТ и FHA могут быть адсорбированными на адъюванте из гидроксида алюминия или фосфата алюминия. Наиболее предпочтительно, каждый из РТ, FHA и пертактина адсорбирован на гидроксиде алюминия.

Инактивированная полиомиелитная вакцина (IPV): полиовирус вызывает полиомиелит. Вместо применения пероральной полиовирусной вакцины, согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения применяют IPV. Перед введением пациентам, полиовирусы должны быть инактивированы, и это может быть достигнуто путем обработки формальдегидом. Полиомиелит может быть вызван одним из трех типов полиовируса. Данные три типа похожи и вызывают одинаковые симптомы, но они являются антигенно различными, и заражение одним типом не защищает от заражения другим. Поэтому, согласно изобретению предпочтительно применять три полиовирусных антигена: полиовирус типа 1 (например, штамм Mahoney), полиовирус типа 2 (например, штамм MEF-1), и полиовирус типа 3 (например, штамм Saukett). Предпочтительно вирусы выращивают, очищают и инактивируют по-отдельности, и затем комбинируют, получая объемную трехвалентную смесь для применения по настоящему изобретению.

Дифтерийный анатоксин: Corynebacterium diphtheriae вызывает дифтерию. Дифтерийный токсин может быть обработан (например, с применением формалина или формальдегида) для устранения токсичности, сохраняя при этом способность индуцировать специфичные антитоксины после инъекции. Данные дифтерийные анатоксины применяют в вакцине против дифтерии. Предпочтительно дифтерийные анатоксины получают обработкой формальдегидом. Дифтерийный анатоксин может быть получен путем выращивания С.diphtheriae в среде для роста, с последующей обработкой формальдегидом, ультрафильтрацией и осаждением. Анатоксиновый материал затем может быть обработан согласно способу, включающему стерильную фильтрацию и/или диализ. Дифтерийный анатоксин предпочтительно адсорбируют на адъюванте на основе гидроксида алюминия. Столбнячный анатоксин: Clostridium tetani вызывает столбняк. Столбнячный токсин может быть обработан для того, чтобы получить защитный анатоксин. Анатоксины применяют в вакцинах против столбняка. Предпочтительно столбнячные анатоксины получают обработкой формальдегидом. Столбнячный анатоксин может быть получен путем выращивания С.tetani в среде для роста, с последующей обработкой формальдегидом, ультрафильтрацией и осаждением. Материал затем может быть обработан согласно способу, включающему стерильную фильтрацию и/или диализ.

Антигены вируса гепатита А: Вирус гепатита A (HAV) является одним из известных агентов, которые вызывают вирусный гепатит. Предпочтительно HAV компонент основан на инактивированном вирусе, и инактивация может быть достигнута за счет обработки формалином.

Вирус гепатита В (HBV) является одним из известных агентов, которые вызывают вирусный гепатит. Основным компонентом капсида является белок, известный как поверхностный антиген HBV, или, более общепринято, HBsAg, который, как правило, представляет собой полипептид из 226 аминокислот с молекулярной массой ~24 кДа. Все существующие вакцины против гепатита В содержат HBsAg, и когда данный антиген вводят здоровому вакцинируемому, он стимулирует продуцирование анти-HBsAg антител, которые защищают от HBV-инфекции. Для производства вакцины, HBsAg был получен двумя способами: очисткой антигена в дисперсной форме из плазмы носителей хронического гепатита В или экспрессией белка с применением рекомбинантных ДНК (например, рекомбинантной экспрессией в клетках дрожжей). В отличие от нативного HBsAg (то есть, такого как в очищенном продукте из плазмы), экспрессированный дрожжами HBsAg, как правило, является негликозилированным, и это представляет собой наиболее предпочтительную форму HBsAg для применения согласно настоящему изобретению.

Конъюгированные антигены Haemophilus influenzae типа b: Haemophilus influenzae типа b (Hib) вызывает бактериальный менингит. Hib вакцины, как правило, основаны на капсульном сахаридном антигене, получение которого хорошо известно. Hib сахарид может быть конъюгированным с белком-носителем для того, чтобы повысить его иммуногенность, особенно у детей. Типичные белки-носители представляют собой столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, CRM₁₉₇, D-протеин Н.influenzae, и комплекс белков внешней мембраны из менингококка серогруппы В. Сахаридный фрагмент конъюгата может содержать полноразмерный олирибосилрибитолфосфат (PRP), полученный из Hib бактерий, и/или фрагменты полноразмерного PRP. Hib конъюгаты могут быть адсорбированы или не адсорбированы на адъюванте на основе соли алюминия. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению дополнительно включает конъюгированный капсульный сахарид N.meningitidis серогруппы Y (MenY), и/или конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы С (MenC).

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению дополнительно включает конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы А (MenA), конъюгированный капсульный сахарид N.meningitidis серогруппы W135 (MenW135), конъюгированный капсульный сахарид N.meningitidis серогруппы Y (MenY), и/или конъюгированный капсульный сахарид N.meningitidis серогруппы С (MenC).

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению дополнительно включает конъюгированный капсульный сахарид N.meningitidis серогруппы W135 (MenW135), конъюгированный капсульный сахарид N.meningitidis серогруппы Y (MenY), и/или конъюгированный капсульный сахарид N.meningitidis серогруппы С (MenC).

4 Адъювант(ы)

В некоторых вариантах осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе может дополнительно содержать по меньшей мере два или три адъюванта. Термин "адъювант" относится к соединению или смеси, которая усиливает иммунный ответ на антиген. Адъюванты могут действовать в первую очередь в качестве системы доставки, в первую очередь в качестве иммуномодулятора или сильно проявлять оба указанных свойства. Приемлемые адъюванты включают адъюванты, приемлемые для применения у млекопитающих, включая людей.

Примеры известных приемлемых адъювантов типа систем доставки, которые можно применять в организме человека, включают, но не ограничиваются этим, алюминиевые квасцы (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидроксид алюминия), фосфат кальция, липосомы, эмульсии масло-в-воде, такие как MF59 (4,3% мас./об. сквалена, 0,5% мас./об. полисорбата 80 (Tween 80), 0,5% мас./об. сорбитана триолеата (Span 85)), эмульсии вода-в-масле, такие как Montanide, и микрочастицы или наночастицы поли(D,L-лактид-со-гликолида) (PLG).

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, содержит соли алюминия (алюминиевые квасцы) в качестве адъюванта (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидроксид алюминия). В предпочтительном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, содержит фосфат алюминия или гидроксид алюминия в качестве адъюванта. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, содержит от 0,1 мг/мл до 1 мг/мл или от 0,2 мг/мл до 0,3 мг/мл элементарного алюминия в виде фосфата алюминия. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, содержит около 0,25 мг/мл элементарного алюминия в виде фосфата алюминия.

Примеры известных приемлемых адъювантов иммуно-модуляторного типа, которые можно применять у людей включают, но не ограничиваются этим, сапониновые экстракты из коры дерева Aquilla (QS21, Quil А), агонисты TLR4, такие как MPL (монофосфориллипид A), 3DMPL (3-О-деацилированный MPL) или GLA-AQ, LT/CT мутанты, цитокины, такие как различные интерлейкины (например, IL-2, IL-12) или GM-CSF, и тому подобное.

Примеры известных приемлемых адъювантов иммуно-модуляторного типа, которые обладают как функцией доставки, так и функцией иммуномодуляции, которые можно применять у людей, включают, но не ограничиваются этим, ISCOMS (смотрите, например, Sjölander et al., (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 00/48630, WO 98/36772, WO 00/41720, WO 2006/134423 и WO 2007/026190) или GLA-EM, который представляет собой комбинацию агониста TLR4 и эмульсии масло-в-воде.

Для применений в ветеринарии, включая, но не ограничиваясь этим, эксперименты на животных, можно применять полный адъювант Фрейнда (CFA), неполный адъювант Фрейнда (IFA), Emulsigen, N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, называемый как nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипалмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (CGP 19835А, называемый как МТР-РЕ), и RIBI, который содержит три компонента, экстрагированные из бактерий, монофосфориллипид А, трегалозы димиколат и скелет клеточной стенки (MPL+TDM+CWS) в 2% эмульсии сквален/Tween 80.

Дополнительные примеры адъювантов для повышения эффективности пневмококковых вакцин, как раскрыто в данном документе, включают, но не ограничиваются этим: (1) эмульсионные композиции масло-в-воде (с или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как мурамилпептиды (смотри ниже) или компоненты стенки бактериальной клетки), такие как, например, (a) SAF, содержащий 10% сквален, 0,4% Tween 80, 5% плюроник-блокированный полимер L121, и thr-MDP либо микрофлуидизированный в субмикронной эмульсии, либо встряхиваемый для образования эмульсии с большим размером частиц, и (b) адъювантная система RIBI™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, МТ) содержащая 2% сквален, 0,2% Tween 80, и один или более компонентов стенки бактериальной клетки, такие как монофосфориллипид A (MPL), трегалозы димиколат (TDM), и скелет клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL+CWS (DETOX™); (2) можно применять сапониновые адъюванты, такие как QS21, STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), ABISCO® (Isconova, Sweden), или ISCOMATRIX® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia) или частицы, образованные ими, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы), в которых ISCOMS может быть лишен дополнительного детергента (например, WO 00/07621); (3) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (4) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (например, WO 99/44636)), интерфероны (например, гамма-интерферон), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF), и т.д.; (5) монофосфориллипид A (MPL) или 3-O-деацилированный MPL (3dMPL) (смотрите, например, GB-2220221, ЕР 0689454), необязательно в основном при отсутствии алюминиевых квасцов при применении с пневмококковыми сахаридами (смотрите, например, WO 00/56358); (6) комбинации 3dMPL с, например, QS21 и/или эмульсиями масло-в-воде (смотрите, например, ЕР 0835318, ЕР0735898, ЕР 0761231); (7) полиоксиэтиленовые простые эфиры или полиоксиэтиленовые сложные эфиры (смотрите, например, WO 99/52549); (8) поверхностно-активное вещество - сложный эфир полиоксиэтилена и сорбитана в комбинации с октоксинолом (например, WO 01/21207) или поверхностно-активное вещество - полиоксиэтиленалкиловый простой эфир или сложный эфир в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным неионным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол (например, WO 01/21152); (9) сапонин и иммуностимулирующий олигонуклеотид (например, CpG олигонуклеотид) (например, WO 00/62800); (10) иммуностимулятор и частица соли металла (смотрите, например, WO 00/23105); (11) сапонин и эмульсия масло-в-воде (например, WO 99/11241); (12) сапонин (например, QS21)+3dMPL+IM2 (необязательно+стерол) (например, WO 98/57659); (13) другие вещества, которые действуют в качестве иммуностимулирующих агентов, для повышения эффективности композиции. Мурамилпептиды включают N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-25 ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглуглутарнинил-L-аланин-2-(1'-2'-дипалмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин МТР-РЕ), и т.д. В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуногенная композиция, как раскрыто в данном документе, содержит CpG олигонуклеотид в качестве адъюванта. CpG олигонуклеотид, как использовано в данном документе, означает иммуностимулирующий CpG олигодезоксинуклеотид (CpG ODN), и, соответственно, данные термины используются взаимозаменяемо, если не указано иное.

Иммуностимулирующие CpG олигодезоксинуклеотиды содержат один или более иммуностимулирующих CpG мотивов, которые представляют собой неметилированные цитозин-гуаниновые динуклеотиды, необязательно в определенных предпочтительных основных контекстах. Статус метилирования иммуностимулирующего мотива CpG, как правило, относится к цитозиновому остатку в динуклеотиде. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один неметилированный CpG динуклеотид, представляет собой олигонуклеотид, который содержит 5' неметилированный цитозин, связанный фосфатной связью с 3' гуанином, и который активирует иммунную систему посредством связывания с Toll-подобным рецептором 9 (TLR-9). В другом варианте осуществления иммуностимулирующий олигонуклеотид может содержать один или более метилированный CpG динуклеотид, который активирует иммунную систему посредством TLR9, но не так сильно, как если бы CpG мотив(ы) был/были неметилированным(ми).

CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут содержать один или более палиндром, который, в свою очередь, может включать CpG динуклеотид. CpG олигонуклеотиды были описаны в ряде выданных патентов, опубликованных патентных заявок и других публикаций, в том числе патентах США №№6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; и 6,339,068.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуногенная композиция, как раскрыто в данном документе, содержит любой из CpG олигонуклеотидов, описанных со страницы 3, строка 22, до страницы 12, строка 36, WO 2010/125480.

Идентифицированы различные классы CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов. Они называются А, В, С и Р классы, и описаны более подробно со страницы 3, строка 22, до страницы 12, строка 36, WO 2010/125480. Способы, согласно изобретению, охватывают применение данных различных классов CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуногенная композиция, как раскрыто в данном документе, содержит олигонуклеотид CpG класса А. Предпочтительно, олигонуклеотид CpG "класса А" согласно изобретению имеет следующую последовательность нуклеиновых кислот: 5' GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 1). Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов А-класса включают: 5' G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3' (SEQ ID NO: 2); где "*" обозначает фосфоротиоатную связь и "_" обозначает фосфодисложноэфирную связь.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуногенная композиция, как раскрыто в данном документе, содержит олигонуклеотид CpG класса В. В одном варианте осуществления, CpG олигонуклеотид для применения в представленном изобретении представляет собой олигонуклеотид CpG класса В, представленный по меньшей мере формулой:

5' X₁X₂CGX₃X₄ 3',

где X₁, Х₂, Х₃, и Х₄ представляют собой нуклеотиды. В одном варианте осуществления, Х₂ представляет собой аденин, гуанин, или тимин. В другом варианте осуществления, Х₃ представляет собой цитозин, аденин, или тимин. Последовательности олигонуклеотида CpG класса В согласно изобретению представляют собой те, которые в общих чертах описаны выше, а также раскрыты в wo 96/02555, wo 98/18810 и патентах США №№6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116 и 6,339,068. Примеры последовательностей включают, но не ограничиваются этим, последовательности, раскрытые в данных последних заявках и патентах.

В одном варианте осуществления, олигонуклеотид CpG "В-класса" согласно изобретению имеет следующую последовательность нуклеиновых кислот:

5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (SEQ ID NO: 3), или

5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3' (SEQ ID NO: 4), или

5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 5), или

5' TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 6), или

5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3' (SEQ ID NO: 7).

В любой из данных последовательностей все связи могут быть фосфортиоатными связями. В другом варианте осуществления, в любой из данных последовательностей одна или более связей могут быть фосфодисложноэфирными, предпочтительно из "С" и "G" мотива CpG, образуя полумягкий CpG олигонуклеотид. В какой-либо из данных последовательностей, этил-уридин или галоген может замещать 5' Т; примеры галоген-замещений включают, но не ограничиваются этим, бром-уридин или йод-уридин замещения. Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов В-класса включают:

5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 8), или

5' t*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 9), или

5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 10), или

5' t*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 11), или

5' t*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3' (SEQ ID NO: 12).

где "*" обозначает фосфортиоатную связь.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуногенная композиция, как раскрыто в данном документе, содержит олигонуклеотид CpG класса С. В одном варианте осуществления, олигонуклеотиды CpG "С-класса", согласно изобретению, имеют следующую последовательность нуклеиновых кислот:

5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 13), или

5' TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 14), или

5' TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 15), или

5' TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 16), или

5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 17), или

5' TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 18), или

5' TCGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 19), или

5' TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 20), или

5' TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 21), или

5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 22), или

5' TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3' (SEQ ID NO: 23), или

5' TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3' (SEQ ID NO: 24), или

5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3' (SEQ ID NO: 25).

В любой из данных последовательностей, все связи могут быть фосфортиоатными связями. В другом варианте осуществления, в любой из данных последовательностей, одна или более из связей могут быть фосфодисложноэфирными, предпочтительно из "С" и "G" мотива CpG, образуя полумягкий CpG олигонуклеотид.

Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов С-класса включают:

5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 26), или

5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 27), или

5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 28), или

5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 29), или

5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 30), или

5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 31), или

5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 32), или

5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 33), или

5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 34), или

5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 35), или

5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 36), или

5' T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 37), или

5' T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3' (SEQ ID NO: 38)

где "*" обозначает фосфортиоатную связь и "_" обозначает фосфодисложноэфирную связь.

В любой из данных последовательностей, этил-уридин или галоген может замещать 5' Т; примеры галоген-замещений включают, но не ограничиваются этим, бром-уридин или йод-уридин замещения.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуногенная композиция, как раскрыто в данном документе, содержит олигонуклеотид CpG класса Р. В одном варианте осуществления, CpG олигонуклеотид для применения в представленном изобретении представляет собой олигонуклеотид CpG класса Р, содержащий 5' TLR домен активации и по меньшей мере две палиндромные области, где одна палиндромная область представляет собой 5' палиндромную область по меньшей мере из 6 нуклеотидов в длину и связанную с 3' палиндромной областью по меньшей мере из 8 нуклеотидов в длину, или непосредственно, или посредством спейсера, где олигонуклеотид включает по меньшей мере динуклеотид YpR. В одном варианте осуществления, указанный олигонуклеотид не представляет собой T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 27). В одном варианте осуществления олигонуклеотид CpG класса Р включает по меньшей мере неметилированный CpG динуклеотид. В другом варианте осуществления TLR домен активации представляет собой TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT, или TTTT. В еще другом варианте осуществления TLR домен активации находится в пределах 5' палиндромной области. В другом варианте осуществления TLR домен активации находится непосредственно в 5' палиндромной области.

В одном варианте осуществления, олигонуклеотиды CpG "Р-класса" согласно изобретению имеют следующую последовательность нуклеиновых кислот: 5' TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 39).

В указанных последовательностях, все связи могут быть фосфортиоатными связями. В другом варианте осуществления, одна или более связей могут быть фосфодисложноэфирными, предпочтительно из "С" и "G" мотива CpG, образуя полумягкий CpG олигонуклеотид. В какой-либо из данных последовательностей, этил-уридин или галоген может замещать 5' Т; примеры галоген-замещений включают, но не ограничиваются этим, бром-уридин или йод-уридин замещения. Неограничивающий пример олигонуклеотидов Р-класса включает: 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 40)

где "*" обозначает фосфортиоатную связь и "_" обозначает фосфодисложноэфирную связь.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид включает по меньшей мере фосфортиоатную связь. В другом варианте осуществления все межнуклеотидные связи олигонуклеотида являются фосфортиоатными связями. В другом варианте осуществления олигонуклеотид включает по меньшей мере фосфодисложноэфирно-подобную связь. В другом варианте осуществления фосфодисложноэфирно-подобная связь представляет собой фосфодисложноэфирную связь. В другом варианте осуществления липофильная группа конъюгирована с олигонуклеотидом. В одном варианте осуществления липофильная группа представляет собой холестерин.

В одном варианте осуществления, все межнуклеотидные связи олигонуклеотидов CpG, раскрытых в данном документе, представляют собой фосфодисложноэфирные связи ("мягкие" олигонуклеотиды, как описано в WO 2007/026190). В другом варианте осуществления, олигонуклеотиды CpG, согласно изобретению, оказываются устойчивыми к разрушению (например, являются стабилизированными). "Стабилизированный олигонуклеотид" означает олигонуклеотид, который относительно устойчив к разложению in vivo (например, с участием экзо- или эндо-нуклеазы). Стабилизация нуклеиновой кислоты может быть осуществлена за счет модификаций скелета. Олигонуклеотиды, имеющие фосфортиоатные связи, обеспечивают максимальную активность и защиту олигонуклеотиду от разрушения внутриклеточными экзо- и эндо-нуклеазами. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут иметь химерный скелет, который содержит комбинации фосфодисложноэфирных и фосфортиоатных связей. Для целей настоящего изобретения, химерный скелет означает частично стабилизированный скелет, где по меньшей мере одна межнуклеотидная связь является фосфодисложноэфирной или фосфодисложноэфирно-подобной, и где по меньшей мере одна другая межнуклеотидная связь представляет собой стабилизированную межнуклеотидную связь, где по меньшей мере одна фосфодисложноэфирная или фосфодисложноэфирно-подобная связь отличается от по меньшей мере одной стабилизированной связи. Когда фосфодисложноэфирная связь преимущественно находится в пределах мотива CpG, такие молекулы называются "полумягкими", как описано в WO 2007/026190.

Другие модифицированные олигонуклеотиды включают комбинации из фосфодисложноэфирных, фосфортиоатных, метилфосфонатных, метилфосфортиоатных, фосфордитиоатных, и/или п-этокси связей. Смешанный скелет, модифицированный ODN, может быть синтезирован, как описано в WO 2007/026190.

Размер олигонуклеотида CpG (то есть, количество нуклеотидных остатков по всей длине олигонуклеотида) также может внести свой вклад в стимулирующую активность олигонуклеотида. Для облегчения поступления в клетки, олигонуклеотид CpG согласно изобретению предпочтительно имеет минимальную длину из 6 нуклеотидных остатков. Олигонуклеотиды любого размера, содержащие более чем 6 нуклеотидов (даже длиной во много тысяч пар нуклеотидов) способны индуцировать иммунный ответ, если присутствует достаточное количество иммуностимулирующих мотивов, поскольку более крупные олигонуклеотиды разрушаются внутри клеток. В определенных вариантах осуществления, олигонуклеотиды CpG имеют длину от 6 до 100 нуклеотидов, предпочтительно от 8 до 30 нуклеотидов. В важных вариантах осуществления, нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды, согласно изобретению, не являются плазмидами или векторами экспрессии.

В одном варианте осуществления, CpG олигонуклеотид, раскрытый в данном документе, содержит замещения или модификации, такие как в основаниях и/или сахарах, как описано в параграфах 134-147 WO 2007/026190. В одном варианте осуществления, CpG олигонуклеотид согласно настоящему изобретению является химически модифицированным. Примеры химических модификаций известны квалифицированному специалисту и описаны, например, в Uhlmann et al., (1990) Chem. Rev. 90:543; S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke et al., (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129; и Hunziker et al., (1995) Mod. Synth. Способы 7:331-417. Олигонуклеотид в соответствии с изобретением может содержать одну или более модификаций по сравнению с олигонуклеотидом с такой же последовательностью, который содержится в природной ДНК или РНК, где каждая модификация расположена в конкретном фосфодисложноэфирном межнуклеозидном мостике, и/или в определенном β-D-рибозном фрагменте, и/или в конкретном положении природного нуклеозидного основания.

В некоторых вариантах осуществления согласно изобретению, CpG-содержащие нуклеиновые кислоты могут быть просто смешаны с иммуногенными носителями в соответствии со способами, известными квалифицированным специалистам в данной области (смотрите, например, WO 03/024480).

В конкретном варианте осуществления согласно представленному изобретению, любая иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, содержит от 2 мкг до 100 мг CpG олигонуклеотида, предпочтительно от 0,1 мг до 50 мг CpG олигонуклеотида, предпочтительно от 0,2 мг до 10 мг CpG олигонуклеотида, предпочтительно от 0,3 мг до 5 мг CpG олигонуклеотида, предпочтительно от 0,3 мг до 5 мг CpG олигонуклеотида, более предпочтительно от 0,5 до 2 мг CpG олигонуклеотида, более предпочтительно от 0,75 до 1,5 мг CpG олигонуклеотида. В предпочтительном варианте осуществления, какая-либо иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, содержит около 1 мг CpG олигонуклеотида.

5. Состав

Иммуногенная композиция согласно изобретению может быть получена в жидкой форме (то есть, в виде растворов или суспензий) или в лиофилизированной форме. Жидкие препараты преимущественно можно вводить непосредственно из их упакованной формы и, таким образом, они идеально подходят для инъекций, так как, в отличие от лиофилизированных композиций согласно изобретению, отсутствует необходимость их восстановления в водной среде. Приготовление иммуногенной композиции согласно представленному изобретению можно осуществлять с применением способов, общепринятых в данной области. Например, для получения композиции можно объединить отдельные пневмококковые конъюгаты с физиологически приемлемым носителем. Примеры таких носителей включают, но не ограничиваются этим, воду, буферный солевой раствор, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтилен гликоль) и растворы декстрозы.

Согласно представленному изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая любую комбинацию гликоконъюгатов, раскрытых в данном документе, и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, или разбавитель.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению находится в жидкой форме, предпочтительно в водной жидкой форме.

Иммуногенная композиция согласно изобретению может содержать одно или более из буфера, соли, двухвалентного катиона, неионогенного детергента, криопротектора, такого как сахар, и антиоксиданта, такого как ловушка свободного радикала, или хелатирующего агента, или любую из нескольких их комбинаций. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит буфер. В одном варианте осуществления, указанный буфер имеет pKa от около 3,5 до около 7,5. В некоторых вариантах осуществления, буфер представляет собой фосфатный, сукцинатный, гистидиновый или цитратный буфер. В определенных вариантах осуществления, буфер представляет собой сукцинатный буфер с конечной концентрацией от 1 мМ до 10 мМ. В одном конкретном варианте осуществления, конечная концентрация сукцинатного буфера составляет около 5 мМ.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит соль. В некоторых вариантах осуществления, соль выбирают из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации. В одном конкретном варианте осуществления, соль представляет собой хлорид натрия. В одном конкретном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит хлорид натрия в количестве 150 мМ.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит поверхностно-активное вещество. В одном варианте осуществления, поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20 (TWEEN™20), полисорбата 40 (TWEEN™40), полисорбата 60 (TWEEN™60), полисорбата 65 (TWEEN™65), полисорбата 80 (TWEEN™80), полисорбата 85 (TWEEN™85), TRITON™ N-101, TRITON™ X-100, окстоксинола 40, ноноксинола-9, триэтаноламина, триэтаноламинполипептидолеата, полиоксиэтилен-660 гидроксистеарата (PEG-15, Solutol Н 15), полиоксиэтилен-35-рицинолеата (CREMOPHOR® EL), соевого лецитина и полоксамера. В одном конкретном варианте осуществления, поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80. В некоторых указанных вариантах осуществления, конечная концентрация полисорбата 80 в препарате составляет по меньшей мере от 0,0001% до 10% полисорбата 80 (масс./масс.). В некоторых указанных вариантах осуществления, конечная концентрация полисорбата 80 в препарате составляет по меньшей мере от 0,001% до 1% полисорбата 80 (масс./масс.). В некоторых указанных вариантах осуществления, конечная концентрация полисорбата 80 в препарате составляет по меньшей мере от 0,01% до 1% полисорбата 80 (масс./масс.). В других вариантах осуществления, конечная концентрация полисорбата 80 в препарате составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% или 0,1% полисорбата 80 (масс./масс.). В другом варианте осуществления, конечная концентрация полисорбата 80 в препарате составляет 1% полисорбата 80 (масс./масс.).

В определенных вариантах осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению имеет рН от 5,5 до 7,5, более предпочтительно рН от 5,6 до 7,0, еще более предпочтительно рН от 5,8 до 6,0.

В одном варианте осуществления, согласно представленному изобретению предложен контейнер, наполненный любой иммуногенной композицией, раскрытой в данном документе. В одном варианте осуществления, контейнер выбирают из группы, состоящей из флакона, шприца, колбы, ферментера, биореактора, мешка, банки, ампулы, картриджа и одноразовой ручки. В определенных вариантах осуществления, контейнер является силиконизированным.

В одном варианте осуществления, контейнер согласно представленному изобретению изготовлен из стекла, металлов (например, стали, нержавеющей стали, алюминия и т.д.) и/или полимеров (например, термопластов, эластомеров, термопластичных эластомеров). В одном варианте осуществления, контейнер согласно представленному изобретению изготовлен из стекла. В одном варианте осуществления, согласно представленному изобретению предложен шприц, наполненный любой иммуногенной композицией, раскрытой в данном документе. В определенных вариантах осуществления, шприц является силиконизированным и/или изготовлен из стекла.

Типичная доза для инъекций иммуногенной композиции согласно изобретению имеет объем от 0,1 мл до 2 мл, более предпочтительно от 0,2 мл до 1 мл, еще более предпочтительно около 0,5 мл.

Поэтому контейнер или шприц, как определено выше, наполняют любой иммуногенной композицией, определенной в данном документе, объемом от 0,1 мл до 2 мл, более предпочтительно от 0,2 мл до 1 мл, еще более предпочтительно около 0,5 мл.

6. Применение иммуногенных композиций согласно изобретению

В одном варианте осуществления, иммуногенные композиции, раскрытые в данном документе, предназначены для применения в качестве лекарственного средства.

Иммуногенную композицию, описанную в данном документе, можно применять в различных терапевтических или профилактических способах для предупреждения, лечения или ослабления бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта. В частности, иммуногенную композицию, описанную в данном документе, можно применять для предупреждения, лечения или ослабления инфекции, заболевания или состояния у субъекта, вызванных S. Pneumoniae.

Таким образом, в одном аспекте, согласно изобретению предложен способ предупреждения, лечения или ослабления инфекции, заболевания или состояния, связанного с S. Pneumoniae у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции согласно изобретению.

В некоторых таких вариантах осуществления, инфекция, заболевание или состояние является выбранным из группы, состоящей из пневмонии, синусита, отита среднего уха, острого отита среднего уха, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, целлюлит, инфекции мягких тканей и абсцесса мозга.

В одном варианте осуществления, согласно изобретению предложен способ индуцирования иммунного ответа к S. pneumoniae у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции согласно изобретению.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, предназначена для применения в качестве вакцины. В таких вариантах осуществления иммуногенную композицию, описанную в данном документе, можно применять для предупреждения инфекции, вызванной S. pneumonia, у субъекта. Таким образом, в одном аспекте, согласно изобретению предложен способ предупреждения инфекции, вызванной S. pneumonia, у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции согласно изобретению. В некоторых таких вариантах осуществления, инфекция является выбранной из группы, состоящей из пневмонии, синусита, отита среднего уха, острого отита среднего уха, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, целлюлита, инфекции мягких тканей и абсцесса мозга. В одном аспекте, субъект, подлежащий вакцинации, представляет собой млекопитающее, такое как человек, кошка, овца, свинья, лошадь, корова или собака. В одном аспекте, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, предназначена для применения в способе предупреждения, лечения или ослабления инфекции, заболевания или состояния, связанного с S. pneumonia, у субъекта. В некоторых таких вариантах осуществления, инфекцию, заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из пневмонии, синусита, отита среднего уха, острого отита среднего уха, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, целлюлита, инфекции мягких тканей и абсцесса мозга.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, предназначена для применения в качестве вакцины. В таких вариантах осуществления иммуногенную композицию, описанную в данном документе, можно применять для предупреждения инфекции, вызванной S. pneumoniae, у субъекта. Таким образом в одном аспекте, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе предназначена для применения в способе предупреждения инфекции, вызванной S. pneumoniae, у субъекта. В некоторых таких вариантах осуществления, инфекцию выбирают из группы, состоящей из пневмонии, синусита, отита среднего уха, острого отита среднего уха, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, целлюлита, инфекции мягких тканей и абсцесса мозга. В одном аспекте, субъект, подлежащий вакцинации, представляет собой млекопитающее, такое как человек, кошка, овца, свинья, лошадь, корова или собака. Иммуногенную композицию согласно представленному изобретению можно применять для защиты или лечения человека, страдающего от пневмококковой инфекции, путем введения иммуногенной композиции с применением системного введения или введения через слизистую. В одном варианте осуществления, иммуногенную композицию, раскрытую в данном документе, вводят внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным или подкожным способами. В одном варианте осуществления, иммуногенную композицию, раскрытую в данном документе, вводят с применением внутримышечной, внутрибрюшинной, внутрикожной или подкожной инъекции. В одном варианте осуществления, иммуногенную композицию, раскрытую в данном документе, вводят с применением внутримышечной или подкожной инъекции.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 15В (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при введении субъекту, способна индуцировать образование антител, способных к связыванию с S. pneumoniae серотипа 15В, 15А и/или 15С как измерено с применением стандартного ИФА анализа. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при введении субъекту, способна индуцировать образование антител, способных к связыванию с S. pneumoniae серотипа 15В и 15С, как измерено с применением стандартного ИФА анализа. В ИФА (твердофазном иммуноферментном анализе) способе, антитела из сывороток вакцинированных субъектов инкубируют с полисахаридами, которые адсорбированы на твердом носителе. Связанные антитела детектировали с применением вторичных фермент-конъюгированных антител обнаружения. В одном варианте осуществления указанный стандартный ИФА анализ представляет собой стандартизированный (ВОЗ) ИФА анализ как это определено в учебном пособии ВОЗ 'Training manual for Enzyme linked immunosorbent assay for the quantitation of Streptococcus pneumoniae serotype specific IgG (Pn PS ELISA).' (доступно по ссылке: http://www.vaccine.uab.edu/ELISA%20protocol.pdf; 31.03. 2014).

С помощью ИФА определяют типы специфических антикапсульных IgG антител к капсульному полисахариду (PS) S. pneumoniae, присутствующие в сыворотке крови человека. При добавлении сыворотки крови человека в различных разбавлениях в планшеты для микротитрования, покрытые тип-специфическим капсульным PS, антитела, специфичные для этого капсульного PS, связываются с планшетами для микротитрования. Антитела, связанные с планшетами, детектируют с применением антитела козы к IgG человека, меченного щелочной фосфатазой, с последующим применением п-нитрофенилфосфатного субстрата. Оптическая плотность окрашенного конечного продукта пропорциональна количеству анти-капсульного PS антитела, присутствующего в сыворотке. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше) способна индуцировать образование IgG антител у человека, которые способны связываться с полисахаридом S. pneumoniae серотипа 15В при концентрации по меньшей мере 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 или 0,5 мкг/мл, как определено с помощью ИФА анализа. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), способна индуцировать образование IgG антител у человека, которые способны связываться с полисахаридом S. pneumoniae серотипа 15С при концентрации по меньшей мере 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 или 0,5 мкг/мл, как определено с помощью ИФА анализа. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), способна индуцировать образование IgG антител у человека, которые способны связываться с полисахаридом S. pneumoniae серотипов 15В и 15С при концентрации по меньшей мере 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 или 0,5 мкг/мл, как определено с помощью ИФА анализа. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при введении субъекту, способна индуцировать образование антител, способных к уничтожению S. pneumoniae серотипа 15В в анализе опсонофагоцитирующей активности, как раскрыто в данном документе (например, в ОРА анализе Примера 12).

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при исследовании в ОРА анализе, как раскрыто в данном документе (например, в ОРА анализе Примера 12), имеет ОРА титр больший, чем ОРА титр, полученный с неконъюгированным нативным капсульным полисахаридом S. pneumoniae серотипа 15В.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при введении субъекту, способна индуцировать образование антител, способных к уничтожению S. pneumoniae серотипа 15С в анализе опсонофагоцитирующей активности, как раскрыто в данном документе (например, в ОРА анализе Примера 12). В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при исследовании в ОРА анализе, как раскрыто в данном документе (например, в ОРА анализе примера 12), имеет ОРА титр больший, чем ОРА титр, полученный с неконъюгированным нативным капсульным полисахаридом S. pneumoniae серотипа 15В.

Пневмококковый анализ опсонофагоцитирующей активности (ОРА), с помощью которого измеряют уничтожение S. pneumoniae клеток с применением фагоцитарных эффекторных клеток в присутствии функционального антитела и комплемента, как считается, является важным методом для оценки эффективности пневмококковых вакцин.

Анализ опсонофагоцитирующей активности (ОРА) можно проводить путем совместного инкубирования смеси клеток Streptococcus pneumoniae, инактивированной при нагревании сыворотки человек, которую следует исследовать, дифференцированных HL-60 клеток (фагоцитов) и источника экзогенного комплемента (например, комплемента детеныша кролика). Опсонофагоцитоз протекает в процессе инкубирования, и бактериальные клетки, которые покрываются антителом и комплементом, погибают при опсонофагоцитозе. Колониеобразующие единицы (КОЕ) выживших бактерий, которые избежали опсонофагоцитоза, определяют путем высевания смеси для анализа. ОРА титр определяют как обратное разведение, которое в результате приводит к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки. ОРА титр интерполируют по двум разведениям, при которых выполняется данный 50% предел уничтожения.

Конечная точка титра 1:8 или более считается положительным результатом в данном типе ОРА уничтожения.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), способна вызывать титр по меньшей мере 1:8 против S. pneumoniae серотипа 15В у по меньшей мере 50% субъектов как определено согласно анализу опсонофагоцитирующей активности уничтожения (ОРА). В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше) способна вызывать титр по меньшей мере 1:8 против S. pneumoniae серотипа 15В у по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, или по меньшей мере 93% субъектов, как определено согласно анализу опсонофагоцитирующей активности уничтожения (ОРА).

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), способна вызывать титр по меньшей мере 1:8 против S. pneumoniae серотипа 15С у по меньшей мере 50% субъектов, как определено согласно анализу опсонофагоцитирующей активности уничтожения (ОРА). В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), способна вызывать титр по меньшей мере 1:8 против S. pneumoniae серотипа 15С у по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, или по меньшей мере 95% субъектов, как определено согласно анализу опсонофагоцитирующей активности уничтожения (ОРА).

В следующем аспекте, согласно представленному изобретению предложен способ лечения или предупреждения инфекции, заболевания или состояния, связанного с S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С у субъекта, где способ включает стадию введения терапевтически или профилактически эффективного количества любой иммуногенной композиции согласно представленному изобретению, содержащей по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше). В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при введении субъекту, индуцирует образование антител способных к связыванию с S. pneumoniae серотипа 15В, 15А и/или 15С. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно представленному изобретению содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при введении субъекту, индуцирует образование антител, способных к уничтожению S. Pneumoniae серотипа 15В, 15С и/или 15А в анализе опсонофагоцитирующей активности, как раскрыто в данном документе (например, в ОРА анализе Примера 12).

Согласно одному варианту осуществления, предложен способ защиты субъекта против инфекции, вызванной S. Pneumoniae серотипа 15С, или способ предупреждения инфекции, вызванной S. Pneumoniae серотипа 15С, или способ уменьшения тяжести или задержки возникновения по меньшей мере одного симптома, связанного с инфекцией, вызванной S. Pneumoniae серотипа 15С, где способы включают введение субъекту иммуногенного количества какой-либо из иммуногенных композиций согласно представленному изобретению, содержащих по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше). Согласно одному варианту осуществления согласно изобретению предложен способ лечения или предупреждения S. pneumoniae инфекции, заболевания или состояния, связанного с S. Pneumoniae серотипа 15А, 15 В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В) у субъекта, где способ включает стадию введения терапевтически или профилактически эффективного количество какой-либо из иммуногенных композиций согласно представленному изобретению, содержащих по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше) субъекту. Согласно другому варианту осуществления предложен способ лечения или предупреждения S. pneumoniae инфекции, заболевания или состояния, связанного с S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В) у субъекта, где способ включает генерирование препарата поликлонального или моноклонального антитела из любой из иммуногенных композиций согласно представленному изобретению, содержащих по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), и применение указанного препарата антитела для обеспечения пассивного иммунитета у субъекта.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к применению любой из иммуногенных композиций, согласно представленному изобретению, содержащей по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше) для производства лекарственного средства для защиты субъекта против инфекции, вызванной S. pneumoniae, и/или предупреждения инфекции, вызванной S. pneumoniae, и/или уменьшения тяжести или задержки возникновения по меньшей мере одного симптома, связанного с инфекцией, вызванной S. pneumoniae, и/или защиты субъекта против инфекции, вызванной S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В), и/или предупреждения инфекции, вызванной S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В), и/или уменьшения тяжести или задержки возникновения по меньшей мере одного симптома, связанного с инфекцией, вызванной S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В). В одном варианте осуществления, изобретение относится к применению любой из иммуногенных композиций согласно представленному изобретению, содержащей по меньшей мере один гликоконъюгат на основе S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше) для защиты субъекта против инфекции, вызванной S. pneumoniae, и/или предупреждения инфекции, вызванной S. pneumoniae, и/или уменьшения тяжести или задержки возникновения по меньшей мере одного симптома, связанного с инфекцией, вызванной S. pneumoniae, и/или защиты субъекта против инфекции, вызванной S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В) и/или предупреждения инфекции, вызванной S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В), и/или уменьшения тяжести или задержки возникновения по меньшей мере одного симптома, связанного с инфекцией, вызванной S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В).

7. Субъект, подвергаемый лечению иммуногенной композицией согласно изобретению

Как раскрыто в данном документе, иммуногенную композицию, описанную в данном документе, можно применять в различных терапевтических или профилактических способах для предупреждения, лечения или облегчения бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта.

В предпочтительном варианте осуществления, указанным субъектом является человек. В наиболее предпочтительном варианте осуществления, указанный субъект является новорожденным (то есть в возрасте до трех месяцев), младенцем (то есть в возрасте от 3 месяцев до одного года) или ребенком ясельного возраста (то есть в возрасте от одного года до четырех лет).

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, предназначена для применения в качестве вакцины. В таком варианте осуществления, субъект, подлежащий вакцинации, может быть в возрасте менее 1 года. Например, субъект, подлежащий вакцинации, может быть в возрасте около 1, около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11 или около 12 месяцев. В одном варианте осуществления, субъект, подлежащий вакцинации, находится в возрасте около 2, около 4 или около 6 месяцев. В другом варианте осуществления, субъект, подлежащий вакцинации, находится в возрасте менее 2 лет. Например, субъект, подлежащий вакцинации, может находиться в возрасте от около 12 до около 15 месяцев. В некоторых случаях, необходима только одна доза иммуногенной композиции в соответствии с изобретением, но в некоторых случаях, можно вводить вторую, третью или четвертую дозы (смотри раздел 8 ниже). В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, субъект, подлежащий вакцинации, является взрослым человеком в возрасте 50 лет или старше, более предпочтительно взрослым человеком в возрасте 55 лет или старше. В одном варианте осуществления, субъект, подлежащий вакцинации, является взрослым человеком в возрасте 65 лет или старше, в возрасте 70 лет или старше, в возрасте 75 лет или старше, или в возрасте 80 лет или старше. В одном варианте осуществления субъект, подлежащий вакцинации, является индивидуумом с ослабленным иммунитетом, в частности, человеком. Индивидуума с ослабленным иммунитетом, как правило, определяют как лицо, которое демонстрирует ослабленную или сниженную способность поддерживать нормальную гуморальную или клеточную защиту, чтобы сопротивляться инфекционным агентам.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, субъект с ослабленным иммунитетом, которого следует вакцинировать, страдает от заболевания или состояния, которое ослабляет иммунную систему и в результате приводит к образованию антител, которых недостаточно для защиты против или лечения пневмококковых заболеваний.

В одном варианте осуществления, указанное заболевание представляет собой первичное иммунодефицитное расстройство. Предпочтительно, указанное первичное иммунодефицитное растройство выбирают из группы, состоящей из: комбинированного Т- и В-клеточных иммунодефицитов, дефицитов антитела, хорошо определенных синдромов, иммунных дисрегуляциоиных заболеваний, расстройств фагоцитов, врожденных дефицитов иммунитета, аутовоспалительных расстройств, и комплемента дефектов. В одном варианте осуществления, указанное первичное иммунодефицитное растройство выбирают из тех, которые раскрыты на странице 24, строка 11, до страницы 25, строка 19, из WO 2010/125480.

В конкретном варианте осуществления представленного изобретения, иммуно-скомпрометированный субъект, которого следует вакцинировать, страдает от заболевания, выбранного из группы состоящей из: ВИЧ-инфекции, синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа), рака, хронической сердечной или легочной недостаточности, застойной сердечной недостаточности, сахарного диабета, хронического заболевания печени, алкоголизма, цирроза печени, спинального протекания жидкости, кардиомиопатии, хронического бронхита, эмфиземы, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), дисфункции селезенки (например, серповидно-клеточной анемии), отсутствия функции селезенке (асплении), малигнизации крови, лейкоза, множественной миеломы, болезни Ходжкина, лимфомы, почечной недостаточности, нефротического синдрома и астмы.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуно-скомпрометированный субъект, которого следует вакцинировать, страдает от недостаточного питания.

В конкретном варианте осуществления представленного изобретения, иммуно-скомпрометированный субъект, которого следует вакцинировать, принимает лекарство или получает лечение, которое снижает устойчивость организма к инфекции. В одном варианте осуществления, указанное лекарственное средство выбирают из одного из раскрытых на странице 26, строка 33, до страницы 26, строка 4, из WO 2010/125480.

В конкретном варианте осуществления представленного изобретения, иммуно-скомпрометированный субъект, которого следует вакцинировать, является курильщиком.

В конкретном варианте осуществления представленного изобретения, иммуно-скомпрометированный субъект, которого следует вакцинировать, имеет количество белых кровяных клеток (количество лейкоцитов) ниже 5×10⁹ клеток на литр, или ниже 4×10⁹ клеток на литр, или ниже 3×10⁹ клеток на литр, или ниже 2×10⁹ клеток на литр, или ниже 1×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,5×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,3×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,1×10⁹ клеток на литр. Количество белых кровяных клеток (количество лейкоцитов): Количество белых кровяных клеток (WBC) в крови. WBC, как правило, измеряют как часть СВС (полного анализа крови). Белые кровяные клетки представляют собой клетки в крови, которые борются с инфекцией и отличаются от красных (переносящих кислород) кровяных клеток, известных как эритроциты. Существуют различные типы белых кровяных клеток, включая нейтрофилы (полиморфноядерные лейкоциты; PMN), ленточные клетки (слегка незрелые нейтрофилы), лимфоциты Т-типа (Т-клетки), лимфоциты В-типа (В-клетки), моноциты, эозинофилы, и базофилы. Все типы белых кровяных клеток отражают в количестве белых кровяных клеток. Нормальный диапазон для количества белых кровяных клеток, как правило, составляет от 4 300 до 10 800 клеток на кубический миллиметр крови. Эту величину также называют как количество лейкоцитов и выражают в международных единицах, как 4,3-10,8×10⁹ клеток на литр. В конкретном варианте осуществления представленного изобретения, иммуно-скомпрометированный субъект, которого следует вакцинировать, страдает от нейтропении. В конкретном варианте осуществления представленного изобретения, иммуно-скомпрометированный субъект, которого следует вакцинировать, имеет количество нейтрофилов ниже 2×10⁹ клеток на литр, или ниже 1×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,5×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,1×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,05×10⁹ клеток на литр.

Низкое количество белых кровяных клеток или "нейтропения" представляет собой состояние, характеризуещееся аномально низким уровнем нейтрофилов в циркулирующей крови. Нейтрофилы представляют собой специфический вид белых кровяных клеток, которые помогают предупреждать и бороться с инфекциями. Самой распространенной причиной того, что больные раком страдают от нейтропении, является побочный эффект химиотерапии. Нейтропения, индуцированная химиотерапией, увеличивает риск инфицирования пациента и препятствует лечению рака.

В конкретном варианте осуществления представленного изобретения, иммуно-скомпрометированный субъект, которого следует вакцинировать, имеет количество CD4+ клеток ниже 500/мм³, или количество CD4+ клеток ниже 300/мм³, или количество CD4+ клеток ниже 200/мм³, количество CD4+ клеток ниже 100/мм³, количество CD4+ клеток ниже 75/мм³, или количество CD4+ клеток ниже 50/мм³. Количество CD4 клеток, как правило, измеряют в виде количества клеток в мм³. Нормальный уровень CD4 клеток составляет от 500 до 1 600, и уровень CD8 клеток составляет от 375 до 1 100. Уровень CD4 клеток резко падает у людей с ВИЧ.

В одном варианте осуществления согласно изобретению, какой-либо из иммуно-скомпрометированных субъектов, раскрытыми в данном документе, является человеком мужского пола или человеком женского пола.

8. Режим введения

В некоторых случаях, необходимой является всего-навсего одна доза иммуногенной композиции в соответствии с изобретением, но при некоторых обстоятельствах, таких как состояние большего иммунного дефицита, можно вводить вторую, третью или четвертую дозу. После первичной вакцинации субъекты могут проходить одну или несколько бустерных иммунизаций, адекватно разнесенных по времени.

В одном варианте осуществления, график вакцинации иммуногенной композицией в соответствии с изобретением представляет собой одну дозу. В конкретном варианте осуществления, указанный график, содержащий одну дозу, приведен для здорового индивидуума в возрасте по меньшей мере 2 года. В одном варианте осуществления, график вакцинации иммуногенной композицией в соответствии с изобретением представляет собой график, содержащий несколько доз. В конкретном варианте осуществления, указанный график, содержащий несколько доз, состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от около 1 месяца до около 2 месяцев. В конкретном варианте осуществления, указанный график, содержащий несколько доз, состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом около 1 месяца, или серии из 2 доз, разделенных интервалом около 2 месяцев.

В другом варианте осуществления, указанный график, содержащий несколько доз, состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от около 1 месяца до около 2 месяцев. В другом варианте осуществления, указанный график, содержащий несколько доз, состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом около 1 месяца, или серии из 3 доз, разделенных интервалом около 2 месяцев. В другом варианте осуществления, указанный график, содержащий несколько доз, состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от около 1 месяца до около 2 месяцев с последующим введением четырех доз через от около 10 месяцев до около 13 месяцев после первой дозы. В другом варианте осуществления, указанный график, содержащий несколько доз, состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом около 1 месяца, с последующим введением четырех доз через от около 10 месяцев до около 13 месяцев после первой дозы, или серии из 3 доз, разделенных интервалом около 2 месяцев, с последующим введением четырех доз через от около 10 месяцев до около 13 месяцев после первой дозы. В одном варианте осуществления, график, содержащий несколько доз, состоит из по меньшей мере одной дозы (например, 1, 2 или 3 доз) в первый год жизни, с последующим введением по меньшей мере одной дозой при достижении ясельного возраста.

В одном варианте осуществления, график, содержащий несколько доз, состоит из серии из 2 или 3 доз, разделенных интервалом от около 1 месяца до около 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением одной дозы при достижении возраста 12-18 месяцев. В одном варианте осуществления, указанный график, содержащий несколько доз, состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от около 1 месяца до около 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением одной дозы при достижении возраста 12-15 месяцев. В другом варианте осуществления, указанный график, содержащий несколько доз, состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом около 2 месяцев, начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением одной дозы при достижении возраста 12-18 месяцев.

В одном варианте осуществления, график, содержащий несколько доз, состоит из серии из 4 доз вакцины, которые вводят в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

В одном варианте осуществления, первую дозу вводят в возрасте 0 дней и один или более бустов вводят с интервалами, которые находятся в диапазоне от около 2 до около 24 недель, предпочтительно с интервалом дозирования 4-8 недель. В одном варианте осуществления, первую дозу вводят в возрасте 0 дней и буст вводят через около 3 месяца.

Как использовано в данном документе, термин "около" означает в пределах статистически значимого диапазона значения, такого как указанный диапазон концентраций, временные рамки, молекулярная масса, температура или рН. Такой диапазон может быть в пределах порядка величины, как правило, в пределах 20%, более типично, в пределах 10%, и еще более типично, в пределах 5% или в пределах 1% от заданного значения или диапазона. Иногда, такой диапазон может быть в пределах погрешности эксперимента типичных стандартных методов, применяемых для измерения и/или определения заданного значения или диапазона. Допустимое отклонение, охватываемое термином "около", зависит от конкретной исследуемой системы, и может быть легко оценено среднестатистическим специалистом в данной области. Всякий раз, когда в данной заявке упомянут диапазон, в качестве варианта осуществления изобретения может выступать любое целое число в пределах диапазона. В контексте настоящего изобретения термины "содержащий", "содержат" и "содержит" понимаются авторами изобретения как необязательно взаимозаменяемые с терминами "содержащий по сути", "содержат по сути", "содержит по суть", "состоящий из', "состоят из' и "состоит из', соответственно, в каждом примере.

Все ссылки или заявки на патент, процитированные в данном описании патента являются включенными в данный документ посредством ссылки. Изобретение иллюстрируется в прилагаемых примерах. Приведенные ниже примеры выполнены с применением стандартных методик, которые хорошо известны и рутинны для квалифицированных специалистов в данной области, за исключением тех, где подробно описано другое. Примеры иллюстрируют изобретение, но не ограничивают его.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Общий способ получения еТЕС связанных гликоконъюгатов

Активирование сахарида и тиолирование цистамина дигидрохлоридом

Сахарид растворяют в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). Содержание влаги в растворе определяют по методу Карла Фишера (KF) и регулируют, чтобы достичь содержания влаги от 0,1% до 0,4%, как правило, 0,2%. Для того, чтобы инициировать активирование, готовят свежий раствор 1,1'-карбонил-ди-1,2,4-триазол (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI) концентрацией 100 мг/мл в ДМСО. Сахарид активируют различными количествами CDT/CDI (1-10 молярными эквивалентами) и реакции дают протекать в течение 1 часа при 23±2°С. Степень активации может быть определена с помощью ВЭЖХ. Цистамина дигидрохлорид готовят свежим в безводном ДМСО в концентрации 50 мг/мл. Активированный сахарид подвергают взаимодействию с 1 молярным эквивалентом (мол. экв.) цистамина дигидрохлорида.

Альтернативно, активированный сахарид подвергают взаимодействию с 1 мол. экв. цистеамина гидрохлорида. Реакции тиолирования дают протекать в течение 21±2 часа при 23±2°С, получая тиолированный сахарид. Степень тиолирования определяют с помощью дополнительного количества CDT/CDI. Остаточный CDT/CDI в реакции активации раствора гасят путем добавления 100 мМ натрия тетрабората, рН раствора 9,0. Чтобы определить дополнительное количество тетрабората и регулировать конечное содержание влаги, которое должно составлять вплоть до 1-2% от общего количества воды, выполняют расчеты.

Восстановление и очистка активированного тиолированного сахарида Реакционную смесь тиолированного сахарида разбавляют в 10 раз за счет добавления к предварительно охлажденному 5 мМ сукцинату натрия в 0,9% солевом растворе, рН 6,0, и фильтруют через фильтр 5 мкм. Диафильтрацию тиолированного сахарида осуществляют 40-кратным диаобъемом WFI. К ретентату добавляют раствор три(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), 1 - 5 мол. экв., после разбавления 10 об.% 0,1 М натрий-фосфатным буфером, рН 6,0. Данной реакции восстановления дают протекать в течение 20±2 часов при 5±3°С. Очистку активированного тиолированного сахарида предпочтительно осуществляют, применяя ультрафильтрацию/диафильтрацию предварительно охлажденным 10 мМ моноосновным фосфатом натрия, рН 4,3. Альтернативно, тиолированный сахарид очищают, применяя стандартные методики гель проникающей хроматографии (SEC) или способы ионообменной хроматографии. Чтобы определить концентрацию сахарида и содержание тиолов (метод Эллмана), отбирают аликвоту ретентата активированного тиолированного сахарида.

Альтернативное восстановление и очистка активированного тиолированного сахарида

В качестве альтернативы процедуре очистки, описанной выше, активированный тиолированный сахарид также очищали, как описано ниже.

К реакционной смеси тиолированного сахарида добавляли раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), 5-10 мол. экв., и давали протекать реакции в течение 3±1 часов при 23±2°С. Реакционную смесь затем разбавляли в 5 раз посредством добавления к предварительно охлажденному 5 мМ сукцината натрия в 0,9% солевом растворе, рН 6,0, и фильтровали через фильтр 5 мкм. Диафильтрацию тиолированного сахарида проводили 40-кратным диаобъемом предварительно охлажденного 10 мМ раствора моноосновного фосфата натрия, рН 4,3. Чтобы определить концентрацию сахарида и содержание тиолов (метод Эллмана), отбирают аликвоту ретентата активированного тиолированного сахарида.

Активирование и очистка бромацетилированного белка-носителя Свободные аминогруппы белка-носителя бромацетилируют в результате реакции с бромацетилирующим агентом, таким как сложный эфир бромуксусной кислоты и N-гидроксисукцинимида (BAANS), бромацетилбромид, или другим приемлемым реагентом.

Перед активированием белок-носитель (в 0,1 М фосфата натрия, рН 8,0±0,2) сначала выдерживают при 8±3°С при рН около 7. К исходному раствору белка добавляют сложный эфир N-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты (BAANS) в диметилсульфоксиде (ДМСО) (20 мг/мл) в соотношении BAANS: белок (масс./масс.), равном 0,25-0,5. Реакцию осторожно перемешивают при 5±3°С в течение 30-60 минут. Полученный в результате бромацетилированный (активированный) белок очищают, например, ультрафильтрацией/диафильтрацией с применением мембраны с пределом отсечения по молекулярной массе (MWCO) 10 кДа и 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,0). После очистки концентрацию белка в бромацетилированном белке-носителе оценивают методом Лоури для определения белка.

Степень активации определяют по анализу на общее содержание бромида с применением ионно-обменной жидкостной хроматографии в сочетании с кондуктометрическим детектированием с подавлением фоновой электропроводности (ионная хроматография). Связанный бромид на активированном бромацетилированном белке отщепляется от белка в ходе пробоподготовки и учитывается вместе со свободными бромидами любого происхождения, которые могут присутствовать в растворе. Оставшийся бром, ковалентно связанный с белком, высвобождается путем превращения в ионы бромида путем нагревания образца в щелочном растворе 2-меркаптоэтанола.

Активирование и очистка бромацетилированного CRM₁₉₇ CRM₁₉₇ разбавляли до 5 мг/мл 10 мМ фосфатным буфером в 0,9% NaCl, рН 7, (PBS) и затем приготовленным 0,1 М NaHCO₃, рН 7,0, с применением 1 М стокового раствора. К CRM₁₉₇ добавляли BAANS при соотношении CRM₁₉₇: BAANS, равном 1:0,35 (масс./масс.) с применением стокового раствора BAANS в ДМСО с концентрацией 20 мг/мл. Реакционную смесь инкубировали при температуре от 3°С до 11°С в течение 30 минут - 1 часа, затем очищали ультрафильтрацией/диафильтрацией с применением мембраны с MWCO 10 кДа и 10 мМ фосфата натрия в 0,9% NaCl, рН 7,0. Очищенный активированный CRM₁₉₇ анализировали методом Лоури, чтобы определить концентрацию белка, и затем разбавляли PBS до концентрации 5 мг/мл. Добавляли до 5% масс/об. сахарозы в качестве криопротектора и активированный белок замораживали и хранили при -25°С, пока он не требовался для конъюгации.

Бромацетилирование лизиновых остатков CRM₁₉₇ было очень последовательным, что в результате приводило к активированию от 15 до 25 лизиновых остатков из 39 доступных. Реакция давала высокие выходы активированного белка.

Конъюгация активированного тиолированного сахарида с бромацетилированным белком-носителем

Перед началом реакции конъюгации, реакционные сосуды предварительно охлаждают до 5°С. Бромацетилированный белок-носитель и активированный тиолированный сахарид последовательно добавляют и перемешивают со скоростью перемешивания 150-200 оборотов в минуту. Соотношение сахарид/белок при загрузке составляет 0,9±0,1. рН реакции регулируют до 8,0±0,1 с помощью 1 М раствора NaOH. Реакции конъюгации дают протекать при 5°С в течение 20±2 часов.

Блокирование остаточных реакционно-способных функциональных групп Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на белке-носителе гасят путем взаимодействия с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в качестве блокирующего реагента в течение 3 часов при 5°С. Остаточные свободные сульфгидрильные группы блокируют 4 мол. экв. йодацетамида (IAA) в течение 20 часов при 5°С.

Очистка еТЕС-связанного гликоконъюгата Реакционную смесь в реакции конъюгации (после блокирования с помощью IAA) фильтруют через 0,45 мкм фильтр. Ультрафильтрацию/диафильтрацию гликоконъюгата осуществляют 5 мМ сукцинатом-в 0,9% солевого раствора, рН 6,0. Ретентат гликоконъюгата фильтруют через 0,2 мкм фильтр. Аликвоту гликоконъюгата отбирают для анализов. Оставшийся гликоконъюгат хранят при 5°С.

Пример 2. Получение Pn-33F еТЕС конъюгатов

Процесс активирования

Активирование Pn-33F полисахарида Pn-33F полисахарид смешивали с 500 мМ 1,2,4-триазола (в WFI) с получением 10 грамм триазола на грамм полисахарида. Смесь подвергали замораживанию тонкого слоя на стенке вращающегося сосуда (shell-freezing) на бане из этанола, охлаждаемого сухим льдом, и затем лиофилизировали до высыхания. Лиофилизированный полисахарид серотипа 33F восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). Содержание влаги в лиофилизированном растворе полисахарида серотипа 33F/ДМСО определяли по методу Карла Фишера (KF). Содержание влаги регулировали за счет добавления WFI к раствору полисахарида серотипа 33F/ДМСО, чтобы достичь содержания влаги 0,2%. Для того, чтобы инициировать активирование, готовили 100 мг/мл свежего раствора 1,1'-карбонил-ди-1,2,4-триазол (CDT) в ДМСО. Pn-33F полисахарид активировали различными количествами CDT перед стадией тиолирования. CDT активирование проводили при 23±2°С в течение 1 часа. Степень активации определяли методом ВЭЖХ (А220/А205). Остаточный CDT в реакции активации гасили с помощью 100 мМ раствора тетрабората натрия, рН 9,0. Чтобы определить дополнительное количество тетрабората и регулировать конечное содержание влаги, которое должно составлять вплоть до 1-2% от общего количества воды, выполняют расчеты. Реакции давали протекать в течение 1 часа при 23±2°С.

Тиолирование активированного Pn-33F полисахарида Готовили свежий раствор цистамина дигидрохлорида в безводном ДМСО и 1 мол. экв. цистамина дигидрохлорида добавляли к реакционному раствору активированного полисахарида. Реакции давали протекать в течение 21±3 часов при 23±2°С. Раствор тиолированного сахарида разбавляли в 10 раз посредством добавления к предварительно охлажденному 5 мМ сукцинату натрия в 0,9% солевом растворе, рН 6,0. Разбавленный реакционный раствор фильтровали через фильтр 5 мкм. Диафильтрацию тиолированного Pn-33F полисахарида проводили с помощью кассет для ультрафильтрации с мебранами с MWCO 100 кДа с применением воды для инъекций (WFI).

Восстановление и очистка активированного тиолированного Pn-33F полисахарида

К раствору ретентата добавляли 5 м-экв. трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) после разбавления 10 об.% 0,1 М натрий-фосфатным буфером, рН 6,0. Данной реакции восстановления давали протекать в течение 2±1 часов при 23±2°С. Диафильтрацию тиолированного 33F полисахарида проводили с помощью кассет для ультрафильтрации с мебранами с MWCO 100 кДа. Диафильтрацию проводили предварительно охлажденным 10 мМ фосфатом натрия, рН 4,3. Ретентат тиолированного 33F полисахарида отбирали как для анализа концентрации сахарида, так и тиола (метод Эллмана).

Альтернативное восстановление и очистка активированного тиолированного Pn-33F полисахарида

В качестве альтернативы процедуре очистки, описанной выше, 33F активированный тиолированный сахарид также очищали следующим образом. К реакционной смеси тиолированного сахарида добавляли 5 мол. экв. раствора трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), и давали протекать реакции в течение 3±1 часов при 23±2°С. Реакционную смесь затем разбавляли в 5 раз посредством добавления к предварительно охлажденному 5 мМ сукцинату натрия в 0,9% солевом растворе, рН 6,0 и фильтровали через фильтр 5 мкм. Диафильтрацию тиолированного сахарида проводили с помощью 40-кратного диаобъема предварительно охлажденного 10 мМ моноосновного фосфата натрия, рН 4,3 с помощью кассет для ультрафильтрации с мебранами с MWCO 100 кДа. Ретентат тиолированного 33F полисахарида отбирали как для анализа концентрации сахарида, так и тиола (методом Эллмана). Блок-схема процесса активирования представлена на Фигуре 8(A).

Процесс конъюгирования

Конъюгация тиолированного Pn-33F полисахарида с бромацетилированным CRM₁₉₇

Белок-носитель CRM-197 активировали отдельно путем бромацетилирования, как описано в Примере 1, и затем подвергали взаимодействию с активированным Pn-33F полисахаридом для реакции конъюгации. Перед началом реакции конъюгации, реакционную емкость предварительно охлаждали до 5°С. Бромацетилированный CRM₁₉₇ и тиолированный 33F полисахарид смешивали вместе в реакционной емкости со скоростью перемешивания 150-200 оборотов в минуту. Соотношение сахарид/белок при загрузке составляло 0,9±0,1. рН реакции регулировали до 8,0-9,0. Реакции конъюгации давали протекать при 5°С в течение 20±2 часов.

Блокирование реакционноспособных групп на бромацетилированном

CRM₁₉₇ и тиолированном Pn33F полисахариде

Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на CRM₁₉₇ белках блокировали путем взаимодействия с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в течение 3 часов при 5°С, с последующим блокированием любых остаточных свободных сульфгидрильных групп тиолированного 33Р-полисахарида с помощью 4 мол. экв. йодацетамида (IAA) в течение 20 часов при 5°С.

Очистка еТЕС-связанного Pn-33F гликоконъюгата

Конъюгационный раствор фильтровали через 0,45 мкм или 5 мкм фильтр. Диафильтрацию гликоконъюгата 33F проводили с помощью кассет для ультрафильтрации с мебранами с MWCO 300 кДа. Диафильтрацию проводили 5 мМ сукцинатом в 0,9% солевом растворе, рН 6,0. Ретентат Pn-33F гликоконъюгата с молекулярной массой 300 кДа затем фильтровали через 0,22 мкм фильтр и хранили при 5°С. Блок-схема процесса конъюгирования представлена на Фигуре 8(B).

Результаты

Параметры реакции и характеристические данные для нескольких серий Pn-33F еТЕС гликоконъюгатов показаны в Таблице 1. CDT активирование-тиолирование цистамина дигидрохлоридом приводило к образованию гликоконъюгатов с содержанием от 63% до 90% сахаридов и от <1% до 13% свободных сахаридов.

ОРА Титры Pn-33F еТЕС гликоконъюгатов с CRM₁₉₇

ОРА титры Pn-33F у мышей определяли в стандартных условиях (подобным к методикам определения ОРА, описанным ниже для конъюгатов на основе серотипов 10А и 22F). ОРА титры (средние геометрические титры (GMT) с доверительным интервалом (Cl) 95%) через четыре и семь недель, приведенные в Таблице 2, показывают, что гликоконъюгат на основе серотипа 33F-Pn вызывал ОРА титры в модели иммуногенности на мышах.

Пример 3. Получение дополнительных Pn-33F еТЕС конъюгатов

Дополнительные Pn-33F еТЕС конъюгаты получали способом, описанным в Примере 2. Параметры реакции и характеристические данные для данных дополнительных серий Pn-33F еТЕС гликоконъюгатов показаны в Таблице 3.

Как показано выше и в Таблице 3, несколько Pn-33F конъюгатов были получены с применением еТЕС конъюгации. еТЕС конъюгирование позволило получить конъюгаты с высоким выходом, низким % свободного сахарида и высокой степенью конъюгации (конъюгированных лизинов). Дополнительно, способ еТЕС конъюгирования позволил сохранить более чем 80% ацетильных функциональных групп.

Пример 4. Оценка стабильности Pn-33F еТЕС гликоконъюгатов: тенденции изменения % свободного сахарида

Аликвоты конъюгата серии 33F-2B (смотри Таблицу 1) дозировали в полипропиленовые пробирки и хранили при 4°С, 25°С, и 37°С, соответственно и контролировали тенденции по изменению % свободного сахарида. Результаты (% свободного сахарида) показаны в Таблице 4. Как показано в данной таблице, значительных изменений в % свободного сахарида не происходило.

Ускоренный анализ стабильности другой партии конъюгата (Партия 33F-3C) также проводили при 37°С вплоть до 1 месяца. Как показано в Таблице 5, значительных изменений в % свободного сахарида при 37°С вплоть до 1 месяца не происходило.

Для дополнительного подтверждения стабильности еТЕС конъюгатов, конъюгаты дополнительной серии (33F-3C и 33F-5E (смотри Таблицу 1)) хранили при 4°С в течение около одного года для наблюдения потенциальных тенденций в изменении % свободного сахарида. Как показано в Таблице 6, значительных изменений в % свободного сахарида для конъюгатов, которые хранили при 4°С в течение длительного периода времени до около одного года, не происходило.

Как следует из данных по исследованию тенденций изменения содержания свободного сахарида при различных температурах (в режиме реального времени и ускоренном режиме), конъюгаты серотипа 33F, полученные с применением еТЕС конъюгирования, как продемонстрировано, являются стабильными без заметного разложения.

Пример 5. Получение Pn-8 конъюгатов с CRM₁₉₇

Получение Pn-8 RAC/ДМСО гликоконъюгатов

Замороженный полисахарид размораживали и переносили в реакционную емкость. 2М уксусную кислоту и WFI (воду для инъекций) добавляли к раствору полисахарида, чтобы достичь конечной концентрации полисахарида около 2,5 г/л и конечной концентрации уксусной кислоты 0,2 М.

Гидролиз полисахарида

Нативный полисахарид химически гидролизовали перед активированием. Разбавленный раствор полисахарида нагревали до 70°С, и затем выдерживали при данной температуре в течение 3,5 часов.

Окисление полисахарида

Окисление полисахарида инициировали путем добавления раствора натрия периодата и реакцию проводили в течение 20 часов при 23°С.

Очистка активированного полисахарида

Активированный полисахарид концентрировали с применением ультрафильтрационных кассет. Диафильтрацию проводили 20-кратным диаобъемом WFI.

Лиофилизация

Активированный полисахарид смешивают с сахарозой в соотношении 25 грамм сахарозы на грамм активированного полисахарида. Флаконы, содержащие активированный сахарид и сахарозу, подвергали лиофилизации путем замораживания тонкого слоя на стенке вращающегося сосуда (shell-freezing) на бане из этанола.

Конъюгация активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирование

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в ДМСО до концентрации 2 мг/мл. ДМСО добавляли к лиофилизированному CRM₁₉₇ для восстановления. Восстановленный CRM₁₉₇ добавляли к восстановленному активированному полисахариду. Затем инициировали конъюгацию за счет добавления натрия цианоборгидрида к реакционной смеси и инкубировали при 23°С в течение 24 часов. Прекращение реакции конъюгацию осуществляется путем добавления 2 мэкв. боргидрида натрия. Данное блокирование реакции проводили в течение 3 часов при 23°С.

Очистка конъюгата

Раствор конъюгата затем разбавляли охлажденным 5 мМ сукцинатом в 0,9% солевого раствора (рН 6,0), фильтровали, концентрировали до 2-4 г/л с помощью мембран из целлюлозы с MWCO 300 кДа, и первую стадию диафильтрации проводили с помощью 5 мМ сукцината в 0,9% солевом растворе (рН 6,0). Стадию конечной очистки осуществляли путем диафильтрации 5 мМ сукцинатом в 0,9% солевом растворе, с рН 6,0. После завершения диафильтрации очищенный конъюгат переносили в емкость для сбора через 0,22 мкм фильтр.

Разбавление моновалентного объемного конъюгата

Конъюгат разбавляли дополнительным 5 мМ сукцинатом в 0,9% солевом растворе (рН 6) до целевой концентрации сахарида 0,5 мг/мл. После завершения конечной стадии фильтрования через фильтр 0,22 мкм получали моновалентный объемный продукт конъюгат (МВС) для лекарственных составов.

Несколько конъюгатов получали путем изменения различных параметров вышеописанного способа (например, соотношения сахарид-белок при загрузке, концентрации реакционной смеси и количества мэкв натрия цианоборгидрида). Характеристика представленных Pn-8 гликоконъюгатов с CRM₁₉₇ приведена в Таблице 7.

Титры опсонофагоцитирующей активности (OPA) для конъюгатов серотипа 8-CRM₁₉₇ у мышей определяли в стандартных условиях (подобные методикам определения OPA, описанным ниже для 10А и 22F конъюгатов). OPA титры (среднегеометрические титры (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре недели, приведенные в Таблицах 8 и 9 для различных доз (два отдельных эксперимента), показывают, что конъюгат серотипа 8 (образцы 1-9; также смотри Таблицу 7 для характеристических данных этих конъюгатов) вызвал OPA титры в модели иммуногенности на мышах.

Как показано в Таблице 8, конъюгаты серотипа 8 имеют значительно более высокие титры антител по сравнению с контрольным неконъюгированным полисахаридом, который давал низкие титры антител.

Совокупность данных, полученных для конъюгатов, приготовленных по описанному выше способу восстановительного аминирования, показывает, что этот способ позволяет получать конъюгаты с высоким выходом конъюгации, низким % свободного сахарида и с хорошей стабильностью. Дополнительно, полученные конъюгаты вызвали хорошие OPA титры в модели иммуногенности на мышах.

Пример 6. Получение конъюгата полисахарида серотипа 10А-CRM₁₉₇

Получение выделенного полисахарида S. pneumoniae серотипа 10А

Капсульные полисахариды серотипа 10А могут быть получены непосредственно из бактерий с применением процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, 2008/0102498 и WO 2008/118752). Streptococcus pneumoniae серотипа 10А выращивали в виале для посевного материала, а затем переносили в ферментер для посевного материала. После достижения целевой оптической плотности, клетки переносили в ферментер. Ферментативный бульон инактивировали добавлением N-лауроилсаркозина и очищали с применением ультрафильтрации и диафильтрации.

Окисление выделенного капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 10A

Рассчитанный объем 0,1 M калий-фосфатного буфера (рН 6,0) и воды для инъекций (WFI) добавляли к раствору полисахарида для достижения конечной концентрации полисахарида 2,5 г/л и конечной концентрации калий-фосфатного буфера 25 мМ, если необходимо, рН доводили до значения около 6,0. Разбавленный полисахарид затем охлаждали до 5°С. Окисление инициировали путем добавления раствора 0,25 молярных эквивалентов (М-экв.) натрия периодата. Время реакции окисления составляло около 4 часа при 5°С. Реакцию окисления гасили 1 М-экв. 2,3-бутандиола, продолжая перемешивание при 5°С в течение 1-2 часов.

После достижения целевого времени реакции, активированный полисахарид концентрировали с применением кассет Millipore для ультрафильтрации с мебранами с MWCO 30 кДа. Затем проводили диафильтрацию 20-кратным диаобъемом WFI. Очищенный активированный полисахарид хранили при 5°С. Очищенный активированный сахарид характеризуется, среди прочего, (i) молекулярной массой по SEC-MALLS и (ii) степенью окисления.

Конъюгация активированного полисахарида S. pneumoniae серотипа 10А с CRM₁₉₇

Процесс конъюгирования включал следующие стадии:

a. Смешивания с сахарозным эксципиентом, и лиофилизации;

b. Восстановления лиофилизированного полисахарида и CRM₁₉₇;

c. Конъюгации активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирования; и

d. Очистки конъюгата

a. Смешивание с сахарозой

Активированный полисахарид смешивают с сахарозой в соотношении 25 г сахарозы на грамм активированного полисахарида. Флакон полученной смеси затем лиофилизировали. После лиофилизации, флаконы, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид, хранили при -20°С.

b. Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и CRM₁₉₇ белка

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). После полного растворения полисахарида, такое же количество ДМСО добавляли к рассчитанному CRM₁₉₇ для восстановления.

c. Конъюгация активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирование

Восстановленный CRM₁₉₇ (в ДМСО) добавляли к восстановленному активированному полисахариду в реакторе для конъюгирования. Конечная концентрация полисахарида составляет 1 г/л. Конъюгацию проводили за счет добавления 1,2 М-экв. натрия цианоборгидрида к реакционной смеси. Реакцию инкубировали при 23°С в течение 24 часов. Завершение реакции конъюгирования осуществляли за счет добавления 2 М-экв. натрия боргидрида. Реакцию блокирования инкубировали при 23°С в течение 3 часов.

d. Очистка конъюгата Раствор конъюгата затем разбавляли в 5 раз (по объему) охлажденным 5 мМ сукцинатом в 0,9% солевого раствора (рН 6,0) и диафильтрацию проводили 20-кратным диаобъемом 5 мМ сукцината в -0,9% солевом растворе (рН 6,0). После завершения начальной диафильтрации ретентат конъюгата фильтровали через 0,22 мкм фильтр. Конъюгат разбавляли дополнительным 5 мМ сукцинатом в 0,9% солевом растворе (рН 6), и после конечной стадии фильтрования через 0,22 мкм его хранили при 2-8°С.

Несколько конъюгатов получали путем варьирования различных параметров вышеописанного способа (например, соотношения сахарид-белок при загрузке, концентрации реакционной смеси и количества М-экв натрия цианоборгидрида). Указанный выше способ позволил получить конъюгаты серотипа 10А, которые, как продемонстрировано, являются стабильными без заметного разложения, как показано в исследовании тенденций изменения содержания свободного сахарида при различных температурах (в режиме реального времени и ускоренном режиме). Характеристики представленных гликоконъюгатов Pn-10А с CRM₁₉₇ приведены в Таблице 10.

Титры опсонофагоцитирующей активности (OPA) для конъюгатов серотипа 10А-CRM₁₉₇ у мышей определяли в стандартных условиях. Группу из тридцати самок мышей Swiss Webster возрастом 6-7 недель иммунизировали с помощью 0,001 мкг, 0,01 мкг, или 0,1 мкг исследуемых конъюгатов с помощью подкожной инъекции на неделе 0. Мышей бустировали такой же дозой конъюгата на неделе 3 и затем брали кровь на неделе 4. Анализ серотип-специфической OPA проводили на образцах сывороток, полученных на 4 неделе.

Анализ опсонофагоцитирующей активности (OPA) применяют для измерения функциональных антител специфичных к S. pneumoniae серотипа 10А в сыворотке крови мышей. Исследуемую сыворотку вводят в реакции анализа, в которых измеряют способность капсульного полисахарида специфического иммуноглобулина опсонизировать бактерии, запускать отложение комплемента, тем самым облегчая фагоцитоз и уничтожая бактерии с помощью фагоцитов. OPA титр определяют как обратное разведение, которое в результате приводит к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки. OPA титр интерполируют по двум разведениям, при которых выполняется данный 50% предел уничтожения.

Анализ OPA основан на способах, описанных в Hu et al., (2005) Clin Diagn Lab Immunol12 (2):287-295 со следующими модификациями. Исследуемую сыворотку серийно разбавляли в 2,5 раза и добавляли в планшеты для микротитрования для анализа. Живые целевые бактериальные штаммы серотипа 10А добавляли в лунки и планшеты встряхивали при 37°С в течение 30 минут. Дифференцированные HL-60 клетки (фагоциты) и сыворотку детенышей кроликов (возрастом 3-4-недели, PEL-FREES®, 12,5% конечная концентрация) добавляли в лунки, и планшеты встряхивали при 37°С в течение 60 минут. Для прекращения реакции, 80 мкл 0,9% NaCl добавляли во все лунки, перемешивали, и 10 мкл аликвоту переносили в лунки MULTISCREEN® HTS HV планшетов, содержащих 200 мкл воды, для фильтрования (MILLIPORE®). Жидкость из планшетов отфильтровали в вакууме, и 150 мкл среды HYSOY® добавляли в каждую лунку и фильтровали. Планшеты для фильтрования затем инкубировали при 37°С, 5% СО₂ на протяжении ночи и затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Планшеты затем окрашивали Кумасси синим, и обесцвечивали один раз. Был проведен имиджинг и подсчет колоний анализатором IMMUNOSPOT®, Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, ОН) анализатором. Необработанные данные по подсчету колоний использовали для построения кривых по уничтожению и рассчета OPA титров. OPA титры (среднегеометрические титры (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре недели в различных дозах, приведенные в Таблице 11, показывают, что конъюгат серотипа 10А (Образцы 1-3; также см. Таблицу 10 для характеристических данных этих конъюгатов) вызвал OPA титры в модели иммуногенности на мышах. Как показано в Таблице 11, конъюгаты серотипа 10А имеют значительно более высокие OPA титры по сравнению с контрольным неконъюгированным полисахаридом, который имел низкий OPA ответ.

Пример 7. Конъюгация Pn-12F с применением TEMPO/NCS

В целях повышения стабильности 12F-CRM₁₉₇ гликоконъюгатов, были исследованы альтернативные способы синтеза с применением 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси свободного радикала (TEMPO) и N-хлорсукцинимида (NCS) в качестве совместного окислителя для окисления первичных спиртов до альдегидных групп. ГХ/МС анализ показал, что участки, которые подвергались окислению, в этом случае отличались от участков, которые подвергались окислению, для периодат-опосредованного окисления. В случае TEMPO-NCS окисления, окислялись α-D-Glcp и 2-Glcp, тогда как основным участком, который подвергался окислению при применении периодата, был α-D-Galp (смотри Фигуру 4). Как описано далее более подробно в данном документе, TEMPO применяли в каталитических количествах (≤0,1 молярныйэквивалент), и желаемая степень окисления (DO) достигалась за счет варьирования количества применяемого NCS. Впоследствии было синтезировано и охарактеризовано несколько конъюгатов. В целом, получение гликоконъюгатов на основе серотипа 12F проводили в несколько стадий следующим образом:

a) Гидролиз полисахарида серотипа 12F до молекулярных масс от 50 кДа до 500 кДа

b) Активирование полисахарида серотипа 12F с помощью TEMPO/NCS;

c) Очистка активированного полисахарида;

d) Конъюгация активированного серотипа 12F с CRM₁₉₇ белком; и

e) Очистка конъюгатов полисахарид серотипа 12F-CRM₁₉₇.

Гидролиз и окисление полисахарида серотипа 12F Гидролиз полисахарида, как правило, проводили в кислотных условиях с нагреванием, получая среднюю молекулярную массу в желаемом диапазоне от 100 кДа до 350 кДа. Типичный эксперимент описан ниже. Гидролиз

Раствор полисахарида серотипа 12F добавляли в реакционную емкость с рубашкой. В него добавляли требуемый объем 0,30 M уксусной кислоты и воды для инъекций (WFI), поддерживая концентрацию ~ 0,1 M уксусной кислоты. рН раствора регулировали до 3,2±0,3 с применением 1 H NaOH или ледяной уксусной кислоты. Температуру реакционной смеси повышали до 70±5°С. Реакционную смесь перемешивали при 70±5°С в течение 90-120 минут. Реакционную смесь охлаждали до 23±2°С и нейтрализовали (рН 7,0) за счет добавления 1 M раствора NaOH. Гидролизованный полисахарид очищали с применением ультрафильтрации/диафильтрации WFI с применением мембран с MWCO 30 кДа. Раствор фильтровали через 0,22 мкм фильтр и хранили при 2-8°С до окисления. Молекулярную массу гидролизованного полисахарида анализировали с помощью SEC-MALLS, чтобы гарантировать, что молекулярная масса соответствует целевому диапазону от 100 кДа до 350 кДа.

Частичное окисление В одном эксперименте, механически оптимизировали размер полисахарида серотипа 12F с применением гомогенизации под давлением с применением микрофлюидизатора для снижения молекулярной массы до от около 100 кДа до 500 кДа. Полисахарид оптимизированного размера добавляли в реакционную емкость в концентрации 4,0 мг/мл и перемешивали с карбонатным буфером (0,5 M NaHCO₃/0,05 M Na₂CO₃ буфер, рН 8,6) в соотношении 1:1 об./об. К перемешиваемой смеси добавляли ≤0,1 мол. эквивалента TEMPO. Реакцию начинали путем добавления от 0,6 до 1,0 мол. эквивалента NCS. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, после чего активированный полисахарид очищали диафильтрацией WFI с применением мембраны для ультрафильтрации с MWCO 30 кДа. Очищенный полисахарид собирали и степень окисления (DO) определяли с помощью количественного измерения альдегида (с применением гидразона 3-метил-2-бензотиазолинона (МВТН)) и полисахарида (с применением антронового анализа). В другом эксперименте, полисахарид серотипа 12F гидролизовали, чтобы уменьшить молекулярную массу до молекулярной массы от около 100 кДа до 500 кДа. Полисахарид серотипа 12F добавляли в реакционную емкость и перемешивали с 0,5 M NaHCO₃/0,05 M Na₂CO₃ буфером (рН 8,6) в соотношении 1:1 об./об. К перемешиваемой смеси добавляли от 0,6 до 1,0 молярного эквивалента NCS, растворенного в WFI. Активирование инициировали путем добавления около 0,1 молярного эквивалента TEMPO, растворенного в WFI. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, после чего активированный полисахарид очищали с применением диафильтрации с WFI с применением мембраны для ультрафильтрации с MWCO 30 кДа. Очищенный активированный полисахарид фильтровали через 0,2 мкм фильтр и хранили при температуре 4°С до применения.

Окисление с помощью TEMPO/NCS также успешно проводили в натрий-фосфатном буфере с рН 6,5, 7,0, 7,5 и 8,0. В некоторых экспериментах по активированию первичный спирт, такой как н-пропанол, применяли для гашения реагентов, чтобы избежать окисления сахарида. В другом наборе экспериментов, химически гидролизованный полисахарид был подвергнут окислению непосредственно, без стадии очистки ультрафильтрацией/ диафильтрацией.

Конъюгация окисленного полисахарида серотипа 12F

В одном эксперименте, очищенный окисленный полисахарид серотипа 12F добавляли в реакционную емкость с последующим добавлением 0,5 M натрий-фосфатного буфера (рН 6,5) до конечной концентрации буфера 0,1 М. К данному раствору добавляли ранее лиофилизированный CRM₁₉₇ и тщательно перемешивали, чтобы получить гомогенный раствор. рН регулировали до 6,8 с применением разбавленного HCl или 1Н раствора NaOH. Затем добавляли 1,5 молярных эквивалента NaCNBh₃. Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре (23°С) и в течение 2,5 дней при 37°С. Реакционную смесь затем разбавляли 1Х 0,9% солевым раствором, и непрореагировавшие альдегидные группы "блокировали" 2 молярными эквивалентами натрия боргидрида. Время реакции блокирования составляло 3 часа.

В другом эксперименте, очищенный активированный полисахарид серотипа 12F добавляли в реакционную емкость с последующим добавлением 0,5 M натрий-фосфатного буфера (рН 6,5) до конечной концентрации буфера 0,1 М. К данному раствору добавляли и интенсивно перемешивали ранее лиофилизированный CRM₁₉₇, чтобы получить гомогенный раствор. рН регулировали до 6,8 с применением разбавленного HCl или 1Н раствора NaOH. Затем добавляли 3 молярных эквивалента NaCNBh₃. Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при 23°С и в течение 48 часов при 37°С. Реакционную смесь затем разбавляли 1Х 0,9% солевым раствором при перемешивании и непрореагировавшие альдегидные группы "блокировали" 1 молярным эквивалентом натрия боргидрида NaBH₄. Время реакции блокирования составляло 3 часа.

В другом эксперименте, очищенный активированный полисахарид серотипа 12F добавляли в реакционную емкость и перемешивали с раствором CRM₁₉₇. Смесь лиофилизировали, и порошок растворяли в 0,1 M натрий-фосфатного буфера (рН 6,8) до конечной концентрации сахарида 5 мг/мл. При необходимости рН регулировали до 6,8 с применением разбавленного HCl или 1Н раствора NaOH. Затем добавляли 3 молярных эквивалента NaCNBH₃. Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при 23°С и в течение 48 часов при 37°С. Реакционную смесь затем разбавляли 1Х 0,9% солевым раствором, непрореагировавшие альдегидные группы "блокировали" 1 молярным эквивалентом натрия боргидрида NaBH₄. Время реакции блокирования составляло 3 часа.

Очистка конъюгата

Блокированную реакционную смесь фильтровали с применением 5 мкм фильтра и затем очищали с применением мебран для ультрафильтрации с MWCO 100 кДа. Конъюгат сначала диафильтровали с применением 10 мМ сукцинатного буфера в 0,9% солевом растворе, рН 6,0. Очищенный конъюгат затем фильтровали через 0,45/0,22 мкм фильтры, для того чтобы получить объемный конъюгат.

Степень окисления

Успешное окисление первичного спирта в полисахариде серотипа 12F достигали с применением системы TEMPO/NCS. Гидролизованные полисахариды серотипа 12F окисляли до различных степеней окисления (DO) за счет регулирования количества совместного окислителя NCS. Влияние варьирования количества NCS на DO для различных партий и молекулярных масс полисахаридов показано на Фигуре 9. Как правило, реакция окисления завершалась за 2 часа, поскольку никаких значительных изменений в DO не наблюдалось после 2 часов. Несколько конъюгатов серотипов 12F получали и характеризовали с применением TEMPO/NCS окисления полисахарида. Результаты приведены в Таблице 12.

Пример 8. Иммуногенность конъюгатов Pn-12F-CRM₁₉₇ с применением TEMPO/NCS способа окисления

Титры опсонофагоцитирующей активности (OPA) для конъюгатов серотипа 12F-CRM₁₉₇ у мышей определяли в стандартных условиях. OPA титры (среднегеометрические титры (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре и семь недель, приведенные в Таблице 13, показывают, что конъюгат серотипа 12F-CRM₁₉₇ (Партия 12F-97B; также смотри Таблицу 12 для характеристических данных этого конъюгата) вызвал OPA титры в модели иммуногенности на мышах. Конъюгат, полученный с помощью TEMPO-NCS, проявлял более высокую иммуногенность по сравнению с контрольным конъюгатом (171В), полученным с помощью окисления периодатом.

Пример 9. Оценка стабильности Pn-12F гликоконъюгатов

Сравнение стабильности (при 25°С) конъюгатов, полученных окислением периодатом и окислением с помощью TEMPO/NCS (смотри Фигуру 10), показало, что конъюгаты, полученные путем окисления Pn-12F полисахаридов с помощью TEMPO/NCS, были относительно более стабильными. Как показано на Фигуре 10, для гликоконъюгата, полученного путем окисления Pn-12F полисахарида периодатом при температуре 25°С, наблюдалось увеличение содержания свободного сахарида с течением времени. В отличие от этого, гликоконъюгат, полученный окислением Pn-12F полисахарида с помощью TEMPO/NCS, проявил незначительные тенденции в отношении увеличения содержания свободного сахарида в аналогичных условиях.

Пример 10. Получение конъюгата полисахарида серотипа 15В-CRM₁₉₇

Получение выделенного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 15В

Капсульные полисахариды серотипа 15В могут быть получены непосредственно из бактерий с применением процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области. S. pneumoniae серотипа 15В выращивали в виале для посевного материала, а затем переносили в ферментер для посевного материала. После достижения целевой оптической плотности, клетки переносили в ферментер промышленного масштаба. Ферментативный бульон инактивировали добавлением N-лауроилсаркозина и очищали с применением ультрафильтрации и диафильтрации.

Затем оптимизировали размер очищенного полисахарида S. pneumoniae серотипа 15В с помощью гомогенизации под высоким давлением с применением PANDA 2K® гомогенизатора (GEA Niro Soavi, Parma, Italy), получая выделенный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В.

Предпочтительно, выделенный капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, полученный согласно способу, указанному выше, содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарид серотипа 15В и имеет молекулярную массу от 50 кДа до 500 кДа, предпочтительно от 150 кДа до 350 кДа.

Окисление выделенного капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 15В

Окисление полисахарида проводили в 100 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,0) последовательным добавлением рассчитанного количества 500 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,0) и WFI, получая конечную концентрацию полисахарида 2,0 г/л. При необходимости рН реакции регулировали до рН около 6,0. После регулирования рН, температуру реакции регулировали до 23°С. Окисление инициировали путем добавления около 0,25 молярных эквивалентов натрия периодата. Реакцию окисления проводили при 23°С в течение около 16 часов.

Концентрирование и диафильтрацию активированного полисахарида проводили с применением кассет для ультрафильтрации с мебранами с MWCO 10 кДа. Диафильтрацию проводили 20-кратным диаобъемом WFI. Очищенный активированный полисахарид затем хранили при 5°С. Очищенный активированный сахарид характеризовали среди прочего (i) концентрацией сахарида по колориметрическому анализу; (ii) концентрацией альдегида по колориметрическому анализу; (iii) степенью окисления; (iv) молекулярной массой по SEC-MALLS и (v) присутствием О-ацетила и глицерина.

SEC-MALLS применяют для определения молекулярной массы полисахаридов и конъюгатов полисахарид-белок. SEC применяют для разделения полисахаридов по гидродинамическому объему. Показатель преломления (RI) и детекторы многоуглового рассеяния лазерного излучения (MALLS) применяют для определения молекулярной массы. Когда свет взаимодействует с материей, он рассеивается, и количество рассеянного света связано с концентрацией, квадратом dn/dc (специфические приращения показателя преломления), и молярной массой вещества. Измерение молекулярной массы рассчитывают на основе считанных сигналов рассеянного света детектора MALLS и концентрации сигнала RI детектора.

Степень окисления (DO = количество моль повторяющегося фрагмента сахара / количество моль альдегида) активированного полисахарида определяли следующим образом:

Количество моль повторяющегося фрагмента сахара определяют с применением различных колориметрических способов, например, с применением антронового способа. Полисахарид сначала разрушают до моносахаридов действием серной кислоты и тепла. Антроновый реагент взаимодействует с гексозой с образованием комплекса желто-зеленого цвета, чье поглощение считывают спектрофотометрически при длине волны 625 нм. В пределах диапазона анализа, поглощение прямо пропорционально количеству присутствующей гексозы.

Одновременно также определяют количество моль альдегида, применяя МВТН колориметрический способ. МВТН анализ включает образование азинового соединения за счет взаимодействия альдегидных групп (данного образца) с гидразоном 3-метил-2-бензотиозолона (реагент для МВТН анализа). Избыток гидразона 3-метил-2-бензотиозолона окисляется с образованием реакционноспособного катиона. Реакционноспособный катион и азин реагируют с образованием голубого хромофора. Образованный хромофор считывают спектроскопически при длине волны 650 нм.

Предпочтительно, активированный капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, полученный согласно способу, указанному выше, содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В и имеет молекулярную массу от 50 кДа до 500 кДа, предпочтительно от 150 кДа до 350 кДа.

Конъюгирование активированного капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 15В с CRM₁₉₇

Процесс конъюгирования включает следующие стадии:

a) Смешивания с сахарозным эксципиентом и лиофилизации;

b) Восстановления лиофилизированного активированного полисахарида и CRM₁₉₇;

c) Конъюгирования активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирования; и

d) Очистка конъюгата.

а) Смешивание с сахарозным эксципиентом и лиофилизация

Активированный полисахарид смешивали с сахарозой в соотношении 25 грамм сахарозы на грамм активированного полисахарида. Флакон полученной смеси затем лиофилизировали. После лиофилизации, флаконы, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид, хранили при -20°С. Рассчитанное количество белка CRM₁₉₇ подвергали отдельной лиофилизации путем замораживания тонкого слоя на стенке вращающегося сосуда (shell-freezing). Лиофилизированный CRM₁₉₇ хранили при -20°С.

b) Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). После полного растворения полисахарида, к лиофилизированному CRM₁₉₇ добавляли такое же количество безводного ДМСО для восстановления.

c) Конъюгация и блокирование

Перед началом конъюгирования с натрия цианоборгидридом восстановленный активированный полисахарид смешивали с восстановленным CRM₁₉₇ в реакционной емкости (соотношение при загрузке: 0,8:1), с последующим тщательным перемешиванием для получения прозрачного раствора. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляет около 1 г/л. Конъюгацию инициировали за счет добавления 1,0-1,5 М-экв. натрия цианоборгидрида в реакционную смесь и инкубировали при 23°С в течение 40-48 часов. Реакцию конъюгации завершали за счет добавления 2 эквивалентов натрия боргидрида (NaBH₄) для того, чтобы блокировать непрореагировавшие альдегиды. Данную реакцию блокирования проводили при 23°С в течение 3 часов.

d) Очистка конъюгата

Раствор конъюгата разбавляли 1:10 охлажденным 5 мМ сукцинатом в 0,9% солевом растворе (рН 6,0) в рамках подготовки для очистки фильтрованием тангенциальным потоком с применением мембран с MWCO 100-300 кДа. Разбавленный раствор конъюгата пропускали через 5 мкм фильтр, и диафильтрацию проводили с применением 5 мМ сукцината в 0,9% солевом растворе (рН 6,0) в качестве среды. После того как диафильтрация завершалась, ретентат конъюгата фильтровали через 0,22 мкм фильтр.

Конъюгат дополнительно разбавляли 5 мМ сукцинатом в 0,9% солевом растворе (рН 6), до целевой концентрации сахарида около 0,5 мг/мл. Конечная стадия фильтрования через 0,22 мкм завершалась с получением гликоконъюгата. Предпочтительно, конъюгат, полученный согласно способу, указанному выше, содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарид серотипа 15В, имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа и имеет степень конъюгации от 2 до 6.

Пример 11. Характеристика гликоконъюгата, содержащего капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, ковалентно связанный с CRM₁₉₇

Конъюгат 1 получали согласно способу из Примера 10. Конъюгаты 2 и 3 получали согласно аналогичному способу с применением различного количества окислительного агента. Конъюгат 4 получали согласно аналогичному способу за исключением того, что не оптимизировали размер очищенного капсульного полисахарида серотипа 15В и активировали до меньшей DO (более высокие степени окисления) и конъюгацию проводили в водной среде. Конъюгат 5 получали согласно аналогичному способу за исключением того, что оптимизацию размера очищенного капсульного полисахарида серотипа 15В проводили путем химического гидролиза, и конъюгацию проводили в водной среде. Конъюгаты 6 и 7 получали согласно аналогичному способу за исключением того, что не оптимизировали размер очищенного капсульного полисахарида серотипа 15В. Полученные конъюгаты были охарактеризованы и результаты приведены в Таблице 14.

Процент свободного полисахарида измеряют, применяя методики с применением геля гидроксида алюминия, связывающего белок, и ковалентно связанный сахарид удаляют путем центрифугирования. Образцы перемешивают с фосфатным буфером геля гидроксида алюминия и центрифугируют. Связанный сахарид пеллетируют с гелем, и свободный сахарид остается в супернатанте. Проводят количественный анализ полученного в результате супернатанта и контрольных образцов с помощью соответствующих методов колориметрии, чтобы определить процент свободного сахарида, и удостовериться в достаточной степени удаления белка и восстановления сахарида.

Для аминокислотного анализа образец полисахарид-белок сначала гидролизуют до его индивидуальных компонентов в виде свободных аминокислот с применением 6Н соляной кислоты (HCl) в вакууме и при нагревании (160°С в течение 15 минут). После гидролиза, образцы анализируют с применением аминокислотного анализатора. Индивидуальные аминокислоты разделяют с помощью ионно-обменной хроматографии с применением ступенчатого градиента буфера цитрата натрия с изменением температуры и скорости потока. После разделения остаточное количество каждой аминокислоты количественно определяют с применением системы детектирования, основанной на связывании с нингидрином, после колонки. В данной системе нингидрин перемешивают с элюатом колонки в послеколоночной системе реакторов и смесь направляют в фотометр. Реакция нингидрина с элюированными аминокислотами дает соединение пурпурного цвета, максимум поглощения которого находится на 570 нм. Данное поглощение представляет собой линейный ответ (функцию) количества присутствующих α-аминогрупп, и данная реакция предусматривает количественный колориметрический анализ для всех органических соединений с α-аминогруппами. В реакции с аминокислотами, такими как пролин и гидроксилпролин, у которых отсутствует свободная аминогруппа, образуется ярко-желтое соединение, и его определяют на 440 нм. Площади пиков для каждой аминокислоты рассчитывают с применением длины волны выходов как при 570 нм, так и 440 нм.

Выход рассчитывают следующим образом: (количество полисахарида в конъюгате × 100) / количество активированного полисахарида.

Конъюгаты (4 и 5), полученные с применением водной среды, демонстрировали значительное снижение степени О-ацетилирования. Конъюгаты, полученные в растворителе ДМСО, с применением нативного полисахарида без оптимизации размера M_w (6 и 7) не демонстрировали снижения степени О-ацетилирования. Однако выходы конъюгатов были очень низкие, также низкими были характеристиками фильтруемости. Конъюгаты, полученные в ДМСО с применением полисахаридов, размер которых оптимизировали с помощью гомогенизации под высоким давлением (1, 2 и 3), имели высокий выход и лучшие характеристики фильтруемости со значительным сохранением степени О-ацетилирования. Данные конъюгаты также имели очень низкие уровни свободных полисахаридов.

Пример 12. Анализ опсонофагоцитирующей активности (OPA) с применением конъюгатов Pn-15B-CRM₁₉₇

Иммуногенность конъюгатов S. pneumoniae серотипа 15В согласно изобретению может быть оценена с применением OPA анализа, описанного ниже. Группу из 30 самок мышей Swiss Webster возрастом 6-7 недель иммунизировали с помощью 0,001 мкг, 0,01 мкг, или 0,1 мкг исследуемых конъюгатов посредством их введения подкожно в неделю 0. Мышей бустировали такой же дозой конъюгата на неделе 3, и затем делали забор крови на недели 4. Анализ серотип-специфической OPA проводили на образцах сывороток, полученных на недели 4.

OPA применяют для измерения функциональных антител специфичных к S. pneumoniae серотипа 15В в сыворотке крови мышей. Исследуемую сыворотку вводили в реакции анализа, в которых измеряют способность капсульного полисахарида специфического иммуноглобулина опсонизировать бактерии, запускать отложение комплемента, тем самым облегчая фагоцитоз и уничтожая бактерии с помощью фагоцитов. OPA титр определяют как обратное разведение, которое в результате приводит к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки. OPA титр интерполируют по двум разведениям, при которых выполняется данный 50% предел уничтожения.

Анализ OPA основан на способах, описанных в Hu et al. (2005) Clin Diagn Lab Immunol12 (2):287-295 со следующими модификациями. Исследуемую сыворотку серийно разбавляли в 2,5 раза и добавляли в планшеты для микротитрования для анализа. Живые целевые бактериальные штаммы серотипа 10А и 15В бактерий-мишеней добавляли в лунки, и планшеты встряхивали при 37°С в течение 30 минут. Дифференцированные HL-60 клетки (фагоциты) и сыворотку детенышей кроликов (возрастом 3-4-недели, PEL-FREES®, 6,25% конечная концентрация) добавляли в лунки, и планшеты встряхивали при 37°С в течение 45 минут. Для прекращения реакции, 80 мкл 0,9% NaCl добавляли во все лунки, перемешивали, и аликвоту 10 мкл переносили в лунки MULTISCREEN® HTS HV планшетов, содержащих 200 мкл воды, для фильтрования (MILLIPORE®). Жидкость из планшетов отфильтровали в вакууме, и 150 мкл среды HYSOY® добавляли в каждую лунку и снова фильтровали. Планшеты для фильтрования затем инкубировали при 37°С, 5% СО₂ на протяжении ночи и затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Планшеты затем окрашивали Кумасси синим и обесцвечивали один раз. Был проведен имиджинг и подсчет колоний анализатором IMMUNOSPOT®, Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH). Необработанные данные по подсчету колоний использовали для построения кривых по уничтожению и рассчета OPA титров.

Иммуногенность конъюгатов 1 и 2 исследовали в соответствии с указанным выше анализом. Один дополнительный конъюгат и неконъюгированный нативный капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В (неконъюгированный PS) также исследовали в таком же анализе.

Конъюгат 9 получали путем конъюгации нативного (то есть не оптимизированного по размерам) капсульного полисахарида серотипа 15В с CRM₁₉₇ посредством восстановительного аминирования в водном растворе.

Результаты показаны в Таблице 15.

Как показано в приведенной выше Таблице 15, конъюгаты 1 и 2 при введении мышам генерировали антитела способные к опсонизации S. pneumoniae серотипа 15В, запускали отложение комплемента, тем самым облегчая фагоцитоз и уничтожая бактерии с помощью фагоцитов. Кроме того, несмотря на их более низкую молекулярную массу, они также показали аналогичный уровень иммуногенности по сравнению с конъюгатом 9, который не был оптимизирован по размеру.

Пример 13. Получение конъюгата полисахарид серотипа 22F-CRM₁₉₇ Получение выделенного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F S. pneumoniae серотип 22F выращивали в виале для посевного материала, а затем переносили в ферментер для посевного материала. После того как целевая оптическая плотность была достигнута, клетки переносили в ферментер промышленного масштаба. Ферментативный бульон инактивировали добавлением N-лауроилсаркозина и очищали с применением ультрафильтрации и диафильтрации.

Проводили оптимизацию размера очищенного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F гомогенизацией под высоким давлением с применением PANDA 2K® гомогенизатора (GEA Niro Soavi, Parma, Italy), получая выделенный полисахарид S. pneumoniae серотипа 22F.

Окисление выделенного капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F

Окисление полисахарида проводили в 100 мМ калий-фосфатного буфера (рН 5,8), полученном последовательным добавлением рассчитанного количества 500 мМ калий-фосфатного буфера (рН 5,8) и WFI, с получением конечной концентрации полисахарида 2,0 г/л. При необходимости рН реакции регулировали до около 5,8. После регулирования рН, температуру реакции понижали до 5°С. Окисление инициировали путем добавления 0,10 молярного молярного эквивалента (м-экв.) периодата натрия. Целевое время реакции окисления составляет 16 часов при 5°С.

Реакцию окисления гасили 2 м-экв. 2,3-бутандиола при продолжении перемешивания при 5°С в течение 1-2 часов.

Концентрацию и диафильтрацию активированного полисахарида проводили с применением кассет для ультрафильтрации с мебранами с MWCO 100 кДа. Диафильтрацию проводили 35-кратным диаобъемом WFI. Очищенный активированный полисахарид хранили при 5°С. Очищенный активированный сахарид характеризовали среди прочего (i) молекулярной массой согласно SEC-MALLS, (ii) присутствием О-ацетила и (iii) степенью окисления.

SEC-MALLS применяют для определения молекулярной массы полисахаридов и конъюгатов полисахарид-белок. SEC применяют для разделения полисахаридов по гидродинамическому объему. Показатель преломления (RI) и детекторы многоуглового рассеяния лазерного излучения (MALLS) применяют для определения молекулярной массы. Когда свет взаимодействует с материей, он рассеивается, и количество рассеянного света связано с концентрацией, квадратом dn/dc (специфические приращения показателя преломления), и молярной массой вещества. Измерение молекулярной массы рассчитывают на основе считанных сигналов рассеянного света детектора MALLS и концентрации сигнала RI детектора.

Степень окисления (DO = количество моль повторяющегося фрагмента сахара / количество моль альдегида) активированного полисахарида определяли следующим образом:

Количество моль повторяющегося фрагмента сахара определяют, с применением различных способов колориметрии, например, с применением антронового метода. Полисахарид сначала разрушают до моносахаридов действием серной кислоты и тепла. Антроновый реагент взаимодействует с гексозой с образованием комплекса желто-зеленого цвета, чье поглощение считывается спектрофотометрически на 625 нм. В пределах диапазона анализа, поглощение прямо пропорционально количеству присутствующей гексозы.

Одновременно также определяют количество моль альдегида с применением МВТН колориметрического способа. МВТН анализ включает образование азинового соединения за счет взаимодействия альдегидных групп (данного образца) с гидразоном 3-метил-2-бензотиозолона (реагент для МВТН анализа). Избыток гидразона 3-метил-2-бензотиозолона окисляется с образованием реакционноспособного катиона. Реакционноспособный катион и азин реагируют с образованием голубого хромофора. Образованный хромофор считывают спектроскопически на 650 нм.

Конъюгирование активированного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F с CRM₁₉₇

Процесс конъюгирования включал следующие стадии:

а. Смешивания с сахарозным эксципиентом, и лиофилизации;

b. Восстановления лиофилизированного полисахарида и CRM₁₉₇;

с. Конъюгирования активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирования; и

d. Очистки конъюгата

а. Смешивание с сахарозой и лиофилизация Активированный полисахарид смешивали с сахарозой (50% мас./об. в WFI) в соотношении 25 грамм сахарозы на грамм активированного полисахарида. Флакон полученной смеси затем лиофилизировали. После лиофилизации, флаконы, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид, хранили при -20°С. Рассчитанное количество белка CRM₁₉₇ (целевое S/P соотношение при загрузке = 1) подвергали отдельной лиофилизации путем замораживания тонкого слоя на стенке вращающегося сосуда (shell-freezing). Лиофилизированный CRM₁₉₇ хранили при -20°С.

b. Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). После полного растворения полисахарида, такое же количество безводного ДМСО добавляли к лиофилизированному CRM₁₉₇ для восстановления.

с. Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирование

Восстановленный CRM₁₉₇ (в ДМСО) смешивали в емкости для реакции конъюгации с восстановленным активированным полисахаридом. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляет 1 г/л. Конъюгацию инициировали за счет добавления в реакционную смесь 1,5 М-экв. натрия цианоборгидрида, и реакцию инкубировали при 23°С в течение 20 часов. Завершение реакции конъюгирования осуществляли за счет добавления 2 М-экв. натрия боргидрида. Реакцию блокирования инкубировали при 23°С в течение 3 часов.

d. Очистка конъюгата

Раствор конъюгата разбавляли 1:5 охлажденным 5 мМ сукцинатом в 0,9% солевого раствора (рН 6,0), и очищали фильтрованием тангенциальным потоком с применением мембран с MWCO 100 кДа, и диафильтрацию проводили с применением 20-кратного объема 5 мМ сукцината в 0,9% солевого раствора (рН 6,0) в качестве среды. После того, как диафильтрация завершалась, ретентат конъюгата дополнительно разбавляли, фильтровали через 0,22 мкм фильтр и хранили при 2-8°С.

Несколько конъюгатов были получены с применением описанного выше способа за счет варьирования различных параметров (например, соотношением сахарид-белок при загрузке, концентрации реакционной смеси и количества м-экв натрия цианоборгидрида). Характеристика для представленных Pn-22F гликоконъюгатов с CRM₁₉₇ приведена в Таблице 16.

Степень % O-Ацетилирования (сохранившегося) в конечном конъюгате рассчитывали как отношение содержания O-ацетила в конъюгате (мкмоль O-ацетила на мкмоль повторяющегося фрагмента сахарида серотипа 22F) к содержанию O-ацетила в полисахариде (мкмоль O-Ацетила на мкмоль повторяющегося фрагмента сахарида серотипа 22F).

Иммуногенность конъюгатов, полученных выше, оценивали с применением анализа опсонофагоцитирующей активности (ОРА), который описан ниже.

Группу из тридцати самок мышей Swiss Webster возрастом 6-7 недель иммунизировали с помощью 0,001 мкг, 0,005 мкг, или 0,01 мкг исследуемых конъюгатов с помощью подкожной инъекции неделю 0. Мышей бустировали такой же дозой конъюгата на неделе 3, и затем брали кровь на неделе 4. Анализ серотип-специфической ОРА проводили на образцах сывороток, полученных на неделе 4.

Анализ опсонофагоцитирующей активности (ОРА) применяют для измерения функциональных антител, специфичных к S. pneumoniae серотипа 22F, в сыворотке крови мышей. Исследуемую сыворотку вводят в реакции анализа, в которых измеряют способность капсульного полисахарида специфического иммуноглобулина опсонизировать бактерии, запускать отложение комплемента, тем самым облегчая фагоцитоз и уничтожая бактерии с помощью фагоцитов. ОРА титр определяют как обратное разведение, которое в результате приводит к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки. ОРА титр интерполируют по двум разведениям, при которых выполняется данный 50% предел уничтожения.

Анализ ОРА основан на способах, описанных в Hu et al. (2005) Clin Diagn Lab Immunol12(2):287-295 со следующими модификациями. Исследуемую сыворотку серийно разбавляли в 2,5 раза и добавляли в планшеты для микротитрования для анализа. Живые целевые бактериальные штаммы серотипа 22F добавляли в лунки и планшеты встряхивали при 25°С в течение 30 минут. Дифференцированные HL-60 клетки (фагоциты) и сыворотку детенышей кроликов (возрастом 3-4-недели, PEL-FREES®, 12,5% конечная концентрация) добавляли в лунки, и планшеты встряхивали при 37°С в течение 45 минут. Для прекращения реакции, 80 мкл 0,9% NaCl добавляли во все лунки, перемешивали, и аликвоту 10 мкл переносили в лунки MULTISCREEN® HTS HV планшетов, содержащих 200 мкл воды, для фильтрования (MILLIPORE®). Жидкость из планшетов отфильтровали в вакууме, и 150 мкл среды HYSOY® добавляли в каждую лунку и снова фильтровали. Планшеты для фильтрования затем инкубировали при 37°С, 5% CO₂ на протяжении ночи и затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Планшеты затем окрашивали Кумасси синим и обесцвечивали один раз. Был проведен имиджинг и подсчет колоний анализатором IMMUNOSPOT®, Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, ОН). Необработанные данные по подсчету колоний применяли для построения кривых по уничтожению и рассчета ОРА титров.

Титры опсонофагоцитирующей активности (ОРА) для конъюгатов серотип 22F-CRM-I97 определяли, как указано выше. ОРА титры (среднегеометрические титры (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре недели в различных дозах, приведенные в Таблицах 17 и 18, (два отдельных эксперимента), показывают, что конъюгат серотипа 22F (партии 1-7; также смотри Таблицу 16 для характеристических данных этих конъюгатов) вызвал ОРА титры в модели иммуногенности на мышах.

Пример 14. Получение конъюгатов Pn-11А с CRM₁₉₇

Получение гликоконъюгатов Pn-11A RAC

Замороженный, оптимизированный по размерам полисахарид, который хранили в деионизированной воде или 25 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,0) размораживали при 5°С.

Окисление полисахарида

Окисление полисахарида проводили в 100 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,0) посредством добавления 500 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,0) и WFI, получая конечную концентрацию полисахарида 2,0 г/л. Реакцию окисления проводили при 23°С. Окисление инициировали путем добавления натрия периодата. Скорость перемешивания находилась в диапазоне от 100-140 оборотов в минуту.

Очистка активированного полисахарид 11А

Концентрацию и диафильтрацию активированного полисахарида проводили с применением кассет для ультрафильтрации. Диафильтрацию проводили 20-кратным диаобъемом WFI. После фильтрования через фильтр 0,22 мкм, очищенный активированный полисахарид хранили при 5°С.

Описание процесса конъюгирования

Процесс конъюгирования включает следующие стадии:

а. Лиофилизации путем замораживания тонкого слоя на стенке вращающегося сосуда (shell-freezing) белка CRM₁₉₇;

b. Восстановления активированного полисахарида и CRM₁₉₇;

с. Конъюгирования активированного полисахарида с CRM₁₉₇; и

d. Очистки и разбавления конъюгата

а. Лиофилизация путем замораживания тонкого слоя на стенке вращающегося сосуда (shell-freezing)белка CRM₁₉₇ Белок CRM₁₉₇ подвергали лиофилизации путем замораживания тонкого слоя на стенке вращающегося сосуда (shell-freezing).

b. Восстановление активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Раствор активированного полисахарида (~10 г/л) загружали в реактор с последующим добавлением рассчитанного количества 0,5 Н натрий-фосфатного буфера (рН 7,2). При перемешивании добавляли лиофилизированный CRM₁₉₇, и реакционную смесь перемешивали в течение 2-4 часов для того, чтобы достичь полного растворения CRM₁₉₇.

с. Конъюгация и блокирование

Конъюгацию инициировали за счет добавления цианоборгидрида. Реакционную смесь инкубировали при 23°С в течение 72-96 часов. Завершение реакции конъюгации осуществляли за счет добавления 0,5 Х WFI с последующим 2 М-экв. натрия боргидрида. Данную реакцию блокирования проводили при 23°С в течение 3-4 часов.

d. Разбавление и начальная очистка конъюгата Раствор конъюгата разбавляли 1:5 (реакционный объем) 0,15 Н натрий-фосфатного буфера (рН 8,0), и очищали фильтрованием тангенциальным потоком (TFF). Разбавленный конъюгат перемешивали в емкости для разбавления и затем фильтровали через 5 мкм фильтр. Фильтрованный раствор конъюгата затем концентрировали до 1-2 г/л. Проводили двухстадийный способ диафильтрации. На первой стадии, TFF проводили с применением 30-кратного объема (диафильтрационный объем) 0,15 Н натрий-фосфатного буфера (рН 8,0) с последующим 20-кратным 5 мМ сукцинатом в 0,9% NaCl (pH 6,0). После того как начальная диафильтрация завершалась, ретентат конъюгата фильтровали через 0,4/ 5 мкм фильтры в емкость для сбора.

Конечная диафильтрация конъюгата

Конечная стадия очистки представляла собой диафильтрацию 20-кратным объемом 5 мМ сукцината в 0,9% NaCl, рН 6,0 с применением регенерируемых целлюлозных мембран.

Разбавление моновалентного объемного конъюгата (МВС)

Конъюгат дополнительно разбавляли 5 мМ сукцинатом в 0,9% NaCl, рН 6, до целевой концентрации сахарида 0,5 мг/мл. Конечная стадия фильтрования через фильтр 0,22 мкм завершалась с получением продукта моновалентного объемного конъюгата (МВС) для лекарственных составов.

Несколько конъюгатов было получено с применением описанных выше способов за счет варьирования различных параметров (например, соотношения сахарид-белок при загрузке, концентрации реакционной смеси и М-экв. натрия цианоборгидрида). Характеристики представленных гл и ко конъюгатов Pn-11А с CRM₁₉₇ приведены в Таблице 19 (партии 1-5).

Получение гликоконъюгатов Pn-11А с применением RAC/ДМСО

Окисленный полисахарид получали и очищали, как описано выше (смотри получение гликоконъюгатов Pn-11A RAC).

Конъюгация посредством восстановительного аминирования в ДМСО (RAC/ДМСО)

Конъюгация 11А посредством RAC/ДМСО включала следующие стадии:

а. Смешивания с сахарозой, лиофилизации путем замораживания тонкого слоя на стенке вращающегося сосуда (shell-freezing);

b. Восстановления лиофилизированного полисахарида и CRM₁₉₇;

с. Конъюгирования активированного полисахарида с CRM₁₉₇; и

d. Очистки и разбавления конъюгата.

а. Смешивание с сахарозой, лиофилизация путем замораживания тонкого слоя на стенке вращающегося сосуда (shell-freezing) Активированный полисахарид, полученный оптимизацией размера полисахарида, смешивали с сахарозой (50% мас./об. в wfi) в соотношении 25 грамм сахарозы на грамм активированного полисахарида. Компоненты смешивали в виале для лиофилизации путем замораживания тонкого слоя на стенке вращающегося сосуда (shell-freezing), полученную смесь затем лиофилизировали. CRM₁₉₇ белок подвергали отдельной лиофилизации путем замораживания тонкого слоя на стенке вращающегося сосуда (shell-freezing).

b. Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в ДМСО до концентрации 2 мг/мл. После завершения растворения полисахарида, ДМСО добавляли к лиофилизированному CRM₁₉₇ для восстановления.

с. Конъюгация и блокирование

Восстановленный CRM₁₉₇ (в ДМСО) смешивали в емкости для реакции конъюгации с восстановленным активированным полисахаридом. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляет 1 г/л. Конъюгацию инициировали за счет добавления цианоборгидрида к реакционной смеси и инкубировали при 23°С в течение 22 часов. Завершение реакции конъюгирования осуществляли за счет добавления 2 М-экв. натрия боргидрида. Данную реакцию блокирования проводили при 23°С в течение 3-4 часов.

d. Очистка и разбавление конъюгата

Раствор конъюгата очищали и разбавляли, применяя аналогичный способ, как описано выше.

Несколько конъюгатов были получены с применением описанного выше способа за счет варьирования различных параметров (например, соотношения сахарид-белок при загрузке, концентрация реакционной смеси и М-экв. натрия цианоборгидрида). Характеристики представленных гл и ко конъюгатов Pn-11А с CRM₁₉₇, полученных согласно способу, указанному выше, приведены в Таблице 19 (партии 6-8).

Совокупность данных, полученных для конъюгатов, приготовленных с применением указанных выше способов восстановительного аминирования, показывает, что эти способы позволяют получать конъюгаты с высоким выходом конъюгирования, низким % свободного сахарида и с хорошей стабильностью.

Иммуногенность конъюгатов, полученных выше, оценивали с применением анализа опсонофагоцитирующей активности (ОРА), который описан ниже.

Группу из 30 самок мышей Swiss Webster возрастом 6-7 недель иммунизировали с помощью 0,001 мкг, 0,005 мкг, 0,01 мкг, или 0,1 мкг исследуемых конъюгатов посредством их введения подкожно на неделе 0. Мышей бустировали такой же дозой конъюгата на неделе 3, и затем брали кровь на неделе 4. Анализ серотип-специфической ОРА проводили на образцах сывороток, полученных на неделе 4. Анализ опсонофагоцитирующей активности (ОРА) применяют для измерения функциональных антител, специфичных к S. pneumoniae серотипа 11А в сыворотке крови мышей. Исследуемую сыворотку вводили в реакции анализа, в которых измеряют способность капсульного полисахарида специфического иммуноглобулина опсонизировать бактерии, запускать отложение комплемента, тем самым облегчая фагоцитоз и уничтожая бактерии с помощью фагоцитов. ОРА титр определяют как обратное разведение, которое в результате приводит к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки. ОРА титр интерполируют по двум разведениям, при которых выполняется данный 50% предел уничтожения.

Анализ ОРА основан на способах, описанных в Hu et al., (2005) Clin Diagn Lab Immunol12 (2):287-295 со следующими модификациями. Исследуемую сыворотку серийно разбавляли в 2,5 раза и добавляли в планшеты для микротитрования для анализа. Живые целевые бактериальные штаммы серотипа 11А добавляли в лунки, и планшеты встряхивали при 25°С в течение 30 минут. Дифференцированные HL-60 клетки (фагоциты) и сыворотку детенышей кроликов (возрастом 3-4-недели, PEL-FREES®, 12,5% конечная концентрация) добавляли в лунки, и планшеты встряхивали при 37°С в течение 60 минут. Для прекращения реакции, 80 мкл 0,9% NaCl добавляли во все лунки, перемешивали, и аликвоту 10 мкл переносили в лунки MULTISCREEN® HTS HV планшетов, содержащих 200 мкл воды, для фильтрования (MILLIPORE®). Жидкость из планшетов отфильтровали в вакууме, и 150 мкл среды HYSOY® добавляли в каждую лунку и фильтровали. Планшеты для фильтрования затем инкубировали при 37°С, 5% CO₂ на протяжении ночи и затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Планшеты затем окрашивали Кумасси синим и обесцвечивали один раз. Был проведен имиджинг и подсчет колоний анализатором IMMUNOSPOT®, Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, ОН). Необработанные данные по подсчету колоний использовали для построения кривых по уничтожению и рассчета ОРА титров.

Титры опсонофагоцитирующей активности (ОРА) для конъюгатов серотипа 11А-CRM₁₉₇ у мышей определяли, как указано выше. ОРА титры (среднегеометрические титры (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре недели в различных дозах, приведенные в Таблице 20, показывают, что конъюгат серотипа 11А (партии 2-4 и 8; также смотри Таблицу 19 для характеристических данных этих конъюгатов) вызвал ОРА титры в модели иммуногенности на мышах.

Пример 15. Состав 16-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины

Получена 16-валентная конъюгированная композиция, содержащая полисахариды S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F (16vPnC), которые все независимо получены конъюгированием с CRM₁₉₇. Гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 15В, 22F и 33F были получены, как раскрыто выше, и гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F были получены, как раскрыто в WO 2006/110381.

Требуемые объемы составных концентратов рассчитывали на основе объема партии и концентраций составных сахаридов. Полученную составную вакцину получали за счет добавления требуемого объема сукцинатного буфера в NaCl (pH 5,8) для того, чтобы получить конечную целевую концентрацию сукцинатного буфера 5,0 мМ и 150 мМ NaCl. Добавляли полисорбат 80 (PS80) до конечной концентрации 0,02% и 16 пневмококковых конъюгатов. Полученную смесь фильтровали через мембрану 0,2 мкм Millipore PES, с последующим добавлением AlPO₄. Препарат перемешивали для обеспечения связывания и достижения гомогенности.

Составом затем наполняли стеклянные шприцы, чтобы доставлять дозу объемом 0,5 мл.

Конечная дозированная форма содержала 2,2 мкг каждого из полисахаридов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F независимо полученных конъюгированием с CRM₁₉₇, 4,4 мкг гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 6В, 5 мМ сукцинатного буфера с pH 5,8, 0,02 PS80, 150 мМ NaCl и 0,25 мг/мл алюминия в виде AlPO₄ для дозы 0,5 мл. Содержание CRM₁₉₇, составляло около 38 мкг для дозы 0,5 мл.

Пример 16. Состав 20-валентно и пневмококковой конъюгированной вакцины

Получена 20-валентная конъюгированная композиция, содержащая полисахариды S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10A, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F (20vPnC), которые все независимо получены конъюгированием с CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты на основе S. pneumoniae серотипов 8, 10A, 11А, 12F, 15В, 22F и 33F были получены, как раскрыто выше, и гликоконъюгаты на основе S. Pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F были получены, как раскрыто в WO 2006/110381.

Требуемые объемы составных концентратов рассчитывали на основе объема партии и концентраций составного сахаридов. Полученную составную вакцину получали за счет добавления требуемого объема сукцинатного буфера в NaCl (рН 5,8) для того, чтобы получить конечную целевую концентрацию сукцинатного буфера 5,0 мМ и 150 мМ NaCl. Добавляли полисорбат 80 до конечной концентрации 0,02% и 20 пневмококковых конъюгатов. Полученую смесь фильтровали через мембрану 0,2 мкм Millipore PES, с последующим добавлением AlPO₄. Препарат хорошо перемешивали, чтобы получить максимальное связывание конъюгатов с алюминием.

Составом затем наполняли стеклянные шприцы, чтобы доставлять дозу объемом 0,5 мл.

Конечная дозированная форма содержала 2,2 мкг каждого из полисахаридов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F независимо полученных конъюгированием с CRM₁₉₇, 4,4 мкг гликоконъюгата на основе S. pneumoniae серотипа 6В, 5 мМ буфера сукцината рН 5,8, 0,02 PS80, 150 мМ NaCl и 0,25 мг/мл алюминия в виде AlPO₄ для дозы 0,5 мл. Содержание CRM₁₉₇, составляло около 46 мкг для дозы 0,5 мл.

Пример 17. Иммуногенность 16-валентной иммуногенной композиции

Иммуногенность 16-валентной иммуногенной композиции (смотри Пример 15) оценивали на кроликах с применением мультиплексных прямых иммуноанализов Luminex (dLIAs) для того, чтобы измерить концентрации серотип-специфических IgG в сыворотке и серотип-специфические ОРА.

Группу из десяти самок новозеландских белых кроликов массой от 2,5 кг до 3,5 кг иммунизировали предложенной для человека клинической дозой (2,2 мкг конъюгата за исключением серотипа 6В, в случае которого брали 4,4 мкг; плюс 0,1 мг алюминия в виде AlPO₄) посредством внутримышечного введения на неделе 0. Кроликов бустировали такой же дозой конъюгированной вакцины на неделе 2, и затем брали кровь на неделе 4. Анализы серотип-специфических dLIA и ОРА проводили на образцах сывороток недели 0 и недели 4.

Для количественной оценки общего связывания полисахаридных антител (IgG), специфичных для каждого пневмококкового полисахарида (ПНП), кроличьи сыворотки были оценены в двух прямых иммуноанализах Luminex (dLIAs, 13-Plex dLIA, Prevnar 13® серотипы и 7-Plex dLIA, дополнительные серотипы). В 13-Plex анализе измеряют анти-PnPS антитела, специфичные к 13 серотипам, включенным в 13-валентную пневмококковую конъюгированную (PnC) вакцину (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, и 23F) и в 7-Plex анализе измеряют анти-PnPS антитела к дополнительным серотипам (15В, 22F, 33F). Каждый анализ содержит комбинацию из 13 или 7 спектрально различных магнитных микросфер, соединенных с PnPS конъюгатами (PnPS-PLL конъюгаты: PnPS, конъюгированный с поли-L-лизином).

Вкратце, референтный стандарт, контрольные и исследуемые сыворотки сначала были предварительно адсорбированы на два Pn адсорбента; CWPS1 (полисахарид клеточной стенки PnA, содержащий С-полисахарид) и CWPS2 (CWP акапсульного S. pneumoniae серотипа 2) для того, чтобы блокировать связывание неспецифических антител с PnPS покрывающим антигеном. После предварительной адсорбции, PnPS-связанные микросферы инкубировали с соответственно разбавленным референтным стандартом сыворотки, контрольными или исследуемыми сыворотками кроликов. После инкубирования, каждую смесь промывали и добавляли R-фикоэритрин-конъюгированное козье анти-кроличье IgG вторичное антитело. Сигналы флуоресценции (выраженные в виде средних значений интенсивности флуоресценции (MFI)) измеряли с применением Bio-Plex ридера и коррелировали с количеством связанного PnPS-специфического IgG. Значения для исследуемых образцов выражали в виде (единицы/мл, ед./мл).

Анализ серотип-специфическиой ОРА проводили, как описано выше. ОРА титр представляет собой обратную величину самого высокого разбавления сыворотки, которое приводит к 50% уменьшению количества бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ) по сравнению с контролем без сыворотки (определено как фоновое КОЕ). Титр интерполируют по двум разведениям, при которых выполняется данный 50% предел уничтожения.

Результаты показали значительное увеличение серотип-специфических антител IgG и функциональных ответов ОРА антител после двух иммунизации 16vPnC (Таблица 21). Уровни сывороточных IgG увеличились более чем на 2-log (2 порядка) выше базового уровня. Аналогичным образом, на основании по меньшей мере 22-кратного увеличения ОРА GMT выше базовой линии можно сделать вывод о наличии устойчивого образования функциональных антител согласно анализу ОРА. Сыворотки для иммунизации (Нед. 0) показали недетектируемые уровни PnPS-специфических IgG и функциональных антител согласно анализу ОРА для большинства 16v Pn серотипов за исключением серотипов 14 и 33F. Для данных серотипов наблюдали низкие уровни ОРА титров, но эти ответы на базовом уровне не оказывают неблагоприятного воздействия на образование антител после вакцинации.

Пример 18. Иммуногенность 20-валентной иммуногенной композиции

Иммуногенность 20-валентной иммуногенной композиции (которая получена в Примере 16) оценивали на кроликах с применением мультиплексных прямых иммуноанализов Luminex (dLIAs) для того, чтобы измерить концентрации серотип-специфических IgG в сыворотке и серотип-специфические ОРА.

Группу из десяти самок новозеландских белых кроликов массой от 2,5 кг до 3,5 кг иммунизировали предложенной для человека клинической дозой (2,2 мкг конъюгата за исключением серотипа 6В, в случае которого брали 4,4 мкг; плюс 0,1 мг алюминия в виде AlPO₄) посредством внутримышечного введения на неделе 0. Кроликов бустировали такой же дозой конъюгированной вакцины на неделе 2, и затем брали кровь на неделе 4. Анализы серотип-специфических dLIA и ОРА проводили на образцах сывороток недели 0 и недели 4.

Для количественной оценки общего связывания полисахаридных антител (IgG), специфичных для каждого пневмококкового полисахарида (ПНП), кроличьи сыворотки были оценены в двух прямых иммуноанализах Luminex (dLIAs, 13-Plex dLIA, Prevnar 13® серотипы и 7-Plex dLIA, дополнительные серотипы). В 13-Plex анализе измеряют анти-PnPS антитела, специфичные к 13 серотипам, включенным в 13-валентную пневмококковую конъюгированную (PnC) вакцину (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, и 23F) и в 7-Plex анализе измеряют анти-PnPS антитела к дополнительным серотипам (15В, 22F, 33F). Каждый анализ содержит комбинацию из 13 или 7 спектрально различных магнитных микросфер, соединенных с PnPS конъюгатами (PnPS-PLL конъюгаты: PnPS, конъюгированный с поли-L-лизином).

Вкратце, референтный стандарт, контрольные и исследуемые сыворотки сначала были предварительно адсорбированы на два Pn адсорбента; CWPS1 (полисахарид клеточной стенки PnA, содержащий С-полисахарид) и CWPS2 (CWP акапсульного S. pneumoniae серотипа 2) для того, чтобы блокировать связывание неспецифических антител с PnPS покрывающим антигеном. После предварительной адсорбции, PnPS-связанные микросферы инкубировали с соответственно разбавленным референтным стандартом сыворотки, контрольными или исследуемыми сыворотками кроликов. После инкубирования, каждую смесь промывали и добавляли R-фикоэритрин-конъюгированное козье анти-кроличье IgG вторичное антитело. Сигналы флуоресценции (выраженные в виде средних значений интенсивности флуоресценции (MFI)) измеряли с применением Bio-Plex ридера и коррелировали с количеством связанного PnPS-специфического IgG. Значения для исследуемых образцов выражали в виде (единицы/мл, ед./мл).

Анализ серотип-специфической ОРА проводили, как описано выше. ОРА титр представляет собой обратную величину самого высокого разбавления сыворотки, которое приводит к 50% уменьшению количества бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ), по сравнению с контролем без сыворотки (определено как фоновое КОЕ). Титр интерполируют по двум разведениям, при которых выполняется данный 50% предел уничтожения.

Кролики, иммунизированные 20vPnC, также демонстрировали значительное увеличение количества общих IgG и титров функциональных ОРА антител к серотипам общим для 16v- и 20v-составов, а также дополнительных четырех серотипов (8, 10А, 11А, и 12F) (Таблица 22). Для совокупности 20 серотипов наблюдали увеличение сывороточных уровней IgG на 2-log (2 порядка) после двух иммунизации. Значение ОРА GMT после вакцинирования было по меньшей мере в 27 раз выше базовой линии. Аналогичным образом, низкие уровни ОРА титров в сыворотках перед иммунизацией наблюдались для серотипов 4 и 33F после вакцинации 20vPnC, но это также не влияло на устойчивость образования антител после вакцинации.

Составы 16vPnC и 20vPnC вызвали устойчивый гуморальный ответ, который был как специфическим к пневмококковым полисахаридам, так и связан с функциональным уничтожением бактерии (смотри Таблицы 21 и 22). Таким образом, исследования, указанные в Примерах 17 и 18, продемонстрировали наличие хорошей иммуногенности как у 16vPnC, так и 20vPnC составов.

Пример 19. Оценка перекрестных реакционноспособных опсонофагоцитирующих иммунных ответов в пределах серогруппы 9 Streptococcus pneumoniae

Пневмококковый анализ опсонофагоцитирующей активности (ОРА), с помощью которого измеряют уничтожение S. pneumoniae клеток с применением фагоцитарных эффекторных клеток в присутствии функционального антитела и комплемента, как считается, является важным методом для оценки эффективности пневмококковых вакцин.

Материалы и Способы

Два случайно выбранных подмножества иммунных сывороток от взрослых, вакцинированных 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (13vPnC) были исследованы в анализах ОРА для серотипов 9В, 9А, 9L и 9N. Сыворотки собирали из клинических испытаний США 6115А1-004 (N=59, после вакцинирования) и 6115А1-3005 (N=66, соответствует до и после вакцинирования), соответственно.

Исследование 6115А1-3005 (идентификатор на сайте ClinicalTrials.gov:NCT00546572) представляло собой рандомизированное, активно-контролируемое, модифицированное двойное слепое исследование фазы 3 для оценки безопасности, переносимости и иммуногенности Prevnar 13 по сравнению с 23-валентной пневмококковой полисахаридной вакциной (23vPS) у амбулаторных пациентов преклонного возраста 70 лет и старше, которые получали 1 дозу 23vPS по меньшей мере за 5 лет до регистрации на исследование (смотри: http://http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00546572; от 31 марта 2014).

Исследование 6115А1-004 (идентификатор на сайте ClinicalTrials.gov:NCT00427895) представляло собой рандомизированное, активно-контролируемое, модифицированные двойное слепое исследование фазы 3 для оценки безопасности, переносимости и иммуногенности 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины (13vPnC) по сравнению с 23-валентной пневмококковой полисахаридной вакциной (23vPS) у взрослых в возрасте от 60 до 64 лет, которые ранее не получали 23vPS, и безопасности, переносимости и иммуногенности 13vPnC у взрослых в возрасте от 18 до 59 лет, которые ранее не получали 23vPS (смотри: http://clinicaltrials.gov/show/NCT00427895; от 31 марта 2014).

13-валентные пневмококковые конъюгированные вакцины (13vPnC), тестированные в данных исследованиях, содержали полисахариды из пневмококковых серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, и 23F, независимо полученные конъюгированием с белком-носителем CRM₁₉₇, перекрестно-реактивным с дифтерийным токсином.

ОРА применяют для измерения функциональных антител к S. pneumoniae серотипов 9V, 9N, 9А и/или 9L в сыворотках человека. Исследуемую сыворотку вводили в реакции анализа, в которых измеряют способность капсульного полисахарида специфического иммуноглобулина опсонизировать бактерии, запускать отложение комплемента, тем самым облегчая фагоцитоз и уничтожая бактерии с помощью фагоцитов. ОРА титр определяют как обратное разведение, которое в результате приводит к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки. ОРА титр интерполируют по двум разведениям, при которых выполняется данный 50% предел уничтожения.

Анализ ОРА основан на способах, описанных в Hu et al., (2005) Clin Diagn Lab Immunol122):287-295. Исследуемую инактивированную нагреванием сыворотку серийно разбавляли в 2,5 раза и добавляли вместе с бактериями-мишенями в планшеты для анализа и инкубировали в течение 30 минут с встряхиванием. Дифференцированные HL-60 клетки (фагоциты) и сыворотку детенышей кроликов (возрастом 3-4-недели, PEL-FREES®, Arkansas, 12,5% конечная концентрацию) затем добавляли в лунки, при соотношение эффектора аппроксимации к мишени 200:1, и инкубировали при 37°С с встряхиванием. Для прекращения реакции, 80 мкл 0,9% NaCl добавляли во все лунки, перемешивали, и аликвоту 10 мкл переносили в лунки MULTISCREEN® HTS HV планшетов, содержащих 200 мкл воды, для фильтрования (MILLIPORE®). Жидкость из планшетов отфильтровали в вакууме, и 150 мкл среды HYSOY® добавляли в каждую лунку и фильтровали. Планшеты для фильтрования затем инкубировали при 37°С, 5% CO₂ на протяжении ночи и затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Планшеты затем окрашивали Кумасси синим и обесцвечивали один раз. Был проведен имиджинг и подсчет колоний анализатором IMMUNOSPOT®, Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH).

Статистический анализ: рассчитывали коэффициенты корреляции Пирсона с двусторонней проверкой статистической значимости.

Результаты - ОРА ответы для 9V, 9А. 9L и 9N Перекрестно-функциональный ответ от иммунных сывороток взрослых, иммунизированных с помощью 13vPnC против серотипов 9А, 9L, и 9N, оценивали в соответствующем анализе опсонофагоцитирующих активностей микроколоний (mcOPAs), наряду с гомологичным функциональным ответом к серотипу 9V. Протестированными были два случайно выбранных подмножества иммунных сывороток от взрослых, вакцинированных 13vPnC. Сыворотки собирали из клинических испытаний в США 6115А1-004 (N=59, после вакцинирования) и 6115А1-3005 (N=66, соответствует до и после вакцинирования), соответственно. Субъекты в исследовании 6115А1-004 ранее были иммунизированы любой пневмококковой вакциной и получили одну дозу 13vPnC как часть протокола исследования. Для Иммунных сывороток из исследования 6115А1-004 наблюдали аналогичный процент субъектов, ответивших на иммунизацию, для всех серогрупп со значениями 98,3%, 98,3%, 100% и 93,2% для 9V, 9А, 9L и 9N, соответственно (Фигура 11), подтверждая результаты 6115А1-3005 (Фигура 12). Наблюдались относительно хорошие корреляции ОРА титров между серотипами 9V и 9А (коэффициент корреляции Пирсона р=0,5456, р 0,0001) или 9L (р=0,7353, р<0,0001), но не 9N (р=0,1217, р 0,3627).

Субъекты в исследовании 6115А1-3005 ранее получали 1 дозу 23vPS по меньшей мере за 5 лет до включения в исследование и получили одну дозу 13vPnC как часть протокола исследования. Панель сывороток до и после вакцинирования (N=66) от взрослых, иммунизированных 13vPnC (исследование 6115А1-3005), оценивали с помощью ОРА в отношении гомологичного ответа к серотипу 9V и перекрестной реактивности анти-9V антител к серотипам 9А, 9L и 9N. Как показано на Фигуре 12, относительно высокий иммунитет (процент ответивших на иммунизацию) к 9V (84%), 9А (66%), 9L (82%) и 9N (86%) был обнаружен в ОРА анализе, вероятно, благодаря тому, что ранее они были иммунизированы 23vPS вакциной, которая включает неконъюгированные полисахариды серотипов 9V и 9N. Тем не менее процент субъектов, ответивших на иммунизацию, увеличился до 95% или более для всех четырех серотипов после вакцинации 13vPnC, которая содержит только конъюгат серотипа 9V серогруппы 9. В Таблице 23 показано, что значения титров увеличились на порядок и что они похожи для серотипов, между которыми предполагается наличие перекрестной реактивности.

Более тщательный анализ титров ОРА показан на обратных кумулятивных кривых распределения (RCDC) на Фигурах 13-16. RCDC показывают увеличение серотип-специфического иммунного ответа после вакцинации для серотипов 9V, 9А, 9L и в меньшей степени 9N. Корреляция кратности повышения титра отдельных совпадений / образцов от 9V 9А, 9V/9L и 9V/9N были также проанализированы с использованием корреляции Пирсона. Наблюдались относительно хорошие корреляции кратности повышения титров для серотипов 9V и 9А (коэффициент корреляции Пирсона р=0,8720, р<0,0001) или 9N (р=0,5801, р<0,0001), но в меньшей степени с 9L (р=0,1804, р<0,1640).

Вывод

На основании этих данных, вакцина 13vPnC, вероятно, должна обеспечивать более широкий охват серотипов, обеспечивая дополнительную защиту от серотипов 9А, 9L и 9N.

Пример 20: Функциональные ОРА ответы против серотипа 15В и серотипа 15С

Пневмококковая серогруппа 15 включает четыре структурно связанных серотипа:

15А, 15В, 15С и 15F. Серотипы 15В и 15С являются неразличимыми генетическими методами типирования и имеют аналогичное строение капсульного полисахарида (PS), за исключением того, что 15B-PS является O-ацетилированным вариантом 15C-PS. Для того, чтобы понять, являются ли анти-капсульные антитела PS к серотипу 15В функционально кросс-реагирующими с серотипом 15С, 10 кроликов были иммунизированы 16vPnC (смотри Пример 15) и 20vPnC (смотри Пример 16) и вакцинами, содержащими иммуногенный конъюгат, содержащий капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, ковалентно связанный с CRM₁₉₇ как раскрыто в данном документе в качестве части их состава. Сыворотки перед и после вакцинации были протестированы в анализах ОРА относительно серотипов 15В и 15С целевых пневмококковых штаммов.

Из 10 кроликов в каждой группе у 100% был ОРА ответ к серотипу 15В после иммунизации конъюгатом серотипа 15В. Из этих же образцов, 100% также имели ОРА ответ к серотипу 15С (Таблицы 24 и 25). Низкие ОРА титры наблюдались в сыворотке перед вакцинацией 15С методом ОРА. Тем не менее, увеличение более чем в 10 раз GMT ОРА в сыворотке после вакцинации по сравнению со значением до вакцинации показало, что иммуногенные конъюгаты согласно изобретению индуцируют образование антител, способных уничтожать серотипы 15В и 15С Streptococcus pneumoniae согласно ОРА анализу.

Все публикации и заявки на патенты, упомянутые в описании, показывают уровень техники для специалистов в данной области, к которой относится данное изобретение. Все публикации и заявки на патенты включены в данное описание посредством ссылок таким образом, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была бы конкретно и отдельно указана для включения в качестве ссылки.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано путем иллюстраций и примеров в целях ясности понимания, определенные изменения и модификации могут быть осуществлены в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Pfizer Inc.

<120> Иммуногенные композиции, содержащие конъюгированные

капсульные сахаридные антигены и их применение

<130> PC72040A

<150> US 61/929,547

<151> 2014-01-21

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> "A класс" CpG олигонуклеотид

<400> 1

ggggacgacg tcgtgggggg g 21

<210> 2

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> "A класс" CpG олигонуклеотид

<400> 2

ggggacgacg tcgtgggggg g 21

<210> 3

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> "B класс" CpG олигонуклеотид

<400> 3

tcgtcgtttt tcggtgcttt t 21

<210> 4

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> "B класс" CpG олигонуклеотид

<400> 4

tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21

<210> 5

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> "B класс" CpG олигонуклеотид

<400> 5

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 6

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> "B класс" CpG олигонуклеотид

<400> 6

tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24

<210> 7

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> "B класс" CpG олигонуклеотид

<400> 7

tcgtcgtttt gtcgtttttt tcga 24

<210> 8

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> B-Класс олигонуклеотид

<400> 8

tcgtcgtttt tcggtgcttt t 21

<210> 9

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> B-Класс олигонуклеотид

<400> 9

tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21

<210> 10

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> B-Класс олигонуклеотид

<400> 10

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 11

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> B-Класс олигонуклеотид

<400> 11

tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24

<210> 12

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> B-Класс олигонуклеотид

<400> 12

tcgtcgtttt gtcgtttttt tcga 24

<210> 13

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 13

tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22

<210> 14

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 14

tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg 23

<210> 15

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 15

tcggacgttc ggcgcgcgcc g 21

<210> 16

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 16

tcggacgttc ggcgcgccg 19

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 17

tcgcgtcgtt cggcgcgccg 20

<210> 18

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 18

tcgacgttcg gcgcgcgccg 20

<210> 19

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 19

tcgacgttcg gcgcgccg 18

<210> 20

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 20

tcgcgtcgtt cggcgccg 18

<210> 21

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 21

tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22

<210> 22

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 22

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210> 23

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 23

tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22

<210> 24

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 24

tcgtcgtttt acggcgccgt gccg 24

<210> 25

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C класс CpG Олигонуклеотид

<400> 25

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23

<210> 26

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотиды

<400> 26

tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22

<210> 27

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотид

<400> 27

tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg 23

<210> 28

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотид

<400> 28

tcggacgttc ggcgcgcgcc g 21

<210> 29

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотид

<400> 29

tcggacgttc ggcgcgccg 19

<210> 30

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотид

<400> 30

tcgcgtcgtt cggcgcgccg 20

<210> 31

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотид

<400> 31

tcgacgttcg gcgcgcgccg 20

<210> 32

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотид

<400> 32

tcgacgttcg gcgcgccg 18

<210> 33

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотид

<400> 33

tcgcgtcgtt cggcgccg 18

<210> 34

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотид

<400> 34

tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22

<210> 35

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотид

<400> 35

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210> 36

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотид

<400> 36

tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22

<210> 37

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотид

<400> 37

tcgtcgtttt acggcgccgt gccg 24

<210> 38

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-Класс олигонуклеотид

<400> 38

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23

<210> 39

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> P класс CpG олигонуклеотид

<400> 39

tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23

<210> 40

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> P класс CpG олигонуклеотид

<400> 40

tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23

<---

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана композиция для предупреждения заболевания или состояния, связанного с S. pneumoniae, содержащая гликоконъюгаты серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F S. pneumoniae, представляющая собой 15, 16, 17, 18, 19 или 20-валентную пневмококковую конъюгированную композицию, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. Изобретение расширяет арсенал иммуногенных композиций для предупреждения заболевания или состояния, связанного с S. Pneumoniae. 56 з.п. ф-лы, 16 ил., 25 табл., 20 пр.

Формула