Система-носитель в форме наночастиц на основе протеина для клеточно-специфического обогащения действующих лекарственных веществ - RU2388463C2

Чертежи

Описание

Настоящее изобретение относится к системе-носителю действующих лекарственных веществ для клеточно-специфического обогащения действующих лекарственных веществ, которая находится в форме модифицированных авидином наночастиц на основе протеина, предпочтительно на основе желатина и/или сывороточного альбумина, в частности человеческого сывороточного альбумина (HSA), с которыми за счет образования устойчивого авидин-биотинового комплекса связаны биотинилированные антитела, при этом путем ковалентного связывания и комплексообразования посредством авидин-биотиновой системы, а также за счет внедрения или адсорбции может происходить дополнительное связывание действующих лекарственных веществ с наночастицами.

Наночастицы представляют собой частицы искусственных или природных макромолекулярных веществ, размер которых составляет от 10 до 1000 нм и с которыми ковалентными, ионными или адсорбционными связями могут быть связаны лекарственные вещества или иные действующие биологические вещества или в которые могут быть внедрены названные вещества.

В Европейском патенте ЕР 1392255 раскрыты наночастицы на основе человеческого сывороточного альбумина, с которыми ковалентными связями или посредством авидин-биотиновой системы связан аполипопротеин Е, способствующий преодолению гематоэнцефалического барьера.

Однако особой задачей медикаментозного лечения является обеспечение специфического обогащения действующего лекарственного вещества или обладающего лечебным действием лекарственного вещества не только в специфической ткани или органе, как это описано в ЕР 1392255, но помимо этого даже в специфических клетках.

Немодифицированные наночастицы способствуют пассивному "нацеливанию лекарственных средств", признаком чего является абсорбция частиц клетками системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) после внутрисосудистого применения. Обогащение таких наночастиц наблюдалось в макрофагах печени, селезенки, костного мозга, а также циркулирующих моноцитах. Пассивное "нацеливание лекарственных средств" отличается от активного "нацеливания лекарственных средств", задачей которого является нацеленное обогащение действующего вещества при помощи модифицированных наночастиц даже в преимущественно недоступных частях тела или клеточных системах. С этой целью необходимо использовать наночастицы с гидрофильными структурами поверхности, которые сводят к минимуму неспецифические взаимодействия с клетками, не являющимися мишенями, и снабдить их лигандами, которые способствуют клеточно-специфическому обогащению наночастиц. Такие лиганды также называют "нацеливающими лекарственные средства лигандами". Использование клеточно-специфических наночастиц в качестве носителя лекарственных веществ позволяет в контролируемых условиях обогащать действующее лекарственное вещество в клетках-мишенях или целенаправленно доставлять действующее лекарственное вещество до места его действия в организме. Большинство лекарственных веществ не отвечают данному требованию без использования соответствующей лекарственной формы и в лучшем случае обеспечивают клеточное обогащение или распространение по организму за счет физико-химических свойств самого действующего вещества. Лишь часть введенного действующего вещества достигает необходимого места назначения, а остальная часть вызывает нежелательные побочные или токсические эффекты. Таким образом, клеточно-специфические наночастицы способствуют уменьшению нежелательных побочных эффектов или токсических свойств действующих веществ.

На начальных этапах испытаний использовались гидрофильные частицы латекса, полученные методом сополимеризации гидроксиэтилметакрилата, метакриловой кислоты и метилметакрилата. С данными частицами связывали антитело к кроличьему γ-глобулину. По сравнению с немодифицированными частицами было отмечено, что модифицированный антителом препарат связывал лимфоциты, предварительно инкубированные с кроличьей антисывороткой к таким лимфоцитам.

Впоследствии для осуществления магнитного разделения лимфоцитов и эритроцитов использовали системы соответствующих частиц на основе полиакрилатов, с которыми дополнительно связан ионный оксид.

Затем на основе данного базового исследования моноклональные антитела против CD3-клеток связывали через спейсерную структуру С7 с наночастицами полиакрилата и исследовали их в условиях клеточной культуры. Однако недостатком данных исследований являлось то, что объединение клеток с субпопуляциями и, тем самым, наблюдаемое объединение частиц с соответствующей субпопуляцией происходило целиком визуально под микроскопом и, следовательно, могло вызывать сомнение.

Также было изучено адсорбционное связывание моноклональных антител с поверхностью наночастиц полигексилцианакрилата. С одной стороны, была отмечена эффективная адсорбция антител к поверхности частиц, а с другой стороны, в результате добавления дополнительного количества сыворотки происходило конкурирующее смещение антител с поверхности частиц. В связи с этим адсорбционное связывание лигандов неприменимо в биологических системах для клеточно-специфического нацеливания лекарственных средств.

Дополнительным недостатком описанных клеточно-специфических систем наночастиц является то, что они основаны на полимерах, таких как латекс и полиакрилаты, которые не поддаются биологическому разложению.

Были проведены начальные испытания белково-химического связывания антител к поверхности наночастиц на основе сывороточного альбумина. В ходе данных испытаний антитела конъюгировали посредством простейших аминогрупп альбумина и антител при помощи глутаральдегидной реакции. В качестве лигандов использовали моноклональные антитела к легочной карциноме Льюса, а также для сравнения неспецифические иммуноглобулины G. Несмотря на то, что под воздействием свободного специфического антитела в клетках-мишенях наблюдалось заметное обогащение как в условиях клеточной культуры, так и после внутривенного введения подопытным животным, после конъюгации с наночастицами было отмечено лишь очень незначительное обогащение частиц опухоли в условиях in vivo. Основная часть введенных наночастиц была обнаружена в печени и почках. Наночастицы, конъюгированные с неспецифическим иммуноглобулином G, вообще не продемонстрировали обогащения в опухолевой ткани. Таким образом, в выбранных условиях проведения эксперимента было возможно обеспечить лишь низкую специфичность конъюгированных наночастиц на основе человеческого сывороточного альбумина. У основной части данной системы частиц было отмечено неспецифическое распространение по организму, характерное для пассивного нацеливания лекарственных средств. Вместе с тем, поскольку использованные конъюгированные наночастицы были лишь в недостаточной степени охарактеризованы с точки зрения связывания антител, остается неясным, является ли причиной отсутствия специфичности недостаточное связывание антител. В любом случае, в настоящее время не существует доказательств возможности специфической и опосредованной рецептором абсорбции наночастиц в клетках-мишенях одновременно в обход клеток, не являющихся мишенями.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание наночастиц, которые не имеют недостатков описанных выше систем наночастиц, но обладают высокой специфичностью в отношении клеток даже в случае применения в биологических системах и способствуют обогащению действующих лекарственных веществ специфически в выбранных клетках-мишенях, а также основаны на материале, подверженном биологическому разложению.

Данная задача решена при помощи системы-носителя, которая находится в форме модифицированных авидином наночастиц с протеином, с которыми за счет образования устойчивого авидин-биотинового комплекса связаны биотинилированные антитела. Предпочтительно в качестве протеинов используют желатин и/или сывороточный альбумин, особо предпочтительно человеческий сывороточный альбумин. С такими модифицированными наночастицами может происходить дополнительное связывание действующих лекарственных веществ путем ковалентного связывания, комплексообразования посредством авидин-биотиновой системы, а также за счет внедрения или адсорбции.

На фиг.1 показана структура модифицированной авидином наночастицы на основе желатина или человеческого сывороточного альбумина, у которой антитело связано при помощи авидин-биотинового комплекса.

На фиг.2 показана столбиковая диаграмма, иллюстрирующая клеточную абсорбцию модифицированных антителом (Trastazumab) наночастиц желатина А в клетках рака молочной железы различных линий, определенную методом анализа возбужденной флуоресценции сортированных клеток (FACS). Модифицированные антителом наночастицы в каждом случае сравнивали с немодифицированными наночастицами в одинаковых условиях инкубации. Необработанные клетки использовали в качестве контроля.

Из водного раствора желатина, который подвергли двойной десольватации, получили наночастицы согласно изобретению, которые затем стабилизировали путем перекрестного сшивания. Функциональные группы (аминогруппы, карбоксильные группы, гидроксильные группы), расположенные на поверхности данных наночастиц, при помощи соответствующих реагентов преобразовали в реакционно-способные тиоловые группы. При помощи двухфункциональных спейсерных молекул, способных вступать в реакцию как с аминогруппами, так и свободными тиоловыми группами, связали функциональные протеины с наночастицами, модифицированными тиоловыми группами. Функциональные протеины, в частности, включают производные авидина или клеточно-специфические антитела.

При получении наночастиц для описанных далее испытаний клеточных культур простейшие аминогруппы на поверхности частиц ввели в реакцию с 2-иминотиоланом, в результате чего свободные тиоловые группы были внедрены на поверхность частиц. Аминогруппы производного авидина NeutrAvidin™ активировали при помощи двухфункционального спейсера Sulfo-MBS (m-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимидный эфир) и после очистки методом колоночной хроматографии продукта промежуточной стадии активации добавили к нему тиолированные наночастицы желатина. Промежуточный продукт получения модифицированных авидином наночастиц представляет собой универсальную систему-носитель множества биотинилированных веществ, которые могут быть связаны посредством образования авидин-биотинового комплекса.

Для связывания антител, предпочтительно моноклональных антител, их используют в биотинилированной форме или биотинилируют путем преобразования при помощи NHS-биотина (N-гидроксисукцинимидбиотина) и добавляют к ним модифицированные авидином наночастицы. В результате посредством описанного выше образования авидин-биотинового комплекса получают модифицированные авидином наночастицы на основе желатина (фиг.1). Вместе с тем, соответствующие модифицированные авидином наночастицы могут быть также получены на основе сывороточного альбумина, предпочтительно человеческого сывороточного альбумина.

Таким образом, настоящее изобретение представляет собой систему-носитель для клеточно-специфического внутриклеточного обогащения по меньшей мере действующего лекарственного вещества, которая находится в форме наночастиц на основе протеина и содержит структуры, связанные при помощи реакционно-способных групп, при этом упомянутые структуры способствуют клеточно-специфическому прикреплению и клеточной абсорбции наночастиц. Желатин и/или сывороточный альбумин, особо предпочтительно человеческий сывороточный альбумин, являются предпочтительными в качестве протеиновой основы. Реакционно-способной группой предпочтительно является аминовая, тиоловая, карбоксильная группа или производное авидина, а связанной структурой является антитело, особо предпочтительно моноклональное антитело.

Изобретение также относится к соответствующей системе-носителю, которая дополнительно содержит, по меньшей мере, одно действующее лекарственное вещество, которое путем абсорбции, внедрения или ковалентной связи связано или образует комплекс связей с системой-носителем или наночастицами при помощи реакционно-способных групп.

Изобретение дополнительно относится к применению предложенной в изобретении системы-носителя с целью получения лекарственного средства для обогащения действующего лекарственного вещества вблизи или внутри специфических клеток.

Изобретение дополнительно относится к способу получения системы-носителя в форме наночастиц на основе протеина для клеточно-специфического обогащения, по меньшей мере, одного действующего лекарственного вещества, который заключается в том, что осуществляют следующие стадии:

- десольватируют водный раствор протеина,

- путем перекрестного сшивания стабилизируют наночастицы, образовавшиеся в результате десольватации,

- преобразуют часть функциональных групп на поверхности стабилизированных наночастиц в реакционно-способные тиоловые группы,

- при помощи двухфункциональных спейсерных молекул прикрепляют функциональные протеины, предпочтительно авидин, за счет ковалентного связывания,

- при необходимости биотинилируют антитело,

- нагружают модифицированные авидином наночастицы биотинилированным антителом,

- нагружают модифицированные авидином наночастицы биотинилированным действующим лекарственным или биологическим веществом.

В предложенном в изобретении способе, в особенности, применяют желатин и/или сывороточный альбумин, особо предпочтительно человеческий сывороточный альбумин.

Десольватацию предпочтительно осуществляют путем перемешивания и добавления смешивающегося с водой осадителя протеинов или обессоливания. Смешивающийся с водой осадитель протеинов предпочтительно выбирают из группы, включающей этанол, метанол, изопропанол и ацетон.

Для стабилизации наночастиц предпочтительно применяют тепловые процессы или двухфункциональные альдегиды, в особенности глутаральдегид или формальдегид.

В качестве вещества, модифицирующего тиоловую группу, предпочтительно используют вещество, выбранное из группы, включающей 2-иминотиолан, сочетание 1-этил-3-(3диметиламинпропил)карбодиимидина и цистеина или сочетание 1-этил-3-(3диметиламинпропил)карбодиимидина и дихлорида цистамина, а также дитиотреитол.

В качестве двухфункциональной спейсерной молекулы предпочтительно используют вещество, выбранное из группы, включающей m-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимидный эфир, сульфосукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат, сульфосукцинимидил-2-[m-азидо-o-нитробензамидо]-этил-1,3'дитиопропионат, диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат-дигидрохлорид и 3,3'-дитиобис[сульфосукцинимидилпропионат].

Пример

Для получения наночастиц протеина 500 мг желатина А растворили в 10,0 мл очищенной воды, которую одновременно нагревали, и выделили осадок, добавив 10,0 мл ацетона. Осажденный желатин отделили, повторно растворили в 10,0 мл воды, которую одновременно нагревали, и довели рН раствора до 2,5. Из раствора получили наночастицы путем покапельного добавления 30 мл ацетона (методом десольватации).

Наночастицы стабилизировали, добавив 625 µл 8-процентного глутаральдегида и перемешивая в течение ночи. Наночастицы очистили аликвотными количествами, составлявшими 2,0 мл, путем пятикратного центрифугирования и повторного диспергирования при помощи обработки ультразвуком. С целью тиолирования поверхности частиц к 1,0 мл суспензии наночастиц (20 мг/л) добавили 2,5 мл раствора 30 мг 2-иминотиолана (реагент Трота) в трио-буфере с рН 8,5, после чего перемешивали в течение 24 часов. После тиолирования повторно осуществили очистку, как это описано выше.

Производное авидина FITC-NeutrAvidin™ связали с тиолированными наночастицами посредством двухфункционального спейсера сульфо-MBS (m-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимидный эфир). Для активации производного авидина в раствор 2,5 мг FITC-NeutrAvidin™ в 500 µл PBS-буфера с рН 7,0 добавили 0,75 мг сульфо-MBS и перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Методом эксклюзионной хроматографии отделили не прореагировавший сульфо-MBS от активированного NeutrAvidin™. Фракции, в которых методом спектрофотометрии на волне 280 нм был обнаружен NeutrAvidin™, соединили, добавили к ним суспензию тиолированных наночастиц и перемешивали в течение 12 часов при комнатной температуре. Осуществили дополнительную очистку наночастиц, теперь модифицированных ковалентно связанным FITC-NeutrAvidin™, как это описано выше. Супернатант, образовавшийся в результате очистки частиц, подвергли фотометрическому исследованию на наличие несвязанного NeutrAvidin™ и вычислили часть ковалентно связанного NeutrAvidin™. Путем экспериментального титрования с биотин-4-флюоресцеином определили функциональные свойства связанного NeutrAvidin™, выраженные в виде числа мест связывания с биотином на молекулу авидина. Было установлено, что 2,4 из 4 мест связывания с биотином, теоретически присутствующих в молекуле авидина, также функционально доступны после конъюгации с наночастицами. С целью нагрузки антителами 500 µл биотинилированных антител (25 µг/мл) добавили к 150 µл модифицированных NeutrAvidin™ наночастиц (20 мг/мл), после чего инкубировали в течение 90 мин при температуре 10°С.

После инкубации частицы снова очистили путем центрифугирования и повторного диспергирования. Полученный супернатант в виде частиц исследовали на наличие несвязанных антител методом вестерн-блоттинга. Было установлено присутствие свыше 80% использованных антител, связанных с частицами системы.

При помощи описанной системы частиц в ходе испытаний различных клеточных культур было обнаружено клеточно-специфическое обогащение частицами клеток-мишеней, которые имели поверхностный антиген, распознанный антителом. Были применены следующие модели клеточных структур:

1. Лимфоцитарные клетки-мишени (Т-клетки Jurkat) с поверхностным антигеном CD3.

Наночастицы были загружены биотилинированным антителом против CD3-клеток.

2. Линии клеток рака молочной железы человека (SK-Br3-клетки, MCF7-клетки, ВТ474-клетки) с экспрессией поверхностного антигена HER2.

Наночастицы были загружены апробированным антителом Trastuzumab (Herceptin^®), которое было предварительно биотинилировано.

Культивированные клетки инкубировали наночастицами системы в концентрации от 100 до 1000 µг/мл и после инкубации в течение 4 часов отделили несвязанные наночастицы путем промывания клеток. Клетки исследовали методом проточной цитометрии (FACS), а также конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) на абсорбцию наночастиц.

Для проведения экспериментов по клеточно-специфической абсорбции в лимфоцитарных клетках наночастиц, модифицированных биотинилированным антителом против CD3-клеток, на 24-луночный микротитратор произвели посев Т-клеток Jurkat с плотностью 1×10⁶ клеток на лунку и культивировали их в среде с указателем числа оборотов в минуту. Среду дополнили 10-процентной (об./об.) фетальной телячьей сывороткой, 2-процентнным L-глутамином и 1-процентным пенициллином/стрептомицином. Модифицированные антителом наночастицы в течение 4 часов инкубировали с клетками при концентрации 1000 µг/мл. С целью доказать специфическую клеточную абсорбцию через Т-клеточный рецептор осуществляли различные контрольные эксперименты. С одной стороны, использовали наночастицы, загруженные неспецифическими иммуноглобулинами G вместо специфических антител против CD3-клеток. Кроме того, проводили опыты с посевом Т-клеток Jurkat плотностью 1×10⁶ клеток, которые в течение 30 минут предварительно инкубировали с 2.5 µг свободного иммуноглобулина G или антител против CD3-клеток. По истечении указанного времени добавляли наночастицы, загруженные антителом против CD3-клеток. С другой стороны, проводили сравнительные эксперименты с использованием MCF7-клеток, которые не имели поверхностного антигена против клеток CD3. Клеточную абсорбцию оценивали количественно методом конфокальной микроскопии, а также в количественном отношении методом проточной цитометрии.

Для проведения экспериментов по клеточно-специфической абсорбции в клетках рака молочной железы наночастиц, модифицированных биотинилированным антителом против HER2-клеток, на 24-луночный микротитратор произвели посев HER2-клеток с избыточной экспрессией (ВТ474-клетки и SK-Br3-клетки) с плотностью 2×10⁵ и 1×10⁵ клеток соответственно на лунку и культивировали их в среде с указателем числа оборотов в минуту и среде Мак-Коя 5 А соответственно. Среду с ВТ474-клетками дополнили 20-процентной (об./об.) фетальной телячьей сывороткой, 2-процентным L-глутамином, 1-процентным пенициллином/стрептомицином и 100 единицами инсулина. Среду с SK-Br3-клетками дополнили 10-процентной (об./об.) фетальной телячьей сывороткой, 2-процентным L-глутамином и 1-процентным пенициллином/стрептомицином. Модифицированные антителом наночастицы в течение 3 часов инкубировали с клетками при концентрации 100 µг/мл.

С целью доказать специфическую клеточную абсорбцию через HER2-клеточный рецептор осуществляли различные контрольные эксперименты. С одной стороны, использовали наночастицы, не загруженные специфическим антителом. С другой стороны, проводили опыты с MCF7-клетками (HER2-клетки с нормальной экспрессией). Кроме того, проводили контрольные эксперименты с SK-Br3-клетками, которые в течение 30 минут предварительно инкубировали с 2.5 µг/мл свободных антител против HER2-клеток (Trastuzumab), высеянных с плотностью 2×10⁵ клеток. По истечении данного периода добавили наночастицы, загруженные антителом против HER2-клеток. Клеточную абсорбцию оценивали количественно методом конфокальной микроскопии, а также в количественном отношении методом проточной цитометрии.

Результаты

Лимфоцитарные клетки-мишени (Т-клетки Jurkat)

Как путем оценки сортировки клеток методом возбужденной флуоресценции (FACS), так и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) было установлено, что имела место клеточная абсорбция наночастиц, которые были использованы в форме, модифицированной клеточно-специфическим антителом против CD3-клеток. Клеточная абсорбция не происходила в тех случаях, когда перед добавлением частиц клетки были обработаны свободным специфическим антителом. Вместе с тем, предварительная обработка свободными неспецифическими иммуноглобулинами G не выявила какого-либо влияния на абсорбцию частиц. Модификация наночастиц неспецифическим иммуноглобулином G вместо специфического антитела против CD3-клеток также не приводила к абсорбции в клетках-мишенях. Также были проведены контрольные эксперименты с клетками рака молочной железы (МСР7-клетки), которые не имели поверхностный антиген против CD3-клеток. В ходе таких контрольных экспериментов не наблюдалось абсорбции препаратов наночастиц ни при одном из выбранных условий.

Линии клеток рака молочной железы человека (SK-Br3-клетки, MCF7-клетки, ВТ474-клетки)

Было установлено, что использованные клетки в различной степени демонстрировали экспрессию поверхностного антигена против HER2-клеток, что использовали в качестве точки приложения клеточной абсорбции модифицированных антителом наночастиц. Экспрессию клеток определяли до инкубации с наночастицами методом вестерн-блоттинга (таблица).

Как путем оценки сортировки клеток методом возбужденной флуоресценции (FACS), так и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) было установлено, что имела место клеточная абсорбция наночастиц, которые были использованы в форме, модифицированной клеточно-специфическим антителом Trastuzumab (фиг.2). Клеточная абсорбция специфических наночастиц могла быть предотвращена в тех случаях, когда перед добавлением частиц клетки были обработаны свободным специфическим антителом. Наночастицы той же партии, которые не использовались в форме, модифицированной биотинилированным антителом, демонстрировали лишь незначительное клеточное обогащение при выбранных условиях. Степень клеточной абсорбции модифицированных антителом наночастиц могла быть соотнесена со степенью экспрессии поверхностного антигена против HER2-клеток.

Результаты описанных выше экспериментов с клеточными культурами ясно демонстрируют, что модифицированные антителом наночастицы на основе желатина способствуют обогащению клеток-мишеней. При сравнимых условиях абсорбция систем частиц происходила лишь в соответствующих клетках-мишенях, а не в контрольных клетках. Предварительная инкубация со свободным специфическим антителом ясно показывает, что абсорбция частиц происходит в ходе опосредованного рецептором эндоцитоза. Таким образом, находящаяся в форме наночастиц система-носитель лекарственного средства, которая предложена в изобретении, позволяет осуществлять специфическую доставку лекарственных веществ к пораженным клеткам при условии, что свойства поверхности таких клеток-мишеней отличаются от свойств поверхности здоровых клеток.

При помощи предложенных в изобретении модифицированных антителом наночастиц на основе желатина создана находящаяся в форме наночастиц система-носитель с хорошими характеристиками, которая при помощи нацеливающего лекарственное средство функционального лиганда, находящегося на поверхности упомянутой системы-носителя, способствует клеточно-специфической абсорбции и обогащению даже таких действующих лекарственных веществ, которые связаны с системой-носителем за счет абсорбции, внедрения или путем ковалентного связывания либо комплексообразования.

Реферат

Изобретение относится к области медицины и направлено на создание и применение системы направленного транспорта лекарственных веществ в раковые клетки. Сущность изобретения заключается в том, что наночастицы, представляющие собой модифицированные авидином наночастицы на основе протеина, предпочтительно на основе желатина и/или сывороточного альбумина, особо предпочтительно на основе человеческого сывороточного альбумина, содержат биотинилированные антитела, которые связаны с наночастицами за счет образования устойчивого авидин-биотинового комплекса. При этом заявленные наночастицы дополнительно содержат действующее лекарственное вещество, связанное с наночастицами путем ковалентного связывания или комплексообразования посредством авидин-биотиновой системы или за счет внедрения или абсорбции, а специфические антитела способствуют клеточно-специфическому прикреплению к клеткам-мишеням и клеточной абсорбции наночастиц внутрь упомянутых клеток-мишеней. Использование заявленного позволяет провести нацеленное накопление путем опосредованного рецепторами эндоцитоза наночастиц с лекарственным веществом в клетках. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.

Формула