Код документа: RU2624045C2
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0001] Список последовательностей, предоставленный при посредстве EFS в соответствии с 37 CFR § 1.52(e)(5), включен в настоящий документ в качестве ссылки. Текстовой файл списка последовательностей, предоставленный при посредстве EFS, содержит файл "SequenceListing_IFD1USPSP", созданный 17 августа 2010 года, размер которого составляет 455495 байтов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ
[0002] Гепатит B представляет собой инфекционное заболевание печени, вызываемое вирусом гепатита B (HBV). Заболевание может быть острым, при этом происходит воспаление печени, рвота, желтуха, а в некоторых редких случаях с тяжелым скоротечным протеканием - смерть. В большинстве случаев инфекция приводит к хроническому заболеванию, которое может протекать либо бессимптомно, либо приводить к хроническому воспалению печени, что ведет к циррозу печени и к повышенной частоте развития печеночноклеточной карциномы (HCC).
[0003] Инфекция HBV представляет мировую проблему, приблизительно >350 миллионов во всем мире имеют хроническую инфекцию, и от связанного с HBV заболевания печении или HCC умирают 600000 человек ежегодно. Заболевание вызывает эпидемии в Азии и Африке и является эндемичным в Китае. Передача HBV осуществляется через зараженную кровь или жидкости организма. В настоящее время существуют вакцины для профилактики инфекции HBV. Однако, если вакцина является профилактической, то ее нельзя применять для лечения уже инфицированных пациентов.
[0004] Существует несколько одобренных химиотерапевтических средств для лечения хронического гепатита B (ламивудин, адефовир, энтакавир и телбивудин), которые препятствуют репликации HBV, блокируя действие полимеразы HBV. Ни один из способов лечения не приводит к полному выведению вируса, и эти виды лечения после длительного лечения приводят к развитию лекарственной резистентности вариантов HBV. Также лечение гепатита B можно осуществлять пегилированным интерфероном-альфа2а, но это лечение связано с тяжелыми побочными эффектами и эффективно не для всех пациентов.
[0005] HBV является представителем семейства Hepadanvirus и на основе антигенных эпитопов разделяется на 4 основных серотипа (adr, adw, ayr, ayw). Вирус также классифицируют по восьми генотипам (A-H на основе геномной последовательности. Генотип A распространен в Америке, Африке, Индии и Восточной Европе. Генотипы B и C выявляют в Азии и США. Генотип D наиболее распространен в Южной Европе и Индии. Генотип E выявляют в Восточной и Южной Африке. Генотип F и H, как правило, выявляют в Центральной и Южной Америке. Генотип G, как правило, выявляют в Европе и США.
[0006] Геном HBV состоит из кольцевой цепи ДНК, которая частично является двухцепочечной. Длина генома составляет ≈3,3 т.п.н. Геном кодирует 4 известных гена (C, X, P и S). HBV является одним из нескольких ДНК-содержащих вирусов, который в процессе репликации использует обратную транскриптазу. Репликация HBV включает несколько стадий, в том числе проникновение, сбрасывание оболочки и транспорт генома вируса в ядро. Исходно репликация генома HBV включает образование промежуточной РНК, которая затем подвергается обратной транскрипции с получением ДНК вирусного генома.
[0007] Так как современные способы лечения ограничены своей неэффективностью, тяжелыми побочными эффектами или возникновением образования лекарственно-резистентных вариантов, существует клиническая необходимость в разработке новых терапевтических средств для лечения инфекции HBV.
[0008] Одним из подходов, удовлетворяющих этой необходимости, является изменение экспрессии вирусных генов, особенно экспрессии генов HBV, посредством РНК-интерференции (далее в настоящем документе "РНКи"). РНКи индуцируют молекулы малых одноцепочечных РНК ("оцРНК") или двухцепочечных РНК ("дцРНК"). Молекулы малых дцРНК, называемые "малыми интерферирующими нуклеиновыми кислотами ("миНК")" или "малыми интерферирующими РНК" или "миРНК" или "ингибиторами РНКи" осуществляют сайленсинг экспрессии матричной РНК ("мРНК"), которая обладает последовательностью, гомологичной миНК. Это может происходить вследствие расщепления мРНК, опосредованного эндонуклеазным комплексом, содержащим миНК, как правило, обозначаемым как индуцируемый РНК комплекс сайленсинга (RISC). Расщепление РНК-мишени, как правило, происходит в середине области, комплементарной направляющей последовательности дуплекса миНК (Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15:188). Кроме того, РНК-интерференция также может вовлекать опосредуемый малой РНК (например, микро-РНК или мкРНК) сайленсинг генов, предположительно посредством клеточных механизмов, которые или ингибируют трансляцию, или регулируют структуру хроматина и, таким образом, предотвращают транскрипцию последовательности гена-мишени (см. например, Allshire, 2002, Science, 297:1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297:1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297:2215-2218 и Hall et al., 2002, Science, 297:2232-2237).
[0009] Попытки использовать РНКи для лечения HBV были предприняты в нескольких исследованиях, и этот подход подробно рассмотрен в "RNAI for treating Hepatitis B Viral Infection", Chen, Y. et al., Pharmaceutical Research, 2008 Vol. 25, No.1, стр. 72-86. До настоящего времени, как указано в приведенной выше ссылке, трансфекция одной миРНК часто оказывалась неспособной обеспечить адекватный сайленсинг генов. Таким образом, несмотря на значительный прогресс в области РНКи, остается необходимость в средствах, которые могут эффективно ингибировать экспрессию генов HBV и которые могут лечить заболевание, ассоциированное с экспрессией HBV, такое как заболевания и злокачественная опухоль печени.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] Изобретение решает проблему лечения заболеваний, реагирующих на модуляцию экспрессии генов HBV, благодаря применению новых молекул малых интерферирующих нуклеиновых кислот (миНК) для модуляции экспрессии HBV.
[0011] Настоящее изобретение относится к соединениям, композициям и способам, подходящим для модуляции экспрессии генов HBV и для лечения гепатита B и таких условий, которые являются результатом инфекции вирусом гепатита B, посредством РНК-интерференции (РНКи) с использованием молекул малых нуклеиновых кислот.
[0012] В частности, настоящее изобретение относится к молекулам малых нуклеиновых кислот, т.е., к молекулам малых интерферирующих нуклеиновых кислот (миНК), включая, но не ограничиваясь этим, молекулы малых интерферирующих РНК (миРНК), двухцепочечных РНК (дцРНК), микро-РНК (мкРНК), короткошпилечных РНК (кшРНК) и кольцевых РНК, и к способам, применяемым для модуляции экспрессии генов HBV и/или других генов, вовлеченных в пути экспрессии и/или активности генов HBV. Авторы изобретения обнаружили, что выбор участков-мишеней из консервативных областей всех известных полных геномов HBV, привел к последовательностям с высокой активностью и эффективностью.
[0013] В одном из аспектов изобретение относится к молекулам двухцепочечных малых интерферирующих нуклеиновых кислот (миНК), ингибирующих экспрессию гена HBV в клетке или у млекопитающего, где двухцепочечная миНК содержит смысловую и антисмысловую цепь. Антисмысловая цепь содержит последовательность, комплементарную по меньшей мере части РНК, ассоциированной с экспрессией гена HBV. Смысловая цепь содержит последовательность, комплементарную антисмысловой цепи. В различных вариантах осуществления по меньшей мере одна цепь содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, выбранную из группы последовательностей, состоящей из SEQ ID NO: 1-502. В определенных вариантах осуществления антисмысловая цепь содержит последовательность, содержащую по меньшей мере 15 нуклеотидов, комплементарную последовательности-мишени, приведенной в таблице 1a. В других и/или в аналогичных вариантах осуществления антисмысловая цепь содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов одной из антисмысловых последовательностей, приведенных в таблице 1b. В некоторых вариантах осуществления смысловая цепь содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов последовательности смысловой цепи, как приведено в таблице 1b.
[0014] В определенных вариантах осуществления этого аспекта изобретения предоставлены молекулы двухцепочечных малых интерферирующих нуклеиновых кислот (миНК), где антисмысловая цепь содержит модифицированную последовательность, как приведено в таблице 1c (см. в графической части), с комплементарностью последовательности c последовательностью-мишенью по изобретению. В некоторых вариантах осуществления смысловая цепь также содержит модифицированную последовательность, как приведено в таблице 1c.
[0015] В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК), модулирующей экспрессию HBV, где миНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь; где длина каждой цепи независимо составляет от 15 до 30 нуклеотидов; и антисмысловая цепь содержит последовательность, содержащую по меньшей мере 15 нуклеотидов, комплементарную любой из:
5'-UCGUGGUGGACUUCUCUCA-3' (SEQ ID NO: 1);
5'-GUGGUGGACUUCUCUCAAU-3' (SEQ ID NO: 2);
5'-GCCGAUCCAUACUGCGGAA-3' (SEQ ID NO: 3); или
5'-CCGAUCCAUACUGCGGAAC-3' (SEQ ID NO: 4).
[0016] В некоторых вариантах осуществления изобретения антисмысловая цепь молекулы миНК содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из:
5'-UGAGAGAAGUCCACCACGA-3' (SEQ ID NO: 452);
5'-AUUGAGAGAAGUCCACCAC-3' (SEQ ID NO: 453);
5'-UUCCGCAGUAUGGAUCGGC-3' (SEQ ID NO: 454); или
5'-GUUCCGCAGUAUGGAUCGG-3' (SEQ ID NO: 455).
[0017] В некоторых вариантах осуществления смысловая цепь молекулы миНК по изобретению содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из:
5'-UCGUGGUGGACUUCUCUCA-3' (SEQ ID NO: 1);
5'-GUGGUGGACUUCUCUCAAU-3' (SEQ ID NO: 2);
5'-GCCGAUCCAUACUGCGGAA-3' (SEQ ID NO: 3); или
5'-CCGAUCCAUACUGCGGAAC-3' (SEQ ID NO: 4).
[0018] В некоторых вариантах осуществления молекула миНК по изобретению содержит любую из:
5'-UCGUGGUGGACUUCUCUCA-3' (SEQ ID NO: 1) и 5'-UGAGAGAAGUCCACCACGA-3' (SEQ ID NO: 452); или
5'-GUGGUGGACUUCUCUCAAU-3' (SEQ ID NO: 2); и 5'-AUUGAGAGAAGUCCACCAC-3' (SEQ ID NO: 453); или
5'-GCCGAUCCAUACUGCGGAA-3' (SEQ ID NO: 3) и 5'-UUCCGCAGUAUGGAUCGGC-3' (SEQ ID NO: 454); или
5'-CCGAUCCAUACUGCGGAAC-3' (SEQ ID NO: 4); и 5'-GUUCCGCAGUAUGGAUCGG-3' (SEQ ID NO: 455).
[0019] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к молекуле двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК), содержащей любой из дуплексов R-008380648-000E, R-008380783-000R, R-008380665-000N, R-008380645-000D, R-008380408-000R, R-008380633-000U, R-008380767-000R, R-008380730-000C, R-008380777-000H, R-008380740-000V, R-008380558-000M, R-008380406-000Y, R-008380764-000P, R-008380772-000P, R-008380389-000D, R-008380362-000H, R-008380363-000S, R-008380340-000F, R-008380689-000H, R-008380756-000P, R-008380736-000E, R-008380757-000Y, R-008380753-000N, R-008380737-000N, R-008380734-000M или R-008380791-000R.
[0020] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к композиции, содержащей:
(a) двухцепочечную малую интерферирующую нуклеиновую кислоту (миНК) по изобретению;
(b) катионное липидное соединение, с любым из номеров соединений 1-46 или любое их сочетание;
(c) холестерин;
(d) DSPC и
(e) PEG-DMG.
[0021] В некоторых вариантах осуществления композиция по изобретению содержит любой катионный липид с любым из номеров соединений 1-46 в следующих молярных отношениях:
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG 56,6/38/5,4;
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG 60/38/2;
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG 67,3/29/3,7;
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG 49,3/47/3,7;
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG 50,3/44,3/5,4;
Катионный липид/Холестерин/PEG-C-DMA/DSPC 40/48/2/10;
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG/DSPC 40/48/2/10 и
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10.
[0022] В некоторых вариантах осуществления композиция по изобретению содержит (13Z,16Z)-N,N-диметил-3-нонилдокоза-13,16-диен-1-амин, холестерин, DSPC и PEG-DMG с молярным отношением приблизительно 50:30:10:2, соответственно.
[0023] В некоторых вариантах осуществления композиция по изобретению дополнительно содержит криопротектор. В некоторых вариантах осуществления криопротектор представляет собой сахарозу, трегалозу, рафинозу, стахиозу, вербаскозу, маннит, глюкозу, лактозу, мальтозу, мальтотриозу-гептаозу, декстран, гидроксиэтилкрахмал, инсулин, сорбит, глицерин, аргинин, гистидин, лизин, пролин, диметилсульфоксид или любое их сочетание. В некоторых вариантах осуществления криопротектор представляет собой сахарозу. В некоторых вариантах осуществления криопротектор представляет собой трегалозу. В некоторых вариантах осуществления криопротектор представляет собой комбинацию сахарозы и трегалозы.
[0024] В некоторых вариантах осуществления изобретения все нуклеотиды миНК по изобретению являются немодифицированными. В других вариантах осуществления нуклеотиды в одном или нескольких (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) положениях независимо в одной или обеих цепях молекулы миНК являются модифицированными. Модификации включают модификацию сахара нуклеиновой кислоты, модификации оснований, модификации каркаса (межнуклеотидных связей), модификации вставки не являющихся нуклеотидами групп и/или любое их сочетание. В определенных вариантах пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды модифицированы различно. Например, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды можно различно модифицировать по 2'-положению сахара (т.е., по меньшей мере один из пуринов в 2'-положении сахара содержит модификацию, отличающуюся по меньшей мере от одного из пиримидинов в той же или другой цепи). В определенных вариантах пурины в одной или обеих цепях являются немодифицированными, тогда как пиримидины в одной или обеих цепях являются модифицированными. В других определенных вариантах пиримидины в одной или обеих цепях являются немодифицированными, тогда как пурины в одной или обеих цепях являются модифицированными. В некоторых вариантах по меньшей мере один модифицированный нуклеотид представляет собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотид, 2'-дезоксинуклеотид или 2'-O-алкилнуклеотид. В некоторых вариантах по меньшей мере 5 или более пиримидиновых нуклеотидов в одной или обеих цепях все являются либо 2'-дезокси-2'-фтор-, либо 2'-O-метилпиримидиновыми нуклеотидами. В некоторых вариантах по меньшей мере 5 или более пуриновых нуклеотидов в одной или обеих цепях все являются либо 2'-дезокси-2'-фтор-, либо 2'-O-метилпуриновыми нуклеотидами. В определенных вариантах, где молекулы миНК содержат одну или несколько модификаций, как описано в настоящем документе, модифицированными являются нуклеотиды в положениях 1, 2 и 3 на 5'-конце направляющей (антисмысловой) цепи.
[0025] В определенных вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению содержат 3' выступы одного, двух, трех или четырех нуклеотидов в одной или обеих цепях. В других вариантах осуществления в молекулах миНК выступы отсутствуют (т.е., имеют тупые концы). Предпочтительно, молекула миНК содержит 3'-концевые выступы двух нуклеотидов на смысловой и антисмысловой цепях. Выступы могут быть модифицированными или немодифицированными. Примеры модифицированных нуклеотидов в выступах в качестве неограничивающих примеров включают 2'-O-алкилнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, нуклеотиды закрытой нуклеиновой кислоты (ЗНК) или 2'-дезоксинуклеотиды. Выступающие нуклеотиды в антисмысловой цепи могут содержать нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам в последовательности-мишени HBV. Подобным образом, выступы в смысловой цепи могут содержать нуклеотиды, которые находятся в последовательности-мишени HBV. В определенных вариантах молекулы миНК по изобретению содержат два 3'-концевых выступающих нуклеотида в антисмысловой цепи, которые представляют собой 2'-O-алкил- (например, 2'-O-метил-) нуклеотиды и два 3'-концевых выступающих нуклеотида на смысловой цепи, которые представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды. В других вариантах молекулы миНК по изобретению содержат два 3'-концевых выступающих нуклеотида, которые представляют собой 2'-O-алкил- (например, 2'-O-метил-) нуклеотиды, и на антисмысловой цепи, и на смысловой цепи. В определенных вариантах осуществления 2'-O-алкилнуклеотиды представляют собой 2'-O-метилуридиновые нуклеотиды. В определенных вариантах выступы между нуклеотидами выступа также содержат одну или несколько тиофосфатных связей.
[0026] В некоторых вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению содержат "кэп" (также обозначаемые в настоящем документе как "концевой кэп". Кэп может присутствовать на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп) или может присутствовать на обоих концах, например, на 5'- и 3'-концах смысловой цепи миНК.
[0027] В некоторых вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению фосфорилированы на 5'-конце антисмысловой цепи. Фосфатная группа может представлять собой фосфат, дифосфат или трифосфат.
[0028] Молекулы миНК по изобретению, если они являются двухцепочечными, могут быть симметричными или асимметричными. Диапазон длины в нуклеотидах каждой цепь этих двухцепочечных миНК может независимо составлять от 3 до 30 нуклеотидов. Как правило, длина каждой цепи молекул миНК по изобретению приблизительно составляет от 15 до 30 (т.е., приблизительно 19, 20, 21, 22, 23 или 24) нуклеотидов.
[0029] Молекулы миНК по изобретению, которые являются двухцепочечными или содержат дуплексную структуру, независимо содержат от приблизительно 3 до приблизительно 30 (например, приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) пар оснований. Как правило, длина дуплексной структуры миНК по изобретению составляет от 15 до 30, чаще от 18 до 25, еще чаще от 19 до 24, а наиболее часто от 19 до 21 пар оснований.
[0030] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к молекулам двухцепочечных малых интерферирующих нуклеиновых кислот (миНК), где молекула содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь и образует формулу (A):
где верхняя цепь представляет собой смысловую цепь, а нижняя цепь представляет собой антисмысловую цепь двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты; где антисмысловая цепь содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 454 или SEQ ID NO: 455, а смысловая цепь содержит последовательность, комплементарную антисмысловой цепи;
каждый N независимо представляет собой нуклеотид, который является немодифицированным, или химически модифицированным, или не являющуюся нуклеотидом группу;
каждый B представляет собой концевой кэп, который присутствует или отсутствует;
(N) представляет собой выступающие нуклеотиды, каждый из которых независимо является немодифицированным или химически модифицированным;
[N] представляет собой нуклеотиды, которые являются рибонуклеотидами;
X1 и X2 независимо представляют собой целые числа от 0 до 4;
X3 представляет собой целое число от 15 до 30;
X4 представляет собой целое число от 9 до 30; и
X5 представляет собой целое число от 0 до 6, при условии, что сумма X4 и X5 составляет 15-30.
[0031] В одном из вариантов осуществления изобретение относится к двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоте (миНК) формулы (A); где
(a) один или несколько пиримидиновых нуклеотидов в положениях NX4 независимо представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-O-алкилнуклеотиды, 2'-дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или любое их сочетание;
(b) один или несколько пуринов нуклеотиды в положениях NX4 независимо представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-O-алкилнуклеотиды, 2'-дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или любое их сочетание;
(c) один или несколько пиримидинов нуклеотиды в положениях NX3 независимо представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-O-алкилнуклеотиды, 2'-дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или любое их сочетание; и
(d) один или несколько пуринов нуклеотиды в положениях NX3 независимо представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-O-алкилнуклеотиды, 2'-дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды.
[0032] Настоящее изобретение дополнительно относится к композициям, содержащим двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, описываемых в настоящем документе, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
[0033] Введение композиции можно проводить известными способами, где нуклеиновую кислоту вводят в желаемую клетку-мишень in vitro или in vivo.
[0034] Широко используемые способы введения молекул нуклеиновых кислот по изобретению в клетки, ткани и организмы предусматривают использование различных систем носителей, реагентов и векторов. Неограничивающие примеры таких систем носителей, подходящих для использования по настоящему изобретению, включают конъюгаты, частицы нуклеиновая кислота-липид, липидные наночастицы (LNP), липосомы, липоплексы, мицеллы, виросомы, вирусоподобные частицы (VLP), комплексы нуклеиновых кислот и их смеси.
[0035] Композиции по изобретению могут находиться в форме аэрозоля, дисперсии, раствора (например, инъецируемого раствора), крема, мази, таблетки, порошка, суспензии или т.п. Эти композиции можно вводить любым подходящим путем, например, перорально, сублингвально, буккально, парентерально, назально, или местно. В некоторых вариантах осуществления композиции формулируют в виде аэрозоля и доставляют посредством ингаляции.
[0036] Молекулы и композиции по настоящему изобретению могут использоваться для широкого диапазона терапевтических задач. Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединений и композиции по изобретению для лечения индивидуума. Таким образом, изобретение относится к способу лечения индивидуума, такого как человек, страдающего состоянием, опосредованным действием HBV, где способ включает введение индивидууму эффективного количества молекулы двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК) по изобретению. Таким образом, молекулы миНК по изобретению являются эффективными для лечения инфекции вируса гепатита B и/или состояния, возникающего вследствие этой инфекции. В некоторых вариантах осуществления состоянием является болезнь печени. В других вариантах осуществления состоянием является злокачественная опухоль.
[0037] Эти и другие аспекты изобретения станут очевидны при обзоре следующего ниже подробного описания и приложенных фигур. Кроме того, полагают, что любой способ или композицию, описываемые в настоящем документе, можно применять в отношении любого другого способа или композиции, описываемых в настоящем документе, и что различные варианты осуществления можно комбинировать.
[0038] Кроме того, патенты, патентные заявки и другие документы цитируются на всем протяжении описания для описания и более конкретного указания различных аспектов настоящего изобретения. Таким образом, каждая из этих ссылок, цитируемых в настоящем документе, включена в качестве ссылки полностью, включая рисунки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0039] На фиг.1 представлено неограничивающее предполагаемое механистическое представление разрушения РНК-мишени, вовлеченного в РНКи. Двухцепочечная РНК (дцРНК), которая образуется РНК-зависимой РНК-полимеразой (RdRP) из чужеродной одноцепочечной РНК, например, РНК вируса, транспозона или другой экзогенной РНК, активирует фермент DICER, который в свою очередь образует дуплексы миНК. Альтернативно, в клетку подходящими способами можно непосредственно вводить синтетическую или экспрессированную миНК. Образуется активный комплекс миНК, который распознает РНК-мишень, что приводит к разрушению РНК-мишени комплексом эндонуклеазы RISC или к синтезу дополнительной РНК РНК-зависимой РНК-полимеразой (RdRP), которая может активировать DICER и приводить к дополнительным молекулам миНК, таким образом, усиливая ответ РНКи.
[0040] На фиг.2 представлены неограничивающие примеры конструкций химически модифицированных миНК по настоящему изобретению с использованием обобщенной структуры характерного дуплекса миНК. Конкретные модификации, представленные на фигуре, в дополнение к другим модификациям и признакам, описываемым в настоящем документе в отношении любой молекулы миНК по изобретению, можно использовать отдельно или в комбинации с другими модификациями на фигуре. На фигуре, N означает любой нуклеотид или необязательную не являющуюся нуклеотидом группу, как описано в настоящем документе. Верхняя цепь, содержащая B-NX3-(N)X2-B-3' представляет собой смысловую (или сопровождающую) цепь миНК, тогда как нижняя цепь, содержащая B(N)X1-NX4-[N]X5-5' представляет собой антисмысловую (или направляющую) цепь миНК. Нуклеотиды (или необязательные не являющиеся нуклеотидами группы) внутренних участков смысловой цепи обозначены NX3, а нуклеотиды (или необязательные не являющиеся нуклеотидами группы) внутренних участков антисмысловой цепи обозначены NX4. Нуклеотиды (или необязательные не являющиеся нуклеотидами группы) внутренних участков, как правило, спарены по основаниям в двух цепях, но, необязательно, в некоторых вариантах осуществления спаривание оснований может отсутствовать (например, могут присутствовать несоответствия или пропуски). Нуклеотиды (или необязательные не являющиеся нуклеотидами группы) выступающих областей обозначены скобками (N). Нуклеотиды 5'-концевого участка антисмысловой цепи обозначены [N]. Необязательно на 5'- и/или 3'-конце смысловой цепи и дополнительно необязательно на 3'-конце антисмысловой цепи присутствуют концевые кэпы. Как правило, длина каждой цепи может независимо находиться в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 30 нуклеотидов, но может варьировать в зависимости от присутствия любых выступающих нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления X1 и X2 независимо представляют собой целые числа от 0 до 4; X3 представляет собой целое число от 15 до 30; X4 представляет собой целое число от 9 до 30; X5 представляет собой целое число от 0 до 6, при условии, что сумма X4 и X5 составляет 15-30. Представлены различные модификации для нуклеотидов смысловой и антисмысловой цепи конструкций миНК. Положения выступающих нуклеотидов (N) можно химически модифицировать, как описано в настоящем документе (например, 2'-O-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-дезокси-, ЗНК, универсальные основания и т.д.) и можно получать из соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или нет. Конструкции, представленные на фигуре, также могут содержать тиофосфатные связи, как описано в настоящем документе. Например, тиофосфатные связи могут присутствовать между любыми положениями N, (N) и/или [N]. Такое встраивание тиофосфата можно использовать между положениями пурина "R" и пиримидина "Y" или, в основном, для стабилизации связей между пиримидинами. Кроме того, несмотря на то, что на фигуре этого не приведено, конструкции, представленные на фигуре, необязательно могут содержать рибонуклеотид в положении 9 от 5'-конца смысловой цепи или в положении 11 на основе 5'-конца направляющей цепи, отсчитывая 11 положений нуклеотидов от 5'-конца направляющей цепи. Подобным образом, антисмысловая цепь может содержать рибонуклеотид в положении 14 от 5'-конца, или альтернативно, ее можно выбирать или конструировать так, чтобы в этом положении 2'-O-алкилнуклеотид (например, a 2'-O-метилпурин) не присутствовал. Кроме того, несмотря на то, что на фигуре этого не представлено, 5'-концевое положение антисмысловой цепи может содержать концевую фосфатную группу, как описано в настоящем документе. Как правило, антисмысловая цепь содержит последовательность, комплементарную любой последовательности нуклеиновой кислоты-мишени по изобретению, такой как последовательности, приведенные в таблице 1a в настоящем документе.
[0041] На фиг.3 представлены неограничивающие примеры определенных комбинаций модификаций, применяемых для характерного дуплекса миНК, описанного на фиг.2. В таблице, демонстрирующей ниже характерную структуру, представлены конкретные комбинации положений нуклеотидов (и необязательных не являющихся нуклеотидами групп) (N)X1, (N)X2, NX3, NX4 и/или [N]X5. Например, указаны комбинации из 5 или более (например, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более) NX3 и 5 или более (например, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более) NX4 пиримидиновых "Y" и пуриновых "R" нуклеотидов, каждый из которых в дополнение к необязательным фосфотиоатным заменам может независимо содержать конкретные замены (N)X1 и/или (N)X2, как представлено на фигуре. Как правило, нуклеотиды 5'-концевой антисмысловой цепи [N] представляют собой рибонуклеотиды, но также они могут быть модифицированными или немодифицированными в зависимости от того, являются ли они пуриновыми "R" или пиримидиновыми "Y" нуклеотидами.
[0042] На фиг.4A-C представлены неограничивающие примеры различных конструкций миНК по изобретению. К любым структурам, представленным на фигурах фиг.4A-C, можно применять параметры характерных структур, представленных на фиг.2 и 3.
[0043] В примерах, представленных на фиг.4A (конструкции 1, 2 и 3), содержатся 19 характерных пар оснований; однако различные варианты осуществления изобретения включают любое количество пар оснований, описываемых в настоящем документе. Области в скобках представляют собой нуклеотидные выступы, например, составляющие приблизительно 1, 2, 3 или 4 нуклеотида в длину, предпочтительно приблизительно 2 нуклеотида. Конструкции 1 и 2 для обеспечения активности РНКи можно использовать независимо. Конструкция 2 может содержать полинуклеотидный или ненуклеотидный линкер, который необязательно можно конструировать в виде биологически разрушаемого линкера. В одном из вариантов осуществления петлевая структура, представленная в конструкции 2, может содержать биологически разрушаемый линкер, который in vivo и/или in vitro приводит к образованию конструкции 1. В другом примере по тому же принципу для получения конструкции 2 можно использовать конструкцию 3, где применяют линкер для получения активной конструкции миНК 2 in vivo и/или in vitro, в которой можно необязательно использовать другой биологически разрушаемый линкер с получением in vivo и/или in vitro активной конструкции миНК 1. По существу, стабильность и/или активность конструкций миНК можно модулировать на основе разработки конструкции миНК для применения in vivo или in vitro и/или in vitro.
[0044] Примеры, представленные на фиг.4B, представляют собой различные вариации двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, такой как микроРНК, которая может включать выступы, выпячивания, петли и стебель-петли, являющиеся результатом частичной комплементарности. Такие мотивы с выпячиваниями, петлями и стеблем-петлями, как правило, являются характерными для мкРНК. Выпячивания, петли и стебель-петли могут являться результатом частичной комплементарности любой степени, такой как несоответствия или выпячивания приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более нуклеотидов в одной или обеих цепях двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению.
[0045] Пример, представленный на фиг.4C, представляет собой модельную двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, содержащую дуплекс из 19 пар оснований из двух 21-нуклеотидных последовательностей с динуклеотидными выступами на 3'-конце. Верхняя цепь (1) представляет собой смысловую цепь (сопровождающую цепь), средняя цепь (2) представляет собой антисмысловую (направляющую цепь), а нижняя цепь (3) представляет собой полинуклеотидную последовательность-мишень. Динуклеотидные выступы (NN) могут содержать последовательность, происходящую из полинуклеотида-мишени. Например, последовательность 3'-(NN) в направляющей цепи может быть комплементарна последовательности 5'-[NN] полинуклеотида-мишени. Кроме того, последовательность 5'-(NN) сопровождающей цепи может содержать ту же последовательность, что и последовательность 5'-[NN] полинуклеотидной последовательности-мишени. В других вариантах осуществления выступы (NN) не происходят из полинуклеотидной последовательности-мишени, например, когда последовательность 3'-(NN) в направляющей цепи не комплементарна последовательности 5'-[NN] полинуклеотида-мишени, а последовательность 5'-(NN) сопровождающей цепи может содержать последовательность, отличную от последовательности 5'-[NN] полинуклеотидной последовательности-мишени. В дополнительных вариантах осуществления любые нуклеотиды (NN) являются химически модифицированными, например, в виде 2'-O-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- и/или других модификаций по настоящему документу. Кроме того, сопровождающая цепь может в положении N сопровождающей цепи содержать рибонуклеотид. Для представленного характерного 21-членного дуплекса с 19 парами оснований, положение N может представлять собой 9 нуклеотидов от 3'-конца сопровождающей цепи. Однако в дуплексах другой длины, положение N определяют на основе 5’-конца направляющей цепи, отсчитывая 11 положений нуклеотидов от 5'-конца направляющей цепи и отмечая соответствующий спаренный нуклеотид в сопровождающей цепи. Расщепление посредством Ago2 происходит между положениями 10 и 11, как указано стрелкой. В дополнительных вариантах осуществления в положениях 10 и 11 на основе 5’-конца направляющей цепи, отсчитывая 10 и 11 положений нуклеотидов от 5'-конца направляющей цепи и отмечая соответствующие спаренные нуклеотиды в сопровождающей цепи, находятся два рибонуклеотида, NN.
[0046] На фиг.5 представлены неограничивающие примеры различных стабилизационных химических соединений (1-10), которые можно использовать, например, для стабилизации 3’-конца последовательностей миНК по изобретению, включая (1) [3-3']-инвертированную дезоксирибозу; (2) дезоксирибонуклеотид; (3) [5'-3']-3'-дезоксирибонуклеотид; (4) [5'-3']-рибонуклеотид; (5) [5'-3']-3'-O-метилрибонуклеотид; (6) 3'-глицерил; (7) [3'-5']-3'-дезоксирибонуклеотид; (8) [3'-3']-дезоксирибонуклеотид; (9) [5'-2']-дезоксирибонуклеотид и (10) [5-3']-дидезоксирибонуклеотид (когда X=O). В дополнение к химическим соединениям с модифицированным и немодифицированным каркасом, указанным на фигуре, эти химические соединения можно комбинировать с различными модификациями сахаров и оснований нуклеотидов, как описано в настоящем документе. R = О, S, NH2, N-диалкил, NH-алкил, алкил, замещенный алкил, O-алкил, S-алкил, алкиларил или аралкил. В = независимо любое нуклеотидное основание, природное или химически модифицированное, или необязательно Н (без основания). Х = О, S, NH, N-алкил, алкил, замещенный алкил, O-алкил, S-алкил, сульфон и т.д.
[0047] На фиг.6 представлен неограничивающий пример стратегии, используемой для определения химически модифицированных конструкций миНК по изобретению, которые устойчивы к нуклеазам, при сохранении способности опосредовать активность РНКи. Химические модификации вносят в конструкцию миНК на основе параметров "обученной" конструкции (например, внесение 2'-модификаций, модификаций оснований, модификаций каркаса, концевых кэпирующих модификаций и т.д.). Модифицированную конструкцию тестируют в подходящей системе (например, в сыворотке человека на устойчивость к нуклеазам, представлено, или в модели на животных на параметры ФК/доставки). Параллельно конструкцию миНК тестируют на активность РНКи, например, в системе клеточной культуры, такой как анализ с люциферазным репортером и/или по сравнению с эндогенной мРНК). Затем определяют лидирующие конструкции миНК, которые обладают конкретной характеристикой с поддержанием в то же время активности РНКи, и их можно дополнительно модифицировать и еще раз анализировать. Такой же подход можно использовать для определения миНК-молекул конъюгатов с улучшенными фармакокинетическими профилями, доставкой и активностью РНКи.
[0048] На фиг.7 представлены неограничивающие примеры фосфорилированных молекул миНК по изобретению, включая линейные и дуплексные конструкции и их ассиметричные производные.
[0049] На фиг.8 представлены неограничивающие примеры химически модифицированных концевых фосфатных групп по изобретению. PO4- является эквивалентом в виде сульфоновой кислоты или ванадиловым эквивалентом с любой комбинацией других модификаций по настоящему изобретению.
[0050] На фиг.9 представлен неограничивающий пример связанного с холестерином фосфорамидита, который можно использовать для синтеза конъюгированных с холестерином молекул миНК по изобретению. Пример представлен с холестериновой группой, связанной c 5’-концом смысловой цепи молекулы миНК.
[0051] На фиг.10 изображен вариант осуществления 5' и 3' инвертированной кэпирующей группы без основания, связанной с цепью нуклеиновой кислоты.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
A. Термины и определения
[0052] Приведенная ниже терминология и определения применяются, как использовано в настоящей заявке.
[0053] Как используется в настоящем документе, термин "без основания" имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к группам сахаров с отсутствующим нуклеиновым основанием или содержащим вместо нуклеинового основания в положении 1' группы сахара атом водорода (H) или другие не являющиеся нуклеиновыми основаниями химические группы, см. например, Adamic et al., патент США № 5998203. В одном из вариантов осуществления группа без основания по изобретению представляет собой сахара рибозу, дезоксирибозу или дидезоксирибозу.
[0054] Как используется в настоящем документе, термин "ациклический нуклеотид" имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к любому нуклеотиду, содержащему ациклический сахар рибозу, например, когда любая из связей углерод/углерод или углерод/кислород рибозы независимо или в комбинации в нуклеотиде отсутствуют.
[0055] Как используется в настоящем документе, термин "алкил" имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к насыщенным или ненасыщенным углеводородам, включая неразветвленные цепи, разветвленные цепи, алкенильные, алкинильные группы и циклические группы, но исключая ароматические группы. Несмотря на указанное выше, алкил также относится к неароматическим гетероциклическим группам. Предпочтительно, алкильная группа содержит от 1 до 12 атомов углерода. Более предпочтительно, он представляет собой низший алкил с количеством атомов углерода от 1 до 7, более предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода. Алкильная группа может быть замещенной или незамещенной. Когда она является замещенной, замещающая группа(-ы) предпочтительно представляет собой гидроксил, галоген, циано, C1-C4-алкокси, =O, =S, NO2, SH, NH2 или NR1R2, где R1 и R2 независимо представляют собой H или C1-C4-алкил.
[0056] Фраза "средства, блокирующие контрольные точки клеточного цикла" относится к соединениям, ингибирующим протеинкиназы, передающие сигналы контрольных точек клеточного цикла, таким образом, сенсибилизируя злокачественную клетку к повреждающим ДНК средствам.
[0057] Фраза "средства, блокирующие рецепторные тирозинкиназы (RTK)" относится к соединениям, ингибирующим RTK и, таким образом, ингибирующим механизмы, вовлеченные в онкогенез и прогрессию опухоли.
[0058] Фраза "модуляторы рецепторов андрогенов" относится к соединениям, блокирующим или ингибирующим связывание андрогенов c рецептором, вне зависимости от механизма.
[0059] Фраза "ингибиторы ангиогенеза" относится к соединениям, ингибирующим формирование новых кровеносных сосудов вне зависимости от механизма.
[0060] Как используется в настоящем документе, термин "арил" имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к ароматической группе, содержащей по меньшей мере одно кольцо, содержащее систему конъюгированных пи-электронов, и включающей карбоциклические арильные, гетероциклические арильные и биарильные группы, которые все необязательно могут быть замещенными. Предпочтительными заместителями арильных групп являются галоген, тригалогенметил, гидроксил, SH, OH, циано, C1-C4-алкокси, C1-C4-алкил, C2-C4-алкенил, C2-C4-алкинил, NH2 и группы NR1R2, где R1 и R2 независимо представляют собой H или C1-C4-алкил.
[0061] Как используется в настоящем документе, термин "алкиларил" имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к алкильной группе (как описано выше), ковалентно связанной с арильной группой (как описано выше). Карбоциклические арильные группы представляют собой группы, где все циклические атомы в ароматическом цикле представляют собой атомы углерода. Атомы углерода необязательно являются замещенными. Гетероциклические арильные группы представляют собой группы, содержащие от 1 до 3 гетероатомов в качестве циклических атомов в ароматическом цикле, а оставшиеся циклические атомы являются атомами углерода. Подходящие гетероатомы включают кислород, серу и азот, а примеры гетероциклических арильных групп, содержащих такие гетероатомы включают фуранил, тиенил, пиридил, пирролил, низший N-алкилпирроло, пиримидил, пиразинил, имидазолил и т.п., все необязательно замещенные. Предпочтительно, алкильная группа представляет собой C1-C4-алкильную группу.
[0062] Как используется в настоящем документе, термин "амид" имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к -C(O)-NH-R, где R представляет собой алкил, арил, алкиларил или водород.
[0063] Как используется в настоящем документе, фраза "антисмысловая область" имеет значение, общепринятое в данной области. В отношении к иллюстративным молекулам нуклеиновой кислоты по изобретению термин относится к нуклеотидной последовательности молекулы миНК с комплементарностью к последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Кроме того, антисмысловая область молекулы миНК необязательно может содержать последовательность нуклеиновой кислоты с комплементарностью к смысловой области молекулы миНК. В одном из вариантов осуществления антисмысловая область молекулы миНК относится к антисмысловой цепи или направляющей цепи.
[0064] Фраза "асимметрическая шпилька" относится к линейной молекуле миНК, содержащей антисмысловую область, участок петли, который может содержать нуклеотиды или не являющиеся нуклеотидами группы и смысловую область, содержащую меньше нуклеотидов, чем антисмысловая область, таким образом, что смысловая область содержит достаточно комплементарных нуклеотидов, чтобы образовывать пары с антисмысловой областью и формировать дуплекс с петлей. Например, молекула ассиметрической шпильки миНК по изобретению может содержать антисмысловую область с длиной, достаточной для опосредования РНКи в клетке или в системе in vitro (например, от приблизительно 15 до приблизительно 30 или приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов), и область петли, содержащую от приблизительно 4 до приблизительно 12 (например, приблизительно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) нуклеотидов, и смысловую область, содержащую от приблизительно 3 до приблизительно 25 (например, приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) нуклеотидов, комплементарных антисмысловой области. Также молекула ассиметрической шпильки миНК может содержать 5'-концевую фосфатную группу, которая может быть химически модифицированной. Участок петли молекулы ассиметрической шпильки миНК может содержать нуклеотиды, не являющиеся нуклеотидами группы, линкерные молекулы или молекулы конъюгатов, как описано в настоящем документе.
[0065] Как используется в настоящем документе, термин "биологически разрушаемый" имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к разрушению в биологической системе, например, к ферментативному расщеплению или к химическому разрушению.
[0066] Как используется в настоящем документе, термин "биологически разрушаемый линкер" имеет значение, общепринятое в данной области. В отношении иллюстративных молекул нуклеиновой кислоты по изобретению термин относится к линкерной молекуле, сконструированной для связывания одной молекулы с другой молекулой и чувствительной к разрушению в биологической системе. Линкер может представлять собой линкер на основе нуклеиновой кислоты или не на основе нуклеиновой кислоты. Например, биологически разрушаемый линкер можно использовать для присоединения лиганда или биологически активной молекулы к молекуле миНК по изобретению. Альтернативно, биологически разрушаемый линкер можно использовать для связывания смысловой и антисмысловой цепей молекулы миНК по изобретению. Биологически разрушаемый линкер сконструирован так, чтобы его стабильность можно было модулировать для конкретной цели, такой как доставка в конкретную ткань или тип клеток. Стабильность линкерной молекулы на основе нуклеиновой кислоты можно модулировать, применяя различные химические вещества, например, комбинации рибонуклеотидов, дезоксирибонуклеотидов и химически модифицированных нуклеотидов, таких как 2'-O-метил-, 2'-фтор-, 2'-амино-, 2'-O-амино-, 2'-C-аллил-, 2'-O-аллил- и других модифицированных по 2'-положению или модифицированных по основанию нуклеотидов. Биологически разрушаемая линкерная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой димер, тример, тетрамер или более длинную молекулу нуклеиновой кислоты, например, олигонуклеотид с длиной приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, или может содержать один нуклеотид со связью на основе фосфора, например, с фосфорамидатной или фосфодиэфирной связью. Биологически разрушаемая линкерная молекула нуклеиновой кислоты также может содержать модификации каркаса нуклеиновой кислоты, сахаров нуклеиновой кислоты или оснований нуклеиновой кислоты.
[0067] Как используется в настоящем документе, фраза "биологически активная молекула" имеет значение, общепринятое в данной области. В отношении иллюстративных молекул нуклеиновой кислоты по изобретению, термин относится к соединениям или молекулам, способным к вызову или модификации биологического ответа в системе и/или способным к модуляции фармакокинетики и/или фармакодинамики других биологически активных молекул. Примеры биологически активных молекул включают молекулы миНК отдельно или в комбинации с другими молекулами, включая в качестве неограничивающих примеров терапевтически активные молекулы, такие как антитела, холестерин, гормоны, противовирусные средства, пептиды, белки, химиотерапевтические средства, низкомолекулярные соединения, витамины, кофакторы, нуклеозиды, нуклеотиды, олигонуклеотиды, ферментативные нуклеиновые кислоты, антисмысловые нуклеиновые кислоты, формирующие триплексы олигонуклеотиды, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоль, другие простые полиэфиры, химеры 2,5-A, миНК, дцРНК, аллозимы, аптамеры, ловушки и их аналоги.
[0068] Как используется в настоящем документе, фраза "биологическая система" имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к материалу, в очищенной или неочищенной форме, из биологических источников, включая в качестве неограничивающих примеров человека или животных, где система содержит компоненты, необходимые для активности РНКи. Таким образом, фраза включает, например, клетку, ткань, индивидуума или организм или экстракт из них. Термин также включает восстановленный материал из биологического источника.
[0069] Как используется в настоящем документе, фраза "тупой конец" имеет значение, общепринятое в данной области. В отношении иллюстративных молекул нуклеиновой кислоты по изобретению термин относится к концам двухцепочечной молекулы миНК без выступающих нуклеотидов. Например, две цепи двухцепочечной молекулы миНК с тупыми концами выровнены друг с другом с совпадающими парами оснований без выступающих нуклеотидов на концах. Дуплексная молекула миНК по изобретению может содержать тупые концы на одном или двух концах дуплекса, таких как концы, расположенные на 5'-конце антисмысловой цепи, 5'-конце смысловой цепи или оба конца дуплекса.
[0070] Как используется в настоящем документе, термин "кэп" также обозначаемый в настоящем документе как "концевой кэп", имеет значение, общепринятое в данной области. В отношении иллюстративных молекул нуклеиновой кислоты по изобретению, термин относится к молекуле, которая может представлять собой химически модифицированный нуклеотид или не являющуюся нуклеотидом молекулу, которую можно встраивать на одном или нескольких концах одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты по изобретению. Эти концевые модификации защищают молекулу нуклеиновой кислоты от экзонуклеазного расщепления и могут помогать при доставке и/или локализации в клетке. Кэп может находиться на 5'-конце (5'-кэп) или на 3’-конце (3'-кэп), или может находиться на обоих концах любой молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению. Кэп может находиться на 5'-конце, 3'-конце и/или 5'- и 3'-концах смысловой цепи молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению. Кроме того, кэп необязательно может находиться на 3'-конце антисмысловой цепи молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению. В неограничивающих примерах 5'-кэп в качестве неограничивающих примеров включает ЗНК; глицерил, инвертированный остаток (группу) дезоксинуклеотида без основания; 4',5'-метиленнуклеотид; 1-(бета-D-эритрофуранозил)нуклеотид, 4'-тионуклеотид; карбоциклический нуклеотид; 1,5-дегидрогекситоловый нуклеотид; L-нуклеотиды; альфа-нуклеотиды; нуклеотид с модифицированным основанием; фосфодитиоатную связь; трео-пентофранозиловый нуклеотид; ациклический 3',4'-секо нуклеотид; ациклический 3,4-дигидроксибутиловый нуклеотид; ациклический 3,5-дигидроксипентиловый нуклеотид, 3'-3'-инвертированная нуклеотидную группу; 3'-3'-инвертированную группу без основания; 3'-2'-инвертированную нуклеотидную группу; 3'-2'-инвертированную группу без основания; 1,4-бутандиолфосфат; 3'-фосфорамидат; гексилфосфат; аминогексилфосфат; 3'-фосфат; 3'-фосфотиоат; фосфодитиоат или мостиковую или немостиковую метилфосфонатную группу. Неограничивающие примеры 3'-кэпа включают, но не ограничиваясь этим, ЗНК; глицерил; инвертированный остаток (группу) дезоксинуклеотида без основания; 4',5'-метиленовый нуклеотид; 1-(бета-D-эритроуфранозил)нуклеотид; 4'-тионуклеотид; карбоциклический нуклеотид; 5'-аминоалкилфосфат; 1,3-диамино-2-пропилфосфат; 3-аминопропилфосфат; 6-аминогексилфосфат; 1,2-аминододецилфосфат; гидроксипропилфосфат; 1,5-дегидрогекситоловый нуклеотид; L-нуклеотид; альфа-нуклеотид; нуклеотид с модифицированным основанием; фосфодитиоат; трео-пентофуранозиловый нуклеотид; ациклический 3',4'-секо нуклеотид; 3,4-дигидроксибутиловый нуклеотид; 3,5-дигидроксипентиловый нуклеотид, 5'-5'-инвертированную нуклеотидную группу; 5'-5'-инвертированную группу без основания; 5'-фосфорамидат; 5'-фосфотиоат; 1,4-бутандиолфосфат; 5'-амино; мостиковый и/или немостиковый 5'-фосфорамидат, фосфотиоат и/или фосфодитиоат, мостиковый или немостиковый метилфосфонат и 5'-меркаптогруппы (для дополнительных подробностей см. Beaucage and Iyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925; включенный в настоящий документ в качестве ссылки). На фиг.5 представлены некоторые неограничивающие примеры различных кэпов.
[0071] Как используется в настоящем документе, термин "клетка" имеет значение, общепринятое в данной области. В отношении иллюстративных молекул нуклеиновой кислоты по изобретению, термин имеет значение, общепринятое в биологии, и он не относится к целому многоклеточному организму, например, конкретно не относится к человеку. Клетка может находиться в организме, например, птиц, растений и млекопитающих, таких как люди, коровы, овцы, человекообразные обезьяны, обезьянообразные, свиньи, собаки и кошки. Клетка может являться прокариотической (например, бактериальной клеткой) или эукариотической (например, клеткой млекопитающего или растения). Клетка может быть соматического или зародышевого происхождения, тотипотентной или плюрипотентной, делящейся или неделящейся. Клетка также может происходить из гаметы или эмбриона, стволовой клетки или полностью дифференцированной клетки или включать их.
[0072] Как используется в настоящем документе, фраза "химическая модификация" имеет значение, общепринятое в данной области. В отношении иллюстративных молекул нуклеиновой кислоты по изобретению, термин относится к любой модификации химической структуры нуклеотидов, отличающихся от нуклеотидов природной миРНК или РНК вообще. Термин "химическая модификация" включает добавление, замену или модификацию природных миРНК или РНК по сахару, основанию или межнуклеотидной связи, как описано в настоящем документе или как иным образом известно в данной области. В определенных вариантах осуществления термин "химическая модификация" может относиться к определенным формам РНК, которые являются природными в определенных биологических системах, например, к 2'-O-метильным модификациям или инозиновым модификациям.
[0073] Как используется в настоящем документе, термин "комплементарность" или "комплементарный" имеет значение, общепринятое в данной области. В отношении иллюстративных молекул нуклеиновой кислоты по изобретению, термины в основном относятся к формированию или существованию водородной связи(-ей) между одной последовательностью нуклеиновой кислоты и другой последовательностью нуклеиновой кислоты посредством традиционного связывания по Уотсону-Крику или других нетрадиционных типов связывания, как описано в настоящем документе. По отношению к нуклеиновым молекулам по настоящему изобретению, свободная энергия связывания для молекулы нуклеиновой кислоты с комплементарной ей последовательностью является достаточной для обеспечения характерной функции нуклеиновой кислоты для осуществления, например, активности РНКи. Определение свободной энергии связывания молекул нуклеиновых кислот хорошо известно в данной области (см., например, Turner et al., 1987, CSHSymp. Quant. Biol. LII pp.123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785). Полная комплементарность означает, что все смежные остатки последовательности нуклеиновой кислоты образуют водородную связь с тем же количеством смежных остатков во второй последовательности нуклеиновой кислоты. Частичная комплементарность может включать различные несоответствия или неспаренные нуклеотиды (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более несоответствий, ненуклеотидных линкеров или неспаренных нуклеотидов) в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут приводить к выпячивания, петлям или выступам, которые происходят между смысловой цепью или смысловой областью и антисмысловой цепью или антисмысловой областью молекулы нуклеиновой кислоты или между антисмысловой цепью или антисмысловой областью молекулы нуклеиновой кислоты и соответствующей молекулой нуклеиновой кислоты-мишенью. Такую частичную комплементарность можно представлять посредством % комплементарности, который определяет количество неспаренных нуклеотидов, т.е., приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и т.д. в зависимости общего количества включаемых нуклеотидов. Такая частичная комплементарность допустима до той степени, что молекула нуклеиновой кислоты (например, миНК) сохраняет свою функцию, например, способность опосредовать специфичную для последовательности РНКи.
[0074] Как используется в настоящем документе, термины "композиция" или "состав" имеют общепринятое в данной области значение. Эти термины в основном относятся к композиции или составу, такому как в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе, в форме, подходящей для введения, например, системного или локального введения, в клетку или индивидууму, включая, например, человека. Подходящие формы частично зависят от использования или пути введения, например, перорального, трансдермального, посредством ингаляции или посредством инъекции. Такие формы не должны препятствовать достижению композицией или составом клетки-мишени (т.е., клетки, для которой желательна доставка отрицательно заряженной нуклеиновой кислоты). Например, композиции, инъецируемые в кровоток, должны быть растворимыми. В данной области известны другие факторы, и они включают такие факторы, как токсичность и формы, препятствующие проявлению действия композиции или состава. Как используется в настоящем документе, фармацевтические составы включают составы для применения для человека и в ветеринарии. Неограничивающие примеры средств, подходящих для состава с молекулами нуклеиновых кислот по настоящему изобретению включают: липидные наночастицы (см. например, Semple et al., 2010, Nat. Biotechnol., Feb; 28(2): 172-6.); ингибиторы P-гликопротеина (такие как плюроник P85); биологически разрушаемые полимеры, такие как микросферы из сополимера DL-лактида с гликолидом для доставки с пролонгированным высвобождением (Emerich, DF et al, 1999, Cell Transplant, 8, 47-58); и нагруженные наночастицы, такие как наночастицы, получаемые из полибутилцианоакрилата. Другие неограничивающие примеры стратегий доставки молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению включают материал, описанный в Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA., 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; и Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058. "Фармацевтически приемлемая композиция" или "фармацевтически приемлемый состав" могут относиться к композиции или составу, обеспечивающим эффективное распределение молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению в физическом местоположении, наиболее подходящем для их желаемой активности.
[0075] Фраза "цитотоксические/цитостатические средства" относится к соединениям, вызывающим гибель клеток или ингибирующим клеточную пролиферацию, преимущественно прямо препятствуя функционированию клеток или ингибируя митоз клеток или препятствую ему, включающим алкилирующие средства, факторы некроза опухоли, интеркаляторы, активируемые гипоксией соединения, ингибиторы микротрубочек/стабилизаторы микротрубочек, ингибиторы митотических кинезинов, ингибиторы гистондеацетилаз, ингибиторы киназ, вовлеченных в прохождение митоза, антиметаболиты; модификаторы биологического ответа; гормональные/противогормональные терапевтические средства, гемопоэтические факторы роста, нацеливаемые моноклональными антителами терапевтические средства, ингибиторы топоизомераз, ингибиторы протеасом и ингибиторы убиквитинлигазы.
[0076] Фраза "модуляторы рецепторов эстрогенов" относится к соединениям, препятствующим или ингибирующим связывание эстрогена с рецептором вне зависимости от механизма.
[0077] Как используется в настоящем документе, термины "ген" или "ген-мишень" имеют значение, общепринятое в данной области. Термины в основном относятся к последовательности нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), содержащей частичные или полноразмерные кодирующие последовательности, необходимые для продукции полипептида. Также ген-мишень может включать UTR или некодирующую область последовательности нуклеиновой кислоты. Ген или ген-мишень также может кодировать функциональную РНК (фРНК) или некодирующую РНК (нкРНК), такую как малую временную РНК (мвРНК), микроРНК (мкРНК), малую ядерную РНК (мяРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК), малую ядерную РНК (мяРНК), рибосомальную РНК (рРНК), транспортную РНК (тРНК) и их РНК-предшественники. Такие некодирующие РНК могут служить в качестве молекул-мишеней нуклеиновой кислоты для опосредуемой миНК РНК-интерференции для модуляции активности фРНК или нкРНК, вовлеченных в функциональные или регуляторные клеточные процессы. Таким образом, молекулами миНК по изобретению можно модулировать аберрантную активность фРНК или нкРНК, приводящую к заболеванию. Молекулы миНК, нацеленные на фРНК и нкРНК, также можно использовать для воздействия на генотип или фенотип индивидуума, организма или клетки или их изменения, вмешиваясь в такие клеточные процессы, как генетический импринтинг, транскрипция, трансляция или процессинг нуклеиновой кислоты (например, трансаминирование, метилирование и т.д.). Ген-мишень может представлять собой ген, получаемый из клетки, эндогенный ген, трансген или экзогенные гены, такие как гены патогенного микроорганизма, например, вируса, который находится в клетке после ее инфицирования. Клетку, содержащую ген-мишень, можно получать из любого организма, например, растения, животного, простейшего, вируса, бактерии или гриба, или она содержится в них. Неограничивающие примеры растений включают однодольные, двудольные или голосемянные. Неограничивающие примеры животных включают позвоночных или беспозвоночных. Неограничивающие примеры грибов включают плесневые грибы или дрожжи. Для обзора, см. например, Snyder and Gerstein, 2003, Science, 300, 258-260.
[0078] Фраза "ингибиторы HMG-КоА-редуктазы" относится к ингибиторы 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктазы. Как используется в настоящем документе, термин ингибитор HMG-КоА-редуктазы включает все фармацевтически приемлемые формы лактонов и открытых кислот (т.е., где лактонное кольцо открыто с формированием свободной кислоты), а также формы солей и сложных эфиров соединений, обладающих ингибирующей HMG-КоА-редуктазу активностью, и, таким образом, использование таких солей, сложных эфиров, форм открытых кислот и лактонов включено в объем настоящего изобретения.
[0079] Термин "HBV" относится к вирусу гепатита B, который представляет собой ген, кодирующий белки HBV, пептиды HBV, полипептиды HBV, регуляторные полинуклеотиды HBV (например, мкРНК и миНК HBV), мутантные гены HBV и варианты сплайсинга генов HBV, а также другие гены, вовлеченные в HBV пути экспрессии и/или активности генов. Таким образом, каждый из вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе в отношении термина "HBV", применим ко всем молекулам белков, пептидов, полипептидов и/или полинуклеотидов, охватываемых термином "HBV", как этот термин понимают в настоящем документе. В широком смысле такие генные мишени в настоящем документе также в основном обозначают как последовательности-"мишени" (включая последовательности-мишени, перечисленные в таблице 1a).
[0080] Фраза "высококонсервативная область последовательности" относится к нуклеотидной последовательности одной или нескольких областей в гене-мишени, которые от одного поколения к другому или от одной биологической системы к другой значительно не варьируют.
[0081] Как используется в настоящем документе, фраза "гомологичная последовательность" имеет значение, общепринятое в данной области. Термин в основном относится к нуклеотидной последовательности, общей для одной или нескольких полинуклеотидных последовательностей, таких как гены, транскрипты генов и/или некодирующие полинуклеотиды. Например, гомологичная последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность, общую для двух или более генов, кодирующих родственные, но различные белки, такие как различные представители семейства генов, различные эпитопы белка, различные изоформы белка или полностью дивергентные гены. Гомологичная последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность, общую для двух или более некодирующих полинуклеотидов, таких как некодирующие ДНК или РНК, регуляторные последовательности, интроны и участки контроля или регуляции транскрипции. Гомологичные последовательности также могут включать области последовательностей, общие более чем для одной полинуклеотидной последовательности. Гомология не обязательно должна быть полной идентичностью (100%), так как частично гомологичные последовательности также предусмотрены по настоящему изобретению и входят в его объем (например, по меньшей мере 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80% и т.д.). Процент гомологии представляет собой число совпадающих нуклеотидов в двух последовательностях, деленное на всю длину сравниваемого, умноженное на 100.
[0082] Фраза "улучшенная активность РНКи" относится к увеличению активности РНКи, измеряемой in vitro и/или in vivo, где активность РНКи представляет собой отражение способности миНК опосредовать РНКи и стабильности миНК по изобретению. В настоящем изобретении результат этих видов активности по сравнению со всеми миНК из РНК или миНК, содержащих множество рибонуклеотидов, in vitro и/или in vivo можно увеличивать. В некоторых вариантах активность или стабильность молекулы миНК можно снижать (т.е., менее чем десятикратно), но общая активность молекулы миНК in vitro и/или in vivo увеличена.
[0083] Как используется в настоящем документе, термины "ингибирует", "отрицательно регулирует" или "снижает" имеют значение, общепринятое в данной области. В отношении иллюстративных молекул нуклеиновой кислоты по изобретению, термин в основном относится к снижению экспрессии гена или уровня молекул РНК или эквивалентных молекул РНК, кодирующих один или несколько белков или белковых субъединиц, или активность одного или нескольких белков или белковых субъединиц ниже наблюдаемого в отсутствие молекул нуклеиновых кислот (например, миНК) по изобретению. Отрицательная регуляция также может быть ассоциирована с посттранскрипционным сайленсингом, таким как опосредованное РНКи расщепление или посредством изменения профилей метилирования ДНК или структуры хроматина ДНК. Ингибирование, отрицательная регуляция или снижение с применением молекулы миНК может происходить по отношению к неактивной молекуле, аттенуированной молекуле, молекуле миНК с последовательностью со случайной перестановкой или молекуле миНК с несоответствиями, или, альтернативно, может происходить по отношению к системе в отсутствие нуклеиновой кислоты.
[0084] Фраза "ингибиторы клеточной пролиферации и пути передачи сигнала выживания" относится к фармацевтическим средствам, ингибирующим рецепторы клеточной поверхности и каскады передачи сигнала ниже этих поверхностных рецепторов.
[0085] Термин "блокаторы интегринов" относится к соединениям, являющимся селективными антагонистами, ингибирующим или противодействующим связыванию физиологического лиганда с интегрином αωβ3, к соединениям, являющимся селективными антагонистами, ингибирующим или противодействующим связыванию физиологического лиганда с интегрином αωβ5, к соединениям, являющимся селективными антагонистами, ингибирующим или противодействующим связыванию физиологического лиганда и с интегрином αωβ3, и с интегрином αωβ5, и к соединениям, являющимся селективными антагонистами, ингибирующим или противодействующим активности конкретного интегрина(-ов), экспрессируемого на эндотелиальных клетках капилляров. Термин также относится к антагонистам интегринов αωβ6, αωβ8, α1β1, α2β1, α5β1, α6β1 и α6β4. Термин также относится к антагонисты любой комбинации интегринов αωβ3, αωβ5, αωβ6, αωβ8, α1β1, α2β1, α5β1, α6β1 и α6β4.
[0086] Как используется в настоящем документе, термины "периодический" или "периодически" имеют значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к периодической остановке и запуску с регулярными или нерегулярными интервалами.
[0087] Термины "межнуклеозидная связь" или "межнуклеозидный линкер" или "межнуклеотидная связь" или "межнуклеотидный линкер" используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и они относятся к любому линкеру или связи между двумя нуклеозидными единицами, как известно в данной области, например, включая, но не ограничиваясь ими, фосфатные связи, связи аналогами фосфатов, фосфонатные, гуанидиновые, гидроксиламиновые, гидроксилгидразиниловые, амидные, карбаматные, алкильные связи и связи замещенными алкилами. Межнуклеозидные связи составляют каркас молекулы нуклеиновой кислоты.
[0088] Как используется в настоящем документе, термин "млекопитающее" имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к любому виду теплокровного позвоночного, такому как человек, мышь, крыса, собака, кошка, хомяк, морская свинка, кролик, домашний скот и т.п.
[0089] Фраза "ингалятор мерных доз" или MDI относится к устройству, содержащему баллон, закрепляемую крышку, закрывающую баллон, и отмеряющий состав клапан, расположенный на крышке. Системы MDI содержат подходящее канальное устройство. Подходящие канальные устройства включают, например, пусковой клапан и цилиндрическую или конусовидную трубку, через которую лекарственное средство может поступать из наполненного контейнера через дозирующий клапан в нос или рот пациента, например, мундштучное пусковое устройство.
[0090] Как используется в настоящем документе, термин "микроРНК" или "мкРНК" имеет значение, общепринятое в данной области. Термин в основном относится к малой двухцепочечной РНК, которая регулирует экспрессию матричной РНК-мишени посредством расщепления мРНК, подавления/ингибирования трансляции или гетерохроматинового сайленсинга (см. например, Ambros, 2004, Nature, 431, 350-355; Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297; Cullen, 2004, Virus Research., 102, 3-9; He et al., 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531; Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28; и Sethupathy et al., 2006, RNA, 12:192-197).
[0091] Как используется в настоящем документе, термин "модулирует" имеет значение, общепринятое в данной области. В отношении иллюстративных молекул нуклеиновой кислоты по изобретению термин относится к случаям, когда экспрессия гена, или уровень одной или нескольких молекул РНК (кодирующих или некодирующих), или активность одной или нескольких молекул РНК или белков или белковых субъединиц положительно регулируются или отрицательно регулируются так, что экспрессия, уровень или активность являются большими или меньшими, чем наблюдаемые в отсутствие молекулы, осуществляющей модуляцию. Например, в некоторых вариантах осуществления термин "модулирует" может относиться к ингибированию, а в других вариантах осуществления может относиться к потенцированию или положительной регуляции, например, экспрессии гена.
[0092] Как используется в настоящем документе, фраза "модифицированный нуклеотид" имеет значение, общепринятое в данной области. Термин в основном относится к нуклеотиду, содержащему модификацию в химической структуре основания, сахара и/или фосфата немодифицированного (или природного) нуклеотида, как широко известно в данной области. Неограничивающие примеры модифицированных нуклеотидов описаны в настоящем документе и в заявке США № 12/064014.
[0093] Фраза "NSAID, являющиеся селективными ингибиторами COX-2" для целей настоящего документа, относится к NSAID, обладающими специфичностью для ингибирования COX-2 по отношению к COX-1, по меньшей мере в 100 раз большей, как измеряют по отношению IC50 для COX-2 к IC50 для COX-1, оцениваемых посредством клеточных или микросомальных анализов.
[0094] Фраза "неспаренные" относится к нуклеотидам, основания которых в смысловой цепи или смысловой области и антисмысловой цепи или антисмысловой области двухцепочечной молекулы миНК являются неспаренными; и может в качестве неограничивающих примеров включать, например, несоответствия, выступы, одноцепочечные петли, и т.д.
[0095] Термин "не являющаяся нуклеотидом группа" относится к любой группе или соединению, которые можно встраивать в цепь нуклеиновой кислоты вместо одной или нескольких нуклеотидных единиц, таких как, например, но не ограничиваясь этим, группы без оснований или алкильные цепи. Группа или соединение находится "без основания" в том смысле, что она не содержит общеизвестного нуклеотидного основания, такого как аденозин, гуанин, цитозин, урацил или тимин, и, таким образом, у нее в положении 1' отсутствует нуклеиновое основание.
[0096] Термин "нуклеотид" используют так, как это общепризнанно в данной области. Как правило, нуклеотиды содержат нуклеиновое основание, сахар и межнуклеозидную связь, например, фосфат. Основание может представлять собой природное основание (стандарт), модифицированное основание или аналог основания, как хорошо известно в данной области. Такие основания, как правило, расположены в положении 1' группы сахара нуклеотида. Кроме того, нуклеотиды могут являться немодифицированными или модифицированными по группе сахара, межнуклеозидной связи и/или по группе основания (также взаимозаменяемо обозначаемые как аналоги нуклеотидов, модифицированные нуклеотиды, неприродные нуклеотиды, нестандартные нуклеотиды и другое; см., например, заявку США № 12/064014.
[0097] Как используется в настоящем документе, термин "выступ" имеет значение, общепринятое в данной области. В отношении иллюстративной двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, как правило, термин относится к концевой части нуклеотидной последовательности, в которой отсутствует спаривание оснований между двумя цепями двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты (см. например, фиг.4). Когда они присутствуют, как правило, выступы, находятся на 3'-конце одной или обеих цепей дуплекса миНК.
[0098] Как используется в настоящем документе, термин "парентеральный" имеет значение, общепринятое в данной области. Термин в основном относится к способам или технологиям введения молекулы, лекарственного средства, средства или соединения способом, отличным от введения через желудочно-кишечный тракт, и включает способы накожной, подкожной, внутрисосудистой (например, внутривенной), внутримышечной или интратекальной инъекции или инфузии и т.п.
[0099] Фраза "мишень из каскада" относится к любой мишени, вовлеченной в каскады экспрессии генов или активности генов. Например, любая данная мишень может иметь связанные мишени из каскада, которые могут включать гены, расположенные выше по биологическому каскаду, ниже по биологическому каскаду или гены-модификаторы биологического каскада. Эти гены-мишени из каскадов могут обеспечивать дополнительное или синергическое действие при лечении заболеваний, состояний и симптомов по настоящему документу.
[0100] Термин "фосфотиоат" относится к межнуклеотидной фосфатной связи, содержащей вместо атома кислорода один или несколько атомов серы. Таким образом, термин фосфотиоат относится к фосфотиоатной и фосфодитиоатной межнуклеотидным связям.
[0101] "Ингибитор пренилпротеинтрансферазы" относится к соединению, ингибирующему любой один или любую комбинацию пренилпротеинтрансферазных ферментов, включая фарнезилпротеинтрансферазу (FPTазу), геранилгеранилпротеинтрансферазу типа I (GGPTаза-I) и геранилгеранилпротеинтрансферазу типа II (GGPTаза-II, также называемая Rab GGPTase).
[0102] Фраза "модуляторы ретиноидного рецептора" относится к соединениям, препятствующим связыванию или ингибирующим связывание ретиноидов с рецептором, вне зависимости от механизма.
[0103] Как используется в настоящем документе, термин "рибонуклеотид" имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к нуклеотиду c гидроксильной группой в положении 2' β-D-рибофуранозной группы.
[0104] Как используется в настоящем документе, термин "РНК" имеет общепринятое в данной области значение. Как правило, термин РНК относится к молекуле, содержащей по меньшей мере одну рибофуранозидную группу. Термин может включать двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, выделенную РНК, например, частично очищенную РНК, по существу чистую РНК, синтетическую РНК, рекомбинантно полученную РНК, а также измененную РНК, которая отличается от природной РНК добавлением, делецией заменой и/или изменением одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут включать добавление ненуклеотидного материала, например, на конце(-ах) миНК или внутри, например, по одному или нескольким нуклеотидам РНК. Нуклеотиды в молекулах РНК по настоящему изобретению также могут включать нестандартные нуклеотиды, такие как неприродные нуклеотиды или химически синтезированные нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Эти измененные РНК можно обозначать как аналоги или аналоги природной РНК.
[0105] Фраза "РНК-интерференция" или термин "РНКи" относятся к биологическому процессу ингибирования или отрицательной регуляции экспрессии гена в клетке, как это в основном известно в данной области, который опосредован малыми интерферирующими молекулами нуклеиновой кислоты, см. например, Zamore and Haley, 2005, Science, 309, 1519-1524; Vaughn and Martienssen, 2005, Science, 309, 1525-1526; Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498; и Kreutzer et al., публикация международной PCT № WO 00/44895; Zemicka-Goetz et al., публикация международной PCT № WO 01/36646; Fire, публикация международной PCT № WO 99/32619; Plaetinck et al., публикация международной PCT № WO 00/01846; Mello and Fire, публикация международной PCT № WO 01/29058; Deschamps-Depaillette, публикация международной PCT № WO 99/07409 и Li et al., публикация международной PCT № WO 00/44914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; и Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al., 2002, РНК, 8, 842-850; Reinhart et al., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626; и Reinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831). Кроме того, полагают, что термин РНКи эквивалентен другим терминам, используемым для описания специфичной для последовательности РНК-интерференции, таким как посттранскрипционный сайленсинг генов, ингибирование трансляции, ингибирование транскрипции или эпигенетика. Например, молекулы миНК по изобретению можно использовать для эпигенетического сайленсинга генов на любом посттранскрипционном уровне или претранскрипционном уровне. В неограничивающем примере, эпигенетическая модуляция экспрессии гена молекулами миНК по изобретению может являться результатом опосредуемой миНК модификации структуры хроматина или профилей метилирования с изменением экспрессии гена (см., например, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; и Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237). В другом неограничивающем примере модуляция экспрессии генов молекулами миНК по изобретению может являться результатом опосредованного миНК расщепления РНК (кодирующей или некодирующей РНК) посредством RISC или посредством ингибирования трансляции, как это известно в данной области, или модуляция может являться результатом ингибирования транскрипции (см. например, Janowski et al., 2005, Nature Chemical Biology, 1, 216-222).
[0106] Фраза "ингибитор РНКи" относится к любой молекуле, которая может отрицательно регулировать, снижать или ингибировать функцию или активность РНК-интерференции в клетке или организме. Ингибитор РНКи может отрицательно регулировать, снижать или ингибировать РНКи (например, опосредованное РНКи расщепление полинуклеотида-мишени, ингибирование трансляции или сайленсинг транскрипции) посредством взаимодействия или препятствования функции любого компонента пути РНКи, включая белковые компоненты, такие как RISC, или компоненты нуклеиновых кислот, такие как мкРНК или миРНК. Ингибитор РНКи может представлять собой молекулу миНК, антисмысловую молекулу, аптамер или низкомолекулярное соединение, взаимодействующее или препятствующее функции RISC, мкРНК или миРНК или любого другого компонента пути РНКи в клетке или организме. Посредством ингибирования РНКи (например, опосредованного РНКи расщепления полинуклеотида-мишени, ингибирования трансляции или сайленсинга транскрипции) ингибитор РНКи по изобретению можно использовать для модуляции (например, положительной регуляции или отрицательной регуляции) экспрессии гена-мишени.
[0107] Как используется в настоящем документе, фраза "смысловая область" имеет значение, общепринятое в данной области. В отношении иллюстративных молекул нуклеиновой кислоты по изобретению, термин относится к нуклеотидной последовательности молекулы миНК с комплементарностью к антисмысловой области молекулы миНК. Кроме того, смысловая область молекулы миНК может содержать последовательность нуклеиновой кислоты с гомологией или идентичностью последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишенью. В одном из вариантов осуществления смысловая область молекулы миНК также относится к смысловой цепи или сопровождающей цепи.
[0108] Фразы "малая интерферирующая нуклеиновая кислота", "миНК", "малая интерферирующая РНК", "миРНК", "молекула малой интерферирующей нуклеиновой кислоты", "малая интерферирующая олигонуклеотидная молекула" или "химически модифицированная молекула малой интерферирующей нуклеиновой кислоты" относятся к любой молекуле нуклеиновой кислоты, способной к ингибированию или отрицательной регуляции экспрессии гена или вирусной репликации, опосредуя РНК-интерференцию, "РНКи" или сайленсинг генов специфичным для последовательности образом. Эти термины могут относиться к индивидуальным молекулам нуклеиновых кислот, множеству таких молекул нуклеиновых кислот или совокупности таких молекул нуклеиновых кислот. миНК может представлять собой двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую самокомплементарные смысловую и антисмысловую цепи, где антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, а смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части. миНК может представлять собой полинуклеотид со вторичной структурой дуплекса, ассиметричного дуплекса, шпильки или ассиметричной шпильки с самокомплементарными смысловой и антисмысловой областями, где антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности в отдельной молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, а смысловая область содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части. миНК может представлять собой кольцевой одноцепочечный полинуклеотид, имеющий две или более петлевые структуры и содержащие стебель самокомплементарные смысловую и антисмысловую области, где антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, а смысловая область содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, и где кольцевой полинуклеотид можно преобразовывать in vivo или in vitro с получением активной молекулы миНК, способной опосредовать РНКи. миНК также может содержать одноцепочечный полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части (например, где такая молекула миНК не требует присутствия в молекуле миНК нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части), где одноцепочечный полинуклеотид может дополнительно содержать концевую фосфатную группу, такую как 5'-фосфат (см. например, Martinez et al., 2002, Cell, 110, 563-574 и Schwarz et al., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568), или 5',3'-дифосфат.
[0109] Как используется в настоящем документе, термин "индивидуум" имеет значение, общепринятое в данной области. Термин в основном относится к организму, в который можно вводить молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению. Индивидуум может представлять собой млекопитающее или клетки млекопитающих, включая человека или клетки человека. Термин также относится к организму, который представляет собой донора или реципиента эксплантируемых клеток или сами клетки.
[0110] Как используется в настоящем документе, фраза "системное введение" имеет значение, общепринятое в данной области. Термин в основном относится к системному всасыванию или накоплению лекарственных средств в кровотоке in vivo с последующим распределением по всему организму.
[0111] Термин "мишень", относительно HBV, относится к любому белку, пептиду или полипептиду HBV-мишеням, например, кодируемым номерами доступа GenBank, представленными в таблице 7. Термин также относится к последовательностям нуклеиновых кислот или полинуклеотидной последовательности-мишени, кодирующей любой белок-, пептид- или полипептид-мишень, такие как белки, пептиды или полипептиды, кодируемые последовательностями с номерами доступа GenBank, представленными в таблице 7. Представляющая интерес мишень может включать полинуклеотидные последовательности-мишени, такие как ДНК-мишень или РНК-мишень. Также подразумевают, что термин "мишень" включает другие последовательности, такие как различные изоформы, мутантные гены-мишени, варианты сплайсинга полинуклеотидов-мишеней, полиморфизмы-мишени и некодирующие (например, нкРНК, мкРНК, квРНК, sRNA) или другие регуляторные полинуклеотидные последовательности, как описано в настоящем документе.
[0112] Как используется в настоящем документе, фраза "участок-мишень" имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени, (например, РНК), которая является "мишенью", например, для расщепления, опосредуемого конструкцией миНК, которая в своей антисмысловой области содержит последовательности, комплементарные последовательности-мишени.
[0113] Как используется в настоящем документе, фраза "терапевтически эффективное количество" имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к количеству соединения или композиции, которые вызывают биологический или медицинский ответ клетки, ткани, системы, животного или человека, которого добивался исследователь, ветеринар, лечащий врач или другой клиницист. Например, если конкретное клиническое лечение рассматривают как эффективное, когда существует по меньшей мере 25% снижение измеряемого параметра, ассоциированного с заболеванием или нарушением, терапевтически эффективное количество лекарственного средства для лечения этого заболевания или нарушения представляет собой количество, необходимое для осуществления по меньшей мере 25% снижения этого параметра.
[0114] Как используется в настоящем документе, фраза "универсальное основание" имеет значение, общепринятое в данной области. Термин универсальное основание в основном относится к аналогам нуклеотидных оснований, формирующих пары оснований с каждым из природных оснований ДНК/РНК с небольшим различием или отсутствием различия между ними. Неограничивающие примеры универсальных оснований включают C-фенил, C-нафтил и другие ароматические производные, инозин, азоловые карбоксамиды и нитроазоловые производные, такие как 3-нитропиррол, 4-нитроиндол, 5-нитроиндол и 6-нитроиндол, как известно в данной области (см. например, Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447).
[0115] Как используется в настоящем документе, термин "положительная регуляция" имеет значение, общепринятое в данной области. В отношении иллюстративных молекул нуклеиновой кислоты по изобретению термин относится к увеличению экспрессии гена или уровня молекул РНК или эквивалентных молекул РНК, кодирующих один или несколько белков или белковых субъединиц, или активности одной или нескольких РНК, белков или белковых субъединиц, выше наблюдаемого в отсутствие молекул нуклеиновых кислот (например, миНК) по изобретению. В определенных вариантах положительная регуляция или стимуляция экспрессии гена молекулой миНК происходит выше уровня, наблюдаемого в присутствии неактивной или аттенуированной молекулы. В других вариантах положительная регуляция или стимуляция экспрессии гена молекулами миНК происходит выше уровня, наблюдаемого в присутствии, например, молекулы миНК с последовательностью со случайной перестановкой или с несоответствиями. В других вариантах положительная регуляция или стимуляция экспрессии гена молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению происходит на более высоком уровне, чем в ее отсутствие. В некоторых вариантах положительная регуляция или стимуляция экспрессии гена ассоциированы с ингибированием опосредованного РНК сайленсинга генов, такого как опосредованное РНКи расщепление или сайленсинг кодирующей или некодирующей РНК-мишени, которая отрицательно регулирует, ингибирует или осуществляет сайленсинг экспрессии представляющего интерес для повышающей регуляции гена. Отрицательную регуляцию экспрессии гена можно индуцировать, например, посредством кодирующей РНК или кодируемого ей белка, например, посредством отрицательной обратной связи или антагонистических эффектов. Отрицательную регуляцию экспрессии гена можно индуцировать, например, посредством некодирующей РНК, регулирующей представляющий интерес ген, например, посредством сайленсинга экспрессии гена посредством ингибирования трансляции, структуры хроматина, метилирования, опосредованного RISC расщепления РНК или ингибирования трансляции. По существу, для повышающей регуляции экспрессии представляющего интерес в отношении терапевтического применения гена можно использовать ингибирование или отрицательную регуляцию мишеней, которые отрицательно регулируют, супрессируют или подвергают сайленсингу представляющий интерес ген.
[0116] Как используется в настоящем документе, термин "вектор" имеет значение, общепринятое в данной области. Термин вектор в основном относится к любой экспрессирующей система на основе нуклеиновой кислоты и/или вируса или способу, используемому для доставки одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты.
B. Молекулы миНК по изобретению
[0117] Настоящее изобретение относится к композициям и способам, включающим миНК, направленную к HBV, которые можно использовать для лечения заболевания, например, заболевания печени или злокачественных новообразований и/или злокачественных опухолей, ассоциированных с экспрессией HBV, или других состояний, являющихся результатом инфекции вируса гепатита B. В конкретных аспектах и вариантах осуществления изобретения молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению содержат последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов последовательностей, представленных в таблице 1a и таблице 1b. МиНК можно предоставлять в нескольких формах. Например, миНК можно выделять как одно или несколько соединений миНК, или она может находиться в форме транскрипционной кассеты в плазмиде ДНК. Также миНК можно синтезировать химически, и она может содержать модификации, как в качестве неограничивающих примеров представлено в таблице 1c и таблице 8. Таким образом, в различных вариантах осуществления по меньшей мере одна цепь или область нуклеиновых кислот по изобретению содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, выбранную из группы последовательностей, состоящей из SEQ ID NO: 1-502. МиНК можно вводить отдельно или совместно вводить с другими молекулами миНК или с общепринятыми средствами, которые лечат связанное с HBV заболевание или состояние.
[0118] Молекулы миНК по изобретению можно использовать для опосредования сайленсинга генов, особенно HBV, посредством взаимодействия с транскриптами РНК или, альтернативно, посредством взаимодействия с последовательностями конкретных генов, где такое взаимодействие приводит к модуляции сайленсинга генов на уровне транскрипции или на посттранскрипционном уровне, в качестве неограничивающих примеров РНКи или посредством клеточных процессов, модулирующих структуру хроматина или профили метилирования мишени и предотвращающих транскрипцию гена-мишени, с нуклеотидной последовательностью мишени, таким образом, опосредуя сайленсинг. Более конкретно, мишень представляет собой любое из РНК HBV, ДНК или мРНК.
[0119] В одном из аспектов изобретение относится к молекулам малых интерферирующих нуклеиновых кислот (миНК) для ингибирования экспрессии гена HBV в клетке или у млекопитающего. МиНК может быть одноцепочечной или двухцепочечной. Когда она является двухцепочечной, миНК содержит смысловую и антисмысловую цепь. Антисмысловая цепь комплементарна по меньшей мере части мРНК, формирующейся при экспрессии гена HBV. Смысловая цепь содержит область, комплементарную антисмысловой цепи. В конкретных вариантах осуществления антисмысловая цепь содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов антисмысловой последовательности, приведенной в таблице 1b. Как правило, двухцепочечная миНК содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из смысловой цепи из таблицы 1b и последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из антисмысловой цепи из таблицы 1b. Один или несколько нуклеотидов миНК по изобретению необязательно являются модифицированными. В дополнительных вариантах осуществления с модификациями некоторые миНК по изобретению содержат по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из групп последовательностей, предоставленных в таблице 1c. В других вариантах осуществления миНК содержит по меньшей мере две последовательности, выбранных из группы последовательностей, предоставленных в таблице 1c, где одна по меньшей мере из двух последовательностей комплементарна другой по меньшей мере из двух последовательностей, и одна по меньшей мере из двух последовательностей комплементарна последовательности мРНК, получаемой при экспрессии гена HBV. Примеры определенных модифицированных миНК по изобретению приведены в таблице 1c.
[0120] Двухцепочечные молекулы РНК по изобретению могут содержать две различных и раздельных цепи, которые могут являться симметричными или ассиметричными и являются комплементарными, т.е., две одноцепочечные молекулы РНК, или могут содержать одну одноцепочечную молекулу, в которой две комплементарные части, например, смысловая область и антисмысловая область, спарены и ковалентно связаны одной или несколькими областями одноцепочечных "шпилек" (т.е. петель), что приводит, например, к одноцепочечному короткошпилечному полинуклеотиду или кольцевому одноцепочечному полинуклеотиду.
[0121] Линкер может представлять собой полинуклеотидный линкер или ненуклеотидный линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой ненуклеотидный линкер. В некоторых вариантах осуществления шпилечная или кольцевая молекула миНК по изобретению содержит один или несколько петлевых мотивов, где по меньшей мере один из участков петель молекулы миНК является биологически разрушаемым. Например, одноцепочечная шпилечная молекула миНК по изобретению сконструирована так, что разрушение участка петли молекулы миНК in vivo может формировать двухцепочечную молекулу миНК с 3'-концевыми выступами, такими как 3'-концевые нуклеотидные выступы, содержащие 1, 2, 3 или 4 нуклеотида. Или альтернативно, кольцевую молекула миНК по изобретению конструируют так, что разрушение участков петель молекулы миНК in vivo может формировать двухцепочечную молекула миНК с 3'-концевыми выступами, такими как 3'-концевые нуклеотидные выступы, содержащие приблизительно 2 нуклеотида.
[0122] В симметричных молекулах миНК по изобретению длина каждой цепи, смысловой (сопровождающей) цепи и антисмысловой (направляющей) цепи, независимо составляет от приблизительно 15 до приблизительно 30 (например, приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов. Как правило, длина каждой цепи симметричных молекул миНК по изобретению составляет приблизительно 19-24 (например, приблизительно 19, 20, 21, 22, 23 или 24) нуклеотидов.
[0123] В асимметричных молекулах миНК, длина антисмысловой области или цепи молекулы составляет от приблизительно 15 до приблизительно 30 (например, приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов, где длина смысловой области составляет от приблизительно 3 до приблизительно 25 (например, приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) нуклеотидов. Как правило, длина каждой цепи асимметричных молекул миНК по изобретению составляет приблизительно 19-24 (например, приблизительно 19, 20, 21, 22, 23 или 24) нуклеотидов.
[0124] В других вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению содержат одноцепочечные шпилечные молекулы миНК, где длина молекул миНК составляет от приблизительно 25 до приблизительно 70 (например, приблизительно 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70) нуклеотидов.
[0125] В других вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению содержат одноцепочечные кольцевые молекулы миНК, где длина молекул миНК составляет от приблизительно 38 до приблизительно 70 (например, приблизительно 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70) нуклеотидов.
[0126] В других вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению содержат одноцепочечные некольцевые молекулы миНК, где длина молекул миНК независимо составляет от приблизительно 15 до приблизительно 30 (например, приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов.
[0127] В различных симметричных вариантах осуществления, дуплексы миНК по изобретению независимо содержат от приблизительно 15 до приблизительно 30 (например, приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) пар оснований. Как правило, дуплексная структура миНК по изобретению составляет от 15 до 30, чаще от 18 до 25, еще чаще от 19 до 24 и наиболее часто от 19 до 21 пар оснований в длину.
[0128] В других вариантах осуществления, где дуплексные молекулы миНК по изобретению являются асимметричными, молекулы миНК содержат приблизительно от 3 до 25 (например, приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) пар оснований. Как правило, дуплексная структура миНК по изобретению составляет от 15 до 25, чаще от 18 до 25, еще чаще от 19 до 24 и наиболее часто от 19 до 21 пар оснований в длину.
[0129] В других вариантах осуществления, где молекулы миНК по изобретению являются шпилечными или кольцевыми структурами, молекулы миНК содержат от приблизительно 15 до приблизительно 30 (например, приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) пар оснований.
[0130] Смысловая цепь и антисмысловая цепь или смысловая область и антисмысловая область, молекул миНК по изобретению может быть комплементарной. Также антисмысловая цепь или антисмысловая область может быть комплементарна нуклеотидной последовательности или ее части РНК-мишени HBV. Смысловая цепь или смысловая область миНК может содержать нуклеотидную последовательность гена HBV или ее часть. В определенных вариантах осуществления смысловая область или смысловая цепь молекулы миНК по изобретению комплементарна части антисмысловой области или антисмысловой цепи молекулы миНК, которая комплементарна полинуклеотидной последовательности-мишени HBV, такой как, например, но не ограничиваясь этим, последовательности, представленные номерами доступа GenBank, показанными в таблице 7.
[0131] В некоторых вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению обладают полной комплементарностью между смысловой цепью или смысловой областью и антисмысловой цепью или антисмысловой областью молекулы миНК. В других или тех же вариантах осуществления антисмысловая цепь молекул миНК по изобретению полностью комплементарна соответствующей молекуле нуклеиновой кислоты-мишени.
[0132] В других вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению обладают частичной комплементарностью (т.е., комплементарностью менее 100%) между смысловой цепью или смысловой областью и антисмысловой цепью или антисмысловой областью молекулы миНК или между антисмысловой цепью или антисмысловой областью молекулы миНК и соответствующей молекулой нуклеиновой кислоты-мишени. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления двухцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению содержат от приблизительно 15 до приблизительно 30 (например, приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов в одной цепи, которые комплементарны нуклеотидам другой цепи. В других вариантах осуществления молекулы содержат от приблизительно 15 до приблизительно 30 (например, приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов в смысловой области, которые комплементарны нуклеотидам антисмысловой области двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах осуществления двухцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению содержат от приблизительно 15 до приблизительно 30 (например, приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов в антисмысловой цепи, комплементарных нуклеотидной последовательности соответствующей ей молекуле нуклеиновой кислоты-мишени.
[0133] В других вариантах осуществления молекула миНК может содержать одну или несколько делеций, замен, несоответствий и/или добавлений нуклеотидов; однако при условии, что молекула миНК сохраняет свою активность, например, в опосредовании РНКи. В неограничивающем примере делеция, замена, несоответствие и/или добавление могут приводить к петле или выпячиванию или, альтернативно, к неоднозначным или другим альтернативным (не уотсон-криковским) парам оснований. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, например, двухцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению в одной цепи или области содержат 1 или более (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) нуклеотидов, которые не соответствуют или не спарены с другой цепью или областью. В других вариантах осуществления двухцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению в каждой цепи или области содержат 1 или более (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) нуклеотидов, которые не соответствуют или не спарены с другой цепью или областью. В предпочтительном варианте осуществления миНК по изобретению содержат не более 3 несоответствий. Если антисмысловая цепь миНК содержит несоответствия с последовательностью-мишенью, предпочтительно, чтобы область несоответствия не располагалась в центре области комплементарности.
[0134] В других вариантах осуществления молекула миНК может содержать одну или несколько делеций, замен, несоответствий и/или добавлений нуклеотидов в последовательности, предоставленной в таблице 1b, однако эта молекула миНК сохраняет свою активность, например, для опосредования РНКи. В неограничивающем примере делеция, замена, несоответствие и/или добавление может приводить к петле или выпячиванию или, альтернативно, к неоднозначному или другому альтернативному (не уотсон-криковскому) спариванию оснований.
[0135] Изобретение также относится к молекулам двухцепочечной нуклеиновой кислоты (миНК), как описано выше другим способом в настоящем документе, в которых первая цепь и вторая цепь комплементарны друг другу, и где по меньшей мере одна цепь гибридизуется с полинуклеотидной последовательностью последовательности из таблицы 1b в условиях высокой жесткости, и где любой из нуклеотидов является немодифицированным или химически модифицированным.
[0136] Способы гибридизации хорошо известны специалисту в данной области (см. например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Предпочтительные жесткие условия гибридизации включают инкубацию в течение ночи при 42°C в растворе, содержащем: 50% формамида, 5×SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ трицитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 7,6), 5× раствор Денхардта, 10% декстрана сульфат и 20 микрограмм/мл денатурированной, фрагментированной ДНК спермы лосося; с последующей отмывкой фильтров в 0,1× SSC при приблизительно 65°C.
[0137] В одном конкретном варианте осуществления первая цепь содержит приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидам другой цепи, и по меньшей мере одна цепь гибридизуется с полинуклеотидной последовательностью из таблицы 1b. В более предпочтительном варианте осуществления первая цепь содержит приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид, которые комплементарны нуклеотидам другой цепи, и по меньшей мере одна цепь гибридизуется с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1210, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1211, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1212, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 1213 в условиях высокой жесткости, и где любой из нуклеотидов является немодифицированным или химически модифицированным.
[0138] В определенных вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению содержат выступы нуклеотидов в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 4 (например, приблизительно 1, 2, 3 или 4). Нуклеотиды в выступах могут быть одинаковыми или различными нуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления выступы находятся на 3'-конце на одной или обеих цепях двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. Например, двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать нуклеотидный или ненуклеотидный выступ на 3'-конце антисмысловой цепи/области, 3'-конце смысловой цепи/области или и на антисмысловой цепи/области, и на смысловой цепи/области двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты.
[0139] В некоторых вариантах осуществления нуклеотиды, составляющие выступающую часть молекулы миНК по изобретению, содержат последовательности на основе полинуклеотидной последовательности HBV-мишени, в которых нуклеотиды, составляющие выступающую часть антисмысловой цепи/области молекулы миНК по изобретению, могут быть комплементарны нуклеотидам в полинуклеотидной последовательности HBV-мишени, и/или нуклеотиды, составляющие выступающую часть смысловой цепи/области молекулы миНК по изобретению, могут содержать нуклеотиды из полинуклеотидной последовательности HBV-мишени. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления выступ содержит двухнуклеотидный выступ, комплементарный части полинуклеотидной последовательности HBV-мишени. Однако в других вариантах осуществления выступ содержит двухнуклеотидный выступ, некомплементарный части полинуклеотидной последовательности HBV-мишени. В определенных вариантах осуществления выступ содержит выступ 3'-UU, некомплементарный части полинуклеотидной последовательности HBV-мишени. В других вариантах осуществления выступ содержит выступ UU на 3'-конце антисмысловой цепи и выступ TT на 3'-конце смысловой цепи. В других вариантах осуществления выступ содержит нуклеотиды, как описано в примерах, таблицах и фигурах в настоящем документе.
[0140] В любом из вариантов осуществления молекул миНК, описываемых в настоящем документе, содержащих 3'-концевые нуклеотидные выступы, выступы необязательно химически модифицированы по одному или нескольким сахарам, основаниям или положениям каркаса нуклеиновой кислоты. Характерные, но неограничивающие примеры модифицированных нуклеотидов в выступающей части молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты (миНК) по изобретению включают: 2'-O-алкил- (например, 2'-O-метил-), 2'-дезокси-, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-дезокси-2'-фторарабино- (FANA), 4'-тио-, 2'-O-трифторметил-, 2'-O-этилтрифторметокси-, 2'-O-дифторметоксиэтоксинуклеотиды, универсальное основание, ациклические нуклеотиды или 5-C-метилнуклеотиды. В более предпочтительных вариантах осуществления каждый из выступающих нуклеотидов независимо представляет собой 2'-O-алкилнуклеотид, 2'-O-метилнуклеотид, a 2'-дезокси-2-фторнуклеотид или 2'-дезоксирибонуклеотид. В некоторых вариантах выступающие нуклеотиды связаны одной или несколькими фосфотиоатными связями.
[0141] В других вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению содержат дуплексные молекулы нуклеиновой кислоты с тупыми концами (т.е., без нуклеотидных выступов), где оба конца являются тупыми, или, альтернативно, где тупым является один из концов. В некоторых вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению могут содержать один тупой конец, например, где 5'-конец антисмысловой цепи и 3'-конец смысловой цепи не содержат выступающих нуклеотидов. В другом примере молекула миНК содержит один тупой конец, например, где 3'-конец антисмысловой цепи и 5'-конец смысловой цепи не содержат выступающих нуклеотидов. В других вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению содержат два тупых конца, например, где 3'-конец антисмысловой цепи и 5'-конец смысловой цепи, а также 5'-конец антисмысловой цепи и 3'-конец смысловой цепи не содержат выступающих нуклеотидов.
[0142] В любых вариантах осуществления или аспектах молекул миНК по изобретению смысловая цепь и/или антисмысловая цепь дополнительно может содержать кэп, как описано в настоящем документе или как известно в данной области, на 3'-конце, 5'-конце или и на 3'-, и на 5'-концах смысловой цепи и/или антисмысловой цепи. Или как в случае шпилечной молекулы миНК, кэп может являться одним или обоими концевыми нуклеотидами полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления кэп находится на одном или обоих концах смысловой цепи двухцепочечной молекулы миНК. В других вариантах осуществления кэп находится на 3'-конце антисмысловой (направляющей) цепи. В предпочтительных вариантах осуществления кэпы находятся на 3'-конце смысловой цепи и 5'-конце смысловой цепи.
[0143] Характерные, но неограничивающие примеры таких концевых кэпов включают инвертированный нуклеотид без основания, инвертированный дезоксинуклеотид без основания, молекулу инвертированного нуклеотида, группу, представленную на фиг.5, модификацию глицерилом, алкильную или циклоалкильную группу, гетероцикл или любой другой кэп, как широко известно в данной области.
[0144] Любой из вариантов осуществления молекул миНК по изобретению может содержать концевой 5'-фосфат. В некоторых вариантах осуществления в молекулах миНК концевые фосфаты отсутствуют.
[0145] Любая молекула или конструкция миНК по изобретению может содержать одну или несколько химических модификаций. Модификации можно использовать для улучшения характеристик in vitro или in vivo, таких как стабильность, активность, токсичность, иммунный ответ (например, предотвращать стимуляцию ответа интерферона, ответа воспалительных или провоспалительных цитокинов или ответа Toll-подобных рецепторов (TlF)) и/или биодоступность.
[0146] Заявители описывают в настоящем документе химически модифицированные молекулы миНК с улучшенной активностью и/или стабильностью РНКи по сравнению с соответствующими немодифицированными молекулами миНК. Различные химически модифицированные мотивы миНК, описываемые в настоящем документе, обеспечивают способность сохранять активность РНКи, которая в значительной степени сходна с немодифицированной или минимально модифицированной активной миРНК (см. например, Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20:6877-6888), в то же время обеспечивая устойчивость к нуклеазам и фармакокинетические свойства, пригодные для использования при терапевтическом применении.
[0147] В различных вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению содержат модификации, где любые (например, один, или несколько, или все) нуклеотиды, находящиеся в смысловой и/или антисмысловой цепи, представляют собой модифицированные нуклеотиды (например, где один нуклеотид является модифицированными, некоторые нуклеотиды (т.е., множество или более одного) являются модифицированными, или все нуклеотиды являются модифицированными нуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению являются частично модифицированными (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55 или 59 нуклеотидов являются модифицированными) посредством химических модификаций. В некоторых вариантах осуществления молекула миНК по изобретению содержит по меньшей мере приблизительно 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 или 60 нуклеотидов, которые являются модифицированными нуклеотидами. В других вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению являются полностью модифицированными (например, 100% модифицированных) посредством химических модификаций, т.е., молекула миНК не содержит ни одного рибонуклеотида. В некоторых из вариантов осуществления один или несколько нуклеотидов в смысловой цепи молекул миНК по изобретению являются модифицированными. В тех же или других вариантах осуществления модифицированными являются один или несколько нуклеотидов в антисмысловой цепи молекул миНК по изобретению.
[0148] Химические модификации в одной молекуле миНК могут быть одинаковыми или различными. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна цепь содержит по меньшей мере одну химическую модификацию. В других вариантах осуществления каждая цепь содержит не менее одной химической модификации, которые может быть одинаковыми или различными, такими как модификации сахара, основания или каркаса (т.е., межнуклеотидной связи). В других вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению содержат по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или более различных химических модификаций.
[0149] Неограничивающие примеры химических модификаций, пригодных для использования по настоящему изобретению, описаны в патентных заявках США №№ 10/444853; 10/981966; 12/064014 и в цитируемых в них ссылках и включают модификации сахаров, оснований и фосфатов, ненуклеотидные модификации и/или любое их сочетание.
[0150] В определенных конкретных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один модифицированный нуклеотид представляет собой 2'-дезокси-2-фторнуклеотид, 2'-дезоксинуклеотид, 2'-O-алкил- (например, 2'-O-метил-) нуклеотид или нуклеотид с закрытой нуклеиновой кислотой (ЗНК), как это общеизвестно в данной области.
[0151] В еще одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один нуклеотид имеет рибозоподобную, "северную" конфигурацию или конфигурацию A-форму спирали (см. например, Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984). Неограничивающие примеры нуклеотидов с северной конфигурацией включают нуклеотиды с закрытой нуклеиновой кислотой (ЗНК) (например, 2-O, 4'-C-метилен-(D-рибофуранозил)нуклеотиды); 2'-метоксиэтокси- (MOE) нуклеотиды; 2'-метилтиоэтилнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; 2'-дезокси-2'-хлорнуклеотиды; 2'-азидонуклеотиды; 2'-O-трифторметилнуклеотиды; 2'-O-этилтрифторметоксинуклеотиды; 2'-O-дифторметоксиэтоксинуклеотиды; 4'-тионуклеотиды и 2'-O-метилнуклеотиды.
[0152] В различных вариантах осуществления большинство (например, более 50%) пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в двухцепочечной молекуле миНК, содержат модификацию сахара. В некоторых из тех же и/или других вариантах осуществления большинство (например, более 50%) пуриновых нуклеотидов, присутствующих в двухцепочечной молекуле миНК, содержат модификацию сахара.
[0153] В некоторых вариантах осуществления пиримидиновые нуклеотиды в антисмысловой цепи представляют собой 2'-O-метил- или 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды, а пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой 2'-O-метилнуклеотиды или 2'-дезоксинуклеотиды. В других вариантах осуществления пиримидиновые нуклеотиды в смысловой цепи представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды, а пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи, представляют собой 2'-O-метил- или 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды.
[0154] В определенных вариантах осуществления все пиримидиновые нуклеотиды в комплементарной области на смысловой цепи представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды. В определенных вариантах осуществления все пиримидиновые нуклеотиды в комплементарной области антисмысловой цепи представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды. В определенных вариантах осуществления все пуриновые нуклеотиды в комплементарной области на смысловой цепи представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В определенных вариантах осуществления все пурины в комплементарной области на антисмысловой цепи представляют собой 2'-O-метилпуриновые нуклеотиды. В определенных вариантах осуществления все пиримидиновые нуклеотиды в комплементарных областях на смысловой цепи представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды; все пиримидиновые нуклеотиды в комплементарной области антисмысловой цепи представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды; все пуриновые нуклеотиды в комплементарной области на смысловой цепи представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды, и все пурины в комплементарной области на антисмысловой цепи представляют собой 2'-O-метилпуриновые нуклеотиды.
[0155] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 5 или более пиримидиновых нуклеотидов в одной или обеих цепях представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 5 или более пиримидиновых нуклеотидов в одной или обеих цепях представляют собой 2'-O-метилпиримидиновые нуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 5 или более пуриновых нуклеотидов в одной или обеих цепях представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпуриновые нуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 5 или более пуриновых нуклеотидов в одной или обеих цепях представляют собой 2'-O-метилпуриновые нуклеотиды.
[0156] В определенных вариантах осуществления пурины и пиримидины по 2'-положению сахара модифицированы различным образом (т.е., по меньшей мере один пурин содержит модификацию по 2'-положению сахара, отличающуюся по меньшей мере от одного пиримидина в той же или другой цепи). Например, в некоторых вариантах по меньшей мере 5 или более пиримидиновых нуклеотидов в одной или обеих цепях представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды, а по меньшей мере 5 или более пуриновых нуклеотидов в одной или обеих цепях представляют собой 2'-O-метилпуриновые нуклеотиды. В других вариантах по меньшей мере 5 или более пиримидиновых нуклеотидов в одной или обеих цепях представляют собой 2'-O-метилпиримидиновые нуклеотиды, а по меньшей мере 5 или более пуриновых нуклеотидов в одной или обеих цепях представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпуриновые нуклеотиды.
[0157] Кроме того, неограничивающие примеры смысловых и антисмысловых цепей таких молекул миНК с различными модификациями и профилями модификаций представлены на фигурах 2 и 3.
[0158] В любой из молекул миНК по изобретению можно применять любые из описанных выше модификаций, или их сочетания, включая модификации или их сочетания в цитируемых ссылках.
[0159] Модифицированные молекулы миНК по изобретению могут содержать модификации в любых положениях молекулы миНК. В некоторых вариантах осуществления двухцепочечная молекула миНК по изобретению содержит модифицированные нуклеотиды по внутренним спаренным положениям в дуплексе миНК. В других вариантах осуществления двухцепочечная молекула миНК по изобретению содержит модифицированные нуклеотиды в неспаренных или выступающих областях молекулы миНК. В других вариантах осуществления двухцепочечная молекула миНК по изобретению содержит модифицированные нуклеотиды в концевых положениях молекулы миНК. Например, такие концевые области включают 3'-положение и/или 5'-положение смысловой и/или антисмысловой цепи или области молекулы миНК. Кроме того, любые модифицированные молекулы миНК по изобретению могут содержать модификацию в одной или обеих олигонуклеотидных цепях дуплекса миНК, например, в смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепях. Кроме того, в отношении химических модификаций молекул миНК по изобретению, каждая цепь двухцепочечных молекул миНК по изобретению может содержать одну или несколько химических модификаций так, что каждая цепь содержит отличающийся профиль химических модификаций.
[0160] В определенных вариантах осуществления каждая цепь двухцепочечной молекулы миНК по изобретению содержит отличающийся профиль химических модификаций, таких как любые модифицированные химические структуры "Стаб.", описываемые в настоящем документе (см. таблицу 8) или любое их сочетание, т.е., различные комбинации определенных смысловых и антисмысловых цепей со стабилизированными химическими структурами (Стаб.). Кроме того, в таблице 8 представлены неограничивающие примеры схем модификаций, которые могут приводить к различным профилям модификаций. Стабилизированные химические структуры, приведенные в таблице 8 как Стаб., можно комбинировать в любой комбинации смысловой/антисмысловой химических структур, таких как Стаб. 7/8, Стаб. 7/11, Стаб. 8/8, Стаб. 18/8, Стаб. 18/11, Стаб. 12/13, Стаб. 7/13, Стаб. 18/13, Стаб. 7/19, Стаб. 8/19, Стаб. 18/19, Стаб. 7/20, Стаб. 8/20, Стаб. 18/20, Стаб. 7/32, Стаб. 8/32 или Стаб. 18/32 или любой другой комбинации стабилизированных химических структур.
[0161] В любой миНК по изобретению один или несколько (например, 1, 2, 3, 4 или 5) нуклеотидов на 5'-конце направляющей цепи или направляющей области (также известной как антисмысловая цепь или антисмысловая область) молекулы миНК являются рибонуклеотидами.
[0162] В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК), модулирующей экспрессию HBV, где миНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь; длина каждой цепь независимо представляет собой от 15 до 30 нуклеотидов; и антисмысловая цепь содержит последовательность, содержащую по меньшей мере 15 нуклеотидов, комплементарную любой из:
5'-UCGUGGUGGACUUCUCUCA-3' (SEQ ID NO: 1);
5'-GU GGUGGACUUCUCUCAAU-3' (SEQ ID NO: 2);
5'-GCCGAUCCAUACUGCGGAA-3' (SEQ ID NO: 3); или
5'-CCGAUCCAUACUGCGGAAC-3' (SEQ ID NO: 4).
[0163] В некоторых вариантах осуществления антисмысловая цепь молекулы миНК по изобретению содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из:
5'-UGAGAGAAGUCCACCACGA-3' (SEQ ID NO: 452);
5'-AUUGAGAGAAGUCCACCAC-3' (SEQ ID NO: 453);
5'-UUCCGCAGUAUGGAUCGGC-3' (SEQ ID NO: 454); или
5'-GUUCCGCAGUAUGGAUCGG-3' (SEQ ID NO: 455).
[0164] В некоторых вариантах осуществления смысловая цепь молекулы миНК по изобретению содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из:
5'-UCGUGGUGGACUUCUCUCA-3' (SEQ ID NO: 1);
5'-GUGGUGGACUUCUCUCAAU-3' (SEQ ID NO: 2);
5'-GCCGAUCCAUACUGCGGAA-3' (SEQ ID NO: 3); или
5'-CCGAUCCAUACUGCGGAAC-3' (SEQ ID NO: 4).
[0165] В некоторых вариантах осуществления молекула миНК по изобретению содержит любую из:
5'-UCGUGGUGGACUUCUCUCA-3' (SEQ ID NO: 1) и 5'-UGAGAGAAGUCCACCACGA-3' (SEQ ID NO: 452); или
5'-GUGGUGGACUUCUCUCAAU-3' (SEQ ID NO: 2) и 5'-AUUGAGAGAAGUCCACCAC-3' (SEQ ID NO: 453); или
5'-GCCGAUCCAUACUGCGGAA-3' (SEQ ID NO: 3) и 5'-UUCCGCAGUAUGGAUCGGC-3' (SEQ ID NO: 454); или
5'-CCGAUCCAUACUGCGGAAC-3' (SEQ ID NO: 4); и 5'-GUUCCGCAGUAUGGAUCGG-3' (SEQ ID NO: 455).
[0166] В любом из этих вариантов осуществления можно использовать любую из описанных выше модификаций или их сочетаний, включая модификации или их сочетания в цитируемых ссылках.
[0167] В определенных вариантах осуществления нуклеотиды последовательности по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO:455 формируют непрерывный участок нуклеотидов.
[0168] В некоторых вариантах осуществления молекула миНК может содержать одно или несколько из делеций, замен, несоответствий и/или добавлений нуклеотидов в последовательности по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO:455; однако при условии, что молекула миНК сохраняет свою активность, например, в опосредовании РНКи. В неограничивающем примере, делеция, замена, несоответствие и/или добавление могут приводить к петле или выпячиванию или, альтернативно, к неоднозначным или другим альтернативным (не уотсон-криковским) парам оснований.
[0169] В определенных вариантах осуществления предоставлены двухцепочечные молекулы миНК, где молекула содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь и составляет следующую формулу (A):
где верхняя цепь представляет собой смысловую цепь, а нижняя цепь представляет собой антисмысловую цепь двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты; где антисмысловая цепь содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 454 или SEQ ID NO: 455, и смысловая цепь содержит последовательность, комплементарную антисмысловой цепи;
каждый N независимо представляет собой нуклеотид, являющийся немодифицированным или химически модифицированным или не являющийся нуклеотидом;
каждый B представляет собой концевой кэп, который присутствует или отсутствует;
(N) представляет собой выступающие нуклеотиды, каждый из которых независимо является немодифицированным или химически модифицированным;
[N] представляет собой нуклеотиды, которые являются рибонуклеотидами;
X1 и X2 независимо представляют собой целые числа от 0 до 4;
X3 представляет собой целое число от 15 до 30;
X4 представляет собой целое число от 9 до 30; и
X5 представляет собой целое число от 0 до 6, при условии, что сумма X4 и X5 составляет 15-30.
[0170] В определенных вариантах осуществления нуклеотиды последовательности по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 454 или SEQ ID NO: 455 формируют непрерывный участок нуклеотидов.
[0171] В некоторых вариантах осуществления молекула миНК формулы A может содержать одну или несколько делеций, замен, несоответствий и/или добавлений нуклеотидов в последовательности по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 454 или SEQ ID NO: 455; однако при условии, что молекула миНК сохраняет свою активность, например, в опосредовании РНКи. В неограничивающем примере делеция, замена, несоответствие и/или добавление могут приводить к петле или выпячиванию или, альтернативно, к неоднозначной или другой альтернативной (не уотсон-криковской) паре оснований.
[0172] В одном из вариантов осуществления изобретение относится к двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоте (миНК) формулы (A); где
(a) один или несколько пиримидиновых нуклеотидов в положениях NX4 независимо представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-O-алкилнуклеотиды, 2'-дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или любое их сочетание;
(b) один или несколько пуриновых нуклеотидов в положениях NX4 независимо представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-O-алкилнуклеотиды, 2'-дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или любое их сочетание;
(c) один или несколько пиримидиновых нуклеотидов в положениях NX3 независимо представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-O-алкилнуклеотиды, 2'-дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или любое их сочетание; и
(d) один или несколько пуриновых нуклеотидов в положениях NX3 независимо представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-O-алкилнуклеотиды, 2'-дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или любое их сочетание.
[0173] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к молекуле двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК) формулы (A); где
(a) 1, 2, 3, 4, 5 или более пиримидиновых нуклеотидов в положениях NX4 представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды;
(b) 1, 2, 3, 4, 5 или более пуриновых нуклеотидов в положениях NX4 представляют собой 2'-O-алкилнуклеотиды;
(c) 1, 2, 3, 4, 5 или более пиримидиновых нуклеотидов в положениях NX3 представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; и
(d) 1, 2, 3, 4, 5 или более пуриновых нуклеотидов в положениях NX3 представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды.
[0174] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к молекуле двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК) формулы (A); где
(a) 1, 2, 3, 4, 5 или более пиримидиновых нуклеотидов в положениях NX4 представляют собой 2'-O-алкилнуклеотиды;
(b) 1, 2, 3, 4, 5 или более пуриновых нуклеотидов в положениях NX4 представляют собой рибонуклеотиды;
(c) 1, 2, 3, 4, 5 или более пиримидиновых нуклеотидов в положениях NX3 представляют собой 2'-O-алкилнуклеотиды; и
(d) 1, 2, 3, 4, 5 или более пуриновых нуклеотидов в положениях NX3 представляют собой рибонуклеотиды.
[0175] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к молекуле двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК) формулы (A); где
(a) 1, 2, 3, 4, 5 или более пиримидиновых нуклеотидов в положениях NX4 представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды;
(b) 1, 2, 3, 4, 5 или более пуриновых нуклеотидов в положениях NX4 представляют собой 2'-O-алкилнуклеотиды;
(c) 1, 2, 3, 4, 5 или более пиримидиновых нуклеотидов в положениях NX3 представляют собой 2'-O-алкилнуклеотиды; и
(d) 1, 2, 3, 4, 5 или более пуриновых нуклеотидов в положениях NX3 представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды.
[0176] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к молекуле двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК) формулы (A), дополнительно содержащей одну или несколько тиофосфатных межнуклеотидных связей.
[0177] В некоторых вариантах осуществления молекулы миНК формулы A содержат концевую фосфатную группу на 5'-конце антисмысловой цепи или антисмысловой области молекулы нуклеиновой кислоты.
[0178] В различных вариантах осуществления молекулы миНК формулы A включают X5 = 0, 1, 2 или 3; каждый X1 и X2 = 1 или 2; X3 = 18, 19, 20, 21, 22 или 23, и X4 = 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23.
[0179] В определенных вариантах осуществления молекулы миНК формулы A включают X5=3. В других вариантах осуществления молекулы миНК формулы A включают X5=0.
[0180] В определенных вариантах осуществления молекулы миНК формулы A включают X1=2 и X2=2.
[0181] В различных вариантах осуществления молекулы миНК формулы A включают X5=0, X1=2 и X2=2. В других вариантах осуществления молекулы миНК формулы A включают X5=3, X1=2 и X2=2.
[0182] В одном конкретном варианте осуществления молекула миНК формулы A включает X5=3; каждый X1 и X2=2; X3=19 и X4=16.
[0183] В другом конкретном варианте осуществления молекула миНК формулы A включает X5=0; каждый X1 и X2=2; X3=19 и X4=19.
[0184] В определенных вариантах осуществления молекулы миНК формулы A содержат кэпы (B) на 3'- и 5'-концах смысловой цепи или смысловой области.
[0185] В определенных вариантах осуществления молекулы миНК формулы A содержат кэпы (B) на 3'-конце антисмысловой цепи или антисмысловой области.
[0186] В различных вариантах осуществления молекулы миНК формулы A содержат кэпы (B) на 3'- и 5'-концах смысловой цепи или смысловой области и кэпы (B) на 3'-конце антисмысловой цепи или антисмысловой области.
[0187] В других вариантах осуществления молекулы миНК формулы A содержат кэпы (B) только на 5'-конце смысловой (верхней) цепи двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты.
[0188] В некоторых вариантах осуществления молекулы миНК формулы A дополнительно содержат одну или несколько фосфотиоатных межнуклеотидных связей между нуклеотидами. В определенных вариантах осуществления молекулы миНК формулы A содержат одну или несколько фосфотиоатных межнуклеотидных связей между первым концевым (N) и прилежащим нуклеотидом на 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи либо и смысловой цепи, и антисмысловой цепи молекулы нуклеиновой кислоты. Например, двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты может включать X1 и/или X2=2 с выступающими нуклеотидными положениями с фосфотиоатной межнуклеотидной связью, например, (NsN), где "s" означает фосфотиоат.
[0189] В некоторых вариантах осуществления один или несколько из нуклеотидов молекул миНК формулы A содержат универсальное основание.
[0190] В определенных вариантах осуществления молекулы миНК формулы A, когда нуклеотид в положении 14 представляет собой пурин, содержат в положении 14 от 5'-конца антисмысловой цепи рибонуклеотид. В других вариантах осуществления молекулы миНК формулы A, когда нуклеотид в положении 14 представляет собой пиримидиновый нуклеотид, содержат в положении 14 от 5'-конца антисмысловой цепи рибонуклеотид, 2'-дезокси-2'-фторнуклеотид или 2'-O-метилнуклеотид.
[0191] В некоторых вариантах осуществления молекулы миНК формулы A содержат нуклеотиды (N) в антисмысловой цепи (нижней цепи), которые комплементарны нуклеотидам в полинуклеотидной последовательности HBV-мишени, которая также обладает комплементарностью с нуклеотидами N и [N] антисмысловой (нижней) цепи.
[0192] Любые из описанных выше модификаций или их сочетаний, обсуждаемых выше, как применяют к миНК по изобретению, включая модификации или их сочетания в цитируемых ссылках, можно применять в любых вариантах осуществления молекул миНК формулы A.
C. Получение/синтез молекул миНК
[0193] МиНК по изобретению можно получать рядом способов, известных специалистам в данной области. Например, миНК можно синтезировать химически или можно кодировать посредством плазмиды (например, они могут транскрибироваться в виде последовательностей, которые автоматически сворачиваются в дуплексы с петлями шпилек). Также миНК можно получать посредством расщепления более длинной дцРНК (например, дцРНК с длиной, большей, чем приблизительно 25 нуклеотидов) посредством РНКазы II или Dicer E coli. Эти ферменты процессируют дцРНК в биологически активную миНК (см., например, Yang et al., PNAS USA 99:9942-9947 (2002); Calegari et al. PNAS USA 99:14236 (2002) Byron et al. Ambion Tech Notes; 10 (l):4-6 (2009); Kawaski et al., Nucleic Acids Res., 31:981-987 (2003), Knight and Bass, Science, 293:2269-2271 (2001) и Roberston et al., J. Biol. Chem 243:82(1969).
1. Химический синтез
[0194] Предпочтительно, миНК по изобретению синтезируют химически. Олигонуклеотиды (например, определенные модифицированные олигонуклеотиды или части олигонуклеотидов, где отсутствуют рибонуклеотиды) синтезируют с использованием известных в данной области протоколов, например, как описано в Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19, Thompson et al., публикация международной PCT № WO 99/54459, Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684, Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45 и Brennan, патент США № 6001311. В синтезе олигонуклеотидов используют широко известные защитные группы нуклеиновых кислот и связывающие нуклеиновые кислоты группы, такие как диметокситритил на 5'-конце и фосфорамидиты на 3'-конце.
[0195] Молекулы миНК без модификации синтезируют способами, как описано в Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433. В этих способах синтеза используют широко известные защитные группы нуклеиновых кислот и связывающие нуклеиновые кислоты группы, такие как диметокситритил на 5'-конце и фосфорамидиты на 3'-конце, которые можно использовать для определенных молекул миНК по изобретению.
[0196] В определенных вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению синтезируют, снимают с них защиту и анализируют способами, описанными в патентах США №№ 6995259, 6686463, 6673918, 6649751, 6989442 и в патентной заявке США № 10/190359.
[0197] В неограничивающем примере синтеза маломасштабные способы синтеза проводят на синтезаторе 394 Applied Biosystems, Inc. с использованием протокола в масштабе 0,2 мкмоль c этапом связывания для 2'-O-метилированных нуклеотидов 2,5 мин и этапом связывания для 2'-дезоксинуклеотидов или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотидов 45 секунд. В таблице 9 приведены количества и времена контакта реагентов, используемых в цикле синтеза.
[0198] Альтернативно, молекулы миНК по настоящему изобретению можно синтезировать раздельно и связывать вместе после синтеза, например, посредством лигирования (Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., публикация международной PCT № WO 93/23569; Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204) или посредством гибридизации после синтеза и/или снятия защиты.
[0199] Различные молекулы миНК по изобретению также можно синтезировать способами из Scaringe et al., патенты США №№ 5889136; 6008400 и 6111086.
2. Экспрессия в векторах
[0200] Альтернативно, молекулы миНК по изобретению, которые взаимодействуют с кодирующими гены молекулами HBV-мишени и отрицательно регулируют их, можно экспрессировать и доставлять из единиц транскрипции (см. например, Couture et al., 1996, TIG., 12, 510), встроенных в ДНК- или РНК-содержащие векторы. Рекомбинантные векторы могут представлять собой плазмиды ДНК или вирусные векторы. Экспрессирующие миНК вирусные векторы можно конструировать на основе, но не ограничиваясь ими, аденоассоциированного вируса, ретровируса, аденовируса или альфавируса.
[0201] В некоторых вариантах осуществления для экспрессии молекул нуклеиновой кислоты по изобретению используют конструкции на основе pol III. Транскрипция последовательностей молекул миНК может находиться под контролем промотора эукариотических РНК-полимеразы I (pol I), РНК-полимеразы II (pol II) или РНК-полимеразы III (pol III), (см. например, Thompson, патенты США №№ 5902880 и 6146886). (Также см. Izant and Weintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry and Lindquist, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 399; Scanlon et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5; Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic et al., 1992, J. Virol., 66, 1432-41; Weerasinghe et al., 1991, J. Virol., 65, 5531-4; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Sarver et al., 1990 Science, 247, 1222-1225; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Good et al., 1997, Gene Therapy, 4, 45. Транскрипты с промоторов pol II или pol III экспрессируются на высоких уровнях во всех клетках; уровни данного промотора pol II в данном типе клеток зависят от характера расположенных рядом генных регуляторных последовательностей (энхансеров, сайленсеров и т.д.). Также используют промоторы прокариотических РНК-полимераз, при условии, что в соответствующих клетках экспрессируется фермент прокариотической РНК-полимеразы (Elroy-Stein and Moss, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6743-7; Gao and Huang 1993, Nucleic Acids Res., 21, 2867-72; Lieber et al., 1993, Methods Enzymol., 217, 47-66; Zhou et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4529-37). Некоторые исследователи продемонстрировали, что молекулы нуклеиновой кислоты, экспрессируемые с таких промоторов, могут функционировать в клетках млекопитающих (например, Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Yu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6340-4; L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 11, 4411-8; Lisziewicz et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 90, 8000-4; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Sullenger & Cech, 1993, Science, 262, 1566). Более конкретно, для получения в клетках высоких концентраций желаемых молекул РНК, таких как миНК, пригодны единицы транскрипции, такие как единицы транскрипции, происходящие из генов, кодирующих малую ядерную РНК (мяРНК) U6, транспортную РНК (тРНК) и РНК аденовируса VA (Thompson et al., выше; Couture and Stinchcomb, 1996, выше; Noonberg et al., 1994, Nucleic Acids Res., 22, 2830; Noonberg et al., патент США № 5624803; Good et al., 1997, Gene Ther., 4, 45; Beigelman et al., публикация международной PCT № WO 96/18736. Указанные выше единицы транскрипции миНК для введения в клетки млекопитающих можно встраивать во множество векторов, включая, но не ограничиваясь ими, плазмидные ДНК-содержащие векторы, вирусные ДНК-содержащие векторы (такие как аденовирусные векторы или векторы на основе аденоассоциированного вируса) или вирусные РНК-содержащие векторы (такие как ретровирусные или альфавирусные векторы) (для обзора см. Couture and Stinchcomb, 1996, выше).
[0202] Векторы, используемые для экспрессии молекул миНК по изобретению, могут кодировать одну или обе цепи дуплекса миНК или одну самокомплементарную цепь, которая гибридизуется в дуплекс миНК сама с собой. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие молекулы миНК по настоящему изобретению, могут быть функционально связанными так, чтобы обеспечивать экспрессию молекулы миНК (см. например, Paul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; и Novina et al., 2002, Nature Medicine, предварительная онлайн-публикация, doi:10,1038/nm725).
D. Системы носителей/доставки
[0203] Молекулы миНК по изобретению добавляют непосредственно или они могут образовывать комплексы с катионными липидами, их можно упаковывать в липосомы, или они могут находиться в виде рекомбинантных плазмидных или вирусных векторов, экспрессирующих молекулы миНК, или их можно иным образом доставлять в клетки-мишени или ткани. Способы доставки молекул нуклеиновых кислот описаны в Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol., 16, 129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; и Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192. В Beigelman et al., патент США № 6395713 и Sullivan et al., PCT WO 94/02595 дополнительно описаны общие способы доставки молекул нуклеиновых кислот. Эти протоколы можно использовать для доставки практически любой молекулы нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновой кислоты можно вводить в клетки множеством способов, известных специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, инкапсуляцию в липосомах, посредством ионтофореза или посредством встраивания в другие носители, такие как биологически разрушаемые полимеры, гидрогели, циклодекстрины (см. например, Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; Wang et al., публикации международных PCT №№ WO 03/47518 и WO 03/46185), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA) и микросферы PLCA (см. например, патент США 6447796 и публикацию патентной заявки США № US 2002130430), биологически разрушаемые нанокапсулы и биоадгезивные микросферы, или посредством белковоподобных векторов (O'Hare and Normand, публикация международной PCT № WO 00/53722).
[0204] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к системам носителей, содержащим молекулы миНК, описываемые в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления система носителей представляет собой систему носителей на основе липидов, катионного липида или комплексов липосома-нуклеиновая кислота, липосому, мицеллу, виросому, липидную наночастицу или их смесь. В других вариантах осуществления система носителей представляет собой систему носителей на основе полимеров, такую как комплекс катионный полимер-нуклеиновая кислота. В дополнительных вариантах осуществления система носителей представляет собой систему носителей на основе циклодекстринов, такую как комплекс циклодекстриновый полимер-нуклеиновая кислота. В дополнительных вариантах осуществления система носителей представляет собой систему носителей на основе белков, такую как комплекс катионный пептид-нуклеиновая кислота. Предпочтительно, система носителей представляет собой состав липидной наночастицы ("LNP").
[0205] В определенных вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению формулируют с композицией липидных наночастиц, как описано в патентных заявках США №№ 11/353630, 11/586102, 61/189295, 61/204878, 61/235476, 61/249807, 61/298022, 61/351373, 61/347640, 61/345754, 61/322054, 12/640342 и 12/617079, и заявках PCT №№ PCT/US10/020013 и PCT/US09/053336. В определенных вариантах осуществления миНК формулируют с компонентами, и соотношения описаны и проиллюстрированы в примере 6 в настоящем документе (также см. таблицы 10 и 11).
[0206] В различных вариантах осуществления составы липидных наночастиц, описанные в таблице 10, применяют для любой молекулы миНК или комбинации молекул миНК по настоящему документу. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к композициям, содержащим молекулы миНК по изобретению, формулируемым в виде композиции, содержащий любые номера соединений катионных липидов 1-46 или их сочетание.
[0207] В других определенных вариантах осуществления изобретение относится к композициям, содержащим молекулы миНК по изобретению, формулируемым с любыми составами катионных липидов, описанными в патентных заявках США №№ 61/189295, 61/204878, 61/235476, 61/249807 и 61/298022.
[0208] В других вариантах осуществления изобретение относится к конъюгатам и/или комплексам молекул миНК по изобретению. Такие конъюгаты и/или комплексы можно использовать для облегчения доставки молекул миНК в биологическую систему, такую как клетка. Конъюгаты и комплексы, предоставляемые по настоящему изобретению, могут обеспечивать терапевтическую активность, перенося терапевтические соединения через клеточные мембраны, изменяя фармакокинетику и/или изменяя локализацию молекул нуклеиновых кислот по изобретению. Неограничивающие примеры таких конъюгатов описаны в публикациях США №№ US2008/0152661 A1 и US 2004/0162260 A1 (например, CDM-LBA, CDM-Pip-LBA, CDM-PEG, CDM-NAG и т.д.) и в патентных заявках США №№ 10/427160, 10/201394, 61/322422 и 61/315223; и в патентах США №№ 6528631; 6335434; 6235886; 6153737; 5214136 и 5138045.
[0209] В различных вариантах осуществления к соединениям миНК по настоящему изобретению можно ковалентно присоединять полиэтиленгликоль (PEG). Присоединенный PEG может быть любой молекулярной массы, предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 50000 Дальтон (Да).
[0210] В других вариантах осуществления изобретение относится к композициям или составам, содержащим липосомы с модифицированными поверхностями, содержащими поли(этиленгликолевые) липиды (модифицированные PEG или длительно циркулирующие липосомы или липосомы-невидимки) и молекулы миНК по изобретению, как описано, например, в публикации международной PCT № WO 96/10391; Ansell et al., публикации международной PCT № WO 96/10390; Holland et al., публикации международной PCT № WO 96/10392.
[0211] В некоторых вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению также можно формулировать или формировать в комплексы с полиэтиленимином и его производными, такими как производные полиэтилениминполиэтиленгликоль-N-ацетилгалактозамин (PEI-PEG-GAL) или полиэтилениминполиэтиленгликоль-три-N-ацетилгалактозамин (PEI-PEG-triGAL). В одном из вариантов осуществления молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению формулируют, как описано в публикации патентной заявки США № 20030077829.
[0212] В других вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению формируют в комплексы с разрушающими мембраны средствами, такими как разрушающие мембраны средства, описанные в публикации патентной заявки США № 20010007666. В других вариантах осуществления разрушающие мембраны средство или средства и молекулу миНК также формируют в комплексы с катионным липидом или вспомогательной липидной молекулой, такой как липиды, описанные в патенте США № 6235310.
[0213] В определенных вариантах осуществления молекулы миНК по изобретению формируют в комплексы с системами доставки, как описано в публикациях патентных заявок США №№ 2003077829; 20050287551; 20050164220; 20050191627; 20050118594; 20050153919; 20050085486 и 20030158133 и публикациях международных PCT №№ WO 00/03683 и WO 02/087541.
[0214] В некоторых вариантах осуществления липосомный состав по изобретению содержит молекулу миНК по изобретению (например, миНК), сформулированную или сформированную в комплекс с соединениями и композициями, описанными в патентах США №№ 6858224; 6534484; 6287591; 6835395; 6586410; 6858225; 6815432; 6586001; 6120798; 6977223; 6998115; 5981501; 5976567; 5705385 и в публикациях патентных заявок США №№ 2006/0019912; 2006/0019258; 2006/0008909; 2005/0255153; 2005/0079212; 2005/0008689; 2003/0077829, 2005/0064595, 2005/0175682, 2005/0118253; 2004/0071654; 2005/0244504; 2005/0265961 и 2003/0077829.
[0215] Альтернативно, для доставки молекул по изобретению можно использовать рекомбинантные плазмиды и вирусные векторы, как указано выше, экспрессирующие миНК по изобретению. Доставка экспрессирующих молекулы миНК векторов может являться системной, такой как посредством внутривенного или внутримышечного введения, посредством введения в клетки-мишени, эксплантированные у индивидуума, с последующим обратным введением индивидууму или посредством любых других средств, которые могут обеспечить введение в желаемую клетку-мишень (для обзора см. Couture et al., 1996, TIG., 12, 510). Такие рекомбинантные плазмиды также можно вводить непосредственно или в сочетании с подходящими реагентами для доставки, включая, например, липофильный реагент Mirus Transit LT1; липофектин; липофектамин; целфектин; поликатионы (например, полилизин) или липосомную систему носителей на основе липидов, катионный липид или комплексы липосома-нуклеиновая кислота, мицеллу, виросому, липидную наночастицу.
E. Наборы
[0216] Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам в форме набора. Набор может содержать контейнер. Как правило, набор содержит нуклеиновую кислоту по изобретению с инструкциями по ее введению. В определенных вариантах нуклеиновые кислоты могут содержать присоединенные направляющие молекулы. Способы присоединения направляющих молекул (например, антител, белков) известны специалистам в данной области. В определенных вариантах нуклеиновые кислоты являются химически модифицированными. В других вариантах осуществления набор содержит более одной молекулы миНК по изобретению. Наборы могут содержать молекулу миНК по изобретению с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Наборы могут дополнительно содержать эксципиенты.
F. Терапевтическое применение/фармацевтические композиции
[0217] Современная совокупность знаний в исследовании HBV свидетельствует о необходимости способов анализа активности HBV и в соединениях, которые могут регулировать экспрессию HBV, для исследовательского, диагностического и терапевтического применения. Как описано ниже, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно использовать в анализах для диагностики болезненного состояния, связанного с уровнями HBV. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты и фармацевтические композиции можно использовать для лечения болезненных состояний, связанных с уровнями РНК HBV.
1. Болезненные состояния, связанные с HBV
[0218] Конкретные болезненные состояния, которые могут быть связаны с модуляцией экспрессии HBV, включают заболевания и злокачественную опухоль печени. Неограничивающие примеры таких заболеваний включают цирроз печени и гепатоклеточную карциному.
[0219] Следует понимать, что молекулы миНК по изобретению могут разрушать мРНК-мишень HBV (и таким образом подавлять указанные выше заболевания). Подавление заболевания можно оценивать, непосредственно измеряя развитие заболевания у индивидуума. Заключения также можно делать, наблюдая изменения или купирование состояния, связанного с заболеванием. Кроме того, молекулы миНК по изобретению можно использовать в качестве профилактических средств. Таким образом, использование молекул нуклеиновых кислот и фармацевтических композиций по изобретению можно использовать для улучшения состояния, лечения, предотвращения и/или излечения этих и других заболеваний, связанных с регуляцией экспрессии генов HBV.
2. Фармацевтические композиции
[0220] Молекулы миНК по настоящему изобретению обеспечивают пригодные реагенты и способы для множества из терапевтических, профилактических, косметических, ветеринарных, диагностических применений, применений для подтверждения мишени, геномного поиска, генетической инженерии и фармакогеномных применений.
a. Составы
[0221] Таким образом, настоящее изобретение в одном из аспектов также относится к фармацевтическим композициям описанных молекул миНК, т.е., к композициям в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. Эти фармацевтические композиции включают соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров указанных выше соединений, например, соли присоединения кислот, например, соли соляной, бромистоводородной, йодистоводородной, уксусной кислоты и бензолсульфоновой кислоты. Другие соли включают, например, натриевые, калиевые, марганцевые, аммонийные и кальциевые соли. Эти составы или композиции могут содержать фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, как это общеизвестно в данной области.
[0222] В одном из вариантов осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу миНК, содержащую последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу миНК, содержащую последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 452. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу миНК, содержащую последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу миНК, содержащую последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 453. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу миНК, содержащую последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу миНК, содержащую последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 454. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу миНК, содержащую последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 4. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу миНК, содержащую последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 455. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу миНК формулы (A).
[0223] Молекулы миНК по изобретению до введения индивидууму предпочтительно формулируют в виде фармацевтических композиций известными в данной области способами. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению характеризуют, как являющиеся по меньшей мере стерильными и не содержащими пирогенов. Способы получения фармацевтических композиций по изобретению известны специалистам в данной области, например, как описано в Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985).
[0224] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции по изобретению (например, миНК и/или их составы LNP) дополнительно содержат общепринятые фармацевтические эксципиенты и/или добавки. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают консерванты, ароматизаторы, стабилизаторы, антиоксиданты, средства регуляции осмоляльности, буферы и средства регуляции pH. Подходящие добавки включают физиологически биологически совместимые буферы (например, гидрохлорид триметиламина), добавление хелатирующих средств (таких как, например, DTPA или DTPA-бисамид) или хелатные кальциевые комплексы (как например, кальций DTPA, CaNaDTPA-бисамид) или, необязательно, добавления кальциевых или натриевых солей (например, хлорида кальция, аскорбата кальция, глюконата кальция или лактата кальция). Кроме того, можно использовать антиоксиданты и суспендирующие средства.
[0225] Неограничивающие примеры различных типов составов для локального введения включают мази, лосьоны, кремы, гели, пены, препараты для доставки посредством трансдермальных пластырей, порошки, спреи, аэрозоли, капсулы или картриджи для применения в ингаляторе или инсуффляторе или капли (например, глазные капли или капли для носа), растворы/суспензии для распыления, суппозитории, пессарии, удерживающие клизмы и жевательные или сосательные таблетки или гранулы (например, для лечения афтозных язв) или липосомные или микрокапсулированные препараты.
[0226] Мази, кремы и гели можно формулировать, например, с водной или масляной основой с добавлением подходящего загустителя и/или гелеобразующего средства и/или растворителей. Таким образом, неограничивающие примеры таких основ могут включать, например, воду и/или масло, такое как парафиновое масло или растительное масло, такое как арахисовое масло или касторовое масло, или растворитель, такой как полиэтиленгликоль. В зависимости от характера основания можно использовать различные загустители и гелеобразующие средства. Неограничивающие примеры таких средств включают мягкий парафин, стеарат алюминия, цетостеариловый спирт, полиэтиленгликоли, ланолин, пчелиный воск, карбоксиполиметилен и производные целлюлозы и/или глицерилмоностеарат и/или неионные эмульгаторы.
[0227] В одном из вариантов осуществления лосьоны можно формулировать с водной или масляной основой, и они в основном также содержат один или несколько эмульгаторов, стабилизаторов, диспергирующих средств, суспендирующих средств или загустителей.
[0228] В одном из вариантов осуществления порошки для наружного применения можно получать с помощью любой подходящей порошковой основы, например, талька, лактозы или крахмала. Капли можно формулировать с водной или неводной основой, также содержащей одно или несколько диспергирующих средств, солюбилизаторов, суспендирующих средств или консервантов.
[0229] Композиции, предназначенные для перорального применения, можно получать любым способом, известным в области получения фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать один или несколько таких подсластителей, ароматизаторов, красителей или консервантов для обеспечения фармацевтически превосходных и приятных на вкус препаратов. Таблетки содержат активный ингредиент в смеси с нетоксическими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, подходящими для получения таблеток. Эти эксципиенты могут представлять собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие средства, например, кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связывающие средства, например, крахмал, желатин или гуммиарабик; и смазывающие средства, например, стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть непокрытыми или их можно покрывать известными способами. В некоторых вариантах такие покрытия можно известными способами получать для задержки дезинтеграции и всасывания в желудочно-кишечном тракте, и, таким образом, обеспечивая длительное действие в течение более длительного периода. Например, можно применять вещество для временной задержки, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.
[0230] Составы для перорального применения также можно предоставлять в виде твердых желатиновых капсул, где активный ингредиент смешивают с твердым инертным разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешивают с водой или с масляной средой, например, арахисовым маслом, парафиновым маслом или оливковым маслом.
[0231] Водные суспензии содержат активные вещества в смеси с эксципиентами, подходящими для получения водных суспензий. Такие эксципиенты представляют собой суспендирующие средства, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь и гуммиарабик; диспергирующие средства или средства для смачивания могут представлять собой природный фосфолипид, например, лецитин или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, полиоксиэтиленстеарат; или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, гептадекаэтиленоксицетанолом, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, получаемыми из жирных кислот и гексита, такие как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, получаемыми из жирных кислот и ангидридами гексита, например, полиэтиленсорбитанмоноолеат. Водные суспензии также могут содержать один или несколько консервантов, например, этил- или н-пропил-п-гидроксибензоат, один или несколько красителей, один или несколько ароматизаторов и один или несколько подсластителей, таких как сахароза или сахарин.
[0232] Масляные суспензии можно формулировать, суспендируя активные ингредиенты в растительном масле, например, арахисовом масле, оливковом масле, сезамовом масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как парафиновое масло. Масляные суспензии могут содержать загуститель, например, пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Для обеспечения пероральных препаратов с приятным вкусом можно добавлять подсластители и ароматизаторы. Эти композиции можно защищать посредством добавления антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.
[0233] Фармацевтические композиции по изобретению также могут находиться в форме эмульсий "масло-в-воде". Масляная фаза может представлять собой растительное масло или минеральное масло или их смеси. Подходящие эмульгаторы могут представлять собой природные камеди, например, гуммиарабик или трагакантовую камедь, природные фосфолипиды, например, соевый, лецитиновый, и сложные эфиры или частичные сложные эфиры, получаемые из жирных кислот и гексита, ангидридов, например, сорбитанмоноолеат, и продукты конденсации указанных частичных сложных эфиров с этиленоксидом, например, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Эмульсии также могут содержать подсластитель и ароматизаторы.
[0234] Сиропы и эликсиры можно формулировать с подсластителями, например, глицерином, пропиленгликолем, сорбитом, глюкозой или сахарозой. Такие составы также могут содержать смягчающее средство, консервант и ароматизаторы и красители. Фармацевтические композиции могут находиться в форме стерильной инъецируемой водной или масляной суспензии. Эту суспензию можно формулировать, как известно в данной области, с использованием подходящих диспергирующих средств или средств для смачивания и суспендирующих средств, которые указаны выше. Также стерильный инъецируемый препарат может представлять собой стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксическом парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые можно применять, находятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или среды для суспендирования, как правило, применяют стерильные, жирные масла. Для этой цели можно применять любое мягкое жирное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, в получении инъецируемых средств находят применение жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.
[0235] Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению также можно вводить в форме суппозиториев, например, для ректального введения лекарственного средства. Эти композиции можно получать, смешивая лекарственное средство с подходящим не раздражающим эксципиентом, который является твердым при обычных температурах, но жидким при ректальной температуре и, таким образом, плавится в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такие вещества включают масло какао и полиэтиленгликоли.
[0236] Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению можно вводить парентерально в стерильной среде. Лекарственное средство, в зависимости от используемых носителя и концентрации, можно суспендировать или растворять в носителе. Предпочтительно, в носители можно растворять вспомогательные вещества, такие как местные анестетики, консерванты и буферные средства.
[0237] В других вариантах осуществления миНК и композиции и составы LNP, предоставленные в настоящем документе для применения в легочной доставке, дополнительно содержат одно или несколько поверхностно-активных веществ. Подходящие поверхностно-активные вещества или компоненты поверхностно-активных веществ для увеличения поглощения композиций по изобретению наряду с другими включают синтетические и природные, а также полные и укороченные формы поверхностно-активного белка A, поверхностно-активного белка B, поверхностно-активного белка C, поверхностно-активного белка D и поверхностно-активного белка E, насыщенный дифосфатидилхолин (отличный от дипальмитоила), дипальмитоилфосфатидилхолин, фосфатидилхолин, фосфатидилглицерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин; фосфатидную кислоту, убихиноны, лизофосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилхолин, пальмитоиллизофосфатидилхолин, дегидроэпиандростерон, долихолы, сульфатидную куслоту, глицерин-3-фосфат, дигидроксиацетонфосфат, глицерин, глицеро-3-фосфохолин, дигидроксиацетон, пальмитат, цитидиндифосфат (CDP) диацилглицерин, CDP холин, холин, холинфосфат; а также природные и искусственные ламеллярные тельца, которые представляют собой природные транспортеры для компонентов поверхностно-активных веществ, омега-3 жирные кислоты, полиеновую кислоту, полиеноевую кислоту, лецитин, пальмитиновую кислоту, неионные блок-сополимеры этилена или пропиленоксидов, полиоксипропилен, мономерный и полимерный полиоксиэтилен, мономерный и полимерный, поли(виниламин) с декстрановыми и/или алканоильными боковыми цепями, Brij 35, Triton X-100 и синтетические поверхностно-активные вещества ALEC, Exosurf, Survan и Atovaquone. Эти поверхностно-активные вещества можно использовать или по одному, или как часть многокомпонентного поверхностно-активного вещества в составе, или в виде ковалентно связанных добавлений к 5'- и/или 3'-концам компонента нуклеиновой кислоты фармацевтической композиции по настоящему документу.
b. Комбинации
[0238] МиНК и фармацевтические составы по изобретению можно вводить индивидууму отдельно, или использовать в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, или они могут включать одно или несколько других терапевтических средств, например, противовирусные средства или средства против злокачественных опухолей. Таким образом, в объеме изобретения находятся комбинации описываемых в настоящем документе соединений с другими противовирусными средствами, или средствами против злокачественных опухолей, или химиотерапевтическими средствами.
[0239] Примеры средств против злокачественных опухолей или химиотерапевтических средств можно найти в Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Heilman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Специалист в данной области может понять, какие комбинации средств могут быть пригодными на основе конкретных характеристик рассматриваемых лекарственных средств и злокачественной опухоли. Такие средства против злокачественных опухолей включают, но не ограничиваясь этим, следующее: модуляторы рецепторов эстрогенов, модуляторы рецепторов андрогенов, модуляторы ретиноидного рецептора, цитотоксические/цитостатические средства, антипролиферативные средства, ингибиторы пренилпротеинтрансферазы, ингибиторы HMG-КоА-редуктазы и другие ингибиторы ангиогенеза, ингибиторы клеточной пролиферации и передачи сигналов выживания, средства индукции апоптоза и средства, блокирующие контрольные точки клеточного цикла. миНК по изобретению также пригодны в комбинации с любым терапевтическим средством, используемым для лечения HCC, например, но не ограничиваясь этим, сорафениб.
[0240] Таким образом, в дополнительном варианте осуществления изобретение относится к комбинации, включающей молекулу миНК по изобретению, такую как например, но без ограничения, молекула миНК, содержащая последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1210, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1211, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1212, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO:1213; или ее формулу (A) или фармацевтически приемлемую соль, сольват или физиологически функциональное производное, совместно с одним или несколькими противовирусными средствами. В некоторых вариантах осуществления антивирусное средство представляет собой другой ингибитор HBV.
[0241] В определенных вариантах осуществления молекулы миНК по настоящему изобретению пригодны в комбинации с известными средствами против вируса HBV, включая следующие: ламивудин (2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин, как правило, называемый 3TC), пегинтерферон-альфа2а, тенофовир, энтекавир, телбивудин, адефовир.
[0242] Также изобретение относится к комбинации, содержащей молекулу миНК по изобретению, такую как, например, но без ограничения, молекула миНК, содержащая последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 455; или ее формулу (A) или фармацевтически приемлемую соль, сольват или физиологически функциональное производное, совместно с одним или несколькими средствами против злокачественных опухолей или химиотерапевтическими средствами.
[0243] В определенных вариантах осуществления молекулы миНК по настоящему изобретению подходят в комбинации с известными средствами против злокачественных опухолей, включая следующие: модуляторы рецепторов эстрогенов, модуляторы рецепторов андрогенов, модуляторы ретиноидного рецептора, цитотоксические средства, антипролиферативные средства, ингибиторы пренилпротеинтрансферазы, ингибиторы HMG-КоА-редуктазы, ингибиторы протеазы ВИЧ, ингибиторы обратной транскриптазы и другие ингибиторы ангиогенеза.
[0244] Примеры модуляторов рецепторов эстрогенов, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, тамоксифен, ралоксифен, идоксифен, LY353381, LY117081, торемифен, фулвестрант, 4-[7-(2,2-диметил-1-оксопропокси-4-метил-2-[4-[2-(1-пиперидинил)этокси]фенил]-2H-1-бензопиран-3-ил]-фенил-2,2-диметилпропаноат, 4,4'-дигидроксибензофенон-2,4-динитрофенилгидразон и SH646.
[0245] Примеры модуляторов рецепторов андрогенов, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, финастерид и другие ингибиторы 5α-редуктазы, нилутамид, флутамид, бикалутамид, лиарозол и ацетат абиратерона.
[0246] Примеры таких модуляторов ретиноидного рецептора, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, бексаротен, третиноин, 13-цис-ретиноевую кислоту, 9-цис-ретиноевую кислоту, α-дифторметилорнитин, ILX23-7553, транс-N-(4'-гидроксифенил)ретинамид и N-4-карбоксифенилретинамид.
[0247] Примеры цитотоксических средств, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, сертенеф, кахектин, ифосфамид, тазонермин, лонидамин, карбоплатин, алтретамин, преднимустин, дибромодульцитол, ранимустин, фотемустин, недаплатин, оксалиплатин, темозоломид, гептаплатин, эстрамустин, тозилат импросульфана, трофосфамид, нимустин, хлорид диброспидия, пумитепа, лобаплатин, сатраплатин, профиромицин, цисплатин, ирофульвен, дексифосфамид, цис-аминодихлор(2-метилпиридин)платина, бензилгуанин, глюфосфамид, GPX100, (транс,транс,транс)-бис-мю-(гексан-1,6-диамин)-мю-[диаминплатина(II)]бис[диамин(хлор)платина(II)]тетрахлорид, диаризидинилспермин, триоксид мышьяка, 1-(11-додециламино-10-гидроксиундецил)-3,7-диметилксантин, зорубицин, идарубицин, даунорубицин, бизантрен, митоксантрон, пирарубицин, пинафид, валрубицин, амрубицин, антинеопластон, 3'-деамино-3'-морфолино-13-деоксо-10-гидроксикарминомицин, аннамицин, галарубицин, элинафид, MEN10755 и 4-деметокси-3-деамино-3-азиридинил-4-метилсульфонилдаунорубицин (см. WO 00/50032).
[0248] Пример активируемого гипоксией соединения, которое можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, представляет собой тирапазамин.
[0249] Примеры ингибиторов протеасом, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, лактацистин и бортезомиб.
[0250] Примеры ингибиторы микротрубочек/стабилизирующих микротрубочки средств, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, паклитаксел, виндезинсульфат, 3',4'-дидегидро-4'-дезокси-8'-норвинкалейкобластин, доцетаксол, ризоксин, доластатин, изетионат мивобулина, ауристатин, цемадотин, RPR109881, BMS184476, винфлунин, криптофицин, 2,3,4,5,6-пентафтор-N-(3-фтор-4-метоксифенил)бензолсульфонамид, ангидровинбластин, N,N-диметил-L-валил-L-валил-N-метил-L-валил-L-пролил-L-пролин-трет-бутиламид, TDX258, эпотилоны (см. например, патенты США №№ 6284781 и 6288237) и BMS 188797.
[0251] Некоторые примеры ингибиторов топоизомераз, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, топотекан, гикаптамин, иринотекан, рубитекан, 6-этоксипропионил-3',4'-O-экзо-бензилиденшартрезин, 9-метокси-N,N-диметил-5-нитропиразоло[3,4,5-kl]акридин-2-(6H)пропанамин, 1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4-метил-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':b,7]-индолизино[1,2b]хинолин-10,13(9H,15H)дион, луртотекан, 7-[2-(N-изопропиламино)этил]-(20S)камптотецин, BNP 1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, фосфат этопозида, тенипозид, собузоксан, 2'-диметиламино-2'-дезоксиэтопозид, GL331, N-[2-(диметиламино)этил]-9-гидрокси-5,6-диметил-6H-пиридо[4,3-b]карбазол-1-карбоксамид, азулакрин, (5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(диметиламино)этил]-N-метиламино]этил]-5-[4-гидрокси-3,5-диметоксифенил]-5,5a,6,8,8a,9-гексогидрофуро(3',4':6,7)нафто(2,3-d)-1,3-диоксол-6-он, 2,3-(метилендиокси)-5-метил-7-гидрокси-8-метоксибензо[c]-фенантридиний, 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-дион, 5-(3-аминопропиламино)-7,10-дигидрокси-2-(2-гидроксиэтиламинометил)-6H-пиразоло[4,5,1-де]акридин-6-он, N-[1-[2(диэтиламино)этиламино]-7-метокси-9-оксо-9H-тиоксантен-4-илметил]формамид, N-(2-(диметиламино)этил)акридин-4-карбоксамид, 6-[[2-(диметиламино)этил]амино]-3-гидрокси-7H-индено[2,1-c]хинолин-7-он и димесна.
[0252] Примеры ингибиторов митотических кинезинов, и в частности, митотического кинезина KSP человека, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, ингибиторы, описанные в публикациях PCT WO 01/30768, WO 01/98278, WO 03/050064, WO 03/050122, WO 03/049527, WO 03/049679, WO 03/049678, WO04/039774, WO03/079973, WO03/099211, WO03/105855, WO03/106417, WO04/037171, WO04/058148, WO04/058700, WO04/126699, WO05/018638, WO05/019206, WO05/019205, WO05/018547, WO05/017190, US2005/0176776. В одном из вариантов осуществления ингибиторы митотических кинезинов включают, но не ограничиваясь этим, ингибиторы KSP, ингибиторы MKLP1, ингибиторы CENP-E, ингибиторы MCAK, ингибиторы Kif14, ингибиторы Mphosph1 и ингибиторы Rab6-KIFL.
[0253] Примеры "ингибиторов деацетилаз гистонов", которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, TSA, оксамфлатин, PXD101, MG98, вальпроевую кислоту и скриптейд. Кроме того, ссылки на другие ингибиторы деацетилаз гистонов можно найти в следующей публикации: Miller, T.A. et al. J. Med. Chem. 46(24):5097-5116 (2003).
[0254] Ингибиторы киназ, вовлеченных в прогресс митоза, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, ингибиторы киназы aurora, ингибиторы Polo-подобных киназ (PLK) (в частности, ингибиторы PLK-1), ингибиторы bub-1 и ингибиторы bub-R1.
[0255] Антипролиферативные средства, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, олигонуклеотиды антисмысловых РНК и ДНК, такие как G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231 и INX3001, и антиметаболиты, такие как эноцитабин, кармофур, тегафур, пентостатин, доксифлуридин, триметрексат, флударабин, капецитабин, галоцитабин, окфосфат цитарабина, гидрат фостеабина натрия, ралтитрексед, палтитрексид, эмитефур, тиазофурин, децитабин, нолатрексед, пеметрексед, нелзарабин, 2'-дезокси-2'-метилиденцитидин, 2'-фторметилен-2'-дезоксицитидин, N-[5-(2,3-дигидро-бензофурил)сульфонил]-N'-(3,4-дихлорфенил)мочевина, N6-[4-дезокси-4-[N2-[2(E),4(E)-тетрадекадиеноил]глициламино]-L-глицеро-B-L-манно-гептопиранозил]аденин, аплидин, эктеинасцидин, троксацитабин, 4-[2-амино-4-оксо-4,6,7,8-тетрагидро-3H-пиримидино[5,4-b][1,4]тиазин-6-ил-(S)-этил]-2,5-тиеноил-L-глутаминовая кислота, аминоптерин, 5-фторурацил, аланозин, 11-ацетил-8-(карбамоилоксиметил)-4-формил-6-метокси-14-окса-1,11-диазатетрацикло(7.4.1.0.0)-тетрадека-2,4,6-триен-9-иловый эфир уксусной кислоты, свайнсонин, лометрексол, дексразоксан, метиониназа, 2'-циано-2'-дезокси-N4-пальмитоил-1-B-D-арабинофуранозилцитозин и тиосемикарбазон 3-аминопиридин-2-карбоксальдегида.
[0256] Примеры направляемых моноклональными антителами терапевтических средств, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают терапевтические средства, которые содержат цитотоксические средства или радиоактивные изотопы, связанные со специфичными к злокачественным клеткам или специфичными к клеткам-мишеням моноклональными антителами, такие как, например, бексар (Bexxar).
[0257] Примеры ингибиторов HMG-КоА-редуктазы, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, ловастатин (мевакор (MEVACOR®); см. патенты США №№ 4231938, 4294926 и 4319039), симвастатин (зокор (ZOCOR®); см. патенты США №№ 4444784, 4820850 и 4916239), правастатин (правахол (PRAVACHOL®); см. патенты США №№ 4346227, 4537859, 4410629, 5030447 и 5180589), флувастатин (лескол (LESCOL®); см. патенты США №№ 5354772, 4911165, 4929437, 5189164, 5118853, 5290946 и 5356896) и аторвастатин (липитор (LIPITOR®); см. патенты США №№ 5273995, 4681893, 5489691 и 5342952). Структурные формулы этих и дополнительных ингибиторов HMG-КоА-редуктазы, которые можно использовать в способах по настоящему изобретению, описаны на странице 87 M. Yalpani, "Cholesterol Lowering Drugs", Chemistry & Industry, pp. 85-89 (5 февраля 1996) и в патентах США №№ 4782084 и 4885314.
[0258] Примеры ингибиторов пренилпротеинтрансферазы, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают такие, которые можно найти в следующих публикациях и патентах: WO 96/30343, WO 97/18813, WO 97/21701, WO 97/23478, WO 97/38665, WO 98/28980, WO 98/29119, WO 95/32987, патент США № 5420245, патент США № 5523430, патент США № 5532359, патент США № 5510510, патент США № 5589485, патент США № 5602098, публикация патента Европы 0618221, публикация патента Европы 0675112, публикация патента Европы 0604181, публикация патента Европы 0696593, WO 94/19357, WO 95/08542, WO 95/11917, WO 95/12612, WO 95/12572, WO 95/10514, патент США № 5661152, WO 95/10515, WO 95/10516, WO 95/24612, WO 95/34535, WO 95/25086, WO 96/05529, WO 96/06138, WO 96/06193, WO 96/16443, WO 96/21701, WO 96/21456, WO 96/22278, WO 96/24611, WO 96/24612, WO 96/05168, WO 96/05169, WO 96/00736, патент США № 5571792, WO 96/17861, WO 96/33159, WO 96/34850, WO 96/34851, WO 96/30017, WO 96/30018, WO 96/30362, WO 96/30363, WO 96/31111, WO 96/31477, WO 96/31478, WO 96/31501, WO 97/00252, WO 97/03047, WO 97/03050, WO 97/04785, WO 97/02920, WO 97/17070, WO 97/23478, WO 97/26246, WO 97/30053, WO 97/44350, WO 98/02436 и патент США № 5532359. Для примера роли ингибитора пренилпротеинтрансферазы в ангиогенезе см. European J. of Cancer, Vol. 35, No. 9, pp.1394-1401 (1999).
[0259] Примеры ингибиторов ангиогенеза, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, ингибиторы тирозинкиназ, такие как ингибиторы тирозинкиназных рецепторов Flt-1 (VEGFR1) и Flk-1/KDR (VEGFR2), ингибиторы эпидермального фактора роста, фактора роста фибробластов или фактора роста тромбоцитов, ингибиторы MMP (матриксной металлопротеазы), блокаторы интегринов, ингибиторы интерферона-α, интерлейкина-12, пентозанполисульфата, циклооксигеназы, включая нестероидные противовоспалительные (NSAID), такие как аспирин и ибупрофен, а также селективные ингибиторы циклооксигеназы-2, такие как целекоксиб и рофекоксиб (PNAS, Vol. 89, p. 7384 (1992); JNCI, Vol. 69, p. 475 (1982); Arch. Opthalmol., Vol. 108, p.573 (1990); Anat. Rec., Vol. 238, p. 68 (1994); FEBS Letters, Vol. 372, p. 83 (1995); Clin, Orthop. Vol. 313, p. 76 (1995); J. Mol. Endocrinol., Vol. 16, p.107 (1996); Jpn. J. Pharmacol., Vol. 75, p. 105 (1997); Cancer Res., Vol. 57, p. 1625 (1997); Cell, Vol. 93, p. 705 (1998); Intl. J. Mol. Med., Vol. 2, p. 715 (1998); J. Biol. Chem., Vol. 274, p. 9116 (1999)), стероидные противовоспалительные средства (такие как кортикостероиды, минералокортикоиды, дексаметазон, преднизон, преднизолон, метилпред, бетаметазон), карбоксиамидотриазол, комбретастатин A-4, скваламин, 6-O-хлорацетилкарбонил)фумагиллол, талидомид, ангиостатин, тропонин-1, антагонисты ангиотензина II (см. Fernandez et al., J. Lab. Clin. Med. 105:141-145 (1985)), и антитела к VEGF (см., Nature Biotechnology, Vol. 17, pp.963-968 (октябрь 1999); Kim et al., Nature, 362, 841-844 (1993); WO 00/44777 и WO 00/61186).
[0260] Также в комбинации с соединениями по настоящему изобретению можно использовать другие терапевтические средства, модулирующие или ингибирующие ангиогенез, и они включают средства, модулирующие или ингибирующие системы свертывания и фибринолиза (см. обзор в Clin. Chem. La. Med. 38:679-692 (2000)). Примеры таких средств, модулирующих или ингибирующих пути свертывания и фибринолиза, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, гепарин (см. Thromb. Haemost. 80:10-23 (1998)), низкомолекулярные гепарины и ингибиторы карбоксипептидазы U (также известные как ингибиторы активного активируемого тромбином ингибитора фибринолиза [TAFIa]) (см. Thrombosis Res. 101:329-354 (2001)). Ингибиторы TAFIa описаны в публикации PCT WO 03/013526 и заявке США с серийным № 60/349925 (зарегистрированной 18 января 2002 года).
[0261] Средства, блокирующие контрольные точки клеточного цикла, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, ингибиторы ATR, ATM, ингибиторы киназ Chk1 и Chk2 и киназ cdk и cdc и конкретно проиллюстрированы 7-гидроксистауроспорином, флавопиридолом, CYC202 (циклацел) и BMS-387032.
[0262] Средства, блокирующие тирозинкиназные рецепторы (RTK), которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, ингибиторы c-Kit, Eph, PDGF, Flt3 и HBV. Дополнительные средства включают ингибиторы RTK, как описано Bume-Jensen and Hunter, Nature, 411:355-365, 2001.
[0263] Ингибиторы клеточной пролиферации и пути передачи сигнала выживания, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, ингибиторы EGFR (например, гефинитиб и эрлотиниб), ингибиторы ERB-2 (например, трастузумаб), ингибиторы IGFR, ингибиторы цитокиновых рецепторов, ингибиторы HBV, ингибиторы PI3K (например, LY294002), серин/треониновых киназ (включая без ограничения ингибиторы Akt, так как описано в WO 02/083064, WO 02/083139, WO 02/083140, US 2004-0116432, WO 02/083138, US 2004-0102360, WO 03/086404, WO 03/086279, WO 03/086394, WO 03/084473, WO 03/086403, WO 2004/041162, WO 2004/096131, WO 2004/096129, WO 2004/096135, WO 2004/096130, WO 2005/100356, WO 2005/100344), ингибиторы Raf-киназы (например, BAY-43-9006), ингибиторы MEK (например, CI-1040 и PD-098059) и ингибиторы mTOR (например, Wyeth CCI-779). Такие средства включают низкомолекулярные ингибирующие соединения и антагонисты на основе антител.
[0264] Индуцирующие апоптоз средства, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, активаторы представителей семейства рецептора TNF (включая рецепторы TRAIL).
[0265] NSAID, являющиеся селективными ингибиторами COX-2, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают, NSAID, описанные в патенте США 5474995, патенте США 5861419, патенте США 6001843, патенте США 6020343, патенте США 5409944, патенте США 5436265, патенте США 5536752, патенте США 5550142, патенте США 5604260, патенте США 5698584, патенте США 5710140, WO 94/15932, патенте США 5344991, патенте США 5134142, патенте США 5380738, патенте США 5393790, патенте США 5466823, патенте США 5633272 и патенте США 5932598, которые, таким образом, все включены в качестве ссылки.
[0266] Ингибиторы COX-2, которые особенно пригодны в комбинации с соединениями по изобретению, включают: 3-фенил-4-(4-(метилсульфонил)фенил)-2-(5H)-фуранон; и 5-хлор-3-(4-метилсульфонил)-фенил-2-(2-метил-5-пиридинил)пиридин или их фармацевтически приемлемую соль.
[0267] Соединения, описанные в качестве специфических ингибиторов COX-2 и, таким образом, пригодные в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваясь этим: парекоксиб, целебрекс (CELEBREX®) и бекстра (BEXTRA®) или их фармацевтически приемлемую соль.
[0268] Ингибиторы ангиогенеза, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, эндостатин, украин, ранпирназу, IM862, 5-метокси-4-[2-метил-3-(3-метил-2-бутенил)оксиранил]-1-оксаспиро[2,5]окт-6-ил(хлорацетил)карбамат, ацетилдинаналин, 5-амино-1-[[3,5-дихлор-4-(4-хлорбензоил)-фенил]метил]-1H-1,2,3-триазол-4-карбоксамид, CM101, скваламин, комбретастатин, RPI4610, NX31838, сульфатированный фосфат маннопентаозы, 7,7-(карбонил-бис[имино-N-метил-4,2-пирролокарбонилимино[N-метил-4,2-пиррол]-карбонилимино]-бис-(1,3-нафталиндисульфонат) и 3-[(2,4-диметилпиррол-5-ил)метилен]-2-индолинон (SU5416).
[0269] Ингибиторы тирозинкиназ, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, N-(трифторметилфенил)-5-метилизоксазол-4-карбоксамид, 3-[(2,4-диметилпиррол-5-ил)метилиденил)индолин-2-он, 17-(аллиламино)-17-деметоксигелданамицин, 4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-метокси-6-[3-(4-морфолинил)пропоксил]хиназолин, N-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин, BIBX1382, 2,3,9,10,11,12-гексагидро-10-(гидроксиметил)-10-гидрокси-9-метил-9,12-эпокси-1H-дииндоло[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]пирроло[3,4-i][1,6]бензодиазоцин-1-он, SH268, генистеин, иматиниб (STI571), CEP2563, 4-(3-хлорфениламино)-5,6-диметил-7H-пирроло[2,3-d]пиримидинметансульфонат, 4-(3-бром-4-гидроксифенил)амино-6,7-диметоксихиназолин, 4-(4'-гидроксифенил)амино-6,7-диметоксихиназолин, SU6668, STI571A, N-4-хлорфенил-4-(4-пиридилметил)-1-фталазинамин и EMD121974.
[0270] В композиции и способы по настоящему изобретению также включены комбинации с соединениями, отличными от соединений против злокачественных опухолей. Например, при лечении определенных злокачественных новообразований пригодны комбинации заявляемых по настоящему изобретению соединений с агонистами PPAR-γ (т.е., PPAR-гамма) и агонистами PPAR-δ (т.е., PPAR-дельта). PPAR-γ и PPAR-δ представляют собой ядерные активируемые пролифератором пероксисом рецепторы γ и δ. В литературе описаны экспрессия PPAR-γ в эндотелиальных клетках и его вовлечение в ангиогенез (см. J. Cardiovasc. Pharmacol. 31:909-913 (1998); J. Biol. Chem. 274:9116-9121 (1999); Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 41:2309-2317 (2000)). Недавно показано, что агонисты PPAR-γ ингибируют ангиогенный ответ на VEGF in vitro; и троглитазон, и малеат росиглитазона ингибируют развитие неоваскуляризации сетчатки у мышей. (Arch. Ophthamol. 119:709-717 (2001)). Примеры агонистов PPAR-γ и агонистов PPAR-γ/α, которые можно использовать в комбинации с соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, тиазолидиндионы (такие как DRF2725, CS-011, троглитазон, росиглитазон и пиоглитазон), фенофибрат, гемфиброзил, клофибрат, GW2570, SB219994, AR-H039242, JTT-501, MCC-555, GW2331, GW409544, NN2344, KRP297, NP0110, DRF4158, NN622, GI262570, PNU182716, DRF552926, 2-[(5,7-дипропил-3-трифторметил-1,2-бензизоксазол-6-ил)окси]-2-метилпропионовую кислоту (описанную в USSN 09/782856) и 2(R)-7-(3-(2-хлор-4-(4-фторфенокси)фенокси)пропокси)-2-этилхроман-2-карбоновую кислоту (описанную в USSN 60/235708 и 60/244697).
[0271] Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой использование описываемых в настоящем документе соединений в комбинации с генотерапией для лечения злокачественной опухоли. Для обзора генетических стратегий для лечения злокачественных опухолей см. Hall et al. (Am J. Hum. Genet. 61:785-789 (1997)) и Kufe et al. (Cancer Medicine, 5th Ed, pp 876-889, BC Decker, Hamilton, 2000). Генотерапию можно использовать для доставки любого супрессирующего опухоль гена. Примеры таких генов включают, но не ограничиваясь этим, p53, который можно доставлять посредством опосредуемого рекомбинантными вирусами транспорта (см., например, патент США № 6069134), антагонист uPA/uPAR ("Adenovirus-Mediated Delivery of a uPA/uPAR Antagonist Suppresses Angiogenesis-Dependent Tumor Growth and Dissemination in Mice", Gene Therapy, August 5(8): 1105-13 (1998)), и интерферон-гамма (J. Immunol. 164:217-222 (2000)).
[0272] Соединения по настоящему изобретению также можно вводить в комбинации с ингибитором наследственной множественной лекарственной устойчивости (MDR), в частности, MDR, связанной с высокими уровнями экспрессии транспортных белков. Такие ингибиторы MDR включают ингибиторы п-гликопротеина (P-gp), такие как LY335979, XR9576, 0C144-093, R101922, VX853 и PSC833 (вальсподар).
[0273] Соединение по настоящему изобретению можно использовать в сочетании с противорвотными средствами для лечения тошноты или рвоты, включая острую, отложенную, поздней фазы и ожидаемую рвоту, которая может являться результатом использования соединения по настоящему изобретению, отдельно или с лучевой терапией. Для предотвращения или лечения рвоты соединение по настоящему изобретению можно использовать в сочетании с другими противорвотными средствами, особенно антагонистами рецепторов нейрокинина-1, антагонистами рецепторов 5HT3, такими как ондансетрон, гранисетрон, трописетрон и затисетрон, агонистами рецепторов GAGAB, такими как баклофен, кортикостероидами, такими как декадрон (дексаметазон), кеналог, аристокорт, назалид, преферид, бенекортен или другие такие средства, как описано в патентах США №№ 2789118, 2990401, 3048581, 3126375, 3929768, 3996359, 3928326 и 3749712, антидофаминергическими средствами, такими как фенотиазины (например, прохлорперазин, флуфеназин, тиоридазин и мезоридазин), метоклопрамид или дронабинол. В одном из вариантов осуществления противорвотное средство, выбранное из антагониста рецепторов нейрокинина-1, антагониста рецепторов 5HT3 и кортикостероида, вводят в качестве вспомогательного средства для лечения или предотвращения рвоты, которая может являться результатом введения соединений по настоящему изобретению.
[0274] Антагонисты рецепторов нейрокинина-1 для применения в сочетании с соединения по настоящему изобретению полностью описаны, например, в патентах США №№ 5162339, 5232929, 5242930, 5373003, 5387595, 5459270, 5494926, 5496833, 5637699, 5719147; публикациях патентов Европы №№ EP 0360390, 0394989, 0428434, 0429366, 0430771, 0436334, 0443132, 0482539, 0498069, 0499313, 0512901, 0512902, 0514273, 0514274, 0514275, 0514276, 0515681, 0517589, 0520555, 0522808, 0528495, 0532456, 0533280, 0536817, 0545478, 0558156, 0577394, 0585913, 0590152, 0599538, 0610793, 0634402, 0686629, 0693489, 0694535, 0699655, 0699674, 0707006, 0708101, 0709375, 0709376, 0714891, 0723959, 0733632 и 0776893; международных патентных публикациях PCT №№ WO 90/05525, 90/05729, 91/09844, 91/18899, 92/01688, 92/06079, 92/12151, 92/15585, 92/17449, 92/20661, 92/20676, 92/21677, 92/22569, 93/00330, 93/00331, 93/01159, 93/01165, 93/01169, 93/01170, 93/06099, 93/09116, 93/10073, 93/14084, 93/14113, 93/18023, 93/19064, 93/21155, 93/21181, 93/23380, 93/24465, 94/00440, 94/01402, 94/02461, 94/02595, 94/03429, 94/03445, 94/04494, 94/04496, 94/05625, 94/07843, 94/08997, 94/10165, 94/10167, 94/10168, 94/10170, 94/11368, 94/13639, 94/13663, 94/14767, 94/15903, 94/19320, 94/19323, 94/20500, 94/26735, 94/26740, 94/29309, 95/02595, 95/04040, 95/04042, 95/06645, 95/07886, 95/07908, 95/08549, 95/11880, 95/14017, 95/15311, 95/16679, 95/17382, 95/18124, 95/18129, 95/19344, 95/20575, 95/21819, 95/22525, 95/23798, 95/26338, 95/28418, 95/30674, 95/30687, 95/33744, 96/05181, 96/05193, 96/05203, 96/06094, 96/07649, 96/10562, 96/16939, 96/18643, 96/20197, 96/21661, 96/29304, 96/29317, 96/29326, 96/29328, 96/31214, 96/32385, 96/37489, 97/01553, 97/01554, 97/03066, 97/08144, 97/14671, 97/17362, 97/18206, 97/19084, 97/19942 и 97/21702 и в британских патентных публикациях №№ 2266529, 2268931, 2269170, 2269590, 2271774, 2292144, 2293168, 2293169 и 2302689. Получение таких соединений полностью описано в указанных выше патентах и публикациях, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки.
[0275] В одном из вариантов осуществления антагонист рецепторов нейрокинина-1 для применения в сочетании с соединениями по настоящему изобретению выбран из: 2-(R)-(1-(R)-(3,5-бис(трифторметил)фенил)этокси)-3-(S)-(4-фторфенил)-4-(3-(5-оксо-1H,4H-1,2,4-триазоло)метил)морфолина или его фармацевтически приемлемой соли, которые описаны в патенте США № 5719147.
[0276] Соединение по настоящему изобретению также можно вводить со средством, подходящим для лечения анемии. Такое средство для лечения анемии представляет собой, например, активатор рецептора непрерывного эритропоэза (такой как эпоэтин альфа).
[0277] Соединение по настоящему изобретению также можно вводить со средством, подходящим для лечения нейтропении. Такое средство для лечения нейтропении представляет собой, например, гемопоэтический фактор роста, регулирующий продукцию и функцию нейтрофилов, такой как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (G-CSF). Примеры G-CSF включают филграстим и PEG-филграстим.
[0278] Соединение по настоящему изобретению также можно вводить с иммуностимулирующим лекарственным средством, таким как левамизол, изопринозин и задаксин.
[0279] Соединение по настоящему изобретению также может быть подходящим для лечения или профилактики заболевания или злокачественной опухоли печени в сочетании с другими терапевтическими средствами на основе миНК.
[0280] Соединения по настоящему изобретению также можно вводить в комбинации с ингибиторами γ-секретазы и/или ингибиторами пути передачи сигнала NOTCH. Такие ингибиторы включают соединения, описанные в WO 01/90084, WO 02/30912, WO 01/70677, WO 03/013506, WO 02/36555, WO 03/093252, WO 03/093264, WO 03/093251, WO 03/093253, WO 2004/039800, WO 2004/039370, WO 2005/030731, WO 2005/014553, USSN 10/957251, WO 2004/089911, WO 02/081435, WO 02/081433, WO 03/018543, WO 2004/031137, WO 2004/031139, WO 2004/031138, WO 2004/101538, WO 2004/101539 и WO 02/47671 (включая LY-450139).
[0281] Соединение по настоящему изобретению также может быть подходящим для лечения или профилактики злокачественной опухоли в комбинации с ингибиторами PARP.
[0282] Соединение по настоящему изобретению также может быть подходящим для лечения злокачественной опухоли в сочетании со следующими терапевтическими средствами: абареликс (пленаксис-депо (Plenaxis depot®)); альдеслейкин (прокин (Prokine®)); альдеслейкин (пролейкин (Proleukin®)); алемтузумаб (кэмпас (Campath®)); алитретиноин (панретин (Panretin®)); аллопуринол (зилоприм (Zyloprim®)); алтретамин (гексален (Hexalen®)); афифостин (этиол (Ethyol®)); анастрозол (аримидекс (Arimidex®)); триоксид мышьяка (трисенокс (Trisenox®)); аспарагиназа (эльспар (Elspar®)); азацитидин (видаза (Vidaza®)); гидрохлорид бендамустина (треанда (Treanda®)); бевацизумаб (авастин (Avastin®)); капсулы бексаротена (таргретин (Targretin®)); бексаротен гель (таргретин (Targretin®)); блеомицин (бленоксан (Blenoxane®)); бортезомиб (велкейд (Velcade®)); брефелдин A; внутривенный бусульфан (бусулфекс (Busulfex®)); пероральный бусульфан (милеран (Myleran®)); калустерон (метосарб (Methosarb®)); капецитабин (кселода (Xeloda®)); карбоплатин (параплатин (Paraplatin®)); кармустин (BCNU®, BiCNU®); кармустин (глиадел (Gliadel®)); имплантат кармустина с полифепросаном 20 (пластина глиаделя (Gliadel Wafer®)); целекоксиб (целебрекс (Celebrex®)); цетуксимаб (эрбитукс (Erbitux®)); хлорамбуцил (лейкеран (Leukeran®)); цисплатин (платинол (Platinol®)); кладрибин (леустатин (Leustatin®, 2-CdA®)); клофарабин (клолар (Clolar®)); циклофосфамид (цитоксан (Cytoxan®), неозар (Neosar®)); циклофосфамид (инъекция цитоксана (Cytoxan®)); циклофосфамид (таблетка цитоксана (Cytoxan®)); цитарабин (цитозар-U (Cytosar-U®)); липосомальный цитарабин (депоцит (DepoCyt®)); дакарбазин (DTIC-Dome®); дактиномицин, актиномицин D (космеген (Cosmegen®)); инъекция далтепарина натрия (фрагмин (Fragmin®)); дарбэпоэтин альфа (аранесп (Aranesp®)); дазатиниб (сприцел (Sprycel®)); липосомальный даунорубицин (дануоксом (DanuoXome®)); даунорубицин, дауномицин (даунорубицин (Daunorubicin®)); даунорубицин, дауномицин (церубидин (Cerubidine®)); дегареликс (фирмагон (Firmagon®)); денилейкин дифтитокс (онтак (Ontak®)); дексразоксан (зинекард (Zinecard®)); гидрохлорид дексразоксана (тотект (Totect®)); дидемнин B; 17-DMAG; доцетаксел (таксотер (Taxotere®)); доксорубицин (адриамицин PFS (Adriamycin PFS®)); доксорубицин (адриамицин (Adriamycin®), рубекс (Rubex®)); доксорубицин (инъекция адриамицина (Adriamycin PFS Injection®)); липосомальный доксорубицин (доксил (Doxil®)); пропионат дромостанолона (дромостанолон (Dromostanolone®)); пропионат дромостанолона (инъекция мастерона (Masterone Injection®)); инъекция экулизумаба (солирис (Soliris®)); раствор Эллиота B (Elliott's B Solution®); элтромбопаг (промакта (Promacta®)); эпирубицин (элленс (Ellence®)); эпоэтин альфа (эпоген (epogen®)); эрлотиниб (тарцева (Tarceva®)); эстрамустин (эмцит (Emcyt®)); этинилэстрадиол; фосфат этопозида (этопофос (Etopophos®)); этопозид, VP-16 (вепезид (Vepesid®)); таблетки эверолимуса (афинитор (Afinitor®)); экземестан (аромазин (Aromasin®)); ферумокситол (инъекция ферагема (Feraheme Injection®)); филграстим (нейпоген (Neupogen®)); флоксуридин (внутриартериальный) (FUDR®); флударабин (флудара (Fludara®)); фторурацил, 5-FU (адруцил (Adrucil®)); фулвестрант (фаслодекс (Faslodex®)); гефинитиб (иресса (Iressa®)); гелданамицин; гемцитабин (гемзар (Gemzar®)); гемтузумаб озогамицин (милотарг (Mylotarg®)); ацетат гозерелина (имплантат золадекса (Zoladex Implant®)); ацетат гозерелина (золадекс (Zoladex®)); ацетат гистрелина (имплантат гистрелина (Histrelin implant®)); гидроксимочевина (гидрея (Hydrea®)); ибритумомаб тиуксетан (зевалин (Zevalin®)); идарубицин (идамицин (Idamycin®)); ифосфамид (ифекс (IFEX®)); иматиниба мезилат (Гливек (Gleevec®)); интерферон альфа 2a (роферон A (Roferon A®)); интерферон альфа 2b (интрон A (Intron A®)); инъекция иобенгуана I 123 (адревью (AdreView®)); иринотекан (камптосар (Camptosar®)); иксабепилон (иксемпра (Ixempra®)); таблетки лапатиниба (тайкерб (Tykerb®)); леналидомид (ревлимид (Revlimid®)); летрозол (фемара (Femara®)); лейковорин (велковорин (Wellcovorin®), лейковорин Leucovorin®)); ацетат лейпролида (элигард (Eligard®)); левамизол (эргамизол (Ergamisol®)); ломустин, CCNU (CeeBU®); мехлоретамин, азотистый иприт (мустарген (Mustargen®)); ацетат мегестрола (мегейс (Megace®)); мелфалан, L-PAM (алкеран (Alkeran®)); меркаптопурин, 6-MP (Пуринтол (Purinethol®)); месна (меснекс (Mesnex®)); месна (таблетки меснекса (Mesnex tabs®)); метотрексат (Methotrexate®); метоксален (увадекс (Uvadex®)); 8-метоксипсорален; митомицин C (мутамицин (Mutamycin®)); митотан (лизодрен (Lysodren®)); митоксантрон (новантрон (Novantrone®)); митрамицин; фенпропионат нандролона (дураболин-50 (Durabolin-50®)); неларабин (арранон (Arranon®)); нилотиниб (тасигна (Tasigna®)); нофетумомаб (верлума (Verluma®)); офатумумаб (арцерра (Arzerra®)); опрелвекин (неумега (Neumega®)); оксалиплатин (элоксатин (Eloxatin®)); паклитаксел (паксен (Paxene®)); паклитаксел (таксол (Taxol®)); связанные с белком частицы паклитаксела (абраксан (Abraxane®)); палифермин (кепиванс (Kepivance®)); памидронат (аредиа (Aredia®)); панитумумаб (вектибикс (Vectibix®)); таблетки пазопаниба (вотриентм (Votrienttm®)); пегадемаза (адаген (Adagen) (бычья пегадемаза (Pegademase Bovine®); пегаспаргаза (онкаспар (Oncaspar®)); пэгфилграстим (неуласта (Neulasta®)); пеметрексед динатрия (алимта (Alimta®)); пентостатин (нипент (Nipent®)); пипоброман (верцит (Vercyte®)); плериксафор (мозобил (Mozobil®)); пликамицин, митрамицин (митрацин (Mithracin®)); порфимер натрия (фотофрин (Photofrin®)); инъекция пралатрексата (фолотин (Folotyn®)); прокарбазин (матулан (Matulane®)); хинакрин (атабрин (Atabrine®)); рапамицин; расбуриказа (элитек (Elitek®)); гидрохлорид ралоксифена (эвиста (Evista®)); Ритуксимаб (ритуксан (Rituxan®)); ромидепсин (истодакс (Istodax®)); ромиплостим (энплат (Nplate®)); сарграмостим (лейкин (Leukine®)); сарграмостим (прокин (Prokine®)); сорафениб (нексавар (Nexavar®)); стрептозоцин (занозар (Zanosar®)); малеат сунитиниба (сутент (Sutent®)); тальк (склерозол (Sclerosol®)); тамоксифен (нолвадекс (Nolvadex®)); темозоломид (темодар (Temodar®)); темсиролимус (торисел (Torisel®)); тенипозид, VM-26 (вумон (Vumon®)); тестолактон (теслак (Teslac®)); тиогуанин, 6-TG (Thioguanine®); тиопурин; тиотепа (тиоплекс (Thioplex®)); топотекан (гикамтин (Hycamtin®)); торемифен (фарестон (Fareston®)); тозитумомаб (бексар (Bexxar®)); Тозитумомаб/I-131 тозитумомаб (бексар (Bexxar®)); транс-ретиноевая кислота; трастузумаб (герцептин (Herceptin®)); третиноин, ATRA (везаноид (Vesanoid®)); триэтиленмеламин; урамустин (капсулы урамустина (Uracil Mustard Capsules®)); валрубицин (валстар (Valstar®)); винбластин (вельбан (Velban®)); винкристин (онковин (Oncovin®)); винорелбин (навельбин (Navelbine®)); вориностат (золинза (Zolinza®)); вортманнин и золедронат (зомета (Zometa®)).
[0283] Указанные выше комбинации можно подходящим способом предоставлять для применения в форме фармацевтического состава, и, таким образом, фармацевтические композиции, содержащие комбинации, как определено выше, совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем представляют дополнительный аспект изобретения.
[0284] Отдельные соединения таких комбинаций можно вводить последовательно или одновременно в раздельных или комбинированных фармацевтических составах. В одном из вариантов осуществления отдельные соединения вводят одновременно в комбинированном фармацевтическом составе.
[0285] Таким образом, описываемые молекулы можно использовать в комбинации с одним или несколькими известными соединениями, способами лечения или процедурами для профилактики или лечения заболеваний, нарушений, состояний и симптопов, описываемых в настоящем документе, у индивидуума или в организме, как известно в данной области, таких как другие ингибиторы HBV.
3. Терапевтические применения
[0286] Современная база знаний в исследованиях HBV свидетельствует о необходимости способов, способных регулировать экспрессию HBV для терапевтического применения.
[0287] Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к способу лечения индивидуума, включающего без ограничения человека, страдающего инфекцией HBV или состоянием, опосредуемым действием экспрессии генов HBV, где способ включает введение указанному индивидууму эффективного количества двухцепочечной молекулы миНК по изобретению. В одном из вариантов осуществления этого аспекта молекулы миНК содержат последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO:455; или формулы (A).
[0288] В некоторых вариантах осуществления указанного аспекта состоянием является злокачественная опухоль. Таким образом, в определенных вариантах осуществления молекулы и композиции по настоящему изобретению пригодны в способе лечения злокачественной опухоли, а в частности при лечении печеночноклеточной карциномы (HCC).
[0289] В некоторых вариантах осуществления состоянием является заболевание печени. Таким образом, в определенных вариантах осуществления молекулы и композиции по настоящему изобретению пригодны в способе лечения заболевания печени, и в частности, при лечении цирроза печени.
[0290] В определенных вариантах осуществления введение молекулы миНК проводят посредством локального введения или системного введения. В других вариантах осуществления изобретение относится к приведению индивидуума или организма в контакт с молекулой миНК по изобретению посредством локального введения в подходящие ткани или клетки, такие как клетки и ткани легкого, например, посредством легочной доставки. В других вариантах осуществления изобретение относится к приведению индивидуума или организма в контакт с молекулой миНК по изобретению посредством системного введения (например, посредством внутривенного или подкожного введения миНК) в подходящие ткани или клетки, такие как печень или злокачественные ткани или клетки у индивидуума или в организме.
[0291] Молекулы миНК по изобретению также используют в качестве реагентов для применений ex vivo. Например, реагенты миНК вводят в ткань или клетки, которые трансплантируют индивидууму для получения терапевтического эффекта. Клетки и/или ткань можно получать до трансплантации из организма или у индивидуума, который позже получает эксплантат, или их можно получать из другого организма или у другого индивидуума. Молекулы миНК можно использовать для модуляции экспрессии одного или нескольких генов в клетках или ткани так, что клетки или ткань получают желаемый фенотип или становятся способными выполнять функцию при трансплантации in vivo. В одном из вариантов осуществления у пациента извлекают определенные клетки-мишени HBV. Эти извлеченные клетки приводят в контакт с миНК HBV, направленными к специфичной нуклеотидной последовательности в клетках в условиях, подходящих для захвата миНК этими клетками (например, с использованием для облегчения доставки миНК в клетки реагентов для доставки, таких как катионные липиды, липосомы и т.п., или такими способами, как электропорация). Затем клетки вводят обратно тому же пациенту или другим пациентам.
[0292] Для терапевтического применения индивидууму вводят фармацевтически эффективную дозу молекул миНК или фармацевтические композиции по изобретению. Фармацевтически эффективная доза представляет собой дозу, необходимую для профилактики, подавления возникновения или лечения (снижения симптома до определенной степени, предпочтительно всех симптомов) болезненного состояния. Специалист в данной области может легко определить терапевтически эффективную дозу миНК по изобретению для введения данному индивидууму, учитывая такие факторы, как размер и масса индивидуума, степень прогрессирования или развития заболевания, возраст, состояние здоровья и пол индивидуума, маршрут введения и является ли введение регионарным или системным. Как правило, вводят количество активных ингредиентов от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг массы тела/сутки в зависимости от активности отрицательно заряженного полимера. Оптимальные схемы дозирования можно рассчитать на основании измерений накопления лекарственного средства в организме пациента. Молекулы миНК по изобретению можно вводить в однократной дозе или в нескольких дозах.
[0293] Молекулы миНК по настоящему изобретению можно вводить раз в месяц, раз в неделю, раз в сутки (QD) или разделять на несколько доз в месяц, в неделю или суточных доз, так как, например, но без ограничения, дважды в неделю (BID), трижды в неделю (TID), раз в две недели. Специалисты в данной области могут легко оценить частоты повторения для дозирования на основе измеряемой продолжительности обработки и концентраций лекарственного средства в жидкостях или тканях организма.
[0294] Кроме того, введение может являться непрерывным, т.е., каждые сутки, или периодическим. Например, периодическое введение соединения по настоящему изобретению может представлять собой введение от одних до шести суток в неделю, или оно может означать введение циклами (например, ежесуточное введение в течение от двух до восьми последовательных недель, затем период покоя с отсутствием введения в течение срока до одной недели), или оно может означать введение через сутки.
G. Введение
[0295] Композиции или составы можно вводить множеством способов. Неограничивающие примеры способов введения по изобретению включают пероральное, буккальное, сублингвальное, парентеральное (т.е., внутрисуставное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное или внутримышечное), локальное ректальное введение или другое локальное введение. В одном из вариантов осуществления композицию по изобретению можно вводить посредством инсуффляции и ингаляции. Введение можно проводить посредством одной или дробных доз. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции вводят внутривенно или интраперитонеально посредством болюсной инъекции (см., например, патент США № 5286634). Липидные частицы с нуклеиновой кислотой можно вводить посредством прямой инъекции в участок заболевания или посредством инъекции в удаленный от участка заболевания участок (см., например, Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp. 70-71(1994)). В одном из вариантов осуществления молекулы миНК по изобретению и их составы или композиции вводят в клетку, индивидууму или в организм, как описано в настоящем документе и как общеизвестно в данной области.
1. Введение in vivo
[0296] В любом из способов лечения по изобретению миНК можно вводить индивидууму системно, как описано в настоящем документе, или иным известным в данной области способом, отдельно в виде монотерапии или в сочетании с дополнительными лечебными средствами, описываемыми в настоящем документе или как известно в данной области. Системное введение может включать, например, легочное (ингаляция, распыление и т.д.), внутривенное, подкожное, внутримышечное, катетерное, назофарингиальное, трансдермальное или пероральное/желудочно-кишечное введение, как общеизвестно в данной области.
[0297] В любом из способов лечения или профилактики по изобретению миНК можно вводить индивидууму локально или в локальные ткани, как описано в настоящем документе или иначе известно в данной области, отдельно в виде монотерапии или в сочетании с дополнительными лечебными средствами, как известно в данной области. Локальное введение может включать, например, ингаляцию, распыление, катетеризацию, имплантацию, прямую инъекцию, кожное/трансдермальное нанесение, пластыри, стентирование, ушные/глазные капли или введение в воротную вену в подходящие ткани или любые другие технологию, способ или процедуру локального введение, как общеизвестно в данной области.
[0298] В одном из вариантов осуществления молекулы миНК по изобретению и их составы или композиции вводят в печень, как общеизвестно в данной области (см. например, Wen et al., 2004, World J. Gastroenterol., 10, 244-9; Murao et al., 2002, Pharm. Res., 19, 1808-14; Liu et al., 2003, Gene Ther., 10, 180-7; Hong et al., 2003, J. Pharm. Pharmacol., 54, 51-8; Herrmann et al., 2004, Arch Virol., 149, 1611-7; и Matsuno et al., 2003, Gene Ther., 10, 1559-66).
[0299] В одном из вариантов осуществления изобретение относится к применению способов доставки молекул миНК по настоящему изобретению в гематопоэтические клетки, включая моноциты и лимфоциты. Эти способы подробно описаны Hartmann et al., 1998, J. Phamacol. Exp. Ther., 285(2), 920-928; Kronenwett et al., 1998, Blood, 91(3), 852-862; Filion and Phillips, 1997, Biochim. Biophys. Acta., 1329(2), 345-356; Ma and Wei, 1996, Leuk. Res., 20(11/12), 925-930; и Bongartz et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22(22), 4681-8.
[0300] В одном из вариантов осуществления молекулы миНК по изобретению и их составы или композиции вводят непосредственно или топически (например, локально) в дерму или фолликулы, как общеизвестно в данной области (см. например, Brand, 2001, Curr. Opin. Mol. Ther., 3, 244-8; Regnier et al., 1998, J. Drug Target, 5, 275-89; Kanikkannan, 2002, BioDrugs, 16, 339-47; Wraight et al., 2001, Pharmacol. Ther., 90, 89-104; и Preat and Dujardin, 2001, STP PharmaSciences, 11, 57-68). В одном из вариантов осуществления молекулы миНК по изобретению и их составы или композиции вводят непосредственно или топически с использованием водно-спиртового гелевого состава, содержащего спирт (например, этанол или изопропанол), воду и, необязательно, содержащего дополнительные средства, такие как изопропилмиристат и карбомер 980. В других вариантах осуществления миНК формулируют для топического введения в носовую полость. Топические препараты можно вводить посредством одного или нескольких нанесений в сутки на пораженную область; на областях кожи преимущественно можно использовать герметичную повязку. Непрерывной или длительной доставки можно достичь посредством адгезивной резервуарной системы.
[0301] В одном из вариантов осуществления молекулу миНК по изобретению вводят ионтофоретически, например, в конкретный орган или компартмент (например, глаз, задняя поверхность глаза, сердце, печень, почка, мочевой пузырь, предстательная железа, опухоль, ЦНС и т.д.). Неограничивающие примеры ионтофоретической доставки описаны, например, в WO 03/043689 и WO 03/030989, полностью включенных в качестве ссылки в настоящий документ.
[0302] В одном из вариантов осуществления молекулы миНК по изобретению и их составы или композиции вводят в легкое, как описано в настоящем документе и как общеизвестно в данной области. В другом варианте осуществления молекулы миНК по изобретению и их составы или композиции вводят в ткани и клетки легкого, как описано в патентных публикациях США №№ 2006/0062758; 2006/0014289 и 2004/0077540.
2. Аэрозоли и средства доставки
a. Аэрозольные составы
[0303] Композиции по настоящему изобретению, отдельно или в сочетании с другими подходящими компонентами, можно получать в аэрозольных составах (т.е., их можно "распылять") для введения посредством ингаляции (например, интраназально или интратрахеально) (см., Brigham et al., Am. J. Sci., 298:278 (1989)). Аэрозольные составы можно помещать в подходящие газы-вытеснители под давлением, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п.
[0304] В одном из вариантов осуществления молекулы миНК по изобретению и их составы вводят посредством легочной доставки, например, посредством ингаляции аэрозоля или высушенного распылением состава, вводимого посредством ингаляционного устройства или распылителя, обеспечивающих быстрый локальный захват молекул нуклеиновых кислот в соответствующих тканях легкого. Можно получать композиции твердых частиц, содержащие вдыхаемые высушенные частицы тонкоизмельченной композиции нуклеиновой кислоты посредством измельчения высушенных или лиофилизированных композиций нуклеиновых кислот, а затем пропуская тонкоизмельченную композицию, например, через фильтр 400 меш для разрушения или отделения больших агломератов. Композиция твердых частиц, содержащая композиции миНК по изобретению, необязательно может содержать дисперсант, служащий облегчению формирования аэрозоля, а также другие терапевтические соединения. Подходящий дисперсант представляет собой лактозу, которую можно смешивать с соединением нуклеиновой кислоты в любом подходящем отношении, таком как отношение 1 к 1 по массе.
[0305] Можно формулировать спрейные композиции, содержащие молекулы миНК или композиции по изобретению, например, в виде водных растворов или суспензий или в виде аэрозолей, доставляемых из контейнеров под давлением, таких как ингалятор мерных доз, с использованием подходящего сжиженного газа-вытеснителя. В одном из вариантов осуществления аэрозольные композиции по изобретению, подходящие для ингаляции, могут представлять собой суспензию или раствор и, как правило, содержат молекулу миНК, содержащую последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO:455 или формулы (A), и подходящий газ-вытеснитель, такой как фторуглерод или содержащий водород хлорфторуглерод или их смеси, в частности гидрофторалканы, особенно 1,1,1,2-тетрафторэтан, 1,1,1,2,3,3,3-гептафтор-н-пропан или их смесь. Аэрозольная композиция необязательно может содержать дополнительные эксципиенты состава, хорошо известные в данной области, такие как поверхностно-активные вещества. Неограничивающие примеры включают олеиновую кислоту, лецитин или олигомолочную кислоту или производные, такие, как описанные в WO94/21229 и WO98/34596, и сорастворители например, этанол. В одном из вариантов осуществления фармацевтический аэрозольный состав по изобретению содержит соединение по изобретению и фторуглерод или содержащий водород хлорфторуглерод или их смеси в качестве газа-вытеснителя, необязательно в сочетании с поверхностно-активным веществом и/или сорастворителем.
[0306] Аэрозольные составы по изобретению можно буферировать посредством добавления подходящих буферных средств.
[0307] Аэрозольные составы могут содержать необязательные добавки, включая консерванты, если состав получают не стерильным. Неограничивающие примеры включают метилгидроксибензоат, антиоксиданты, ароматизаторы, эфирные масла, буферные средства и эмульгаторы и другие поверхностно-активные вещества состава. В одном из вариантов осуществления для уменьшения разрушения и обеспечения безопасных биологически совместимых композиций нежидких суспензий частиц по изобретению (например, миНК и/или их составы LNP) используют фторуглеродные или перфторуглеродные носители. В другом варианте осуществления композицию по изобретению (например, миНК и/или их составы LNP), содержащую фторсодержащие химические соединения, которые являются бактериостатическими, таким образом, снижая потенциал для роста микроорганизмов в совместимых устройствах, доставляет устройство, содержащее распылитель.
[0308] Капсулы и картриджи, содержащие композицию по изобретению для применения в ингаляторе или инсуффляторе, например, из желатина, можно формулировать содержащими порошковую смесь для ингаляции соединения по изобретению и подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал. В одном из вариантов осуществления каждая капсула или картридж содержат молекулу миНК, содержащую последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO:455; или формулы (A), и один или несколько эксципиентов. В другом варианте осуществления соединение по изобретению можно предоставлять без эксципиентов, таких как лактоза
[0309] Аэрозольные композиции по настоящему изобретению можно вводить в дыхательную систему в виде состава, содержащего частицы пригодного для вдыхания размера, например, частицы достаточно малого размера, чтобы пройти при ингаляции через нос, рот и гортань и через бронхи и альвеолы легких. В основном, диапазон размеров пригодных для вдыхания частиц составляет приблизительно от 0,5 до 10 микрон. В одном из вариантов осуществления диапазон размеров частиц может составлять от 1 до 5 микрон. В другом варианте осуществления диапазон размеров частиц может составлять от 2 до 3 микрон. Частицы непригодного для вдыхания размера, которые содержаться в аэрозоле, имеют тенденцию откладываться в гортани и проглатыванию, и, таким образом, количество непригодных для вдыхания частиц в аэрозоле минимизируют. Для назального введения для обеспечения задержки в носовой полости предпочтителен размер частиц в диапазоне 10-500 мкм.
[0310] В некоторых вариантах осуществления композиции миНК по изобретению вводят топически в нос, например, для лечения ринита, посредством аэрозольных составов под давлением, водных составов, вводимых в нос посредством нагнетателя, создающего давление или посредством распыления. Подходящие составы содержат для этой цели воду в качестве разбавителя или носителя. В определенных вариантах осуществления водные составы для введения композиции по изобретению в легкое или нос можно предоставлять с общепринятыми эксципиентами, такими как буферные средства, модифицирующими тоничность средствами и т.п.
b. Устройства
[0311] Молекулы миНК по изобретению можно формулировать и доставлять в виде частиц и/или аэрозолей, как указано выше, и распределять из различных формирующих аэрозоли устройств, известных специалистам в данной области.
[0312] Аэрозоли жидких или нежидких частиц, содержащие молекулу миНК или состав по изобретению можно получать любыми подходящими способами, такими как с применением устройства, содержащего распылитель (например, см. патент США 4501729), такой как ультразвуковой или форсуночный распылитель.
[0313] Аэрозоли твердых частиц, содержащие молекулу миНК или состав по изобретению и поверхностно-активное вещество, можно получать с использованием любого генератора аэрозоля твердых частиц. Одним типом генератора аэрозоля твердых частиц, используемым с молекулами миНК по изобретению является инсуффлятор. Второй тип иллюстративного генератора аэрозоля включает ингалятор мерных доз ("MDI"). MDI, содержащие молекулы миНК или составы, указываемые в настоящем документе, можно получать известными в данной области способами (например, см. Byron, выше и WO96/32099).
[0314] Молекулы миНК также можно формулировать в виде жидкого состава для доставки из распределителя жидкостей, такого как описанные и проиллюстрированные в WO05/044354.
[0315] В определенных вариантах осуществления распылительные устройства используют в применениях для индивидуумов в сознании, произвольно дышащих индивидуумов и для индивидуумов с контролируемой вентиляцией легких всех возрастов. Распылительные устройства можно использовать для направленной топической и системной доставки лекарственного средства в легкое. В одном из вариантов осуществления устройство, содержащее распылитель, используют для доставки молекулы миНК или состава по изобретению локально в легкое или легочные ткани. В другом варианте осуществления устройство, содержащее распылитель, используют для системной доставки молекулы миНК или состава по изобретению.
H. Другие приложения/применения молекул миНК по изобретению
[0316] Молекулы миНК по изобретению также можно использовать для диагностических применений, исследовательских применений и/или производства лекарственных средств.
[0317] В одном из аспектов изобретение относится к способу диагностики заболевания, симптома или состояния у индивидуума, включающему введение индивидууму композиции по изобретению в условиях, подходящих для диагностики заболевания, симптома или состояния у индивидуума.
[0318] В одном из вариантов осуществления молекулы миНК по изобретению используют для отрицательной регуляции или ингибирования экспрессии белков HBV, образующихся на основе полиморфизма гаплотипов, которые связаны с симптомом, заболеванием или состоянием у индивидуума или организма. Анализ генов HBV или уровней белков или РНК HBV можно использовать для идентификации индивидуумов с такими полиморфизмами или индивидуумов с риском развития симптомов, состояний или заболеваний, описываемых в настоящем документе. Эти индивидуумы поддаются лечению, например, лечению молекулами миНК по изобретению и любой другой композицией, пригодной для лечения заболеваний, связанных с экспрессией гена-мишени. По существу анализ уровней белков или РНК HBV можно использовать для определения типа лечения или курса терапии у подлежащего лечению индивидуума. Мониторинг уровня белков (например, корового антигена гепатита B или HbcAg), поверхностного антигена HBV (например, HBsAg) или РНК HBV можно использовать для прогноза исхода лечения и для определения эффективности соединений и композиций, модулирующих уровень и/или активность определенных белков HBV, связанных с симптомом, нарушением, состоянием или заболеванием.
[0319] В другом варианте осуществления изобретение включает использование двухцепочечной нуклеиновой кислоты по изобретению для применения в производстве лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления лекарственное средство предназначено для применения при лечении инфекции HBV или состояния, которое опосредовано действием HBV. В одном из вариантов осуществления лекарственное средство предназначено для применения при лечении инфекции HBV. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство предназначено для применения при лечении злокачественной опухоли. В конкретном варианте осуществления соединения по настоящему изобретению пригодны для лечения печеночноклеточной карциномы. В одном из вариантов осуществления лекарственное средство предназначено для применения при лечении заболевания печени. В конкретном варианте осуществления соединения по настоящему изобретению пригодны для лечения цирроза печени.
[0320] В определенных вариантах осуществления миНК, где по меньшей мере одна цепь содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO:455; или формулы (A), предназначена для применения в способе лечения инфекции HBV.
[0321] В определенных вариантах осуществления миНК, где по меньшей мере одна цепь содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO:455; или формулы (A), предназначена для применения в способе лечения злокачественной опухоли.
[0322] В определенных вариантах осуществления миНК, где по меньшей мере одна цепь содержит последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO:455; или формулы (A), предназначена для применения в способе лечения заболевания печени.
I. Примеры
[0323] Далее изобретение будет проиллюстрировано приведенными ниже неограничивающими примерами. Специалисты в данной области легко определят множество некритических параметров, которые можно изменять или модифицировать с получением по существу таких же результатов.
Пример 1: Конструирование, синтез и идентификация миНК, активных против HBV
Синтез миНК HBV
[0324] Конструировали, синтезировали и оценивали на эффективность против экспрессии генов HBV ряд молекул миНК. Последовательности HBV конструировали и отбирали, отбирая все возможные последовательности из 19 нуклеотидов из генома серотипа adw2 HBV (номер доступа X02763), а затем сравнивая эти последовательности с геномными последовательностями 22 других подтипов HBV, представленных в таблице 7. Оставляли последовательности из 19 нуклеотидов с полными совпадениями со всеми 22 геномами или полными совпадениями с 21 из 22 геномов и 1 или 2 несоответствиями с оставшимся геномом. Эти последовательности подвергали стандартной фильтрации (например, отсутствие мишени в геноме человека, участки с одинаковым основанием, совпадения с затравочными последовательностями мкРНК человека) (также см. заявку США № 60/182605 о способах конструирования последовательностей и стандартных фильтрах). Оставшиеся кандидаты сортировали посредством собственной шкалы прогнозирования сайленсинг и выбирали определенные последовательности.
[0325] Первичными критериями для конструирования последовательностей HBV для миНК человека являлись (i) гомология между несколькими генотипами и серотипами HBV и (ii) высокие показатели эффективности, как определяли посредством собственного алгоритма. Выбранные последовательности-мишени миНК приведены в таблице 1a (последовательности-мишени). Последовательности смысловых и антисмысловых цепей миНК, соответствующие последовательностям-мишеням в таблице 1a приведены в таблице 1b. Различные химически модифицированные миНК, которые были синтезированы приведены в таблице 1c.
[0326] Для каждого олигонуклеотида последовательности-мишени, раздельно синтезировали две отдельных комплементарных цепи миНК с использованием твердофазного синтеза, затем раздельно очищали посредством твердофазная экстракции с обратной фазой (SPE). Комплементарные цепи отжигали с формированием двойной цепи (дуплекса) и помещали в желаемой концентрации и в выбранный буфер.
[0327] В кратком изложении, синтезировали одноцепочечные олигонуклеотиды с применением химии фосфорамидитов в автоматизированном твердофазном синтезаторе способами, общеизвестными в данной области (см. например, заявку США № 12/064014). Колонку для синтеза упаковывали твердой подложкой, дериватизированной первым нуклеозидным остатком (природным или модифицированным химически). Синтез начинали посредством детритилирования кислотолабильной 5'-O-диметокситритильной группы с высвобождением 5'-гидроксила. В колонку для синтеза одновременно вводили подходящим образом защищенный фосфорамидит и подходящий активатор в ацетонитриле, что приводило к связыванию амидита с 5'-гидроксилом. Затем колонку отмывали растворителем, таким как ацетонитрил. Через колонку прокачивали окисляющий раствор, такой как раствор йода, для окисления фосфитной триэфирной связи P(III) до ее фосфотриэфирного P(V) аналога. Непрореагировавшие 5'-гидроксильные группы кэпируют с использованием таких реагентов, как уксусный ангидрид в присутствии 2,6-лутидина и N-метилимидазола. Цикл удлинения возобновляли с этапа детритилирования для введения следующего фосфорамидита. Этот процесс повторяли до получения желаемой последовательности. Синтез завершали последней 5'-концевой защитной группой (тритил или 5'-O-диметокситритил).
[0328] После завершения синтеза твердую подложку и связанный олигонуклеотид сушили под давлением в атмосфере аргона или в вакууме. Добавляли водное основание, и смесь нагревали для проведения расщепления сукцинильной связи, удаления цианоэтилфосфатной защитной группы и снятия защиты экзоциклическим амином.
[0329] Для одиночных цепей, не содержащих рибонуклеотидов, проводили следующий процесс. После обработки твердой подложки водным основанием смесь фильтровали для отделения твердой подложки от неочищенного синтезируемого вещества со снятой защитой. Затем твердую подложку промывали водой, комбинированной с фильтратом. Полученный основной раствор обеспечивал удержание 5'-O-диметокситритильной группы в 5'-концевом положении (Trityl-ON).
[0330] Для одиночных цепей, содержащих рибонуклеотиды, проводили следующий процесс. После обработки твердой подложки водным основанием, смесь фильтровали для отделения твердой подложки от неочищенного синтезируемого вещества со снятой защитой. Затем твердую подложку промывали диметилсульфоксидом (DMSO), который объединяли с фильтратом. К смеси добавляли фторидный реагент, такой как триэтиламинтригидрофторид и раствор нагревали. Реакцию гасили подходящим буфером с получением раствора неочищенной одиночной цепи с 5'-O-диметокситритильной группой в последнем 5'-концевом положении.
[0331] Раствор Trityl-ON каждой неочищенной одиночной цепи очищали с применением хроматографической очистки, такой как очистка SPE RPC. Гидрофобный характер тритильной группы допускает удерживание желаемых полноразмерных олигонуклеотидов в более жестких условиях, чем нетритилированные укороченные неудачные последовательности. Неудачные последовательности селективно отмывали со смолы подходящим растворителем, таким как низкопроцентный ацетонитрил. Затем удерживаемые олигонуклеотиды детритилировали на колонке трифторуксусной кислотой с удалением кислотолабильной тритильной группы. Остаточную кислоту смывали с колонки и проводили солевой обмен и начинали конечное обессоливание материала. Полноразмерные олигонуклеотиды восстанавливали в очищенной форме водноорганическим растворителем. Затем конечный продукт анализировали на чистоту (ВЭЖХ), идентичность (Maldi-TOF MS) и выход (УФ A260). Олигонуклеотиды сушили посредством лиофилизации или конденсации в вакууме.
[0332] Отжиг: На основе анализа продукта высушенные олигонуклеотиды растворяли в подходящих буферах с последующим смешиванием равных молярных количеств (рассчитанных с использованием теоретического коэффициента экстинкции) смысловой и антисмысловой олигонуклеотидных цепей. Затем раствор анализировали на чистоту дуплекса хроматографическими способами и на желаемую конечную концентрацию. Если анализ свидетельствовал об избытке какой-либо из цепей, тогда проводили титрование дополнительной неизбыточной цепью до завершения формирования дуплексов. Когда анализ свидетельствовал о достижении намеченной чистоты продукта, получали материал, и он был готов к применению.
[0333] Ниже представлена таблица 1с (см. в графической части), демонстрирующая различные модифицированные миНК, синтезированные с использованием этого протокола или которые можно синтезировать с использованием этого протокола или известными в данной области способами.
Дополнительные этапы синтеза для коммерческого получения
[0334] Когда анализ свидетельствует о достижении намеченной чистоты продукта после этапа отжига, материал переносят в систему фильтрования тангенциальным потоком (TFF) для концентрирования и обессоливания, в отличие от проведения этого до этапа отжига.
[0335] Ультрафильтрация: Раствор отожженного продукта концентрируют с использованием системы TFF, содержащей мембрану с соответствующей границей пропускания молекулярной массы. После концентрирования раствор продукта обессоливают посредством диафильтрации с использованием воды Milli-Q до достижения такой проводимости фильтрата, как у воды.
[0336] Лиофилизация: Концентрированный раствор переносят в бутылку, быстро замораживают и присоединяют к лиофилизатору. Затем продукт лиофилизируют до порошка. Бутылку вынимают из лиофилизатора, и она готова к применению.
Протокол первичного скрининга (трансфекция в 96-луночном планшете)
Получение клеточной культуры:
[0337] Клеточную линию гепатомы человека, HepG2, или клеточную линию гепатомы мыши, Hepa1-6, выращивали в модифицированной среде Игла. Все среды для культивирования дополняли 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 Ед/мл пенициллина и 1% бикарбонатом натрия.
Трансфекция и скрининг
[0338] Получали плазмиду (pSiCheck-HepB-Partial, Ref ID: 1104), где в плазмиду pSiCheck2 (Promega, Madison, WI) по участкам XhoI/NotI ниже гена люциферазы Renilla встраивали частичный геном HBV. Затем экспрессировали мРНК транскрипт люциферазы Renilla выше транскрипта HBV, и, таким образом, миНК, направленные к геному HBV, которые вызывают нокдаун транскрипта HBV, также приводят к нокдауну транскрипта люциферазы Renilla. Уровень транскрипта люциферазы Renilla можно определять посредством прямого измерения степени активности люциферазы Renilla. Плазмида также экспрессирует ген люциферазы светлячка, на которую не влияют миНК HBV и которую можно использовать для нормализации данных для учета различных вариаций количества плазмиды, трансфицируемой в клетки.
[0339] Частичный геном HBV состоял из 2270 нт. вируса adw2 генотипа A HBV (нт. 158-2427, где участок EcoRI представляет собой нт.1).
Частичная последовательность ДНК HBV (SEQ ID N0:503):
[0340] Клетки высевали во все лунки обработанных тканевой культурой 96-луночных планшетов при конечном количестве 10000 клеток/лунку в 100 мкл подходящей среды для культивирования. Клетки после посева культивировали в течение ночи при 37°C в присутствии 5% CO2.
[0341] На следующие сутки получали комплексы, содержащие миНК, плазмиду pSiCheck-HepB-Partial и липофектамин (Invitrogen), как описано ниже. Получали раствор миНК и плазмиды, содержащий 500 нМ миНК и 30 нг/мкл плазмиды. Параллельно получали раствор липофектамина, разбавленный в 33 раза в OPTI-MEM. После инкубации раствора RNAiMax/OPTI-MEM при комнатной температуре в течение 5 мин, в каждую миНК совместно добавляли равный объем раствора миНК и раствора RNAiMax.
[0342] Смешивание приводило к раствору миНК/RNAiMax, где концентрация миНК составляла 60 нМ, а плазмиды - 3,6 нг/мкл. Этот раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. После инкубации 20 мкл раствора добавляли к каждой из соответствующих лунок. Конечная концентрация миНК в каждой лунке составляла 10 нМ и 0,6 нг/мкл для плазмиды. Конечный объем липофектамина в каждой лунке составлял 0,3 мкл.
[0343] Для исследований 12-точковой кривой доза-ответ, серийные разведения миНК представляли собой 6-кратное серийное разведение, начиная от 30 нМ, или 4-кратное серийное разведение, начиная от 40 нМ. Все трансфекции проводили в виде нескольких биологических повторений.
[0344] Время инкубация с комплексами липофектамин-миНК составляло 48 часов и между трансфекцией и сбором для скрининга и изучения кривой доза-ответ замены сред не проводили.
Люциферазные анализы
[0345] В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 50 мкл реагента Dual-Glo™ Firefly (Promega, Madison, WI), а затем планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем на планшетном спектрофотометре Wallac Envison с использованием протокола люциферазы считывали люминесценцию люциферазы светлячка. В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 50 мкл разведения 1:100 субстрата Stop & Glo (Promega, Madison, WI), а затем планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем на планшетном спектрофотометре Wallac Envison с использованием протокола люциферазы считывали люминесценцию люциферазы Renilla.
Расчеты
[0346] Уровень экспрессии представляющего интерес гена и % ингибирования экспрессии гена (%KD) рассчитывали с использованием сравнительного способа:
L_firefly = log 2 (люминесценция люциферазы светлячка)
L_renilla = log 2 (люминесценция люциферазы Renilla)
dL = L_firefly - L_renilla
ddL (log2(кратности изменения)) = dL_siRNA - dL_NTC
Относительный уровень экспрессии = 2-ddL
% KD = 100×(1-2-ddL)
[0347] Если не указано иначе, в качестве значения, от которого рассчитывали процент ингибирования (нокдауна) экспрессии гена, выбирали ненаправленную контрольную миНК, так как это является наиболее подходящим контролем.
[0348] Кроме того, исследовали только нормализованные данные, отражающие общее состояние здоровья клетки и качество плазмиды и миНК. Это проводили, исследуя на уровне двух различных мРНК в обрабатываемых клетках, где первая является мРНК-мишенью, а вторая является нормализующей мРНК. Это проводили, сравнивая log2 люминесценции люциферазы renilla (мишень) в каждой лунке относительно log2 люминесценции люциферазы светлячка (нормализатор) для всего планшета. Это обеспечивало исключение миНК, которые могут быть потенциально токсичными для клеток, а не только осуществлять нокдаун представляющего интерес гена.
[0349] Все расчеты IC50 проводили с использованием программного обеспечения R.2.9.2. Данные анализировали с использованием уравнения сигмовидной кривой доза-ответ (переменная крутизна) для простого связывания лиганда. Если не указано иначе, во всех расчетах процента ингибирования (нокдауна), расчет проводили относительно нормализованных уровней экспрессии представляющего интерес гена в образцах, обработанных ненаправленным контролем (Ctrl миНК).
Результаты:
[0350] МиНК HBV конструировали и синтезировали, как описано ранее. Различные миНК подвергали скринингу в клетках HepG2 или Hepa1-6, трансфицированных плазмидой pSiCheck-HepB-Partial. log2(кратности изменения) в уровнях экспрессии мРНК HBV после обработки различными модифицированными миНК HBV в клетках человека приведен в таблицах 3a и 3b. Каждый скрининг проводили после 48 часов способом анализа люциферазы.
[0351] Подмножество миНК из таблицы 3a и таблицы 3b с большим log2(кратности изменения) при первичном скрининге повторно помещали в один 96-луночный планшет в трех повторениях и снова подвергали скринингу в клетках HepG2 человека, трансфицированных pSiCheck_HepB-partial, для подтверждения нокдауна и для прямого сравнения миНК, которых синтезировали на различных планшетах. Данные обобщены в таблице 4. МиНК ранжировали на основе log2(кратности изменения) в уровнях экспрессии мРНК HBV.
[0352] Выбранные миНК из таблицы 4 с наибольшим рангом (наибольшее значение log2(кратности изменения)) дополнительно анализировали на эффективность и активность в клетках HepG2, трансфицированных плазмидой pSiCheck-HepB-partial. Для установления значения клетки обрабатывали миНК с серийными титрованными дозами 1:6. Potency50 представляет собой рассчитанную концентрацию трансфекции миНК, обеспечивающую 50% нокдаун мРНК-мишени. Результаты для этих миНК представлены в таблице 5.
[0353] Затем выбранные наиболее эффективные последовательности, идентифицированные в предыдущих скринингах на основе наибольшего значения ранга (наибольший log2(кратности изменения) и наименьших значений Potency50 из таблицы 5 синтезировали с различными химическими модификациями в сопровождающей и направляющей цепях. Затем эти миНК анализировали на эффективность и активность в клетках Hepa1-6, трансфицированных плазмидой pSiCheck-HepB-partial. Log2(кратности изменения) в уровнях экспрессии мРНК HBV после обработки различными модифицированными миНК HBV в клетках человека приведен в таблице 6a. Каждый скрининг проводили через 48 часов способом анализа люциферазы.
[0354] Подмножество миНК из таблицы 6a с наибольшим log2 (кратности изменения) в первичном скрининге повторно помещали в один 96-луночный планшет в трех повторениях и снова подвергали скринингу в клетках Heap1-6 мыши, трансфицированных pSiCheck_HepB-partial, для подтверждения нокдауна и для прямого сравнения миНК, которых синтезировали на различных планшетах. Данные обобщены в таблице 6b. МиНК ранжировали на основе log2(кратности изменения) в уровнях экспрессии мРНК HBV.
[0355] Выбранные миНК из таблицы 6b с наибольшим рангом (наибольшее значение log2(кратности изменения)) дополнительно анализировали на эффективность и активность в клетках Hepa1-6, трансфицированных плазмидой pSiCheck-HepB-partial. Для установления значения клетки обрабатывали миНК с серийными титрованными дозами 1:6. Potency50 представляет собой рассчитанную концентрацию трансфекции миНК, обеспечивающую 50% нокдаун мРНК-мишени. Результаты для этих миНК представлены в таблице 6c.
Пример 2: Определение стабильности миНК в сыворотке in vitro
[0356] миНК восстанавливают в виде маточного раствора от 50 мкМ до 100 мкМ H2O и добавляют в сыворотку человека, предварительно нагретую до 37°C до конечной концентрации 20 мкг/мл. Затем смесь инкубируют при 37°C в течение 0, 1 и 2 часов. В конце каждого периода времени реакции останавливают, смешивая с равным объемом буфера для лизиза-нанесения Phenomenex. Олигонуклеотиды очищают в 96-луночном формате посредством твердофазной экстракция Phenomenex и лиофилизируют до высушивания с использованием Labconco Triad Lyo-00417. Лиофилизированные образцы восстанавливают в 150 мкл 1 мМ ЭДТА, полученной с использованием H2O без РНКаз. Затем растворы образцов разбавляют в 5 раз 1 мМ ЭДТА для анализа посредством жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS) на ThermoFisher Orbitrap. Сывороточные метаболиты миНК определяют на основе измеренных молекулярных масс.
Пример 3: Тестирование индукции цитокинов
[0357] Для оценки иммуностимулирующего действия различных миНК по изобретению, загружаемых в липидные наночастицы (например, DLinDMA/холестерин/S-PEG-C-DMA/DSPC в отношении 40/48/2/10), мышам C57B1/6 дозировали одну дозу 3 мг/кг сформулированных в LNP миНК посредством инъекции в хвостовую вену. Образцы сыворотки или плазмы собирали на 3 и 24 час после дозирования. Уровни цитокинов и хемокинов в этих образцах измеряют с использованием чипа Searchlight IR Cytokine Array из Aushon Biosciences по инструкции производителя. Измеряемыми цитокинами и хемокинами являются IL-1α, IL-1β, IL-6, KC, IL-10, IFNγ, TNF, GMCSF, MIP-1β, MCP-1/JE и RANTES.
Пример 4: Исследования эффективности у мыши
[0358] Исследования эффективности in vivo проводят у мышей SCID с гуманизированной печенью, которых затем инфицировали HBV. Трансгенным мышам с поврежденной печенью инъецируют первичные гепатоциты человека, обеспечивающие репопуляцию печени мыши гепатоцитов человека до уровня 70%. Затем мышам инокулируют изоляты HBV человека. Инфицированным мышам через хвостовую вену в/в дозируют инъекции с инкапсулированными в LNP миНК или контрольный носитель с использованием однократной дозы 3 мг/кг. Действие миНК на вирусную нагрузку определяют, получая образец сыворотки в различные моменты времени после дозирования, а затем измеряя уровень циркулирующих геномов HBV в сыворотке посредством кПЦР.
Пример 5: Фармакодинамическое исследование у не являющихся человеком приматов
[0359] Инфицированных HBV шимпанзе дозировали одной дозой 2,5 мг/кг нагруженных миНК липидных наночастиц посредством внутривенной инфузии. Для контроля вирусной нагрузки HBV, в различные моменты времени перед и после дозирования собирают образцы сыворотки и определяют уровень геномов HBV посредством кПЦР. Во всех способах соблюдают правила, изложенные в USDA Animal Welfare Act (9 CFR, Parts 1, 2 and 3) и условиях, определенные в The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (ILAR publication, 1996, National Academy Press).
Пример 6: Составы LNP с миНК
A. Описание основного способа LNP для составов DLinDMA:
[0360] Липидные наночастицы получают способом сталкивающихся струй. Частицы формируют, смешивая липиды, растворенные в спирту с миНК, растворенной в цитратном буфере. Коэффициент смешения липидов с миНК определяют как 45-55% липида и 65-45% миНК. Раствор липидов содержит катионный липид, вспомогательный липид (холестерин), липид PEG (например, PEG-C-DMA, PEG-DMG) и DSPC в концентрации 5-15 мг/мл, предпочтительно 9-12 мг/мл в спирту (например, этаноле). Отношение липидов имеет диапазон молярного процента 25-98 для катионного липида, предпочтительно 35-65, вспомогательный липид имеет диапазон молярного процента 0-75, предпочтительно 30-50, липид PEG имеет диапазон молярного процента 1-15, предпочтительно 1-6, и DSPC имеет диапазон молярного процента 0-15, предпочтительно 0-12. Раствор миНК содержит одну или несколько последовательностей миНК в диапазоне концентраций от 0,3 до 1,0 мг/мл, предпочтительно 0,3-0,9 мг/мл в буферизуемом цитратом натрия солевом растворе с pH в диапазоне 3,5-5. Две жидкости нагревают до температуры в диапазоне 15-40°C, предпочтительно 30-40°C, а затем смешивают в смесителе со сталкивающимися струями, сразу же формируя LNP. ID T-образного профиля имеет диапазон от 0,25 до 1,0 мм и общую скорость потока от 10-600 мл/минуту. Комбинация скорости потока и ID системы трубок имеет эффект контроля размера частиц в LNP от 30 до 200 нм. Затем раствор смешивают с буферным раствором при более высоком pH с коэффициентом смешения в диапазоне от 1:1 до 1:3 об.:об., но, предпочтительно 1:2 об.:об. Этот буферный раствор находится при температуре в диапазоне 15-40°C, предпочтительно 30-40°C. Смешанные LNP перед стадией анионообменной фильтрации выдерживают в течение периода от 30 минут до 2 часов. Температура при инкубации находится в диапазоне 15-40°C, предпочтительно 30-40°C. После инкубации раствор фильтруют через 0,8 мкм фильтр, включая стадию анионообменного разделения. В этом процессе используют ID систем трубок в диапазоне от ID 1 мм до ID 5 мм и скорость потока от 10 до 2000 мл/минуту. LNP концентрируют и подвергают диафильтрации способом ультрафильтрации, где удаляют спирт и цитратный буфер заменяют на конечный буферный раствор, такой как фосфатно-солевой буфер. В процессе ультрафильтрации используют формат фильтрования тангенциальным потоком (TFF). В этом процессе используют мембрану с номинальным диапазоном порога молекулярной массы 30-500 кДа. Формат мембраны представляет собой кассету из полого волокна или слоистую листовую кассету. Процессы TFF с подходящим порогом молекулярной массы удерживает LNP в концентрате, а фильтрат или пермеат содержат стоки спирта; цитратного буфера и конечного буфера. Процесс TFF представляет собой многостадийный процесс от исходной концентрации до концентрации миНК 1-3 мг/мл. После концентрирования, раствор LNP подвергают диафильтрации против конечного буфера для 10-20 объемов для удаления спирта и проведения замены буфера. Затем материал дополнительно концентрируют в 1-3 раза. Конечные стадии процесса получения LNP представляют собой стерильное фильтрование концентрированного раствора LNP и помещение продукта во флаконы.
Способ анализа:
1) Концентрация миНК
[0361] Концентрации дуплексов миНК определяют посредством строгой анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SAX-HPLS) с использованием системы Waters 2695 Alliance (Water Corporation, Milford MA) с PDA детектором 2996. LNP, иначе обозначаемые как доставляющие РНКи носители (RDV), обрабатывают 0,5% Triton X-100 для высвобождения всей миНК и анализируют посредством разделения с SAX с применением колонки Dionex BioLC DNAPac PA 200 (4×250 мм) с детекцией в УФ при 254 нм. Подвижная фаза состоит из A: 25 мМ NaClO4, 10 мМ Tris, 20% EtOH, pH 7,0 и B: 250 мМ NaClO4, 10 мМ Tris, 20% EtOH, pH 7,0 с линейным градиентом 0-15 мин и скоростью потока 1 мл/минута. Количество миНК определяют, сравнивая со стандартной кривой миНК.
2) Коэффициент инкапсуляции
[0362] Для определения количества РНК для контроля коэффициента инкапсуляции RDV используют флуоресцентный реагент SYBR Gold. Для определения количества свободной миНК и общей миНК используют RDV с Triton X-100 или без него. Анализ проводят с применением спектрофотометра для микропланшетов SpectraMax M5e от Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Образцы возбуждают при 485 нм, а флуоресценцию измеряют при 530 нм. Количество миНК определяют, сравнивая со стандартной кривой миНК.
Коэффициент инкапсуляции = (1-свободная миНК/общая миНК)×100%
3) Размер и полидисперсность частиц
[0363] RDV, содержащие 1 мкг миНК разбавляют до конечного объема 3 мл 1× PBS. Размер частиц и полидисперсность образцов измеряют способом динамического светорассеяния с использованием устройства ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY). Интенсивность рассеянного излучения измеряют лазером He-Ne при 25°C с углом светорассеяния 90°.
4) Анализ дзета-потенциала
[0364] RDV, содержащие 1 мкг миНК, разбавляют до конечного объема 2 мл 1 мМ буфером Tris (pH 7,4). Электрофоретическую подвижность образцов определяют с использованием устройства ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY) с электродом и He-Ne лазером в качестве источника света. В расчете дзета-потенциала принимают предел Смолуховского.
5) Анализ липидов
[0365] Концентрации индивидуальных липидов определяют посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC) с использованием системы Waters 2695 Alliance (Water Corporation, Milford MA) c аэрозольным детектором с коронным разрядом (CAD) (ESA Biosciences, Inc, Chelmsford, MA). Индивидуальные липиды в RDV анализируют с использованием колонки Agilent Zorbax SB-C18 (50×4,6 мм, размер частиц 1,8 мкм) с CAD при 60°C. Подвижная фаза состоит из A: 0,1% TFA в H2O, и B: 0,1% TFA в IPA. Градиент изменяется от 60% подвижной фазы A и 40% подвижной фазы B на момент времени 0 до 40% подвижной фазы A и 60% подвижной фазы B на 1,00 мин; 40% подвижной фазы A и 60% подвижной фазы B от 1,00 до 5,00 мин; 40% подвижной фазы A и 60% подвижной фазы B от 5,00 мин до 25% подвижной фазы A и 75% подвижной фазы B на 10,00 мин; 25% подвижной фазы A и 75% подвижной фазы B от 10,00 мин до 5% подвижной фазы A и 95% подвижной фазы B на 15,00 мин; и 5% подвижной фазы A и 95% подвижной фазы B от 15,00 до 60% подвижной фазы A и 40% подвижной фазы B на 20,00 мин со скоростью потока 1 мл/минуту. Концентрацию индивидуальных липидов определяют посредством сравнения со стандартной кривой со всеми липидными компонентами в RDV с подбором кривой второго порядка. Молярную долю каждого липида рассчитывают на основе его молекулярной массы.
B. Общий способ формулирования для CLinDMA/холестерина/PEG-DMG при соотношении 71,9:20,2:7,9.
[0366] Растворы миНК получали, растворяя миНК в 25 мМ цитратном буфере (pH 4,0) при концентрации 0,8 мг/мл. Растворы липидов получали, растворяя смесь 2S-октил-ClinDMA, холестерина и PEG-DMG при соотношении 71,9:20,2:7,9 в абсолютном этаноле при концентрации приблизительно 10 мг/мл. В смешивающий T-образный коннектор при одинаковой скорости потока двумя шприцевыми насосами вводят равные объемы миНК и растворов липидов. Получаемую молочно-белую смесь собирали в стерильные бутылки. Затем эту смесь медленно разбавляли равным объемом цитратного буфера и фильтровали через эксклюзионный картридж с полым волокном для удаления из смеси любой свободной миНК. Использовали ультрафильтрацию против цитратного буфера (pH 4,0) для удаления этанола (тестовый карандаш из ALCO-скрининга) и против PBS (pH 7,4) для замены буфера. Конечные LNP получали посредством концентрирования до желаемого объема и стерильно фильтровали через 0,2 мм фильтр. Полученные LNP характеризовали на основе размера частиц, содержания спирта, общего содержания липидов, инкапсулированной нуклеиновой кислоты и общей концентрации нуклеиновой кислоты.
C. Общее получение LNP для различных составов из таблицы 10
[0367] Суспензии наночастиц миНК в таблице 10 получали, растворяя миНК и/или молекулы носителя в 20 мМ буфере цитрата натрия (pH 5,0) в концентрации приблизительно 0,40 мг/мл. Растворы липидов получали, растворяя смесь катионного липида (например, (13Z,16Z)-N,N-диметил-3-нонилдокоза-13,16-диен-1-амина, см. структуру в таблице 11), DSPC, холестерин и PEG-DMG (отношения приведены в таблице 10) в абсолютном этаноле при концентрации приблизительно 8 мг/мл. Отношение азота к фосфату приблизительно соответствовало 6:1.
[0368] В смешивающий T-образный коннектор двумя насосами FPLC при одинаковой скорости потока вводили приблизительно одинаковые объемы миНК/носителя и растворов липидов. Для коррекции до желаемого размера частиц использовали возвратный клапан. Полученную молочно-белую смесь собирали в стерильную стеклянную бутылку. Затем эту смесь разбавляли равным объемом цитратного буфера с последующим равным объемом PBS (pH 7,4) и фильтровали через ионообменную мембрану для удаления любых свободных миНК/носителя в смеси. Для удаления этанола и замены буфера использовали ультрафильтрацию против PBS (7,4)). Конечные LNP получали, концентрируя до желаемого объема, и стерильно фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Полученные LNP характеризовали на основе размера частиц, дзета-потенциала, содержания спирта, общего содержания липидов, инкапсулированной нуклеиновой кислоты и общей концентрации нуклеиновой кислоты.
Способ производства LNP
[0369] В неограничивающем примере LNP получали в большом объеме, как описано ниже. Процесс состоит из (1) получения раствора липидов; (2) получения раствора миНК/носителя; (3) смешивание/формирование частиц; (4) инкубация; (5) разбавление; (6) ультрафильтрация и концентрация.
1. Получение раствора липидов
[0370] В 2 л стеклянных бутылках для реагентов и в мерных цилиндрах удаляли пирогены. Липиды нагревали до комнатной температуры. В стеклянные бутылки для реагентов пипеткой переносили 8,0 г (13Z,16Z)-N,N-диметил-3-нонилдокоза-13,16-диен-1-амин и добавляли 1,2 г DSPC, 3,5 г холестерина, 0,9 г PEG-DMG. К смеси добавляют 1 л этанола. Бутылки для реагентов помещали в нагреваемую водяную баню при температуре, не превосходящей 50°C. Липидную суспензию перемешивали магнитной мешалкой. В суспензию через одно горло круглодонной колбы с закрытым адаптером помещали термопару. Суспензию нагревали при 30-40°C до тех пор, пока она не становилась прозрачной. Раствору позволяли охлаждаться до комнатной температуры.
2. Получение раствора миНК/носитель
[0371] В стерильный контейнер (бутылка с повторным хранением) навешивал 0,4 г умноженные на водный корректирующий фактор (приблизительно 1,2) порошка миНК. МиНК переносили в лишенную пирогенов 2 л стеклянную бутылку для реагентов. Взвешенный контейнер 3 раза промывали цитратным буфером (20 мМ, pH 5,0) и смывы помещали в 2 л стеклянную бутылку, доводя количество цитратным буфером до 1 л. Концентрацию раствора миНК определяли с использованием УФ-спектрометра приведенным ниже способом. Из раствора отбирали 20 мкл, разбавляли в 50 раз до 1000 мкл и записывали показания УФ-спектрометра при A260 нм после обнуления цитратным буфером. Это повторяли. Следует отметить, что если показания для двух образцов согласуются, можно получать среднее и на основе коэффициентов экстинкции миНК рассчитывать концентрации. Если конечная концентрация находится вне диапазона 0,40±0,01 мг/мл, концентрацию можно доводить, добавляя больше порошка миНК/носителя или добавляя больше цитратного буфера. Если применимо, этот процесс можно повторять для второй миНК.
[0372] Когда раствор миНК/носителя вместо смеси двух или более дуплексов миНК и/или носителей содержал один дуплекс миНК, тогда миНК/носитель растворяли в 20 мМ цитратном буфере (pH 5,0) с получением конечной концентрации 0,4 мг/мл.
[0373] Затем растворы липидов и этанола стерильно фильтровали через стерильный фильтр Pall Acropak 20 0,8/0,2 мкм PN 12203 в стеклянный сосуд без пирогенов с использованием перистальтического насоса Master Flex модели 7520-40 с предоставлением стерильного исходное вещество для процесса инкапсуляции. Процесс фильтрации проводили в масштабе 80 мл с площадью мембраны 20 см2. Скорость потока составляла 280 мл/минуту. Этот процесс можно масштабировать, увеличивая диаметр трубок и площадь фильтрации.
3. Формирование частиц - стадия смешивания
[0374] С использованием приводимого в движение шприцом двухцилиндрового насоса (Harvard 33 Twin Syringe) в T-образном смесителе с ID 0,5 мм (Стадия смешивания I) при равных или почти равных скоростях потока смешивали стерильный раствор липидов/этанола и стерильные растворы миНК/носитель или смесь миНК/носителей/цитратный буфер (20 мМ цитрат буфер, pH 5,0). Полученная на выходе суспензия LNP содержала 40-50 об.% этанолаа. Для получения выходной суспензии с 45 об.% этанол, стерильный раствор липид/этанол и стерильные растворы миНК/носитель или смесь миНК/носителей/цитратный буфер смешивали при скорости потока 54 мл/мин и 66 мл/мин, соответственно, так, что общая скорость потока в смешивающем выходном отверстии составляла 120 мл/мин.
4. Разведение
[0375] Выходной поток стадии смешивания I непосредственно направляли в T-образный смеситель с ID 4 мм (Стадия смешивания II), где его разбавляли буферным раствором при более высоком pH (20 мМ цитрат натрия, 300 мМ хлорид натрия, pH 6,0) в отношении 1:1 об.:об.%. Этот буферный раствор находился при температуре в диапазоне 30-40°C, и его доставляли в T-образный смеситель с ID 4 мм посредством перистальтического насоса (Cole Parmer MasterFlex L/S 600 об/мин) при скорости потока 120 мл/мин.
[0376] Выходной поток после стадии смешивания II непосредственно направляли в T-образный смеситель с ID 6 мм (Стадия смешивания III), где его разбавляли буферным раствором при более высоком pH (PBS, pH 7,4) в отношении 1:1 об.:об.%. Этот буферный раствор находился при температуре в диапазоне 15-25°C, и его доставляли в T-образный смеситель с ID 6 мм посредством перистальтического насоса (Cole Parmer MasterFlex L/S 600 об/мин) при скорости потока 240 мл/мин.
5. Инкубация и удаление свободных миНК
[0377] Выходной поток после стадии смешивания III после смешивания удерживали в течение 30 минут инкубации. Инкубацию проводили при температуре 35-40°C и суспензию в ходе процесса предохраняли от света. После инкубации свободные (неинкапсулированные) миНК удаляли посредством анионного обмена с использованием хроматографических фильтров Mustang Q (капсулы). Перед использованием хроматографические фильтры предварительно обрабатывали, последовательно промывая 1 н. NaOH, 1M NaCl и конечным раствором 12,5 об.% этанола в PBS. Проверяли pH конечной промывки для обеспечения pH <8. Затем поток инкубируемых LNP фильтровали через фильтры Mustang Q посредством перистальтического насоса (Cole Parmer MasterFlex L/S 600 об/мин) при скорости потока приблизительно 100 мл/мин. Фильтрованный поток направляли в стерильный стеклянный контейнер для ультрафильтрации и концентрирования, как описано ниже.
6. Ультрафильтрация, концентрирование и стерильное фильтрование
[0378] Процесс ультрафильтрации представляет собой временной процесс и необходимо тщательно контролировать скорости потока. Он представляет собой двухстадийный процесс; сначала проводят стадию концентрации, добавляя разбавленный материал и концентрируя приблизительно в 8 раз, с концентрацией миНК приблизительно 0,3-0,6 мг/мл.
[0379] На первой стадии кольцевой штатив с установленной мембраной для ультрафильтрации 100 кДа PES (Spectrum Labs) подсоединяли к перистальтическому насосу (Spectrum KrosFloII System). В резервуар добавляли 9,2 л стерильной дистиллированной воды; 3 л сливали, а остаток фильтровали через пермеат в слив. В резервуар добавляли 5,3 л 0,25 н. гидроксида натрия с 1,5 л сливом и 3,1 л, пропускаемых через пермеат в слив. Оставшийся гидроксид натрия удерживали в системе для очистки (по меньшей мере 10 минут), а затем насос опустошали. В резервуар добавляли 9,2 л 70% (об./об.) изопропилового спирта с 1,5 л сливом и остатком, фильтруемым через пермеат в слив. Добавляли 6 л кондиционирующего буфера (12,5% этанол в фосфатно-солевом буфере) с 1,5 л сливом и остатком, фильтруемым через пермеат до приобретения сливом нейтрального pH (7-8). Записывали значение потока через мембрану, и затем насос опустошали.
[0380] Разбавленный раствор LNP помещали в резервуар до отметки 1,1 л. Насос включали на 2,3 л/мин. После 5 минут рециркуляции включали насос пермеата при 62,5 мл/мин, и уровень жидкости в резервуаре являлся постоянным приблизительно при 950 мл. Разбавленный раствор LNP концентрировали от 9,8 л до 1,1 л в течение 140 минут и, когда весь разбавленный раствор LNP переносили в резервуар насос, ставили на паузу.
[0381] Вторая стадия представляла собой стадию диафильтрации с заменой буфера этанол/вода на фосфатно-солевой буфер. На этой стадии использовали приблизительно 10-20 объемов диафильтрации фосфатно-солевого буфера. После диафильтрации проводили второе концентрирование с 3-кратным концентрированием LNP в 3 раза приблизительно до 1-1,5 мг/мл миРНК. Концентрированную суспензию собирали в стерильные, пластиковые бутылки PETG. Затем конечную суспензию фильтровали последовательно через фильтры PES Pall 0,45 мкм PES и Pall 0,2 мкм для конечной стерилизации до заполнения флаконов.
[0382] Полученные LNP характеризовали в отношении размера частиц, дзета-потенциала, содержания спирта, общего содержания липидов, инкапсулированной нуклеиновой кислоты и общей концентрации нуклеиновой кислоты.
D. Синтез новых катионных липидов
[0383] Синтез новых катионных липидов представляет собой линейный процесс, начиная от липидной кислоты (i). Связывание с N,O-диметилгидроксиламином дает амид Вайнреба ii. Добавление по Гриньяру позволяет получать кетон iii. Катализируемое титаном восстановительное аминирование позволяет получать конечные продукты типа iv.
ОБЩАЯ СХЕМА 1
[0384] Синтез гомологизированных одним атомом углерода катионных липидов v представляет собой линейный процесс, начинающийся от липидного кетона (iii). Преобразование кетона в нитрил (iv) проводят посредством обработки TOSMIC и трет-бутоксидом калия. Восстановление нитрила до первичного амина с последующим восстановительным аминированием обеспечивает конечные катионные липиды v.
ОБЩАЯ СХЕМА 2
[0385] Синтез гомологизированных двумя атомами углерода катионных липидов viii представляет собой линейный процесс, начинающийся от липидного кетона (iii). Преобразование кетона в α,β-ненасыщенный амид vi проводят в условиях Петерсона. Восстановление конъюгата из α,β-ненасыщенности проводят с использованием LS-селектрида с получением амида vii. Восстановление амида гидридом лития алюминия обеспечивает катионные липиды viii.
ОБЩАЯ СХЕМА 3
[0386] Содержащие циклопропил липиды получают в соответствии с общей схемой 4. Ненасыщенные амиды Вайнреба ii помещают в условия циклопропанирования Симмонса-Смита с получением содержащих циклопропил амидов Вайнреба ix. Их переносят на конечные продукты, как описано в общих схемах 1-3.
ОБЩАЯ СХЕМА 4
[0387] Синтез катионных липидов с аллиламинами xv представляет собой линейный процесс, начиная от альдегида x. Добавление трет-бутилацетата приводит к получению сложного β-гидроксиэфира xi. Преобразование гидроксильной функциональной группы в группу фтора с последующей обработкой кислотой позволяет получить β-фторкислоту xii. Преобразование кислоты в амид Вайнреба с последующим добавлением по Гриньяру позволяет получить β-фторкетон xiv. Восстановительное аминирование приводит к одновременному отщеплению с получением желаемого аллиламина xv.
ОБЩАЯ СХЕМА 5
20,23-нонакозадиен-10-амин, N,N-диметил-, (20Z,23Z) (Соединение 1)
[0388] 11,14-Эйкозандиеновую кислоту, (11Z,14Z)- (50 г, 162 ммоль), гидрохлорид N,O-диметилгидроксиламина (31,6 г, 324 ммоль), HOAt (44,1 г, 324 ммоль), Et3N (45,2 мл, 324 ммоль) и EDC (62,1 г, 324 ммоль) смешивали в DCM (810 мл) и перемешивали в течение ночи при температуре окружающей среды. Затем реакционную смесь отмывали 5×700 мл воды, затем отмывали 1×600 мл 1 M NaOH, сушили сульфатом натрия, фильтровали через целит и выпаривали с получением 53,06 г (93%) 11,14-эйкозадиенамида, N-метокси-N-метил-, (11Z,14Z) в качестве прозрачного золотистого масла.1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,35 (м, 4H), 3,68 (с, 3H), 3,18 (с, 3H), 2,77 (м, 2H), 2,41 (т, J=7 Гц, 2H), 2,05 (м, 4H), 1,63 (м, 2H), 1,40-1,26 (м, 18H), 0,89 (т, J=7 Гц, 3H).
[0389] 11,14-Эйкозадиенамид, N-метокси-N-метил-, (11Z,14Z)-1 (4 г, 11,38 ммоль) растворяли в сухом THF (50,0 мл) в 250 мл колбе, затем в атмосфере азота добавляли 1 M бромид нонилмагния (22,76 мл, 22,76 ммоль) при температуре окружающей среды. Через 10 мин реакционную смесь медленно гасили избытком насыщенного водного NH4Cl. Реакционную смесь промывали в делительную воронку гексаном и водой, перемешивали, нижний водный слой удаляли, верхний слой сушили сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали с получением неочищенного кетона в виде золотистого масла. К указанному выше неочищенному кетону добавляли диметиламин (2 M в THF) (14,22 мл, 28,4 ммоль) с последующим Ti(O-i-Pr)4 (6,67 мл, 22,76 ммоль) и оставляли перемешиваться в течение ночи. На следующие сутки добавляли EtOH (50 мл) с последующим NaBH4 (0,646 г, 17,07 ммоль). Через 5 минут перемешивания всю реакционную смесь непосредственно наносили на колонку с 40 г диоксида кремния, которая находилась, совмещенную с колонкой с 330 г диоксида кремния. Элюировали 10 мин 100% DCM, затем 30 мин 0-15% MeOH/DCM, собирали 20,23-нонакозадиен-10-амин, N,N-диметил-, (20Z,23Z) (1) (2,45 г, 5,47 ммоль, выход 48,1%) в виде слабозолотистого масла.1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,35 (м, 4H), 2,78 (м, 2H), 2,23 (м, 1H), 2,21 (с, 6H), 2,05 (м, 4H), 1,45-1,16 (м, 38H), 0,89 (м, 6H). Вычисленная HRMS для C31H61N - 448,4877, найденная - 448,4872.
[0390] Соединения 2-30 являются новыми катионными липидами, и их получали по общей схеме 1 выше.
(12Z,15Z)-N,N-диметил-2-нонилгеникоза-12,15-диен-1-амин (Соединение 31)
[0391] Раствор кетона iii (4,0 г, 9,55 ммоль), TOSMIC (2,4 г, 12,4 ммоль) в диметоксиэтане (45 мл) охлаждали до 0°C и обрабатывали трет-бутоксидом калия (19,1 ммоль, 19,1 мл 1M раствора в tBuOH). Через 90 минут реакционную смесь распределяли между гексаном и водой. Органические фракции отмывали водой, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали в вакууме. Этот материал очищали посредством флэш-хроматографии (0-5% EtOAc/гексаны) с получением желаемого продукта (содержащего ~20% s.m.). Эту смесь применяли на следующей стадии как есть. LC/MS (M+H)=430,6.
[0392] Гидрид лития алюминия (23,9 ммоль, 23,9 мл 1M раствора в THF) добавляли непосредственно к нитрилу iv (3,42 г, 8 ммоль) при температуре окружающей среды и реакционную смесь перемешивали в течение 20 минут. Реакционную смесь разбавляли 100 мл THF, охлаждали до 0°C и осторожно гасили раствором декагидрата сульфата натрия. Твердые вещества отфильтровали и промывали THF. Фильтрат выпаривали в вакууме и непосредственно применяли неочищенными на следующей стадии. LC/MS (M+H)=434,6.
[0393] Раствор первичного амина (3,45 г, 6,2 ммоль) в дихлорэтане (100 мл) обрабатывали формальдегидом (1,6 мл, 21,7 ммоль) с последующим триацетоксиборгидридом натрия (6,6 г, 31 ммоль). Через 5 минут реакционную смесь распределяли между дихлорметаном и 1 н. NaOH. Органические фракции сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали в вакууме. Неочищенную смесь очищали посредством препаративной хроматографии с обращенной фазой (колонка C8) с получением (12Z, 15Z)-N,N-диметил-2-нонилгеникоза-12,15-диен-1-амина. Вычисленная HRMS - 462,5033, найденная - 462,5026.1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,35 (м, 4H), 2,78 (2H, т, J=5,6 Гц), 2,18 (с, 6H), 2,05 (м, 6H), 1,3 (м, 39H), 0,89 (м, 6H).
(13Z,16Z)-N,N-диметил-3-нонилдокоза-13,16-диен-1-амин (Соединение 32)
[0394] Силиламидный реагент Петерсона (3,1 г, 16,7 ммоль) растворяли в THF (35 мл) и охлаждали до -63°C. К этому раствору добавляли nBuLi (16,7 ммоль, 6,7 мл 2,5M раствора). Реакционную смесь нагревали до температуры окружающей среды в течение 30 минут. Во второй колбе в THF (25 мл) растворяли кетон (5,0 г, 11,9 ммоль). Реагент Петерсона переносили в раствор кетона при -60°C. Реакционную смесь нагревали до -40°C в течение 1 часа, затем нагревали до 0°C в течение 30 минут. Реакцию гасили бикарбонатом натрия, разбавляли дополнительной водой и распределяли между водой/гексанами. Органические фракции отмывали насыщенным солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали в вакууме. Очистка посредством флэш-хроматографии (0-40% MTBE/гексаны) приводила к α,β-ненасыщенному амиду vi.1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,75 (с, 1H), 5,36 (м, 4H), 3,01 (с, 3H), 2,99 (с, 3H), 2,78 (т, 2H), 2,28 (т, 2H), 2,05 (м, 6H), 1,35 (м, 34H), 0,89 (м, 6H).
[0395] α,β-Ненасыщенный амид vi (1 г, 2,1 ммоль) и LS-Селектрид (4,1 ммоль, 4,1 мл 1M раствора) объединяли в закрытой пробирке и нагревали до 60°C в течение 24 часов. Реакционную смесь охлаждали до температуры окружающей среды и распределяли между раствором хлорида аммония и гептаном. Органические фракции сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали в вакууме с получением амида vii. Это промежуточное соединение непосредственно применяли неочищенным в следующей реакции.
[0396] К раствору амида vii (2,85 г, 5,8 ммоль) добавляли гидрид лития алюминия (8,7 ммоль, 8,7 мл 1M раствора). Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 10 минут, затем гасили медленным добавлением раствора декагидрата сульфата натрия раствор. Твердые вещества фильтровали и отмывали THF, и фильтрат выпаривали в вакууме. Неочищенную смесь очищали посредством препаративной хроматографии с обращенной фазой (колонка C8) с получением (13Z,16Z)-N,N-диметил-3-нонилдокоза-13,16-диен-1-амина (Соединение 32) в виде масла. Вычисленная HRMS (M+H) - 476,5190, найденная - 476,5189.1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,37 (м, 4H), 2,78 (т, 2H), 2,42 (м, 8H), 2,05 (кв, 4H), 1,28 (м, 41H), 0,89 (м, 6H).
N,N-диметил-1-(2-октилциклопропил)гептадекан-8-амин (Соединение 33)
[0397] К раствору олеиновой кислоты (1 г, 3,5 ммоль) в DCM (500 мл), охлажденному до 0°C, добавляли CDI (0,63 г, 3,9 ммоль). Реакционную смесь перед охлаждением до 0°C и обработкой сначала триэтиламином (0,39 г, 3,9 ммоль), а затем гидрохлоридом диметилгидроксиламина (0,38 г, 3,9 ммоль) нагревали до температуры окружающей среды в течение 30 минут. Через 1 час реакционную смесь распределяли между водой и гептаном. Органические фракции сушили над сульфатом магния, фильтровали и выпаривали в вакууме с получением неочищенного амида Вайнреба ii, который непосредственно применяли в следующей реакции.
[0398] Раствор диэтилцинка (70,3 ммоль, 70,3 мл 1M раствора) в дихлорметане (130 мл) охлаждали до -1°C и капельно обрабатывали TFA (8,0 г, 70,3 ммоль). Через 30 минут добавляли дийодометан (18,8 г, 70,3 ммоль), и эту смесь выдерживали в течение 30 минут в ледяной бане. К этому раствору добавляли амид Вайнреба ii (7,6 г, 23,4 ммоль). Реакционную смесь нагревали до температуры окружающей среды и перемешивали в течение 1 часа. Реакцию гасили раствором хлорида аммония (100 мл), и органический слой отделяли, промывали 10% тиосульфатом натрия, сушили над сульфатом магния, фильтровали и выпаривали в вакууме. Очистка посредством флэш-хроматографии (0-30% MTBE/гептан) давала желаемый продукт ix.1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 3,72 (с, 3H), 3,22 (с, 3H), 2,48 (т, 2H), 1,65 (м, 2H), 1,39 (м, 22H), 1,18 (м, 2H), 0,91 (т, 3H), 0,68 (м, 2H), 0,59 (м, 1H), -0,32 (м, 1H).
[0399] Преобразование амида Вайнреба ix в соединение 33 проводили способом, аналогичным описанному для соединения 1 выше (добавление нонила по Гриньяру добавление с последующим восстановительным аминированием). LC/MS (M+H)=436,6.1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 2,25 (с, 6H), 1,30 (м, 45H), 0,91 (м, 6H), 0,68 (м, 2H), 0,59 (м, 1H), -0,31 (м, 1H).
[0400] Соединения 34-43 представляют собой новые катионные липиды, и их получали в соответствии с общими схемами 1-4 выше.
(11E,20Z,23Z)-N,N-диметилнонакоза-11,20,23-триен-10-амин (Соединение 44)
[0401] К раствору LDA (95 ммоль, 47,5 мл 2M раствора) в THF (127 мл), охлажденному до -78°C, добавляли трет-бутилацетат. Реакционную смесь перемешивали в течение 15 минут с последующим добавление альдегида x. Реакционную смесь сразу же гасили раствором хлорида аммония, нагревали до температуры окружающей среды и распределяли между водой/пентаном. Органические фракции сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали в вакууме. LC/MS (M+H-tBu) = 325,4.
[0402] Гидроксикетон xi (7 г, 18,4 ммоль) растворяли в дихлорметане (150 мл) и охлаждали до 0°C и обрабатывали деоксофтором (7,3 г, 33,1 ммоль). Реакционную смесь нагревали до температуры окружающей среды с перемешиванием в течение 16 часов с последующим гашением раствором бикарбоната натрия. Реакционную смесь разделяли, и органические фракции сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали в вакууме. Колоночная флэш-хроматография (0-5% этилацетат/гексан) приводила к сложному фторэфиру.
[0403] Промежуточное соединение сложный фторэфир (6 г, 15,6 ммоль) в дихлорметане обрабатывали соляной кислотой (157 ммоль, 39,2 мл 4M раствора в диоксане), и реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 16 часов. Реакционную смесь выпаривали в вакууме с получением желаемой β-фторкислоты xii. LC/MS (M+H) = 327,3.
[0404] Фторкарбоновую кислоту xii (5,1 г, 15,7 ммоль), EDC (6,0 г, 31,4 ммоль), гидрохлорид N,O-диметилгидроксиламина (3,1 г, 31,4 ммоль), триметиламин (4,0 г, 39,2 ммоль) и HOAt (4,3 г, 31,4 ммоль) объединяли в DCM (78 мл) и перемешивали при температуре окружающей среды в течение 16 часов. Реакционную смесь распределяли между водой/DCM, и органические фракции отмывали водой (3×) и раствором NaOH (1×), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали в вакууме. Неочищенный материал очищали посредством препаративной хроматографии с обращенной фазой с получением желаемого амида Вайнреба xiii. LC/MS (M+H) = 370,4.
[0405] Раствор амида Вайнреба xiii (4,3 г, 11,7 ммоль) в THF (50 мл) обрабатывали бромидом нонилмагния (23,4 ммоль, 23,4 мл 1M раствора) при температуре окружающей среды. Реакцию гасили раствором хлорида аммония через 1 час и распределяли между водой и пентаном. Органические фракции сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали в вакууме. Этот материал неочищенным применяли на следующей стадии.
[0406] Кетон xiv (5,1 г, 11,7 ммоль) обрабатывали диметиламином (29,3 ммоль, 14,7 мл 2M раствора в THF) и изопропоксидом титана(IV) (6,7 г, 23,5 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 16 часов. К реакционной смеси добавляли этанол (50 мл) с последующим борогидридом натрия (0,67 г, 17,6 ммоль). Реакционную смесь непосредственно наносили на колонку с диоксидом кремния и очищали посредством флэш-хроматографии (0-15% MeOH/DCM). Материал требовал второй очистки препаративной хроматографией с обращенной фазой с получением (11E,20Z,23Z)-N,N-диметилнонакоза-11,20,23-триен-10-амина. Вычисленная HRMS 446,4720, найденная - 446,4724.1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,48 (м, 1H), 5,37 (м, 4H), 5,23 (м, 1H), 2,78 (т, 2H), 2,58 (м, 1H), 2,22 (с, 6H), 2,04 (м, 6H), 1,56 (м, 1H), 1,30 (м, 31H), 0,89 (м, 6H).
[0407] Соединение 45 представляет собой DLinKC2DMA, как описано в Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176, WO 2010/042877 A1, WO 2010/048536 A2, WO 2010/088537 A2 и WO 2009/127060 A1.
[0408] Соединение 46 представляет собой MC3, как описано в WO 2010/054401 и WO 2010/144740 A1.
E. Композиции липидных наночастиц
[0409] Для доставки олигонуклеотидов, особенно молекул миНК по изобретению, пригодны следующие композиции липидных наночастиц (LNP) по настоящему изобретению:
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG 56,6/38/5,4;
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG 60/38/2;
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG 67,3/29/3,7;
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG 49,3/47/3,7;
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG 50,3/44,3/5,4;
Катионный липид/Холестерин/PEG-C-DMA/DSPC 40/48/2/10;
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG/DSPC 40/48/2/10; и
Катионный липид/Холестерин/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10.
[0410] Специалист в данной области легко поймет, что настоящее изобретение хорошо адаптировано для осуществления задач и получения указанных результатов и преимуществ, а также результатов и преимуществ характерных для него. Способы и композиции, описываемые в настоящем документе, являясь в настоящий момент иллюстрацией предпочтительных вариантов осуществления, являются иллюстративными и не предназначены для ограничения объема изобретения. Его изменения и другие применения, очевидные специалистам в данной области, которые включены в сущность изобретения, определены объемом формулы изобретения.
Изобретение относится к области биохимии. Предложена молекула двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК) для ингибирования экспрессии вируса гепатита В (HBV). Также изобретение относится к композициям и способам исследования, диагностики и лечения симптомов, заболеваний и состояний, реагирующих на модуляцию экспрессии генов HBV. Изобретение позволяет эффективно ингибировать экспрессию генов HBV. 11 н. и 6 з.п. ф-лы, 12 ил., 15 табл., 6 пр.
Ингибирование вирусной экспрессии генов с использованием малой интерферирующей рнк