Низкотемпературное циклическое удлинение днк с высокой специфичностью праймирования - RU2004100107A

Реферат

1. Способ удлинения праймера или пары праймеров с использованием ферментативной циклической реакции удлинения праймера при температурах ниже, чем приблизительно 80°C, включающий стадию смешивания ДНК-матрицы с праймером или парой праймеров и встречающийся в природе или модифицированной формой умеренно термостабильной ДНК-полимеразы из организма, выбранного из группы, состоящей из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax и Bacillus caldolyticus, в растворе, содержащем примерно от 10 до 20% (об./об.) глицерина, этиленгликоля или их смеси, в таких условиях, что температура циклической реакции колеблется между температурой плавления, примерно равной 70°C, и температурой отжига, примерно равной 37°C, так что ДНК-полимераза неоднократно удлиняет праймер или пару праймеров.

2. Способ по п.1, где глицерин, этиленгликоль или их смесь присутствует в концентрации, примерно равной 15% (об./об.).

3. Способ по п.1, где ДНК-полимераза характеризуется оптимальной ферментативной активностью, при примерно 65°C.

4. Способ по п.1, где ДНК-полимераза характеризуется аминокислотной последовательностью, которая проявляет не менее 95% гомологии в отношении ДНК-полимеразы, выделенной из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax или Bacillus caldolyticus.

5. Способ по п.1, который включает дальнейшую стадию повторения циклической реакции удлинения праймера.

6. Способ по п.1, где копии выбранного сегмента двухцепочечной ДНК амплифицируют в присутствии прямого праймера и обратного праймера на матрице путем неоднократных циклов нагревания и охлаждения.

7. Способ по п.6, где прямой праймер и обратный праймер могут быть различных длин.

8. Способ по п.1, где молекулы единственного праймера различной длины удлиняются с терминациями на специфичных нуклеотидах в присутствии ddNTP или их аналогов для циклического секвенирования.

9. Способ удлинения молекул праймера, подвергнутого отжигу на ДНК-матрицу, для прямого циклического секвенирования амплифицированных in vitro двухцепочечных продуктов ДНК без предварительного выделения или очистки, включающий стадии:

(i) смешивания разведенного неочищенного амплифицированного продукта реакции с избыточным количеством секвенирующего праймера, четырьмя стандартными ddNTP-терминаторами или соответствующими им аналогами, встречающейся в природе или модифицированной формой умеренно термостабильной ДНК-полимеразы, относящейся к организму, выбранному из группы, состоящей из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax и Bacillus caldolyticus, подходящей концентрацией dNTP, и композицией, включающей буфер в растворе, содержащем примерно от 10 до 20% глицерина, этиленгликоля или их смеси, и

(ii) осуществления циклической(-их) реакции(-ий) удлинения праймера при температуре ниже 80°C столько раз, сколько достаточно для удлинения молекул секвенирующего праймера до требуемых длин, причем данные молекулы специфично терминируются посредством ddNTP или соответствующих им аналогов.

10. Способ по п.9, где амплифицированные in vitro двухцепочечные ДНК-продукты получают путем удлинения праймера или пары праймеров с использованием ферментативной циклической реакции удлинения праймера при температурах ниже, чем примерно 80°C, включающий стадию смешивания целевого сегмента ДНК с праймером или парой праймеров и встречающейся в природе или модифицированной формой умеренно термостабильной ДНК-полимеразы из организма, выбранного из группы, состоящей из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax и Bacillus caldolyticus, в растворе, содержащем примерно от 10 до 20% (об./об.) глицерина, этиленгликоля или их смеси, в таких условиях, что температура циклической реакции колеблется между температурой плавления, примерно равной 70°C, и температурой охлаждения, примерно равной 37°C, так что ДНК-полимераза неоднократно удлиняет праймер или пару праймеров.

11. Способ по п.9, где умеренно термостабильная ДНК-полимераза характеризуется аминокислотной последовательностью, которая проявляет не менее 95% гомологии в отношении ДНК-полимеразы, выделенной из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax или Bacillus caldolyticus.

12. Сухая или жидкая готовая к употреблению реакционная смесь, подходящая для применения в низкотемпературной циклической реакции удлинения праймера при температурах ниже, чем примерно 80°C, включающая умеренно термостабильную, встречающуюся в природе или модифицированную ДНК-полимеразу из организма, выбранного из группы, состоящей из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax или Bacillus caldolyticus, которая предварительно смешана, по крайней мере, с одним компонентом ферментативной реакции удлинения ДНК-праймера, подходящим для применения при амплификации ДНК или для специфичных терминаций удлинения посредством дидезоксирибонуклеотидных аналогов.

13. Готовая к употреблению реакционная смесь по п.12, где умеренно термостабильная ДНК-полимераза представляет собой встречающуюся в природе или модифицированную ДНК-полимеразу из организма выбранного из группы, состоящей из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax или Bacillus caldolyticus, или умеренно термостабильную ДНК-полимеразу, характеризующейся аминокислотной последовательностью, которая проявляет не менее 95% гомологии в отношении ДНК-полимеразы, выделенной из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax или Bacillus caldolyticus.

14. Готовая к употреблению реакционная смесь по п.12, которая предварительно распределена по микроцентрифужным пробиркам или многолуночным планшетам.

15. Готовая к употреблению реакционная смесь по п.13, которая предварительно распределена по микроцентрифужным пробиркам или многолуночным планшетам.

16. Готовая к употреблению реакционная смесь по п.14, которая предварительно распределена по микроцентрифужным пробиркам или многолуночным планшетам и остается стабильной при температурах от 22 до 25°C, по крайней мере, в течение восьми недель.

17. Готовая к употреблению реакционная смесь по п.15, которая предварительно распределена по микроцентрифужным пробиркам или многолуночным планшетам и остается стабильной при температурах от 22 до 25°C, по крайней мере, в течение восьми недель.