Реагент и способ предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции, наборы реагентов и олигонуклеотидов для осуществления амплификации посредством полимеразной цепной реакции - RU2007118546A

Реферат

1. Реагент для предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР-амплификация), проводимой для получения по меньшей мере одного амплифицированного продукта ДНК, характеризующийся содержанием в смеси для ПЦР-амплификации, которая включает 1,25 единицы термостабильной ДНК-полимеразы/25 мкл реакционной смеси, в концентрации не более, чем 650 нМ, при этом реагент представляет собой неудлиняющийся олигонуклеотид, который имеет структуру ствол-петля и не является гибридизационым зондом для указанного по меньшей мере одного амплифицированного продукта ДНК, имеет ствол длиной более чем шесть нуклеотидов, стабилизирован на конце, отдаленном от петли, и который имеет рассчитанную температуру плавления ствола (Т_m) ниже 94°С.

2. Реагент по п.1, в котором петля представляет собой олигонуклеотид, включающий по меньшей мере три нуклеотида.

3. Реагент по п.1, в котором петля представляет собой ненуклеотидный химический линкер.

4. Реагент по п.1, в котором ствол стабилизирован на конце посредством химических групп, которые ковалентно присоединены к 3′- и 5′-нуклеотидам ствола.

5. Реагент по п.4, в котором химические группы обладают свойствами, отличными от флуоресцентных.

6. Реагент по п.1, в котором часть ствола, являеющаяся двунитевой при температурах ниже его Т_m, имеет длину 9-12 пар оснований.

7. Реагент по пп.1-6, в котором рассчитанная температура плавления ствола находится в интервале 72-85°С.

8. Реагент по пп.1-6, в котором рассчитанная температура плавления ствола лежит в интервале 50-71°С.

9. Способ предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР-амплификация), проводимой для получения по меньшей мере одного амплифицированного продукта ДНК из реакционной смеси для амплификации, которая включает дезоксинуклеотидфосфаты (дНТФ) и термостабильную ДНК-полимеразу, характеризующийся в добавлении в данную реакционную смесь по меньшей мере одного реагента по любому из пп.1-8.

10. Способ по п.9, в котором реагент имеет олигонуклеотидную петлю, а концентрация указанного реагента не превышает 300 нМ.

11. Способ по п.9 в котором реагент имеет петлю, которая представляет собой ненуклеотидный химический линкер, а реагент добавляют к реакционной смеси в концентрации, не превышающей 1000 нМ.

12. Способ по п.9, в котором амплификация представляет собой анализ на основе линейной после экспоненциальной ПЦР (ЛПЭ-ПЦР), включающий низкотемпературную стадию детекции, проводимую при температуре ниже, чем указанная Т_m.

13. Способ по п.12, в котором амплификация представляет собой анализ на основе симметричной ПЦР.

14. Способ по пп.9-13, в котором после амплификации следует детекция конечного результата.

15. Набор реагентов для осуществления амплификации посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий термостабильную ДНК-полимеразу, по меньшей мере одну пару ПЦР-праймеров, дНТФ и по меньшей мере один реагент по любому из пп.1-8.

16. Набор по п.15, дополнительно включающий реагенты для выделения нуклеиновой кислоты.

17. Набор олигонуклеотидов для осуществления амплификации посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающая по меньшей мере одну пару ПЦР-праймеров и по меньшей мере один реагент по любому из пп.1-8.

18. Набор по п.17, дополнительно включающая по меньшей мере один зонд с флуоресцентной меткой, который гибридизуется с амплифицированным продуктом, определяемым указанной по меньшей мере одной парой ПЦР-праймеров.

19. Набор по п.18, в которой по меньшей мере одна пара праймеров включает ограничивающий праймер и избыточный праймер в соотношении, подходящем для проведения амплификации посредством линейной после экспоненциальной ПЦР (ЛПЭ-ПЦР).

20. Набор по пп.17-19, в которой указанный амплифицированный продукт является однонитевым.