Усовершенствования в процессах амплификации нуклеиновой кислоты или связанные с таковыми - RU2019101504A
Код документа: RU2019101504A
Формула
1. Способ осуществления неизотермической реакции амплификации нуклеиновой кислоты, причем способ предусматривает стадии:
(a) смешивания последовательности-мишени с одним или несколькими комплементарными однонитевыми праймерами в условиях, которые способствуют событию гибридизации, при котором праймеры гибридизируются с мишенью, при этом событие гибридизации напрямую или опосредованно приводит к образованию дуплексной структуры, содержащей два сайта образования разрыва, расположенных на противоположных концах дуплекса или возле них; и осуществления процесса амплификации за счет;
(b) создания разрыва в каждом из указанных сайтов образования разрыва в нитях дуплекса;
(c) применения полимеразы для элонгации содержащих разрыв нитей таким образом, чтобы образовывалась вновь синтезированная нуклеиновая кислота, при этом элонгация с помощью полимеразы восстанавливает сайты образования разрыва;
(d) повторения, при необходимости, стадий (b) и (c) таким образом, чтобы привести к получению множественных копий вновь синтезированной нуклеиновой кислоты;
при этом он отличается тем, что температура, при которой осуществляют способ, является неизотермической, и ее подвергают снижению на по меньшей мере 2°C во время стадий (b) - (d) процесса амплификации.
2. Способ по п. 1, где на стадии (a) мишень содержит две комплементарные нити нуклеиновой кислоты, а праймер предусматривает прямой и обратный праймеры, каждый из которых является комплементарным соответствующей нити мишени, вследствие чего 3'-концы прямого и обратного праймеров ориентированы в направлении друг друга.
3. Способ по п. 1 или 2, где температуру подвергают контролируемому снижению, составляющему по меньшей мере 5°C, предпочтительно по меньшей мере 10°C, более предпочтительно по меньшей мере 15°C, во время реакции амплификации.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где средняя скорость снижения температуры во время реакции амплификации находится в диапазоне от 0,10 до 6,0°C мин-1, предпочтительно от 0,20 до 3,5°C мин-1, более предпочтительно от 0,30 до 3,5°C мин-1 и наиболее предпочтительно от 0,40 до 3,5°C мин-1.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадии (b) - (d) осуществляют практически немедленно после стадии (a), и где стадии (a) - (d) предпочтительно осуществляют в одном и том же реакционном сосуде или на одной и той же твердой подложке.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадию (a) осуществляют при температуре в диапазоне 55-62°C, предпочтительно 57-61°C, более предпочтительно 58 60°C.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий стадию выявления напрямую или опосредованно вновь синтезированной нуклеиновой кислоты.
8. Способ по п. 7, где указанная стадия выявления предусматривает применение молекулярного маяка или флуоресцентного красителя, меченого зонда для иммунохроматографического анализа или фермента, который катализирует электрохимическую реакцию.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия (b) предусматривает применение никующей эндонуклеазы.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий применение первой полимеразы и/или первой никующей эндонуклеазы, характеризующихся оптимальной температурой, и второй полимеразы и/или второй никующей эндонуклеазы, характеризующихся оптимальной температурой, где оптимальная температура второй полимеразы и/или второй никующей эндонуклеазы ниже, чем оптимальная температура соответствующих первой полимеразы и/или первой никующей эндонуклеазы.
11. Способ по п. 10, где вторая полимераза представляет собой полимеразу Bsu или фрагмент Кленова ДНК-полимеразы.
12. Способ по п. 10, где начальная температура реакции амплификации находится на уровне оптимальной температуры первой никующей эндонуклеазы или выше нее, и температуру снижают в ходе реакции амплификации до температуры ниже оптимальной температуры первой никующей эндонуклеазы.
13. Способ по пп. 10, 11 или 12, где температуру реакции амплификации снижают до оптимальной температуры второй полимеразы и/или второй никующей эндонуклеазы или ниже нее.
14. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий стадию приведения смеси, полученной с помощью осуществления способа, в контакт с термолабильным ферментом, который разрушает нуклеиновую кислоту, при этом смесь приводят в контакт с термолабильным ферментом при температуре, при которой термолабильный фермент является в значительной степени активным.
15. Способ по п. 14, где фермент представляет собой урацил-ДНК-гликозилазу (UDG) трески или антарктическую термолабильную UDG.
16. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадии (a) предшествует осуществление стадии обратной транскрипции, предусматривающей приведение представляющего интерес аналита РНК в контакт с обратной транскриптазой таким образом, чтобы образовывался ДНК-транскрипт представляющего интерес аналита РНК.
17. Способ по п. 16, дополнительно предусматривающий стадию образования двухнитевой ДНК из ДНК-транскрипта.
18. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий стадию предамплификации или обогащения.
19. Способ по любому из предыдущих пунктов, где один или несколько праймеров содержат модифицированный нуклеотид.
20. Способ по п. 19, где модифицированный нуклеотид находится в участке праймера, комплементарном мишени.
21. Способ по п. 19 или 20, где один или несколько праймеров содержат 2' модифицированный нуклеотид.
22. Способ по любому из пп. 19-21, где один или несколько праймеров содержат 2' O-метил-модифицированный нуклеотид.
23. Способ по п. 22, где один или несколько праймеров содержат несколько 2'-O-метил-модифицированных нуклеотидов.
24. Способ по п. 23, где один или несколько праймеров содержат до семи 2'-O-метил-модифицированных нуклеотидов.
25. Способ по любому из предыдущих пунктов, где температура реакции во время стадий (b) - (d) не возвращается к температуре, при которой осуществляют стадию (a).
26. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором температура реакции не возвращается к заранее определенной температуре.
27. Способ по любому из предыдущих пунктов, где один или несколько праймеров содержат самокомплементарный участок.
28. Способ по п. 27, где самокомплементарный участок образует шпилечную структуру.
29. Способ по п. 28, где шпилька содержит от 5 до 10 пар оснований.
30. Способ по любому из предыдущих пунктов, где величина снижения температуры во время стадий (b) - (d) находится в диапазоне 8-20°C.
31. Устройство для осуществления способа по любому из предыдущих пунктов, причем устройство содержит средства регуляции температуры, при этом программируемые средства контроля программируют таким образом, чтобы управлять средствами регуляции температуры для осуществления снижения температуры на по меньшей мере 2°C, предпочтительно на по меньшей мере 5°C, во время процесса амплификации реакционной смеси, применяемой для осуществления способа.
