Детекция целевой последовательности путем нанопорового сенсорного обнаружения синтетических зондов - RU2017114160A

1. Способ детекции полинуклеотида, содержащего целевую последовательность, в образце, причем способ содержит:

a) приведение в контакт указанного образца с зондом, который специфично связывается с указанным полинуклеотидом, содержащим указанную целевую последовательность, в условиях, которые способствуют связыванию указанного зонда с указанной целевой последовательностью, с образованием комплекса полинуклеотид-зонд:

b) загрузку указанного образца в первую камеру нанопорового устройства, причем указанное нанопоровое устройство содержит по меньшей мере одну нанопору и по меньшей мере указанную первую камеру и вторую камеру, причем указанные первая и вторая камеры находятся в электрическом и жидкостном сообщении посредством указанной по меньшей мере одной нанопоры, и причем нанопоровое устройство дополнительно характеризуется независимо управляемым напряжением между каждой из указанной по меньшей мере одной нанопоры и сенсором, связанным с каждой из указанной по меньшей мере одной нанопоры, причем указанный сенсор может идентифицировать объекты, проходящие через по меньшей мере одну нанопору, и причем указанный комплекс полинуклеотид-зонд, перемещающийся через указанную по меньшей мере одну нанопору, подает детектируемый сигнал, связанный с указанным комплексом полинуклеотид-зонд; и

c) определение наличия или отсутствия указанного комплекса полинуклеотид-зонд в указанном образце путем отслеживания указанного детектируемого сигнала, таким образом детектируя указанный полинуклеотид, содержащий указанную целевую последовательность.

2. Способ по п. 1, в котором указанный полинуклеотид представляет собой ДНК или РНК.

3. Способ по п. 1, в котором указанный детектируемый сигнал представляет собой электрический сигнал.

4. Способ по п. 1, в котором указанный детектируемый сигнал представляет собой оптический сигнал.

5. Способ по п. 1, в котором указанный зонд содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из белка, пептида, нуклеиновой кислоты, TALEN, CRISPR, пептид-нуклеиновой кислоты или химического соединения.

6. Способ по п. 1, в котором указанный зонд содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК), пептид-нуклеиновой кислоты (PNA), гибрида ДНК/РНК, полипептида или любого химически полученного полимера.

7. Способ по п. 1, в котором указанный зонд содержит молекулу PNA, связанную со вторичной молекулой, способной облегчать детекцию зонда, связанного с указанным полинуклеотидом, в процессе перемещения через указанную по меньшей мере одну нанопору.

8. Способ по п. 7, в котором указанная вторичная молекула представляет собой PEG.

9. Способ по п. 8, в котором указанный PEG характеризуется молекулярной массой по меньшей мере 1 кДа, 2 кДа, 3 кДа, 4 кДа, 5 кДа, 6 кДа, 7 кДа, 8 кДа, 9 кДа или 10 кДа.

10. Способ по п. 1, дополнительно содержащий применение к указанному образцу условия, предположительно приводящего к изменению связывающего взаимодействия между зондом и целевой последовательностью.

11. Способ по п. 10, в котором условие выбрано из группы, состоящей из удаления зонда из образца, добавления средства, которое конкурирует с зондом за связывание с целевой последовательностью, и изменение изначального рН, солевого или температурного условия.

12. Способ по п. 1, в котором указанный полинуклеотид содержит химическую модификацию, способную модифицировать связывание полинуклеотида с зондом.

13. Способ по п. 12, в котором химическая модификация выбрана из группы, состоящей из биотинилирования, ацетилирования, метилирования, сумоилирования, гликозилирования, фосфорилирования и окисления.

14. Способ по п. 1, в котором указанный зонд содержит химическую модификацию, соединенную с зондом с помощью расщепляемой связи.

15. Способ по п. 1, в котором указанный зонд взаимодействует с целевой последовательностью полинуклеотида посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, металлической связи, ван-дер-ваальсовой силы, гидрофобного взаимодействия или межплоскостных стэкинг-взаимодействий.

16. Способ по п. 1, дополнительно содержащий приведение образца в контакт с одной или более детектируемыми метками, способными связываться с зондом или с комплексом полинуклеотид-зонд.

17. Способ по п. 1, в котором полинуклеотид содержит по меньшей мере две целевых последовательности.

18. Способ по п. 1, в котором нанопора имеет диаметр от около 1 нм до около 100 нм, длину от 1 нм до около 100 нм, и причем каждая из камер содержит электрод.

19. Способ по п. 1, в котором указанное нанопоровое устройство содержит по меньшей мере две нанопоры, выполненные с возможностью управлять движением указанного полинуклеотида одновременно в обоих нанопорах.

20. Способ по п. 1, дополнительно содержащий изменение полярности указанного независимо управляемого напряжения после начальной детекции комплекса полинуклеотид-зонд по указанному детектируемому сигналу, с тем чтобы обращалось движение указанного полинуклеотида через нанопору после прохождения связанной с зондом части через нанопору, таким образом еще раз идентифицируя наличие или отсутствие комплекса полинуклеотид-зонд.

21. Способ по п. 1, в котором указанное нанопоровое устройство содержит две нанопоры, и причем указанный полинуклеотид одновременно расположен в обеих из указанных двух нанопор.

22. Способ по п. 21, дополнительно содержащий корректировку величины и или направления напряжения в каждой из указанных двух нанопор так, чтобы нанопорами создавалась противодействующая сила для управления скоростью перемещения полинуклеотида через нанопоры.

23. Способ детекции полинуклеотида или полинуклеотидной последовательности в образце, содержащий:

а) приведение в контакт указанного образца с первым зондом и вторым зондом, причем указанный первый зон специфично связывается с первой целевой последовательностью указанного полинуклеотида в условиях, которые способствуют связыванию указанного первого зонда с указанной первой целевой последовательностью, а указанный второй зонд специфично связывается со второй целевой последовательностью указанного полинуклеотида в условиях, которые способствуют связыванию указанного второго зонда с указанной второй целевой последовательностью;

b) приведение в контакт указанного образца с третьей молекулой, которая может одновременно связываться с указанным первым и вторым зондом при нахождении в достаточной близости друг к другу указанного первого и второго зонда в условиях, которые способствуют связыванию указанной третьей молекулы с указанным первым зондом и указанным вторым зондом, таким образом образуя слитый комплекс, содержащий указанный полинуклеотид, указанный первый зонд, указанный второй зонд и указанную третью молекулу;

c) загрузку указанного образца в первую камеру нанопорового устройства, причем указанное нанопоровое устройство содержит по меньшей мере одну нанопору и по меньшей мере указанную первую камеру и вторую камеру, причем указанная первая и вторая камеры находятся в электрическом и жидкостном сообщении посредством указанной по меньшей мере одной нанопоры, и причем нанопоровое устройство дополнительно характеризуется управляемым напряжением между каждой из указанной по меньшей мере одной нанопоры и сенсором, связанным с каждой их указанной по меньшей мере одной нанопорой, причем указанный сенсор может идентифицировать объекты, проходящие через по меньшей мере одну нанопору, а указанный слитый комплекс, перемещающийся через указанную по меньшей мере одну нанопору, подает детектируемый сигнал, связанный с указанным слитым комплексом; и

d) определение наличия или отсутствия указанного слитого комплекса в указанном образце путем отслеживания указанного детектируемого сигнала.

24. Способ по п. 23, в котором указанный полинуклеотид представляет собой ДНК или РНК.

25. Способ по п. 23, в котором указанный детектируемый сигнал представляет собой электрический сигнал.

26. Способ по п. 23, в котором указанный детектируемый сигнал представляет собой оптический сигнал.

27. Способ по п. 23, в котором указанная достаточная близость составляет менее 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 нуклеотидов.

28. Способ по п. 23, в котором указанная третья молекула содержит PEG или антитело.

29. Способ по п. 23, в котором указанная третья молекула и указанные первый и второй зонды связаны с ssDNA, и причем указанная ssDNA, связанная с указанной третьей молекулой, содержит участок, комплементарный участку ssDNA, связанному с указанным первым зондом, и комплементарный участку ssDNA, связанному со указанным вторым зондом.

30. Способ по п. 23, дополнительно содержащий приведение в контакт образца с одной или более детектируемыми метками, способными связываться с третьей молекулой или со слитым комплексом.

31. Набор, содержащий первый зонд, второй зонд и третью молекулу, причем первый зонд может связываться с первой целевой последовательностью на целевом полинуклеотиде, второй зонд может связываться со второй целевой последовательностью на указанном целевом полинуклеотиде, а указанная третья молекула может связываться с первым зондом и вторым зондом при связывании указанного первого и второго зондов с указанным полинуклеотидом в указанной первой и второй целевых последовательностях, таким образом локализуя первый и второй зонд в достаточной близости для осуществления одновременного связывания указанной третьей молекулы с указанным первым и вторым зондами.

32. Набор по п. 31, причем указанный первый зонд и указанный второй зонд выбраны из группы, состоящей из белка, пептида, нуклеиновой кислоты, TALEN, CRISPR, пептид-нуклеиновой кислоты или химического соединения.

33. Набор по п. 31, причем указанная третья молекула содержит PEG или антитело.

34. Набор по п. 31, причем указанная третья молекула содержит модификацию, модифицирующую аффинность связывания с указанными зондами.

35. Нанопоровое устройство, содержащее по меньшей мере две камеры и нанопору, причем указанное устройство содержит модифицированный PNA-зонд, связанный с полинуклеотидом в указанной нанопоре.

36. Двухпоровое устройство со сдвоенным усилителем для детекции заряженного полимера с помощью двух пор, причем устройство содержит верхнюю камеру, среднюю камеру и нижнюю камеру, первую пору, соединяющую верхнюю камеру и среднюю камеру, и вторую пору, соединяющую среднюю камеру и нижнюю камеру, причем указанное устройство содержит модифицированный PNA-зонд, связанный с полинуклеотидом в указанной первой или второй поре.

37. Устройство по п. 36, причем указанное устройство выполнено с возможностью одновременного управления движением указанного заряженного полимера через как указанную первую пору, так и указанную вторую пору.

38. Устройство по п. 36, причем указанный модифицированный PNA-зонд связан по меньшей мере с одной молекулой PEG.

39. Устройство по п. 36, причем устройство дополнительно содержит источник питания, способный подавать первое напряжение между верхней камерой и средней камерой и подавать второе напряжение между средней камерой и нижней камерой, причем каждое напряжение можно независимо корректировать, средняя камера соединена с общим заземлением для двух напряжений, устройство имеет электронный компонент, выполняющий функцию сдвоенного усилителя и предназначенный для независимого управления напряжением и измерения тока в каждой поре, причем два напряжения могут отличаться по величине, а первая и вторая пора выполнены таким образом, чтобы заряженный полимер мог одновременно двигаться через обе поры в любом направлении и управляемым образом.