Набор зондов для анализа образцов днк и способы их использования - RU2018113795A
Код документа: RU2018113795A
Формула
1. Система зондов для анализа образца нуклеиновой кислоты, содержащая:
(а) набор идентифицирующих олигонуклеотидов последовательности B;
(b) набор фиксирующих олигонуклеотидов формулы X'-A'-B'-Z ', где:
в пределах набора: (i) последовательности A' и B' варьируют, и (ii) последовательности X' и Z' отличаются друг от друга и не являются переменными; а также,
в пределах каждого фиксирующего олигонуклеотида: (i) последовательность А' комплементарна геномному фрагменту образца нуклеиновой кислоты и (ii) последовательность В' комплементарна по меньшей мере одному из членов набора идентифицирующих олигонуклеотидов; а также
(c) одну или более зондовых последовательностей, содержащих X и Z, где последовательности X и Z не являются переменными и гибридизуются с последовательностями X' и Z';
где каждый фиксирующий олигонуклеотид способен гибридизоваться с: (i) последовательностями зонда, (ii) членом набора идентифицирующих олигонуклеотидов и (iii) геномным фрагментом, в результате чего образуется лигируемый комплекс формулы X-A-B-Z.
2. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что набор идентифицирующих олигонуклеотидов содержит по меньшей мере два различных идентифицирующих олигонуклеотида последовательности В, и в наборе фиксирующих олигонуклеотидов присутствуют по меньшей мере 100 различных последовательностей А'; и по меньшей мере две различные последовательности B', которые являются комплементарными по меньшей мере двум различным идентифицирующим олигонуклеотидам.
3. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что каждый идентифицирующий олигонуклеотид или его комплементарная последовательность В' в фиксирующем олигонуклеотиде соответствует геномному фрагменту.
4. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что каждый идентифицирующих олигонуклеотид или его комплементарная последовательность В' в фиксирующем олигонуклеотиде указывает на локус в геноме, из которого получен геномный фрагмент.
5. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что каждый идентифицирующий олигонуклеотид или его комплементарная последовательность В' в фиксирующем олигонуклеотиде указывает на хромосому, из которой получен геномный фрагмент.
6. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что геномный фрагмент представляет собой фрагмент генома млекопитающего.
7. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что каждый идентифицирующий олигонуклеотид или его комплементарная последовательность В' в фиксирующем олигонуклеотиде идентифицирует одно или более из следующего: хромосома 21, хромосома 18 и хромосома 13.
8. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что геномный фрагмент представляет собой рестрикционный фрагмент.
9. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что одна или несколько зондовых последовательностей (c) дополнительно содержит олигонуклеотид, содержащий последовательность Y, причем лигируемый комплекс является линейным.
10. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит пару ПЦР-праймеров, которые гибридизуются с одним или несколькими зондами (c).
11. Система зондов по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что одна или более зондовых последовательностей (c) содержат основной зонд формулы X-Y-Z, где Y содержит олигонуклеотидную последовательность, так что лигируемый комплекс является кольцевым лигируемым комплексом формулы X-A-B-Z-Y, причем последовательность Y соединяет последовательности X и Z.
12. Система зондов по п. 11, дополнительно содержащая праймер для амплификации по типу катящегося кольца, который гибридизуется с последовательностью в основном зонде.
13. Система зондов по п. 11, дополнительно содержащая:
(A) праймер для амплификации по типу катящегося кольца, который гибридизуется с последовательностью в основном зонде; и
(B) до четырех различно меченых детектирующих олигонуклеотидов, причем каждый из различно меченых детектирующих олигонуклеотидов гибридизуется с последовательностью В'.
14. Способ, включающий:
(а) гибридизацию системы зондов по любому из предыдущих пунктов с исследуемым геномным образцом, который содержит геномные фрагменты, для получения лигируемых комплексов формулы X-A-B-Z;
(b) лигирование лигируемых комплексов с получением молекул ДНК-продукта формулы X-A-B-Z; и
(c) подсчет молекул ДНК-продукта, соответствующих каждому локусовому идентификатору последовательности B.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что подсчет проводят путем секвенирования молекул ДНК-продукта или их продуктов амплификации для получения данных о последовательности и подсчета количества считанных последовательностей, содержащих каждую последовательность В или ее комплементарную последовательность.
16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что молекулы ДНК-продукта являются кольцевыми, а подсчет включает в себя амплификацию молекул ДНК-продукта путем амплификации по типу катящегося кольца и подсчет количества продуктов амплификации, содержащих каждую последовательность В или ее комплементарную последовательность.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что он включает маркировку продуктов амплификации по типу катящегося кольца (RCA) с использованием различно меченых зондов, которые гибридизуются с последовательностью B', и подсчет производится путем подсчета количества продуктов RCA для каждой отдельной метки.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что он дополнительно включает: i. размещение продуктов RCA на плоской подложке; и ii. подсчет количества отдельных меченных продуктов RCA в области подложки.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что подложка представляет собой стеклянный слайд.
20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что подложка представляет собой пористая прозрачная капиллярная мембрана.
21. Способ по любому из пп. 14-20, отличающийся тем, что различные последовательности B и их комплементарные последовательности B' идентифицируют разные хромосомы, и способ дополнительно включает в себя сравнение количества молекул ДНК-продукта, содержащих первую последовательность B или B', с числом молекул ДНК-продукта, содержащих вторую последовательность B или B', для определения наличия или отсутствия в геномном образце анеуплоидии.
22. Способ по любому из пп. 14-21, отличающийся тем, что он включает сравнение результатов подсчета на этапе (c) с результатами подсчета, полученными для одного или нескольких референтных образцов.
23. Способ по любому из пп. 14-22, отличающийся тем, что исследуемый геномный образец получен от пациента, который подозревается в наличии или подвергается риску заболевания или состояния, и результаты подсчета на стадии (c) дают указание на то, имеет ли пациент или его плод заболевание или состояние.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что заболевание или состояние представляет собой рак, инфекционное заболевание, воспалительное заболевание, отторжение трансплантата или трисомию.
25. Способ по любому из пп. 14-24, отличающийся тем, что фрагменты являются рестрикционными фрагментами.
