Определение нуклеиновых кислот путем амплификации, основанной на встраивании в цепь - RU2016116333A
Код документа: RU2016116333A
Формула
1. Способ определения целевой нуклеотидной последовательности в пробе в присутствии по меньшей мере одного белка, способного связываться с одноцепочечной ДНК, включающий приведение в контакт указанной пробы по меньшей мере с одним олигонуклеотидным зондом, содержащим флуорофор, гаситель и область, комплементарную указанной целевой нуклеотидной последовательности, причем последовательность указанного олигонуклеотидного зонда содержит по меньшей мере 20% нуклеотидов РНК, модифицированных нуклеотидов РНК и/или нуклеотидов ПНК (пептидной нуклеиновой кислоты).
2. Способ по п. 1, включающий амплификацию указанной целевой нуклеотидной последовательности, необязательно при изотермических условиях, способствующих амплификации указанной целевой нуклеотидной последовательности.
3. Способ по п. 1 или 2, включающий приведение в контакт указанной пробы по меньшей мере с одним прямым праймером и по меньшей мере с одним обратным праймером, каждый из которых содержит область, комплементарную целевой нуклеотидной последовательности.
4. Способ по п. 1 или 2, включающий приведение в контакт указанной пробы с олигонуклеотидом встраивания в цепь, содержащим область, комплементарную указанной целевой нуклеотидной последовательности.
5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотидный зонд способен инициировать амплификацию указанной целевой нуклеотидной последовательности и функционировать как указанный по меньшей мере один прямой или обратный праймер.
6. Способ по любому из пп. 1, 2, 5, отличающийся тем, что указанным белком, способным связываться с одноцепочечной ДНК, является рекомбиназа или акцессорный белок рекомбиназы или кофакторный белок рекомбиназы.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанная рекомбиназа выбрана из UvsX или RecA, или указанный акцессорный белок рекомбиназы выбран из UvsY или gp32.
8. Способ по любому из пп. 1, 2, 5, 7, отличающийся тем, что модифицированные нуклеотиды РНК, присутствующие в указанном олигонуклеотидном зонде, содержат по меньшей мере один 2'-фтор-рибонуклеотид, 2'-O-метил-рибонуклеотид или рибонуклеотид ЗНК (закрытой нуклеиновой кислоты).
9. Способ по любому из пп. 1, 2, 5, 7, который включает приведение в контакт указанной пробы с РНКазой Н.
10. Способ по любому из пп. 1, 2, 5, 7, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотидный зонд содержит последовательность SEQ ID №: 24, 25 или 30 или вариант любого из них.
11. Набор, содержащий олигонуклеотидный зонд, содержащий флуорофор, гаситель и область, комплементарную целевой нуклеотидной последовательности, причем последовательность указанного олигонуклеотидного зонда содержит по меньшей мере 20% нуклеотидов РНК, модифицированных нуклеотидов РНК и/или нуклеотидов ПНК, и дополнительно:
(i) олигонуклеотид встраивания в цепь, содержащий область, комплементарную указанной целевой нуклеотидной последовательности; и/или
(ii) по меньшей мере один белок, способный связываться с одноцепочечной ДНК.
12. Набор по п. 11, отличающийся тем, что (i) указанный набор дополнительно содержит прямой и/или обратный праймер, содержащий область, комплементарную указанной целевой нуклеотидной последовательности; или (ii) указанный олигонуклеотидный зонд способен инициировать амплификацию указанной целевой нуклеотидной последовательности и функционирует как указанный прямой праймер или указанный обратный праймер.
13. Способ диагностики заболевания у субъекта, включающий осуществление способа, описанного в любом из пп. 1-10, в пробе от указанного субъекта для определения целевой нуклеотидной последовательности, ассоциированной с указанным заболеванием.
14. Олигонуклеотидный зонд длиной 8-25 нуклеотидов, содержащий флуорофор, гаситель и область, комплементарную целевой нуклеотидной последовательности, причем последовательность указанного олигонуклеотидного зонда содержит по меньшей мере 20% нуклеотидов РНК, модифицированных нуклеотидов РНК и/или нуклеотидов ПНК.
15. Олигонуклеотидный зонд по п. 14, отличающийся тем, что (i) указанный зонд содержит модифицированные нуклеотиды РНК, включающие по меньшей мере один 2'-фтор-рибонуклеотид, 2'-O-метил-рибонуклеотид или рибонуклеотид ЗНК; или (ii) последовательность указанного зонда состоит из нуклеотидов РНК, модифицированных нуклеотидов РНК и/или нуклеотидов ПНК.
