Мультиплексные зонды - RU2016117929A
Код документа: RU2016117929A
Формула
1. Система нуклеиновых кислот, содержащая:
a) нижерасположенный олигонуклеотидный зонд, содержащий по меньшей мере 50 пар оснований, имеющий последовательность, комплементарную первой последовательности целевого олигонуклеотида, и который характеризуется расщепляемой последовательностью; и
b) вышерасположенный олигонуклеотидный праймер, содержащий по меньшей мере 50 пар оснований, имеющий последовательность, комплементарную второй последовательности целевого олигонуклеотида, и который имеет сайт первоначального связывания полимеразы нуклеиновых кислот,
где нижерасположенный олигонуклеотидный зонд сконфигурирован так, чтобы полимераза отщепляла мононуклеотиды или небольшие олигонуклеотиды на его 5’-конце, и
при этом Tm нижерасположенного олигонуклеотидного зонда и вышерасположенного олигонуклеотидного праймера находится в пределах приблизительно 15°C от Tm целевой нуклеиновой кислоты.
2. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где нижерасположенный олигонуклеотидный зонд содержит расщепляемую последовательность, которая расщепляется посредством независимого от полимеризации расщепления под действием полимеразы, связывающейся с сайтом первоначального связывания полимеразы нуклеиновых кислот.
3. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где нижерасположенный олигонуклеотидный зонд содержит по меньшей мере одну метку, которая отщепляется под действием нуклеазной активности.
4. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где нижерасположенный олигонуклеотидный зонд содержит 5’-конец, имеющий репортер и тушитель, расположенный ниже репортера.
5. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где вышерасположенный олигонуклеотидный праймер и нижерасположенный олигонуклеотидный зонд гибридизируются с целевым олигонуклеотидом.
6. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где нижерасположенный олигонуклеотидный зонд и вышерасположенный олигонуклеотидный праймер отжигаются с целевым олигонуклеотидом на расстоянии в нуклеотидах, достаточно близком для того, чтобы полимераза нуклеиновых кислот контактировала с 5’-концом нижерасположенного олигонуклеотидного зонда при связывании с сайтом первоначального связывания полимеразы нуклеиновых кислот вышерасположенного олигонуклеотидного праймера.
7. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где вышерасположенный олигонуклеотидный праймер и нижерасположенный олигонуклеотидный зонд вместе сконфигурированы так, чтобы нижерасположенный олигонуклеотидный зонд расщеплялся посредством независимого от полимеризации расщепления под действием полимеразы, связывающейся с сайтом первоначального связывания полимеразы нуклеиновых кислот вышерасположенного олигонуклеотидного праймера.
8. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где нижерасположенный олигонуклеотидный зонд и вышерасположенный олигонуклеотидный праймер отжигаются с целевым олигонуклеотидом на расстоянии в нуклеотидах, достаточно далеком для того, чтобы полимераза нуклеиновых кислот не контактировала с 5’-концом нижерасположенного олигонуклеотидного зонда, когда полимераза нуклеиновых кислот связывается с сайтом первоначального связывания полимеразы нуклеиновых кислот вышерасположенного олигонуклеотидного праймера.
9. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где вышерасположенный олигонуклеотидный праймер и нижерасположенный олигонуклеотидный зонд вместе сконфигурированы так, чтобы нижерасположенный олигонуклеотидный зонд расщеплялся посредством зависимого от полимеризации расщепления под действием полимеразы после полимеризации.
10. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где нижерасположенный олигонуклеотид содержит вышерасположенную метку и нижерасположенную метку.
11. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где нижерасположенный олигонуклеотидный зонд содержит флуоресцентный краситель и тушитель, расположенные взаимозаменяемо на 5’- или 3’-конце указанного зонда, так что когда зонд находится в растворе, сигнал от флуоресцентного красителя подавляется тушителем.
12. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где нижерасположенный олигонуклеотидный зонд содержит флуоресцентный краситель и тушитель, расположенные взаимозаменяемо на 5’- или 3’-конце указанного зонда, так что когда происходит связывание вышерасположенного олигонуклеотидного праймера и нижерасположенного олигонуклеотидного зонда с целевым олигонуклеотидом, то вместе со связыванием полимеразы с сайтом первоначального связывания полимеразы нуклеиновых кислот полимераза будет отщеплять либо флуоресцентную метку, либо тушитель нижерасположенного олигонуклеотидного зонда.
13. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где один из вышерасположенного олигонуклеотидного праймера или нижерасположенного олигонуклеотидного зонда содержит в качестве метки комплекс батофенантролин-RU II, а другой из вышерасположенного олигонуклеотидного праймера или нижерасположенного олигонуклеотидного зонда содержит молекулу-донор энергии.
14. Система нуклеиновых кислот по п. 1, где нижерасположенный олигонуклеотидный зонд является гибридным шпилечным/расщепляемым зондом.
15. Способ обнаружения целевой последовательности нуклеиновой кислоты, включающий:
a) получение системы нуклеиновых кислот по п. 1;
b) денатурацию ДНК, имеющей целевую последовательность;
c) гибридизацию вышерасположенного олигонуклеотидного праймера и нижерасположенного олигонуклеотидного зонда с целевым олигонуклеотидом;
d) связывание полимеразы с сайтом первоначального связывания полимеразы нуклеиновых кислот;
e) элонгацию вышерасположенного олигонуклеотидного праймера посредством полимеризации при помощи полимеразы в направлении нижерасположенного олигонуклеотидного зонда;
f) отщепление нуклеотидов или небольших олигонуклеотидов нижерасположенного олигонуклеотидного зонда и
g) обнаружение сигнала, являющегося следствием указанного отщепления.
16. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот, содержащая:
a) образующий триплекс олигонуклеотидный (TFO) праймер, имеющий:
i. гибридизирующуюся полинуклеотидную последовательность, которая сконструирована так, чтобы гибридизироваться с целевой последовательностью целевого олигонуклеотида; и
ii. образующий триплекс участок (TFR), ассоциированный с гибридизирующейся полинуклеотидной последовательностью; и
b) целевой нуклеотид.
17. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 16, дополнительно содержащая TFO-зонд, который гибридизируется с TFR с образованием, таким образом, триплекса с последовательностью двухнитевой ДНК, которая была образована во время процесса амплификации целевой нуклеотидной последовательности с помощью праймера c TFR.
18. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 17, где зонд с TFR содержит компонент-метку, выбранный из группы, включающей флуоресцентный компонент, радиоактивный компонент, окрашенный компонент, флуоресцентный репортерный компонент, флуоресцентный тушащий компонент, один из пары компонентов резонансного переноса энергии флуоресценции и их комбинации.
19. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 16, где TFR находится на 5’-конце гибридизирующейся полинуклеотидной последовательности, или где TFR находится вблизи 5’-конца гибридизирующейся полинуклеотидной последовательности.
20. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 16, где TFR находится на 3’-конце гибридизирующейся полинуклеотидной последовательности, или где TFR находится вблизи 3’-конца гибридизирующейся полинуклеотидной последовательности.
21. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 16, где TFR находится в местоположении между 5’-концом и 3’-концом гибридизирующейся полинуклеотидной последовательности.
22. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 16, где длина гибридизирующейся полинуклеотидной последовательности составляет приблизительно 50 оснований или больше.
23. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 16, где длина гибридизирующейся полинуклеотидной последовательности находится в диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 100 оснований.
24. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 16, дополнительно содержащая метку, связанную с гибридизирующейся полинуклеотидной последовательностью.
25. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 17, дополнительно содержащая кэп на 3’-конце TFO-зонда, который ингибирует элонгацию с 3’-конца.
26. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 17, где TFO-зонд является образующим триплекс флуоресцентным зондом (TFFP).
27. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 17, где TFO-зонд является образующим триплекс флуоресцентным зондом (TFFP), и где TFFP отжигается с амплифицированной ДНК только тогда, когда температура реакции равна температуре отжига праймеров или ниже ее, и, как следствие, TFFP не принимает участие в реакции полимеризации.
28. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 17, где TFO-зонд является образующим триплекс флуоресцентным зондом (TFFP), а двухнитевая ДНК имеет краситель-рецептор.
29. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 28, где TFFP отжигается с амплифицированной двухнитевой ДНК, и, вследствие этого, возникает свечение, причем краситель-донор на TFFP резонирует, и по мере резонирования красителя-донора он передает энергию красителю-акцептору, расположенному на двухнитевой ДНК, что вызывает флуоресценцию красителя-акцептора при определенной длине волны с излучением света такого цвета, который соответствует такой длине волны, чтобы можно было зарегистрировать, что целевая последовательность присутствовала и была амплифицирована.
30. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 17, где двухнитевая ДНК имеет первую метку, и где TFO-зонд имеет вторую метку, причем первая метка и вторая метка обеспечивают обнаруживаемое излучение при тесной ассоциации.
31. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 16, дополнительно содержащая несколько праймеров c TFR с различными целевыми последовательностями, где праймеры c TFR имеют различные метки.
32. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 17, дополнительно содержащая несколько праймеров c TFR с различными целевыми последовательностями, где праймеры c TFR имеют различные первые метки, а TFO-зонд содержит соответствующую вторую метку, которая вызывает флуоресценцию при ассоциации с различными первыми метками.
33. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 17, где TFO-зонд сконструирован так, чтобы он отжигался при приблизительно такой же или более низкой температуре, чем Tm праймеров c TFR.
34. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 16, где TFR содержит встречающуюся в природе последовательность TFR.
35. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 17, дополнительно содержащая один или более неспецифичных ДНК-связывающих красителей, которые связываются с гибридизированной триплексной ДНК.
36. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 17, дополнительно содержащая один или более квадруплекс-связывающих красителей.
37. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 17, где TFO-зонд содержит флуоресцентный краситель и тушитель.
38. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 17, где TFO-зонд содержит флуоресцентный краситель и тушитель в шпилечной конфигурации.
39. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 16, где праймер c TFR приводит к образованию нитей образующей триплекс ДНК, если целевая ДНК содержит последовательность, характеризующуюся комплементарностью с последовательностью праймера c TFR.
40. Система мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 16, где целевая ДНК содержит природный образующий триплекс участок.
41. Способ амплификации целевой последовательности нуклеиновой кислоты, включающий:
a) получение системы мультиплексирующихся нуклеиновых кислот по п. 16;
b) гибридизацию праймера c TFR с целевым нуклеотидом, где праймер c TFR содержит метку, имеющую включенный в нее один или более TFR;
c) элонгацию праймера c TFR посредством полимеризации с помощью полимеразы;
d) дегибридизацию элонгированного праймера c TFR от целевого олигонуклеотида;
e) гибридизацию праймера с элонгированным праймером c TFR;
f) элонгацию праймера с получением комплементарной последовательности элонгированного праймера c TFR.
42. Способ по п. 41, дополнительно включающий:
g) получение TFO-зонда и
h) обнаружение того, связывается ли TFO-зонд с TFR-участком в амплифицированном целевом нуклеотиде.
43. Способ по п. 42, где TFO-зонд содержит метку для облегчения обнаружения амплифицированного целевого нуклеотида.
44 Набор, имеющий два или более олигонуклеотидов по пп. 1 и 16.
45. Набор по п. 44, где по меньшей мере один из олигонуклеотидов является образующим триплекс олигонуклеотидом.
46. Набор по п. 44, включающий праймер с TFR.
47. Набор по п. 44, включающий TFO-зонд.
48. Набор по п. 44, включающий праймер c TFR и TFO-зонд.
49. Набор по п. 44, имеющий реагенты для полимеризации.
