Олигонуклеотид, контролирующий область гибридизации, и его применение - RU2004120769A

Реферат

1. Олигонуклеотид для анализа нуклеотидной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты посредством гибридизации, причем указанный олигонуклеотид имеет следующую общую структуру:

5’-Х_р -Y_q-Z_r-3’ или 5’-Z_r-Y_q-X_p-3’

где Х_р представляет собой первую гибридизующуюся область, имеющую специфическую гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, по существу комплементарную нуклеотидной последовательности-мишени в указанном образце нуклеиновой кислоты, для гибридизации с ней; Y_q представляет собой регуляторную область, содержащую по меньшей мере два универсальных основания или неразличаемых аналога оснований; Z_r представляет собой вторую гибридизующуюся область, имеющую предварительно выбранную произвольную нуклеотидную последовательность; p, q и r означают количество нуклеотидов; и Х, Y и Z означают дезоксирибонуклеотид или рибонуклеотид.

2. Олигонуклеотид по п.1, который участвует в двух отдельных гибридизациях в виде первой и второй гибридизаций, где указанная первая гибридизующаяся область используется в качестве сайта специфической гибридизации в первой гибридизации, а указанная вторая гибридизующаяся область служит в качестве универсального гибридизующегося сайта во второй гибридизации.

3. Олигонуклеотид по п.1, где указанная регуляторная область способна контролировать гибридизующуюся область указанного олигонуклеотида.

4. Олигонуклеотид по п.1, где указанное универсальное основание или неразличаемый аналог основания могут образовывать пары оснований с каждым из природных оснований ДНК/РНК с незначительным различением между указанными природными основаниями ДНК/РНК.

5. Олигонуклеотид по п.4, где указанное универсальное основание или неразличаемый аналог основания выбран из группы, состоящей из дезоксиинозина, инозина, 7-деаза-2’-дезоксиинозина, 2-аза-2’-дезоксиинозина, 2’-ОМе-инозина, 2’-F-инозина, дезокси-3-нитропиррола, 3-нитропиррола, 2’-ОМе-3-нитропиррола, 2’-F-3-нитропиррола, 1-(2’-дезокси-бета-D-рибофуранозил)-3-нитропиррола, дезокси-5-нитроиндола, 5-нитроиндола, 2’-ОМе-5-нитроиндола, 2’-F-5-нитроиндола, дезокси-4-нитробензимидазола, 4-нитробензимидазола, дезокси-4-аминобензимидазола, 4-аминобензимидазола, дезоксинебуларина, 2’-F-небуларина, 2’-F-4-нитробензимидазола, ПНК-5-нитроиндола, ПНК-небуларина, ПНК-инозина, ПНК-4-нитробензимидазола, ПНК-3-нитропиррола, морфолино-5-нитроиндола, морфолинонебуларина, морфолиноинозина, морфолино-4-нитробензимидазола, морфолино-3-нитропиррола, фосфорамидат-5-нитроиндола, фосфорамидатнебуларина, фосфорамидатинозина, фосфорамидат-4-нитробензимидазола, фосфорамидат-3-нитропиррола, 2’-О-метоксиэтилинозина, 2’-О-метоксиэтилнебуларина, 2’-О-метоксиэтил-5-нитроиндола, 2’-О-метоксиэтил-4-нитробензимидазола, 2’-О-метоксиэтил-3-нитропиррола и их комбинаций.

6. Олигонуклеотид по п.5, где указанным универсальным основанием или неразличаемым аналогом основания является дезоксиинозин, 1-(2’-дезокси-бета-D-рибофуранозил)-3-нитропиррол или 5-нитроиндол.

7. Олигонуклеотид по п.1, где указанная регуляторная область содержит смежные универсальные основания или неразличаемые аналоги оснований.

8. Олигонуклеотид по п.1, где указанный дезоксирибонуклеотид является природно встречающимся dNMP, модифицированным нуклеотидом и неприродным нуклеотидом.

9. Олигонуклеотид по п.1, где р представляет собой целое число от 6 до 100.

10. Олигонуклеотид по п.1, где q представляет по меньшей мере 3.

11. Олигонуклеотид по п.10, где q составляет по меньшей мере 4.

12. Олигонуклеотид по п.10, где q представляет собой целое число от 2 до 15.

13. Олигонуклеотид по п.1, где r представляет собой целое число от 15 до 100.

14. Олигонуклеотид по п.1, где вторая гибридизующаяся область имеет предварительно выбранную произвольную нуклеотидную последовательность, по существу некомплементарную любому сайту в указанном образце нуклеиновой кислоты.

15. Олигонуклеотид по п.1, который иммобилизован на нерастворимом носителе.

16. Набор для проведения гибридизации, где указанный набор содержит олигонуклеотид по любому из пп.1-15.

17. Способ обнаружения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты посредством гибридизации, где указанный способ предусматривает стадии

(а) выполнения первой гибридизации с использованием первого олигонуклеотида по любому из пп.1-15, имеющего в его первой гибридизующейся области специфическую гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, по существу комплементарную указанной нуклеотидной последовательности-мишени, для гибридизации с ней в условиях, в которых указанная первая гибридизующаяся область указанного первого олигонуклеотида должна гибридизоваться с указанной нуклеотидной последовательностью-мишенью; и

(b) детектирования присутствия или отсутствия указанной нуклеотидной последовательности-мишени, по существу комплементарной указанной первой гибридизующейся области указанного первого олигонуклеотида, в указанном образце нуклеиновой кислоты посредством сигнала, свидетельствующего о гибридизации между указанной нуклеотидной последовательностью-мишенью и указанной первой гибридизующейся областью.

18. Способ по п.17, где указанный способ дополнительно предусматривает стадии

(с) выполнения второй гибридизации с использованием второго олигонуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, по существу комплементарную указанной второй гибридизующейся области указанного первого олигонуклеотида, используемого на стадии (а), для гибридизации с ней в условиях, при которых указанный второй олигонуклеотид должен гибридизоваться с последовательностью указанной второй гибридизующейся области указанного первого олигонуклеотида; и (d) детектирования сигнала, свидетельствующего о гибридизации между указанной второй гибридизующейся областью указанного первого олигонуклеотида и указанным вторым олигонуклеотидом, так что подтверждается, что присутствие или отсутствие указанного сигнала стадии (b) должно быть приписано только гибридизации между указанной нуклеотидной последовательностью-мишенью и указанной первой гибридизующейся областью указанного первого олигонуклеотида.

19. Способ идентификации нуклеотидной вариации в нуклеотидной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты, где указанный способ предусматривает стадии

(а) выполнения первой гибридизации с использованием первого олигонуклеотида по любому из пп.1-15, имеющего в его первой гибридизующейся области специфическую гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, по существу комплементарную указанной нуклеотидной последовательности-мишени указанному образцу нуклеиновой кислоты, для гибридизации с ней в условиях, в которых указанная первая гибридизующаяся область указанного первого олигонуклеотида должна гибридизоваться с указанной нуклеотидной последовательностью-мишенью указанного образца нуклеиновой кислоты, где каждая из указанной последовательности первого олигонуклеотида и указанной нуклеотидной последовательности-мишени содержит находящееся под вопросом положение, соответствующее указанной нуклеотидной вариации, посредством чего указанный первый олигонуклеотид, включающий в себя нуклеотидную вариацию, гибридизуется с указанной нуклеотидной последовательностью-мишенью, когда указанное находящееся под вопросом положение занято нуклеотидом указанного первого олигонуклеотида, комплементарным соответствующему ему нуклеотиду указанной нуклеотидной последовательности-мишени; и

(b) идентификации указанной нуклеотидной вариации в указанной нуклеотидной последовательности-мишени указанного образца нуклеиновой кислоты путем детектирования сигнала, свидетельствующего о гибридизации между указанной нуклеотидной последовательностью-мишенью и указанной первой гибридизующейся областью указанного первого олигонуклеотида.

20. Способ по п.19, где указанный способ дополнительно предусматривает стадии

(с) выполнения второй гибридизации с использованием второго олигонуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, по существу комплементарную указанной второй гибридизующейся области указанного первого олигонуклеотида, используемого на стадии (а), для гибридизации с ней в условиях, при которых указанный второй олигонуклеотид должен гибридизоваться с указанной последовательностью второй гибридизующейся области указанного первого олигонуклеотида; и (d) детектирования сигнала, свидетельствующего о гибридизации между указанной второй гибридизующейся областью указанного первого олигонуклеотида и указанным вторым олигонуклеотидом так, что подтверждается, что присутствие или отсутствие указанного сигнала стадии (b) должно быть приписано только гибридизации между указанной нуклеотидной последовательностью-мишенью и указанной первой гибридизующейся областью указанного первого олигонуклеотида.

21. Способ по п.17 или 19, где указанная регуляторная область указанного первого олигонуклеотида может ограничивать гибридизующуюся область указанного первого олигонуклеотида с указанной нуклеотидной последовательностью-мишенью указанной первой гибридизующейся области.

22. Способ по п.17 или 19, где указанная регуляторная область указанного первого олигонуклеотида ответственна за повышение специфичности гибридизации указанной первой гибридизующейся области указанного первого олигонуклеотида.

23. Способ по п.19, где указанная нуклеиновая кислота в пробе является коротким нуклеотидным сегментом, включающим в себя нуклеотидную вариацию, которую получают путем амплификации соответствующей нуклеотидной последовательности указанного короткого нуклеотидного сегмента.

24. Способ по п.19, где указанный образец нуклеиновой кислоты является более чем одним коротким нуклеотидным сегментом-мишенью, каждый из которых включает в себя нуклеотидную вариацию, которую получают путем амплификации соответствующей нуклеотидной последовательности более чем одного короткого нуклеотидного сегмента.

25. Способ по п.19, где указанная нуклеотидная вариация является полиморфизмом единственного основания или точковой мутацией.

26. Способ по п.19, где указанная нуклеотидная вариация содержится в нуклеиновой кислоте человека.

27. Способ по п.19, где указанная нуклеотидная вариация содержится в нуклеиновой кислоте организма, который может вызывать инфекционное заболевание.

28. Способ по п.19, где указанная первая гибридизующаяся область указанного первого олигонуклеотида, используемого на стадии (а), содержит находящееся под вопросом положение, занимаемое нуклеотидом, комплементарным соответствующему нуклеотиду, который соответствует нуклеотидной вариации.

29. Способ по п.19, где указанное находящееся под вопросом положение указанного первого олигонуклеотида, используемого на стадии (а), находится в центре его первой гибридизующейся области.

30. Способ по п.19, где указанная первая гибридизующаяся область указанного первого олигонуклеотида, используемого на стадии (а), имеет длину от 8 до 30 нуклеотидов.

31. Способ по п.30, где указанная первая гибридизующаяся область указанного первого олигонуклеотида, используемого на стадии (а), имеет длину от 10 до 15 нуклеотидов.

32. Способ по п.19, где указанная находящаяся под вопросом область указанного первого олигонуклеотида, используемого на стадии (а), находится в пределах приблизительно 10 оснований от 3’-концевого нуклеотида указанного первого олигонуклеотида.

33. Способ по п.32, где указанная находящаяся под вопросом область указанного первого олигонуклеотида, используемого на стадии (а), находится в пределах приблизительно 6 оснований от 3’-концевого нуклеотида указанного первого олигонуклеотида.

34. Способ по п.33, где указанная находящаяся под вопросом область указанного первого олигонуклеотида, используемого на стадии (а), находится в положениях 4 и 6 от 3’-концевого нуклеотида указанного первого олигонуклеотида.

35. Способ по п.19, где указанный первый олигонуклеотид, используемый на стадии (а), имеет в своей первой гибридизующейся области по меньшей мере один нуклеотид искусственного ошибочного спаривания по существу смежный с указанным находящимся под вопросом положением указанного первого олигонуклеотида, где указанный нуклеотид ошибочного спаривания содержит универсальное основание или неразличаемый аналог основания.

36. Набор для идентификации нуклеотидной вариации в нуклеиновой кислоте-мишени образца нуклеиновой кислоты, который содержит олигонуклеотид или набор олигонуклеотидов, указанных в любом из пп.19-37.