Способ получения профиля растительного экстракта - RU2271393C2

Описание

Заявление, касающееся федерального финансирования исследования

Настоящее исследование частично финансировалось грантом ES-07747 NIEHS, из National Institutes of Health, и, таким образом, правительство США может обладать определенными правами на настоящее изобретение.

Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение относится к способу установления «идентичности» листьев Ginkgo biloba или выделенного гинкголида В (GKB), компонента экстракта листьев Ginkgo biloba, посредством получения «профиля генной регуляции». Изобретение также относится к способу проверки идентичности экстракта Ginkgo biloba путем сравнения профиля генной регуляции экстрактом Ginkgo biloba неизвестного или сомнительного происхождения с профилем генной регуляции экстрактом Ginkgo biloba известного происхождения. Термин «известное происхождение» относится к коммерческому источнику экстракта. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения экстракт Ginkgo biloba представляет собой EGB 761®, который производится и продается IPSEN в Париже, Франция. Более конкретно, данное изобретение относится к способу определения аутентичности экстракта неизвестного происхождения, который, как предполагается, представляет собой EGB 761®. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу установления профиля генной экспрессии гинкголида А, гинкголида В или других компонентов, выделенных из экстракта Ginkgo biloba, более конкретно из EGB 761®.

Фармацевтическое производство основано на контроле состава и соответствия профиля биологической активности производимой партии. Данная стандартизация и контроль обеспечивают воспроизводимый материал для предсказуемого и соответствующего лечения пациентов. Такое применение стандартизации и контроля с целью предохранения против поддельных экстрактов, выдаваемых за EGB 761®, является благоприятным для пациентов, поскольку оно вселяет в пациентов уверенность в том, что они получают экстракт с конкретным профилем биологической активности.

Ginkgo biloba является одним из реликтовых растений, и экстракты из его листьев применяли в традиционной медицине в течение нескольких сотен лет. Имеются многочисленные исследования, описывающие благоприятное действие экстрактов Ginkgo biloba на пациентов с нарушениями внимания, памяти и когнитивных функций, ассоциированных со старением и одряхлением, и на таковых со всеми типами деменции, на изменение настроения и на способность справляться с ежедневными стрессами. В большинстве данных иссследований использовали стандартизованный экстракт листьев Ginkgo biloba EGB 761®. Также известно, что данный экстракт обладает кардиопротективным действием (DeFeudis F.V. Ginkgo biloba extract (EGB 761®): from chemistry to clinic. Ullstein Medical, Wisbaden, Germany. 400 pp. 1998; Tosaki, A., DroyLefaix, M. Т., Pali, Т., and Das, D. K., Free Rad. Biol. Med., 14: 361-370, 1993). Данные эффекты обусловлены, по меньшей мере частично, тем, что EGB 761® обладает свойствами захвата свободных радикалов, возможно, по причине наличия в экстракте флавоноидных и терпеноидных составляющих. Последние исследования in vivo и in vitro продемонстрировали, что терпеновые составляющие EGB 761®, гинкголиды и билобалид, обладают антиоксидантными свойствами (Pietri, S., Maurelli, Е., Drieu, К., and Culcasi, M., J. Mol. Cell. Cardiol., 29:733-742, 1997; Yao, Z., Boujrad, N., Drieu, K., and Papadopoulos, V., Adv. Ginkgo Biloba Res. 7: 129-138, 1998). В других исследованиях EGB 761® сообщалось о медицинской ценности данного продукта при лечении различных клинических нарушений, включая недостаточность мозгового кровообращения и периферической сосудистой недостаточности, ассоциированных со старением и одряхлением. См., например, Ginkgo biloba Extract (EGB 761®) Pharmacological Activities and Clinical Applications, DeFeudis, F. V., Eds, Elsevier, 1991; и Ullstein Medical 1998, Ginkgo biloba extract (EGB 761®), Eds. Wiesbaden, DeFeudis, F. V. Экстракт содержит 24% гинкго-флавоновых гликозидов, 6% терпеновых лактонов (гинкголидов и билобалида), около 7% проантоцианидинов и некоторые другие составляющие. См. Boralle, N., et al.. In: Ginkgolides, Chemistry, Biology, Pharmacology and Clinical perspectives, Ed: Braquet, P., J. R. Prous Science Publishers, 1988.

Чаще всего в торговый поток попадают поддельные препараты, выдаваемые за EGB 761®. Такие подделки не имеют той же композиции компонентов, которая составляет аутентичный EGB 761®. Пациенты, которые получают поддельный EGB 761®, полагая, что подделка является аутентичной, недополучают преимуществ полного спектра биологической активности EGB 761®. Более того, сходит на нет благоприятная репутация, связанная с EGB 761®. Поэтому имеется потребность в способе установления профиля биологической активности EGB 761®, который затем может использоваться для сравнения с профилем биологической активности поддельного EGB 761® для выявления таких подделок в торговых точках.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу установления профиля генной регуляции экстрактом Ginkgo biloba или компонентом экстракта Ginkgo biloba, который включает в себя стадии:

получения по меньшей мере одной группы необработанных клеток;

обработки первой группы клеток экстрактом Ginkgo biloba или компонентом экстракта Ginkgo biloba, с получением обработанной группы клеток;

количественной оценки воздействия на экспрессию одного или более генов в обработанных клетках, с получением количества подвергшихся воздействию генов; и

сравнения количества подвергшихся воздействию генов с количеством генов в клетках, не обработанных экстрактом Ginkgo biloba или компонентом экстракта Ginkgo biloba, с получением профиля генной регуляции экстрактом Ginkgo biloba или компонентом экстракта Ginkgo biloba.

Предпочтительным способом осуществления указанного выше способа является такой, при котором стадия количественной оценки включает в себя

выделение полиА+РНК из обработанной группы клеток, с получением обработанной полиА+РНК;

выделение полиА+РНК из необработанной группы клеток, с получением необработанной полиА+РНК;

генерирование меченых кДНК-зондов из обработанной полиА+РНК, с получением обработанных меченых кДНК-зондов;

генерирование меченых кДНК-зондов из необработанной полиА+РНК, с получением необработанных меченых кДНК-зондов;

гибридизацию обработанных кДНК-зондов с полем (под полем подразумевается ранжированный ряд), содержащим одну или несколько кДНК, с получением обработанного гибридизованного кДНК-поля;

гибридизацию необработанных кДНК-зондов с полем, содержащим одну или несколько кДНК, с получением необработанного гибридизованного кДНК-поля;

количественную оценку каждой кДНК на обработанном гибридизованном кДНК-поле, с получением количеств обработанной кДНК;

количественную оценку каждой кДНК на необработанном гибридизованном кДНК-поле, с получением количеств необработанной кДНК; и

сравнение количеств каждой из обработанных кДНК с количествами каждой из необработанных кДНК, с получением профиля генной регуляции.

Предпочтительным способом осуществления непосредственно предшествующего способа является способ, при котором клетки представляют собой клетки MDA-231; экстракт Ginkgo biloba представляет собой EGB 761®; и поле представляет собой генный чип, несущий множественные гены.

Предпочтительным способом осуществления непосредственно предшествующего способа является способ, при котором профиль генной регуляции EGB 761® включает в себя повышенную экспрессию протоонкогена с-Мус и сниженную экспрессию следующих генов: протимозин-α, CDK2, p55CDC, миелобластин, ядерный антиген пролиферирующих клеток р120, NET1, ERK2, аденозиновый рецептор А2А, FIt3-лиганд, Grb2, кластерин, RXR-β, глутатион-S-трансфераза Р, N-Myc, TRADD, SGP-2, NIP-1, Id-2, ATF-4, ETR101, ETR-103, макрофагальный колониестимулирующий фактор-1, гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста, белок, подобный фактору роста гепатоцитов, ингибин-α, антиген В-лимфоцитов CD19, L1CAM, β-катенин, интегриновая субъединица α3, интегриновая субъединица α4, интегриновая субъединица α6, интегриновая субъединица β5, интегриновая субъединица αМ, АРС, РЕ-1, RhoA, c-Jun, протимозин-α, CDK2, p55CDC и миелобластин.

Предпочтительным способом осуществления непосредственно предшествующего способа является способ, при котором профиль генной регуляции EGB 761® примерно представляет собой:

с-Мус=+75%,

c-Jun=-78%,

RhoA=-93%,

АРС=-59%,

PE-1=-42%,

протимозин-α=-79%,

миелобластин=-66%,

p55CDC=-63%,

ядерный антиген пролиферирующих клеток р120=-68%,

CDK2=-83%,

NET1=-55%,

ERK2=-46%,

аденозиновый рецептор А2А=-40%,

Flt3-лиганд=-58%,

Grb2=-70%,

кластерин=-54%,

RXR-β=-55%,

глутатион-S-трансфераза Р=-39%,

N-Myc=-74%,

TRADD=-51%,

NIP-1=-40%,

Id-2=-65%,

ATF4=-42%,

ETR103=-65%,

ETR101=-60%,

антиген В-лимфоцитов CD19=-62%,

L1CAM=-72%,

β-катенин=-58%,

интегриновая субъединица αM=-41%,

интегриновая субъединица β5=-55%,

интегриновая субъединица α4=-49%,

интегриновая субъединица α3=-77%,

интегриновая субъединица α6=-53%,

макрофагальный колониестимулирующий фактор-1 (CSF-1)=-31%,

гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста (HB-EGF)=-62%,

белок, подобный фактору роста гепатоцитов (HGFLP)=-81%, и

ингибин-α=-69%,

где показанные значения в процентах могут составлять ±20%.

Предпочтительным способом осуществления любого из предшествующих способов является способ, при котором клетки представляют собой клетки MDA-231; компонент экстракта Ginkgo biloba представляет собой гинкголид В; и поле представляет собой генный чип, несущий множественные гены.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу проверки идентичности экстракта Ginkgo biloba, включающего в себя стадии

получения профиля генной регуляции экстрактом Ginkgo biloba с целью получения профиля генной регуляции;

получения профиля генной регуляции EGB 761® с выходом профиля генной регуляции EGB 761®;

сравнения профиля генной регуляции экстрактом Ginkgo biloba с профилем генной регуляции EGB 761®;

определения того, лежат ли значения профиля регуляции экстракта Ginkgo biloba в интервалах ±10% значений профиля генной регуляции EGB 761®, для получения проверки идентичности экстракта Ginkgo biloba.

Предпочтительным способом осуществления непосредственно предшествующего способа является такой, при котором способ получения профиля генной регуляции экстрактом Ginkgo biloba и EGB 761® включает в себя стадии

выделения полиА+РНК из обработанной группы клеток, с получением обработанной полиА+РНК;

выделения полиА+РНК из необработанной группы клеток, с получением необработанной полиА+РНК;

генерирования меченых кДНК-зондов из обработанной полиА+РНК, с получением обработанных меченых кДНК-зондов;

генерирования меченых кДНК-зондов из необработанной полиА+РНК, с получением необработанных меченых кДНК-зондов;

гибридизации обработанных кДНК-зондов с полем (ранжированным рядом), содержащим одну или несколько кДНК, с получением обработанного гибридизованного кДНК-поля;

гибридизации необработанных кДНК-зондов с полем, содержащим одну или несколько кДНК, с получением необработанного гибридизованного кДНК-поля;

количественной оценки каждой кДНК на обработанном гибридизованном кДНК-поле, с получением количеств обработанной кДНК;

количественной оценки каждой кДНК на необработанном гибридизованном кДНК-поле, с получением количеств необработанной кДНК; и

сравнения количеств каждой из обработанных кДНК с количествами каждой из необработанных кДНК, с получением профиля генной регуляции.

Краткое описание чертежа

Чертеж. Транскрипционный ответ на EGB 761® означает действие на гены, участвующие в клеточной пролиферации.

Показанные результаты представляют собой количественный анализ экспрессионного поля Atlas кДНК человека, содержащего 588 фрагментов кДНК, апмлифицированных путем PCR (Clontech Inc.). мРНК получали из контрольных или обработанных EGB 761® в течение 48 часов клеток MDA-231. Для нормирования обилия мРНК нормировали денситометрические значения, полученные при анализе изображения, с использованием контрольно-диспетчерских генов, имеющихся на поле. Рассматривали только устойчивые значимые изменения, составляющие свыше 30%.

Подробное описание

Термин «терпеноид гинкго» включает в себя все встречающиеся в природе терпены, которые происходят от голосеменного дерева Ginkgo biloba, а также синтетически продуцированные терпеноиды гинкго и их фармацевтически активные производные и соли, и их смеси. Примеры терпеноидов гинкго включают в себя гинкголиды. Ginkgolides, Chemistry, Biology, Pharmacology, and Clinical Perspectives, J. R. Provs. Science Publishers, Edited by P. Braguet (1988); F. V. DeFeudis, Ginkgo Biloba Extract (EGB 761®); Pharmacological Activities and Clinical Applications, Elsevier, Chapter II (1991).

Используемый в данном описании термин «гинкголид» включает в себя различные гинкголиды, описанные в книгах, цитируемых выше, а также их нетоксичные фармацевтически активные производные. Примеры производных гинкголидов включают в себя тетрагидропроизводные, ацетильные производные и алкиловые сложные эфиры, такие как моноацетатные производные и триацетатные производные, описанные Okabe, et al., J. Chem. Soc. (c), pp. 2201-2206 (1967). Гинкголид В имеет следующую структуру и при использовании в данном описании относится к изолированному гинкголиду В:

Используемый в данном описании термин «экстракт Ginkgo biloba» включает в себя набор природных молекул, включая терпеноиды, выделенные из листьев дерева Ginkgo biloba. Предпочтительно экстракт представляет собой конкретный препарат экстракта Ginkgo biloba, известный как EGB 761®.

Профиль генной экспрессии экстракта Ginkgo biloba или его компонентов может быть получен способами, известными в данной области. Обычно такой профиль получали путем нозерн-блоттинга РНК или путем анализа защиты от рибонуклеазы, применяемых для каждого индивидуального генного продукта. Однако данные способы анализа отнимают много времени и требуют примерно 2-3 дня для анализа каждого гена. В настоящее время профиль генной экспрессии может определяться посредством применения технологии полей нуклеиновых кислот, таких как экспрессионное поле Atlas I кДНК человека от Clontech (Palo Alto, СА); микрополя GeneFilters от Research Genetics (Huntsville, AL); и микрополя генной экспрессии от Genome Systems, Inc. (St.Louis, МО). Микрополя Gene Filters являются ДНК-полями высокой плотности, которые производятся на мембранах 5 см × 7 см. К настоящему моменту доступны четыре мембраны для генов человека и одна - для генов крысы. Каждая мембрана содержит приблизительно 5000 последовательностей. Некоторые из указанных последовательностей представляют собой известные гены, в то время как большая часть последовательностей представляют собой EST с неизвестной функцией. От Research Genetics скоро будут доступны генные поля на платформе чипа Affymetrix Gene, где гены иммобилизированы на силиконовом чипе. В случае силиконовых чипов результаты гибридизации (с мРНК выбора) выявляют методом флуоресценции и анализируют путем распознавания образов, сравнивая либо флуоресценцию, либо радиоактивность, которые можно использовать для детекции результатов гибридизации на мембранных полях.

В способе Genome System используется технология GEM, по которой набор молекул комплементарной ДНК (кДНК), которые содержат генетическую информацию из интересующих биологических систем, депонирован и привязан к стеклянной поверхности в формате поля. Затем большую часть от половины двойной нити ДНК удаляют, активируя таким образом индивидуальные элементы поля, подготавливая их к реакции с их однозначно подходящими дополнениями из тестируемых клеток. Посредством технологии GEM на одном поле можно разместить 10000 уникальных генов. В технологии GEM также применяется способ кодирования цветом для оценки различия в экспрессии между двумя образцами ДНК.

кДНК-поле содержит множественные амплифицированные посредством PCR фрагменты кДНК животного, такого как крыса или человек, предпочтительно человека, иммобилизованные на положительно заряженной нейлоновой мембране или предметном стекле, или силиконовом чипе, или любой другой поверхности, подлежащей разработке, где возможно взаимодействие ДНК/матриц. Интересующий тип клеток обрабатывают или не обрабатывают экстрактом Ginkgo biloba или его компонентом в течение 48 часов. Из контрольных или обработанных экстрактом клеток выделяют полиА+РНК. С каждой полиА+РНК генерируют меченные³²P, флуоресцентные, хемилюминесцентные или колориметрические кДНК зонды, при использовании стеклянных или основанных на силиконовом чипе полей, предпочтительно хемилюминесцентные или колориметрические, и гибридизуют их на поле согласно рекомендациям производителя. Авторадиографию проводят путем экспонирования пятен на пленку примерно при -70°С в течение 4-96 часов. Количественный анализ гибридизации проводят с использованием систем обработки изображения, которые могут выявлять флуоресценцию или хемилюминесценцию при фиксировании изображения и анализировать данные, такие как программное обеспечение SigmaGel. Для детекции генов, экспрессируемых на низком уровне, используют множественные экспозиции. Для сравнения относительных уровней экспрессии детектируемых генных продуктов в контроле и обработанных экстрактом клетках используют три внутренних контроля, убиквитин, G3PDH и β-актин. Вариации, связанные с экспериментом, корректируют с использованием отношений генной экспрессии к внутренним контролям. Эффект от обработки экстрактом для каждого генного продукта выражают в % от значения, полученного для контрольных (необработанных) клеток.

Приводится следующий пример предшествующего типа профиля генной экспрессии. Экспрессионное поле Atlas I кДНК человека от Clontech (Palo Alto, СА) содержит 588 апмлифицированных путем PCR фрагментов кДНК длиной 200-500 п.н., иммобилизованных на нейлоновой мембране. Клетки MDA-231 обрабатывали или не обрабатывали 20 мг/мл EGB 761® в течение 48 часов. Из контрольных или обработанных EGB 761® клеток выделяли полиА+РНК. С каждой полиА+РНК генерировали меченные³²P зонды и гибридизовали их на поле Atlas согласно рекомендациям производителя. Авторадиографию проводили путем экспонирования пятен на пленку Х-ОМАТ AR (Kodak, Rochester, NY) при -70°С в течение 4-96 часов. Количественный анализ наблюдаемой гибридизации проводили с использованием программного обеспечения SigmaGel (Jandel Scientific, San Rafael, СА). Для детекции генов, экспрессируемых на низком уровне, использовали множественные экспозиции. Для сравнения относительных уровней экспрессии детектируемых генных продуктов в контроле и обработанных EGB 761® клетках использовали три внутренних контроля, убиквитин, G3PDH и β-актин. Вариации, связанные с экспериментом, корректировали с использованием отношений генной экспрессии к внутренним контролям. Эффект от обработки EGB 761® для каждого генного продукта выражали в % от значения, полученного для контрольных (необработанных) клеток. Результаты данного эксперимента, который представлен в таблице 1, показывают гены, стабильно подвергающиеся воздействию до уровня свыше 30% от контроля путем обработки EGB 761®. В сущности, в таблице показано, что обработка приводила к повышению экспрессии ротоонкогена с-Мус и снижению экспрессии 35 генных продуктов, включая онкогены (АР-1, РЕ-1, RhoA, n-Myc), регуляторы клеточного цикла (CDK2, p55CDC, PCNA р120), модуляторы трансдукции сигнала (NET1, ERK2), относящиеся к апоптозу продукты (SGP-2, NIP1), рецепторы (А2А, RXR-бэта, Grb2), факторы транскрипции (Id-2, ATF-4, ETR101, ETR-103), факторы роста (HB-EGF, HGF-подобный) и молекулы клеточной адгезии (CD19, L1CAM, интегрины α3, α4, α6, β5, Mac-1, β-катенин), которые непосредственно вовлечены в различные пути регуляции клеточной пролиферации.

Для экстрактов Ginkgo biloba известного происхождения могут быть установлены профили генной экспрессии, и затем они могут сравниваться с профилем генной экспрессии экстрактов Ginkgo biloba известного происхождения или экстрактов, которые выдаются за конкретный коммерческий экстракт. Сравнение профилей, таким образом, может применяться в качестве средства скрининга для подтверждения происхождения экстракта.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ установления профиля генной регуляции экстрактом Ginkgo biloba, гинкголидом В или компонентом экстракта Ginkgo biloba. На первом этапе обрабатывают клетки MDA-231 одним из указанных компонентов. Затем из обработанных и необработанных клеток MDA-231 выделяют полиА+РНК, из которых далее генерируют меченные кДНК-зонды. Полученные кДНК-зонды гибридизуют с матрицей, содержащей одну или несколько кДНК. Сравнивают степени гибридизации с указанной матрицей меченных кДНК-зондов из обработанных и необработанных клеток MDA-23 и получают профиль генной регуляции. Приведены соответствующие названия генов и степень изменения экспрессии генов (%). Описан также способ установления аутентичности экстракта Ginkgo biloba неизвестного или сомнительного происхождения с полученным профилем генной регуляции экстрактом Ginkgo biloba известного происхождения. Использование изобретения позволяет устанавливать профили биологической активности экстракта Ginkgo biloba, гинкоголида В или компонента экстракта Ginkgo biloba, а также коммерческого препарата EGB 761®, которые затем могут использоваться для выявления поддельных препаратов в торговых точках. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

Формула