Способы, носители и наборы для улучшенного анализа сравнительной геномной гибридизации - RU2017141010A
Код документа: RU2017141010A
Формула
1. Способ сравнительной геномной гибридизации (CGH) на одной матрице для оценки наличия и количества вариаций числа копий в тестируемой ДНК, при этом указанный способ включает следующие этапы:
a) Мечение первым маркером указанной тестируемой ДНК, что приводит к получению меченой тестируемой ДНК;
b) Мечение вторым маркером, отличным от первого, мужской (или женской) эталонной ДНК, что приводит к получению меченой мужской (или женской) эталонной ДНК;
c) Гибридизация ДНК, полученных на этапах а) и b) с тестовой матрицей для гибридизации, что приводит к получению объединенной картины распределения интенсивностей сигналов от обоих маркеров, полученных от соответствующих гибридизованных молекул ДНК;
d) На основе объединенной картины распределения, полученной на этапе с) определение интенсивности отдельных сигналов, создаваемых указанными первым и вторым маркерами;
e) Обеспечение первой оценки CNV в указанной тестируемой ДНК путем сравнения друг с другом двух интенсивностей сигнала, полученных на этапе d);
f) Мечение указанным первым маркером эталонной ДНК, противоположной по полу той, что применяли на этапе b), что приводит к получению эталонной ДНК, меченной указанным первым маркером;
g) Мечение указанным вторым маркером, отличным от первого, указанной эталонной ДНК, противоположной по полу той, что применяли на b), что приводит к получению эталонной ДНК, меченной указанным вторым маркером;
h) Гибридизация обоих ДНК, полученных на этапах f) и g) с эталонной матрицей для гибридизации, что приводит к получению объединенной картины распределения интенсивностей сигналов от обоих маркеров, полученных от соответствующих гибридизованных молекул ДНК;
i) На основе объединенной картины распределения, полученной на этапе h) определение интенсивности отдельных сигналов, создаваемых указанными первым и вторым маркерами;
j) Обеспечение второй оценки CNV в указанной тестируемой ДНК путем сравнения друг с другом:
- интенсивности сигнала указанной тестируемой ДНК, меченной указанным первым маркером, как определено на этапе d),
- с интенсивностью сигнала указанной эталонной ДНК, меченной указанным вторым маркером, как определено на этапе i);
k) Объединение значений CNV, полученных на этапах е) и j) с получением конечного результата определения CNV, получая значение CNV, относящееся к целой тестируемой ДНК, подвергнутой анализу;
при этом в качестве альтернативы при осуществлении указанных этапов f)-i) интенсивности сигналов, упоминаемые на этапе i), можно получить с носителя для хранения данных, на который указанные значения были ранее записаны, и
при этом указанную мужскую эталонную ДНК получали от по меньшей мере одного мужчины-донора и/или указанную женскую эталонную ДНК получали от по меньшей мере одной женщины-донора.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная тестируемая ДНК и/или эталонная ДНК состоит из одной молекулы ДНК.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная тестируемая ДНК и/или эталонная ДНК состоит из более чем одной молекулы ДНК.
4. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что пол донора указанной тестируемой ДНК неизвестен.
5. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что указанная тестируемая ДНК получена из одной клетки или смеси клеток одного и того же индивидуума.
6. Способ по пп. 1-5, отличающийся тем, что указанные эталонные ДНК представляют собой смесь ДНК с по меньшей мере одним изменением числа копий в по меньшей мере одной предварительно определенной области генома с последовательным разведением.
7. Способ по пп. 1-6, отличающийся тем, что на этапе j) указанная интенсивность сигнала указанной тестируемой ДНК, меченной указанным первым маркером, определенным на этапе d), представляет собой интенсивность, получаемую от генотипов, демонстрирующих приобретение Х-хромосомы или потерю Y-хромосомы.
8. Способ по пп. 1-7, отличающийся тем, что на этапах е) и j) оценку CNV осуществляют с помощью способов с применением программного обеспечения, включающих: количественное определение интенсивности сигнала, нормализацию данных, статистический анализ, сокращение систематической ошибки, расчет связанных с хромосомами интенсивностей сигнала и создание связанных с хромосомами ДНК-сегментов.
9. Способ по пп. 1-8, отличающийся тем, что указанные амплифицированные эталонные ДНК подвергают вторичной амплификации с получением соответствующих меченых ДНК, и указанную амплифицированную тестируемую ДНК подвергают такой же вторичной амплификации с получением соответствующей меченой ДНК.
10. Способ по пп. 1-9, отличающийся тем, что указанные эталонные ДНК представляют собой смесь ДНК различных генотипов в различных концентрациях.
11. Способ по пп. 1-10, отличающийся тем, что указанную тестируемую ДНК получают из одной клетки или биоптата человека или животного.
12. Способ по пп. 1-11, отличающийся тем, что оценка указанных вариаций числа копий позволяет выбрать оптимальный ооцит, сперматозоид или эмбрион, подходящий по правильному хромосомному статусу.
13. Способ по пп. 1-12, дополнительно включающий оплодотворение ооцитов и перенос эмбриона в рамках программ по оплодотворению in vitro (IVF).
14. Способ по пп. 1-13, отличающийся тем, что интенсивности сигналов, упоминаемые на этапе i), не содержат систематических ошибок и неспецифических сигналов, при этом указанные интенсивности получены посредством следующей методики:
(I) указанные этапы f)-g)-h)-i) проводят более одного раза, гибридизируя соответствующие эталонные ДНК на микроматрицах различных производственных серий, и
(II) полученные результаты обрабатывают с помощью программного обеспечения с целью получения указанных интенсивностей сигналов, не содержащих системную ошибку и неспецифические сигналы.
15. Способ по пп. 1-13, включающий осуществление «контроля качества» интенсивностей сигналов, упоминаемых на этапе i), путем сравнения их с соответствующими интенсивностями сигналов, не содержащими ошибку и неспецифические сигналы, полученными на этапах (I) и (II) согласно п. 14.
16. Аналитические средства для осуществления способа по пп. 1-15, содержащие, нанесенные слоем на подходящий носитель:
- по меньшей мере одну матрицу для гибридизации для осуществления указанных этапов а)-е) с по меньшей мере одной тестируемой ДНК, и
- одну матрицу для осуществления указанного этапа h).
17. Набор для осуществления способа по пп. 1-15, содержащий:
- по меньшей мере одну матрицу для гибридизации для осуществления указанных этапов а)-е) с использованием по меньшей мере одной тестируемой ДНК,
- эталонные интенсивности сигналов согласно этапу i), записанные на подходящем носителе для хранения информации, или, в качестве альтернативы, эталонную матрицу для осуществления указанного этапа h) и необходимые эталонные меченые мужские и женские ДНК для осуществления указанного этапа, необязательно связанные с контролем качества указанных эталонных ДНК.
