Микросферы гидролизованного крахмала с эндогенными заряженными лигандами - RU2725890C2

Код документа: RU2725890C2

Чертежи

Описание

Область техники

Настоящее изобретение относится к биоразлагаемым микросферам гидролизованного крахмала с эндогенными заряженными лигандами, присоединенными к нему. Изобретение также относится к материалу, состоящему из таких микросфер, а также к применению микросфер или материалов в гемостазе, заживлении ран, выращивании клеток и эмболизации сосудов.

Предпосылки изобретения

Крахмал, разветвленный полимер глюкозы (состоящий из глюкозных цепочек с α4-связями, соединенных с разветвленными участками с α6-связями), является природным веществом, содержащимся в растениях и животных, где он выполняет функцию накопителя энергии. Полимер состоит из амилозы (состоящей из длинных цепочек и слаборазветвленной) и амилопектина (сильноразветвленного и состоящего из коротких цепочек).

Разлагаемые микросферы крахмала (DSM) образованы из поперечно сшитых цепочек крахмала. Разлагаемые микросферы крахмала применяют для временной окклюзии сосудов, также с одновременным введением цитотоксических препаратов и без него (лечение опухолей и профилактика кровотечений) в течение многих лет, а также используют для местного и интраоперационного гемостаза.

Микросферы крахмала разлагаются in vivo амилазой плазмы на олигосахариды, мальтозу и, в конечном итоге, на глюкозу, которая участвует в нормальном метаболизме.

Микрочастицы крахмала или модифицированного крахмала известны из уровня техники, например, в документах US 6060461 и WO 2009/091549, т.е. для биосовместимого гемостаза.

Кроме того, документ U.S. 3812252 относится к гидролизованному крахмалу и его применению для лечения ран, в том числе хронических.

Заживление раны является сложным процессом, при котором кожа или другой орган восстанавливается после травмы. Классическая модель заживления раны делится на четыре последовательных, но пересекающихся, этапа: (1), кровоостанавливающий (гемостатический), (2) воспалительный, (3) пролиферативный, (4) реконструктивный.

Гемостаз является основным этапом в процессе заживления ран, в результате которого останавливается процесс кровотечения. Через несколько минут после повреждения кожи или другого органа, кровяные тельца (тромбоциты) активируются и агрегируются в месте повреждения для формирования фибринового сгустка.

Когда происходит повреждение эндотелия, эндотелиальные клетки перестают тормозить свертывание и начинают выделять факторы свертывания крови, которые вызывают гемостаз после травмы. Гемостаз состоит из трех основных этапов: 1) сужение сосудов, 2) временное блокирование тромбом, и 3) свертывание крови путем преобразования фибриногена в фибрин и образование сгустка, который закупоривает отверстие, пока ткани восстанавливаются.

В воспалительной фазе бактерии и инородные тела фагоцитируются и удаляются, и факторы, вызвавшие миграцию и деление клеток, участвуют в пролиферативной фазе.

Приблизительно через 2-3 дня фибробласты начинают входить в область раны, отмечая наступление пролиферативной фазы еще до того, как воспалительная фаза закончилась. Эта фаза характеризуется ангиогенезом, отложением коллагена, формированием грануляционной ткани, эпителизацией и сокращением раны. При ангиогенезе образуются новые кровеносные сосуды, необходимые для подачи кислорода и питательных веществ к месту раны для поддержки поздних стадий заживления раны. Одновременно фибробласты начинают накапливаться в месте раны, их количество достигает пика через 1-2 недели после травмы. До конца первой недели, фибробласты являются основными клетками в ране.

В первые 2-3 дня после повреждения, фибробласты, главным образом, пролиферируют и мигрируют, при этом позже они являются основными клетками, которые выстилают коллагеновую матрицу в месте раны. Изначально фибробласты используют фибриновый струп, образованный во время воспалительной фазы, чтобы мигрировать сквозь него, прилипая к фибронектину. Фибробласты затем накапливают основное вещество на дне раны, а потом коллаген, к которому они могут прилипнуть для миграции. Грануляционная ткань, растущая из основания раны, начинает созревать в ране уже во время фазы воспаления, и продолжает расти, пока дно раны не будет покрыто. Грануляционная ткань состоит из новых кровеносных сосудов, фибробластов, воспалительных клеток, эндотелиальных клеток, миофибробластов и из компонентов новой, временной внеклеточной матрицы. Реэпителизация эпидермиса происходит, когда эпителиальные клетки пролиферируют и "ползут" поверх дна раны, обеспечивая покров для основной новообразованной ткани.

Выращивание клеток - это процесс, при котором клетки выращиваются в контролируемых условиях. Историческое развитие и способы выращивания клеток тесно переплетены с таковыми для выращивания тканей и органов. Выращивание клеток - это процесс, при котором клетки выращивают в контролируемых условиях. Выращивание клеток животных стало обычной лабораторной методикой в середине 1900-х годов, но концепция сохранения живых клеточных линий, отделенных от их первоначальной ткани была открыта в 19-м веке. Выращивание ткани заключается в росте тканей и/или клеток отдельно от организма. Это, как правило, поддерживается с применением жидкой, полутвердой или твердой среды для роста, такой, как бульон или агар. В этом описании выращивание клеток и выращивание тканей будут использоваться, как синонимы.

Некоторые клетки естественно обитают в суспензии, не привязываясь к поверхности, такие как клетки, которые существуют в кровотоке. Такие клетки могут быть выращены в суспензии. Однако, большинство клеток, полученные из твердых тканей зависимы от опорной точки, так называемые прилипающие клетки. Для прилипающих клеток необходима поверхность, такая, как пластиковая подложка для выращивания ткани или микроносители, чтобы расти дальше. Микроносители для выращивания прилипающих клеток доступны, как, например, микросферы декстрана. Когда прилипающие клетки собирают или пассируют (транспорт субкультуры), клетки должны быть отделены от поверхности, где они выросли. Обычно это делается путем добавления смеси трипсин-EDTA к культуре.

Эмболизация (закупорка) сосудов используется в качестве минимально инвазивной альтернативой хирургии. Целью эмболизации является предотвращение притока крови к области тела, создавая ишемию, которая может эффективно уменьшить опухоль или блокировать аневризмы.

Процедуру проводят, как эндоваскулярную процедуру, консультант рентгенологи в интервенционном кабинете. Общепринято, что для большинства пациентов, чтобы лечение проводилось с небольшим или нулевым седативным эффектом, хотя это во многом зависит от органа подвергающегося эмболизации.

Доступ к органу достигают посредством проволочного направителя и катетера (катетеров). Применяемая искусственный эмболия является, как правило, одним из следующих способов: в виде металлической спирали, гидроспирали, частиц, пены или затора.

Средства, применяемые при эмболизационной терапии, такие, как жидкие эмболические средства, которые могут течь через сложные сосудистые структуры. Примеры этого: этиодол, приготовленный из йода и макового масла, который является очень вязким веществом и обычно используется для хемоэмболизации, особенно при гепатомах; склеротирующие средства, которые укрепляют эндотелиальную выстилку сосудов и этанол.

Дисперсные эмболические средства также используются для эмболизации прекапиллярных артериол и мелких артерий. Gelfoam® временно закупоривает сосуды на 5 недель. Микросферы - широко применяемые средства, как для щадящей эмболизации, так и для хемоэмболизации. Поливиниловый спирт (PVA) и микросферы акриложелатина не разлагаются /л-vivo, поэтому они постоянно находятся в пациенте. В зависимости от ситуации применяют микросферы различных размеров, в диапазоне от приблизительно 50 мкм до приблизительно 1,2 мм в диаметре.

Сущность изобретения

В некоторых случаях оно может представлять интерес для изменения свойств биоразлагаемых микросфер крахмала. Настоящее изобретение предлагает способы изменения биоразлагаемости биоразлагаемых микросфер крахмала; близости биоразлагаемых микросфер крахмала к биологическим системам и/или его компонентам; степени набухания биоразлагаемых микросфер крахмала; скорости набухания биоразлагаемых микросфер крахмала; сжимаемости/эластичности биоразлагаемых микросфер крахмала и/или селективности химического взаимодействия с ионами и молекулами в/на биоразлагаемых микросферах крахмала. Биологические системы и/или их компоненты, описанные выше, могут составлять, например, орган или клетку или их компоненты; бактерии; вирусы; белки и ферменты; полисахариды; липиды; малые молекулы и/или ионы.

Таким образом, настоящее изобретение относится к биоразлагаемой микросфере диаметром 10-2000 мкм, содержащей поперечно сшитый гидролизованный крахмал, с которым через связь через группу сложного эфира карбоновой кислоты связан по меньшей мере один тип лиганда, где указанный лиганд является эндогенной заряженной молекулой с молекулярной массой менее 1000 Да, содержащей по меньшей мере одну дополнительную функциональную группу карбоновой кислоты и/или по меньшей мере одну функциональную аминогруппу, и где в гидролизованном крахмале в среднем 0,05-1,5 лиганда связано с каждым глюкозным фрагментом.

Настоящее изобретение также относится к различным применениям и приложениям этой микросферы.

Описание изобретения

Микросферы, согласно изобретению, включают поперечно сшитый крахмал, подвергнутый кислотному гидролизу. Микросферы могут быть получены из крахмала, подвергнутого кислотному гидролизу, путем эмульгирования раствора крахмала в органический растворитель, такой как толуол или дихлорэтан. Полиглюкозные цепи поперечно сшиваются сшивающим реагентом, таким, как эпихлоргидрин, образуя эфирные связи с глицерином (1,3-диокси-пропан-2-ол), как показано ниже, формируя разлагаемые микросферы крахмала (DSM).

DSM разлагаются in vivo амилазой на олигодекстрины и, в конечном итоге, на глюкозу. Поперечные сшивки остаются в олигосахаридах переменного размера. Судьба их in vivo все еще неизвестна, но вполне вероятно, что они либо выводятся с мочой или фильтруются из ретикулоэндотелиальной системы и распадаются.

Микросферы являются биологически разлагаемыми, определенными, как материал, который разлагается и/или метаболизируется и выводится из организма в физиологических (in vivo) условиях. В этом случае физиологические (in vivo) условия охватывают животных, в частности, позвоночных и более конкретно млекопитающих.

По сути, биоразлагаемые микросферы крахмала полностью распадаются и выводятся из их физиологической среды, такой, как человеческое тело. В зависимости от назначения, микросферы приспособлены распадаться в определенное время, подходящее для использования по назначению. Это время может варьироваться от нескольких минут до 3 месяцев, более предпочтительно до 1 месяца.

Размер биоразлагаемых микросфер, согласно изобретению, находится в микромасштабе, а точнее от 10 мкм до 2000 мкм.

Свойства DSM могут быть изменены путем присоединения лигандов к DSM, и, в частности, к гидроксильным группам глюкозы. Свойства DSM зависят от выбора лигандов, а также от числа лигандов, присоединенных к крахмалу.

Лиганды присоединены к DSM через сложноэфирную связь к глюкозным мономерам DSM. Для того чтобы присоединение лигандов к гидролизованному крахмалу через эту сложноэфирную связь было возможным, лиганды должны содержать по меньшей мере одну карбоксильную группу, то есть по меньшей мере одну -СООН группу, способную образовывать сложноэфирную связь. Сложноэфирная связь может подвергаться химическому или ферментативному гидролизу in vivo, а использование таких связей приводит к биоотделяемым лигандам.

Кроме того, лиганды должны быть эндогенными веществами, которые заряжены при физиологических значениях рН, т.е. при рН 6-8. В дополнение к функциональной группе карбоновой кислоты, используемой для осуществления присоединения лиганда к гидролизованному крахмалу через связь через группу сложного эфира карбоновой кислоты, лиганды должны содержать по меньшей мере одну дополнительную группу карбоновой кислоты и/или по меньшей мере одну первичную, вторичную, третичную или четвертичную функциональную аминогруппу. Поскольку лиганды являются эндогенными соединениями, DSM, таким образом, распадаются на эндогенные соединения, которые метаболизируются и/или выводятся.

Лиганд может, таким образом, быть положительно заряженным, отрицательно заряженным или цвиттер-ионом, т.е. как положительно, так и отрицательно заряженным одновременно. Лиганды могут также иметь неполярные (гидрофобные) части для дальнейшего изменения свойств DSM. Далее, можно использовать смесь различных лигандов.

Заряженные лиганды требуют противоионы. Когда лиганд положительно заряжен, противоион будет отрицательно заряжен, а когда лиганд отрицательно заряжен, противоион будет положительно заряжен. Этот противоион может быть физиологически активным противоионом. Если лиганд цвиттер-ионный, он содержит в себе свой собственный противоион.

Эндогенные лиганды должны быть, кроме того, малыми молекулами с молекулярной массой менее 1000 Да.

С каждым глюкозным фрагментом в DSM в среднем 0,05-1,5 лиганда может быть связано в соответствии с изобретением. Молярное отношение лиганда к глюкозе, таким образом, от 1,5:1 до 1:20 в DSM.

Лиганд может быть выбран из группы, состоящей из аминокислот, других азотсодержащих органических кислот и двухосновных кислот.

Лиганды, которые могут быть предпочтительнее для некоторых вариантов осуществления изобретения приведены в таблице 1.

В таблице 1 показаны предпочитаемые лиганды. R в структурных формулах - мономер глюкопиранозила, приведенного ниже, в гидролизованном крахмале. R² представляет собой лиганд в любых возможных позициях - 2,3 и/или 6 - в глюкозном фрагменте DSM, как приведено ниже.

Описанная выше микросфера может быть применена в гемостазе, заживлении раны, выращивании клетки in vitro и эмболизации сосудов. Описанная выше микросфера может также быть применена для производства биоразлагаемого материала, пригодного для применения при заживлении раны.

Эти различные приложения обсуждается ниже. Гемостаз

В некоторых вариантах осуществления для применения в гемостазе лиганды, присоединенные к микросферам, предпочтительно положительно заряжены или цвиттер-ионные.

В некоторых вариантах осуществления лиганды, присоединенные к микросферам, предпочтительно положительно заряжены. Применяемый противоион, тогда, может быть эллаговой кислотой.

Для гемостаза микросферы, согласно изобретению, должны предпочтительно иметь средний диаметр от 10 мкм до 200 мкм.

При применении для гемостаза микросферы, согласно изобретению, могут быть добавлены на/в рану в виде порошка, раствора или прикреплены к поддерживающей структуре, такой, как марля.

Заживление раны

Микросферы могут применять для производства материала для заживления раны. Этот материал должен иметь трехмерную структуру, состоящую из микросфер и пустот между микросферами.

Благодаря пустотам материал будет проницаемыми для газов и жидкостей и, таким образом, не гелеобразующим при контакте с жидкостями.

Тот факт, что материал является не гелеобразующим материалом означает, что можно избежать пленкообразующего слоя, когда материал применяется на/в ране, и, таким образом, что возможно предотвратить отек, собирающийся под слоем; способствовать эффективному транспорту кислорода и питательных веществ, а также допускается беспрепятственная миграция клеток и эффективная передача давления на или из основной ткани.

Микросферы в материале могут быть однородной фракцией. Для создания пустот между микросферами во многих случаях предпочтительно, чтобы микросферы в материале были достаточно гомогенными по размеру. Если микросферы должны быть неоднородными по размеру, пустоты будут заполнены более мелкими микросферами, создавая, тем самым, более прочную структуру, которая будет вредна для предусмотренного эффекта материала. Если микросферы из гомогенной части фракции, то размер микросфер должен, по меньшей мере, для некоторых вариантов осуществления, различаться не более чем на ± 15% от среднего. Например, во фракции микросфер 300 мкм, отдельные микросферы могут быть от 255 до 345 мкм. Размер пустот, т.е. пространство между ближайшими сферами одинакового размера, упакованных вместе, может быть рассчитан, как ((2/квадратный корень из 3)-1)≈0,155 диаметра микросферы.

Материал может состоять из одной части твердой пористой трехмерной сетки.

Микросферы могут быть прикреплены к основе подложки, тем самым иммобилизируя микросферы. Такая основа может быть обычной марлей или полимерным пенным материалом.

По меньшей мере, для некоторых вариантов осуществления для применения при заживлении ран, лиганды, присоединенные к микросферам, предпочтительно, положительно заряжены.

По меньшей мере, для некоторых вариантов осуществления для применения при заживлении ран, лиганды, присоединенные к микросферам, предпочтительно, положительно заряжены и гидрофобны.

Для заживления ран микросферы, согласно изобретению, предпочтительно, имеют средний диаметр от 200 мкм до 2000 мкм.

Предпочтительно, пустоты в материале имеют диаметр от 30 мкм до 300 мкм, а более предпочтительно от 100 мкм до 300 мкм. Пустоты должны быть хотя бы 30 мкм, поскольку это дает возможность прохождению клеток тканей и пучков нервных клеток, которые, как правило, 20-30 мкм в диаметре.

Кроме того, характеристика поверхности материала стимулирует адгезию и пролиферацию клеток. Это включает в себя сродство клетки к поверхности материала и подходящую для прилипания упругость материала.

Биоразлагаемый материал, пригодный для заживления ран, согласно изобретению, в частности, повышает присоединяемость клетки, миграцию и пролиферацию, в стандартном уходе по заживлению ран, или в процедуре NPWT (лечения ран отрицательным давлением) специально для третьей и четвертой фаз процесса заживления ран, а именно пролиферативной и реконструктивной фаз.

Трехмерная структура биоразлагаемого материала, пригодного для заживления ран, согласно изобретению, уменьшает образование рубцовой ткани. Понимая, что рубцовая ткань характеризуется скорее однонаправленным отложением коллагена, матрица, которая в состоянии воздействовать на неупорядоченное отложение коллагена, вероятно должна снижать образование рубцов. В совокупности, этот материал, в соответствии с настоящим изобретением, стимулирует и способствует постоянному росту новой и здоровой грануляционной ткани.

В заживлении раны может быть полезным замедлить биоразлагаемость материала на от 2 дней до 2 недель, выбрав соответствующий (соответствующие) лиганд (лиганды). Это дает возможность достаточного исцеления без необходимости смены повязки, если это не является необходимым по иным причинам.

При применении в заживлении ран или уходе за раной материал, согласно изобретению, может быть добавлен на/в рану в виде порошка, раствора, приклеенного к структуре основы, такой, как марля или твердая цельная сеть.

Материал согласно изобретению может также являться частью повязки на ране.

Было показано, что при нанесении 2 мм слоя негелеобразующих биоразлагаемых сфер крахмала со средним диаметром 200 мкм с положительно заряженной поверхностью на дно раны получается очень хорошая грануляция с ростом клеток до 500 мкм в течение четырех дней.

Выращивание клеток in vitro

Для применения в выращивании клеток in vitro, микросферы предпочтительно имеют средний диаметр от 200 до 1000 мкм, более предпочтительно от 200 до 500 мкм.

Для некоторых вариантов осуществления для выращивания клеток in vitro, лиганды, предпочтительно, положительно заряжены.

Пустоты важны для клеточных культур, поскольку они позволяют эффективное прохождение для прилипающих и растущих клеток, а также позволяют создать эффективную транспортировку матрицы роста и более крупных молекул в культуре.

Эмболизация сосудов

Для эмболизации сосудов, микросфера, согласно изобретению, предпочтительно имеет средний диаметр от 10 до 1200 мкм.

Для применения в эмболизации сосудов, лиганды присоединенные к микросферам, предпочтительно отрицательно заряженными, по меньшей мере, в некоторых вариантах осуществления.

Отрицательный заряд может быть использован, чтобы ионно связать катионный цитостатический препарат, который затем составляет противоион, для лечения опухолей. Такие цитостатические препараты включают в себя доксорубицин, иринотекан, топотекан, эпирубицин, митомицин, цисплатин и сорафениб.

Микросферы, согласно любому из вариантов осуществления изобретения, как описано выше, и, как указано в формуле изобретения, могут применяться в способах повышения, содействия или проведения гемостаза, заживления ран и/или эмболизации сосудов. Кроме того, материал по любому из вариантов осуществления изобретения, как описано выше, и, как указано в формуле изобретения, может быть применен в способе для облегчения или проведения заживления ран.

Микросферы или материал, соответственно, затем вводится в количестве, эффективном для млекопитающих, таких как человек, нуждающийся в гемостазе, заживлении раны и/или эмболизации сосудов. Это может быть человек, страдающий от кровотечения раны или некоторых других видов ран, внутренних, или внешних, таких, как на коже.

Под "введением" подразумевается, что микросферы или материал, согласно изобретению, вводят в контакт с участком, где гемостаз, заживление раны и/или эмболизация сосудов необходимы. В случае ранения, в целях гемостаза и заживления раны, материал может, например, быть помещен в полость раны или на ее поверхность. В случае заживления раны, DSM могут быть представлены в виде порошка, суспензии или мази. В случае гемостаза, DSM могут быть применены в виде сухого порошка или включены в марлю или в подкладку. В случае эмболизации DSM предпочтительно суспендированы в подходящей среде, такой как физиологический раствор.

В этом контексте "эффективное количество" означает количество, которое будет иметь положительное влияние на гемостаз, заживление ран и/или эмболизацию сосудов.

Микросферы, согласно изобретению, также могут быть использованы в способах повышения, содействия или проведения in vitro выращивания клеток. Микросферы, согласно изобретению, можно добавить к подходящей среде для выращивания. Клетки для выращивания также добавляют к этой среде. Микросферы можно добавить к среде для выращивания одновременно с клетками, перед добавлением клеток или после добавления клеток. Затем клетки оставляют размножаться. Как объяснялось выше, выращивание клеток в этой спецификации также включает выращивание ткани.

Микросферы, согласно любому из вариантов осуществления изобретения, как описано выше, и, как указано в формуле изобретения, могут быть дополнительно использованы в повышении, облегчении или осуществлении гемостаза, заживлении ран и/или эмболизации сосудов.

Микросферы, согласно любому из вариантов осуществления изобретения, как описано выше, и, как указано в формуле изобретения, могут применяться для получения медицинского устройства или фармацевтической композиции.

Микросферы, согласно любому из вариантов осуществления изобретения, как описано выше, и, как указано в формуле изобретения, могут быть произведены специально для использования в повышении, облегчении или осуществлении гемостаза, заживлении ран и/или эмболизации сосудов.

Везде в описании и формуле изобретения, слова "включать" и "содержать", и вариации слов, например, "включая" а "содержит", означает "включая, но не ограничиваясь", и они не предназначены для исключения других фрагментов, добавок, компонентов, целых или стадий.

Везде в описании и формуле изобретения в этой спецификации, единственное охватывает множественное число, если только контекст не требует иного. В частности, если единственное число используется в описании, должно быть понятно, что рассматривают множественное так же, как и единственное, если контекст не требует иного.

Признаки, целые, характеристики, соединения, химические фрагменты или группы, описанные в сочетании с определенным аспектом, вариантом осуществления или примером изобретения, следует понимать как применимые к любому другому аспекту, варианту осуществления или примеру, описанному здесь, если только они совместимы с ними.

Краткое описание графических материалов

Изобретение более подробно описано ниже в примерах, которые ссылаются на графические материалы, где:

На фиг. 1 представлены схематический рисунок разлагаемой микросферы крахмала (DSM) и химические модификации, осуществленные в данном исследовании.

На фиг. 2 представлено, что набухание микросфер можно считать подчиняющимся диффузии Фика с начальной высокой скоростью набухания, которая экспоненциально убывает:

где k = константа набухания первого порядка, и Y_∞ = увеличение объема при максимальном набухании.

На фиг. 3 представлена адгезия тромбоцитов. На фиг. 3А представлены фазовый контраст и флуоресцентные микрофотографии, показывающие DSM и прикрепленные к DSM тромбоциты в соответствии с различно модифицированными партиями. Фиг. 3В представлены крупным планом сочленение между двумя агрегированными DSM (партия 4) и агрегатами тромбоцитов, прикрепленных к DSM. Изображено с применением микроскопии дифференциального интерференционного контраста (DIC).

На фиг. 4 представлено in vivo изучение трех партий DSM. Партии 5, 6 и 9 были оценены на экспериментальной модели кровотечения (почечная травма) на крысах, у которых не свертывалась кровь. У всех животных, обработанных партией 9, имел местопервичный гемостаз, у 29% было повторное кровотечение в течение 20 мин наблюдения. Другие партии продемонстрировали значительно меньшую гемостатическую эффективность, только у некоторых животных был достигнут первичный гемостаз.

На фиг. 5 представлена кровопотеря в соответствии с партией для обработки в экспериментальных исследованиях in vivo. Потерю крови измеряли взвешиванием излишней крови, собранной в марлю. Была значительная разница в потере крови между различными партиями (р=0,001), где партия 5 была немодифицированными DSM, партия 6 доказала активацию коагуляции и DSM в партии 9 с адсорбировали тромбоциты.

Примеры

Разлагаемые микросферы крахмала (DSM) были подготовлены эмульгированием поперечным сшиванием гидролизованного крахмала с эпихлоргидрином в толуоле. DSM впоследствии неоднократно промывали с этанолом, затем дистиллированной водой и, наконец, последовательно обезвоживали с увеличением концентрации этанола и сушили в течение ночи при 60°С.

Детали приготовления DSM

2 г гидроксида натрия растворяют в 280 мл очищенной воды и 2 г боргидрида натрия добавляют и растворяют. 153 г гидролизованного крахмала растворяют при медленном перемешивании в течение по меньшей мере 2 часов. 20 г поверхностно-активного вещества (Rhodafac РА17) растворяют в 450 г толуола. Раствор крахмала затем добавляют и эмульгируют в растворе толуола, температуру повышают до 70°С и эмульсию перемешивают до получения желаемого распределения капель по размерам. 22 г эпихлоргидрина добавляют и поперечное сшивание производят в течение 5 часов. Смесь охлаждают до комнатной температуры и ему дают отстояться, после чего супернатант декантируют.DSM подвергают тройной промывке 95%-ным этанолом, одной промывке 0,8%-ной уксусной кислотой, затем 4 промывкам очищенной водой и, наконец, обезвоживают абсолютным этанолом перед сушкой при 60°С в вентилируемом сушильном шкафу.

Определение степени замещения (DS)

Степень замещения определяют, как среднее число замещений в глюкозном мономере.

Метод щелочного омыления, с последующим титрованием избытка щелочи, использовали для определения степени замещения. К образцу 250 мг DSM добавили 10 мл 0,50 М NaOH, и оставили при комнатной температуре на 72 ч, периодически встряхивания. Избыток NaOH оттитровали 0,50 М HCl с применением фенолфталеина в качестве индикатора.

Определение разлагаемости амилазой

Образец DSM (3-6 мг) разбавили фосфатным буфером, рН=7 (5 мл), а затем добавили 400 мкл слюны человека, потом инкубация при 37°С в течение 4 часов. Образец выдерживали в течение 20 мин или центрифугировали, а затем небольшой образец брали со дна и анализировали под микроскопом, чтобы определить наличие или отсутствие микросфер.

Общая методика замещения DSM двухосновными кислотами (примеры, перечисленные в таблице 1)

DSM (1 г) суспендировали в DMF (10 мл), к этой смеси добавляли ангидрид янтарной кислоты (154 мг, 1,54 ммоль) и пиридин (124 мкл, 1,60 ммоль). Смесь перемешивали и нагревали до 90°С в течение ночи, а затем материал промывали трижды 40 мл этанола, потом 5 мл насыщенного раствора NaHCO₃, а затем трижды 30 мл воды. Материал обезвоживали этанолом и высушивали в сушильном шкафу при температуре 60°С. Этот материал проанализировали с помощью ИК-спектроскопии при идентификации карбонила сложноэфирной группы при длине волны 1730 см^-1.

DS: 0,25 (определяли, как описано выше).