Зонд пептидно-нуклеиновой кислоты, набор и способ обнаружения и/или количественного определения salmonella spp. и их применения - RU2567011C2

Чертежи

Описание

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения микроорганизмов, имеющему значение для клинической безопасности и безопасности пищевых продуктов. Для этой цели разработали PNA-зонд для обнаружения рода Salmonella.

В дополнение к зонду настоящее изобретение включает в себя процедуру ONA FISH и ее применение в наборе для обнаружения и/или количественного определения Salmonella spp., который может быть использован в пищевой и клинической областях.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Род Salmonella включает в себя несколько патогенных бактерий, которые могут вызывать заболевания, которые колеблются от простого гастроэнтерита до системных инфекций. Тяжесть заболевания обычно определяется вирулентностью вида/штамма Salmonella, хозяина (человек или другие виды животных) и состоянием его здоровья.

Филогенетические анализы рода показали, что он делится на два вида: Salmonella bongori и Salmonella enterica. Тем не менее до настоящего времени было идентифицировано более чем 2500 серотипов, большинство из которых способны инфицировать людей, и широкий диапазон видов животных. Обычно штаммы Salmonella идентифицируют и классифицируют по серотипам в соответствии со схемой Кауфманна-Уайта, которая основана на типе антигенов, которые присутствуют на наружной мембране.

Эта бактерия может быть передана непосредственно от человека к человеку фекально-оральным путем или через прямой контакт с внешними источниками при фекальном загрязнении почвы, воды и пищи. Поэтому очень важной является разработка надежного способа обнаружения, позволяющего идентифицировать бактерию во всех этих типах проб. Например, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов намерено контролировать передачу Salmonella enteritidis путем осуществления программы испытаний на птицефабриках в отношении зараженной яичной скорлупы, поскольку яичная скорлупа была идентифицирована в качестве основной в передаче микроорганизма.

Обнаружение Salmonella традиционно выполняют с использованием способов культивирования. Однако эти способы являются лабораторными, требующими достаточно большого количества времени (от 4 до 6 дней) и трудоемкими методами. По существу, необходимо развитие новых способов, которые являются более быстрыми и более надежными, которые могут помочь в борьбе с бактериями в цепях снижения сальмонеллеза, как у людей, так и у животных. Для этой цели был разработан ряд молекулярных методов обнаружения с целью сокращения времени, требующегося для идентификации Salmonella в пробах пищевых продуктов, кала, воды и клинических препаратах. Эти методы включают в себя иммуноферментные анализы (ИФА, ELISA), полимеразную цепную реакцию (PCR) и FISH (флуоресцентная in situ гибридизация). Однако некоторые исследования показали, что методы на основе PCR и ELISA не обнаруживают некоторые пробы, которые были положительными в методе культивирования. Даже в таком случае, методы на основе PCR оказались более точными, чем методы ELISA. С другой стороны, при выполнении стадии селективного обогащения перед PCR, обнаруживают не только все положительные в культуре пробы, но также (обнаруживают) наличие Salmonella, которая не была обнаружена методом культивирования, но может быть обнаружена при помощи PCR. Эти исследования показывают, что стадия обогащения может повышать чувствительность молекулярного анализа, устраняя проблемы, такие как низкое число бактерий и наличие ингибирующих веществ в определенных типах проб, таких как пробы пищевых продуктов и пробы кала. Однако методы на основе PCR обычно требуют стадии выделения ДНК, и ни один из указанных выше способов, за исключением FISH, не обеспечивает прямую визуализацию бактерий в пробе. Это может быть важным, например, при предоставлении возможности оценки заражения сальмонеллой яичной скорлупы непосредственно в пробе.

FISH представляет собой молекулярный анализ, широко применяемый для идентификации и локализации бактерий в пробах. Данный способ основан на специфическом связывании коротких олигонуклеотидов (зондов) с конкретными областями рРНК. Зонд соединяют с флуорохромом, и после гибридизации может быть обнаружен сигнал флуоресценции, вызываемый высоким числом копий рРНК в клетке. Уже существуют некоторые исследования, сообщающие об обнаружении Salmonella с использованием ДНК-зондов («utter et al., 2006; Nordentoft et al., 1997).

Совсем недавно зонды пептидных нуклеиновых кислот (PNA) были разработаны для обнаружения микроорганизмов. Молекулы пептидных нуклеиновых кислот имитируют ДНК и способны специфически гибридизоваться с комплементарными нуклеиновыми кислотами, повинуясь правилам Уотсона-Крика. Однако образовавшаяся связь является более сильной, поскольку в молекуле PNA ее отрицательно заряженный сахаро-фосфатный остов в структуре заменяется на нейтральные повторяющиеся единицы (2-аминоэтил)глицин. Адекватное применение PNA-молекулы в FISH-технологии сделало процедуру более надежной, более быстрой и более эффективной.

Ранее метод PNA-FISH был разработан для Salmonella (Perry-0' Keefe et al., 2001). Однако зонд, который использовали, имеет последовательность, которая является комплементарной другим видам, таким как Actinobacillus actinomycetemcomitans, Buchnera aphidicola, Haemophilus Influenza и Yersinia spp, делая зонд менее привлекательным для диагностики. Таким образом, считалась важным конструирование и тестирование нового зонда и разработка нового способа для данного конкретного микроорганизма.

Важно отметить, что, несмотря на большую надежность после оптимизации, разработка способов PNA-FISH является, так же, как и разработка способов PCR, чрезвычайно трудоемкой и требует большого знания химических и физических характеристик различных участвующих параметров. Кроме того, хорошо известно, что наличие, работающего на организм, способа PNA-FISH, не гарантирует, что будут функционировать другие последовательности, нацеленные на один и тот же организм. Кроме того, несмотря на то, что исследователи обычно чувствуют естественнее отсутствие интереса к публикации отрицательных результатов, в литературе может быть найдено несколько исследований, в которых авторы смогли заставить работать лишь некоторые из зондов для одного и того же микроорганизма.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к зонду пептидной нуклеиновой кислоты (PNA) и его способу для обнаружения рода Salmonella (то есть, идентификации или количественного определения).

Описанный в данном изобретении зонд, узнает 23S рРНК микроорганизма или геномные последовательности, соответствующие указанной рРНК. PNA-зонды имеют физико-химические характеристики, которые свойственны их структуре, и при применении PNA-зондов в способе на основе FISH, обеспечивается более быстрый, более точный и более специфический анализ, чем применение ДНК.

Одно из преимуществ данного способа состоит в том, что зонд работает надежно в широком диапазоне биологических проб, что обычно не происходит с другими молекулярными способами обнаружения.

Другой родственный аспект представляет собой время, необходимое для обнаружения. Разработанный в данном изобретении способ соответствует наилучшим периодам времени, опубликованным для остальных молекулярных методов, даже тогда, когда тип пробы требует стадии обогащения перед анализом. Быстрота и надежность способа может определить подходящее и своевременное лечение заражения и/или инфекции для перспектив клинической или продовольственной безопасности.

Другой аспект данного изобретения относится к развитию набора на основе заявляемого зонда для флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), обеспечивая обнаружение Salmonella в широком диапазоне биологических проб быстрым и простым способом.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, описываемый здесь PNA-зонд, позволяет обнаруживать последовательность-мишень в рРНК, в рДНК или в комплементарных последовательностях рРНК Salmonella.

Один из воплощений осуществления данного изобретения, представляет собой описание PNA-зонда, используемого для обнаружения и/или количественного определения Salmonella, характеризующийся тем, что зонд имеет, по меньшей мере, 86% сходство с последовательностью SEG ID No.1-15'-AGG AGC TTC GCT TGC-3', предпочтительно 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% сходство с последовательностью SEG ID No.1-15'-AGG AGC TTC GCT TGC-3.

В более предпочтительном воплощении данного изобретения, описанные ранее последовательности, связывают по меньшей мере с одним типом обнаруживаемой фракции. Тип обнаруживаемой фракции, подлежащей использованию, может быть выбран из одной из следующих групп: конъюгата, системы обнаружения разветвленной (фракции), хромофора, флуорофора, радиоизотопа, фермента, гаптена или люминесцентного компонента, в числе прочих.

В еще даже более предпочтительном воплощении флуорофорная группа может быть по меньшей мере одной из следующих: флуорофорами серии Alexa, цианинами, 5- (и -6) карбокси-2',7'-дихлорфлуоресцеином, 5-ROX (5-карбокси-Х-родамина триэтиламмониевой солью), в числе прочих.

Объектом данного изобретения также является набор для обнаружения наличия или отсутствия и/или количественного определения Salmonella в биологических пробах.

В более предпочтительном воплощении данного изобретения в наборе может дополнительно присутствовать по меньшей мере один из следующих растворов: раствор для фиксации, раствор для гибридизации и промывочный раствор.

Еще в другом предпочтительном воплощении данного изобретения раствор для фиксации может содержать пара-формальдегид и этанол, а именно 2-8% (мас./об.) пара-формальдегида и 25-90% (об./об.) этанола и/или раствор для гибридизации может содержать формамид.

Объектом данного изобретения также является способ обнаружения Salmonella для проверки Salmonella содержащих биологических проб, (способ) который использует указанный выше PNA-зонд, и который содержит следующие стадии:

- контактирования PNA-зонда с биологическими пробами;

- гибридизации PNA-зонда с последовательностью-мишенью микроорганизмов, присутствующих в биологических пробах;

- обнаружения гибридизации в виде показателя указанного обнаружения и количественное определение в биологических пробах, гибридизация может быть предпочтительно выполнена флуоресценцией.

Биологические пробы могут быть взяты, в числе прочих, из крови, воздуха, пищи, воды, биопсий или фекалий.

Объектом данного изобретения также является применение, описанных ранее PNA-зондов, применение описанного ранее набора, и методология, подлежащая применению для обнаружения Salmonella, или обнаружения Salmonella в биологических пробах.

ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение содержит PNA-зонд, реагенты, способы и набор, предназначенные для обнаружения или количественного определения штаммов Salmonella.

Описанный здесь PNA-зонд, делает возможным специфическое обнаружение рода Salmonella путем связывания с рРНК, геномных последовательностей соответствующих рРНК (r), или их комплементарных последовательностей.

Более высокая специфичность PNA-зондов (относительно ДНК-зондов) обеспечивает лучшее распознавание среди родственных нуклеотидных последовательностей.

Это имеет особенную значимость для данного зонда, поскольку существуют некоторые филогенетически родственные к Salmonella микроорганизмы, у которых существует только одно ошибочное спаривание (нуклеотид в 14 положении, описанного в данном изобретении зонда) в отобранной области-мишени. Некоторые примеры этой ситуации представляют собой Shigella, виды Yersinia enterocolitica и штамм Eschehchia coli K12.

Описанный в данном изобретении PNA-зонд, имеет 15 нуклеотидов со следующей нуклеотидной последовательностью:

SEQ ID No.1-5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3'.

Однако, зонд, подлежащий использованию для обнаружения, может демонстрировать по меньшей мере 86% идентичность указанной выше последовательности.

Данный зонд применяют для анализа флуоресценции in situ гибридизации (FISH), который, в случае проб, положительных на Salmonella, дает в результате эмиссию сигнала флуоресценции, обнаруживаемого или через флуоресцентную микроскопию, или проточную цитометрию.

Усовершенствование нового зонда PNA-FISH выполняли эмпирически с использованием специфического программного обеспечения. Селекцию последовательности зонда первоначально выполняли путем сопоставления (выравнивания) последовательностей рДНК микроорганизма-мишени с последовательностями родственных микроорганизмов. Это позволило идентифицировать потенциально применимые области, которые затем будут оценены на основе других параметров, таких как специфичность, температура гибридизации, процентное содержание гуанин/цитозин, свободная энергия связи и вторичная структура.

После создания дизайна и синтеза зонда, для отобранного зонда должны быть разработаны и оптимизированы три стадии процедуры FISH: фиксация/пермеабилизация, гибридизация и промывка. Этот способ обычно включает в себя следующие параметры:

температуру, концентрацию формамида и этанола, и гибридизацию и число промывок. Важно отметить, что обусловленная сложностью способа и большим числом переменных, не всегда возможна разработка способа для каждой последовательности и поэтому часто тестируют несколько альтернативных вариантов и последовательностей.

Успешно выполненная гибридизация впоследствии позволяет сделать заключение о присутствии/отсутствии и даже концентрации микроорганизма путем флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии или PCR в режиме реального времени. Обнаруженный флуоресцентный сигнал обычно является результатом специфического связывания коротких зондов, до десятков или сотен копий рРНК, присутствующих в цитоплазме бактерии. Ту обнаруживаемую фракцию зонда, которая сообщает о существовании стабильного комплекса, образованного зондом и мишенью, выбирают из одной из следующих групп: конъюгата, системы обнаружения разветвленной (фракции), хромофора, флуорофора, радиоизотопа, фермента, гаптена или люминесцентного компонента.

Описанный в данном изобретении способ содержит контактирование пробы по меньшей мере с одним PNA-зондом с последовательностью, сходной последовательности, которая описана выше. Следовательно, анализ основан на простом тесте с окончательным результатом, в отличие от традиционных способов обнаружения Salmonella, которые основаны на фенотипических свойствах и требуют нескольких дней для получения результата.

Еще объектом данного изобретения является набор, подходящий для выполнения анализа для обнаружения, т.е. идентификации или количественного определения Salmonella, присутствующей в биологических пробах. Набор содержит PNA-зонд и другие выбранные реагенты или соединения, необходимые для выполнения анализов гибридизации in situ.

В более предпочтительном осуществлении набор, подходящий для выполнения анализа для обнаружения, идентификации или количественного определения Salmonella, дополнительно содержит раствор для фиксации, гибридизации и промывки.

Предпочтительно, способ предназначен быть диагностическим адъювантом для выбора метода лечения и контроля качества. Таким образом, осуществление данного способа идентификации Salmonella обеспечит адекватное клиническое антибактериальное лечение и раннюю идентификацию источника загрязнения.

PNA-зонды могут быть применены непосредственно в пробе, приготовленной на слайде, » поскольку применение этих зондов не связано с использованием реагентов или ферментов для пермеабилизации клеточных мембран перед гибридизацией. Однако необходимы некоторые соединения, которые часто используют при гибридизации.

Таким образом, зонды, как правило, включаются в состав более удобных для пользователя наборов.

Если желаемый подход заключается в анализе PNA-FISH проточной цитометрией, то зонд может быть применен к пробе в виде суспензии, с использованием одних и тех же соединений для гибридизации.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I - Определения

a) В применении здесь, термин "нуклеотид" включает в себя природные и искусственные молекулы, обычно известные специалистам, использующим технологию, связанную с нуклеиновыми кислотами, посредством чего создают полимеры, которые специфически связываются с нуклеиновыми кислотами;

b) В применении здесь, термин "нуклеотидная последовательность" отождествляется с термином, относящимся к сегменту полимера, содержащему субъединицы, в данном случае нуклеотиды;

c) Термин "последовательность мишени" относится к нуклеотидной последовательности Salmonella, которая предназначена для обнаружения в анализе, где часть нуклеотидов зонда конструируют для гибридизации;

d) Термин "PNA-зонд" относится к полимеру субъединиц PNA, который имеет нуклеотидную последовательность и является специфическим для гибридизации с последовательностью мишени, представляющей интерес микроорганизма. PNA-молекулы представляют собой ДНК-миметики, в которых отрицательно заряженный сахаро-фосфатный остов структуры заменяют хиральным и электрически нейтральным, образованным повторяющимися единицами М-(2-аминоэтил)глицином;

e) В применении здесь, термин "обнаруживаемая фракция", относится к молекулам, которые могут быть соединены с зондом, посредством чего превращают зонд в обнаруживаемый с помощью прибора или способа;

f) Термин "проба" относится к любой биологической пробе, которая может содержать микроорганизм или последовательность-мишень для обнаружения. Пробы могут быть клиническими (например, крови, мочи, кала и т.д.), пищевых продуктов (например, мяса, яиц, детских смесей, молока и т.д.), или относящимися к окружающей среде (например, воды).

II - Краткое описание графического материала

Фигура 1 демонстрирует частичное сопоставление последовательностей 23S рРНК для селекции зонда. Комплементарная последовательность зонда SalPNA1873 показана выше, сопоставление и положения полиформизма также отмечены.

III - Описание

Конструирование PNA-зонда:

Для идентификации потенциально применимых олигонуклеотидов для применения в качестве зонда выбирали семнадцать последовательностей гена 23S рРНК, доступных на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Этот выбор содержал десять последовательностей Salmonella, в том числе репрезентативные штаммы каждого из семи подвидов, и семь других штаммов родственных видов, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae (Фигура 1). Последовательности сопоставляли выстраиванием с использованием программного обеспечения ClustalW, доступного в Европейском институте биоинформатики (EBI) и выбирали представляющие интерес области. Идентифицировали шесть потенциально применимых областей, которые впоследствии к тому же тестировали в NCBI (программное обеспечение BLAST) и в базе данных проекта SILVA рРНК (программное обеспечение для проверки зондов (Probe Check)), для нахождения зонда с обнаруженным наибольшим числом последовательностей Salmonella, и обнаруженным наименьшим числом последовательностей, не относящихся к Salmonella (non-Salmonella}. Другие критерии также использовали для селекции зонда, такие как: высокое процентное содержание гуанин/цитозин; тип вторичных структур и температуру гибридизации.

Только одна область из 18 п.о. оказалась способной обнаруживать все штаммы Salmonella в базе данных NCBI. Для этой области конструировали четыре возможных зонда. Один из зондов отбирали, поскольку он не гибридизовался с любой из не относящихся к Salmonella последовательностью, и он содержал 60% оснований GC. В соответствии с приведенными критериями отбора, выбранная последовательность была:

5'-AGGAGCTTCGCTTGC-3'. Эта последовательность гибридизуется между положениями 1873 и 1887 23S рРНК штамма S. enterica подвида enterica, серологический вариант Typhimurium LT2 (Американская коллекция типовых культур (АТСС) 43971), инвентарный номер U77920. Зонду дали название SalPNA1873, обусловленное исходным положением последовательности-мишени в штамме LT2. Впоследствии отобранную последовательность синтезировали и олигонуклеотиды прикрепляли, с N-конца, к флуорохрому Alexa Fluor594.

Теоретическая оценка свойств PNA-зонда:

После конструирования зонда его свойства оценивали путем определения теоретических значений в отношении чувствительности и специфичности. Эти параметры оценивали с использованием указанного выше программного обеспечения ProbeCheck, доступного в базах данных rRNA SILVA. Для данного теоретического определения в базе данных были рассмотрены все 101 последовательность Salmonella (в том числе последовательности только хорошего качества, по меньшей мере 1900 п.о.). Зонд сопоставляли выстраиванием в общей сложности с 11124 последовательностями, присутствующими в базе данных для РНК большой субъединицы (LSU, 23S/28S) (лер., LSU - база данных по рибосомальным РНК большой субъединицы рибосомы). Зонд также тестировали в базе данных для малой субъединицы (SSU, 16S/18S) для оценки наличия возможной перекрестной гибридизации с последовательностями 16S рРНК. Специфичность вычисляли в виде nSs/ (TnS)×100, где nSs означает число штаммов, не относящихся к шаммам Salmonella, которые не взаимодействовали с зондом, и TnS означает общее число проанализированных штаммов, не относящихся к шаммам Salmonella. Чувствительность вычисляли в виде Ss/(TSs)×100, где Ss означает число штаммов Salmonella, обнаруженных зондом, и TSs означает общее число штаммов Salmonella, присутствующих в базе данных.

Поиск подтвердил, что зонд SalPNA1873 обнаружил только 101 последовательность Salmonella spp., существующих в базе данных. Таким образом, получали теоретическую специфичность и чувствительность относительно 100% (Таблица 1).

С целью сравнения зонда, разработанного в данном исследовании, с зондами, разработанными ранее, тестировали теоретическую специфичность и чувствительность зондов:

- Sal23S10 (Perry-0 'Keefe et al., 2001)- SEQ ID No.6;

- Salm63 (Kutter et al., 2006) - SEQ ID No.7;

- Sal3 (Nordentoft et al., 1997) - SEQ ID No.8,

оценивали также с использованием программного обеспечения ProbeCheck (Таблица 1).

Теоретическая оценка этих последовательностей показала, что зонды Seq. ID N 6, Seq. ID N7 и Seq. ID N 8, обнаружили 95, 73 и 96 последовательностей Salmonella, соответственно, из 101 штамма, существующих в базе данных, что соответствует значениям чувствительности 94%, 72% и 95%. Что касается числа обнаруженных последовательностей, не имеющих отношения к Salmonella, то Seq ID No.1 и Seq. ID No.8 не обнаружили ни одной последовательности, отличной от Seq. ID No.6 и Seq. ID No.7. Эти значения позволили оценить специфичность относительно 100% (Seq ID No.1 и Seq. ID No.8), 98,13% (Seq ID No.6) и 99,97% (Seq ID No.7).

Выполненная теоретическая оценка показала, что зонд SalPNA1873 улучшает обнаружение Salmonella главным образом за счет двух аспектов: преимуществ молекулы PNA и величин специфичности и чувствительности зонда, описанного в данном изобретении. Молекула PNA делает процедуру FISH более легкой и более быстрой по сравнению с процедурой ДНК- FISH для зондов sal3 и Salm63, в то время как ни один из существующих PNA-зондов не превышает теоретические величины специфичности и чувствительности, полученные для зонда SalPNA1873.

PNA-зонд данного изобретения содержит предпочтительно 15 нуклеотидов и может быть по меньшей мере на 86% идентичен последовательности SEQ ID No.1 - 5'- AGG AGC TTC GCT TGC-3', предпочтительно на 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% сходства к SEQID No. 1-15'-AGG AGC TTC GCT TGC-3'.

Альтернативно данное изобретение также рассматривает вариации нуклеотидных последовательностей зондов. Такие вариации могут включать в себя, в числе прочих, делеции, инсерции. Например, одну из следующих последовательностей:

- SEQ ID No.2 - 5'-ТСА GGA GCT TCG CTT-3';

- SEQ ID No.3 - 5" -GGA GCT TCG CTT GCG-3";

- SEQ ID No.4 - 5'-ТСА GGA GCT TCG CTT GC-3';

- SEQ ID No.5 - 5'-AGG AGC TCC GCT TGC-3'.

Обнаруживаемая фракция PNA-зонда:

Не ограничиваясь следующими примерами, обнаруживаемая фракция PNA-зонда может включать в себя, среди прочих, различные типы молекул, такие как декстрановые конъюгаты, хромофоры, флуорофоры, радиоизотопы, ферменты, гаптены, хемилюминесцентное соединение.

В качестве примера, среди класса флуорофоров, предпочтительными для применения являются флуорофоры (но не ограничиваются ими): флуорофоры ряда Alexa, ряда Alexa Fluor, цианины, 5- (и -6)карбокси-2',7'-дихлорфлуоресцеин, 5-ROX (5-карбокси-Х-родамина триэтиламмониевая соль).

Способ

Данное изобретение предоставляет способ определения наличия Salmonella с использованием нуклеотидной последовательности, по меньшей мере с 86% гомологией с описанной здесь областью из 15 нуклеотидов - SEQ ID No.1.

Способ может включать в себя контактирование пробы с описанным здесь PNA-зондом, с бактериальной последовательностью-мишенью в неподходящих условиях гибридизации или подходящих условиях гибридизации in situ (как показано в примере 1).

Способ может быть разделен на: приготовление пробы (приготовление включает в себя, при необходимости, стадию обогащения), фиксацию, гибридизацию, промывку и визуализацию результатов (смотри пример 1).

Способ может быть выполнен на прикрепленных или суспендированных клетках.

Условия гибридизации - Оптимизация:

Следующие стадии являются возможной оптимизацией условий гибридизации, без ограничения данного изобретения:

Существует несколько факторов, которые влияют на гибридизацию PNA-зонда и последовательности-мишени. Эти факторы включают в себя процентное содержание формамида (или другого денатурирующего химического реагента), концентрацию соли и, следовательно, ионную силу, температуру гибридизации, концентрацию детергента, рН и Другие.

Для определения оптимальных условий гибридизации может быть необходимо фиксирование различных факторов и изменение каждого фактора по отдельности до достижения желаемой степени дискриминации.

Чем ближе последовательность-мишень находится от другой (последовательности), не являющейся мишенью в пробе, тем более строгие условия необходимы для определения различных факторов, которые влияют на гибридизацию. В данном изобретении последовательности, не являющиеся мишенью, такие как виды Shigella, могут иметь только один отличающийся нуклеотид по сравнению с последовательностями-мишенями, и, таким образом, необходим повышенный уровень дискриминации во избежание неспецифической гибридизации.

Для зондов, описанных в данном изобретении, обнаруживали следующие условия:

- Температура гибридизации между 53°С и 59°С. Самый сильный сигнал флуоресценции получали при 57°С как для гибридизации на слайдах, так и для гибридизации в суспензии.

- Стадия фиксации с использованием концентраций этанола между 50% и 80%, но различий в интенсивности сигнала не было обнаружено.

- Анализировали время гибридизации (30, 45, 60 и 90 минут), но более короткое время было столь же эффективно, как и более длинное.

После оптимизации всех указанных выше параметров, процедура, которая, как было обнаружено, в результате дает более сильный сигнал флуоресценции, была следующей:

Мазки каждой культуры бактерий готовили на подходящих слайдах для наблюдения флуоресцентной микроскопией. Затем мазки были:

- Погружены в 4% (мас./об.) пара-формальдегид (Sigma) на 10 минут, а затем в 50% (об./об.) этанол, также на 10 минут;

- Пробы высушивали на воздухе и затем покрывали 20-тью мкл раствора для гибридизации, содержащего: 10% (мас./об.) сульфата декстрана (Sigma); 10 мМ NaCl (Sigma); 30% (об./об.) формамида (Sigma); 0,1% (мас./об.) пирофосфата натрия (Sigma); 0,2% (мас./об.) поливинилпирролидона (Sigma); 0,2% (мас./об.) Фиколла (Sigma); 5 мМ двунатриевой EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты) (Sigma); 0,1% (об./об) тритона Х-100 (Sigma); 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5; Sigma) и 200нМ PNA-зонда;

- Пробы накрывали покровными стеклами, помещали в небольшие влажные камеры, защищенные от света, и инкубировали в течение 30 минут при 57°С;

- Затем покровные стекла удаляли и слайды погружали в предварительно нагретый раствор для помывки (57°С), содержащий 5 мМ Tris Base (Sigma), 15 мМ NaCl (Sigma) и 1% (об./об.) тритона Х-100 (рН 10; Sigma).

- Стадию промывки также выполняли в течение 30 минут при 57°С. Затем слайды удаляли из раствора для промывки и высушивали при 57°С в том же самом термостате в течение приблизительно 5 минут.

- Перед микроскопическим наблюдением наносили каплю нефлуоресцентного иммерсионного масла (Merck) и накрывали покровным стеклом. Слайды хранили в темноте максимум в течение 24 часов перед микроскопией.

Гибридизация также может быть выполнена в суспензии. В некоторых случаях эта процедура помогает почти полностью элиминировать аутофлуоресценцию, а именно аутофлуоресценцию эритроцитов в случае проб крови, и аутофлуоресценцию белков в детских смесях. В этом случае культуру, гомогенизированную в стерильной воде, центрифугируют (10000 g в течение 5 минут) и осадок гомогенизируют в 500 мкл 4% пара-формальдегида. Через 1 час клетки еще раз центрифугируют для удаления пара-формальдегида, и осадок гомогенизируют в 500 мкл 50% (об./об.) этанола.

Через 30 минут инкубации при -20°С клетки гомогенизировали еще раз в 100 мкл раствора для гибридизации с 200 нМ PNA-зонда и инкубировали при 57°С в течение 30 минут. После гибридизации клетки центрифугировали и гомогенизировали в 500 мкл раствора для промывки (как описано выше) и инкубировали при 57°С в течение 30 минут. И, наконец, клетки центрифугировали для удаления раствора для промывки и гомогенизировали в 500 мкл стерильной воды. Затем, 20 мкл суспензии клеток распределяли на слайдах для микроскопа, подходящих для флуоресценции, или 200 мкл фильтровали через мембрану (размер пор 0,2 мкм, нитроцеллюлоза, Whatman).

Для проверки того, что сигнал, который был получен, не был связан с аутофлуоресценцией, все пробы исследовали с использованием других фильтров, доступных в микроскопе. Пробы также одновременно окрашивали DAPI для подтверждения, что все клетки, присутствующие в пробе, были помечены зондом SalPNA1873 - SEQ ID No.1 (описанным в данном изобретении). Дополнительно в каждом анализе выполняли отрицательный контроль, следуя всем стадиям процедуры, но без добавления зонда в раствор для гибридизации.

Тестирование зонда на специфичность и чувствительность в эксперименте

После того как способ гибридизации был полностью оптимизирован, тестировали величины специфичности и чувствительности PNA-зонда.

Для этого в процедуре использовали 61 представитель штаммов Salmonella (принадлежащих к двум видам Salmonella и к шести подвидам S. enterica) и 46 других штаммов. Последние штаммы включали в себя 25 таксономически родственных штаммов, принадлежащих к тому же самому семейству (Shigella, Klebsiella, Citrobacter, Pantoea, Yersinia, Enterobacter, Escherichia и Serrate) и 21 штамм, принадлежащий к различным порядкам (Pseudomonas), классам (Helicobacter и Campylobacter), или даже типам (Listeria и Staphylococcus). Кроме S. enterica subsp.VI (подвида VI), который не обнаруживали (зондом) SalPNA1873 - SEQ ID no.1, все остальные 59 штаммов Salmonella были обнаружены, тогда как во всех других используемых штаммах гибридизацию не наблюдали. Невозможно было оценить результат PNA-FISH для трех видов Shigella, вызываемый сильным сигналом аутофлуоресценции этих штаммов, обнаруженным как в положительных, так и в отрицательных (без зонда) пробах. Этот результат не связан с различием только по одному нуклеотиду между зондом и видами Shigella, поскольку Shigella flexneri, которая имеет сходную последовательность РНК, не гибридизовалась с зондом. Кроме того, и у других видов, таких как У. enterocolitica и Escherichia coli K-12, которые также имеют ошибочно спаренное основание точно в том же положении, перекрестную реакцию не наблюдали. Этот результат подтверждает наблюдение других авторов, которые утверждают, что PNA-зонды позволяют различать последовательности только с одним ошибочно спаренным нуклеотидом (Petersen et al., 2004). На основе этих результатов в эксперименте были получены 100%-ная специфичность и 96,7%-ная чувствительность.

Обогащение:

Пробы, подлежащие анализу, могут быть получены, в числе прочих, из пищевых продуктов, биопсий, крови, воды, фекалий.

Пробы, содержащие Salmonella, обычно имеют низкие уровни контаминации. Вследствие этого рекомендуется стадия обогащения, которая облегчает процесс обнаружения. Эта стадия обогащения может быть выполнена с использованием нескольких типов культуральных сред, от сложных богатых сред до селективной среды для Enterobacteriaceae и/или Salmonella. Температура инкубации может зависеть от выбранной культуральной среды и рекомендованное время инкубации должно составлять от 8 до 24 часов.

Описанный в данном изобретении PNA-зонд, анализировали в четырех различных типах проб: воды, фекалий, детской смеси и крови. Пробы обогащали в соответствии с процедурой, обычно используемой в анализах каждого типа пробы. В случае проб воды и фекалий, первую стадию предварительного обогащения выполняли, как рекомендовано Международной организацией по стандартизации (ISO), с использованием забуференной пептонной воды (BPW) (от 16 до 18 часов). После этого обогащения, зонд позволяет (делает возможным) обнаружение Salmonella во всех анализируемых пробах и результаты согласовывались с результатами, полученными методами ISO, рекомендованными для этих проб, ISO 6579: 2002 (Обнаружение Salmonella в пищевых продуктах и кормах для животных) и ISO 6340: 1995 (Качество воды - Обнаружение и установление количества Salmonella), для проб фекалий и воды, соответственно.

В случае детской смеси смесь растворяли в воде (1:10) и инкубировали в течение 8 часов при 37°С, как рекомендовалось ранее для обнаружения Enterobacter sakazakii, в том же самом типе проб. В случае проб крови обогащение выполняли 16-18 часов при 37°С в среде, обычно используемой в культурах крови (TSB - триптический соевый бульон). После обогащения обнаружение бактерий выполняли на слайдах или в суспензии. Перед гибридизацией пробы должны быть разбавлены 1:10 в дистиллированной стерильной воде для сведения к минимуму интерференции аутофлуоресценции некоторых компонентов (например, белков детской смеси или эритроцитов). Все пробы, содержащие Salmonella, были положительными с использованием PNA-зонда, описанного в данном изобретении.

Эти эксперименты показали, что способ обнаружения с использованием данного PNA-зонда был полностью в состоянии обнаружить Salmonella в различных типах проб, менее чем за 20 часов. Кроме того, было показано, что пробы, содержащие только 1 КОЕ на мл (колониеобразующую единицу) могут быть обнаружены с выполнением стадии обогащения только за 8 часов.

Хотя рекомендованная среда для обогащения была проанализирована для каждого типа проб, стадию обогащения можно стандартизовать. Несколькими авторами было показано, что забуференная пептонная вода (BPW) может быть использована в качестве универсальной культуральной среды для обогащения проб, содержащих Salmonella, даже для проб с высокими уровнями конкурирующих микроорганизмов.

Сравнение данного способа с традиционно используемыми методами или указанными выше пробами показало, что осуществление PNA-пробы может экономить по меньшей мере 3 дня при обнаружении бактерий рода Salmonella.

В случае твердых и компактных проб, пробы должны быть подвергнуты механическому процессу воздействия плоскими лопастями, которые дезинтегрируют пробу, высвобождая бактерии в забуференную пептонную воду. В случае биопсий, пробы разрезают на кусочки от 3 до 5 мм, помещают на слайды и сразу же подвергают гибридизации без необходимости стадии обогащения.

Большинство способов, разработанных для обнаружения Salmonella, основаны на способах PCR или на селективных культуральных средах. Тогда как первый (способ PCR) является более технически трудоемким и обычно также включает в себя стадию обогащения для повышения предела обнаружения, последний (способ на селективных культуральных средах) является трудоемким может давать неточные результаты (12, 34, 38). Представленный в данном изобретении протокол PNA-FISH, является технически менее трудоемким, чем способы PCR, и более быстрым и более точным, чем культуральные методы. Хотя стадия необходима, суммарное время, требуемое для получения результата, составляет менее чем 20 часов (за исключением PIF-файла (лер., информационный файл программы), который занимает всего 12 часов), величина сходная или даже лучше, чем величина суммарного времени, сообщенная для методов на основе PCR (9, 12, 35, 39).

Описанный здесь способ показал, что является надежной альтернативой к используемым в настоящее время культуральным способам, к существующим зондам для Salmonella и даже к способам PCR и ELISA. Показано, что описанный здесь PNA-зонд: позволяет экономить 3 дня для обнаружения, по сравнению с традиционными культуральными способами, имеет более высокую специфичность, чем ранее описанные зонды, будь то ДНК или PNA (см. таблицу 1), и не зависит от присутствия веществ, которые действуют в виде ингибиторов в некоторых молекулярных методах, а именно PCR.

Визуализация результатов:

Данная стадия может быть выполнена на любом эпифлюоресцентном микроскопе с фильтром, чувствительным к используемому флуорофору. Другие фильтры, присутствующие в микроскопе, которые не способны обнаруживать флуоресцентный сигнал зонда, использовали для подтверждения отсутствия аутофлуоресценции.

Набор:

Данное изобретение также относится к набору, который делает возможным тестирование присутствия бактерий рода Salmonella.

Набор данного изобретения содержит PNA-зонд, по меньшей мере на 86% идентичный SEQ ID No.1 и другие реагенты или композиции, которые отобраны для выполнения анализа.

PNA-зонды, характеристики PNA-зондов, способы и набор данного изобретения являются подходящими для анализа последовательностей нуклеиновых кислот, присутствующих, или не присутствующих, внутри организма-мишени.

По существу данное изобретение может быть использовано для обоих: анализа организма или анализа нуклеиновых кислот, экстрагированных или произведенных из представляющего интерес организма, свидетельствуя о том, что источник последовательности-мишени не является ограничением данного изобретения.

Следующие примеры, которые иллюстрируют различные ситуации и несколько стадий для осуществления данного изобретения, являются предпочтительными вариантами данного изобретения, без намерения ограничить любую из них:

ПРИМЕР 1: Обнаружение бактерий, принадлежащих к роду Salmonella, в различных пробах (клинических, пищевых продуктов или пробах, относящимся к окружающей среде)

Последовательность:

SEQ ID No.1 - 5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3 (соединенная с Alexa Fluor 594)

Приготовление пробы:

Пробы клинические, пищевых продуктов или пробы, относящиеся к окружающей среде, предварительно подвергали стадии обогащения перед применением PNA-зонда. Обогащение происходит потому, что обычно Salmonella присутствует в низких уровнях контаминации. Эта стадия обогащения может быть выполнена с использованием среды, рекомендованной для традиционного способа, используемого для каждой пробы. В случае пищевых продуктов, корма для животных, фекалий или воды, использовали BPW. Для порошкового молока или детских смесей использовали стерильную воду для растворения порошка в соотношении 1/10 (масса/объем). Для проб крови использовали сложную среду TSB, традиционно используемую в культурах крови.

Время инкубации колебалось между 8 (порошковое молоко и детская смесь) и 16-18 часами (фекалии, вода, кровь и т.д.) при 37°С, при 120 об./мин. Для одновременного анализа различных типов проб рекомендуется, чтобы используемый способ являлся стандартизированным путем выполнения обогащения в BPW в течение 8 часов при 37°С, при 120 об./мин. В случае отрицательных результатов через 8 часов инкубации, анализ PNA-FISH должен быть повторен после обогащения в течение ночи (16-18 часов). После стадии обогащения каплю культуральной среды помещали на слайд, подходящий для флуоресценции. Слайд помещали приблизительно на 5 минут в термостат при 57°С или оставляли сохнуть на воздухе. Для проб, которые не требуют стадии обогащения, должна начинаться процедура стадии фиксации.

Фиксация:

Для предупреждения потери 23S рРНК в время процесса гибридизации, пробы погружали в раствор 4% пара-формальдегида (мас./об.) и 50% этанола (об./об.), в течение 10 минут каждый.

Гибридизация:

Затем после фиксации пробы покрывали каплей раствора для гибридизации, содержащего: 10% (мас./об.) декстран сульфата (Sigma);10 мМ NaCl (Sigma); 30% (об./об.) формамида (Sigma); 0,1% (мас./об.) пирофосфата натрия (Sigma); 0,2% (мас./об.) поливинилпирролидона (Sigma); 0,2% (мас./об.) Фиколла (Sigma); 5 мМ двунатриевой EDTA (Sigma); 0,1% (об./об.) тритона Х-100 (Sigma); 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5; Sigma) и 200нМ PNA-зонда. Пробы накрывали покровными стеклами (для обеспечения гомогенного распределения зонда), помещали в небольшие влажные камеры (для предотвращения испарения раствора для гибридизации), защищенные от света, и инкубировали в течение 30 минут при 57°С.

Промывка:

По истечении времени гибридизации, покровные стекла удаляли и слайды погружали в предварительно нагретый при 57°С раствор для помывки, содержащий 5 мМ Tris Base (Sigma), 15 мМ NaCl (Sigma) и 1% (об./об.) тритон Х-100 (рН 10). Затем пробы помещали в термостат с температурой для гибридизации на 30 минут. Затем слайды удаляли из раствора для промывки и высушивали при 57°С в том же самом термостате в течение приблизительно 5 минут. Перед микроскопическим наблюдением наносили каплю нефлуоресцентного иммерсионного масла (Merck) и накрывали покровным стеклом. Слайды хранили в темноте максимум в течение 24 часов перед микроскопией.

Результаты:

Результаты получали путем наблюдения в флуоресцентном микроскопе с фильтром, способным обеспечить обнаружение флуорохрома Alexa Fluor 594, связанного с PNA-зондом.

ПРИМЕР 2: Обнаружение бактерий родов Salmonella и Cronobacter в детских смесях

Этот пример иллюстрирует возможность использования зонда для Salmonella spp. вместе с зондом для Cronobacterspp., ранее разработанным Almeida et al., 2009. Эти два рода недавно были идентифицированы в качестве наиболее часто встречающихся загрязнителей порошковых детских смесей, контаминация которых является основной причиной бактериемии, менингита и некротического энтероколита у новорожденных. Эти два зонда имеют очень сходные температуры гибридизации и могут быть без труда использованы в мультиплексном анализе (одновременное использование нескольких зондов).

Последовательности:

SEG ID No.1 - 5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3 (связана с Alexa Fluor 594)

SEG ID No.6 - 5'-TGC AGG ATT CTC TGG-3' (связана с Alexa Fluor 488) Приготовление проб:

10 г каждой детской смеси взвешивали и гидратировали в 90 мл стерильной воды. Могут быть использованы более высокие количества детской смеси, но с сохранением соотношения 1/10 (масса/объем). Затем гидратированные пробы инкубировали в течение 8 часов при 37°С и 120 об./мин. После обогащения пробы брали и разбавляли 1/10 для сведения к минимуму интерференции аутофлуоресценции от белков детской смеси. Наконец, одну каплю разбавленной пробы помещали на подходящий слайд и высушивали на воздухе в термостате при 57°С в течение приблизительно 5 минут.

Гибридизация:

Гибридизацию выполняли как описано ранее в примере 1, с одним небольшим отличием. Раствор для гибридизации содержал два зонда: PNA-зонд для обнаружения Salmonella и PNA-зонд для обнаружения Cronobacter, каждый в концентрации 200 нМ.

Промывка:

Промывку выполняли в соответствии с процедурой, описанной в примере 1.

Результаты:

Результаты получали путем наблюдения в флуоресцентном микроскопе, снабженном подходящими фильтрами для обнаружения флуорохромов Alexa Fluor 594 и 488, связанных с PNA-зондами.

Ссылки:

- Almeida, С, N.F.Azevedo, С.Iversen, S.Fanning, С.W.Keevil, and M.J.Vieira, 2009. Development and application of a novel peptide nucleic acid probe for the specific detection of Cronobacter genomospecies (Enterobacter sakazakii) in powdered infant formula. AppI Environ Microbiol 75:2925-30.

- Perry-О' Keefe, H., S.Rigby, K.Oliveira, D.Sorensen, H.Slender, J.Coull, and J.J.Hyldig-Nielsen, 2001. Identification of indicator microorganisms using a standardized PNA FISH method. Journal of Microbiological Methods 47:281-292. - Kutter, S., A.Hartmann, and M.Schmid. 2006. Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp.Ferns Microbiology Ecology 56:262-271.

- Nordentoft, S., H. Christensen, and H. C. Wegener. 1997.

Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide tide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears. Journal of Clinical Microbiology 35:2642-2648.

- WO 02/27036 A2 - Probes, probe sets, methods and kits pertaining for the detection, identification and/or enumeration of bacteria.

Реферат

Группа изобретений относится к области биотехнологии и касается зонда пептидных нуклеиновых кислот (PNA) для обнаружения рода Salmonella в различных типах проб, набора, включающего такой зонд, способа обнаружения Salmonella и применений указанных зонда и набора в обнаружении Salmonella. PNA представляет собой синтетическую молекулу, аналогичную ДНК, имеющую последовательность SEQ ID No. 1 - 5′-AGG AGC TTC GCT TGC-3′. PNA-зонды комбинируют с флуоресцентной in situ гибридизацией (FISH), для обеспечения прямой визуализации микроорганизма в пробе. Такая комбинация делает процедуру FISH более быстрой, более простой и более эффективной. PNA-зонд может быть применен к большому разнообразию проб, таким как пробы крови, пищевых продуктов, биопсий, фекалий, воды и другим клиническим пробам, имеющим отношение к окружающей среде или сельскому хозяйству и пищевой промышленности. Представленная группа изобретений обеспечивает более быстрый анализ с более высокой чувствительностью, чем ДНК-зонды при обнаружении Salmonella. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр., 1 табл.

Формула