Способ детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода барретта - RU2635964C1

Чертежи

Описание

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может найти применение в диагностике аденокарциномы пищевода (АКП) и прогнозе развития пищевода Барретта (ПБ).

В основе развития ПБ лежат процессы метаплазии эпителия пищевода, при которых вследствие рефлюкса желудочного сока и желчных кислот, нормальный плоскоклеточный эпителий пищевода замещается цилиндрическим эпителием кишечного типа, и затем ПБ прогрессирует до дисплазии и аденокарциномы (АК) пищевода. Прогрессия от предраковых состояний до опухоли связана с появлением в клетках нарушений генома, которые ассоциированы со злокачественной трансформацией. Генетические и эпигенетические изменения, обусловливающие опухолевый рост, могут служить маркерами прогноза клинического течения заболевания.

KazA. М. и соавт. в 2011 году опубликовали результаты полногеномных исследований профилей метилирования ДНК при ПБ и АК пищевода, в которых показали значительные различия в профилях метилирования этих процессов, а также позволили идентифицировать десятки генов, метилирование которых различается при этих состояниях [Kaz A.M., Wong C. J., LuoY., Virgin J.B., et al. DNA methylation profiling in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma reveals unique methylation signatures and molecular subclasses. Epigenetics. 2011; (6:12): 1403-1412]. Однако чтобы собрать метилированные гены в системы, которые можно использовать в практической медицине, необходимо проводить их исследование на различных выборках больных с получением статистически значимых ассоциаций.

Smith E. и соавт. (2008) определяли метилирование 9 генов (АРС, CDKN2A, ID4, MGMT, RBP1, RUNX3, SFRP1, TIMP3 и TMEFF2) в образцах пациентов с ПБ, АК пищевода и нормальном эпителии установили, что частота метилирования для CDKN2A и RUNX3 была значительно выше для АК по сравнению с образцами пациентов с ПБ [Smith E., De Young N.J., Pavey S.J., Hayward N.K., Nancarrow D.J., Whiteman D.C., et al. Similarity of aberrant DNA methylation in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Mol. Cancer. 2008; 7: 75].

ZheJinetal. (2009) в двойном-слепом мультицентровом исследовании изучили аномальное метилирование панели генов (р16, RUNX3, НРР1, NELL1, ТАС1, SST, AKAP12 и CDH13) в 195 образцах биопсий эпителия пищевода у больных пищеводом Барретта с целью использования данных маркеров для оценки риска прогрессии заболевания [Zhe Jin, Yulan Cheng, Wen Gu et al. А multicenter, double-blinded validation study of methylation biomarkers for progression prediction in Barrett's esophagus. Cancer Res. 2009; 69(10): 4112-4115]. Было показано, что метилирование генов НРР1, p16 и RUNX3 выявляется достоверно чаще при прогрессировании ПБ до дисплазии высокой степени и АК пищевода, (р=0.0025, 0.0066 и 0.0002 соответственно) в сравнении с остальными 5 маркерами из исследованной панели. Использование всей панели из 8 генов позволило выявить более 50% больных ПБ с прогрессией до дисплазии высокой степени и АК пищевода, которые не смогли выявить на столь раннем этапе диагностики без применения биомаркеров. Специфичность панели по данным авторов достигала 90%, а чувствительность достигала 50%.

Timmer M.R. et al. исследовали систему маркеров, в которую входили структурные изменения локусов 8q24 (MYC), 9р21 (CDKN2A/p16), 17q12 (erbB2/HER-2/Neu), и 20q13.2 (ZNF217). В материале, полученном от 181 пациентов с ПБ, у которых проводилось консервативное лечение с применением эндоскопической резекции слизистой в сочетании с медикаментозной терапией, исследовали структурные изменения локусов 8q24 (MYC), 9р21 (CDKN2A/p16), 17q12 (erbB2/HER-2/Neu), и 20q13.2 (ZNF217) [Timmer M.R., Brankley S.M., et al. Prediction of Response to Endoscopic Therapy of Barrett's Dysplasia using Genetic Biomarkers. Gastrointest Endosc. 2014; 80(6): 984-991]. Авторы наблюдали полную регрессию изменений слизистой у 72% больных и прогрессию у 16% пациентов. Изменения копийности исследуемых локусов изучаемой панели авторы наблюдали у 88/181 (44%) больных.

На сегодняшний день сертифицированных тест-систем и способов ДНК-диагностики не существует.

Задачей изобретения является ранняя диагностика аденокарциномы пищевода.

Поставленная задача решается способом детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода Барретта, заключающимся в том, что в образцах слизистой пищевода, полученных в ходе биопсии при эндоскопическом исследовании, определяют метилирование промоторных районов генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом метилчувствительной ПЦР и при обнаружении аномального метилирования хотя бы одного из указанных генов делают вывод об увеличении риска онкологической прогрессии в 10 раз.

Выделение геномной ДНК из опухолевого материала

Для получения ДНК ткани опухоли использовали следующий метод выделения ДНК.

Ткань опухоли или материал, полученный с помощью эндоскопии, отмывали 1 mlPBS, измельчали и затем гомогенизировали, растирая со стеклом.

Гомогенат переносили в пробирку, затем добавляли экстракционный буфер (10 мМ Tris-HCl, 2 мМ ЭДТА, 4 мМ NaCl, рН=8,0) и протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и SDS до 0,5%.

Инкубировали 2 часа при 37°С до получения прозрачного раствора. Далее проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, смеси фенол-хлороформ и хлороформом с последующим центрифугированием и отбором верхней фазы.

Полученный в результате раствор ДНК перемешивали с 1/10 объема 5 М ацетата натрия, рН 5,3 и ДНК осаждали с помощью 2,5 объемов холодного 96% этанола, выдерживали образец 30 мин при температуре -70°С.

Пробу центрифугировали при 0°С 15 мин с ускорением 12000 g. Высушивали осадок ДНК на воздухе и растворяли в 200 мкл ТЕ рН 8,0.

Выход ДНК составлял 25-50 мкг на 1 г ткани, в случае эндоскопического материала выход ДНК соответствовал примерно 5 мкг на образец.

После полного растворения ДНК измеряли ее концентрацию на спектрофлюориметре фирмы «Hoefer» (Германия) и снимали спектр поглощения в диапазоне от 220 до 320 нм с целью определения чистоты ДНК.

При этом проверяли выполнение следующих условий: отношение поглощения на длинах волн 230 нм/260 нм<0,5, 260 нм/280 нм>1,8. Максимум поглощения наблюдался в районе 260 нм.

Рестрикционный анализ

Для определения аномального метилирования проводилась обработка опухолевой ДНК соответствующей метилчувствительной рестриктазой HpaII по следующей схеме: к 1000 нг геномной ДНК добавляли 10 е.а. фермента и 2 мкл соответствующего 10×буфера, доводили до 20 мкл дистиллированной водой и оставляли на 10 часов в термостате при температуре, оптимальной для используемой рестриктазы.

Определение аномального метилирования промоторных областей генов-супрессоров опухолевого роста генов МGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3

Метилирование CpG-островков промоторных областей генов определяли при помощи метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Метод МЧ-ПЦР основан на способности метилчувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин.

В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК гидролизованную метилчувствительными рестриктазами HpaII (CCGG) или HhaI (CGCG). Геномную ДНК (1 мкг) обрабатывали 10 ед активной рестриктазы в 10 мкл инкубационной смеси в течение ночи.

Для амплификации использовали 150 нг гидролизованной ДНК. При проведении ПЦР учитывали присутствие сайтов узнавания используемых рестриктаз в амплифицируемом фрагменте, который содержал не менее трех-четырех HpaII или HhaI сайтов. Количество сайтов указано в таблице 1.

В случае модификации цитозинов в метилцитозин ДНК не гидролизуется, и продукт ПЦР может быть выявлен в геле. В отсутствие метилирования сайтов узнавания для используемых рестриктаз ДНК полностью гидролизуется и продукт ПЦР не образуется.

Для исключения ложноотрицательных результатов проводили мультилокусные ПЦР с двумя парами праймеров: один фрагмент принадлежал изучаемому гену {MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3), другой служил внутренним контролем ПЦР, фрагмент гена НВВ или фрагмент гена CUX1, не содержащие сайтов узнавания указанных рестриктаз (таблица 1).

ПЦР проводили по следующей схеме:

- к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,4), 5 мМ MgCl₂, 10% диметилсульфоксида;

- затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95°С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95°С - 30 с, отжиг и элонгация при 58-62°С - 2 мин 30 с.

Разделение продуктов ПЦР в 8%-ном полиакриламидном геле методом вертикального электрофореза.

Разделение ПЦР-продуктов по молекулярной массе при анализе метилирования проводили с помощью вертикального электрофореза в 8%-ном ПААГ следующего состава: 8.4 мл 30%-го раствора акриламида, 0.6 мл 10%-го персульфата аммония, 26 мкл ТЕМЕД, до 30 мл разведенного буфера ТВЕ. Персульфат аммония и ТЕМЕД вносят после всех остальных компонентов и тщательно перемешивают полученную смесь. Электрофорез проводят при напряжении 400 В с использованием камеры для вертикального фореза («Хеликон», Москва) в течение 2.0-3.0 часов.

В качестве контроля молекулярной массы ДНК используют ДНК стандартного молекулярного веса pUC19/Msp1. Визуальный контроль пробега проб ДНК проводят по ксиленцианолу и бромфеноловому синему. Окрашивание геля нитратом серебра для визуализации продуктов ПЦР проводят по приведенной ниже методике.

Ультратонкое окрашивание нитратом серебра

Окрашивание гелей проводят по усовершенствованной методике Liberman. После электрофореза гель инкубируют в растворе 0,011 М AgNO₃ в течение 10-15 минут, затем трижды промывают в дистиллированной воде. Проявление проводят в модифицированном растворе проявителя (увеличена концентрация НСНО) следующего состава: 0,75 М NaOH; 0,5 М НСНО; 2,3 mM Na(BH₄) около 10-15 минут, в зависимости от интенсивности проявления геля.

Оптимальные критерии интерпретация результатов исследования

Если в ДНК, полученной из биопсийного материала или опухоли, присутствует аномальное метилирование промоторов генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3, то цитозины в составе CpG-динуклеотидов заменены на 5-метилцитозины, в том числе в сайтах узнавания HpaII. В этом случае рестриктаза HpaII не в состоянии гидролизовать геномную ДНК в сайтах узнавания, матрица для МЧ-ПЦР остается интактной. В результате в окрашенном ПААГ видны фрагменты, соответствующие промоторным районам MGMT, CDH1, p16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 (рис. 1). В тех образцах, где метилирование генов отсутствует, происходит гидролиз геномной ДНК в сайтах узнавания HpaII. При первой денатурации матрица для ПЦР разрушается и ПЦР-продукт, соответствующий промотору гена, отсутствует в ПААГ. Внутренний контроль МЧ-ПЦР, не содержащий сайтов узнавания HpaII, должен присутствовать во всех анализируемых образцах. Отрицательный контроль не должен содержать фрагментов, соответствующих ПЦР-продуктам, в положительном контроле должны присутствовать ПЦР-продукты внутреннего контроля и промоторов исследуемых генов.

На фиг. 1 представлены примеры определения метилирования генов MGMT, CDH1, pl6/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом МЧ-ПЦР.

Цифрами обозначены ДНК пациентов с ПБ; положительный сигнал показан стрелкой и в положительных дорожках обозначен звездочками. На геле имеется фрагмент, соответствующий метилированной форме гена, и внутренний контроль ПЦР.

Способ обеспечивает повышение точности ранней ДНК-диагностики риска малигнизации эпителия пищевода. Специфичность предложенной и исследованной нами панели генетических маркеров составила 60%, а чувствительность 86%. У больных с аномальным метилированием вероятность прогрессии заболевания почти в 10 раз выше (OR=9,559).

У 60 больных, проходивших оперативное лечение в клинике факультетской хирургии им. Н.Н. Бурденко Первого МГМУ им. И.М. Сеченова по поводу рефлюкс-эзофагита, осложненного пищеводом Барретта, до и после операционного лечения выполняли исследование метилирования генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3. Из 60 пациентов с ПБ у 32 определяли метаплазию эпителия пищевода, у 28 - дисплазию эпителия. Также аномальное метилирование генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 исследовали в операционных образцах у 34 больных с аденокарциномой пищевода.

Было выявлено достоверное возрастание частоты метилирования генетических маркеров по мере прогрессирования стадии опухолевого процесса от IA и IIA до IIIC и IV (р=0,0084).

Аномальное метилирование исследуемой генетической панели у больных ПБ до хирургического лечения достоверно чаще наблюдали в измененном эпителии по сравнению с неизмененным (р<0,0001), при дисплазии, при сравнении с метаплазией (р=0,0358) и при наличии длинных (>3 см) сегментов измененного эпителия, выявленных в результате эндоскопического исследования, по сравнению с короткими (<3 см) (р=0,0068). В нормальном эпителии до операции аномальное метилирование панели генов определяли у 7/60(12%) пациентов. В измененном эпителии наблюдали статистически значимое снижение частоты метилирования после лечения (р=0,0024).

Гены, используемые нами в системе, характеризуются высокой частотой метилирования и клинически значимыми ассоциациями. В нашем исследовании мы не стремились определить частоты метилирования отдельных генов, а использовали все гены в панели, чтобы сделать различия более достоверными.

Специфичность предложенной и исследованной нами панели генетических маркеров {MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3) составила 60%, а чувствительность 86%. Таким образом, у больных группы мет + вероятность прогрессии заболевания почти в 10 раз выше (OR=9,559). При этом в нашем исследовании мы тестировали результаты проведенной антирефлюксной операции и соотносили его с показаниями эндоскопического исследования.

Анализируя полученные результаты, можно сказать, что использование предложенной нами системы молекулярно-генетических маркеров у больных пищеводом Барретта позволяет на раннем этапе диагностировать и осуществлять мониторинг данной группы пациентов с целью формирования группы риска развития АК пищевода.

Реферат

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода Барретта. В образцах слизистой пищевода, полученных в ходе биопсии при эндоскопическом исследовании, определяют метилирование промоторных районов генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом метилчувствительной ПЦР. При обнаружении аномального метилирования хотя бы одного из указанных генов делают вывод об увеличении риска онкологической прогрессии в 10 раз. Изобретение обеспечивает повышение точности при диагностике риска малигнизации эпителия пищевода. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Формула