Способ определения содержания глюкозы в цельной крови, фотометр для его реализации - RU2050545C1
Код документа: RU2050545C1
Чертежи
Описание
Изобретение касается способа количественного определения общего содержания глюкозы в цельно крови, а также фотометра и кюветы разового пользования для осуществления способа.
Известно несколько способов определения глюкозы. От многих старых способов теперь отказались при причине неточности или поражения канцерогенными реагентами.
Под глюкозой в крови, глюкозой в цельной крови понимают глюкозу без белковых связей, присутствующих в крови. Глюкоза свободно распределена во внеклеточной воде и также во внутриклеточной воде, например в эритроцитах, но не обязательно в той же концентрации. Это означает, что общее содержание глюкозы в цельной крови отличается от общего содержания глюкозы в плазме или сыворотке. Диагностические критерии в отношении, например, диабета преимущественно основаны на глюкозе в цельной крови. Для врача поэтому выгодно иметь определения глюкозы, произведенные непосредственно на цельной крови. Многие тесты глюкозы, проведенные в текущее время, где удаляются нетронутые эритроциты, неточно отражают свои результаты в отношении глюкозы в крови, и поэтому могут привести к ошибочному заключению при медицинском диагнозе по причине использования разных реперных параметров.
Большинство текущих способов определения глюкозы основано на реагентах, содержащих энзимы или энзимные системы. Эти разные энзимные системы преобладают по сравнению с глюкозооксидазой, гексокиназой и глюкозодегидрогеназой (ГДГ).
Изобретение касается реагентов, содержащих глюкозодегидрогеназу (ГДГ). Ранее известные способы определения с использованием ГДГ являются традиционными мокрыми химическими методами.
Однако ни один из указанных способов не годится для определения глюкозы в неразбавленной цельной крови.
Известен способ определения глюкозы цельной крови в случае неразбавленной крови. Использованная химическая ферментная реакция основана на глюкозооксидазе, проводятся измерения оптического коэффициента отражения на длине волны свыше 600 нм. Известно, что гемоглобин вмешивается в реакции оксидазы. Реакции оксидазы также требуют доступа свободного кислорода. Поэтому использование микрокюветы для определения глюкозы в цельной крови вызывает значительные проблемы.
Известна микрокювета, которая может использоваться для измерения гемоглобина крови (измерения Hb). Кювета предварительно обрабатывается реагентом так, что когда проба крови вводится в кювету, стенки эритроцитов растворяются и инициируется химическая реакция, результат которой дает возможность определить Hb путем измерения абсорбции непосредственно через кювету, которая для этой цели имеет точно образованную ширину зазора.
Однако этот способ определения Hb на глюкозе трудно применять на практике, так как измерение абсорбции для определения содержания глюкозы встречает сильные помехи от абсорбции, вызываемой гемоглобином. Изменения в концентрации гемоглобина будут мешать определению глюкозы.
Таким образом, существующие способы сложные. Они часто требуют разбавления пробы крови или проводят только определение глюкозы на плазме крови без учета содержания глюкозы в эритроцитах.
Поэтому очевидно, что простой, надежный и быстрый способ количественного определения общего содержания глюкозы в неразбавленной цельной крови будет значительной помощью в диагностике и контроле диабета.
Цель изобретения состоит в создании способа количественного определения общего содержания глюкозы в неразбавленной цельной крови с помощью просвечивающей фотометрии, а также создание кюветы и фотометра для такого определения.
Путем использования соответствующего реагента можно сначала вызвать растворение стенок эритроцитов и затем провести химическую реакцию между реагентом и всем содержанием глюкозы в пробе крови, которая (реакция) образует химические соединения, которые основаны на глюкозе и диапазон абсорбции которых с точки зрения длины волны по крайней мере частично выходит за диапазон длины волны абсорбции гемоглобина. Таким образом, путем измерений абсорбции на соответственно выбранных длинах волн можно полностью устранить воздействие гемоглобина на результат измерения и достигнуть очень быстрого результата определения глюкозы.
Таким образом, изобретение обеспечивает определение глюкозы в цельной крови. При предложенном способе проба цельной крови вводится в контакт с реагентом, который в результате химической реакции с глюкозой в пробе показывает изменение концентрации красителя, которое может детектироваться в пробе и размер которого определяется как мера содержания глюкозы.
Способ включает
следующие стадии:
введение неразбавленной пробы в микрокювету, имеющую по крайней мере одну полость для приема пробы, причем эта полость внутри предварительно обработана реагентом в сухой
фоpме и химическая реакция происходит в этой полости;
выбор в качестве активных компонентов, входящих в реагент, по крайней мере агента гемолиза для воздействия на глюкозу, содержащуюся в
клетках крови пробы для возможности количественного определения всей глюкозы в гемолизате цельной крови, и агентов, участвующих в химической реакции, и обеспечение изменения концентрации красителя по
крайней мере в диапазоне волны, выходящем за диапазон абсорбции гемоглобина крови;
проведение измерения абсорбции в этом диапазоне длины волны непосредственно на пробе в кювете.
Способ включает стадии подачи неразбавленной цельной крови на сухой реагент в кювете, имеющей небольшую ширину зазора, содержащей агент гемолиза, ГДГ, диафоразу или аналог ее. НАД (никотинамид-аденин-динуклеотид) или аналог его, детергент и краско-образующее вещество, и измерение фотометрически концентрации красителя, который образовался путем просвечивающего измерения в фильтрующем фотометре. Аналогами диафоразы являются вещества, имеющие окислительно-восстановительные свойства типа феназинметосульфата или феназинэтосульфата. Они могут заменять вещества диафоразы, но неприемлемы с точки зрения токсичности.
Глюкозодегидрогеназный способ является специальным для β-глюкозы. В крови α-глюкоза и β-глюкоза существуют в зависимости от температуры равновесия. Когда понижается температура пробы крови, равновесие сдвигается в сторону большей пропорциональной части α-глюкозы. Изменение равновесия медленное. Скорость реакции глюкозодегидрогеназного способа ухудшается мутаротазой энзима и тем самым равновесием α-глюкоза /β-глюкоза. При определении глюкозы в крови важно, чтобы анализ проводился без задержки для предотвращения имманентного метаболизма в пробе. Так как спонтанная α-β-реакция происходит очень медленно и температура крови достаточно постоянная для обеспечения α/β равновесия, мутаротаза может быть выгодно исключена в случае прямого испытания крови при температуре тела, давая также возможность калибровки фотометра по всей глюкозе.
Снижение затрат способа основывается на уменьшенном времени реакции и расширенном аналитическом диапазоне.
Система реагента глюкозодегидрогеназного типа состоит из агента гемолиза для разрушения эритроцитов и освобождения гемоглобина, диафоразы, ГДГ или аналога, чтобы сделать видимой реакцию 11А. Н. НАД или аналог, детергент или краскообразующее вещество, например, взятое из группы соединений тетразолия. Дополнительно к этим активным веществам могут использоваться другие химические вещества как вспомогательные средства проведения реакции.
В случае, когда измерение абсорбции происходит на длине волны свыше 645 нм, действие любого производного гемоглобина сводится до минимума.
Другой тип помех при измерении абсорбции состоит, например, в рассеянии света частицами из клеток, жира, пыли или других "осколков". При измерении на другой длине волны, часто выше длины волны первичного измерения, где ни гемоглобин, ни образованный краситель не создают помех абсорбции, эта фоновая абсорбция может быть компенсирована.
Существенный признак предложенного способа состоит в использовании глюкозодегидрогеназной реакции, исходя из конечной цели как с точки зрения химической, так и в отношении фотометрии абсорбции. С точки зрения безопасности и надежности такая реакция предпочтительнее для пользователя.
Оптические способы количественного определения концентрации химического вещества в растворе хорошо известны и документированы. Фотометрия абсорбции является оптическим способом определения.
В основном фотометр состоит из трех частей: оптической, механической и электронной. Оптическая часть состоит из источника света с монохроматором или интерференционным фильтром, детектора света и в некоторых случаях системы линз. Механическая часть содержит подвеску оптической части и средство для перемещения кюветы с химическим раствором. Электронная часть предназначена для управления и контроля светового источника и измерения сигналов от световых детекторов, которые (сигналы) обрабатываются так, чтобы пользователь мог считать числовую величину, выражающую или представляющую измеренную химическую концентрацию.
Известен фотометр для определения гемоглобина в крови, который производит оптимизацию с известными компонентами так, что фотометрическое определение происходит насколько можно ближе к измерительной длине волны 540 нм. Регулировка измерительной длины волны производится путем использования светоизлучающего диода и светового фильтра типа зидимового стекла. В альтернативном варианте реализации светоизлучающий диод используется в инфракрасном диапазоне для измерения мутности в химическом растворе. Этот фотометр предназначен для использования в обычных мокрых химических способах определения гемоглобина, имеющих степень разбавления 1/200 и выше между кровью и реагентом.
Фотометр для определения содержания глюкозы в цельной крови согласно описанному способу т. е. подача сухого глюкозного реагента в неразбавленную кровь и проведение фотометрического измерения по двум длинам волн на микрокювете, должен быть простым, надежным и доступным по низкой цене. Так как кювета содержит сухой глюкозный реагент, она является типом одноразового использования, и транспортирование кюветы после наполнения неразбавленной кровью должно быть несложным и с минимальным эффектом паразитного света. С точки зрения функционирования фотометр должен быть фотометрически стабильным и требовать минимум управления (контроля).
Фотометр для измерения глюкозы в цельной крови в небольших объемах в неразбавленной крови посредством микропроцессора для контроля и управления, способный выполнять арифметические вычисления, а также имеющий светоизлучающие диоды, снабженные интерференционным фильтром, представляет конструкцию, которая проста в обращении, технически стабильна и использует кремниевую электронику, имеет низкое потребление энергии, высоко надежен и может изготавливаться с низкими затратами. Если механическая часть, как наружный корпус и днище, а также средство перемещения кюветы, содержат часть, где присоединены оптические компоненты, изготавливается из пластика экструзионным формованием, общие производственные затраты на фотометр будут низкими.
Фотометр с взаимодействующим микропроцессором способен управлять всеми процессами и выполнять вычисления, включающие в себя логарифмические преобразования. Светоизлучающие диоды фотометра для измерений по двум длинам волн возбуждаются через микропроцессор так, что только один светоизлучающий диод зажигается в данный момент времени. Светоизлучающие диоды очень выгодны тем, что не имеют послесвечения. Чтобы светоизлучающие диоды не утрачивали свою интенсивность света в результате старения, фотометр выполнен так, что максимальная интенсивность света, соответствующая 100% света, регулярно измеряется. Фотометр может функционировать с компенсацией интенсивности света. Благодаря возможности установления, является ли измеренная величина кюветной величиной или пробельной величиной, 100% просвечиваемость, фотометр может функционировать посредством своего микропроцессорного устройства без логарифмических аналоговых усилителей. Отсутствие логарифмических аналоговых усилителей. Отсутствие логарифмических усилителей повышает надежность и стабильность фотометра, обеспечивая одновременно условную точность в логарифмической операции посредством логарифмического алгоритма в программе микропроцессора, дальнейшее преимущество фотометра со взаимодействующим микропроцессором в том, что разные формы приведения арифметических кривых, калибровочных кривых или линеаризации могут легко вводиться в программу. Посредством микропроцессора также можно использовать разные формы целевых стандартных программ, что может выполняться с разными степенями точности в отношении разных уровней концентрации когда это требуется.
На фиг.1 изображен график логарифма коэффициента поглощения по отношению к длине волны, оба показателя в отношении смеси производных гемоглобина и в отношении краскообразующего вещества, включенного в глюкозный реагент; на фиг.2 4 показаны три разных варианта реализации фотометра; на фиг.5 7 то же, но с отдельным логарифмическим усилителем; на фиг.8 приведена оптическая часть фотометра согласно изобретению, разрез.
На фиг. 1 сплошной линией 10 показан спектр абсорбции в отношении соли тетразолия, 3-(4,5-диметилтиазолил-1-2)-2, 5-дифенил бромида тетразолия (МТТ) и пунктирной линией 12 спектр абсорбции в отношении гемолизированной крови. Можно видеть, что диапазон длины волны составляет свыше 600 нм, когда МТТ может быть количественно определено с минимальной помехой от гемоглобина. Также можно видеть, что компенсация в отношении фоновой помехи может происходить при более высоких длинах волн. При измерениях абсорбции на двух длинах волн важно использовать длины волн, которые четко отделены друг от друга. Интерференционные фильтры, используемые для фильтра фотометра, определяются с точки зрения длины волны посредством длины волны, при которой достигается максимальное пропускание света. Дополнительно интерференционный фильтр имеет полуширину полосы пропускания определяемую, когда имеет место 50%-ное пропускания света.
На фиг. 2-7 показаны разные варианты реализации фотометра, взаимодействующего с микропроцессором.
На фиг. 2-4 показан вариант фотометра без логарифмического усилителя, логарифмическая операция происходит в программе микропроцессора; на фиг.5-7 вариант фотометра с логарифмическим усилителем 19. Использование отдельного логарифмического усилителя 19 означает более простую программу в микропроцессоре, но более слабую техническую характеристику фотометра.
Когда имеет место переход от аналоговой к цифровой форме используют цифроаналоговый преобразователь 46. Это устройство является более экономичным, но дает более слабую стабильность в результате требования периферийного оборудования.
Фотометр на фиг.2-4 состоит из двух структурных блоков: одного оптического блока и одной электронной печатной платы 16. Электронная печатная плата является печатной схемой стандартного типа, где используемые компоненты нанесения путем поверхностного монтажа или пайки традиционным способом в просверленной слоеной плате. В некоторых случаях можно использовать печатные платы, допускающие комбинацию разных монтажных способов.
Печатная плата 16, включенная в фотометр (см. фиг.2), содержит микропроцессор 18, аналого-цифровой преобразователь 20, мультиплексор 22, потенциометр 24, блок возбуждения жидкокристаллического дисплея 26, блок жидкокристаллического дисплея 28, схему возбуждения светоизлучающих диодов 30, выпрямитель магистральной линии питания 32, схему зарядки батареи 34 и периферийное устройство.
Печатная плата 16 соединена с другой частью фотометра, содержащем корпус кюветы 36, два светоизлучающих диода 38, датчик (детектор) света 40 и выключатель 42.
При функционировании мультиплексор 22 принимает аналоговые сигналы от светового датчика 40 от схемы зарядки батареи 34 и от потенциометра 24 и передает в соответствии с управляющими командами 44 от микропроцессора 18 один из этих сигналов на аналого-цифровой преобразователь 20. Он преобразует сигнал в форму, которая может быть обработана процессором 18, который в зависимости от принятого сигнала, выполняет разные операции.
Процессор 18 принимает сигнал от потенциометра 24, который может регулироваться пользователем, когда фотометр калиброван посредством пробы известного глюкозного содержания. В результате этого в логарифме устанавливается константа, посредством алгоритма вычисляется содержание глюкозы на основе измеренного коэффициента пропускания (прозрачности).
Процессор 18 принимает сигнал от схемы зарядки батареи 34, когда процессор 18 должен компенсировать изменение заряда батареи.
Процессор 18 принимает оцифрованный измерительный сигнал от светового датчика 40 и в случае измерения 100% прозрачности в качестве опорной величины, и в случае измерения пропускания через пробу крови в кювете одноразового использования, помещенной между светоизлучающими диодами 38 и световым датчиком 40.
На основе предварительно запрограммированного алгоритма процессор 18 вычисляет содержание глюкозы пробы и подает результат на схему возбуждения жидкокристаллического дисплея 26 для визуализации этого результата для пользователя на жидкокристаллическом дисплее 28.
Аналого-цифровой преобразователь (см. фиг.3) может быть исключен и заменен комбинацией компаратора 45, цифроаналогового преобразователя 46 и микропроцессора 18. Микропроцессор 18 подает на преобразователь 46 цифровую величину, которая преобразована в аналоговую форму и которая последовательно изменяется процессором 18, пока будет получен сигнал нуля на выходе компаратора 45.
Основная конструкция оптического блока показана на фиг.8. Устройство содержит два светоизлучающих диода 52, 64, расположенных под углом 90о друг к другу. Для получения подобной оптической оси светоизлучающие диоды перед монтажом должны быть отрегулированы.
Фотометр в отношении глюкозы в неразбавленной крови может иметь свою длину волны измерения 660 нм (позиция 14 на фиг.1). В результате измерения абсорбции на стороне с образовавшимся красителем полуширина диапазона измерительной длины волны должна быть хорошо определена. Фоновая длина волны для измерения глюкозы в неразбавленной крови должна быть выше 700 нм. Соответствующий выбор фоновой волны достигается в случае, когда используются выпускаемые промышленностью светоизлучающие диоды, например, 740-940 нм.
Световой луч 60 от красного светодиода 52 проходит интерференционный фильтр 54, имеющий максимальную пропускаемость света при 660 нм и полуширину диапазона менее 15 нм, и отражатель (зеркало), расположенный под углом 45о. После того, как луч света 50 прошел интерференционный фильтр 54 и отражатель 56, он проходит через полость 60 кюветы 58, которая (полость) содержит неразбавленную цельную кровь и глюкозный реагент или продукты глюкозного реагента, и достигает светового детектора 40 через отверстие 53 в держателе кюветы 55. Детектор света 40 может быть снабжен небольшой собирающей линзой 62.
Световой луч от светодиода инфракрасного света 64 отражается на задней стороне отражателя 56, имеющего наклон 45о, проходит через полость 60 кюветы 58 и достигает детектора 40. Инфракрасная фоновая длина волны измеряется с помощью второго светодиода 64 и на уровне абсорбции плоскости (позиция 15 на фиг.1), при этом полуширина диапазона инфракрасного светодиода 64 имеет малое значение.
Если средство перемещения кюветы 55 (например, конструкция каретки) снабжено элементом, который может быть детектирован стационарно установленным датчиком, микропроцессор 18 может легко снабжаться информацией 43 о положении кюветы 58. Если используется каретка 55 в качестве средства транспортирования кюветы, она может иметь магнит, который детектируется двумя стационарными магнитными язычковыми реле. Когда каретка находится в выдвинутом положении для вставления кюветы 58, измеряется максимальный свет, 100% -ный свет.
Максимальный свет измеряется в отношении к измерительной длины волны и фоновой измерительной длины волны. Путем непрерывного вычисления отношения (т. е. частного от деления) в процентах между величиной измерения кюветы в положении измерения и максимальным светом достигается хорошая компенсация явления старения в световых источниках 52, 64 при измерении пропускаемости. Логарифмическая операция в отношении величины пропускания выполняется в микропроцессоре 18 или в отдельной схеме для приема результата измерения абсорбции.
Ток светового детектора 40 достигает операционного усилителя, который преобразует ток в напряжение для возможности более легкой обработки сигналов на печатной плате 16. Микропроцессор 18 также контролирует, темновой ток от детектора 40 (является ли он низким).
На фиг.2-4 показана только одна подвижная часть потенциометр 24. Потенциометр 24 является единственном компонентом, который может использоваться пользователем на печатной плате 16. Потенциометр 24 используется для калибровки фотометра по отношению к крови с известным содержанием глюкозы. Для достижения максимальной стабильности остальные компоненты фотометра являются стационарными.
По экономическим соображениям микропроцессор является процессором на одном чипе (кристалле). Для экономии энергии цифровые дисплеи жидкокристаллического типа и фотометр питаются энергией от трансформатора магистральной линии питания или батареи аккумуляторов.
На фиг.4 показан другой вариант реализации изобретения.
В этом варианте используют программирующие способности микропроцессора 18 для обеспечения фотометра, который легче подстраивать и которой имеет повышенную стабильность. Это достигается тем, что питание током двух светодиодов 38 упpавляется через цифроаналоговый преобразователь 70, который с точки зрения программирования имеет обратную связь с измерительным сигналом. Тогда можно с точки зрения измерения поддерживать пробельную величину, 100% -ное пропускание, на постоянном уровне. Этот постоянный уровень электронно определяется разрешающей способностью (числом бит) в цифроаналоговой конверсии.
П р и м е р. Микрокювета 58 типа, была снабжена путем сушки в вакууме сухим реагентом для количественного определения общего содержания глюкозы в цельной крови. Микрокювета была загружена сухим реагентом путем образования на первой стадии водорастворимого состава реагента. Водорастворимый состав глюкозного реагента содержал (в единицах объема 1 мл): 100 ед. ГДГ, глюкозодегидрогеназы, 20 ед. диафоразы, 20 мкмоль НАД, 30 мкмоль МТТ, 25 г белого сапонина, 1 мл воды, подвергнутой ионному обмену.
На стадии 2 микрокювету наполняли примерно 5 мкл раствора состава реагента, расстояние между стенками в пробоабсорбирующей полости 60, которая также используется в качестве аналитической полости, около 0,14 мм.
На стадии 3 микрокювета подвергалась сушке в вакууме. После стадии 3 микрокювета, содержащая сухой реагент для определения глюкозы в неразбавленной крови, равномерно распределенной в полости 60, была готова для проведения анализа.
Фотометр описанного типа, снабженный микропроцессором 18 типа ИНТЕЛ 8751, имел соответствующую программу для определения глюкозы в цельной крови. Фотометр был запрограммирован, чтобы с точки зрения конечной цели дать результаты о глюкозе в цельной крови (ммоль/л).
Светодиода 38 получали импульсы каждые 15 с, и светодиоды светились в течение 5 мс.
В реперном способе спектрофотометрия проводилась в ультрафиолетовом диапазоне, т. е. примерно на 340 нм, в соответствии со спецификой на упаковке, приложенной к способу glue-ДН. Реперный способ является аналитическим методом мокрого химического типа.
Содержание глюкозы в "фиксированных" пробах крови определялось реперным (контрольным) способом трижды. На каждом глюкозном уровне 10 предварительно обработанных кювет наполняли неразбавленной кровью и анализировали согласно изобретению на измерительной длине волны 660 нм и фоновой длине волны 880 нм. Полученные результаты приведены в таблице.
Реферат
Использование: медицина, для определения глюкозы в цельной крови. Сущность изобретения: проба цельной крови вводится в контакт с реагентом, который посредством химической реакции с глюкозой в пробе приводит к детектируемому изменению концентрации красителя, величина которого определяется как мера содержания глюкозы в пробе. Проба первоначально вводится неразбавленной в микрокювету, имеющую по крайней мере одну полость для приема пробы. Полость внутри предварительно обрабатывается реагентом в сухой форме, и химическая реакция протекает в этой полости. Активные компоненты реагента содержат агент гемолиза для воздействия на глюкозу в клетках крови пробы, для возможности определения общего содержания глюкозы, а также агенты, принимающие участие в химической реакции и обеспечивающие изменение концентрации красителя в диапазоне длин волн вне диапазона абсорбции гемоглобина крови. Измерение абсорбции проводится в названном диапазоне длин волн непосредственно на пробе в кювете. Также описываются предварительно обрабатываемая одноразового использования кювета с таким реагентом и фотометр. 2 с. и 5 з. п. ф-лы, 8 ил. 1 табл.
