Способ получения иммобилизованной холинэстеразы - SU1572418A3
Код документа: SU1572418A3
Описание
Изобретение относится к способам получения иммобилизованной холинэсте- разы, которая может быть применена при непрерывном функционировании систем измерения, например, с целью об- „. наружения нейротоксинов типа сложных эфиров фосфата, сложных эфиров кар- бамата и сульфата, а также для определения количества нейротоксинов в воздухе или воде.
Цель изобретения - повышение удельной активности и стабильности целевого продукта.
Способ основан на использовании полимерных носителей, содержащих 5,4-6,8 мэкв/г функциональных СООН- групп. Для этого сначала получают сшитый полимер из акриламида и/или ме- такриламида с использованием сшивающих агентов акрилового или аллило- вого типа, а группы амида кислоты полученного таким образом полимера подвергают затем частичному гидролизу
с тем, чтобы получить необходимое количество - СООН функциональных , групп. Носители фермента типа Акри- лекс С, полученные в результате частичного гидролиза шарикового сополимера акриламида и М,Н -метилен-бис- акриламида типа Акрилекс Р (например , Акрилекс Р-30, Р-100 или Р-200) кислотой (например, соляной кислотой или другой сильной кислотой) или основанием (например, гидратом окиси натрия, карбонатом натрия г ш другим сильным основанием), относятся к 1 этому последнему типу носителей-полимеров . В этих материалах примерно 50% содержащихся -СОМНг функциональных групп превращаются в результате гидролиза в карбоксигруппы, в то время как оставшиеся - CONK2 группы не гидролизуются даже при более жестких реакционных условиях. Немодифицированные - CONH -группы расположены между карбоксигруппами гид (Я
СП
i
ND Ј
00
Сл4
реализованного сополимера, что обеспечивает фиксирование карбоксигрупп в необходимых стереопозициях. При связывании фермента с карбоксигруп- пами с помощью карбодиимидного активирования функции отдельных молекул иммобилизованного фермента не препятствуют одна другой благодаря сте- реопозициям карбоксигрупп, в резулъта те достигается высокая удельная активность . Полимеры, содержащие мономеры акриловой, и/или метакриловой кислоты и акриламида и/или метакрил- амида, связанные друг с другом через бифункциональный сшивающий мономер и содержащие не менее 0,1 мэкв/г СООН функциональных групп, и полученные другими методами, обладают аналогичными благоприятными свойствами. Эти полимеры имеют форму шариков, поэтому они позволяют использовать значительную скорость сквозного потока и в то же время химически инертны и обладают абсолютной стойкостью против воздействия микроорганизмов.
Полимеры типа Акрилекс С могут быть применены с некоторыми преиму-i ществами в качестве носителей для хо- линэстеразы.
Холинэстераза любой природы, выделенная любым методом, может быть использована в качестве фермента в соответствии с предлагаемым способом.
При осуществлении данного спосо- ба в результате возникновения кова- лентной связи между ферментом и носителем повышается удельная активность и стабильность (включая и термостабильность ) получаемой иммобилизован-( ной холинэстеразы.
Пример 1. 100,6 мг ксерогеля Акрилекс С-100 с содержанием СООН- групп 6 мэкв/г суспендируют в 5,0 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,0) и в суспензию при 0°С при равномерном перемешивании добавляют раствор 302,5 мг Ы-этил-Ы -(3-диметиламиио- пропил)-карбодиимид хлоргидрата в 2,5 мл холодного (4°С) буферного раствора. В реакционную смесь после 10 мин перемешивания добавляют 47,4 мг холинэстеразы, растворенной в 2,5 мл холодного буферного раствора (4°С). Смесь поддерживают при 0 - 4°С в течение 48 ч. В течение этого периода суспензию дважды перемешивают каждый раз по 6 ч. Гель выделяют фильтрацией, трижды промывают порциями по 10 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,0.) трижды порциями по 10 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,0), содержащего также 0,5 моль хлорида натрия, а затем трижды порциями по 10 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,0). Затем гель промывают четыре раза порциями по 25 мл дистиллированной воды, а затем гель, не содержащий солей, подвергают сушке замораживанием. Получают 106,2 мг композиции иммобилизованной холинэстеразы . Активность: 120 мкмоль бути- рилйодид тиохолина/мин/г сухого материала . Анализ термостабильности полученной иммобилизованной холинэстеразы показал, что при 57°С в течение I 80 мин теряет - 50% активности, в то время как растворенный фермент - более 67%. При хранении при 4°С в течение года потеря активности составила соответственно 10 и 15% для иммобилизованной и нативной холинэстеразы. Пример2. 102мг ксерогеля Акрилекс С-100 (согласно примеру 1) суспендируют в 5,0 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,0) и в суспензию при О С при равномерном перемешивании добавляют раствор 202 мг N- циклогексил-N -Јfi-(N-метилформолино)- этил -карбодиимид пара-толуолсульфо- ната в 2,5 мл холодного (4°с) буфера. После 10 мин перемешивания в реакционную смесь добавляют 49 мг холинэстеразы , растворенной в 2,5 мл холодного 4 С) буферного раствора. Смесь поддерживают при 0 - в течение 48 ч. В течение этого периода суспензию дважды перемешивают, по 6 ч каждый раз. Гель выдечяют фильтрацией , трижды промывают порциями по 10 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,0), трижды порциями по 10 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,0), содержащего также 0,5 моль хлорида натрия, а затем трижды порциями по 10 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,0). Затем гель промывают четыре раза порциями по 25 мл дистиллированной воды, а затем гель, не содержащий солей, подвергают сушке замораживанием . Получают 110 мг иммобилизованной холинэстеразы. Активность: гидролиз мкмоль смеси бутирил- йодид тиохолина/мин/г сухого материала . Испытания термостабильности иммо- билиэованной хЪликэстеразы показали аналогичные примеру 1 результаты. При
5J5
хранении при 4° С в течение года активность иммобилизованной холинэстера зы снизилась на 8%, а активность растворенной - на 15%.
ПримерЗ. 99,2мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание СООН- групп 6,84 мэкв/г, степень гидролиза 50%) суспендируют в 10,0 мл охлажденного 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 7,0), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 19,8 мг гидрохлорида N-этил-М -(З-диметиламинопропил)-кар- бодиимида в 5,0 мл охлажденного бу- ферного раствора (рН 7,0). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют 20,1 мг хо- линэстеразы (удельная активность 17,0 мкмоль гидролизованного бутирил- тиохолинйодида /мин/мг белка), растворенной в 5,0 млчохлажденного буферного раствора фосфата калия (рН 7,0). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дваж- ды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, трижды промывают охлажденным 0,1 М буферным раствором фосфата калия (рН 7,0) порциями по 20 мл, три раза буферным раствором (рН 7,0) порциями по 20 мл, причем раствор дополнительно содержит 0,5 моль хлбристого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 20 мл. После этого гель четыре раза промывают порциями по 50 мл холодной дистиллированной воды. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ни- же 0°С. Получают 107,0 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата. Активность: гидролиз 1110 мкмоль йодида бутирилтиохолина /мин/г сухого вещества.
Стабильность ферментного препарата и исходного фермента исследуют следующим образом.
Фиксированный ферментный препарат и соответственно, растворимую исход- ную холинэстеразу выдерживают в течение 60 мин при 57°С в 0,05 М водном буферном растворе фосфата калия (рН 8,0), затем определяют остаточную активность фиксированного, фермент ного препарата и, соответственно, „ растворимого исходного фермента. Остаточную активность выражают в процентах активности перед термообработ186
кой. При таких условиях остаточная активность растворимого фермента составляет 0%, в то время как остаточная активность фиксированного ферментного препарата - 76,1%. Исходное вещество , следовательно, совершенно неактивировано , в то время как ферментный препарат от воздействия предлагаемой согласно изобретению иммобилизации сохраняет 76,1% своей первоначальной активности, что доказывает чрезвычайно значительное повышение стабиль- ности.
Пример4. 100,2 мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание -СООН- групп 5,40 мэкв/г, степень гидролиза 30%) суспендируют в 10,0 мл охлажденного 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 7,0), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 20,9 мг гидрохлорида N- этил-N -(З-диметиламинопропил)-кар- бодиимида в 5,0 мл охлажденного буферного раствора (рН 7,0). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 20,0 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 3)в 5,0 мл охлажденного раствора фосфата калия (рН 7,0). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 М буферным раствором фосфата калия (рН 7,0) порциями по 20 мл, три раза буферным раствором (рН 7,0) порциями по 20 мл, причем раствор дополнительно содержит Оа5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 20 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой порциями по 50 мл. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже ОС. В результате получают 128,5 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата. Активность: гидролиз 407 мкмоль йодида бутирилтио- холина/мин/г сухого вещества. Остаточная активность полученной иммобилизованной холинэстеразы определена в соответствии с примером 3 и составляет 65,5%.
П р и м е р 5. 259,1 мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание -СООН групп 6,84 мэкв/г, степень гидролиза
50%) суспендируют в 5,0 мл охлажденного 0,1 М раствора фосфата калия (рН 4,0), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 126,9 мг гидрохлорида М-этил-N -(З- диметиламинопропил)-карбодиимида в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 4,0). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси при- бавляют 49,6 мг холинэстеразы (удельная активность 3,7 мкмоль гидролизова ного бутирилтиохолинйодида/мин/мг белка ) в 2,5 мл охлажденного буферного раствора калия (рН 4,0). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают , каждый раз по 6 ч. Гель отделяют , промывают три раза охлажденным 0,1 М буферным раствором фосфата ка- лия (рН 4,0) порциями по 10 мл, три раза буферным раствором (рН 4,0/ порциями по 10 мл, причем раствор дополнительно содержит 0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой порциями по 25 мл. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже 00С. В результате получают 280,1 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата . Активность: гидролиз 13 мкмоль йодида бутирилтиохолина/мин/г сухого вещества. Остаточная активность 39,2% (для исходной ХЭ составляет 29,5%).
Примерб. 252,5 мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание -СООН групп 6,84 мэкв/г, степень гидролиза 50%) суспендируют в 5,0 мл 0,1 М охлажденного раствора фосфата калия (рН 4,56), после чего к приготов- ленной суспензии прибавляют раствор 124,2 мг гидрохлорида М-этил-N1 -(3- диметиламинопропил)-карбодиимида в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 4,56). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 52,9 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5) в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (рН 4,56). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 М буферным раствором фосфата калия (рН 4,56) порциями по 10 мл, три раза буферным раствором (рН4,56) порциями по 10 мл причем раствор дополнительно содержит 0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой порциями по 25 мл. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже О С. Получают 280,8 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата. Активность: гидролиз 102 мкмоль йодида бутирилтиохолина/мин/г сухо- г о вещества. Остаточная активность иммобилизованной и растворенной холинэстеразы соответственно равна 37,3 и 28,2%.
Пример 7. 252,6 мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание - СООН групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в 5,0 мл охлажденного 0,1 М раствора фосфата калия (рН 5,0), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 125 мг гидрохлорида N- этил-Ы -(3-диметиламинопропил)-карбодиимида в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 5,0). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 50,5 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5) в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (рН 5,0). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают , каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 М буферным раствором фосфата калия (рН 5,0) порциями по 10 мл, три раза буферным раствором (рН 5,0) порциями по 10 мл, причем раствор дополнительно содержит 0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой порциями по 25 мл. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже 0°С. В результате получают 239,9 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата. Активность: гидролиз 163 мкмоль йодида бу- тирилтиохолина /мин/г сухого вещества
15
Остаточная активность для иммобилизо- ванной и растворенной холинэстеразы соответственно равна 41,5 и 32,3%.
Примерв. 255,6 мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание - СООН групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в 5,0 мл охлажденного 0,1 М раствора фосфата калия (рН 5,5), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 123,8 мг гидрохлорида N- этил-Н -(3-диметиламинопропил)-карбо- диимида в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 5,5). После перемешивания в течение 10 мин к реакцион- ной смеси прибавляют раствор 51,9 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5) в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфа та калия (рН 5,5).Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 М буферным раствором фосфата калия fpH 5,5) порциями по 10 мл, три раза буферным расвором (рН 5,5) порциями по 10 мл, причем раствор дополнительно содержит 0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл. После этого гель раза промывают холодной дистиллированной водой, применяя каждый раз по 25 мл последней. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже 0°С. В результате получают 283,8 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата . Активность: гидролиз 172 мкмоль йодида бутирилтиохолина /мин/г сухого вещества. Остаточная активность иммобилизованной и растворенной холинэстеразы соответственно равна 42,1 и 29,5%.
П р и м е р 9. 249,2 мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание - СООН групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в 5,0 мл охлажденного 0,1 М раствора фосфата калия (рН 6,0), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 127,2 мг гидрохлорида Н-этил-И1-(З-диметиламинопропил)-кар- бодиимида в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 6,0). После пе- ремешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 51,9 мкг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5)
18I0
в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (рН 6,0). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают , каждый раз по 6 ч. Гель отделяют , промывают три раза охлажденным 0,1 М буферным раствором фосфата калия (рН 6,0), применяя каждый раз по 10 мл этого раствора, три раза буферным раствором (рН 6,0) порциями по 10 мл, причем раствор дополнительно содержит 0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой порциями по 25 мл. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже 0°С. Получают 277,8 мг иммобилизованного холинэс теразного препарата. Активность: гидролиз 165 мкмоль йодида бутирилтио- холина /мин/г сухого вещества. Остаточная активность для иммобилизованно и растворенной холинэстеразы составляет соответственно 42,4 и 31,8%.
Пример 10. 251,5 мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание - СООН групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в 5,0 мл охлажденного 0,1 М раствора фосфата калия (рН 6,5), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 127 мг гидрохлорида N-этил- N -(З-диметиламинопропил)-карбодиими- да в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 6,5). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 51,9 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5) в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (рН 6,5). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 М буферным раствором фосфата калия (рН 6,5), применяя каждый раз по 10 мл указанного t раствора, три раза буферным раствором
(рН 6,5) порциями по 10 мл, причем раствор дополнительно содержит
0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой порциями по 25 мл. Полученный в результате
этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже 0°С. Получают 175,0 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата . Активность: гидролиз 170 мкмоль йодида бутирилтиохолина /мин/г сухого вещества. Остаточная активность иммобилизованной и растворенной холинэстеразы составляет соответственно 38,2 и 28,9%.
Пример 11. 257,4 мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание - СООП- групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в 5,0 мл охлажденного 0,1 М раствора фосфата калия (рН 7,0), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 127,8 мг гидрохлорида N-этил-М1-(3-диметиламинопропил)-кар- бодиимида в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 7,0). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 51,9 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5) в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (рН 7,0). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают , каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 М буферным раствором (рН 7,0) применяя каждый раз по 10 мл указанного раствора , три раза буферным раствором (рН 7,0) порциями по 10 мл причем раствор дополнительно содержит 0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл. После
этого гель четыре раза промывают холод40 фосфата калия (рН 8,0), после чего
0
ют раствор 132 мг гидрохлорида N- этил-М -(3-диметиламинопропил)-кар- бодиимида в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 7,5). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 50,5 мг холинэстераэы в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (рН 7,5). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 М буфер5 ным раствором фосфата калия (рН 7,5), применяя каждый раз по 10 мл указанного раствора, три раза буферным раствором (рН 7,5) порциями по 10 мл, причем раствор дополнительно содержит
0 0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой, применяя
5 каждый раз по 25 мл последней. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже 00С. Получают 336.мг иммобилизованного холинэстеразного препарата. Активность: гидролиз 75 мкмоль йодида бутирилтиохолина /мин/г сухого вещества . Остаточная активность иммобилизованной и растворенной ХЭ составс ляет соответственно 37,1 и 27,4%.
Пример 13. 250,6 мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание -СООН групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в 5,0 мл охлажденного 0,1 М раствора
Реферат
Изобретение относится к способам получения иммобилизованной холинэстеразы. Цель изобретения - повышение удельной активности и стабильности целевого продукта. Для этого связывают холинэстеразу с частично гидролизованным сополимером на основе акриламида, активированным карбодиимидом. Процесс иммобилизации ведут при 0 - 4°С при PH 4,5 - 8,5 предпочтительно в условиях 0,1 М фосфатного буфера с PH 7,0. 1 з.п. ф-лы.
Формула
