Реактив для определения фосфатаз - SU444376A3

Описание

1

Предлагается реактив для обнаружеиия и количественного определеипя щелочных и кислотных фосфатаз в биологических жидкостях, например в сыворотке.

Известен реактив для анализа фосфатаз, который включает субстрат - двунатриевую соль л-иитрофеиилфосфориой кислоты, сухой буфер для иоддержания рН 4-И и активатор - соль магния. Эта соль в сухом состоянии нестабильна и иолучение ее затруднено. Кроме того, чувствительность известного реактива недостаточна, особенно при определении щелочных фосфатаз.

С целью повыщения стабильности реактива и чувствительности анализа, предлагается реактив , в который в качестве субстрата введена аминная соль п-нитрофенилфосфорной кислоты .

Желательно в качестве субстрата использовать соль гу5ыс-(оксиметил) аминометана и л-нитрофенилфосфорной кислоты .или соль дицИКлогексиламиНа и л-нитрофенилфосфорной кислоты. Целесообразно также в состав реаътива добавлять маннит.

Сухой порощкообразиый реактив содержит а.минную соль /г-нитрофенилфосфорной кислоты , буфер (карбоиат щелочного металла, например карбонат натрия и бикарбонат натрия ), металлсодержащий активатор, предпочтительно глютамат магния или магниевую соль аспаргиновой кислоты, и маннит.

Обычно в зависимости от того, какую фосфатазу определяют, кислую или щелочную, рН

поддерживают в пределах 4-11, соответствующим образом выбирая один нли несколько известиых буферов.

В сухо.м виде этот порошок стабилен и может долго сохраняться. Он может быть разделен на отдельные небольщие порции для образования водного раствора, пригодного для проведения одного анализа сыворотки. Каждую из этих порций можно затем расфасовывать в виде таблеток или капсул.

Указанные субстраты в сухом виде бо.тее стабильны, чем двуиатриевая соль «-нитрофеиилфосфорной кислоты. Маннит также увеличивает стабильность субстрата. Кроме того, он активен в энзиматнческой реакции. Количество

добавляемого манннта можно изменять в щироких пределах, так как положительное влияние маннита приблизительно пропорционально его количеству. Верхним предело.м, по-видимому , является растворимость этого индивидуального вещества в воде при температуре проведения испытания, т. е. около 37°С. Точны.ми экспериментами было установлено, что заметные результаты можно получить при концентрации добавки несколько мнллиграммов на 1 мл растворенного в воде аналитичеСКОРО реактива. Пределы конструкции маннита составляют 25-180 мг на 1 мл разбавленного водой реактива.

Реактив можно растворять в стандартном количестве воды и смешивать затем его с биологической пробой для проведения энзиматической реакции. Количество субстрата, содержащегося в реактиве, должно быть достаточным для того, чтобы реакция происходила с постоянной скоростью. В результате онределяют .количество или величину активности неизвестного фермента.

Аминные соли п-нитрофенилфосфорной кислоты (п-НФФ) могут быть нолучены реакцией соответствующего амина с солью щелочного металла /г-нитрофенилфосфорной «ислоты. Эти соли могут быть осаждены концентрированием или же добавлением органического растворителя . Кроме того, свободную п-нитрофенилфосфорную кислоту можно нейтрализовать соответствующим амином в растворе и осадить соль добавлением органического растворителя или унариванием до начала кристаллизации, затем соль отделяют, промывают и сушат.

Пример 1. Определение активности солей /г-иит рофенилфосфорной кйслоты (п-НФФК).

Компоненты реактива.

Буфер (рН 10,2). Растворяют 8 г Ка2СОз 2 г NaHCOs и 300 мг глютамата магния в 1 л воды.

Анормальная клиническая химическая контрольная сыворотка Хиланда.

0,03 М растворы амииных солей п-НФФК.

0,03 М pacTBOip двунатриевой соли л-НФФК (в качестве контрольного).

Расчет.

Скорость реакции аминнойсоли/г-НФФК, %: ДЛ405/МИН (амин)х100

ДЛоб/МИН (МЗг)

Свободный п-нитрофенол(вес. %) определяют цри 405 MiMK.

Свободный /г-нитрофенол

.Л405 (ДДЯ пробы)

406 (для стандарта)

В табл. 1 нриведена энзиматическая активность аминных солей.

Таблица 1

Реферат

Формула

Перед доВавлением сыворотки.

Определение образования п-нитрофенола из солей п-НФФК нри различных внешних условиях .

Методика. Взвешивают 3 пробы каждой соли по 100 мг. Помещают первую нробу каждой соли п-НФФК в сухой эисикатор, кладут вторую пробу в эксикатор с насыщенным раствором сульфата аммония для выдерживания ее при постоянной влажности, третью пробу выдерживают при комнатных условиях.

Выдерживают все образцы в этих условиях по крайней мере в течение 48 час. Растворяют каждую пробу в 5 мл воды (свободный /г-нитрофенол растворяется в 5 мл воды, если нет

полного растворения, то твердый осадок удаляют ).

В кювету отбирают пипеткой 0,05 мл образца и добавляют 2,5 мл буферного раствора (рН 10,2). Определяют светопоглощение при 405 ммк на любом подходящем спектрофотометре ,.

Расчет.

Свободный ft-нитрофенол (вес. %) Л405ХО,228.

В табл. 2 приведены результаты определения свободного п-нитрофенола после обработки реагента фосфатазой.

Растворим не полностью.

Пример 2. Методика определения щелочной фосфатазы. Реактивы.

Раствор А. В 100 мл дистиллированной воды растворяют следующие вещества, мг: NaaCOg850

ЫаНСОз250

Магниевая соль аопарагиновой кислоты50

Ди- (циклогексиламмонийная ) соль /г-НФФ315

Раствор Б. В 10 мл свежеприготовленного раствора растворяют 1000 мг маннита.

Растворы А и Б смешивают вместе для получения четырех аналитических реагентов, как описано ниже.

Реагент 1 :3 мл дистиллированной воды.

Реагент 2:3 мл раствора А+О мл раствора

Таблица 2

Б (концентрация маинита в реагенте равна О мг/мл).

Реагент 3:2 мл раствора А+1 мл раствора Б (концентрация маннита в реагенте равна 33 мг/мл).

Реагент 4 :0 мл раствора А+З мл раствора Б (концентрация маннита в реагенте равна 100 мг/мл).

Реагенты помещают в кюветы, выдерживают в течение 10 мин при 37°С, после чего определяют п записывают оптиче скую плотность при 415 ммк.

Энзиматическую реакцию инициируют добавлением 20 К анормальной сыворотки Хиланда (серийный номер 368А16).

Показания снимают спустя 10 мин после того, как реагент смешали с сывороткой (Лю) и через 15 мин (Лis). Результаты приведены в табл. 3.

Таблица 3

Таким образом,

Д )0

5 (мин)

) Эту серию сыворотки предварительно калибруют хорошо известными методами для оиределения соответствующего числа Международных единиц (М. Е.) следующим образом. Оптическая плотность раствора «-нитрофенола с концентрацией 1 мкмоль/мл равна 17,7. 415 - оптическая плотность При длине волны 4IP ммк.

М. Е./ сыворотки ДЛ415 ммк X общий объем1000

X

17,7

мл Сыворотки

где Л,, ММК/МИН 415 ммк (при 10 мин)

5 мин

ммк (при 5 мин)

5 мин

Общий объем 3,0 мл.

Количество сыворотки 0,020 мл (20 К).

Расчет.

М.Е./л сыворотки - ММК/МИН X 3,0 1000 17,7 о,020

М. Е./л сыворотки - 8450.

Для изготовления реактива сухие ингредиенты смещивают и смесь таблетируют или капсулируют известными методами. Состав таблетки реактива для 3 мл щелочной фосфатазы:

Ма2СОз, мл Магниевая соль аснарагииовой .кислоты, мг грмс-(Оксиметил) ампиометан л-НФФ, мг

Маииит, мг

Карбовакс 4000, мг

В оптической кювете растворяют одпу таблетку (или кацсулу), содержащую указанные ингредиенты, в 3,0 мл воды, добавляют 20 л анализируемого образца сыворотки. Как только реагент и образец перемещаются, происходит следующая реакция:

рН 8Аминная соль- Щелочная я-НФФ фосфатаза

рН 8-10 (Оуфер)

Нитрофенол -f Соль фосфорной

.. .р

кислоты.

Кювету выдерживают при 37°С и измеряют скорость изменения оптической плотности в течение 10 мин. Так как это - скорость реакции , температура и определяемые интервалы доллсны быть точно соблюдены.

Предмет изобретения

1.Реактив для определения фосфатаз, включающий субстрат - соль л-нитрофенилфосфориой кислоты, - сухой буфер для поддержания рН 4-11 и активатор - соль магния, отличающийся тем, что, с целью повыщения стабильности реактива и чувствительности анализа, в качестве субстрата использована аминная соль и-питрофенилфосфорной кислоты .

2.Реактив по п. 1, отличающийся тем, что в качестве субстрата применена соль трис (оксиметил) аминометана и /г-нитрофенилфосфорной кислоты.

3.Реактив по н. 1, отличающийся тем, что в качестве субстрата использована соль дициклогексиламина и п-нитрофенилфосфорной кислоты.

-4. Реактив по п. 1, отличающийся тем, что в его состав вве.ен маииит.

Приоритет 14.11.66 установлен по пп. 1,2иЗ; приоритет 31.03.67-ло п. 4.