Способ определения @ -амилазы - SU1212332A3

Чертежи

Описание

Изобретение относится к микробиологии , а именно к методам определения об -амилазы.

Цель изобретения - повьппение точности определения.

На чертеже показаны графики, полученные по результатам ряда разбавлений человеческой сыворотки физиологическим раствором поваренной соли.

Способ осуществляют следзшщим образом.

Определяют об -амилазу путем проведения энзиматичеСкой реакции об - амилазногЪ субстрата при рН 5,6-8,0 и измеряют количество продуктов реакции , при этом в качестве субстрата используют соединение общей формулы

СНгОН

Мальтогептоза + НзО

где R - глюкозидная, фенилглюкозид- ная, мононитрофенилглюкозид- ная, сорбитная или глюконо- кислотная группа.

В качестве субстрата об -амилазы можнб применять мальтогептозу и определенные ее производные, образующие при воздействии об -амилазы производный продукт расщепления, который может быть особо определен

Способ пригоден при определении продуктов расщепления с помощью об - глюкозидазы или мальтозофосфорилазы.

При определении с oi -глюкозидазой и соединением общей формуль (1) с R равно глюкозиду продукты расщепле- ния мальтогептозы, мальтотетрозы и мальтотриозы расщепляются далее в глюкозу и последнюю определяют известным образом. Для измерения обра- зовавщейся глюкозы в присутствии об - глюкозидазы предпочтительным является гексокинозный способ. Выполнение предлагаемого способа представлено следующими уравнениями:

мальтот иоза + мальтотетроза

Мальтотриоза +

2HjO

oi- -глюкоз ид аза

.. -1„ , -глюкозидаза , Мальтотетроза + - 4 глюкоза;

7 глюкоза + 7 АТР

НК

7 глюкоза-6-Р;

7 глюкоза-6-Р + 7 NAD

6PDH

J

При выполнении способа используют

производные мальтогептозы, т.е. соединения общей формулы (О, в которой R не является глюкозидной группой. При воздействии обоих энзимов об - амилазы и и-глюкозидазы заместитель, т.е. фенильная группа, мононитрофе- нильная группа, или динитрофенильная группа, или концевой сорбитш 1й, или глюконовый остаток, отщепляются и могут легко определяться. Фенильные ., группы могут стоять в oi -или J -положении Если фенильные группы в об -положении , то их отщепление происходит под Действием об -амилазы и А -глюкозидазы . Отщепленные, замещенные или незамещенные фенолы определяют по известным цветным реакциям (для р - положения наряду с оС -глюкозидазой дополнительно применяется -глюкозидаза ) .

При динитрофенильных остатках обе нитрогруппы могут быть в любом

7

3 глюкоза:

7 глюконат-6-Р + 7 NADH + 7Н

положении, например в виде 2,,6- или 3,5-заместителейо

При отщеплении заместлтелей, содержащих нитрогруппы, освобождающиеся нитрофенолы или динитрофенолы сами являются окрашенншш соединениями и их можно определить оптически. Если отщепляется сам фенол, то его можно определить по известным методам , например путем взаимодействия с нуклеофкльным агентом, таким как 3-метш1-6-еульфонш1-бензтиазолон-гид- разон-(2) (HSK) в присутствии фенолоксидазы. При этой реакции получают красный краситель, который можно определить оптически

При отщеплении сорбита, например, путем окисления с помснцью сорбит- дегидрогеназы во фруктозу NAD восстанавливается в NADH. Образование последнего можно определить при помощи УФ-спектрофотометра или путем взаимодействия с солью тетразола, например ТМТ(2-(пара-иодфеншт)-3-(паранит рофенил-тетразолхлоридом), в присутствии диафоразы или другого передатчика электронов, образующийся окра- шенньш формазан определяют оптически в видимой области спектра,

Аналогичным образом можно определить выделенную глюконовую кислоту, например, с глюконаткиназой, дегидро геназой 6-фосфорглюконовой кислоты и NADP, а также с солью тетразола- и передатчиком электронов.

Для осуцГествления способа необходимо поддерживать рН среды 5-9, предпочтительно работать при рН 7-7, (лучшие результаты и сокращается время реакции). В случае применения нитрофенильных соединений рН составляет 6-8,5.

В качестве буферов применяют такие соединения, которые активны в области главной активности применяемого энзима. Предпочитаются фосфат, HEPES (К-2-гидроксиэтш1)-пиперазин- -N-2-зтансульфоновая кислота) и гли- цилглицин, предпочтительны концентрации 10-200 ммоль/л.

Л-Глюкозидазу применяют в количествах от О,1 до 5000 и/мл. Преимущество способа состоит в возможности применять сравнительно большие колиМальтогептоза +

Hi- -аьдалаза

Н,0

Мальтоза +

РОЗмальтозофосфорилаза

P-P-6-lum

глюкоза-6-Р i

NAD

G6PDH

глюконат-6-Р + NADH + Н

Глюконат 6-Р + NAD

6PGDH

рибулоза-5-Р + NADH + Н

Преимущество этого варианта выполнения способа состоит в том, что мальтозофосфорилаза специфичнее, чем oL -глюкозидаза и поэтому не вредит эндогенной глюкозе.

Способ с использованием ой -глюко- зидазы осуществляют аналогичным образом .

Изобретение поясняется следзпетврми примерами.

Пример 1. Мальтогенн метод (е -глюкозидазная система).

Смесь реагентов, содержащую - глюкозидазу, G6PDH, Ж, NAD, ATP, мальтогептозу, , Na:Cl и фосфатный буфер, растворяют в 2,0 мл дистиллированной воды. Устойчивость реа

чества этого энзима., так что об -ами- лазное расщепление является стадией, определяющей скорость.

Соединение формулы (I) берут в количествах от 0,1 до 250 ммоль/л, предпочтительно 0,5-100 ммоль/л.

Насыщение субстрата oi -амилазы мальтогептозой происходит при концентрации от 8 до 10 ммоль. Поэтому целесообразнее применять минимальную концентрацию мальтогептозы (8 ммоль).

Кроме того, целесообразно добавлять активирующее вещество для «л -амилазы ,-предпочтительнее хлористый натрий или хлористый калий.

Определение продуктов расщепления производят путем взаимодействия их с мальтозофосфорилазой, вследствие чего образуется глюкоза-1-фосфат , который затем определяют известным способом, предпочтительнее превращать глюкоза-1-фосфат в глюкоза-б- фосфат с NAD в присутствии глюкоза- -6-фосфатдегидрогеназы с образовани- ем глюконат-6-фосфата и NADH, причем образование последней контролируют фотометрически. Сигнал измерения может быть усилен путем дальнейшего окисления с NAD в присутствии рибу- лозо-5-фосфата и еще одной молекулы.

Вьшолнение способа поясняется следующими уравнениями:

Мальтотриоза + мальтотетроза- мальтоза;

глюкоза + |i-глюкоза 1-Р;

гента при комнатной температуре составляет около 1 ч,при температуре ниже 8 С 6 ч.

Полученный раствор имеет следующие концентрации реагентов,. Фосфатный

50 ммоль/л, рН 7,0 50 ммоль/л 2 ммоль/h

буфер NaCl Mg2 Мальтогептоза ATP NAD НК G6PDH

10 ммоль/л

1,2 ммоль/л

2 ммоль/л

2 и/л

2 и/л

oi-Глюкозидаза 10 U/л

Раствор при 25°С смешивают с 0,02 мл пробы сыворотки и заливают в кювету слоем толщиной 1 см, затем, определяют экстинкцию при 365, 340 или 334 нм в фотометре, Экстинкцию отсчитьгоают через 10 мин и затем через промежутки в одну минуту отсчет повторяют пять раз.

Из вычисленных разниц экстинкции в минуту ( АЕ/мин) выводят среднюю величину, вычитают величину индукции реагента, и скорректированную величину используют в расчетахо

Расчет производят следующим образом

и/л 25°С 4244 х ДЕ 365 нм/мин

.2290 к ЛЕ 340 нм/мин 2235 х

X дЕ 334 нм/мин..

На графике показаны результаты ряда разбавлений человеческой сыворотки физиологическим раствором поваренной соли, полученные по данному методу,

г

Если реагент делят на две загрузки , из которых одна содержит маль- тогептазу, другая - смесь остальных реагентов, то стойкость таких растворов может увеличиваться. Для смеси реагентов при температурааг до 8 С она составляет 30 ч, при комнатной температуре 8 ч. Стойкость мальтогеп тозы составляет 6 и 1 неделю соответственно ,. Пример 2. Определение маль- тозофосфоридазной системой

Готовят два реагента: первый, состоящий из амилазного субстратаj второй - из мальтозофосфорилазной системы . Первый реагент содерлсит маль- тогептозный субстрат, второй - растворимый крахмал. Концентрации реагентов после растворения в воде следующие (см. табл. 1),

Полученный раствор инкубируют при , смешивают с пробой и определяют в фотометре разницу экстинкции при 334 нм Hgo После 10-минутной фор инкубации экстинкцию определяют в течение 10 мино Для .2,0 мл реагента и 0,10 мл пробы получают следующую формулу для вычисления:

АЕ мин X

2.1 X 1000

6,18 X 0,1 X 0,2 дЕ/мин X 1699 и/л .

При применении пяти различных человеческих сьшороток с указанными реагентами получают следукидие вепи- чины (см, табл, 2).

Пример 3, Определение о4 - амилазы с фенил-об-мальтогептозидом в качестве субстрата,

Фенил-сб-мальтогептозид расщепляет- ся об-амилазой на фенил-й-мальтотри- ид- или тетраид, которые ей -глюкози- дазой превращаются в фенол и глюкозу.

Освободивпшйся фенол монофенолок- сидазой с нуклеофильным реагентом З-метил-6-сульфонил-бентриазолрн- -гидразон-(2), окисляясь, превращается в красный .краситель, скорость образования которого пропорциональна активности амилазы в пробе и мо- жет определяться фотометрически.

Испытания.

а) Фенш1-Ы-мальтогептозид+Н,0

ot

25

30

35

40

-амилаза

фенил-сС-гВ-три (тетра) -глюко- пиранозид -f мальтотетра-(три)-оза,

б)Фенил-c6-D-три-(тетра)-глюкопи-

. о//ч II л ct-глюкозидаза . ранозид + 3(4)Н20 - . + 3(4) глюкоза,

. V - . , , . монофенолокв )Фенол + HSK + Oj.

/ краситель .

Условия измерения: , длина волны 492 нм ккшета 1 см.

Состав реагента приведен в табл.З.

Вместо фосфатного буфера используют глицин, глицилглицин, гепес, трис-, тра- и другие буферы.

Пример 4, Определение ot - амилазы с пара-нитрофенил-мальтогеп- тозидом.

Испытания,

. . VLпара-Нитрофенил- (б-мальтогептозид

-амилаза / .

( глюкоза) + пара-нитрофе45 НИЛ-сС-глюкоза

ct-глюкозидаза

m

п

(глюкоза + пара-нитрофенбл).

После расщепления мальтогептозида продукты расщепления разлагают на глюкозу и пара-нитрофенол, Пара-нит- 50 рофенолят-анион в щелочном растворе окрашен в желтый цвет и может быть определен оптически. Испытания,

Смесь реагентов: 50 ммоль/л фос- 55 фатного буфера, рН 7,4 50 ммоль/л .хлористого натрия от 5 до 50 U/мл оС-глюкозидазы; от 5 и/или 10 ммоль/л пара-нитрофенид-о(-мальтогептозида.

Количество: 1 мл смеси реагентов + 50 и/л пробы, температура 30°С, длина волны 405 нм. Начало реакции сьюоротки после достижения температуры измерения (10 мин предваритель- ной инкубации сыворотки).

Пример 5,, Определение ой - амилазы с мальтогептитомо

Испытания.

Мальтогептит + -аьшлаза тотриит мальтотетроза. Мальтотри-. Л-глюкозидаза

ит + HjP

сорбит + SDH

+ мальтоза. Сорбит + NAD +-Л фрук тоза + NADH + Н. NADNH + JNT +

диафораза . „.„н- „„„ -::-: :,. формазан + NAD . SDH

Сорбитдегидрогеназа

Испытуемая . система представлена в табл. 4,.

Начало реакции добавки пробы при 492 нм и 25 С. ,

Реагенты

Фосфатный буфер, рН NAD

9

Мальтогептоза

Растворимый крахмал Глюкоза-1,6-дяфосфат

Мальтозофосфорилаза микроорганизмов

р-Фосфоглюкомутаза (микроорганизмов)

G6PDH (Leuconostoc

niesent),

6PGDH (Leuconostoc .

mesent)

Пример 6. Определение «; - амилазы с мальтогептаглюконовой кислотой

Испытания.

Мальтогептоглюконовая кислота +

Q,t-амилаза

мальтотриоглюконовая

кислота + мальтотетроза.

Мальтотриоглюконовая кислота

10 ил глюкозидаза fttjO

лота + мальтоза.

Глюконовая кислота + АТР

глюконовая кисглюконаткиназа « жгчт,

глюконовая кислота-6-Р + ADP

Глюконовая кислота-6-Р + NADP +

6-фосфоглюконовая кислота

+-2:-. рибулодегидрогеназа

за-5-Р + NADPH + CO + И

Испытуемая система дана в табл. 5.

Проба сыворотки: измерение проводят при 340 или 365 нм и , объем 3,00 мл.

Таблица 1

Количество, используемое при осуществлении способа

предлагаемого

известного

20 мм

2мм

5 мг/л Следы

3и/ил 1 и/МП 9 и/мл 1 и/мл

9 ,1212332

Таблица 2

Реагент в буферном растворе теста.

Таблица 3

м

Реагенты

Ыа-(К-Р04Ьбуфер 0,02 моль/л

+NaCl to ммоль/л, рН 6,9 MgClj 1 моль/л

Мальтогептаглюконовая кислота 150 ммоль/л

NaDP с 10 мг/л

АТР с 50 мг/л Глюконат- киназа 40 U/мл

QJ05

ам

Ш 0,01

i I f f f / 9 ffftOeamam 9 8 7 s $ 4 S 2 1 .

МЮ-iy.

ВНИИдИ Заказ 2527 Ираж 778 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная,

1212332

12 Таблица 5

Концентрация при испытании

14,6 ммоль/л фосфата 7,3 ммоль/л NaCl 3,3 ммоль/л

5 ммоль/л 0,38 ммоль/л

.9т

friot wtMiemt

ffftOeamam .

Реферат