Способ определения глюкозы в биологических жидкостях - SU1505444A3

Чертежи

Описание

1

(21)3786908/28-14

(22)31.08.84

(31)3059/83

(32)02.09..П

(33)ни

(46) 30.08.89. Бюп. N 32

(71)Реанал Финомведьсердьяр (HU)

(72)Ференц Фараго, Тамаш Янчо, Иван Дароци и Габриелла Зайка (HU)

(53)616.07 (088.8)

(56)Trinder Р. - Ann Clin. Biochem., 1968, 6. 24.

(54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

(57)Изобретение относится к медицине , в частности к клинической .

.Цель изобретения - повышение точности способа за счет стабилизации окраски

реакционной смеси. Для этого в раствор буферного вещества добавляют глю- козооксидазу, пероксидазу, 4-аминофе- назоп и азид натрия. Параллельно готовят вещество, взаимодействующее с 4-аминофеназоном, -тимол, . раство ренный в . Затем оба раствора смешивают п соотношении 4:1 «соответственно . Реактив добавляют в биологическую жидкость и инкубируют смесь, а затем ее спектрофотометрируют. Способ позволяет с высокой чувствительностью i О, 1 7 ммоль/; (по отношению к глюкозе) , точностью +0,09 ммоль/л (по отношению к глюкозе) и невысокой погрешностью± О,35Z (по отношению к глюкозе) опредетять концентрацию глюкозы в биологических жидкостях. 2 ил.

С

(J)

Реферат

Изобретение относится к медицине , в частности, к клинической химии. Целью изобретения является повышение точности способа за счет стабилизации окраски реакционной смеси. Для этого в раствор буферного вещества добавляют глюкозооксидазу, пероксидазу, 4 -аминофеназон и азид натрия. Параллельно готовят вещество, взаимодействующее с 4-аминофеназоном, -тимол, растворенный в этаноле. Затем оба раствора смешивают в соотношении 4:1 соответственно. Реактив добавляют в биологическую жидкость и инкубируют смесь, а затем ее спектрофотометрируют. Способ позволяет с высокой чувствительностью ±0,17 ммоль/л (по отношению к глюкозе), точностью ±0,09 ммоль/л (по отношению к глюкозе) и невысокой погрешностью ±0,35% (по отношению к глюкозе) определять концентрацию глюкозы в биологических жидкостях. 2 ил.

Формула

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической химии.

Целью изобретения является повышение точности способа за счет стабилизации окраски реакционной смеси.

На Фиг. 1 поивепен гоабик, на ко- т.оОом показан линейньп хапактер кри- в ой пои изменении коццгнтоации глюкозы: на Лиг. 2 - крипые окоаски реакционной смеси в соавнении с извест- нь1ми мстодаьш.

Способ осуществляют следующим об- рязом.

Способ основан на том что, если пля обоазований кпасяшего вешества использовать 4-аминоЛеназон и тимол, то ппи оптимальных УСЛОВИЯХ имеет

место XODOI4O реализуемая (стабильная линейная хапактеоистика, нечувстви-. тельность к свету) фотометрическая реакция с высокой чувствительностью. Согласно предпочтительному варианту способа тимол растворяют в низшем спирте, предпочтительно в этаноле; другие химические вещества растворяют в дистиллированной воде, а спиртовой и водны11 растворы смешивают друг с другом в соотношении 1:4, Полученный таким образом реактив содержит тимол в концентрации 2,5±0,2 ммоль/л.

Концентрация других химических веществ в реактиве слелующая:

сл

о

СП

4

СИ

0.08iO,02 0,8iO,2

9,85±0j 1

Фосфатный буфер,

миль/л

-Лмияофеиазои,

ммо.ль/л

Лзил натрияJ

ммпль/л

Этанол, мм(зль/л330.0+20

Тимол н 4-аминофеназол соединяют с определяемыми субстанциями в необ- ходимых концентрациях в буферном веществе . В результате вследствие специфических ферментативных реакций образуется перекись водорода. Из обра-, эующейся перекиси водорода освобождается с помощью пероксидазы кислород, который образует 4-(2 -изопролил-5 - -метил-1 ,4 -бензохи юнмоноимино)-фе- иазон (т.е. красящее вещество).

Прс;и1агасмый способ отличается тем что цветная реакция происходит в определенной рИ-области (рН 7,0-8,0, предпочтительно 7,5), максимум поглэ- щоиия света полученного красящего вещества па;1ает на волновой диапазон 465-480 им, поэтому целесообразно фо1ометрпчесмие измерения проводить п этом диапазоне, в частности на вол- )ie 475 пм. Особенно важно, что оп- рел,еляемый фoтoм -грически цвет об- разуется сраннителыш быстро. Установлено , что стабильный цвет при комнатной температуре появляется в течение 25 ьс1н, а при 37 С - через 15 ми)1. Для установления оптимального значения рИ могут быть использованы различные буфер) (трис-фосфат, - К1ЦРО , K,HPO,j - КНРО и борат натрпя - IlCi).

Растворять тимол необходимо в ме- таноле, этанате (предпочтительно) или изопропаноле, Концентрации тимола приведепы в табл. 1.v

Очевидно, что в случае двух растворов глюкозы наивысшая, больше не возрастаю цая эксти1 кщ я (интенсив- ность окраски) получается при концентрации тпмола 2,5 ммоль/л.

Концентрации 4-аминофеиазона нри- водятся Г табл. 2. Измерения в этом случае также производят с раствором глюкозы и раствором тимола концент- раи.ией 2,5 ммоль/л.

Согласно даин.1м табл.2, максимальная , больше не изменяющаяся экстинк- ция получается при концентращ 4- -аминофеназоиа 0,600 ммоль/л. Для больинм надежности в качестве опти-

малыкп принимается конценту)ация 0,800 ммо,ль/л.

KoIп eнтpaция перекиси, требуемая для измерения г.люкозы, также оптимизируется (см. табл. 3). Огггималь- ной является концентрац11я 15 Е/мл (IS- международная единица - количество , которое заменяет 1 ммоль субстрата в течение 1 мин). Использование пероксидаза не может содержать другие ферментные тримеси в концентрациях, оказывающих вредное воздействие.

Из табл. 3 видно, что максимальная интенсивность (экстинкция) полу ченного с глюкозой цвета достигаетс уже при ферментной активности 14 Е/мл; для большей надежности берется активность 15 Е/мл.

При опредзле1 ии холестерина применяется детерге)гг, чтобы повысить рас гворимо(;ть. С этой целью может быть использован 9-лаурплэфирполи- чеканол (Сигма, СШа), Тритон Х-100 (октилфенолполиэтиленгликольэфир, LOBA, Австрия) или Бридж 35 (поли- оксиэтилеилаурилэфир, БЕ, Англия). Диапазон оптимальных концентра1Д1Й вЬ1шеуказа1И1Ых веществ составляет 0,4-1,2%.

Пример 1, Определение глюки: ы в сыворотке крови.

Раствор А. В 0,1 моль/л раствора фос})атного буфера (рН 7,5; . и ) растворяют следующие вещества:

Глюкозооксидаза,

Г:/мл 12,5

Пероксидаза, Е/мл 18,0

4-Аминофеназо11,

ммоль/л10,0

Азид натрия,

MMOJTb/л12,3

Раствор В.. 12.5 ммоль/л тимола в 96%-м этаноле (с дистиЛлирован- ной водой) .

Реактив приготовляют путем смешивания растворов А и В в соотношении 4:1.

Стандартизаг ия производится с помоьчыо 11,1 ммоль/л раствора глюко ( в насыщенпс й без нагревания бензойной кислоте).

В пробирных трубочках уравновешивают по 3,0 мл реактива, 0,02 мл стандарта и в друг-их трубочках 0,02 сыворотки крови. Вещества перемеши- пают и выдерживают при комнатной те5150

пературо 30 t-niH или при 37°С 15 мин. В последнем случае цвет, образовав- иийся после 10-минутного охлажДення, фотометрически сранг1ивают с холостым опытом (толи;ина кюветы 1 см, длина волны 475 нм).

Концентрация I сыворотки крови (в глюкозе, ммоль/л) рассчитывают по следующей формуле:

Экстинкция пробы

Стандартная экстинкция

11,1

Процесс характеризуется линейностью в диапазоне 0-30 ммоль/л.

.Пример 2. Для определения содержания глюкозы в сыворотке крови применяют реакционный раствор следу- Ю1цего состава;

Фосфатный буфер

моль/л0,09

Глюкозооксидаза,

NE/л 8000

Пероксидаза,

NE/л15000

Тимол, ммоль/л2,5

4-Аминофеназон,

ммоль/л0,8

Азид натрия,

ммоль/л 12,3

Этанол, моль/л2,5

Детергент

(Brij-35), %2,5

Значение рН реакгц юнного раствоа составляет 7,5±0,2.

Смесь пробы сыворотки крови и рекционного раствора инкубируют, аос- е этого определяют концентрацию глю- козы спектрофотометрически при длине волны 475-485 нм.

Пример 3. Дгш определения со- одержания глюкозы в спинномозговой идкости применяют реакционный растор следующего состава:

Фосфатный буфер,

моль/л0,09

Глюкозооксидаза, NE/л

Пероксидаза,

NE/л

Азид натрия,

ммоль/л

4-Аминофеназон,

ммоль/л

Тимол, ммоль/л

Детергент

(Brij-35), %

12000 15000 12,3

0,8 2,5

2,5

10

15

20

25

30

5

0

5

0

5

6

Исследуемую пробу центрифугируют и после этого надосадочную жидкость без разбавления смешивают с реакционным раствором (рП 7,5±0,2). Затем концентрацию глюкозы определяют фотометрически при длине волны 475-485 нм.

Пример 4. Для определения содержания глюкозы в моче применяли реакционный раствор следующего состава:

Фосфатный буфер, моль/л0,09

Глюкозооксидаза, NE/л12000

Пероксидаза,

NE/л15000

Тимол, ммоль/л2,5

4-Аминофеназон, ммоль/л0,8

Азид натрия,

ммоль/л12,3

Этанол, моль/л2,5

Детергент

(Brij-35), %2,5

Значение рН реакционного раствора составляло 7,5±0,2.

Исследуемую пробу мочи рдзбавляли дистиллированной водой до 30-кратного первоначального объема. Смесь разбавленной пробы и реакционного раствора инкубировали и после этого определяли концентрацию глюкозы спектрофотометрически при длине волны 475-485 нм.

Пример 5. Для определения содержания глюкозы в цельной крови применяли реакционный раствор следующего состава:j Фосфатный буфер, моль/л 0,09 Глюкозооксидаза, NE/л 12000 Пероксидаза,

NE/л.15000

Тимол, ммоль/л2,5

4-Аминофеназон, ммоль/л0,8

Азид натрия,.

.ммоль/л12,3

Этанол, ммоль/л2,5

Детергент

(Brij-35), %2,5

Значение рН реакционного раствора составляло 7,5tO,2.

Цельную кровь депротеинировали известным способом при помощи раствора трихлоруксусной кислоты, затем приготовили препарат крови в количестве , соответствующем десятикратному количеству, указангюму в примере 1 , и смеш1вали с реакционным раствором в количестве, указанном в примере 1. Смесь инкубировали и после инкубации определяли концентрацию глюкозы спектрофотометрически при длине волны 474-455 нм.

Определение наличия и количествен- Q для измерения других растворов, соные измерения глюкозы производят в диапазоне концентраций 2,775- 33,300 ммапь/л. Данные частично сведены в табл. 4 и частично представлены на фиг. 1 (в математическом выра- жении).

Из приведенных данных следует, что измерительная характеристика (в данном диапазоне) является линейной. Цветная реакция проходит полностью и обеспечивает более точную возможность измерения глюкозы.

Предлагаемый способ сравнивают с эталонным методом, в качестве которого служит известный метод ультра- фиолетовой пробы на гексокиназу Бё- ринга, В качестве раствора, содержащего сахар, в этом случае используются 45 проб человеческой крови (без выбора). Из фиг. 2 видно, что между результатами, полученными этими методами , нет никаких отличий так как коэффициент корреляции (г ,Ч971) очень близок к теорети.ческому значению (tjO.QP) и крутизна кривой регрес- 35 м отличающийся тем,

сии отличается от теоретического значения лишь на 0,4%.

Чувствительность, воспроизводимость и погрешности метода определяются на основании полученных результатов измерения. Такая статистическая обработка дает следующие результаты (по отноше1п ю к глюкозе) : Чувствительность, ммоль/л10,17

Точность, ммоль/л±0,09

Погрешность, %±0,35

40

45

что, с целью повышения точности способа за счет стабилизации окраски реак1и1опной смесиj в качестве вещества , дополнительно взаимодействующе го с 4-аминофеназоном, используют ти мол н концентрации 2,3-2,7 ммоль/л при этом раствор буферного вещества содержит 0,6-1,0 ммоль/л 4-аминофе- назона, 12,1-12,5 /л азида нат рия, 10000-20000 NE/л пероксидазы, 8000-20000 NE/л глюкозооксвдазы,при рН 7,5±0,2, а измерение проводят при длине, волны 475-485 нм.

Пр)сдлагаемый реактив, кроме того пригоден для количественного определения глюкозы в вьщелениях человека и жйиотных (например в крови, моче, ликворе) и для определения содержа- 1ШЯ глюкозы Б употребляемых человеком напитках (например алкогольных напитках , соках, освежающих наиитках) или

держащих глюкозу, холестерин или мочевую кислоту. .

Предлагаемый реактив превосходит известные тесты. Из количественного сравнения следует, что при использовании предлагаемого метода цвет вершенно не. меняется в течение по , мень1аей мере 240 мин, тогда как при использовании известных методов непрерывное снижение интенсивности окраски набл;одаотся уже через короткое вр ем 1 (45 мин, см. рис. 2).

Формула изобретения

Способ определения глюкозы в биологических жидкостях путем помещения исследуемой пробы в раствор буферного вещества, дополнительно содержащего глюкозооксидазу, пероксидазу, 4-аминофеназон, азид натрия и вещество , взаимодействующее с 4-аг нвфе-, иазоном, инкубации полученной смеси с последующим спектрофотометрйрова м отличающийся тем,

что, с целью повышения точности способа за счет стабилизации окраски реак1и1опной смесиj в качестве вещества , дополнительно взаимодействующего с 4-аминофеназоном, используют тимол н концентрации 2,3-2,7 ммоль/л при этом раствор буферного вещества содержит 0,6-1,0 ммоль/л 4-аминофе- назона, 12,1-12,5 /л азида натрия , 10000-20000 NE/л пероксидазы, 8000-20000 NE/л глюкозооксвдазы,при рН 7,5±0,2, а измерение проводят при длине, волны 475-485 нм.

А-Аминофеначон,

ммоль/л0,200 О,AGO 0,600 0,800 1,000

Экстинкция,

11,1 ммоль/л0,350 0,370 0,370 0,370 0,370

Экстинкция,

27,75 ммоль/л0,800 0,860 0,870 0,870 О ,871

Таблица 3

Активность пероксидазы , Е/ип 8 10 12 14 15 17

Экстинкция,

27,75 ммоль/л0,820 0,850 0,865 0,870 0,870 0,870

Таблица 4

X,

ммоль/л 2,775 5,550 8,325 11,100 13,875 16,650 22,200 27,750 33,300 пЗЗЗЗЗЗЗЗЗ Y0,09500,18330,2783 0,3683 0,4616 0,5500 0,7300 0,9133 1,1210

Y0,0951 0,18600,2769 0,3679 0,4588 0,5497 0,7316 0,9135. 1,0953

d, % -0,10 -1,45 +0,50 +0,10 +0,61 +0,05 -0,22 -0,02 +2,32

Примечание, х- концентрация уравновешенной глюкозы, п - число

параллельных -измерений; Y - среднее значение измеренных экстинкций; Y - экстинкции, вычисленные из сравнения калиброванных прямых; d - разница между измеренными и вычисленными экстинкциями.

F 246895; F 1,20746; (F.G. : 6; 16) ,10, где F - проба регрессии;

F - проба линейности; F.G. - степень свободы линейности;

Р - достоверность линейности;

так как это значение больше, чем 10%, кривая отклоняется от прямой незначительно.

и 00

1.000 0,900

0,800 0,700 0,600

0.500 0,400 0,300 0,200

о.т

0,000

.

.

.x. АУ

. 5.55 11.1 Щ5 22.20 27.75 33,3

in Met/i Фиг. 1

./ . ......

1 - erfindungsgemasse. Metfiotfe 2-bekonnfe Sctavo Hettioile

3 - bBkannte Oalenopharml Mefltode

W 90 120 ISO т 210

60

/

.

.

.x. АУ

/ . ......

Фиг.

ninuten