Способ получения @ - @ -аминокислот - SU984405A3
Код документа: SU984405A3
Описание
Изобретение относится к усовер шенствованному способу получения 0-с(гаминокислот-общей формулы (I)
R-CH-COOH
Шз
где R-2-метилмеркаптоэтильная, фенильная . бензильная, 2-м(гтилпропильная , пропильная, индолилметильная, 4-оксифенильная, З-оксифенильная или 3-цианопропильная группы, использующихся в фармацевтической промышлёН- . кости. . .
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения природных 0-с аминокислот микробиологическим гидролизом соответствующих гидантоинов с помощью микроорганизмов, например , . Pseudomonas solanacearum АЗ 11149, Pseudomonas caryophHli : A3 11150. Выходрл целевых продуктов составляют в среднем 20% 1.
Недостатком известного способа является низкий выход целевых продуктов .
Целью изобретения является повьаиение выхода целевых продуктов.
Указанная цель достигается тем, ; что согласно способу получения D-oi: -аминокислот вьх1}еуказанной общей фор;мулы (1), где R - имеет вышеуказанное значение, микробиологическим гидролизом гидантоина общей формулы (II)
,,c-jra it- «
10
N-с
Н 7 II но
где R - вышеуказанные значения с помощью микроорганизма Pseudomonas
15 Sp., НМ-40 (CBS 259.79) и образовавшуюся О-о/.-аминокислоту выделяют хроматографией на ионообменной смоле Dowex - 50 или осаждением в изоэлектрической точке.
20
Выходы целевых продуктов составляют 80-92,5%.
Отличием предлагаемого способа является то, что гидролиз осуществляют микроорганизмом Pseudomonas sp.
25 (CBS 259.79).
Положительным эффектом предлагаемого способа является значительное увеличение выхода целевых продуктов р 20% до 80-92,5%.
Пример 1, а. Получение ферментной композиции.
Готовят культуральную среду следующего состава, г/л:
Глюкоза20
Однозамещенный фосфат калия 3 Дв у 3 амеще н ный фосфат калия 7 Сульфат магния 0,7 Сульфат марганца 0,02. Сульфат железа (II) О, 02 Хлорид натрия 1 Гидантоин D, L -метионина3
Среду разливают в склянки емкостью |250 см израсчета 50 см на склянку стерилизуют в течение 15 температуре 120с, После посева штамма Pseudomonas .:Sp. на избирательной среде с агаром С1 лянки перемеш .ивают (.250 od/мин) в течение 48 ч при температуре .
Продуктивное выращивание осуществляют в ферментере емкостью 2 л, содержащем 1-л вышеуказанной культуральной среды и 1 см противопенного агента. Засевают склянки штаммом, приготовленным как указано выше. Культуру выращивают при температуре 30°С в течение 48 ч при переметиваНИИ турбинной мешалкой (скорость вращения 500 об/мин) и при аэрации стерильным воздухом с расходом 1 л/мин,
К концу роста клеточную массу отделяют центрифугированием и суспендйруют в 50 см дистиллированной воды. Данная суспензия содержит 7,б сухого экстракта на 100 см.
в. Гидролиз D,L-фенилаланингвдантоина . а
К 200 СМ дистиллированной воды добавляют 5 г D,L-фенилаланингидантоина . Нагревают с целью частичного растворения гида нтоина, затем среду охлаждают до 37°С. Доводят рН до 7,8 путем добавления 1н. раствора едкого натра. После этого добавляют 25 см клеточной суспензии, полученной раньше. Доводят объем реакционной смеси до 250 см, а рН доводят до 7,8.
Реакционную смесь помещают в атмосферу азота, поддерживают температуру 37°С, поддерживают рН 7,8 путем постепенного добавления 1н. раствора едкого натра.
После умеренного перемешивания в течение 24 ч весь гидантоин переходит в раствор.
Реакционную смесь осветляют центрифугированием , затем пропускают через ионообменную смолу (смола Dowex 50, форма Н),.элюируя 2н. раствором аммиака.. Щелочные фракции упаривают досуха. Получают 3,98 г D-фенилалани
на (выход 92,5%) со следующими
свойствами. 2О
Id3-i3 29,2 ±2° (с 1, вода)
(%) 8,63 (по теории 8,48)
N
Потенциометричёское титрование: 93,3%.
Оптическая чистота полученного 0-фенилаланина превышает 93%.
Пример 2. К 150 см дистиллированной воды добавляют 4 г D,L-метионингидантоина и 8 см клеточной суспензии, содержащей 0,6 г сухого экстракта (полученного в условиях , описанных в примере 1).
Доводят рН до 7,8 путем добавления 1н. раствора едкого натра. Объем реакционной смеси доводят до 200 см путемдобавления дистиллированной воды . Реакцию проводят в течение 24 ч при температуре 37°С, поддерживая рН 7,8 путем постепенного добавления 1н. раствора едкого натра..
Содержание D-метионина в реакционной смеси определяют по методу Штейн и Мура: его концентрация составляет 17 г/л, что соответствует 100% превращения в расчете на взятый D,1-метионингидантоин.
Реакционную смесь осветляют центрифугированиел затем пропускают через ионообменную смолу (смола Dowex 50, форма Н) ; Получают 2,7 г D-метионина (выход 80%) со следующими свойствами:
2, -19,3° (с 1; 5н. хлористоводородная кислота) N 1%) 9,36-9,42 (теоретическое: 9,39)
Оптическая чистота полученного D-метионина близка к 90%.
Пример 3. а. Получение ферментной композиции.
Готовят культуральную среду сле дующего состава,г/л:
Глюкоза .20
Дрожжевой экстракт 10 Бактопептон10
Среду разливают в склянки емкостью 250 см из расчета 50-см на склянку и стерилизуют в течение 15 мин при температуре 120 С. После посева щтамма Pseudomoinas Sp. НМ-40 склянки перемешивают (25Ооб/мин) в течение 24 ч при температуре .
Содержимое одной склянки используют для обсеменения фер-ментера емкостью 2 л, содержащего 1 л вышеуказанной среды. Культуру выращивают в течение 24 ч при температуре при перемешивании турбинной мешалкой со скоростью вращения 500 об/мин и аэрацией стерильным воздухом с расходом 1 л/мин.
К концу выращивания микробную массу отделяют центрифугированием и суспендируют в 100 см дистиллированно воды, эта суспензия содержит 8,9 г сухого клеточного экстракта. в. Ферментный гидролиз метионингидантоина . Растворяют 5 г D-r -метионингидан тонна в 200 см дистиллированной во ды. Доводят рН до 7,5 путем добавле ния 0,1 н. раствора „едкого натра, з тем добавляют 20 см полученной ран клеточной суспензии, объем доводят до 250 см, реакционную смесь помещ ют в атмосферу азота, температура р акционной смеси 37°С. После проведения процесса в тече ние 5 ч содержание метионина в сред определяют хроматографическим методом по методике Штейна и Мура. Опре деляют гидантионазную активность клеточной суспензии (количество мол метионина, продуцирова1«ного на 1 мг сухого клеточного экстракта в 1 ч ферментативной реакции) она составл ет 4 , 5 ... 1 После проведения процесса в тече;ние 22 ч реакционную смесь осветляют центрифугированием. Образовавшийся метионин отделяют пропусканиемчерез ионообменную смолу (Dowex 50, форма н), элюируя 2н. раствором аммиака. Элюат выпаривают досуха и сушат, получают 3,9 г D-метионина (выход 91%) со следующими свойствами: N (%) 9,4 (теоретическое содержание 9,33%J 23°(С 1, 5н. хлористоводородная кислота). Потенциометрическое титрование 98%. Пример 4. Ферментативный гидролиз L-оксйфенилглицингидантоина Готовят. 100 см,суспензии , содержащей 8,9 г сухого клеточного экстракта в условиях, описанных в примере 3 а. Растворяют 5 г 4-оксифенилглицинпу рантоина в 250 см дистиллированной воды. Доводят рН до 7,5 путем добавления 0,1 н.раствора едкого натра и добавляют 20 см клеточной суспензии. Объем доводят до 250 см реакционную смесь помещают в атмосферу азота,температура реакционной смеси 31°С. После проведения процесса в течение 5 ч определяют содержание 4-оксифенилглицина . Гидантоиназная активность составляет 1, 8 М аминокислоты на 1 мг сухого клеточного экстракта в 1 ч протекания ферментативной реакции. После проведения процесса в течение 22 ч 4-оксифенилглицин отделяют пропусканием через ионообменную смолу (Dowex 50, форма Н) . Получают 3,78 г D-(4-оксифенил)-глицина (выход 87%). оказавшегося однородным при хроматографии, со следующими свойствами: N (%) 7,6 (теоретическое содержание 8,4) Ы3%° -135 (С 1, 5н. хлористоводородная кислота) Потенциометрическое титрование 110%. Пример 5. Выращивают штамм Pseudomonas Sp, НМ-40 в следующих условиях: Состав культуральной среды , г/л: Глюкоза20 Двузамещенный фосфат калия7 Однозамещенный фосфат калия3 Сульфат магния 0,7 Сульфат марганца 0,02 Сульфат железа 0,02 Хлорид натрия. 1 D-L-метионингидантоин3 Дрожжевой экстракт 2 Предварительное выращивание. Первое предварительное выращивание выполнено в склянке емкостью 250 см, содержащей 50 см среды, в течение 24 ч. Второе предварительное выращивание посева, сделанного из предыдущей склянки,. осуществлено . тоже в течение 24 ч в ферментере емкостью 2.л, содержащем 1 л культуральной среды. Продуцирующая культура. Содержимое двухлитрового ферментера используют для обсеменения ферментера емкостью 7,5 л, содержащего 5 л среды. Культуру выращивают в течение 24 ч при температуре при аэрации .стерильным воздухом с расходом 5 л/мин и перемешивании турбинной мешалкой со скоростью 500 об/мин. Полученная в таких условиях биомасса составляет 3,8 г сухого экстракта на 1 л культуральной среды. Ферментативная реакция. По окончании выращивания микробную массу отделяют от среды центрифугированием и суспендируют в 250 см дистиллированной воды. Суспендируют 10 г D,L-фенилглицинг гидантоина в 400 см дистиллированной воды и доводят рН до 7,5 путем добавления 0,1 н. раствора едкого натра. Добавляют 50 см вышеописанной клеточной суспензии и реакционный объем доводят до 500 см добавлением воды. Помещают в атмосферу азота при температуре , поддерживая рН 7,5 в течение 17 «. После протекания процесса в течение 17 ч реакционную смесь осветляют центрифугированием, упаривают до 1/5 первоначального объема и подкисляют до/рН 1 путем добавления кон центрированной соляной кислоты. Образующийся осадок отделяют фильтрованием и сушат. Хроматографи ческий анализ показывает, что он предс-тавляет собой фенилглицингидан тоиновую кислоту со следующими свойствами: N {%) 13,9% (теоретическое содержание 14,4%} ГоЗ 15° -1370 (с 1; 1% амВыход полученной Оггидантоиновой кислоты 6,3% по отношению к взятому гидантоину. Маточный раствор снова упаривают и доводят.- до рН 5 путем добавлени едкого натра, выпавший в осадок D-фенилглицин отделяют фильтрованием промывают водой и этиловым спиртом, сушат. Получают 7,6 г -О-фенилглицин ( выход 88%) со следующими свойствами: , .N (%) 9,2 (теоретическое содержание 9,3) Hd - -148 (С 1; 5н. хлористоводородная кислота) Пример 6. Выращивают культуру Pseudomonas Sp., НМ-40 в условиях примера 5. После центрифугирования микробную массу суспендируют в О,1 М фосфатом буферном растворе при рН 7,8, эту суспензий используют в качестве катализатора гидролиза различных гидантоинов, условия реакции следующие: начальная концентрация гидантоина 20 г/л в 0,1 М фосфатном буферном растворе при рН 7,8; примененная биомасса составляет 6,5 г (в расчете на сухой экстракт) на 1 л реакционной смеси температура реакции продолжительность реакции 5 ч. Затем определяют содержание в реакционной смеси образукнцейся аминокислоты и по ней вычисляют ферментативную активность клеточного экстракта . Вычисленная таким образом активность представлена в таблице в микромолях аминокислоты, образовавшейся на 1 мг сухого ферментного экстракта в 1 ч реакционного времени, i Результаты представлены в табли це .
Реферат
Формула
