Способ получения производного бета-лактама - RU2136759C1

Чертежи

Описание

Изобретение относится к способу получения производных бета-лактамов посредством ферментативного ацилирования исходного амино-бета-лактама посредством ацилирующего агента. Амино-бета-лактам может представлять собой 6-аминопенициллановую кислоту [6-АПК (6-АРА)], 7-аминодезацетоксицефалоспориновую кислоту [7-АДЦК (7-АДСА)] , 7-аминоцефалоспориновую кислоту [7-АЦК (7-АСА)] , или 7-амино-3-хлор-3-цефем-4-карбоксилат, а агент ацилирования может представлять собой производное D-фенилглицина или D-п-оксифенилглицина.

В настоящее время полусинтетические бета-лактамы, например ампициллин, амоксициллин, цефаклор, цефалексин, цефадроскил и цефалоглицин, получают промышленными химическими методами, например в результате реакции амино-бета-лактама, например 6-аминопенициллановой кислоты, в которой карбоксильная группа обычно защищена, с соответствующим активированным производным боковой цепи, с последующим удалением защитной группы посредством гидролиза. С точки зрения достижения высокого выхода важно, например, чтобы амино-бета-лактам, например 6-АПК, использовался в чистом и сухом виде, предпочтительно со степенью чистоты более 97%. Так, например, ампициллин (6-D-альфа-аминофенилацетамидопенициллановая кислота) можно получать посредством реакции 6-АПК, содержащей надлежащим образом защищенную карбоксильную группу, хлорангидридом D-фенилглициновой кислоты, с последующим удалением защитной группы посредством гидролиза. Подобные реакции обычно включают дорогостоящие стадии, такие как использование температур ниже 0^oC, а также предусматривают использование органических растворителей, например хлористого метилена и агентов силилирования.

Ферментативный способ получения ампициллина из чистого 6-АПК и производного D-фенилглицина (например низшего алкильного сложного эфира) описан в патенте ФРГ N 2163792, в патенте Австрии N 243986, в патенте Дании 70-09138, в патенте ФРГ N 2621618, и в европейской патентной заявке N 339751. Способы согласно имеющемуся уровню техники обычно предусматривают использование менее 50 мМ производного D-фенилглицина и менее 25 мМ 6-АПК, а наибольший выход составляет 88% (в европейской патентной заявке N 339751).

Амино-бета-лактам, например 6-АПК, обычно получают посредством ферментативного гидролиза ферментационного пенициллина (например пенициллина V или пенициллина G), с последующим удалением высвобожденной боковой цепи (феноксиуксусной кислоты и т.п.). Помимо примесей, образующихся при ферментировании, получаемый неочищенный раствор обычно содержит амино-бета-лактам в концентрации 150-200 мМ. Указанный неочищенный раствор можно подвергнуть очистке и кристаллизации с получением очищенного 6-АПК или 7-АДЦК (в случае 7-АДЦК ферментационный пенициллин подвергают другой обработке перед стадией гидролиза).

Потенциальными недостатками известных ферментационных способов получения ампициллина, амоксициллина и цефалексина (так и не доведенных в настоящее время до стадии промышленного производства) являются высокая стоимость (обусловленная потерями из-за низкого выхода) и необходимость больших инвестиционных затрат вследствие того, что требуется специальное оборудование для выделения, очистки и сушки бета-лактама перед его использованием в качестве исходного продукта для реакции, ведущей к получению полусинтетического бета-лактама. Кроме того, исходные концентрации 6-АПК очень малы (обычно менее 50 мМ), что делает выделение образующегося ампициллина более трудным и, следовательно, более дорогостоящим. Также желательным является достижение более высоких выходов при ферментативном получении ампициллина.

Способ ферментативного синтеза амоксициллина описан в Agric, Biol, Chem. 44 (1980), стр. 821 и послед. Указанный способ осуществляют в реакционной среде, содержащей 2,5 или более объемн.% 2-бутанол и 5 объемн.% других спиртов. В случае, когда используют один из указанных спиртов, или 2,5% 2-бутанола, начальные концентрации исходных продуктов, метилового эфира D-альфа-(п-оксифенил)глицина и 6-аминопенициллановой кислоты, очень малы, например 100 и 50 мМ соответственно. В случае использования 5% 2-бутанола начальные концентрации исходных продуктов, метилового эфира D-альфа-(п-оксифенил)глицина и 6-аминопенициллановой кислоты, составляют 460 и 230 мМ соответственно. В отмеченной выше статье указывается, что введение метилового эфира D-альфа-(п-оксифенил)глицина в количестве более чем 100 мМ и 6-амино-пенициллановой кислоты в количестве более чем 50 мМ значительно подавляет реакцию превращения 6-аминопенициллановой кислоты в амоксициллин. Вывод из приведенных в указанной статье соображений состоит в том, что невозможно увеличить концентрацию бета-лактама и ациллирующего агента в реакционной смеси.

После даты подачи заявки по настоящему изобретению (18-21 сентября 1990 г. ) был опубликован постер в сообщениях НАТО-Уоркшоп. В указанном постере описано получение цефалоспоринов, причем отмечается, что использование низких температур оказывает положительное воздействие на протекание реакции. Наиболее высокая концентрация ацилирующего агента, использованная в данной работе, составляет 355 мМ метилового эфира D-альфа-(п-оксифенил)глицина, причем отсутствуют какие-либо соображения, позволяющие предполагать, что можно использовать более высокие концентрации ацилирующего агента.

В настоящее время неожиданно обнаружено, что выход при ферментативном получении производных бета-лактама может быть увеличен в результате проведения реакции при высоких концентрациях ацилирующего агента.

В данном описании термин "амино-бета-лактам", "агент ацилирования" и "производное бета-лактама" обозначают соответственно два исходных продукта и целевой продукт согласно способу настоящего изобретения. Следовательно, способ согласно настоящему изобретению можно описать следующей схемой реакции:
амино-бета-лактам + агент ацилирования ---> производное бета-лактама
Производное бета-лактама имеет значительно более высокую активность в качестве антибиотика, чем амино-бета-лактам. Амно-бета-лактам содержит свободную аминогруппу, которая ацилируется при проведении реакции согласно настоящему изобретению. Агент ацилирования может быть свободной кислотой или может представлять собой активированную форму, например быть амидом или сложным эфиром. В данном описании термин "ядро бета-лактама" включает как амино-бета-лактамы, так и производные бета-лактамов. Концентрация ядра бета-лактама таким образом соответствует сумме концентраций амино-бета-лактама и производного бета-лактама.

Важной отличительной особенностью способа согласно настоящему изобретению является тот факт, что концентрация ацилирующего агента плюс концентрация производного бета-лактама в реакционной смеси составляет более 400 мМ. Одним из путей получения такой концентрации в реакционной смеси является введение в осуществляемый периодически процесс к реакционной смеси агента ацилирования в количестве, достаточном для достижения начальной концентрации агента ацилирования в реакционной смеси, более чем примерно 400 мМ.

При осуществлении способа согласно настоящему изобретению возможно и удобно использовать неочищенный раствор амино-бета-лактама, например 6-АПК или 7-АДЦК, без разбавления. Таким путем можно избежать потерь амино-бета-лактама, например 6-АПК или 7-АДЦК, на стадии очистки и/или выделения, в результате чего сводятся к минимуму инвестиционные затраты при получении, например, ампициллина, амоксициллина и цефалексина, поскольку оборудование для очистки, необходимое согласно имеющемуся уровню техники для выделения 6-АПК, теперь можно использовать для выделения ампициллина, амоксициллина и цефалексина.

Предпочтительно высокие выходы согласно настоящему изобретению могут быть достигнуты без необходимости применения низких температур и органических растворителей, например хлористого метилена. Так выход ампициллина может достигать 96% при 20^oC.

Согласно настоящему изобретению предусматривается способ осуществления ферментативной реакции амино-бета-лактама, например 6-аминопенициллановой кислоты, 7-аминодезацетокси-цефалоспориновой кислоты, 7-аминоцефалоспориновой кислоты (7-АЦК), или 7-амино-3-хлор-3-цефем-4-карбоксилата при применении в качестве агента ацилирования, например, производных D-фенилглицина или D-п-оксифенилглицина.

Согласно одному из аспектов способ согласно настоящему изобретению отличается тем, что концентрация исходного амино-бета-лактама в реакционной среде лежит в пределах от примерно 50 до примерно 750 мМ, предпочтительно превышая примерно 100 мМ, более предпочтительно превышая примерно 150 мМ, и наиболее предпочтительно превышая примерно 200 мМ. Согласно другому аспекту указанный способ отличается тем, что начальная концентрация исходного амино-бета-лактама в реакционной среде лежит в пределах от примерно 50 до примерно 750 мМ, предпочтительно превышая примерно 100 мМ, более предпочтительно превышая примерно 150 мМ, и наиболее предпочтительно превышая примерно 200 мМ. Согласно еще одному аспекту указанный способ отличается тем, что начальное количество агента ацилирования, например производного D-фенилглицина или D-п-оксифенилглицина, в реакционной среде превышает растворимость указанного агента в реакционной среде (предпочтительно, по крайней мере 50% выше растворимости); или начальное количество агента ацилирования в реакционной среде превышает примерно половину растворимости указанного агента ацилирования + начальное количество амино-бета-лактама в реакционной среде (предпочтительно превышает растворимость агента ацилирования в реакционной смеси + начальное количество амино-бета-лактама). В соответствии с еще одним аспектом данное изобретение относится к способу, при котором концентрация агента ацилирования + концентрация производного бета-лактама в реакционной смеси составляет более примерно 450 мМ, предпочтительно более примерно 500 мМ, более предпочтительно более примерно 650 мМ, и еще более предпочтительно более примерно 700 мМ. В соответствии с еще одним аспектом данное изобретение относится к способу, при котором начальная концентрация агента ацилирования в реакционной смеси составляет более примерно 450 мМ, предпочтительно более примерно 500 мМ, более предпочтительно более примерно 650 мМ, и еще более предпочтительно более примерно 700 мМ.

Итак, преимущества способа согласно настоящему изобретению можно просуммировать следующим образом.

1) Можно избежать использования органического растворителя, например хлористого метилена, что в свою очередь позволяет избежать загрязнений окружающей среды.

2) Можно избежать использования агента силилирования.

3) Можно избежать процесса экстракции при пониженных температурах, таких как 0^oC.

4) Высокая концентрация реагентов представляет преимущества при последующей очистке.

5) Получаемое производное бета-лактама имеет высокую степень чистоты, которая еще не достигнута в случае коммерческих продуктов согласно имеющемуся уровню техники.

6) Содержание побочных продуктов в реакционной смеси очень незначительно.

7) По сравнению с химическим способом синтеза предусматривается меньшее количество стадий.

Подробное описание изобретения
В число примеров производных бета-лактама, которые могут быть получены в результате осуществления способа согласно настоящему изобретению, входят ампициллин, амоксициллин, цефаклор, цефалексин и цефадроксил.

Агент ацилирования может представлять собой производное D-фенилглицина или D-п-оксифенилглицина, например сложный эфир низшего алкила (метила, этила, н-пропила или изопропила) или амид, незамещенный по группе -CONH₂ . Предпочтительным производным является амид. Производное можно использовать в форме соли, например соли соляной кислоты или серной кислоты. Агент ацилирования можно добавлять в активной форме, или же предусмотреть образование активной формы in situ.

Фермент, который можно использовать при осуществлении способа согласно настоящему изобретению, может представлять собой фермент, катализирующий данную реакцию. Подобные ферменты известны с примерно 1966 г. В число пригодных ферментов входят, например, пенициллинамидаза или пенициллинацилаза, они классифицируются под обозначением Е.С.3.5.1.11. Известен целый ряд микробиологических ферментов, обладающих активностью данного типа, выделенных, например, из культур Acetobacter, Xanthomonas, Mycoplana, Protaminobacter, Aeromonas (патент ФРГ N 2163792), Pseudomonas (патент Австрии N 243986), Flavobacterium (патентная заявка Дании 70-09138), Aphanocladium Cephalosporium (патент ФРГ N 2621618), Acetobacter pasteurianum, Bacillus megaterium, Xanthomonas citrii (европейская патентная заявка N 339751), Kluyvera citrophila (Agr. Biol. Chem. 37, (1973), 2797-2804) и Escherichia coli (патент ФРГ N 2930794). Фермент из Escherichia coli является промышленным продуктом. Указанный фермент может также представлять собой так называемую ампициллингидролазу, ацилазу или амидазу. В этой связи уместно отметить работу, опубликованную в "Хаккато-Когио", 38 (1980), стр. 216 и далее, содержание которой включено в данное описание в качестве справочного материала.

Предпочтительным является использование фермента в форме, предусматривающей повторное использование, например в иммобилизованной или "захваченной" форме. Иммобилизацию можно осуществить с использованием любого известного способа. Иммобилизованный фермент Escherichia coli является промышленным продуктом фирмы "Берингер Маннхейм ГмбХ", ФРГ, выпускаемым под фирменным обозначением "Энзигель".

Способ согласно настоящему изобретению обычно осуществляют в системах, содержащих воду. При желании можно добавлять органический растворитель.

Растворимость агента ацилирования, например производного D-фенилглицина или D-п-оксифенилглицина, меняется в зависимости от конкретного производного и состава реакционной смеси. В водной системе, использованной в примерах, растворимость соли соляной кислоты D-фенилглицинамида обычно составляет примерно 450 мМ. Однако растворимость очень сильно зависит от солевого состава раствора, а также от значения pH и температуры раствора. В некоторых вариантах способа согласно настоящему изобретению исходная реакционная смесь представляет собой густую взвесь, содержащую нерастворенный агент ацилирования и/или бета-лактам, который полностью или частично растворяется в ходе реакции. Образующийся бета-лактам может осаждаться в ходе реакции, кроме того, в осадок могут выпадать также продукты гидролиза агента ацилирования, например производного D-фенилглицина или D-п-оксифенилглицина. Таким образом реакционная смесь в ходе реакции будет представлять собой взвесь.

Амино-бета-лактам, например 6-АПК или 7-АДЦК, используемый при осуществлении способа согласно настоящему изобретению, может быть получен в результате ферментативного гидролиза ферментационного пенициллина или цефалоспорина (например пенициллина V, пенициллина G или цефалоспорина C) или их аналогов с увеличенным кольцом (например V-DCA и G-DCA), или их производных, при желании - с последующим удалением побочных продуктов гидролиза (феноксиуксусной кислоты и т.п.). Предпочтительно неочищенный раствор можно использовать непосредственно, без дополнительной очистки или разбавления.

Обычно температура реакции при осуществлении способа согласно настоящему изобретению может лежать в пределах от примерно 0 до примерно 35^oC, особенно предпочтительно - в пределах от примерно 10 до примерно 30^oC. Для удобства проведения процесса температуры могут лежать в диапазоне примерно 20-30^oC. Подходящие значения pH зависят от типа и степени чистоты фермента. При использовании фермента Escherihia coli значение pH обычно лежит в пределах от примерно 5,5 до примерно 7,5, предпочтительно в пределах от примерно 6,1 до примерно 7. При получении амоксициллина предпочтительным является значение pH в пределах от примерно 5,5 до примерно 6,4. Можно использовать регулирование значения pH. Подходящее время реакции составляет от нескольких минут до нескольких часов, предпочтительно от примерно получаса до примерно 8 часов. Предпочтительные концентрации фермента лежат в пределах от примерно 1 ед. /мл до примерно 100 ед./мл, где 1 ед. = единица активности фермента (см. ниже).

При использовании способа согласно настоящему изобретению могут быть получены исключительно высокие выходы. Большие выходы получаются при использовании рекомендаций согласно настоящему изобретению и надлежащего подбора концентрации агента ацилирования, соотношения между концентрацией агента ацилирования и исходного амино-бета-лактама, значения pH и типа фермента.

Выделение и очистку продукта можно осуществлять в соответствии с известными способами, например кристаллизацией.

Определения и методы анализа
Активность фермента
В описании используется следующее определение активности пенициллин-G-ацилазы: 1 единица (ед.) соответствует количеству фермента, гидролизующего в течение 1 мин 1 мкмоль пенициллина G в стандартных условиях (5% пенициллина G, 0,2 M буфера фосфата натрия, значение pH = 8,0, 28^oC).

Анализ компонентов реакции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ЖХВД):
Колонка: RP LC-18, (250 х 4,6 мм; 5 мкм); элюент А: фосфатный буфер, 25 мМ, pH = 6,5, элюент Б: ацетонитрил,
Градиент: время, мин - элюент Б, %
0 ---> 10 - 1 ---> 20
10 ---> 20 - 20
Скорость потока: 1 мл/мин. Детектирование при 215 нм.

Время удерживания, мин: 4,1 (D-ФГ), 6,3 (7-АДЦК), 8,1 (6-АПК), 9,1 (D-ФГА), 13,4 (цефалексин), 13,9 (ампициллин), 18 (D-ФГМ).

Анализ амоксициллина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ЖХВД).

Колонка: RP LC-18, 5 мкм, (250 х 4,6 мм). Растворитель: 5% ацетонитрила в фосфатном буфере, 25 мМ, pH = 6,5. Скорость потока: 1 мл/мин. УФ-детектирование при 215 нм.

Время удерживания, мин: 2,5 (D-п-оксифенилглицин), 3,3 (ОФГА), 5,4 (6-АПК), 13,2 (амоксициллин).

Настоящее изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами, которые при этом не ограничивают пределов его применения.

Пример 1
Ферментативный синтез ампициллина
Раствор 100 мМ 6-АПК и D-ФГА в приведенных в таблице 1 концентрациях доводят до значения pH = 6,4 и выдерживают при 200^oC, после чего добавляют 345 ед. растворимого фермента из Escherichia coli, который является промышленным продуктом фирмы "Биотехнологише Форшунг ГмбХ", Брауншвейг, Германия (общий объем 20 мл).

Синтез проводят при 25^oC и стационарном значении pH. Максимальные выходы (по данным анализа методом ЖХВД) приведены в табл. 1 (табл. 1-5 см. в конце описания).

Пример 2
Ферментативный синтез цефалексина
Опыт проводят в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что используют 100 мМ 7-АДЦК вместо 6-АПК. При этих условиях получают максимальные выходы при различных концентрациях D-ФГА.HCl, приведенные в табл. 2.

Пример 3
Зависимость от pH
250 мМ 6-АПК и 700 мМ сульфата D-ФГА доводят до указанных в табл. 3 значений pH и проводят ферментативный синтез при 20^oC и стационарном значении pH, при общем объеме 20 мл и использовании 700 ед. растворимого фермента из Escherichia coli.

Пример 4
Зависимость от температуры
Исходя из 180 мМ 6-АПК и 700 мМ D-ФГА при pH = 6,4 и использовании 600 ед. растворимого фермента из Escherichia coli (общий объем 20 мл) и проводя синтез при указанных в табл. 4 температурах, получают максимальные выходы, приведенные в табл. 4.

Пример 5
Данный опыт проводят аналогично описанному в примере 1, используя D-ФГМ вместо D-ФГА. При этом получают максимальные выходы ампициллина, приведенные в табл. 5.

Пример 6
Пенициллин V, частично очищенный от ферментационной среды фильтрованием, экстракцией бутилацетатом и обратно в водную фазу, в результате чего получают раствор 10% (вес/объем) пенициллина V, который гидролизуют посредством семацилазы (фирменное обозначение иммобилизованной пенициллин-V-ацилазы, производимой "Ново Нордиск") при pH = 7,0. Феноксиуксусную кислоту удаляют экстракцией и к получающемуся раствору 6-АПК (150 мМ), содержащему незначительные количества побочных продуктов, образующихся из разрушающихся пенициллина V и 6-АПК, добавляют 45 ед./мл растворимого фермента из Echerichia coli и D-ФГА (до конечной концентрации 700 мМ). Значение pH доводят до 6,4 и оставляют реакционную смесь при 25^oC, поддерживая постоянное значение pH.

При указанных условиях образуется всего 135 ммолей ампициллина на 1 л раствора (90%).

Пример 7
Использование иммобилизованной пенициллин-G-ацилазы (продукт фирмы "Берингер", Маннхейм).

500 мг иммобилизованного фермента переводят в суспензию в 10 мл воды. Раствор фермента смешивают с раствором 6-АПК и D-ФГА до общего объема 25 мл, получающаяся при этом смесь содержит 230 мМ 6-АПК и 920 мМ D-ФГА, имеет значение pH = 6,4, ее выдерживают при комнатной температуре. Реакцию синтеза проводят при стационарном значении pH в течение 22 часов, после чего 91% 6-АПК превращается в ампициллин.

Пример 8
Ферментативный синтез амоксициллина
Смесь 968 мг 6-АПК и 3718 мг ОФГА в воде доводят до значения pH = 6,2 и выдерживают при 20^oC, после чего добавляют 1656 ед. растворимой пенициллин-G -ацилазы из Escherichia coli, доводя конечный объем до 29,8 мл. Синтез проводят при постоянной температуре, используя 2М раствор серной кислоты для поддержания pH = 6,2. Спустя 27,3 час реакционная смесь содержит 136,6 мМ амоксициллина, что соответствует выходу 91% из расчета на исходный 6-АПК.

Пример 9
Ферментативный синтез амоксициллина
К смеси 6-АПК и ОФГА (конечные концентрации которых составляют 200 мМ и 750 мМ соответственно) в воде при pH = 6,0 и 30^oC добавляют 1656 ед. растворимой пенициллин-G-ацилазы из Escherichia coli. После проведения реакции в течение 9 часов при постоянной температуре и постоянном значении pH, которое поддерживают с использованием 2М раствора серной кислоты для титрования, получают 190 мМ амоксициллина, что соответствует выходу 95% из расчета на исходный 6-АПК (по данным анализа методом ЖХВД).

Пример 10
Ферментативный синтез амоксициллина
Исходя из смеси 150 мМ 6-АПК, 600 мМ ОФГА, 1656 ед. растворимой пенициллин-G-ацилазы из Escherichia coli спустя 8 часов получают 140 мМ амоксициллина, что соответствует выходу 93%, реакцию проводят при pH = 5,7 и 35^oC.

Пример 11
Ферментативный синтез амоксициллина
Проводя опыт при описанных в примерах 9 условиях и используя 200 мМ 6-АПК и 450 мМ ОФГА, спустя 9 часов получают амоксициллин со степенью превращения 6-АПК в амоксициллин, равной 91%.

Сокращения:
6-АПК обозначает 6-аминопеницилланову кислоту, 7-АДЦК обозначает 7-аминодезацетоксицефалоспориновую кислоту, D-ФГА обозначает D-фенилглицинамид, D-ФГМ обозначает метиловый эфир D-фенилглицина, V-DCA обозначает 7-феноксиацетамидодезацетоксицефалоспориновую кислоту, G-DCA обозначает 7-фенилацетамидодезацетоксицефалоспориновую кислоту, и ОФГА обозначает D-п-оксифенилглицинамид.

Реферат

Изобретение относится к способу получения антибиотиков производных бета-лактамов. Получение производного бета-лактама осуществляется ферментативной реакцией исходного амино-бета-лактама с ацилирующим агентом. При этом концентрация ацилирующего агента в сумме с концентрацией производного бета-лактама в реакционной смеси превышает 400 мМ. Реакцию проводят при температуре ниже 35^oC, pH в пределах от 5,0 до 7,0. В реакции используется фермент, иммобилизованный из бактерий E.coli, Acetobacter pasteurianum, Xanthomonas citrii, Kluyvera citrophilia или Bacillus megaterium. Ацилирующий агент вводят в реакцию в количестве, превышающем предпочтительно по меньшей мере на 50% его растворимость в реакционной смеси. Исходное количество ацилирующего агента в реакционной смеси превышает половину суммарной растворимости этого агента в сумме с исходным количеством амино-бета-лактама в смеси. Ферментативный синтез производных бета-лактамов увеличивает выход конечного продукта, его чистоту, позволяет избежать использования органических растворителей, уменьшить содержание побочных продуктов и количество стадий реакции. 11 з.п. ф-лы., 5 табл.

Формула